Injection d’ADN étranger dans une

cellule animale

Chapitre 10 L’isolement et la manipulation de gènes

Comment amplifier un gène d’intérêt?

Amplification in vivo à l’aide du clonage d’ADN

L’ensemble formé par un vecteur

et un ou des fragments insérés

est appelé ADN recombinant. Le

mélange d’ADN recombinant est

ensuite utilisé pour transformer

des cellules bactériennes. En

général, il pénètre une seule

molécule de vecteur recombinant

par cellule bactérienne. Ces

cellules sont étalées et se

multiplient en formant des

colonies. Par conséquent, une

colonie contient une population

très importante d’inserts

identiques d’ADN, et on appelle

cette population un clone d’ADN.

La construction de l’ADN recombinant

1- Les types d’ADN donneur:

a) ADN génomique

b) ADN complémentaire (ADNc)

c) ADN obtenu par synthèse chimique

2- Couper l’ADN donneur et le vecteur à l’aide d’enzymes de restrictions

3- Relier les molécules d’ADN (ADN donneur-vecteur)

4- Amplifier chaque ADN recombinant à l’aide de la machinerie bactérienne

C’est la découverte et la caractérisation des enzymes de restriction qui a

permis le développement de la technologie de l’ADN recombinant. Les

enzymes de restriction sont produites par des bactéries et agissent

comme des ciseaux en coupant l’ADN au niveau de séquences cibles

spécifiques.

Exemple de coupure à l’aide d’EcoRI:

Les enzymes de restriction • Enzymes qui clivent l’ADN

• Reconnaissent des séquences nucléotidiques spécifiques

• 1ère enzyme découverte chez Haemophilus influenzae en 1970

• Différentes enzymes sont disponibles commercialement

• Nomenclature: BamHI

– B première lettre du genre bactérien (Bacillus)

– am lettres de l’espèce bactérienne (amyloliquefaciens)

– H représente la souche

bactérienne (H)

– I première enzyme

découverte chez cette

bactérie

Fabrication d’un plasmide d’ADN chimérique

Afin que des extrémités collantes

s’associent pour former une

population de molécules chimériques,

les squelettes sucre-phosphate

doivent être soudés ensemble par

l’utilisation de l’ADN ligase qui

crée des liaisons phosphodiesters.

Amplifier l’ADN recombinant

L’ADN recombinant ligaturé pénètre

dans une cellule bactérienne par

transformation. Après son entrée

dans la cellule hôte, le vecteur

plasmidique est capable de se

répliquer car les plasmides

possèdent habituellement une

origine de réplication. La colonie

résultante de bactéries contiendra

des milliards de copies de l’insert

d’ADN donneur de départ. Cet

ensemble de copies amplifiées du

fragment unique d’ADN donneur

constitue un clone d’ADN.

Choisir un vecteur de clonage

1- Les plasmides: Petites molécules circulaires

d’ADN capables de répliquer leur ADN

indépendamment du chromosome bactérien.

Servent à cloner des fragments d’au plus 30 kb.

2- Les vecteurs viraux: Offrent de nombreux

avantages pour le clonage et les applications

des gènes clonés qui en découlent. Comme

l’efficacité d’infection des virus est élevé, le

gène cloné peut être introduit dans une cellule

à une fréquence élevée. Servent à cloner des

fragments de tailles définies.

3- Les cosmides: Vecteurs hybrides de phages

lambda et de plasmides. Leur ADN peut se

répliquer dans la cellule comme celui d’un

plasmide et être empaqueté comme celui d’un

phage. Servent à cloner des fragments d’au

plus 45 kb.

4- Les vecteurs à large capacité: Permettent le

clonage de larges fragments (maximum de 300 kb pour les BAC et de 400 kb pour les YAC).

BAC: «Bacterial artificial chromosome» ; et YAC: «Yeast artificial chromosome».

5- Les vecteurs d’expression: Permettent le clonage mais aussi l’expression.

Choisir un vecteur de clonage -suite

Un clonage dans le phage lambda

Différents scénarios pour l’entrée des

molécules recombinantes dans la cellule

bactérienne

Fabrication d’une banque d’ADN Une banque d’ADN constitue l’ensemble des

clones obtenu à partir d’un seul échantillon

d’ADN. Il existe trois types de banques

d’ADN:

1- Banque génomique: Banque couvrant

l’ensemble du génome.

2- Banque d’ADN complémentaire ou ADNc:

Banque constituée d’ADNc, qui ne

représentent pas nécessairement la totalité

des ARNm. Il s’agit plutôt d’une banque

fabriquée à partir uniquement des régions

transcrites du génome.

3- Banque d’expression: Banque dans

laquelle le vecteur porte des signaux

transcriptionnels permettant à n’importe

quel insert cloné de produire un ARNm et en

dernier lieu, une protéine.

Trouver des clones spécifiques à l’aide de sondes

Le criblage d’une banque

d’ADN est réalisé en utilisant

une sonde spécifique qui

trouvera et signalera le clone

que l’on cherche à identifier. On

peut soit utiliser une sonde

d’ADN ou une sonde qui

reconnaît les protéines si un

vecteur d’expression est utilisé

et si le produit spécifique d’un

gène (protéine) a au préalable

été isolé sous forme pure,

permettant le développement

d’anticorps.

Criblage d’une banque d’ADN phagique

Le criblage destiné à identifier des acides nucléiques spécifiques

Les techniques de transferts de

Southern et Northern peuvent

également être utilisée pour

déterminer si 1) un individu est

porteur du gène ou plus

précisément de l’allèle qui aura

au préalable été cloné ou 2)

déterminer si le gène en question

est exprimé sous certaines

conditions à l’étude.

La complémentation fonctionnelle On peut détecter des clones spécifiques dans une banque bactérienne

(plasmidique) ou phagique grâce à leur capacité à restaurer la fonction

éliminée par la mutation récessive dans un organisme. Cette procédure

s’appelle la complémentation fonctionnelle ou le sauvetage de mutants.

Construire une banque bactérienne ou phagique contenant

des inserts d’ADN donneur recombinant de type sauvage a+

Transformer les cellules d’une lignée cellulaire

mutante a- en utilisant l’ADN de clones individuels de la banque

Identifier les clones de la banque qui produisent des cellules

transformées avec le phénotype dominant a+

Récupérer le gène a+ à partir du clone phagique ou bactérien positif

Amplification in vitro à l’aide de la réaction de polymérase en chaîne

Si on connaît la séquence de certaines parties

du gène ou d’un fragment intéressant, on

peut l’amplifier en conditions in vitro dans un tube,

tout cela sans clonage. Cette procédure s’appelle

la réaction de polymérase en chaîne (PCR ou

polymerase chain reaction en anglais).

Étapes de la réaction:

1) Dénaturation (95°C)

étape qui dénature les deux fragments d’ADN

2) Hybridation (température variable)

étape où les amorces s’hybrident à leurs

séquences complémentaires

3) Élongation (72°C)

Extension des amorces par l’ADN polymérase

Applications de la technologie de l’ADN recombinant

Le fait de disposer d’un gène isolé sous la forme d’un clone (ou obtenu par PCR)

ouvre diverses perspectives expérimentales:

1- On peut déterminer la séquence d’ADN de ce gène en utilisant la technique

de séquençage.

2- On peut muter le gène cloné et le réintroduire dans son hôte d’origine afin

d’étudier les propriétés fonctionnelles de ce gène.

3- On peut l’utiliser comme sonde pour la cartographie ou le diagnostic génétique.

4- On peut introduire le gène cloné dans un nouvel hôte afin de créer un

organisme transgénique (ou génétiquement modifié) que l’on n’aurait pas pu

obtenir facilement à la suite de procédures standards de croisement.

Déterminer une séquence d’ADN

La séquence nucléotidique d’un gène représente l’aboutissement de la

caractérisation de sa structure génétique. Pour séquencer un ADN, il faut

pouvoir en obtenir des fragments définis. Il y a donc une forte interdépendance

entre la technologie du clonage et celle du séquençage.

Le principe du séquençage La technique de séquençage la

plus utilisée actuellement a été

développée par Fred Sanger.

Elle est basée sur une synthèse

d’ADN en présence de

didésoxynucléotides, qui à

l’inverse de désoxynucléotides

normaux, sont dépourvus de

groupement hydroxyle en 3’.

Séquenceurs automatisés Ces appareils ont permis d’intensifier les séquençages d’ADN et même d’obtenir

la séquence de génomes complets en employant à grande échelle des protocoles

de séquençages robustes à haut débit.

Ajout des 4 ddNTP marqués par un fluorophore différent

Électrophorégramme obtenu suite au

séquençage automatisé

Exprimer des gènes eucaryotes dans des bactéries

Les bactéries transgéniques, contenant un transgène, peuvent être utilisées

comme « usine » de synthèse de protéines eucaryotes utiles, qui autrement

seraient difficiles à obtenir. Il existe plusieurs systèmes de ce type pour

produire en masse des protéines étrangères.

L’un de ces systèmes utilise l’ARN polymérase

du phage T7 dont l’action s’exerce sur un

promoteur de T7. Vers la fin de l’infection, le

phage T7 synthétise de grandes quantités de

produits de gène à partir de plusieurs sites

appelés promoteurs tardifs. Les gènes des

chromosomes de l’hôte n’étant pas synthétisés

à ce moment-là, ces produits sont les seules

protéines synthétisées. Pour tirer profit de ce

système, le gène de l’ARN polymérase de T7

est manipulé de façon à être transcrit sous le

contrôle d’un promoteur lac, à partir duquel la transcription est normalement inhibée par le

répresseur lac, une protéine exerçant une régulation négative. Toutefois, si on ajoute de

l’IPTG, un analogue du lactose, le répresseur est inactivé et de grandes quantités de l’ARN

polymérase de T7 sont synthétisées. Dans le second composant du système, le gène choisi

est inséré à côté du promoteur tardif de T7. L’ARN polymérase de T7 transcrit alors ce gène

en quantité élevée.

La technologie de l’ADN recombinant chez les eucaryotes

Les techniques de manipulation,

clonage et expression des gènes

ont d’abord été développées chez

les bactéries, mais elles sont

désormais utilisées en routine

chez de nombreux modèles

eucaryotes. Le baculovirus des

insectes est un vecteur largement

employé pour les protéines

eucaryotes. Des gènes sont

insérés dans celui-ci et exprimés

à des fréquences élevés dans

des cellules d’insectes en culture.

Suivre l’introduction d’un gène Lorsque de l’ADN étranger (provenant de la même espèce ou non) est introduit

dans une cellule eucaryote, il peut soit remplacer un gène résidant, soit subir

une insertion ectopique. Une fois introduit, il peut être difficile de détecter l’activité

d’un gène donné. Ce problème peut être résolu en mettant sous le contrôle d’un

même promoteur le gène en question et un autre gène, un gène rapporteur, dont le

produit est facilement décelable. Le gène rapporteur signalera les endroits et les

moments auxquels le gène étudié est actif.

Le génie génétique chez les végétaux Le plasmide Ti: Les principaux vecteurs utilisés de façon routinière pour produire

des plantes transgéniques sont dérivés de la bactérie du sol Agrobacterium

tumefaciens. Cette bactérie provoque une maladie appelée galle du collet au

cours de laquelle la plante infectée produit des excroissances incontrôlées,

généralement à la base du collet de la plante. Le responsable de la formation

de tumeurs est un grand ADN plasmidique circulaire de 200 kb, le plasmide

Ti inducteur de tumeurs.

Le génie génétique chez les végétaux

Le génie génétique chez les animaux On peut maintenant cloner et manipuler des gènes

de champignons, végétaux et animaux dans des

bactéries, puis les réintroduire dans la cellule

eucaryote, où ils s’intègrent

généralement dans l’ADN

chromosomique. Ces

recherches ont ouverts

la voie à la thérapie

génique, soit une approche

où un gène fonctionnel est

introduit pour remplacer ce

même gène mais qui est

déficient chez un receveur.

On en distingue deux types,

soient la thérapie génique

germinale et la thérapie

génique somatique.

Utilisation de la génétique moléculaire pour détecter

directement les allèles responsables des maladies

Lorsque l’on peut attribuer une maladie génétique

au changement d’un nucléotide spécifique, des

sondes oligonucléotidiques synthétiques

permettent d’identifier ces changement. Une

sonde, qui contient la séquence de type sauvage,

peut être utilisée lors d’une analyse par transfert

de Southern, pour déterminer si l’ADN contient

la séquence de type sauvage ou mutante. La PCR

constitue également un autre outil qui permet de

mener à bien ce diagnostic grâce à l’utilisation

d’amorces spécifiques qui encadrent le site, puis

isolation de cet ADN amplifié et séquençage.

Quelques maladies génétiques courantes