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STEEVE HOULE
ÉTUDES DE DEUX RÉCEPTEURS COUPLÉS AUX PROTÉ~NES G
MÉDIANT LES EFFETS INJ3LAMMATOIRES
DE DEUX PEPTIDES DÉRIVÉS DU SANG CHEZ LE LAPIN
Mémoire
présenté
à la Faculté des Études Supérieures
de I'Universiti Laval
pour l'obtention
du grade de maître ès sciences (M. Sc.)
FAcULTÉ DE MÉDECME
Médecine expérimentale
UNIVERSITE LAVAL
JUIN 2000
O Steeve Houle, 2000
National Library 1*1 of ,naci, Bibliothèque nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions et Bibliographic Services services bibliographiques
395 Wellington Street 395, rue Wellington OéiawaON K1AON4 Ottawa ON K I A O N 4 Canada Canada
The author has granted a non- L'auteur a accordé une licence non exclusive licence allowing the exclusive permettant à la National Library of Canada to Bibliothèque nationale du Canada de reproduce, loan, distriibute or sell reproduire, prêter, distribuer ou copies of this thesis in microform, vendre des copies de cette thèse sous paper or electronic fonnats. la forme de rnicrofiche/nlm, de
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Le système du complément et le système d'activation par contact (qui inclut le système
kallikréine-kinines) sont des cascades protéolytiques du sang qui produisent des peptides dont
les effets inflammatoires sont médiés par des récepteurs couplés aux protéines G retrouvés a la
surface de différentes cellules. Les travaux présentés dans ce Mémoire concernent les
récepteurs de lapin du Cja et B2 des kinines. Dans un premier volet, le clonage et la
caractérisation du récepteur du C j a de lapin a permis de définir un ensemble d'outils
moléculaires utiles pour son étude (séquence du récepteur, ligand agoniste, anticorps
monoclonal spécifique). Dans un second volet, nous avons caractérisé le comportement
antagoniste de différents ligands du récepteur BI de lapin (icatibant. WC 1773 1, composé 9 et
LF 16.0687) et les effets de l'antagonisme de type non compétitif et irréversible sur la
population de récepteur grâce au nouveau modèle de la protéine de fusion récepteur B1 de
lapin - GFP exprimée dans un système hétbrologue.
AVANT-PROPOS
Je tiens tout d'abord à remercier mon directeur de recherche, le Dr. François Marceau,
pour la conflance qu'il m'a accordée lorsqu'il m'a accepté comme étudiant a la maîtrise dans
son laboratoire et pour sa grande disponibilité. Il a contribué au développement de mon
jugement scientifique par son e s p d critique et de mon autonomie en recherche par son
ouverture d'esprit face à mes suggestions, mais surtout par le partage de ses nombreuses
connaissances.
Je souhaite également remercier le Dr. Dimtcho Batchvarov, mon CO-directeur de
recherche, pour sa participation aux travaux présentés dans ce Mémoire et pour avoir contribué
à l'élargissement de mes conn~ssances en biologie moléculaire.
Je désire remercier Magdalena Batchvarova et Johanne Bouthillier pour leur
participation et leur aide au'; travaux présentés dans ce Mémoire et pour les conseils
techniques qui ont permis de faire avancer mes projets. Je salue particulièrement Johanne sans
qui le laboratoire se retrouverait souvent au dépourvu. Je suis aussi reconnaissant envers Jean-
François Larrivée pour les nombreuses discussions que nous avons eu et ses conseils
techniques.
Finalement, je tiens a remercier mes parents et ami(e)s pour leun encouragements et
leur support moral au cours des dernières années. Je remercie tout particulièrement Sophie,
ma copine, pour son support moral et son amour, mais surtout pour sa patience Lors de la
rédaction de ce Mémoire.
RESUME ..........................................................-................................................................. p. 11
AVANT-PROPOS .............................................................................................................. p. III .
.................................................................................................. TABLE DES MATIERES p. IV
.................................................................................................. LISTE DES TABLEAUX p. VII!
....................................................................................................... LISTE DES FIGURES p. IX
...................................................................... LISTE DES ABRÉVIATIONS UTILISEES p. XII
. I ............................................................................................... 1.1 Introduction generale P b 1 . . ........................................................................................ 1.3 La réaction inf~amrnatoire P. 1
1.3 Les médiateurs de l'inflammation dérivés du sang .................................................. p. 5
..................................................................................... 1.4 Le système du complément P. 4 - t .............................................................................................. 1.3 L anaphylatoxine C j a P. 8
1.6 Le récepteur du C5a .................................. .. ............................................................ p. 10 . . ......................................................................... 1.7 Le système d'activation par contact p. 17
1.8 La bradykinine ........................................................................................................ p. 1 5
1.9 Le récepteur B,. ....................................................................................................... p. 1 8 . . ..................................................................................... 1.10 Les objectifs de ces études p. 2 1
1 .10.1 Le récepteur du C5a .................................................................................. p. 21
.............................................................................................. 1.10.2 Le récepteur B2 p. 23
. . ........................................*................................*......***.. . 2.0 MATERIEL ET METHODES p 24
2.1 Le récepteur de lapin pour le C5a ........................................................................ p . 24
2.1.1 Isolation de clones génomiques contenant le gène de lapin
pour le récepteur du C5a .................................................................................. p . 24
2.1.2 Expression de 1'ADNc cloné du récepteur de lapin pour le Cja
. dans des cellules de mamrniferes ................................................................ p 25 . . . 2.1.3 Immunohistochme ......................................................................................... p 26
.............. . 2.1.4 Synthèse d'un analogue de la séquence C-terminaie du Cja humain p 26 . . . 2 . l . 5 Essais de liaison ........................................................................................... p 27
. .................. 2.1.6 Études de contractilité sur des vaisseaux sanguins isoles de lapin p 27
. ............................................. 2.1.7 Essai de neutropénie aiguë in vivo dans le lapin p 28
2.2 Le récepteur B. de lapin .......................................................................................... p . 29
7.2.1 Études de contractilité sur la veine jugulaire isolée de lapin ........................... p . 19
2.2.2 Construction du vecteur exprimant la protéine de fusion
RB. de lapin . GFP .......................................................................................... p . 30
2.2.3 Expression de la protéine de fusion RB2 de lapin . GFP
.......................................................*............ . dans des cellules de mammiferes p 51 . .
2.2.4 Essais de lrarson ............................................................................................... p . 32 9 CI . ........................................................................... 2.2.5 Essai de la phospholipase A, p 33
2.2.6 Obsetvations en microscopie confocale de la distribution subcellulaire
de la protéine de fusion RBZ de lapin . GFP .................................................... p . 34
2.2.7 Analyse de type western de la protéine de fusion RB, de lapin . GFP ............ p . 34
2.2.8 Fractionnement des cellules HEK 293 exprimant de façon stable
la protéine de fusion RB, de lapin - GFP par centrifugation séquentielle ....... p . 36
VI
. . 3 0 RESULTATS ................................................................................................................ p 37
. .................................................... 3.1 Le récepteur de lapin pour l'anaphylatoxine C5a p 37
3.1. l Isolation et caractérisation du gène du récepteur de lapin pour le Cja ........... p . 37
3.1.2 Profil antigénique du récepteur cloné de lapin pour le C h
................................. . exprimé de façon transitoire dans les cellules HEK 293 p 41
3 - 1 3 Identité pharmacologique du récepteur cloné de lapin pour le C j a
. ....................................... exprime de façon stable dans les cellules RBL-ZH3 p 43
3.1 . 4 Profil pharmacologique du récepteur de lapin pour le C5a naturellement
. ................... exprimé dans les tissus vasculaires et les neutrophiles circulants p 46
. 3.2 Le récepteur B. de lapin ........................................................................................... p 51
3.2.1 Contractilité vasculaire médiée par les récepteurs B, naturellement
exprimés dans la veine jugulaire de lapin ....................................................... p . 51
3.2.2 Identité pharmacologique de la protéine de fusion RB2 de lapin . GFP
exprimée dans des cellules de mammiferes ..................................................... p . 55
32.3 Relâchement de seconds messagers par la protéine de hision
RB2 de lapin . GFP exprimée de façon stable dans les cellules HEK 293 ...... p . 58
32.4 Distribution subcellulaire de la protéine de fusion RB2 de lapin . GFP
...................................... . exprimée de façon stable dans les cellules HEK 295 p 60
. ............................................................................................................... 4.0 DISCUSSION p 67
4.1 Le récepteur de lapin pour l'anaphylatoine C5a ..................................................... p . 67 . ........................................................................................... 4.2 Le récepteur Bz de lapin p 71
. . . 5.0 CONCLUSION GENEKALE ...................................................................................... p 77
5.1 Le récepteur de lapin pour i'anaphylatoxine C5a ............................................. p 77
. ........................................................................................... 5.2 Le récepteur B2 de lapin p 77
. 6.0 REFERENCES ............................................................................................................. p 80
ANNEXE A. .. . . . .. .. . . . . . . . . . . .. . ..... . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 8 8
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I : Classification des protéines (ou peptides) du système du complément
selon certaines classes fonctionnelles ..........................................................,. P* 5
LISTE DES FIGURES
.............................................. Figure 1 : Les grandes étapes de la réaction inflammatoire p. 2
Figure 2 : Description sommaire des trois voies d'activation
dii systéme du complément ....................................................
Figure 3 : Mécanismes de génération et de dégradation des kinines ................................. p. 13
Figure 4 : Structure de la bradykinine et des quatre antagonistes étudiés
du récepteur B ,... ................................................................................................ p. 16
Figure 5 : Séquence nucléo tidique détermide et séquence déduite
des acides aminés du récepteur de lapin pour le C j a ........................................ p. 38
Figure 6 : Immunohistochimie des récepteurs du Cja clonés ou naturels de lapin
par l'anticorps monoclonal SYl ...................................................................... p. 42
Figure 7 : Liaison totale du "'~-Cja a des celluIes RBL-2H3 exprimant ou non
de façon stable le récepteur du Cja de lapin ................................................... p. 44
Figure 8 : Compétition de la liaison du "'1-Cja à des cellules RBL-ZH3 exprimant
ou non de façon stable le récepteur du Cja de lapin par du C j a ou
un analogue synthétique non marqué .............................................................. p. 45
Figure 9 : Tracés représentatifs de la réponse biphasique de vaisseau^ sanguins
isolés de lapin stimulés par des agonistes des récepteurs du C5a suite
a une précontraction à la phényléphrine ..................................................... p. 47
Figure 10 : Effet relaxant du Cja recombinant humain et du peptide synthétique
..................... Ac-YSFKPMPLaR sur des vaisseaux sanguins isolées de lapin p. 49
Figure 11 : Changement dans le décompte des neutrophilrs et des lymphocytes
dans le sang périphérique de lapins suite à l'injection du peptide
................................................... synthétique Ac-YSFKPMPLaR ou de saline p. 50
Figure 12 : Effets de deux antagonistes peptidiques, le W C 1773 1 et l'ic~tibant.
sur la contraction induite par la BK dans la veine jugulaire isolée de lapin .... p. 53
Figure 13 : Effets de deux antagonistes non peptidiques, le LF 16.0687 et le composé 9.
sur la contraction induite par la BK dans la veine jugulaire isolie de lapin ... p. 54
Figure 14 : Liaisons spécifiques de la BK tritiie à la surtàce de cellules COS4
exprimant de façon transitoire la protiine de fusion RB,-GFP ou
un variant de la GFP et à la surface de cellules HEK 293 exprimant
de façon stable ia protéine de fusion RB,-GFP ............................................... p. 56
Figure 15 : Relâchement d'acide arachidonique tritié par des cellules HEK 293
transfectées de façon stable avec le vecteur codant pour le RBrGFP suite
à différents traitements avec l'un des trois antagonistes du RB, testés
...................................................................................................... et/ou la BK p. 59
Figure 16 : Localisation subcellulaire de la fluorescence dans des cellules HEK 293
exprimant de façon transitoire un variant de la GFP ou
de façon stable le RB2 de lapin - GFP ........................................................... p. 62
Figure 17 : Localisation subcellulaire de la fluorescence dans des cellules HEK 293
exprimant de façon stable le RB, de lapin - GFP suite à un traitement avec
un agent pharmacologique pour une période de temps d é h i e ....................... p. 63
Figure 18 : Immunobuvardage d'extraits cellulaires de cellules HEK 293 transfectées
ou non avec le vecteur RB2 de lapin - GFP ou le vecteur pEGFP-N3
à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-GFP ................................................ p. 65
XII
LISTE DES ABRÉVIATIONS UTILISÉES
ADN :
ADNc :
AE'P :
alpha
alpha medium and minimum essential medium
degré celcius
bac tériophages lambda
bêta
longueur d'onde
plus ou moins
pourcentage
adénosine
alanine
isomère D de l'alanine
acétyl-
acide désoxyribonucléique
acide désoxyribonucléique complémentaire
aminopeptidase M
arninopeptidase P
angiotensine
brady kinine
carboxy-
c O mp lément
c y stéine
cytosine
C-l b inding protein
Cl -inhib itor
chlorure de calcium
cluster of differentiution
curie par mi lho l e
cm' : centimètre carré
COz : bioxyde de carbone
coll. : collaborateur
CPM : carboxypeptidase M
cpm/cellule : coups par minute par cellule
cprn/mi :
cpxdpuits :
CPN :
CR :
D ou Asp :
D :
DAF :
des- :
DMEM :
Dr. :
E :
EmaK :
EC,, :
ELA :
ED,, :
EPN :
F ou Phe :
FH :
FHa :
FPPC :
g :
G ou Gly :
g :
coups ?ar minute par millilitre
coups par minute par puits
carboxypeptidase N
récepteur du complément
acide aspartique
isomère D
tfecay acceleroringJk~or
devant un acide amine. cela signifie que ce dernier est omis de la séquence de
référence
Dulbecco 3 rnoclifeti eagle medium
docteur
acide glutamique
effet maximal
concentration nit::ssaire pour observer 50% de l'effet pharmacologique
maximal
enzyme de conversion de l'angiotensine
dose nécessaire pour observer 50% de l'effet biologique maximai
endopeptidase neutre
phénylalanine
facteur Hageman
facteur Hagernan activé
facteur prothromblastique plasmatique C
force g
glycine
gr-'=
XIV
G :
GFP :
h :
H :
H :
HCI :
HYP :
I :
1 :
[Cf0 :
Ig :
IL- :
K ou Lys :
kb :
KBPM :
KCI :
kDa :
KHPM :
KH2P0, :
kg :
L ou Leu :
LPS :
M ou Met :
MASP :
MBL :
MCP :
guanine
green fluorescent protein
heure
histidine
hydrogène
chlorure d'hydrogène
kaliikréine humaine 1
hydroxypro line
iode
iso leucine
concentration nécessaire pour inhiber 50% de l'effet maximal
irnmunoglo buline
interleukine-
iysine
kilobase
kininogène de bas poids moléculaire
chlorure de potassium
kilodalton
kininogène de haut poids moléculaire
phosphate de potassium monobasique
kilognmme
leucine
lipopolysaccharides
méthionine
milliampère
mannose binding ligand ossociated serine protease
mannose binding lectin
membrane cofactor prorein
milligramme par millilitre
sulfate de magnésium
millilitre
millimètre
minute
molaire
nombre
chiorure de sodium
bicarbonate de sodium
hydroxyde de sodium
orthovanadate de sodium
nanométre
nanomolaire
oxyde nitrique
non significatif
extrémité hydroxyle
O? :
Oic :
oxygène
L-[(3as, 7as)-octahydroindol-2-yl-carbonyl]
P ou Pro :
P : phosphate
paire de base
PAGE : polyocrylumide gel electrophoresis
Dulbecco S phosphate buffered saline PBS : ?
PCR : poijmerase chain reaction
PMSF : phenyhet~lsurfonyl fluor ide
poiyvinylidene difluoride PVDF :
Q: glutamine
R ou Arg :
RB2 :
RB,-GFP :
RCSa :
S ou Ser :
Thi :
Tic :
pl :
pM :
v ou Val :
arginine
rticepteur B, des kinines
protéine de fusion récepteur B2 des kinines - greenjlzrorescenr protein
rçcepteur du C j a
reverse transcriplase
sérine
~odiirrn dodecyl nc(/ote
solution de chlorure de sodium et de citrate de sodium
héonine
thymidine
P-(2 - thieny 1)alanine
1,3,3,4-té~ahydroisoquinolin-Wl-carbony 1
tnnsmembranaire
rtimor necrosis factor alpha
microcurie
microgramme
microgramme par millilitre
microlitre
micromolaire
valine
volt
thrytophane
fois
tyrosine
1.0 INTRODUCTION
1.1 Introduction générale
Le sang est le seul tissu conjonctif liquide de l'organisme. Plusieurs fonctions
majeures qui, de près ou de loin, permettent à l'organisme de maintenir son homéostasie, lui
sont attribuées. Les érythrocytes (globules rouges), les leucocytes (globules blancs) et les
plaquettes sont les types cellulaires retrouvés en suspension dans le plasma, la matrice
extracellulaire liquide composant le sang. Le plasma est constitué principalement d'eau dans
laquelle sont dissouts plusieurs solutés, allant de simples Clectrolves a u protéines, l'élément
Ir plus abondant (Marieb. 1993). Ces protéines plasmatiques sont recrutées directement ou
non pour de nombreuses fonctions du sang, dont celles de protection de l'organisme. En
effet. en réponse h une lision touchant un tissu, une réaction inflammatoire impliquant
plusieurs protéines et peptides dérivés du sang prend place.
1.2 La réaction inflammatoire
La réaction inflammatoire, l'une des premières lignes de défense de l'organisme,
consiste en une série de réactions non spécifiques déclenchées dans un tissu suite à un
traumatisme de nature physique, chimique ou biologique. Elle empêche la propagation des
agents toxiques, élimine Les débris cellulaires et les agents pathogènes et amorce le processus
de réparation (Marieb, 1993). Les grandes étapes de la réaction inflammatoire sont décrites a
la figure 1. L' i~ammation aiguë, c'est-à-dire à court terme, est caractérisée par de la
rougeur, de la chaleur, de la tuméfaction et de la douleur. Ces symptômes sont le résultat des
effets sur les vaisseaux sanguins locaux de médiateurs chimiques de l'inflammation,
l'histamine, les bines , les protaglandines, les protéines du systeme du complément et les
lymphokines étant les plus importants. Ces médiateurs sont libérés par les cellules des tissus
lésés, les leucocytes présents dans cette région et certaines protéines plasmatiques. En plus
de leur rôle individuel, tous ces médiateurs causent une vasodilatation des artérioles situées
Ldsion dans un tissu a Libération des médiateurs chimiques
de l'inflammation (histamine; kinines, prostaglandines,
proteines du cornplement, lymphokines,. .)
dilatation des $locales
Augmentation de la permdubilite des capillaires - .
I Pnssap de l'exsudat 1
. 4 dans le compartiment interstitiel (anticorps, proteines de la coagulation,
oxyghne; nutriments. ..) 1
Formation d'un caillot mmmlEl
Figure 1 : Les grandes étapes de la rdaction inflanimatoire (Mnrieb, 1 993). Les quatre sigiies caractérisant I'inflainmation aiguë sont montrds cn canictère gras.
autour du site de la lésion, augmentant ainsi le débit sanguin pour un apport accru en
oxygène, en nutriments, en protéines et en leucocytes vers les tissus touchés. La chaleur en
surface et la rougeur résultent de cette augmentation du débit sanguin. Les médiateurs de
l'intlammation augmentent également la perméabilité des capillaires aux abords mêmes du
site de la lésion, provoquant ainsi une fuite de l'exsudat de La circulation sanguine vers le
compartiment interstitiel, d'où l'oedème. L'exsudat est un liquide composé de diverses
protéines. dont les anticorps et les protéines de la coagulation. Ces dernières sont impliquées
dans la formation d'un caillot temporaire empêchant la propagation des agents pathogènes
et/ou toxiques dans d'autres tissus et permettant la réparation subséquente de la lésion. De
plus, certains médiateurs provoquent une augmentation du nombre de globules blancs
circulants dans le sang (leucocytose). Ces Leucocytes sont attirés vers le siège de la lésion par
différents signai~u chimiques (chimiotactisme) avant de s'accoler aux capillaires
(margination). Ils passent ensuite à travers les capillaires (diapçdese) afin d'éliminer les
agents pathogènes et les débris cellulaires dans les tissus touchés. Plusieurs facteurs
provoquent la douleur lors d'une réaction inflammatoire : la pression exercée par t'oedème
sur les terminaisons nerveuses, la diapédèse des leucocytes et les effets de certains médiateurs
chimiques comme les prostaglandines et la bradykinine (BK) sont quelques exemples
(Marieb, 1993).
1.3 Les médiateurs de l'inflammation dérivés du sang
Certaines protéines plasmatiques sont en mesure de libérer, d'activer, dans certaines
conditions (comme lors d'une réaction inflammatoire), des peptides ou des hormones latentes
par protéolyse sélective. En effet, il existe dans le sang quatre cascades protéolytiques qui
mènent à la libération, l'activation, de médiateun peptidiques de l'inflammation, chacun
d'eux agissant sur un aspect ou un autre de la réaction inflammatoire. Il y a le système du
complément, le système d'activation par contact (qui inclut les systèmes kallikcéine-kinines
et dg initiation de la coagulation intrinsèque), la coagulation et la fibrinolyse (Marceau, 1999).
Les peptides C5a et BK, qui dérivent respectivement des systèmes du complément et
d'activation par contact, sont de puissants médiateurs de I'innammation dont les effets sont
médiés par des récepteurs couplés aux protéines G, le récepteur pour le C5a (RCSa) et le
récepteur B2 des kinines (RB&
1.4 Le système du complément
Un ensemble complexe de protéines. plasmatiques pour la plupart, constitue le
svstème du complément. Les protéines du complément Cl à Cg. les facteurs B. D et P
(propres a la voie alterne), les récepteurs et plusieurs protéines de régulation du complément
sont les pcincipai~u éléments retrouvés dans cet ensemble. Plusieurs de ces protéines, ou du
moins leurs fragments actifs. sont classifiées dans le tableau 1 selon certaines classes
fonctionnelles correspondant à leur rôle majeur dans l'action du système du complément dans
la défense de l'organisme.
Il existe trois voies d'activation de cette cascade protéolytique : la voie classique. la
voie des lectines et la voie alterne (Janeway et Travers. 1997). Ces deux dernières voies font
partie de l'immunité naturelle alors que la voie classique s'intègre bien dans l'immunité
humorale (acquise). La voie classique peut également solliciter. par l'intermédiaire d'un de
ses composants activés. la voie alterne, donnant ainsi à cette dernière un rôle amplificateur de
la voie classique d'activation du complément dans l'immunité acquise. Chacune de ces voies
est enclenchée par un mécanisme différent. mais toutes finissent par converger au même
point (la formation de l'activité eqmat ique de la C3 convertase), c'est-à-dire la où les
fonctions effectrices du système du complément sont ginérees afin de compléter ou
d'augmenter l'efficacité des systèmes de défense, naturel ou acquis, de l'organisme. Ces
fonctions se résument à i'opsonisation et la cytolyse des agents pathogénes, la production de
la réaction inflammatoire et le recrutement des leucocytes. Une description sommaire des
trois voies d'activation est dépeinte à la figure 7.
Tableau 1 : Classification des protéines (ou peptides) du système du complément selon certaines classes fonctionnelles (Janeway et Travers, 1997 ; Ember et Hugli, 1997 ; Kirschfink, 1997).
1 Classes fonctionnelles Protéines liant les complexes antigène-anticorps Enzymes activatrices +---- Protéines liant les membranes des agents pathogènes et opsonines
1 peptides médiateurs de l'inflammation 1 (anap hy laroxines)
Proteines du complexe d'attaque membranaire rn Récepteurs pour le complément
Protéines de régulation du complément
'rotéines ou peptides actifs
lllr Zts Y.2
Facteur D Bb MAS P (Mannose binciing 1 igand Associated Serine Pro tense) C3b C4b lvl B L (lbInnnose Bintling Lecrin)
CSb C6 C7 CS C9 CD35 ou CRI CR2 CR3 CR4 Récepteur de la protiine C 1 q Récepteur du C3a CD88 ou récepteur du C j a C 1 INH (Cl-inhibitor) C Jbp (CJ binding protein) Facteur 1 Facteur H CD55 ou DAF (Decay Accelerating Factor) CD46 ou MCP {Membrane Cofactor Protein) Facteur P ou properdine CD59 ou protectine Protéine S ou vitronecthe Carboxypeptidase N (inactivatew des
La voie classique d'activation du complément est initiée par la liaison de la protéine
Clq à au moins deux types d'immunoglobulines (M ou G) liées aux antigènes d'un agent
pathogène, la voie des lectines par la liaison d'une lectine sérique à des protéines ou des
hydrates de carbone mannosylés de bactéries ou de virus et la voie alterne par l'activation
spontanée ou provoquée par la voie classique d'un composant du système du complément
(C3) se liant à la surface d'un agent pathogène (Janeway et Travers. 1997). Suite à l'un ou
I'autre de ces évènements déclencheurs. une série de réactions protéolytiques s'enclenche.
Des zymogènes (sérine protéases inactives) sont activés séquentiellement par protéolyse
limitée. À chaque réaction, le grand fngment clivé, doué de l'activité enzymatique, se lie à
la surface d'un agent pathogène aiin d'activer à son tour plusieurs molécules de la protéase
suivante. amplifiant ainsi de façon considérable la cascade à chaque ttape. Ces protiolyses
menent finalement à la production de l'activité enzymatique de Iri C3 convertase. laquelle
génère les fonctions effectrices du système du complément. -
En effet. la C3 convertase clive spécifiquement le composant C3 du système du
compliment et produit une grande quantité des fragments protéolytiques C h et C3b. En plus
d'être en mesure d'initier l'activation de la voie alterne. les grands fragments C3b sont les
plus importantes opsonines. Les opsonines C3b se fixent fortement à la surface d'agents
pathogènes ou toxiques et sont reconnus par des récepteurs présents à la surface des
phagocytes (macrophages et neutrophiles), permettant ainsi une élimination plus rapide de
ces agents (opsonisation). Les fragments C3b se lient également à la C3 convertase pour
générer une autre activité enzymatique, la C5 convertase. Cette dernière clive a son tour le
composant C5 du complément et produit les kagments CSa et C5b. La production du grand
hgment C j b initie une série de réactions de polymérisation entre les composants terminaux
du système du complément (C5b et C6 à C9) qui mène a la formation d'un complexe
d'attaque membranaire. Ce complexe perfore les membranes des agents pathogènes,
entraînant ainsi leur mort par cytolyse. Finalement, la génération des peptides C3a et C5a
suite au clivage des composants C3 et CS du complément accentue grandement la réaction
infhmrnatoire. Par exemple, l'anaphyiatoxine C5a est en mesure de stimuler la libération de
d'autres médiateurs inflammatoires et de recruter et activer plusieurs types de leucocytes au
site de 1' infection par chimiotactisme.
L'anaphylatoxine C j a humaine est un petit peptide de 74 acides aminés. 1 I m a .
généré par la protéolyse de la séquence N-terminale de la chaîne u de la protéine C5 du - complément par l'activité enzymatique de la C5 convertase (Ember et Hugli, 1997). IL
présente une structure globulaire compacte due à trois ponts disulfure intramoléculaires. La
réduction de ces ponts disulfure abolit complètement son activité biologique. En plus d'une
chaîne d'oligosaccharides en position 64 qui module son activité biologique. une arginine est
retrouvée en C-terminal du peptide comme pour les autres anaphylatoxincs. Cette arginine
est absolument nécessaire pour l'activation des basophiles et des mastocytes. Une activité
enzymatique semblable à la kininase 1 (carboxypeptidase N) peut cliver cet acide aminé et
ainsi abolir l'effet du Cja sur ces leucocytes en plus de réduire significativement son activité
chirniotactique (Marceau. 1999). La séquence C-terminale du C j a dont fait partie cette
arginine est relativement bien conservée chez toutes les espèces. En effet. la séquence
WIN-Q-L-G-R représente un site effecteur caractéristique retrouvé dans la séquence du
peptide Cja de différentes espéces animales étudiées (Ember et Hugli. 1997). L'importance
de cette séquence pour l'activite biologique du C h a Cté confirmée par des essais biologiques
basés sur des fragments protéolytiques C-terminaux (Chenoweth et Hugli. 1980) ainsi que sur
des analogues synthétiques pharmacologiquement actifs de la région C-terminale du C5a
humain (Chenoweth et coll.. 1979 ; Ember et coll., 1992 ; Morgan et coll.. 1992). Ce genre
de travaux a donc permis de montrer que les peptides mimant Le domaine C-terminal du Cja
étaient de bons modèles du peptide naturel et avaient la capacité d'induire tous les effets
pharamacologiques de ce dernier, mais avec une puissance beaucoup plus faible (Drapeau et
coll., 1993). L'analogue synthétique N-acétyl-Tyr-Ser-Phe-Lys-Pro-Met-Pro-Leu-D-Ala-
kg-OH (Ac-YSFKPMPLaR) est un bon exemple d'un tel agoniste complet conçu suite a des
Ctudes plus poussées sur la relation structure-activité (Kawatsu et coll., 1996 ; Finch et coll..
1997). De plus, certaines analyses ont été effectuées dans le but d'évaluer les interactions
impliquées dans la liaison du ligand a son récepteur et du même coup, de concevoir des
peptides analogues plus puissants. Suite a ces analyses, un modéle à deux sites de liaison a
été suggéré pour expliquer la différence de puissance entre le C5a et ses analogues C-temiinal
synthétiques (Siciliano et coll., 1994). La première interaction, entre le domaine
extracellulaire N-terminal du récepteur et la partie globulaire du Cja, servirait uniquement à
la reco~aissance du récepteur ainsi qu'à la stabilité de la liaison alors que la seconde, entre
la séquence C-terminale du C5a et une région différente du récepteur. serait sufisant pour
activer le récepteur.
Le C5a est considéré comme le facteur chimiotactique majeur du système du
complément et un puissant médiateur de l'inflammation (Ember et Hugli, 1997). En tant que
tel. il semble qu'il soit izpliqué directement ou non dans plusieurs pathologies
inflammatoires comme le choc septique. En effet. il joue un rôle proéminent dans le
recrutement et l'activation de différentes fonctions leucocytaires. Les mastocytes et les
basophiles relâchent de l'histamine et d'autres messagers secondaires (enzymes. leucotnène
C,) lorsquTils sont stimulés par le C j a via leur RCja. Les leucocytes phagocytaires
(neutrophiles. monocytes/macrophages) sont également activés de plusieurs façons par le
Ch. Il provoque chez ces globules blancs des réponses chirniotactiques et chimiocinétiques.
une augmentation de la synthèse de dérivés de l'acide arachidonique (eicosanoïdes), un
relâchement de radicaux libres et de leur contenu granulaire (Ember et Hugli. 1997) et une
augmentation de leur adhérence à l'endothélium cultivé (Tonensen et coll., 1983). De plus, le
C5a augmente la synthèse de cytokines (IL-1, IL-6, Tb@-a) dans les monocytes (Schindler et
coll., 1990).
Le C5a provoque également des réponses vasculaires dans les vaisseaux sanguins
isolés de lapin (Petitclerc et Marceau, 1991) et humains (Marceau et coll.. 1990) par un
mécanisme indirect puisque les cellules endothéliales ou de muscle lisse ne posséderaient pas
de RCSa à leur surface (Marceau et coll., 1990). Des mastocytes et des macrophages
dispersés dans les tissus seraient les cibles du C5a. Une fois activés, ces leucocytes
tissulaires libéreraient d o n des eicosanoïdes (Hugli et Marceau, 1985 ; Petitclerc et coll.,
10
1996) et, dans une moindre mesure. de l'histamine et de l'oxyde nitrique (Petitclerc et
Marceau, 1991). Ces substances agiraient a leur tour sur les cellules musculaires, causant
ainsi la vasoconstriction et/ou la vasodilatation des vaisseauv sanguins. Une augmentation de
la perméabilité vasculaire après une injection de C j a est aussi explicable de la même façon
par un relâchement local d'histamine. En fait, plusieurs effets physiologiques systémiques du
C j a peuvent être expliqués par ce concept de leucocytes tissulaires ou circulants servant
d' intermédiaires.
1.6 Le récepteur du C5r
Le RCja fait partie de la grande famille des récepteurs j. sept domaines
transmernbranaires couplés a u protéines G. I l a d'abord ét6 clone à partir de cellules
humaines (Gerard et Gerard. 1991 : Boulay et coll.. 1991) puis dms quelques autres
mamrnifëres (souris (Gerard et coll., 1992). rat (Akatsu et coll., 1997 ; Sayah et coll.. 1997),
chien (Perret et coll., 1992). cobaye (Fukuoka et coll.. 1998) et différents primates (Alvarez
et coll., 1996)). 11 y a une homologie de la séquence doADN du RCja inférieure à 70% entre
les espèces animales non primates et l'humain, mais supérieure à 95% chez les primates. La
connaissance de la séquence humaine a permis la production d'anticorps polyclonauax
(Morgan et c d . , 1993) et monoclonaur< (Oppermann et coll.. 1993 ; Oppermann, 1995)
dirigés contre des épitopes du domaine N-terminal extracellulaire du RCSa. Deux anticorps
mono cl on au^, S j l l et W 17/l, définissent la région de différentiation antigénique du RC5a
humain (Oppermann, 1995). Le premier de ces anticorps cible une séquence fiche en acide
aspartique dans le domaine N-terminal extracellulaire du RC5a. Le fait que l'anticorps
monoclonal S5/1 ait été utilisé pour identifier des macrophages comme les cellules répondant
au Cja dans des lésions atherosclérotiques observées dans des aortes de lapins (Petitclerc et
coll., 1996) suggère qu'il y a une forte homologie dans la région du récepteur liant l'anticorps
entre les deux espèces. De plus, des anticorps dirigés contre le domaine N-terminal
extracellulaire du RCja ne bloquent pas la liaison d'analogues synthétiques du domaine C-
terminal du CSa, supportant un modèle a deux sites de liaison du RCSa (Morgan et coll.,
1993).
Le récepteur humain, une protéine de 350 acides aminés, présente une stnicture
génique B deux exons, la séquence codante se trouvant entièrement comprise dans le second
exon à l'exception du codon d'initiation (Sayah et coll., 1998). La présence d'un site de N-
glycosylation i l'extrémité du domaine N-terminal extracellulaire augmente le poids
moléculaire de la protéine à 4048 kDa au lieu des 39 estimés pour le peptide seul (Ember et
Hugli, 1997). Ce site n'a pas d'influence sur la liaison ou les effets induits par le Cja.
Pliisieurs informations sur la structure du RCja ont permis de mieux comprendre le r6le de
l'anaphylatoxine. Les études structure-fonction ont particulièrement été utiles dans ce sens
avec des développements comme la caractérisation des déterminants dans la séquence C-
terminale du RCja nécessaires pour I'intemalisation du complexe ligand-récepteur (Naik et
coll., 1997) ainsi que plusieurs autres éléments de structure (Ember et Hugii. 1997).
Le RCja médie les nombreu?: effets biologiques de l'anaphylatoxine Cja.
L'inactivation du gène du RCSa chez la souris est associée j. une certaine susceptibilite a u
infections pulmonaires et à une forte résistance à l'inflammation induite par des complexes
immuns (Hopken et coll., 1996 ; Hopken et coll., 1997). Ce récepteur est exprimé à la
surface de cellules de la lignée myéloïde comme les monocytes et les leucocytes
polymorphonucléaires, des cellules que le Cja cible particulièrement. Il s'agit d'un modèle
potentiel pour l'expression de gène tissu-spécifique puisqu'il y a peu de réponses biologiques
dépendantes de ce récepteur par les cellules de lignées non-rnyéloïdes (Marceau, 1996 ;
Schiefferdecker et coll., 1997). Récemment, le RCSa a toutefois été caractérisé à la surface de
plusieurs types de cellules de lignées non myéloïdes comme des astrocytes de rat cultivés
(Sayah et coll., 1997), des cellules endothéliales, des cellules de muscle lisse, des hépatocytes
et quelques autres (Sayah et coll., 1998). Cela laisse entrevoir de nouveau?: rôles du C5a dans
différents tissus de l'organisme et ouvre des portes d'intérêts pour de futurs travaux portant
sur l'inductibilité du gène du RC5a dans les cellules de lignées non myéloïdes.
1.7 Le système d'activation par contact
Le système d'activation par contact est un système peu complexe si l'on tient compte
du fait qu'il est composé de seulement quatre protéines plasmatiques. En effet, d'un côté il y
a les facteurs de coagulation XI (facteur prothromblastique plasmatique C (FPPC)) et XII
(facteur Hageman (FH)) et de l'autre la prékallikréine (PK) et le kinogène de haut poids
moléculaire (KHPM). Toutes les protéines du système de contact sont des qmogènes, - c'est-
Mire des protéases sous forme inactives. sauf le KHPM qui agit comme cofacteur non
enzymatique. Ces protiines sont incluses d'une part dans le système d'initiation de la
coagulation par la voie intrinsèque et d'autre part. dans le système kallikréine-kinines. Elles
menent donc a deux évènements fort différents: soit à la coagulation et à la formation de
peptides pharmacologiquement actifs. les kinines. respectivement (Bhoola et coll.. 1992 ;
Marceau. 1 999).
Le système de contact est activé lorsqu'il y a une rupture de l'endothélium vasculaire
afin d'empêcher une hémorragie (Marieb. 1993). Cette activation est provoquée par la mise à
nu et l'exposition des fibres de collagène sous-jacentes aux membranes basales de
l'endothélium ou par les membranes basales elles-mêmes. 11 s'agit de surfaces chargées
négativement. Or, le FH et le KHPbI possèdent des domaines chargés positivement les
amenant à se fixer à ce type de surfaces (Bhoolo et coll.. 1997). Le KHPM possède
également des domaines de liaison pour la PK et le FPPC. lui permettant donc de recruter ces
derniers au site de la lésion vasculaire. Le FH est activé spontanément lors de sa liaison à la
surface chargée négativement. Le FH activé (FHa) agit alors de trois façons : (1) en
s'autoactivant, (2) en clivant le FPPC dont l'activation permet la suite des évènements
menant a la coagulation et (3) en clivant la PK en kallikréine active. Dans ces deux derniers
cas, le KHPM sert de cofacteur non enzymatique. La kallikréine plasmatique produite
accélère l'activation du FH et clive le KHPM en kinines pharmacologiquement actives, dont
la BK, et en W o g e n e résiduel (Gihan et coll., 1990 ; Bhoola et coll., 1992). Toutes ces
réactions sont schématisées à la figure 3. Le système de contact peut égaiement être activé
dans certaines situations pathologiques, comme ion d'une inflammation causée par la
CC,
5 L
A II
présence de LPS, une endotoxine, dans le sang ou in vitro par différents composés chimiques
tel le kaolin (Raymond et coll., 1995).
La BK, principalement, peut également être produite en dehors du contexte du
système d'activation par contact. Les kininogènes, synthétises principalement dans le foie.
sont les précurseurs de la BK puisqu'ils contiennent sa séquence dans leur structure primaire.
Deux types de kininogènes sont retrouvés dans le plasma en raison de l'épissage aitematif
d'un même gène, l'un de haut et l'autre de bas poids moliculaire (KBPM), ce dernier étant le
plus abondant. Toutefois, comme mentionné plus haut, seul le KHPM fait partie du système
d'activation par contact. Les kinines sont donc produites à partir de ces deuv précurseurs à la
suite de l'action de deuv protéases spécifiques. les kallikréines. Ces dernières sont
synthétisées et stcrétées par plusieurs tissus. La kallikréine plasmatique circule dans le sang
en complexe avec son substrat. le KHPM. qui est clivé lorsque la kallikréine est activée par le
FH pour ne former que de la BK. Cette protéase n'agit pas sur le KBPLL (Gilman et coll.,
1990 : Bhoola et coll.. 1992 ; Mombouli et Vanhoutte. 1995). La kallikréine tissulaire hK1
est sécrétée sous forme de zymogène (prokallikréine) par les leucocytes. les celiulrs rénales
ou glandulaires. Une séquence de sept acides amines (dite d'activation) doit Stre clivée d i n
d'activer la kallikréine tissulaire. L'enzyme responsable de cette activation in vivo n'est pas
connue quoique plusieurs protéases sont en mesure de la provoquer in vitro. La kdlikréine
tissulaire qui, contrairement à la kallikréine plasmatique. a une action plutôt locale. se charge
de cliver les deuv types de kininogènes en dehors du contexte du système de contact. Elle
produit ainsi de la kallidine (Lys-BK) a partir de l'un ou l'autre de ces substrats (Margolius,
1995). Les évènements menant à la génération des kinines pharmacologiquement actives
sont représentés B la figure 3. Le clivage des KHPM produit environ 20% de la BK dors que
celui des KBPM produit les 80% restant (Marceau, 1999). D'autres protéases peuvent
également agir sur les kininogènes, quoiqu'il en résulte des peptides inactifs seulement.
1.8 La bradykinine
La BK (~rg'-Pro'-Pro~-~ly'-Phe~-~er~-~ro'-Phe%4$) dont la structure est en partie
présentée à la figure 4, est un puissant agent vasoactif peptidique de neuf résidus d'acides
aminés résultant du clivage de présurseun de haut poids moléculaire par des protéases
spécifiques. Le temps de demi-vie des kinines dans les liquides biologiques est extrèmernent
court (15 à 30 secondes) en raison de leur inactivation par de nombreuses kininases
(Margolius, 1995). C'est pourquoi la BK est considérée comme une hormone à action locale.
Les kininases les plus importantes ainsi que leurs sites de clivage sur la BK sont présentés à
la figure 3. L'enzyme de conversion de l'angiotensine (ECA), aussi appelé kininase II. est la
kininase dégradant la plus grande proportion de BK (et de kallidine) en peptides inactifs, en
BK,., et en BK,., sucessivement. Elle se retrouve surtout à la surface des cellules
endothéliales des vaisseaux sanguins et à M a t de trace dans le plasma (Bhoola et coll..
1992 ; Rlombouli et Vanhoutte. 1995). Plusieurs inhibiteurs de I'ECA sont utilisés comme
midicaments. dont le captopril (Igic et c d . . 1972). à des fins expérimentales mais aussi
thérapeutiques. Quelques autres enzymes, comme l'endopeptidase neutre (EPN) et
I'aminopeptidase P (APP), peuvent également dégrader les kinines en peptides inactifs. Une
voie de dégradation particulière, la voie de la kininase 1, mène a la formation de métabolites
actifs des kinines, soit la des-&g9-BK et la des-~rg'O-kallidine. par le clivage de l'arginine.
Ces métabolites agissent préférentiellement sur un autre récepteur que celui stimulé par la
BK, le récepteur B, des kinines (Marceau et c d . , 1998). Les carboxypeptidases LI (CPM) et
N (CPN), largement présentes lorsqu'il y a inflammation, sont responsables de cette action.
La première se retrouve au niveau des membranes plasmiques des cellules endothéliales alors
que la seconde circule dans le plasma. De plus, il y a une enzyme retrouvée dans le plasma
comme à la surface des cellules endothéliales, I'aminopeptidase M (APM), qui hydrolyse la
lysine de la Lys-BK et de la ~ y s - d e s - ~ r ~ ~ - B K pour produire de la BK et de la des-kg9-BK
(Bhoola et coll., 1992 ; Mornbouli et Vanhoutte, 1995). L'amastatine est un composé
chimique inhibant sélectivement cette peptidase (Proud et coll., 1 987).
La BK induit plusieurs effets physiologiques complexes. Les fonctions précises de ce
peptide sont difficiles à cerner en raison de cette complexité. L'étude du rôle du système
kallikréine-kinines dans certaines pathologies (hypertension, diabète ...) permet de mieux
définir les fonctions physiologiques de la BK (Margolius, 1995). La BK exerce donc
plusieurs propriétks pharmacologiques reconnues. Tout d'abord. l'un des rôles de la BK
apparaît au cours d'une réaction inflammatoire puisqu'elle reproduit les quatre symptômes
majeurs d'une réaction inflammatoire. Par exemple. ce peptide vasoactif augmente la
perméabilité capillaire, aidant ainsi à la production d'oedème. De par cet effet de la BK. les
kinines ont donc un rôle actif à jouer dans plusieurs pathologies inflammatoires comme
I'angioedérne héréditaire (Proud et Kaplan, 1998). La douleur est provoquée lorsque les RB2
des kinines présentes a la surface de terminaisons nerveuses sont stimulées par la BK. Ce
peptide est également un puissant vasodilatatrur dans plusieurs organes et vaisseau. sanguins
(muscles. reins. vaisseaux sanguins coronaires et cérébraux ...) par un mecanisme direct ou
indirect impliquant les cellules endothéliales vasculaires. Lorsque ces dernitires sont
stimulées par la BK. elles relâchent des prostaglandines et de l'oxyde nitrique (NO) qui
agissent à leur tour sur les cellules de muscle lisse pour provoquer la vasodilatation. Les
cellules de muscle lisse sont également directement ciblées par la BK. D'un autre côté, In BK
peut également promouvoir la contraction de grosses artères et de la plupan des veines in
vivo ou de différentes préparations de muscle lisse in vitro, comme par exemple la veine
jugulaire isolée de Iapin. Cet agent vasoactif participerait donc à la régulation de In pression
sanguine et de la circulation locale ainsi que de la fonction rénale en influençant la
composition et le volume de l'urine (effet diurétique et natriurétique des kinines). Il s'agirait
peut-être du r d e physiologique le plus important de la BK (Margolius, 1995). Des études
réalisées dans un modèle de souris déficiente pour le gène du RB2 suggèrent et appuient
l'existence d'un rôle préventif du système kallikréine-kinines dans l'hypertension reliée à une
fonction rénale défaillante (Alfie et coll., 1996). Finalement, la BK peut influencer quelques
fonctions cellulaires comme la prolifération cellulaire ou le relâchement de seconds
messagers (Gilman et coll., 1990 ; Bhoola et coll., 1992).
1.9 Le récepteur B,
C'est par le RB2 des kinines que la BK induit la plupart de ces différents effets
biologiques. Le RB, fait partie de la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G.
11 est retrouvé de façon constitutive à la surface de plusieurs types de cellules mais
particulièrement dans les systèmes cardio-vasculaire et rénal. Ce récepteur se distingue du
récepteur Bi des kinines par une série de critères phnmncolopiqiies et génétiques (Marceau et
col]., 1998). L'un de ces critères correspond au fait que la BK possède plus dYaffinité pour le
RB2 que son métabolite des-A-~'-BK.
Le RB, a été le sujet d'efforts considérables pour le développement de rnkkunents.
particulièrement d'antagonistes peptidiques dont la séquence est basée sur la BK (Rhaleb et
coll., 1991 ; Hock et coll., 199 1 ; Trifilieff et coll.. 1993) ou de composés non peptidiques
(Sa~vutz et coll., 1994 ; Aranori et coll., 1997a : Pruneau et coll., 1999 ; Altamura et coll.,
1999). Des peptides modifiés, des pseudopeptides et des composés non peptidiques ont
igalement été diveloppés comme agonistes (inamura et coll., 1994 : Aramon et coll., 1997b).
La structure de cenains de ces composés peut Stre observée à la figure 4. 11 est à remarquer
que la structure de l'extrémité C-terminale de la BK est présentée sous une conformation
favorisée par la proline (,&wn) et postulée pour n'exister que lorsque l'antagoniste se fixe au
RB?. Plusieurs autres conformations sont possibles. particulièrement en solution aqueuse.
Historiquement, les ligands du RB, ont été conçus dans l'espoir de figer le pturn favorisé par
la proline en créant un encombrement stérique à l'aide de résidus artificiels tels D-Tic et Oic,
comme c'est le cas pour l'icatibant (Hock et coll., 1991) et le NPC 1773 1 (Trifilieff et coll.,
1993), ou en fermant de f a ~ o n covalente le cycle de 7 atomes produit par le Pturn (en tenant
compte du pont hydrogène), comme c'est le cas pour le composé 9 (Dziadulewicz et coll.,
1999).
L'exploitation de l'antagoniste peptidique icatibant (HOE 140 ; D-Arg [Hyp3, Thi5, D-
~ i c ' , 0ic8]-BK), un composé résistant au métabolisme, a permis de documenter le rôle des
kinines dans l'autorégulation de la circulation, la régulation de la pression sanguine et les
effets thérapeutiques des inhibiteurs de L'ECA, particulièrement dans les études cliniques
(Groves et coll., 1995 ; Gainer et coll., 1998). L'icatibant est donc un outil phamacologique
efficace pouvant être utilisé dans plusieurs espèces de marnmiTeres. La nature compétitive de
cet antagoniste est observée dans les cellules et tissus humains mais. de façon surprenante.
cette caractéristique varie parmi les espèces étudiées. Ainsi, I'icatibant exerce un effet non
compétitif et peu réversible dans des essais biologiques basés sur la contractilité de la veine
jugulaire isolée de lapin (Rhaleb et coll., 1992). En plus d'être qualifiçe de non compétitive,
l'interaction de cet antagoniste avec le RB, est considérée non équilibre puisque les
récepteurs semblent étre inactivés d'une façon dipendante du temps en présence de
I'icatibant (Marceau et coll., 1994). Le fait que I'icatibant soit compçtitif et réversible dans
d'autres espèces de manmiEres étudiées et que plusieurs autres antagonistes peptidiques ou
non peptidiques du RBI le soient également dans la veine jugulaire isolCe de lapin suggère
que ce type d'interaction est diterminé à la fois par les structures de l'antagoniste et du
récepteur (Rhaleb et coll.. 1991 ; Marceau et coll., 1994 : R i a i et coll.. 1997).
Une petite paranthèse doit d'être ouverte ici pour définir les diffirents types
d'antagonisme pouvant être rencontrés expérimentalement. Tout d'abord, un antagoniste est
un médicament qui, en se liant à un récepteur, empêche la réponse induite par une certaine
concentration d'un médicament agoniste agissant su ce même récepteur. Les antagonistes
sont qualifiés de compétitif ou de non compétitif selon qu'ils interagissent ou non avec le
même site de liaison du récepteur que les agonistes. Un antagoniste compétitif pur ne
déplace la courbe concentration-effet d'un agoniste que vers la droite alors que le non
compétitif ne fait qu'abaisser l'effet maximal de I'agoniste. Un antagoniste peut également
eue qualifié d'incompétitif s'il peut se lier au récepteur alon que I'agoniste y est déjà fixé.
Ces ligands sont ensuite considérés comme surmontables si un excès d'agoniste permet
d'observer l'effet maximal que ce dernier induit ou insurmontables dans le cas contraire.
Finalement, les antagonistes sont réversibles (ou équilibre) lorsque leur effet s'estompe
rapidement dans le temps et peu réversibles ou irréversibles (ou non équilibre) si leur effet
persiste dans le temps même lorsque le médicament est retiré de la réaction. Dans le premier
cas, la courbe concentration-effet de l'agoniste revient à la normale lorsque le médicament
antagoniste est retiré de la réaction alors que dans le second, l'effet maximal n'est pas rétabli
malgré l'absence de l'antagoniste (Kenakin, 1993 ; Page et coll., 1999). Les bases
moléculaires de l'antagonisme non compétitif et irréversible ne sont toujours pas connues.
Malgré le fait que les séquences primaires des génes du RB, clonés chez le lapin et
l'humain présentent 83% d'identité, ils different par leur interaction avec l'antagoniste
icatibant. Cette différence est observke par l'analyse de la courbe de Scatchard de la liaison
de la BK tritiée. La préincubation des cellules exprimant le RB? 6 leur surface à 0°C en
présence de l'antagoniste a provoquée la perte de plusieurs récepteurs de la réaction sans
toutefois changer l'affinité apparente des sites de liaison spécifiques restants (Bachvarov et
coll.. 1995). Un autre indice sur la nature de l'interaction entre l'icatibant et son récepteur
cible a éti noté récemment. En effet. une diminution de l'abondance du RB2 dans différents
tissus de lapins traités in vivo avec plusieurs doses de l'antagoniste sur une période de 48 h a
eté observée. Cette diminution est également observée dans la veine jugulaire par
immunohistochimie (Marceau et coll.. 1999). Ainsi. une faible réversibilité de la. liaison
médicament-récepteur n'est peut-être pas suffisante pour expliquer le comportement non
équilibre observé de l'icatibant. Une forme d'intemalisation du récepteur induite par
l'antagoniste peut être envisageable dans ce système puisque l'internalisation de récepteurs
couplés aux protéines G suite à la liaison d'un antagoniste a dijà été observé dans d'autres
systèmes (Roenger et coll., 1997 ; Pfeiffer e t coll., 1998). La séquestraticn, ou
l'intemalisation, du RB2 dans les caveolaes suite à la stimulation de l'agoniste BK est déjà
très bien connue (de Weerd et Lreb-Lundberg, 1997 ; Haasernann et coll., 1998). D'ailleurs.
des déterminants structuraux du domaine C-terminal (résidus des acides aminées sérine,
thréonine, tyrosine) ont été décrits comme cruciaux pour les évènements de phosphorylation
et d'intemalisation des RB2 (Prado et coll., 1997 ; Faussner et coll., 1998 ; Pizard et coll.,
1999).
1.10 Les objectifs de ces études
1.10.1 Le récepteur du C5a
Le RCSa semble être impliqué dans plusieurs pathologies inflammatoires. 11 a
maintenant été cloné chez plusieurs espèces de mammifères, mais pas encore chez le lapin.
Une forte homologie de séquence existe entre les séquences des différentes espèces étudiées.
De nombreuses études sur la relation structure-activité de ligands de ce récepteur ont été
effectuées afm de concevoir des peptides basés sur le domaine C-terminai du C j a et mimûnt
les effets biologiques de ce dernier. De plus. l'élucidation de la structure du récepteur
humain a permis de produire des anticorps, dont les anticorps monoclonaux SS/1 et W lVl,
dirigés contre des Cpitopes de la séquence rxuacellulaire N-terminale de la molécule
(Oppermann et coll.. 1993).
Considérant que le lapin est l'animal de laboratoire non primate le plus près de
l'humain génétiquement (Graur et coll.. 1996 : Penny et Hasegawa. 1997). il semble tout à
fait pertinent d'utiliser ce mammifëre comme modèle. Le clonage de son RCja est donc
primordial pour en faire une première caractirisation. Dans ce contexte, nous avons entrepris
de cloner le RCja de lapin afin d'établir et de comparer ses profils pharmacologique et
antigénique à c c u du récepteur humain. De plus, nous avons validé l'utilisation du peptide
synthétique Ac-YSFKPMPLaR (Kawatsu et coll., 1996 ; Finch et coll., 1997) et d'un
anticorps monoclonal, S5/1 (Oppemann et coll., 1993 : Oppemann, 1995), pour l'étude du
RC5a de lapin. Ainsi, notre étude définit un ensemble d'outils moléculaires (séquence clonée
du RCSa de lapin, peptide synthétique, anticorps monoclonal) permettant l'étude du rôle du
C5a et de l'expression régulée de son récepteur dans des modèle physiologiques et
pathologiques (athérosclérose, inflammation) basés sur le lapin comme modèle animal.
1.10.2 Le récepteur B,
Le RB2 des kinines a maintenant été cloné chez plusieurs espèces de mammiferes,
dont le lapin. Quoique ces molécules de récepteur présentent une bonne homologie dans leur
séquence en acides aminés, quelques différences sont observées quant aux interactions des
agonistes et des antagonistes avec ces RB?. Le peptide icatibant est un exemple extrême de
ce genre de différences. En effet. dans des essais hklogiques basés sur des rissus,
principalement des vaisseaux sanguins. isolés des différentes espèces de mammiferes
Çtudiées, I'icatibant est un antagoniste de nature non compétitive et non iquilibre
(insurmontable) chez le lapin (Rhaleb et coll.. 1993). un antagoniste compétitif et
surmontable chez I'humain (Marceau et coll.. 1994) alors qu'il est un agoniste chez le
mouton (Félétou et coll.. 1994). De plus. dès antagonistes peptidiques structurellement
apparentés à I'icatibant présentent des caractéres différents de ce dernier. Les bases
structurales de telles différences majeures dans l'interaction de I'icatibant avec différentes
molécules de RB2 impliquent certainement la structure générale du médicament et la structure
primaire du récepteur. Certains indices laissent également croire que le comportement
irréversible, ou peu réversible, d'un antagoniste comme l'icatibant pourrait être expliquable
par une forme d'intemaiisation du RB, induite par la liaison du médicament.
Dans ce contexte, nous avons entrepris d'investiguer. par des essais biologiques
impliquant la veine jugulaire isolée de lapin, la nature de la liaison (compétitive ou non.
réversible ou irréversible) d'un peptide structurellement relié à l'icatibant. !- P C 1773 1 (D-
~rg[Hyp', D-~yp~(trans-propyl)', 0ic8]-BK), d'un composé chimique non peptidique
reproduisant la séquence C-terminal de l'icatibant, le composé 9, et finalement, d'un autre
composé chimique non peptidique, le LF 16.0687 (Pruneau et coll.. 1999). Dans le but
d'identifier les évènements suivant la liaison de l'un ou l'autre de ces antagonistes au RB,
pouvant Sue reliés au comportement pharmxologique de ces derniers
(intemalisation/séquestration), nous avons construit et transfecté dans des cellules de
marnmifëres un vecteur exprimant un RBL de lapin auquel est lié h son extrimité C-terminale
la GFP (green flirorescent protein). D'autres groupes ont d6ji utilisés cene approche afin
d'étudier la distribution subcellulaire de certaines protéines réceptrices sous diffërentes
conditions (Bank et coll.. 1997). Après avoir caractérisé la pharmacologie de ce récepteur
modifié, nous avons utilisé la microscopie confocale afin de visualiser et de comparer
l'intemalisation du RB,-GFP induite par la stimulation de l'agoniste BK et tout autre
événement (séquestration ou intemalisation particï!lerement) provoquée par la liaison de l'un
ou l'autre des antagonistes étudiés. Ainsi. nos travaux permettent d'identifier des
antagonistes pour le RB, de lapin ayant un comportement pharmacologique plutôt rare. non
compétitif et irréversible, et d'investiguer les bases moléculaires encore mal comprises de ce
comportement. Le système développé du RBI-GFP exprimé dans un système hétérologue
permettra certainement d'évaluer les voies de signalisation empruntées par un tel antagoniste.
qu'elles soient semblables ou différentes de l'agoniste.
2.1 Le récepteur de lapin pour le CJa
2.1.1 Isolation de clones génomiques contenant le gène de lapin pour le récepteur du
C5a
Un fngment d'ADN spécifique au RCja humain a été généré par PCR en utilisant
comme patron de l'ADN génomique humain. Les oligodéoxynucléotides sens et antisens qui
ont été utilisés pour ce PCR (Y-AATGCCCTGGTGGTCTGGGTGCA-3' et 5'-
CTACACTGCCTGGGTCTTCTGGG-3') correspondent respectivement aux nucléotides 163
3. 185 et 103 1 h 1052 de la séquence codante du RCSa humain (Gerard et Gerard. 199 1). Le
Fragment d'ADN amplifié par PCR (890 pb) a ensuite été purifié sur gel et cloné dans le
vecteur de clonage TA (Invitrogen). La séquence nucleotidique de cet insert est identique à
la séquence publiée de I'ADNc du RCja humain, du nucléotide 163 au nucliotide 1053
(Gerard et Gerard, 199 1).
Le fragment d'ADN obtenu par PCR, correspondant à une partie de la séquence
codante du RCSa humain, a été marqué au "P (New England Nuclear) puis utilisé pour
cribler à trois reprises (afin d'obtenir un clone positif bien defini) une banque A d'ADN
génomique de lapin (Clontech). Environ un million d'unités formatrices de plages de lyse
ont ainsi été criblées sur des membranes de nylon Hybond-N (hersham). L'hybridation a
été effectuée a 6j°C, pour la nuit, dans la solution d'hybridation (SSC (6X ; 20X : NaCl (3
M) et citrate de sodium (0.3 M pH 7.0)), solution de Denhardt (5X ; lOOX : a 1 b u . e sérique
bovine (Z%), Ficoll (2%) et polyvinylpirrolidone (2%))' SDS (0.5%), ADN de sperme de
saumon (100 pg/ml) et sonde marquée (1 x 10' cpdml)). Les membranes ont par la suite été
lavées deux fois a la température de la pièce dans une solution de SSC 2X puis dans une
solution de SSC 1X et SDS 0.1% a 6YC. Finalement, les membranes ont été exposées a des
films radiographiques. Les clones positifs identifiés sur les f i s suite à leur développement
et leur analyse qualitative ont été clivés avec différentes enzymes de restriction. Suite à un
transfert de type Southem, les hgments de restriction ont été hybridés avec la même sonde
marquée qu'auparavant. Les fragments positifs ont alors été sous-clonés dans le plasmide
pBluescnpt KS (+) (Stratagene). La séquence des insens a été déterminée dans les deux
orientations afm de confirmer la bonne insertion de la séquence clonée du gène du RCja de
lapin à l'intérieur du plasmide.
2.1.2 Expression de llADNc cloné du récepteur de lapin pour le C5a dans des cellules de
mammifères
La région codanre de 1'ADNc du RCja de lapin a été amplifiée par PCR à l'aide
d'oligodéo~ynucléotides spécifiques contenant le codon d'initiation de la traduction ATG et
des sites additionnels de clivage pour l'endonucléase de restriction EcoRl (5'-
CGGAATTCATGGCGCCCATGGAAAATAGCAC-3' et 5'-
GCGMTTCTCACACCGCTTGGCACTTG-3'). Le fragment d'ADN généré a été sous-
cloné dans le si te de restriction EcoRi du vecteur d'expression pS FFV-neo ( Fuhlbri,g e et
coll., 1988). Le vecteur pSFFV-neo, dans lequel est inséré la région codante de 1'ADNc du
RCja de lapin, a alors été trmsfecté de façon stable dans des cellules RBL-2H3 à l'aide du
réactif de transfection SuperFect (Qiagen). Les cellules ont ensuite été cultivées pendant dix
jours dans un milieu DMEM contenant du sérum de veau foetal (10%) et l'antibiotique GJI 8
(800 pg/ml ; Life Technologies) afin de sélectionner les clones résistants à cet antibiotique.
Les cellules ayant été transfectées de façon stable avec le vecteur exprimant le RCSa cloné de
lapin ont par la suite été maintenues dans un milieu DMEM contenant du sérum de veau
foetal (10%) et du G418 (300 j.~g/mi).
La région codante de I' ADNc du RC5a de lapin, insérée dans le vecteur d'expression
pcDNA3, a également été transfectée de façon transitoire dans des cellules HEK 293 par la
méthode du phosphate de cakium. Ces cellules ont été cultivées dans un milieu a-MEM
contenant du sénun de veau foetal (5%), du sérum de cheval (5%) et de la pénicilline et
streptomycine (~Yo) .
2.1.3 Immunohistochimie
Cette expérience a été produite afin de confirmer la présence de RCSa recombinant de
lapin à la surface de cellules HEK 293 transfectées de façon transitoire avec le vecteur
pcDNA3 exprimant ce récepteur. Deux anticorps monoclonauv (SY 1 et W 17/1) (Oppemann
et coll., 1993 ; Oppermann et coll., 1995) dirigés contre la séquence N-terminale du RCja
humain ont été utilisés pour détecter les RCja de lapin, exogènes nu endogènes, à la surface
de ces cellules ou dans des sections de rate de lapin (dilution des deuv anticorps primaires 1 :
100). Des cellules HEK 293 non transfectées ont servi de contrôle négatif. La liaison des
anticorps primaires aux RCja de lapin a été mise en ividrnce grâce à un anticorps de chèvre
anti-1gG de souris couplé à la peroxidase de raifort (dilution de l'anticorps secondaire 1 :
100 ; Sigma) qui permet de colorer les sites de liaison specifiques suite à une réaction de 30
min a 37°C avec son substrat CN/DAB. auquel a été ajout6 du chlorure de nickel pour
augmenter le contrasre (Petitclerc et coll.. 1996). Les résultats de I'immunohistochimie ont
finalement été visualisés a l'aide d'un microscope confocal BioRad 1024.
2.1.4 Synthèse d'un analogue de 13 séquence C-terminale du C5a humain
Un analogue de la séquence C-terminale du C5a humain a Cté synthétisé par une
méthodologie en phase solide afh de documenter un profil pharmacologique préliminaire des
RCSa de lapin. Les procédures générales pour la synthèse, la purification et l'analyse du
peptide synthétisé ont été décrites précédemment (Boulanger et coll.. 1996). Le peptide
synthétisé, N-acétyl-Tyr-Ser-Phe-Lys-Pro-Met-Pro-Leu-D-AlaArg-OH (Ac-
YSFKPMPLaR), est un agoniste des RCSa déjà rapporté dans la littérature (Kawatsu et coll.,
1996 ; Finch et coll., 1997). Selon certaines données décodant de son utilisation dans divers
essais biologiques, dont certains impliquant des ~ U C O C ~ ~ ~ S humains, il devrait conserver de 2
a 10% de la puissance du C5a humain. Ce peptide a par après été utilisé in vitro
(vasomotricité) et in vivo (neutropénie aiguë) afin d'estimer son effet et sa puissance sur les
RCSa retrouvés à la surface de cellules de lapin et comme compétiteur lors d'essais de liaison
de C5a humain marqué a l'iode aux RCja de lapin recombinants exprimés par les cellules
RBL-2H3 transfectées de façon stable.
2.1.5 Essais de liaison
Les essais de liaison ont été effectués afin de vérifier la présence de RCja
recombinants de lapin fonctionnels à la surface de cellules RBL-2H3 transfectées de façon
stable avec le vecteur pSFFV-neo codant pour ces récepteurs et pour évaluer I'dfinité et la
puissance du C5a humain ainsi que de son analogue synthétique (Ac-YSFKPMPLaR) pour
ces récepteurs. Le peptide C j a a été isolé de plasma humain comme décrit ailleurs (Hugli et
coll.. 1981). L'iodation du C h humain avec du Iz5[ a éte effectuée par la méthode Iodobead
comme indiqué par le manufacturier (Pierce). L'activité spécifique moyenne du C h humain
marqué était d'au moins 356 Ci/mmol. Pour les essais de liaison. 2 nbl de "'1-~5a ont été
ajoutés à 5 - 10 x 10' cellules RBL-2H3 transfectées de façon stable avec I'ADNc du RCSa
de lapin dans 100 pl de tampon de liaison (solution saline équilibrée de E d e contenant 0.5%
d'albumine sérique bovine, pH 7.35)' en présence ou non de l'un des compétiteurs non
marqués (C5a humain (10- '~ - 1 O4 M) ou le peptide analogue synthétique (7 x 10" - 1.2 x 10"
M)). Les suspensions de cellules ont alors été incubées sur glace pendant 60 min. La C5a
marqué non lié a ensuite été séparé des cellules à travers une couche de 100 pl d'huile de
phtalate par une centrifugation dans des tubes de polyéthylène de 500 pl. Le bout des tubes.
contenant les cellules et le C ja marqué lié aux RCja recombinants de lapin, a Çté coupé et la
radioactivité s'y trouvant a été mesurée dans un compteur gamma (Packard, Cobra
Autogamma). A l'aide du logiciel P r i m (Graphpad), une analyse de régression non linéaire
a été utilisée pour déterminer le IC, des compétiteurs.
2.1.6 Études de contractilité sur des viisseaux sanguins isolés de Iapin
Les artères pulmonaires et les veines portes de lapin ont été isolées de lapins albinos
New Zealand White. Les animaux ont été sacrifiés, selon les directives approuvées par le
comité d'éthique institutionnel, par asphyxie dans une chambre à CO,. Les vaisseaux
sanguins ont alors été prélevés et déposés dans une solution de Krebs (concentration en mM :
NaC1(117.50), NaHCO, (25.00), D-glucose (5.50), KC1(4.70), CaCI, (2.50), KH,PO, (1 20)
et MgSO, (1.18)) oxygénée (95% 0,: 5% COJ. L'excès de tissus adipeux et conjonctifs a
été retiré avant de découper de façon hélicoïdale les vaisseaux sanguins. Les tissus ont
ensuite été suspendus dans les bains à organes isoles de 5 ml, contenant la solution de Krebs
oxygénée et maintenue à 37*C, sous une tension de base de 1 g pour les artères pulmonaires
et de 0.5 g pour les veines portes pour une période d'équilibration de I h. Les changements
isométriques dans la tension des différentes bandelettes provoqués par l'addition d'agents
pharmacologiques dans la solution de Krebs ont étC détectés et enregistrés à l'aide de
transducteurs isométriques (modkle 52-9545. Harvard Bioscience).
Ces expériences ont Cté effectuées afin d'évaluer La puissance du peptide synthétique
mimant la sCquence C-terminale du C h humain (Ac-YSFKPMPLriR) par rapport au Cja
recombinant humain sur l'artère pulmonaire et la veine porte isolCes de lapin. La stimulation
des RCja présents dans ces vaisseaux sanguins par un agent chirniotactique tel le C h mène
principalement à une relaxation des tissus (Hugli et Marceau, 1985). Ces tissus ont donc ét6
préalablement contractés avec une concentration submzuximale de phénylephrine (500 nibi)
pendant 10 à 30 min (le temps requis pour atteindre un plateau de contraction) avant de les
stimuler avec l'un ou l'autre des agonistes des RCja (Drapeau et coll., 1993). Les effets du
C k recombinant humain (0.1, 1 et 10 nM) ou du peptide analogue (10, 100. 1 O00 et 10000
nM) ont été testés jusqu'a quatre fois dans une même expérience, à des intervalles de 90 min,
avec plusieurs lavages des tissus entre chaque stimulation. Les résultats sont exprimés en
pourcentage de la relaxation du plateau induit par la phényléphrine.
2.1.7 Essai de neutropénie aiguë in vivo dans le lapin
L'essai de neutropénie aiguë a été effectué dans le but d'évaluer la puissance et les
effets du peptide andogue Ac-Y SFKPMPLaR lorsqu' il est injecté directement dans le lapin
et de comparer ces résultats avec ceux déjà obtenus pour le C5a recombinant humain
(Drapeau et coll.. 1993). Cet essai in vivo est basé sur la chute rapide des neutrophiles
circulants suite à une injection de C5a agissant sur ses récepteurs se trouvant à leur surface.
Ce phénomène est expliqué par une adhérence temporaire de ces globules blancs aux parois
des vaisseaux sanguins, suivi par une leucocytose (Kajita et Hugli, 1990 ; Drapeau et coll.,
1993). Les effets hématologiques de l'analogue du C5a ont donc été évalués sur des lapins
blancs albinos New Zealand conscients (2.69 + 0.10 kg, n = 17), d'un sexe ou de l'autre. Des
échantillons de sang artériel ont été obtenus par une petite incision de l'artère c e n a l e de
l'oreille. sous anesthésie locale (lidocaine 3%). avant et 5 min après l'injection de l'analogue
du CSa humain (2.5, 10, 25. 100 ou 250 pg) ou de saline afin de faire le décompte des
globules blancs (dans un hématimètre, après la lyse des érythrocytes dans de l'acide acétique
1%) ainsi qu'un décompte diffiirentiel des leucocytes (suite à une coloration de Wright sur
des Frottis sanguins). Les résultats des dticornptes des leucocytes sont exprimés en
pourcentage de la valeur de base (les décomptes 5 min avant l'injection du peptide
synthétique) pour les neutrophiles et les lymphocytes, les autres types de globules blancs
&nt rares dans la circulation ~ér i~hér iaue du lapin (Weisbroth, 1974).
2.2 Le récepteur B, de lapin
2.2.1 Études de contractilité sur la veine jugulaire isolée de lapin
Les veines jugulaires de lapin ont été isolées de lapins albinos New Zealand White.
Les animaux ont été sacrifiés, selon les directives approuvées par le comité d'éthique, par
asphyxie dans une chambre à CO,. Les veines jugulaires ont alors été prélevées et déposées
dans une solution de Krebs oxygénée (95% O2 : 5% COJ. L'excès de tissus adipeux et
conjonctifs a été retiré avant de découper de façon hélicoïdale les vaisseauu sanguins. Les
tissus ont ensuite été suspendus dans des bains à organes isolés de 5 ml, contenant la solution
de Krebs oxygénée et maintenue à 37T, sous une tension de base de 0.5 g. Les changements
isornétriques dans la tension des bandelettes de veine jugulaire provoqués par l'addition
d'agents pharmacologiques dans la solution de Krebs ont été détectés et enregistrés à l'aide
de transducteurs isométriques (modèle 52-9545, Harvard Bioscience). Du captopril (1pM),
un inhibiteur de I'ECA, a été ajouté dès le début de la période d'équilibration de 1 h des
vaisseaux sanguins, puis en continu tout au long de l'expérience afin de potentialiser l'effet
de la BK sur les RB, présents dans les veines jugulaires en prévenant sa dégradation par la
préparation tissulaire (Marceau et coll., 1994).
Ces travaux ont éti effectués pour étudier la nature de l'interaction et la spécificité de
trois antaeonistes - des RB, présents dans ces préparations de muscle lisse vasculaire. Ainsi.
chaque tissu a été sujet à la construction de trois courbes complètes concentration-effet
cumulatives (1, 3 et 6 h) de la BK (0.25 à 10000 nM) ou de l'histamine (0.3 6 100 pM), un
agoniste des récepteurs H, utilisé comme ternoin de spçcificité. La courbe construite à 1 h a
servi de contrôle interne pour chaque tissu (absence d'antagonisre dans le milieu
d'incubation). La courbe de 3 h a été constmite en présence de I'un des antagonistes des
RB?. soit le LF 16.0687 (50 ou 100 M). le NPC 1773 1 ( 1 ou 3 nM). l'icatibant (3 ml) ou le
composé 9 (3.4 ou 34 PM), ajouté au milieu d'incubation 30 min auparavant. Finalement,
afin d'kvaluer la réversibilité des antagonistes. la construction de la courbe de 6 h a été
effectuée suite à de nombreux lavages des tissus avec une solution fraîche de Krebs. Les
résultats de ces expériences de contractiliti sont exprimes en pourcentage de la réponse
maximale enregistrée lors de la construction des courbes témoin ( I h) de chaque tissu..
2.2.2 Construction du vecteur exprimant In protéine de fusion RB, de lapin - GFP
En utilisant comme gabarit le RB, de lapin cloné dans le vecteur d'expression
pcDNA3 (Bachvarov et coll., 1995), la séquence codante complète du @ne (excluant le
codon stop) a été amplifiée par PCR. Les oligodéoxynucléotides sens et anti-sens qui ont été
utilisés Pour cette amplification sont respectivement, 5'-
GAACA4GCTTGAAATGCTCAACATCAC-3' et 5'-
TGATGGATCCCTGTTTGTTCCTCGTCCACTC-3'. Ces oligos cont ie~ent des séquences
additionnelles (soulignées) correspondant à des sites de clivage pour les enymes de
restriction HindIII et BumHI. Ces sites de restriction ont servi au clonage directionnel du
RB, de lapin dans le vecteur d'expression eucaryote pEGFP-N3 (Clontech Laboratones Inc.),
un vecteur codant pour un variant de la GFP. La séquence codante du RB? de lapin amplifiée
par PCR et le vecteur pEGFP-N3 ont donc été digérés par les enzymes de restriction HindiII
et BamHI et liés ensemble à l'aide de la ligase 6 ADN du phage T4. Le vecteur résultant,
codant pour la protéine de hsion RB2-GFP, contient la séquence codante du RB, de lapin
avec en phase de lecture avec la séquence codante de la GFP à son extrémité carboxy-
terminde, le tout sous le contrôle du promoteur fort du cytomégalovirus. Ainsi, dans cette
construction, le RBI de lapin conserve dans son domaine C-terminal les déterminants
structuraux majeurs proposes pour la phosphorylation et l'intemalisation du récepteur
induites par un agoniste (Prado et coll., 1997 ; Faussner et coll.. 1998 ; Pizard et coll., 1999).
2.2.3 Expression de la protéine de fusion RBI de lapin - GFP dans des cellules de
mammifères
Des cellules COS-1 ont été ensemencées et cultivées dans des plaques de douze puits
jusqu'ê une confluence de 70% dans un milieu DMEM contenant du sérum de veau foetal
(10%) et de la pénicilline et streptomycine (1%). Elles ont ensuite été trmsfectées de façon
transitoire (45 h) avec le vecteur codant pour la protéine de fusion RB2 de lapin - GFP ou le
vecteur pEGFP-N3 (comme témoin) en utilisant le réactif de transfection Ex Gen 500 comme
indiqué par le manufacturier (MBI Fermentas Inc.). En utilisant la même méthode. le vecteur
exprimant le RB,-GFP a également été transfecté dans des cellules HEK 293. Cette fois. des
cellules transfectées de façon stable ont été sélectionnées et maintenues après un mois de
croissance dans un milieu a-MEM auquel est ajouté du sérum de veau foetal (5%), du sérum
de cheval (5%), de la pénicilline et streptomycine (1%) et de la géniticine (500 pg/ml ; Gibco
BK). D'autre part, des cellules HEK 293 ont été transfectées de façon transitoire (48 h),
toujours par la même méthode, avec le vecteur pEGFP-N3 codant pour un variant de la GFP.
2.2.4 Essais de liaison
Les essais de liaison ont été effectués dans un premier temps pour évaluer la
population et l'affinité pour la BK de la protéine de fusion RB, de lapin - GFP présente à la
surface des cellules de mammifères transfectées avec le vecteur exprimant ce récepteur et.
dans un second temps, pour déterminer la puissance et la réversibilité de la liaison des
antagonistes du RB, (icatibant. NPC 1773 1 et LF 16.0687') ou de Igogoni.;re BK ii ce même
récepteur. Pour le premier protocole (Bachvarov et coll.. 1995). des cellules COS-1 (à un
niveau de confluence de 70%) transfectées de Façon transitoire avec le vecteur RB2-GFP ou
pEGFP-N3 (comme témoin) ou des cellules confluentes HEK 293 trmsièctées de Façon
stable avec le vecteur RB2-GFP ont étC lavées a deux reprises avec la solution de liaison à
0°C (une solution de PBS pH 7.1 j. laquelle a i t C iijoutie de I'azoture de sodium (0.02%), de
I'ûlbuinine sérique bovine (0.1%), du PMSF (1 mL[) et du captopril (1 pbl)). Suite aux
lavages. 500 pl de la solution de liaison ont été ajoutés dans chaque puits. Pour la
construction des courbes de saturation. la ['HIBK (NEN Life Science Products) a étC ajoutée
aux différents puits à des concentrations variant de 0.35 j. 7 nM. Paraildement. 300 nkl de
BK non marquée a été ajouté a certains puits afin de déterminer le niveau de liaison non
spécifique. Après 90 min d'incubation sur glace. les puits ont ét t rincés trois fois avec une
solution de PBS à O°C et tous les sumageants ont été aspirés. Les cellules ont alors été
dissoutes dans une solution de NaOH 0.1 M et la radioactivité contenue dans ces suspensions,
correspondant à fa BK tritiée lige aux récepteurs RB2-GFP, a été comptée par scintillation.
Pour le second prctocole, 2 niL1 de BK tritiée ont été utilisés pour les essais de liaison
et les conditions expérimentales générales décrites plus haut ont été suivies. Des courbes de
compétition, effectuées a 0°C dans des plaques de 24 puits recouvertes de cellules HEK 293
transfectées de façon stable avec le vecteur RB2-GFP, ont donc été construites en traitant
chaque puits avec le radioligand et l'undes compétiteurs non marqués (BK, icatibant, W C
1773 1 ou LF 16.0687) à différentes concentrations (de 1 à 1000 ahl). Dans d'autres plaques,
les compétiteurs ont été incubés dans l e m puits respectifs pour une période de 30 min dans
le milieu de culture complet décrit à Ba section 2.2.3 à 37T ou dans la solution de liaison à
0°C. Suite à ces traitements, tous les puits ont été rincés deux fois et réincubés 3 h dans le
même milieu et à la même température. Finalement, toutes les plaques ont été transférées sur
glace afin de permettre la liaison de la BK tritiée dans la solution de liaison. Dans certains
puits, 1 p M de BK non marquée a été ajoutée afui de déterminer le niveau de liaison non
spécifique. Après 90 min d'équilibration. l'essai de liaison a été poursuivie comme décrit
plus haut.
2.2.5 Essai de la phospholipase Al
Un essai de libération de l'acide arachidonique a été effectué pour évaluer la fonction
de la protéine de Fusion RB, de lapin - GFP exprimée de façon stable dans les cellules HEK
293. Pour ce faire. 2.5 x 10' cellules ont été ensemencées dans des puits de 2 cm' (plaque de
24 puits) contenant 1 ml du milieu de culture complet décrit à la section 1.2.3. Vingt-quatre
heures plus tard, alors que les cellules etaient à un niveau de confluence d'environ 50-60%,
0.1 pCi d'acide arachidonique tritié (activité spécifique de 185 Ci/mmol ; NEN) a Cté ajouté
dans chaque puits. Les cellules ont été incubées pour 18 h additionnelles. puis. rincées trois
fois avec une solution saline balancfe de Earle additionnée d'aibumine sérique bovine (2
mgfml). Un ml de ce milieu a ité laissé dans chaque puits suite au lavage. Dans un premier
protocole servant à démontrer la réponse provoquée par l'un ou I'autre des agents
pharmacologiques, les antagonistes du RB, (icatibant, NPC 1773 1 (3 et 30 nM) ou LF
16.0687 (100 ou 1000 nM)) et l'agoniste du RB, (BK (100 ni!)) ont été ajoutés dans les puits
appropriés avant d'incuber toutes les plaques pour 20 min a 37OC. Dans un second protocole
servant à déterminer le caractère compétitif ou non compétitif des antagonistes par des
courbes complètes concenmtion-effet cumulatives à la BK, les antagonistes (icatibant, NPC
1773 1 (30 nM) ou LF 17.0687 (1 PM)) ont d'abord été ajoutés dans les puits appropriés.
Après un premier 30 min d'incubation à 37"C, l'agoniste (BK (O. 1, 1. 10, 100, 1 O00 nt) a
été ajouté aux différents puits. Toutes les plaques ont alors été incubées une fois de plus à
37°C pour une période de 20 min. Suite aux incubations, 500 pl du milieu de chaque puits
ont été récupérés dans un tube conique de 1.5 ml et centrifugés pour 5 mi^. a 15000 g. 400 pl
de chaque surnageant ont ensuite été transférés dans des tubes pour le comptage par
34
scintillation de l'acide arachidonique relâché par les cellules en réponse aux antagonistes ou à
I'agoniste du RB2.
2.2.6 Observations en microscopie confocnle de la distribution subcellulaire de la
protéine de fusion RB, de lapin - GFP
Cette expérience a été rédisée pour observer l'effet de certains agents
pharmacologiques sur la distribution subcellulaire des RB2 de lapin - GFP et ainsi démontrer
une certaine forme d'internalisation. ou du moins de séquestration de ces récepteurs. La BK
(10 et 100 nM) ou l'un des trois antagonistes étudiés du RB, (icatibant. NPC 1773 1 (30 nM)
ou LF 16.0687 (O. 1 ou 1 uM)) a t t i ajouté pour une certaine periodr de temps (BK (IO min),
icotibant. NPC 1773 1 ou LF 16.0687 (1 5 min ou 24 h)) au milieu de culture complet de
cellules HEK 293 exprimant de façon stable le RB,-GFP préalablement ensemencées dans de
petits pétris (35 mm de diamètre). La distribution subcellulaire de la fluorescence a ensuite
Cté observée directement sans fixation des cellules ni lavage des ligands en utilisant un
microscope confocal BioRad 1024 (objectif 60X avec de l'huile à immersion : h émission =
788 nm). Les plans de cellules observés étaient environ à la moitié de l'épaisseur des
cellules. Des cellules HEK 293 transfectées de façon transitoire avec le vecteur pEGFP-N3 et
n'exprimant donc que le variant de la GFP ont également été observées au microscope afin de
constater la distribution de la fluorescence dans ces cellules.
2.2.7 Analyse de type western de Ir protéine de fusion RB, de lapin - GFP
Cette analyse western a été réalisée afin de déceler des signes de dégradation, quant
au sort des RB,-GFP dans les cellules suite à la liaison d'un agoniste ou un antagoniste à ces
récepteurs. Ainsi, dans des flasques de 75 cm', des cellules confluentes HEK 293 exprimant
de façon stable le RB,-GFP ont été traitées avec ou sans l'un ou l'autre des agents
pharmacologiques (icatibant, NPC 1773 1, BK (30 nbr) ou LF 16.0687 (100 nM)) pour une
période de temps spécifique a chacun (24 h dans le cas des antagonistes et 30 min pour la BK
en présence de captopril(1pM) et d'amastatine (3 FM)). Suite à ces traitements, les cellules
ont été récupérées a l'aide d'un tampon de 1) se bouillant (Tris-HCl pH 7.4 (1 0 mM), Na,VO,
( 1 mîvl) et SDS (1 %)). Les extraits cellulaires ont dors ét5 centrifugés à 15000 g pour 5 min.
puis incubés pendant 5 min a 100°C. Des extraits cellulaires de cellules HEK 293 non
transfectées et de cellules HEK 293 transfectées de façon transitoire avec le vecteur
d'expression pEGFP-NS exprimant un variant de la GFP ont égdcvent été préparés au même
moment puisqu'ils ont servis de contrôle lors des analyses de type iiTrsrrrn. La concentration
totale en protéines pour tous les extraits prutéiques a été dkterminie a l'aiiie d u kit " BCA
Protein Assay " comme indiqué par le manufacturier (Pierce).
Après le dosage en protéines de chaque extrait. 15 pg de protéines totales de tous les
ichmtillons ont été déposés et migrés sur deus gels SDS-PAGE 10% à 35 mA pour I h 30
min. L'un des gels a ensuite été colore à l'aide d'une solution de bleu de Coomassie (bleu de
Coomassie (0.1%). acide acétique (10%) et éthanol (40%)) afin de vérifier l'uniformité de la
quantité de protéines des différents Cchantillons déposée sur les gels. Le second gel a étd
utilisé pour le transfert des protéines sur une membrane PVDF (BioRad) 3 30 V pour la nuit.
Suite au transfert, la membrane PVDF a été incubée 1 h à la température de la pièce
dans un tampon de blocage (tampon de lavage (Tris-HCI pH 7.5 (10 mbi), NaCl(100 hi) et
Tween-20 (0.1%)) auquel est ajouté du lait en poudre (5%)). Les sites non spécifiques étant
bloqués, l'anticorps primaire, en l'occurrence un anti-GFP polyclonal (dilution 1 : 875 ; Santa
Cruz Biotechnologies) a été ajouté pour une autre heure à la température de la pièce dms du
tampon de blocage frais. La membrane a par la suite été lavée pendant 30 min avec le
tampon de lavage avant d'être mise en présence de l'anticorps secondaire, un anticorps de
chèvre anti-IgG de lapin couplé à la peroxidase de raifort (dilution 1 : 15000 ; Sigma) pour 1
h à la température de la pièce dans du tampon de blocage frais. La membrane a de nouveau
été lavée pendant 30 min avec du tampon de lavage avant que les anticorps soient mis en
évidence à l'aide du kit '' Western Blot Chernoluminescence Reagent Plus " utilisé comme
suggéré par la compagnie 0. La membrane a alors été exposée à un film radiographique
qui a ensuite été développé puis analysé qualitativement.
2.2.8 Fractionnement des cellules HEK 293 exprimant de façon stable In pruréine de
fusion RB, de lapin - GFP par centrifugation séquentielle
Cette expérience a été effectuée dans le but de vérifier le déplacement des RB,-GFP
vers certnins compartiments cellulaires spécifiques Ion de Ia liaison d'un agoniste ou d'un
antagoniste a ces récepteurs. Pour ce faire. dans des flasques de 75 cm' (un flasque par
traitement). des cellules cunriuantrs HEL 133 éxprimanr ctr: façon stable le RB.-GFP ont été
traitées avec ou sans l'un ou l'autre des agents pharmacologiques (BK (100 nbl), icatibant.
NPC 1773 1 (30 mi!) ou LF 16.0687 (100 nL1)) pour une pçriodr de temps spécifique à
chacun (3 h ou 24 h dans le cas des antagonistes et 10 min pour la BK). Suite à ces
traitements. les cellules ont été récupéries dans 500 pi d'un tampon sucrose (sucrose (250
mM). tricine (20 mM). EDTA (1 mM). PMSF ( 1 mM). leupeptinr ( 10 pg/ml). inhibiteur de
13 trypsine du soja (10 pg/ml) et pepstatine (2 pg/mI) ; pH 7.5). Un flasque de 75 cm' de
cellules HEK 293 confluentes a Cgalement Cté utilisé en tant que témoin pour cette
r'tpdrience. La première centrifugation de tous les extraits cellulaires obtenus a été effectuée
à 600 g pendant 5 min (Lodish et coll.. 1995). Ce premier culot obtenu. comprenant les
noyaux et les débris cellulîires, a été jeté (décision prise suite a des Ctudes préliminaires) et le
surnageant a été récupéré pour une deuxième centrifugation à 15000 g pour 10 min. Ce
deu~ième culot, contenant des organelles telles les mitochondries, les lysosomes et les
endosomes, a alors été conservé après avoir récupéré une fois de plus le surnageant pour la
dernière centrifugation à 150000 g pour une période de 3 h. Le troisième culot, soit les
membranes plasmiques et des fragments de réticulum endoplasmique, a également été
récupéré de même que Le surnageant (partie soluble du cytoplasme et polyribosomes) dont les
protéines ont été par la suite concentrées par centrifugation à travers une membrane semi-
perméable (les protéines ayant un poids moléculaire supérieur à 5000 kDa sont retenues ;
Millipore). Ainsi, les deuxième et troisième culots et le dernier surnageant de chaque
échantillon ont été solubilisés dans un volume restreint de tampon de lyse (Tris-HCl pH 7.4
(10 mM), NaJO, (1 rnM) et SDS (1%)) avant d'être entièrement déposés et migrés sur un
gel SDS-PAGE 10%. A partir de ce point, l'analyse de type wesrern de tous les échantillons
a été effectuée comme décrit dans la section 2.2.7.
3.1 Le récepteur de lapin pour I'anaphylatoxine C5a
3.1.1 Isolation et caractérisation du gène du récepteur de lapin pour le C5a
Un Fragment d'ADN contenant la majorité de la séquence codante du RCSa humain,
soit les nucléotides 163 à 1053 (Gerard et Genrd, 199 L), a été généré par PCR à partir
d'ADN génomique humain afin de cribler une banque h d'ADN génomique de lapin. Trois
clones positifs ont été isolés et ont présentés des patrons de digestion identiques avec les
endonucléases de restriction EcoRI, Saci, SmaI et Bal. Une évaluation plus poussée de l'un
de ces clones a été effectuée par une analyse de type souihern de ses patrons de digestion. Un
fragment de 3.2 kb produit par l'enzyme de restriction SmaI a hybridé de façon spécifique
avec la sonde correspondant it une partie du RC5a humain (ce résultat n'est pas présenté).
Suite au sous-clonage et à une analyse de la séquence de ce fragment de digestion Srncrl. il
était évident que toute la région codante du gène du RCja de lapin de même que la région 3'
non traduite se trouvaient dans un seul exon. Toutefois, la région 5' non traduite et le codon
d'initiation (codant pour une méthionine) n'étaient pas retrouvés dans ce clone. Une
séquence intronique partielle a plutôt été retrouvée devant le deuxième codon (codant pour
une alanine) et présentait un site accepteur d'épissage classique (voir la figure SA). Les
gènes humain et de souris pour le RCSa présentent également un long intron ê cette même
position, séparant le codon d'initiation du reste de la séquence codante (Gerard et col]., 1992 :
Gerard et coll,, 1993). Cette séquence intronique partielle confirme donc la conservation de
l'organisation génomique du RC5a dans les trois espèces. La figure 5A présente les
séquences nucléotidique et d'acides aminés (déduite à partir de la première) du RCja de
lapin.
. . . CCCGG
CGCCCATGÇAAAATAGCACGTACGATTACACCAACTATGACTCTTT~CCCTGGACC P M E N S T Y D Y T N Y D S L G T L D P
fi CCTCCACCCCCGTGGACAACACTGTCAGAAGGCTACGCCCGAC~C~TCGT~CCCTW
c. CI - .. a L ~ V E : ~ T ' J Â X L R ? T T I ' ~ A L ' !
TK- 1
TCATCTACATGGCCGTCTTCCTGGTGCGGGTGCCGGGCAATGCCCTGGTGGTCTGGGTGA I Y M A V F L V G V P G N A L V V W V T
CGGCGCTGGAAGCCAAGCGGACCGTCAACGCCATCTGGTI:CCTGAACCTGGCCGTGGCCG A L E A K R T V N A I W F L N L A V A D
rn- 2
GGCCCTTCGGCAGGGCCGCCTG~GCGTGCTGCCCTCCCTCATCCTGCTCAACATGTACG P F G R A A C S V L P S L I L L N M Y A
r Zn- J
CCAGCATCCTGCTGCTGGCCACCATCAGTGCCGACCGCTTCCTGCTWTGTT~TCC~ S I L L L A T I S A D R F L L V F N P I
TCTCSTGCCAGAACACCCGAGGGGCTGGCTTGGCCTGGCTWCGTGCTGCGTGGCCTGGG W C Q N T R G A G L A W L A C C V A W G
TU-4
GCTTGGCTTTGCTGCTGACCATCCCCTCCTTCCTGTACCG~GGTGCTCCAGGATGAW L A L L L T I F S F L Y R K V L Q D D Y
ATCCGCCCAAGACUCATGCGGTGTGGACTACGGGCACGAGGGCGTGCGCGCCGAGAGGG P P K T T C G V D Y G H E G V R A E R A
? CGGTGGCCATCGTCCWCTGGTCGTGGGCTTCCTGCTGCCGCTGmaCGCTWGCGTCT
V A I V R L V V G F L L P L F T L S V C n - s
GCTACACCTTCCTCCTGCTGCGGACCTGGAGCCGCiAACGGCACGCGCTCCACCAAGACGC Y T F L L L R T W S R N G T R S T K T L
m
TCAAGGTGGTGGTGGCCGTGGTGGTCAGCTTCTTCATCTTCTGGCTGCCCTACCAGGTGA K V V V A V V V S F F I F W L P Y Q V M
TGGGCATGATCCTAGCCCTGCTGCACCCTTCCTCCGCCACCTTCCGGTG(3CCCATCCGGC G M I L A L L H P S S A T F R W A I R L
TGGTCGCCGGCAAGGGCTTCCAGGGCCAGCTGCGWGTCTCTCCCCAGCCTCCTCCGCA V A G K G F Q G Q L R K S L P S L L R N
A A
ACGTGCTGGCGGAGGAATCTGTGATCCAAGGCAGCAAGTCCTTCTCCCGCTCC~CWT~ V L A E E S V I Q G S K S F S R S T V D
A A A A
ACACGGTGGCCGACAAGTGCCAAGCGGTGTGAGGCTCTGGGG T V A D K C Q A V *
B. 5 wi7/1
humain MNSF . NYTTPD YGHYDD . KDTL DLNTPVDKTS.., lapin MAPMEN-STYD YTNYD.SLGTL DPSTPVDNTV souris MDPIDNSS.FE I.NYDH.YGTM DPNIPADGIH rat MDP1SNDSS.E 1.TYDYSDGTP NPDMPADGVY chien MASM-NFSPPE YPDY.G.TATL DPNIFVDESL
Figure 5 : A. La séquence nucléotidique déterminée et la séquence déduite des acides aminés du récepteur de lapin pour le C5a. Ces séquences sont déposées dans la banque de données de GenBank (numéro d'accès AF068680). Le codon de départ, la méthionine (m), est inséré par convention au début de la séquence codante puisqu'on assume qu'il est localisé dans un autre exon. La séquence nucléotidique en amont du codon atg représente l'extrémité 3' de la séquence intronique contenant un site accepteur typique pour un épissage (souligné en double). Les sept domaines transmembranaires (TM), le site potentiel de N-glycosylation conservé (fi), le pont disulfure intramoléculaire (?)et les sites majeurs de phosphorylation en C-terminal (A) sont également indiqués. Tous les résidus d'acides aminés conservés chez l'humain et cinq espèces animales non primates étudiées sont montrés en caractère gras. B. L'alignement manuel des séquences d'acides aminés prédites en N-terminal des récepteurs du C5a humain et de quatre animaux de laboratoire non primates, dont le lapin. Les résidus d'acides aminés conservés par rapport ii la séquence du récepteur du CSa humain sont montrés en caractère gras. Les résidus d'acides aminés correspondant aux épitopes des anticorps monoclonaux S5/1 et W1711, anticorps dirigés contre la séquence N-terminale du récepteur du C5a humain, sont soulignés.
Le RCja de lapin est constitué de 352 acides aminés et présente une structure typique
des récepteurs couplés aux protéines G avec 7 domaines transmembranaires (TM). Certains
sites potentiellement significatifs du point de vue fonctionnel, similaires à cew retrouvés
chez les récepteurs homologues des autres espèces de mammifêres étudiées, sont également
retrouvés chez le RCja de lapin (voir la figure 5A). Parmi ces sites se distinguent un site de
N-glycosylation. un pont disulfure intramoléculaire et des sites de phosphorylation dans le
domaine C-teminal cytosolique. De plus. il cst facilc dc xmqucr qüc plusicuis rtsidus
d'acides aminés sont conservés dans toutes les especes itudiées jusqu'à maintenant.
L'alignement de la séquence peptidique du RC5a de lapin avec celles des autres espèces
révèle une homologie de séquence de 79.5% avec I'humain. de 72.8% avec le chien. de
71.8% avec la souris. de 72.7% avec le rat et de 70.1% avec le cochon d'Inde. Ainsi. le
RCSa de lapin montre une homologie de séquence significativement supkrieure à son
homologue humain comparativement aux autres espèces non primates ktudiies. Cette
homologie est spécialement prononcée dans les domaines transmembranaires. allant même
jusqu'à 100% dans le TM3 et 90% dans le TM? (l'homologie entre les TM des RCja des
marnmiferes étudiées j usqu'ici varie entre 46 et 86% : Fukuoka et coll.. 1 998).
La séquence prédite du domaine N-terminal extracellulaire pour les RCja de
lapin et de quelques autres espèces animales non primates est montrée à la figure 5B. Ce
segment extracellulaire n'est pas très bien conservé a travers les espèces et a donc Cté exploité
pour le développement d'anticorps. Les anticorps monoclona~v SY1 et W17/1 sont
respectivement dirigés contre les épitopes 15-2 1 et 21 -26 de la région de différentiation
antigénique de la molécule humaine (Oppermann et coll., 1993 : Oppermann, 1995). Une
fois de plus, c'est la séquence du RCSa de lapin qui montre le plus haut taux d'homologie
parmi les espèces animales représentées avec la conservation de 4 acides aminés sur 6 ou 7
pour chacun des épitopes.
3.1.2 Profil antigénique du récepteur cloné de lapin pour le C5a exprimé de façon
transitoire dans les celluIes HEK 293
Les cellules HEK 293 transfectées de façon transitoire avec un vecteur d'expression
pour le RCSa cloné de lapin sont colorées positivement pour ce récepteur lorsque testées avec
l'anticorps monoclonal S511 (figure 6B). Les cellules HEK 293 non transfectées sont quant à
d e s négatives (figure 6h). Des sections dc n tc dc lapin on: Cgalemcm CtÇ colortcs
efficacement par l'anticorps Sjll (figures 6C. D) et des cellules provenant d'un lavage
péritonéal d'un lapin. contenant une grande proportion de macrophages (Petitclerc et coll..
1996). sont également positives mais de façon plus variable avec cet anticorps (ces résultats
ne sont pas montrés). Contrairement à ce dernier anticorps. l'anticorps monoclonal W [Ti.
utilisé dans les mêmes conditions. n'a jamais réussi à colorer spécifiquement I'une de ces
sources de RCSa de lapin (ces résultats de sont pas montrés). Finalement. une lignée de
cellules HEK 293 transfectées de façon stable pour exprimer le RCja cloné de lapin a
conservée son imrnunorénctivité pour Iknticorps monoclonal SYl. avec une meilleure
definition de la coloration membranaire (ces résultats ne sont pas montrés).
3.1.3 Identité pharmacologique du récepteur cloné de lapin pour le C5a exprimé de
façon stable dans les cellules RBL-2H3
Les cellules RBL-ZH3 non aansfectées ont lié une quantité faible mais constante de
radioligand lorsqu'e~posées a 2 nM de '%3a et cela même en présence d'un excès de C5a
humain non marqué (figure 7). Cette fàible liaison est considérée comme non spécifique. La
!ignée de ceIIdes AWL-2H3 exprirnmt de f'çcn stable le RCSo dc lapifi cloriC a iiiontrt ai
liaison beaucoup plus importante du radioligand (figure 7). Cette liaison est en grande partie
spécifique puisqu'elle est compétionnée par le C h non marque. La compétition de la liaison
de 2 nM de " 5 ~ - ~ % par les peptides non marqués est davantage Ctudiée sur les cellules
transfectées (figure 8). Le IC, (concentration inhibant 50% de la liaison spicifique du
radioligand) pour le C h humain est évaluC à 12.5 k 3.5 nM alors que pour Ir peptide
synthétique Ac-YSFKPMPLaR cette valeur monte autour de 10 à 49 pM : il conserve donc
environ O. 1% de du CSa humain.
C5a non marqué (nM)
Fipre 7 : Liaison totale de 2 nM de "j1- CS^ à des cellules RBL-2H3 non transtèctées (histogrammes solides) et à des cellules RBL-2H3 transfectées de façon stable avec le vecteur pSFFV-neo codant pour le récepteur du CSa de lapin (histogrammes hachurés). Afii de déterminer le niveau de Liaison non spécifique, des concentrations différentes de Cja non marqué ont été ajoutées à chaque puits. Les valeurs rapportées sont les moyennes t l'écart-type d'expériences dupliquées.
Compétiteur non marqué (log[M])
Figure 8 : Compétition de la liaison de 2 nM de '"1-~5a aux récepteurs de lapin pour le C5a exprimés de façon stable dans les cellules RBL-2H3 par différentes concentrations de CSa non marqué (#) ou du peptide synthétique Ac-YSFKPMPLaR (V). Une expérience représentative de trois expériences nmilaires est présentée. Les valeurs rapportées sont les moyennes k l'écart-type d'essais dupliqués.
3.1.4 Profil pharmacologique du récepteur de lapin pour le C5a naturellement exprimé
dans les tissus vasculaires et les neutrophiles circulants
Le C5a recombinant humain et le peptide synthétique Ac-YSFKPMPLaR ont
provoqué des réponses mécaniques biphasiques dans la veine porte et l'artère pulmonaire
isolées de lapin précontractrées avec de la phényléphrine (figure 9). Ce type de réponse a été
décrit et analysé au cours des dernières années (Hugli et Marceau. 1 985 : Petitclerc et
Marceau. 1991 ; Drapeau et coll.. 3993). Seule la relaxation prolongée. exprimée en
pourcentage du plateau de contraction. est utilisée dans l'analyse quantitative de l'activité
biologique des RCSa présents dans les vaisseaux sanguins de lapin (figure 10). Dans ces
essais biologiques. le peptide analogue Ac-YSFECPMPLaR est 20 à 30 fois moins puissant
que le C5a recombinant humain.
La neutropçnie aiguë kvaluée 5 min après l'injection du peptide synthétique Ac-
YSFKPMPLaR dans le lapin est reliée à la dose donnée avec un effet maximal correspondant
à la disparition complète des neutrophiles circulants (figure 1 1 A). L'ED, (dose nécessaire
pour observer 50% de I'effet biologique mmirnai) de ce peptide est évalui à 5 nrnoi. Le Cja
recombinant humain est seulement deux fois plus puissant que cet analogue lorsque testé sous
des conditions similaires (Drapeau et coll.. 1993). La population de lymphocytes est affectée
seulement par des doses maimales ou suprma..imaies du peptide Ac-YSFKPMPLaR pour
l'effet de neutropénie aiguë (figure 1 1 B). Cela a dejà été observé pour le C j a recombinant
humain (Drapeau et coll.. 1993).
Lavage
Figure 9 : Tracés représentatifs de la réponse biphasique de vaisseau sanguins isolés de lapin stimulés par des agonistes des récepteurs du Cja suite à une précontraction à la phényléphrine (500 nM). A. Une artère pulmonaire stimulée par 10 nM de C j a recombinant humain. B. Une veine porte stimulée par 10 nM de C j a recombinant humain. C. Une artère pulmonaire stimulée par 1pM du peptide synthétique Ac-YSFKPMPLaR. D. Une veine porte stimulée par 1 pM du peptide synthétique Ac-YSFKPMPLaR.
a. Veine porte
b. Artère pulmonaire
1 1 O 100 1000 1 O000
Concentration (nM)
Figure 10 : Effet relaxant du C5a recombinant humain ( 0 ) et du peptide synthétique Ac-YSFKPMPLaR (i) sur la veine porte isolée de lapin (a) et sur l'artère pulmonaire isolée de lapin (b). Les valeurs rapportées sont les moyennes f l'erreur-type de 4 à-6 expériences.
a. Neutrophiles
b. Lymphocytes
Dose de peptide (nmol)
Figure I I : Changement dans le décompte des neutrophiles (a) et des lymphocytes (b) dans le sang périphérique de lapins 5 min après l'injection du peptide synthétique Ac-YSFKPMPLaR (. ) ou de saline ( ). Les résultats obtenus pour le CSa recombinant humain (A) lors d'expériences similaires ont déjà été présentées auparavant (Drapeau et c d . , 1993), et sont rapportés ici à des fins de comparaison. Les valeurs rapportées sont les moyennes ( I'erreur-type de 3 expériences (2 expériences pour les doses de 210 nmol du peptide synthétique). Les décomptes de base (5 min avant l'injection) pour les neutrophiles et les lymphocytes sont, respectivement, pour tous les groupes, 3 174 t 293 et 10074 + 1984 ceiiules par pl de sang (n = 17).
3.2 Le récepteur B, de lapin
3.2.1 Contractilité vasculaire médiée par les récepteurs B2 naturellement exprimés dans
la veine jugulaire de lapin
La veine juguiaire de lapin stimulée par I'agoniste BK du RB, a répondu par une
c o n ~ a c t i ~ n dépendmte de !z concen~ztion de BK. wec L! E L (~(concentntion ni.ccssaire
pour obtenir 50% de l'effet pharmacologique maximal) situé entre 3 et 8 nM (figure 12).
Dans les tissus traités avec une concentration de 3 nbl d'un antagoniste peptidique semblable
à l'icatibant. le NPC 1773 1 (1 ou 3 nM). la courbe de concentration est diplacé vers la droite.
avec un EC,, de 53.1 !: 15.7 nM (p = 0.004 par le test de Mann-Whitney). De plus. j. cette
même concentration, le NPC 1773 1 a déprimi l'effet maximal induit par la BK au temps
contrôle de 1 h jusqu'à un E,, (effet pharmacologique maximal) de 14.8 I 4.6% de ce
maximum (p = 0.002) (figures 12A. B). Après plusieurs lavages sur une période de 3 h.
l'antagonisme exercée par le NPC 1773 1 n'est que partiellement réversible. En effet. I'effet
maximal de la BK sur les tissus traités avec 3 nh.L de cet antagoniste est revenu h 46.2 f
1 1.5% du maximum de 1 h (p = 0.002). avec un EC,, de 12.8 + 3.4 nM (p = 0.015 lorsque
comparé à la valeur témoin de 4.1 + 1.1 dv1) (figures 12A. B). Le NPC 1773 1 (3 N) n'a
exercé aucune forme d'antagonisme sur les contractions induites par l'histamine dans la veine
jugulaire de lapin (figure 12C).
Comme rapporté auparavant, l'icatibant (3 nhd) a démontré son caractère non
compétitif et insurmontable sur la BK dans la veine jupilaire de lapin avec un EC, augmenté
de 3.30 k 1.44 nM à 16.5 ?: 3.6 fil en sa présence (p = 0.002). déplaçant ainsi la courbe de
concentration vers la droite. et un E,, réduit à 63.0 f 6.0% de I'effet maximal de la BK
enregistré au temps 1 h @ = 0.002). La dépression du E,, est essentiellement irréversible
après une période de 3 h de lavage puisque le E,, tend encore à diminuer vers une valeur de
56.3 f 7.1% (p = 0.009)(figure 12D). Le composé 9 (3.4 ou 34 FM), un composé non
peptidique reproduisant la portion C-terminale de l'icatibant, a conservé une grande partie du
caractère non compétitif et insurmontable de l'icatibant. déplaçant vers la droite la courbe de
concentration avec un EC, passant de 8.9 + 3.0 nh.i à 1 1.1 + 4.3 nM et un E,, réduit à 46.1 f
1 1.9% du maximum de 1 h (p = 0.03) (figures 13C. D). L'antagonisme exercée par ce
composé se maintient malgré une période de 3 h de lavage avec un EC,, de 14.9 f 3.8 nM et
un E,, de 50.3 f 9.9 (p = 0.03). Toutefois. le composé 9 a beaucoup moins d'affinité pour le
RB, que son modèle, I'icatibant.
Cont~rernent a a ~ LYU~TCS mtagonistes CtudiCs, un I i M e mmgonistc non pcptidiquc dü
RB!, le LF 16.0687 (30 ou 100 nM), s'est révélé purement compétitif dans les tissus traites
avec une concentration de 100 nb I de ce composé puisqu'il n'a déplacé la courbe de
concentration que vers la droite. avec un EC,, de 44.6 k11.6 nh.1 (p = 0.009). sans changer
l'effet maximal de la BK, conservant ainsi un E,, de 99.0 + 3.6% (n-S.). De plus.
I'antagonisme est réversible après une période de lavage de 3h. maintenant un E,, de 90.6 f
4.5% du ma..imurn de 1 h (n.s.) et un EC,, de 5.6 + 3.2 nA4 (n.s. par rapport à la valeur
contrôle du EC,, au temps 1 h de 5.1 + 2.0 nM) (figures 13A. B). Le comportement
apparemment surmontable du LF 16.0657 a permis le calcul d'une valeur de 7.99 L 0.17 du
pA, en effectuant un estimé informatisé de la regression de Schild (la pente de la régression.
1.09. est près de l'unité ; Taliarida et Murray. 1987).
A. NPC 17731 1 nM B. NPC 17731 3 nM 120
/--- c._.r
s ,Yd -
-3- -
/ 80 /''
80 ? - F--
C. NPC 17731 3 nM 1
[BK] nM [BK] nM
D. lcatibant 3 nM - I
1 10
[Histamine] PM
Figure 12 : Effets de deux antagonistes peptidiques, le NPC 1773 1 (1 aM (A) et 3 nM (B)) et icatibant (3 nM @)) sur la contraction induite par la BK dans la veine jugulaire isolée de lapin. Le NPC 1773 1 (3 nM) a également été testé sur la contraction induite par l'histamine dans cette préparation de muscle lisse vasculaire (C). Chaque tissu a été soumis à la construction de trois courbes complètes concentration-effet cumulatives, à 1 h en l'absence d'un antagoniste (x, témoin), a 3 h en présence d'un antagoniste depuis 30 min (+) et à 6 h après plusieurs lavages des tissus (A, récupération). Les valeurs rapportées sont les moyennes k l'erreur-type de 6 à 8 expériences. -
C. Compose 9, 3.4 pM O. Compose 9, 34 pM 120 1 120 -
Figure 13 : Effets de deux antagonistes non peptidiques, le LF 16.0687 (3 0 nM (A) et 100 nM (B)) et le composé 9 (3.4 p l (C) et 34 ph4 @)) sur la contraction induite par la BK dans la veine jugulaire isoIée de lapin Chaque tissu a été sujet à la construction de trois courties complètes concentration-effet cumulatives, à 1 h en l'absence d'un antagoniste (x, témoin), a 3 h en présence d'un antagoniste depuis 30 min (+) et à 6 h après plusieurs lavages des tissus (A, récupération). Les valeurs rapportées sont les moyennes k I'erreur-type de 6 à 8 expériences.
3.2.2 Identité pharmacologique de la protéine de fusion RB, de lapin - GFP exprimée
dans des cetlules de mammifères
Des cellules COS-1 transfectées de façon transitoire avec Ir vecteur codant pour la
GFP n'ont pas lié la [)H]BK. alors que celles exprimant de façon transitoire le RB2-GFP ont
montré une liaison spécifique et apparemment saturable (figure 1 JA). L'estimé de
de !a liiisofi BK - RB--GFP. (IéRvC d'me mdyse de !z regession de Scarchrrd (figure 14.4.
insert), est de KD = 1.6 1 IN. tout près de la valeur de 2.09 t 0.39 nM du RB2 naturel exprimé
de façon transitoire dans le même type de cellules (Bachvarov et coll.. 1995). Des cellules
HEK 293 transfectées de façon stable et exprimant le RB2-GFP ont lié beaucoup plus de
radioligand. mais pas de manière saturable. dans les limites des concentrations de BK tritiér
utilisées. de 0.25 à 7 nM (figure 14A). La forme irrégulière de la courbe peut suggérer la
présence de plus d'un stade d'affinité.
La puissance et la réversiblité des antagonistes ou de la BK ont été ivaluées en
mesurant la liaison spécifique à O°C de 2 nM de BK tntiCe aux cellules HEK 793 transfectées
de façon stable avec le vecteur codant pour le RB2-GFP en fonction de la présence de l'un des
antagonistes ou de la BK non marqués. Les trois antagonistes testés de même que la BK ont
complètement déplacé la liaison spécifique du radioligand à des concentrations favorables
lorsque CO-incubés avec la ['HIBK (figure 14B). L'occupation des récepteurs par l'un des
agents pharmacologiques non marqués a Cté largement réversible. après 3 h de lavage à O°C
avec la solution de liaison, pour des concentrations de ces agents inférieures à 1 pM (figure
MD). Par contre, dans les cellules traitées avec les peptides NPC 17731 ou icatibant.
l'inhibition de la liaison entre la BK tritiée et les RB,-GFP a persisté après une période de
lavage de 3 h à 3 7°C (figure 14C).
Figure 14 : A. Liaisons spécifiques de BK tritiée à la surface de cellules COS- 1 exprimant de façon transitoire la protéine de fusion RB2-GFP (*) ou un variant de la GFP (x) et à la surface de cellules HEK 293 exprimant de Façon stable la protéine de fusion RB,-GFP (A). Les valeurs rapportées sont les moyennes d'expériences dupliquées. Insert : Analyse de Scatchard des liaisons spécifiques a u ceilules COS- 1 tram fectées de façon transitoire avec le vecteur codant pour la protéine de hsion RB,-GFP. B, C et D. Liaison spécifique de 2 m\I de BK tritiée à la surface de cellules HEK 293 exprimant de façon stable la protéine de fusion RB,-GFP en fonction de différentes conditions expérimentales et de leur traitement avec diffërentes concentrations de BK non marquée (0 ) ou des antagonistes du RB, (icatibant (x). NPC 1773 1 (*) ou LF 17.7687 (A)). Les valeurs rapportées sont les moyennes de 4 expériences. Elles sont exprimées en pourcentage de la liaison spécifique mesurée en l'absence d'antagoniste.
3.2.3 Relâchement de seconds messagers par la protéine de fusion RB, de lapin - GFP
exprimée de façon stable dans les cellules HEK 293
Dans un essai de la phospholipase A?, La BK (100 f i l ) a été en mesure d'induire le
relâchement de L'acide arachidonique tritié de cellules HEK 293 transfectées de façon stable
avec le vecteur codant pour le RB,-GFP via l'activation de ces récepteurs. mais les 3
xtntngo~istcs du N3, $ont 2s été c:: m c s x dc !c faix ( f igüic Wi). En ~ x i a n t la
concentration de I'agoniste, il a été possible d'observer une activité maximale à I nM de BK.
Cet effet est toutefois inhibé par une préincubation des cellules avec n'importe lequel des
trois antagonistes testés (figure 193) . La nature de l'antagonisme observée pour chaque
agent pharmacologique (insurmontable pour I'icatibant et le NPC 17731 à 30 nM et
surmontable pour le LF 16.0687 a 1 FM) est similaire à ce qui est observé dans les essais de
contractilité (comparer la figure 15B aux figures 12 et 13).
[BK] nM
Figure 15 : A. Relâchement d'acide arachidonique tritié par des cellules HM 293 aansféctées de façon stable avec le vecteur codant pour le RB2-GFP suite à une stimulation de 20 min par certaines concentrations de BK ou de l'un des trois antagonistes du RB2 testés. Les valeurs rapportées sont les moyennes I i'erreur-tlpe de 8 expériences. *Significativement différent du témoin selon le test statistique de Mann-Whitney B. Relâchement d'acide arachidonique tritié par des cellules HEK 293 exprimant de façon stable la protéine de fusion RBrGFP suite à un prétraitement de 30 min des cellules sans (x) ou avec Pun des trois antagonistes du RB2 (icatibant (*), NPC 1773 1 (30 nM; A) ou LF 17.0687 (1 0)) suivi d'une stimulation de 20 min par différentes concentrations de BK Les valeurs rapportées sont Les moyennes i l'erreur-type de 16 expériences.
3.2.4 Distribution subceUulaire de la protéine de fusion RB, de lapin - GFP exprimée de
façon stable dans les cellules HEK 293
Des cellules HEK 293 transfectées de façon transitoire avec le vecteur d'expression
pEGFP-N3, codant pour la GFP, ont montré une fluorescence cytosolique uniforme (figure
16) alors que la protéine de fusion RBI-GFP exprimée de façon stable dans les cellules HEK
293 est princinalement Y visudisée lu fiixau de !a niembrme p l s m i q w (!lgi?re 16).
L'addition de BK (10-100 nM) dans ces dernières celiules a provoqué une vanslocation
rapide. en 10 min. de la fluorescence dans les cellules. menant 6 l'observation d'un marquage
diffus près de la membrane et de petites structures intracellulaires (figure 17). Les
antagonistes icatibant. NPC 1773 1 et LF 16.0687. utilisés a des concentrations connues pour
occuper le récepteur de fusion (figures 14 et 15). n'ont ru qu'un modeste effet après 15 min.
consistant en la perte de tluorescence associée i la membrane plasmique (figure 12).
Toutefois. après un traitement de 21 h. le NPC 17731 et I'icatibant (30 nM) ont induit une
perte variable de la fluorescence membranaire et. dépendant de la population cellulaire rdou
d'une région spécifique d'une couche de cellules : la présence de tluorescence diffuse dans le
cytosol est observable (le spectre complet de ces eflets est illustré a la figure 17). Les RB,-
GFP sont majoritairement restés associés à la membrane plasmique dans les cellules exposées
au LF 16.0687 (0.1- 1 FM) pour 24 h.
Deux bandes protéiques, 92 et 57 D a , ont été détectées par une analyse de type
western des extraits cellulaires de cellules HEK 293 non transfectées à l'aide d'anticorps
polyclonau. ad-GFP (figure 18A). Ces bandes sont aussi observées dans tous les autres
extraits du même type cellulaire et sont considérées comme non spécifiques. Des cellules
HEK 293 exprimant de façon transitoire la GFP ont montrées la protéine prévue d'environ 28
kDa en analyse de western (figure 18A). Les cellules HEK 293 exprimant de kçon stable le
RB2-GFP ont exhibé une double bande spécifique d'environ 10 1 - 105 kDa. Les traitements
avec les antagonistes (24 h) ou la BK (30 min en présence de IpM de captopril et 3 FM
d'arnastatine pour inhiber l'inactivation de la BK par le sérum) n'ont produit aucun
changement dans le patron de ces bandes protéiques (spécialement lorsque l'intensité de ces
bandes est corrigée avec les bandes non spécifiques pour des fluctuations de mise sur gel). ce
qui suggère qu'il n'y a pas de dégradation significative du RB2-GFP suite a ces traitements
(présence de bandes de poids moléculaire inférieur).
Toutefois, une translocation induite par le ligand des bandes de 1 0 1 - 1 05 kDa dans une
fraction cellulaire dense (culot de 15000 g), correspondant à des structures cellulaires tels les
lysosomes et les endosomes, est observée dans les ceIliiles euporeer pendant 10 min à !a BK
ou pendant 2 1 h a w peptides antagonistes icatibant et NPC 1773 1, mais pas au LF 16.0687
(figure 18B). L'effet de L'icatibant est plus intense que celui du NPC 1773 1. mais faible
après seulement 3 h de traitement (ces résultats ne sont pas montrés). Le RB,-GFP
irnmunoréactif est présent dans le culot de l5OOOO g de toutes les cellules transfectées et
traitées ou non avec les drogues mais pas dans le surnageant tinal (ces résultats ne sont pas
montres).
Figure 16 : Localisation subcellulaire de la fluorescence dans des cellules HEK 293 exprimant de façon transitoire un varisnt de la GFP (A) ou de façon stable le RB2 de lapin - GFP (B). Les plans de cellules sont environ à la moitié de l'épaisseur des cellules (grossissement de 600X).
Figure 17 : Localisation subcellulaire de la tluorescence dans des cellules HEK 293 exprimant de façon stable le RB, de lapin - GFP suite a un traitement avec un agent pharmacologique pour une période de temps définie. Les plans de cellules sont environ à la moitié de IYpaisseur des cellules (grossissement de 1800X).
1 - c GFP
Figure 18 : Irnmunobuvardage d'extraits cellulaires de cellules HEK 293 transfectées ou non avec le vecteur RB, de lapin - GFP ou le vecteur pEGFP-N3 à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-GFP. A. Des cellules HEK 293 exprimant de façon stable le RB,-GFP ont été traitées pour 24 h avec diffërents agents pharmacologiques : saline ( 1 ). captopd 1 pM -i amastatine 5pM (2). captopnl 1pM + amastathe 3pM + BK 30 nM (5). icatibant 30 nM (4). NPC 1773 1 30 &L ( 5 ) et LF 16.0687 100 nM (6). Des extraits protéiques de cellules HEK 193 non transtèctées (7) et de cellules HEK transfectées de façon transitoire avec le vecteur pEGFP-N3 (8) ont servis de contrôle. B. Des cellules HEK 193 exprimant de hçon stable le RE&-GFP ont été traitées pour 24 h (10 min dans le cas de la BK) avec l'un des trois antagonistes du RBI ou la BK avant d'Stre fractionnées par centrifugation ~Cquentielle. 11 s'agit ici de l'analyse du culot de 15000 g : saline (1 ; dupliqué). BK 100 nM ( 2 : dupliqué). icatibant 30 nM (3). NPC 1773 1 30 nM (4, LF 16.0687 100 nM (5) et cellules HEK 293 non transfectées comme contrôle (6). Les résultats présentés sont représentatifs de 5 expériences similaires.
4.0 DISCUSSION
4.1 Le récepteur de lapin pour I'anaphylatorine C5a
Une stratégie basée sur la sélection de séquences homologues dans une banque
eénornique de lapin a permis l'isolation et la caractérisation d'un gène correspondant à un - récepteur couplé a u protéines G. Cr récepteur exhibe les mêmes éICments essentiels que les
récepteurs connus du Cja. 11 est 79.5% identique au récepteur du Cja humain au niveau de
sa séquence de 352 acides aminis. Le site potentiel de N-glycosylation et le pont disulfure
intramoléculaire présents dans la séquence humaine sont retrouvés aux positions
correspondantes dans la séquence du lapin. Les résidus serine phosphoqlés lorsque le
récepteur du C j a est stimulé par un agoniste (Giannini et coll.. 1995) sont également
conservés dans le domaine C-terminal intracellulaire de la protéine du lapin. Ces sites de
phosphorylation sont nécessaires pour I'intemalisaiion du récepteur induite par un agoniste
(Naik et coll.. 1997). De plus. l e géne de lapin codant pour le récepteur du Cja présente la
même organisation genomique que Irs homologues de souris et humain (Gerard et coll.,
1991 ; Gerard et coll.. 1993) puisque la séquence 5' non traduite et le codon d'initiation sont
séparés par un intron du reste de la séquence codante de la protéine et de la région 3' non
traduite. P m i les animaux de laboratoire non primates. le lapin est celui démontrant la plus
haute homologie de séquence enue son récepteur du Cja et la protéine humaine. Il y a
certainement une relation entre cette observation et une récente réévaluation de la position
phylogénétique des lagomorphes, ordre de mammifères comprenant les lapins et les lièvres.
Ces derniers sont maintenant considérés comme étant plus proches des primates que des
rongeurs, carnivores ou ruminants (Gnur et coll.. 1996 ; Penny et Hasegaiva. L 997).
L'homologie exceptionnellement élevée entre les récepteurs du C j a humains et de
lapin est également mise en évidence dans leur domaine N-terrninal extracellulaire, domaine
qui est normalement moins bien conservé parmi les différentes espèces de mammifères.
C'est d'ailleurs pour cette raison qu'il est exploité pour le développement d'anticorps
spécifiques pour l'un ou l'autre des récepteurs du C5a étudiés. Par exemple, les anticorpç
monoclonaux W l?/l et S5/1 dirigés contre le récepteur du C j a humain défissent la région
de différenciation antigénique de cette protéine avec des épitopes de longueur minimale de 6
ou 7 résidus d'acides aminés respectivement (Oppemann et coll., 1993 ; Oppemann, 1995).
Parmi les animaux de laboratoire non primates, le lapin est encore celui dont la séquence
montre le p l u haut degré de préservation de ces épitopes. avec 4 résidus d'acides aminés
conservés dans chaque cas. Cependant. seul l'anticorps monoclonal S5/1 a conservé une
affinité pour le récepteur de lapin cloné. Quoiqu'il n'y ait aucune information publiée quant
au rôle de chacun des acides aminés constituant ces ipitopes minimums pour l'affinité des
anticorps. il est probable que les sites de liaison critiques de S j k mais pas de W17/1. soient
conservés dans la séquence de lapin comme le suggkre Les résultats obtenus par
I'immunohistochimie de cellules transfectées avec le récepteur du C h . Ce dernier possède
donc un profil antigénique comparable au récepteur humain. D'ailleurs. la liaison de
L'anticorps monoclonal SYl au récepteur du C j a de lapin supporte des résultats précédents
basés sur l'utilisation de cet anticorps pour localiser les cellules rkpondant au Cja. des
macrophages infllüants, dans des lésions athérosclérosiques de l'aorte de lapin nourris avec
du cholestérol (Petitclerc et coll., 1996).
Làbsence de liaison spécifique du C h humain iodé aux cellules utilisées pour la
transfection stable permet de conclure que la lignée cellulaire RBL-2H3, provenant d'une
leucémie de rat. n'exprime pas de façon constitutive le récepteur du C5a à sa surface. La
liaison spécifique du radioligand, à des concentrations de l'ordre du nanomolaire, au
récepteur du C h cloné de lapin indique que la molécule est bien un récepteur fonctionnel
lorsque transfecté de facon stable dans ce type de cellules. De plus, iI y a compétition de la
liaison du Cja humain iodé au récepteur cloné par le peptide synthétique Ac-YSFKPMPLaR,
un agoniste relativement puissant conçu suite à des études structure-activité systématiques
basées sur le récepteur humain (Kavatsu et coll., 1996 ; Finch et coll. 1997), malgré le fait
que cet analogue soit beaucoup moins puissant que le Cja. Un essai de liaison sur des
cellules KEK 293 exprimant de façon stable le récepteur du C5a cloné de lapin a également
été tenté sans succès. A titre hypothétique, les sous-unités cr permettant à la protéine G de se
coupler a ce ricepteur peuvent être absentes de ce type de cellules. Le récepteur du C j a est
fonctionnel dans les cellules HEK 293 lorsqu'il est CO-transfecté avec la sous-unité a 16 de la
protéine G (Buhl et coll., 1993)' probablement parce qu'une interaction entre le récepteur et
la protéine G est nécessaire pour stabiliser le récepteur dans une conformation permettant à
un ligand de s'y ber. C'est ce qui pourrait expliquer l'échec de l'essai de liaison sur les
cellules HEK 293 et la réussite de celui sur les cellules RBL-2H3 puisque ces dernières
expriment de façon constitutive plusieurs sous-unités a. dont peut-être celle pouvant interagir
avec le récepteur du Cja.
Les effets vasorela?rants du C j a et de son analogue C-terminal sur l'artère pulmonaire
et la veine porte isolées de lapin supportent les résultats de la compétition des essais de
liaison du C j a humain sur le récepteur du C h clone de lapin puisque l'ordre de puissance
des agonistes est conservé ( C h > Ac-YSFKPMPLaR). L'effet relaxant du Cja sur la veine
porte et l'artère pulmonaire isolies de lapins normaux a Cté caractérisé précédemment et
dépend principalement des prostaglandines (Petitclerc et Marceau. 199 1 ). Le type cellulaire
precis stimulé par l'anaphylatoxine n'a pas été déterminé mais. par analogie avec les artères
musculaires de lapin, une faible densité d'une population subendothéliale de macrophages
résidents pournit être impliquée (Malinauskas et coll ., 1995). L'essai de neutropénie aiguë
dans le lapin a permis de constater que la puissance molaire de l'analogue C-terminal du C5a
est seulement légèrement inférieure à celle du Cja recombinant humain (Drapeau et coll.,
1993). Le gain apparent de puissance du peptide synthétique Ac-YSFKPMPLaR par rapport
au C5a humain dans différents essais biologiques de complexité grandissante (des essais de
liaison au système vasculaire in vitro jusqu'à l'essai de neutropénie aiguë in vivo) est un
avantage découlant probablement d'une résistance au métabolisme déjà observée par le passé
avec d'autres analogues C-terminal du Cja (Drapeau et coll., 1993). En effet, la séquence C-
terminale D-Ala-kg de ces peptides synthétique, comparée a la séquence naturelle Gly-kg,
est suffisante pour abolir l'hydrolyse de ces analogues par la carboxypeptidase N
plasmatique, l'enzyme principale inactivant le Cja, et par d'autres peptidases (Drapeau et
coll., 1993). Ainsi, dans une étude précédente, le peptide Ac-Phe-Lys-Asp-Cha-Cha-Val-D-
Ala-Arg-OH était 40000 fois moins puissant que le C5a en tant que compétiteur de la liaison
du C j a recombinant humain iodé aux leucocytes polymorphonucléaires humains, 400 fois
moins puissant que le C5a pour induire la relaxation des vaisseaux sanguins de lapin isolés et
seulement 50 fois moins puissant pour produire la neutropénie in vivo dans le lapin (Drapeau
et coll., 1993). L'analogue Ac-YSFKPMPLaR testé dans cette étude montre une diminution
comparable de la différence de puissance entre lui-même et le CSa humain dans les essais
biologiques de complexité croissante. Il possède toutefois une affinité plus élevée pour le
réce~teur du C5a que les analogues peptidiques étudiés auparavant. atteignant ainsi une
puissance relative plus grande dans les essais biologiques plus complexes. Les actions
phmacologiques plus complexes du peptide synthétique Ac-YSFKPbPLaR, comme la
neu~opénie aiguë suite à une injection intraveineuse, sont certainement médiées par le
récepteur du Cja puisqu'il est limité au- neutrophiles (les lymphocytes sont largement
réfractaires) et parce que le récepteur du C 5a cloné de lapin a de l'affinité pour ce peptide.
4.2 Le récepteur B, de lapin
A l'exception de quelques cas de médicaments exceptionnellement réactifs causant
l'alkyiation des récepteurs, les bases moléculaires de l'antagonisme pharmacologique
irréversible (non équilibre) ne sont pas trés bien connues. 11 est simplement assumé que les
sites de liaison du récepteur sont définitivement retirés de l'équilibre de la réaction par la
liaison d'un médicament ou que ce médicament se dissocie très lentement du récepteur
(Kenakin, 1993). Les données fonctionnelles présentées dans cette étude supportent le fait
que les antagonistes apparentés du RB, NPC 1773 1 et icatibant, deux peptides à structure
rigide. et le composé 9 (Dziadulewicz et coll.. 1999)' une molécule non peptidique
reproduisant les trois acides aminés C-terminaux de l'icatibant. sont des antagonistes non
compétitifs et non equilibre dans les cellules vivantes de lapin. En effet. a des concentrations
de l'ordre des nanomolaires (NPC 1773 1 et icotibant) ou du micromolaire (composé 9), leur
effet insurmontable n'est pas ou n'est que très lentement réversible. L'effet de ces
antagonistes est qua1 i fié d' insurmontable parce qu'une forte concentration de 1 'agoniste n'est
pas en mesure de révéler le niveau d'effet maximal de ce dernier. Cette perte durable de la
réponse biologique induite par la BK dans la veine jugulaire isolie de lapin n'est pas reliée à
la toxicité des antagonistes ou à un effet post-récepteur sur la contractilité. En effet,
l'absence de changements dans les réponses contractiles induites par l'histamine dans les
tissus traités avec l'antagoniste du RB2 NPC 1773 1 le montrent très bien. Des travaux
précédents ont également établis que l'icatibant est sélectif pour le RBz dans la veine
jugulaire de lapin (Rhaleb et coll., 1992). Cependant, contrairement au NPC 1773 1 et à
I'icatibant, beaucoup d'antagonistes du RB, apparentés à la séquence de la BK ont un effet
surmontable et réversible dans la veine jugulaire isolée de lapin. En fait, plusieurs d'entre
eux, comme la ~-A.rg-[Hyp~, D-~he', Leus]-BK, sont très puissants et compétitifs même s'ils
r e t i e~en t des éléments stnictum~x clés présents dans le NPC 1773 1 et l'icatibant comme les
résidus d'arginine en position 1 et 9 (Rhaleb et coll., 1991). De façon similaire, en se basant
sur les essais de conttactilité, les antagonistes non peptidiques WM 64338 (Marceau et c o k
1994)' FR 173657 (Rizzi et coll., 1997) et LF 16.0687 (Pruneau et coll., 1999) sont
également compétitifs, surmontables et réversibles. Ainsi, le comportement insurmontable et
non équilibre est certainement déterminé par une structure rigide semblable à la région C-
terminale de l'icatibant ainsi que par la structure du récepteur puisque l'icatibant est
compétitif pour le RB, humain (Marceau et coil., 1994 ; Bachvarov et coll., 1995). Il y a
donc une opportunité d'évaluer les déterminants structuraux responsables de ce
comportement pharmacologique dans la séquence du RBZ de lapin.
Sur l'unique base de sa compétitivité avec la BK. il est intéressant de remarquer que
le composé 9 semble être un antagoniste non compétitif pur en ce sens qu'il ne fait que
déprimer l'effet maximum de La BK sans affecter son EC,,. Cependant, le NPC 1773 1 et
I'icatibant semblent posséder une double nature, soit compétitive et non compétitive à la fois,
puisqu'en pius de déprimer l'effet maimurn de la BK. ils augmentent le EC,,. Cette
différence entre le composé 9 et les peptides peut s'expliquer par les interactions qu'ont ces
antagonistes avec le RB!. Ricemment. une caractérisation plus précise des contacts
moléculaires menant à la liaison de la BK et de I'icatibant au RB, humain a permis de
constater que ces deux peptides lient le récepteur selon un modèle à deux sites de liaison
comme pour le C h et son récepteur (Jarnagin et coll., 1996). Selon ce modèle. l'extrémité
N-terminale des peptides reconnaîtrait des domaines extraccllulaires aux régions
uansmembranaires de la protéine alon que leur extrémité C-terminale s'enfouirait dans les
régions transmembranaires par des liens hydrophobes et ioniques. La decouvene la plus
surprenante de cette étude vient du fait que. contrairement à leur extrémité N-terminale,
l'extrémité C-terminale de la BK et de l'icatibant se lie à des régions différentes du RB,.
Ainsi, par l'interaction de son extrémité N-terminale avec des domaines extracellulaires du
récepteur, l'icatibant serait compétitif pour la BK alors qu'il serait non compétitif par la
liaison de son extrémité C-terminale avec un site different de celui de la BK sur le récepteur.
Ce modèle pourrait également être appliqué pour un antagoniste comme le NPC 17731
puisque ce dernier est fortement apparenté à l'icatibant et démontre des propriétés
pharmacologiques similaires. Ceci dit. il faut être prudent puisque des études aussi précises
que celles effectuées pour l'icatibant et la BK sont nécessaires pour en venir à une telle
conciusion définitive. En se basant sur ce modèle, il est facile de comprendre pourquoi le
composé 9 est quant à lui exclusivement non compétitif. En effet, puisqu'ii reproduit
l'extrémité C-terminale de l'icatibant, cet antagoniste se lie uniquement au second site de
liaison de l'icatibant, soit celui où la BK n'a pas de contact. Par conséquent, le composé 9 ne
pourrait compétionner la liaison de la BK au récepteur. D'ailleurs, des résultats récents, qui
ne sont pas présentés ici, démontrent bien que cet antagoniste ne peut empêcher la liaison de
la BK tritiée dans un essai de liaison comme l'icatibant et le NPC 17731 le font par
l'intermédiaire fort probablement de leur extrémité N-terminale, supportant une fois de plus
Ir modèle du RBl à deux sites de liaison.
La visualisation de récepteurs couplés aux protéines G Fusionnés à la GFP a été
introduit pour étudier le cycle du récepteur P+drénergique (Bank et coll., 1997).
Normalement. les propriétés pharmacologiques de la protéine de Fusion demeurent
cornpuables à la protéine naturelle lorsqu'il y a addition de la GFP a son extrémité C-
terminale (Milligan, 1999). C'est le cas pour notre construction RB,-GFP qui a conservé une
affinité de liaison pour ainsi dire identique à celle du RB2 naturel. De plus. à de faibles
concentrations de BK, I'observation du relâchement d'acide arachidonique et de
l'intemalisation rapide du récepteur induite par l'agoniste indique que la fonction de la
protéine de fusion est lvgement intacte. Toutefois, la compétition de la liaison de la BK
tritiée par l'icatibant suggère qu'il y a une perte mineure de l'affinité de la protéine de fision
pour cet antagoniste par rapport au RB1 de lapin naturel (Bachvarov et coll.. 1995). Ce fait
pourrait être expliqué par une contrainte structurale imposée par l'addition de la GFP. une
protéine d'environ 29 kDa, tout près du domaine transmembranaire 7 du RB2. En effet,
contrairement à la BK, la région C-terminale de ka t iban t semble impliquer le TM7 pour sa
liaison au récepteur (Jarnagin et coll.. 1996). Malgré cette légère perte d'affinité du RB,-
GFP, les trois antagonistes testés ont conservé leur propriété originale de surmontabilité
relativement à l'action de la BK sur le récepteur lorsque testés à 37OC dans un essai de la
phospholipase A2.
L'intemalisation du RB2 induite par l'agoniste BK est très bien documentée. La
phosphorylation d'une région riche en résidus sénne et thrionine dans le domaine
intracellulaire C-terminal serait impliquée (Pizard et coll., 1999). De plus, certains travauy
montrent que la BK induit rapidement I'intemalisation du RB, dans des vésicules
intracellulaires, les caveolae (de Weerd et Leeb-Lundberg, 1997 ; Haasemann et coll., 1998).
Certains éléments de nos résultats tendent à supporter l'idée d'une intemalisation du RBZ-
GFP hdliite nar r !es tln.&gonistes non conpédrifs iréversib!es, m i s non p z des mtqcnis~es
compétitifs réversibles comme le LF 16.0687. En effet, des expériences plus poussées sur la
liaison des antagonistes au RB,-GFP ont montré que la liaison de ces trois médicaments est
largement réversible suite à des lavages à OaC, particulièrement à des concentrations
inférieures i 1 PM. Touterois, les deux peptides ont apparemment soustrait. à de faibles
concentrations, les sites de liaison de la surface des cellules à 37°C. L'agoniste BK n'a pas
eu de tels effets durables après les 3 h de la période de lavage malgré le fait que le RBI est
rapidement internalisé dans les cellules suite à une stimulation par un agoniste. suggérant
ainsi le recyclage des récepteurs vers la surfûce des cellules au cours de la période de lavage.
De plus, les effets des antagonistes du RB2 LF 16.0687. NPC 17731 et icatibant sur la
distribution subceilulaire du récepteur de surface après 24 h d'exposition vont dans le même
sens que les effets des médicaments sur la liaison de la BK à 37OC. Les deux peptides
irréversibles induisent une perte de la fluorescence membranaire du RB,-GFP et une
translocation apparente des récepteurs dans des structures intracellulaires mal définies.
Comme ces observations sont effectuées après 24 h de traitement, cela suggère que le taux
d'internalisation du récepteur est supérieur au tau?< constant de sa synthèse qui est controllée
par le promoteur fort du cytomégalovirus se trouvant dans le vecteur d'expression. Ces effets
et leurs cinétiques sont très différents de ceux de l'agoniste BK qui intemalise très
rapidement les récepteurs fluorescents dans de petites vésicules, appuyant les découvertes
récentes sur la redistribution sucessive des RB2 vers les caveolae, puis les endosornes suite à
une stimulation par l'agoniste (de Weerd et Leeb-Lundberg, 1997 ; Haasemann et coll.,
1998). Finalement, la BK ou l'un des peptides antagonistes sont en mesure de transférer une
partie du RB-GFP buno réac t i f d'une hc t ion de faible densité, correspondant aux
membranes plasmatiques, a une hct ion plus dense, contenant les lysosomes et les
endosornes (Lodish et coll., 1995). Cette translocation du récepteur confirme une fois de plus
les observations récentes de l'intemalisation du RB, (de Weerd et Leeb-Lundberg, 1997 ;
Haasemann et d l . , 1998 ; Pizard et coll., 1999). Fait à remarquer, le NPC 1773 1 est
généralement moins efficace que l'icatibant pour séquestrer le récepteur dans les cellules.
L'antagoniste LF 16.0687 n'est pas actif dans ce sens, en accord avec le fait que les
récepteurs fonctionnels sont récupérés lorsque le médicament est lavé. Ainsi, une forme de
signalisation - spécifique pour les deux antagonistes insurmontables menant à une
séquestration subséquente du RBZ pourrait expliquer leur faible réversibilité dans les essais
biologiques. Cette signalisation ne serait pas conventionnelle puisque ces médicaments n'ont
pas d'activité agoniste détectable dans le récepteur B2 naturel de lapin ou la protéine de - *
La suggestion de la destruction des RB, induite par I'icatibant supportée
précédemment par I'irnmunohistochimie du récepteur dans les tissus de lapin mi té avec le
médicament (Marceau et coll.. 1999) ne va pas entièrement dans le même sens que la
redistribution subcellulaire induite par l'antagoniste sans destruction significative du RB2-
GFP montrée par analyse de weskrn. La divergence dans ces observations provient peut-être
d'une perte de l'immunoréactivité des RB, intemalisés dans les tissus ou d'une saturation des
mécanismes de destruction du récepteur dans les cellules HEK 293 exprimant le RB2-GFP 8
un niveau élevé. Ce système expérimental, soit le RB,-GFP exprimé de façon hétérologue
dans les cellules HEK 293, est convenable pour tester différentes hypothèses au sujet du
mécanisme de séquestration induite par un antagoniste, qui pourrait impliquer un
comportement agoniste partiel de I'icatibant et du NPC 1773 1 (quoique ce comportement
n'est pas détecté dans aucun des essais fonctionnels effectués), la phosphorylation et les voies
d'intemalisation communes à celles recrutées par les agonistes, ou un nouveau mécanisme
différent.
Peut-être en relation avec les données et observations présentées, un groupe de
recherche a montré, en utilisant des anticorps anti-icatibant, l'intemalisation et la distribution
cytosolique de l'icatibant dans une minorité de cellules formant l'épithéliu'~: du néphron
distal après une simple injection intraveineuse du médicament à des rats (Vio et coll., 1996).
Cet épithélium distal est particulièrement riche en RB,, et les auteurs ont suggéré qu'une
forme de captation de l'antagoniste médiée par le récepteur a lieu. Ce n'est toutefois pas clair
pourquoi seulement une certaine proportion des cellules possédant le récepteur était capable
de cette prise. Il y a également certaines indications que l'icatibant n'est pas totalement
surmontable dans le RB, de rat. De plus, il serait un agoniste inverse lorsqu'utilisé sans
agoniste, c'est-à-dire qu' il décroîtrait la signalisation de base du RB2 (Leeb-Lundberg et coll.,
1994). L'importance de l'inactivation du récepteur induite par un antagoniste dans la
phmacothénpie n'est pas claire, ni même si la liaison d'autres antagonistes
pharmacologiques ayant une faible réversibilité peut stimuler la siquestration des récepteun.
Toutefois, il est intéressant de noter que pratiquement tous les antagonistes du récepteur AT,
de l'angiotensine utilisés en clinique (ou leur métabolite actif) exercent a des degrés variables
l'antagonisme non équilibre insumiontable (Vanderheyden et coll., 1999). La régulation
négative des récepteurs induite par un antagoniste serait un avantage potentiel lorsque
l'inhibition de la liaison de l'agoniste à ces récepteurs est physiologiquement compensée par
une augmentation de la concentration de l'agoniste, comme c'est le cas avec l'angiotensine
II, parce qu'il n'y aurait pas une surstimulation des récepteurs lorsque le médicament
antagoniste est métabolisé. Dans le cas des antagonistes du RB, dans le lapin vivant, une
étude récente a démontré que l'icatibant est plus puissant que n'importe lequel des
antagonistes réversibles testés dans des essais hémodynarniques et ce, malgré le fait que
certains des autres antagonistes sont plus puissants que l'icatibant in vitro (Gobeil et ~ 0 1 1 . ~
1999).
Les travaux présentés ici ont permis (ou vont permettre) d'approfondir la façon par
laquelle les cascades protéolytiques du sang communiquent avec différentes cellules, soit par
l'interaction d'un peptide formé, pharmacologiquement actif, avec des ricrpteurs couplés aux
protéines G se trouvant à la surface de ces cellules.
5.1 Le récepteur de lapin pour l'anaphylntoxine C5a
Cette étude a permis de définir un ensemble db.itils moléculaires efficaces (séquence
du récepteur, ligand agoniste, anticorps monoclonal spécifique) pour l'étude du récepteur du
Cja de lapin. dont l'homologie de séquence avec le récepteur humain est très élevée. Ces
outils vont ainsi permettre de futures études sur le rôle du C j a dans des modèles
physiologiques et pathologiques basés sur le lapin comme modèle animal (athérosclérose,
inflammation). Les informations précises sur la séquence vont également permettre des
études de régulation basées sur une approche de RT-PCR ainsi que la production d'anricorps
anti-récepteur plus spécifiques. Que la réponse tissulaire au récepteur du C5a soit limitée aux
cellules de la lignée hématopoïétique et donc amplifiée par une infiltration pathologique de
Leucocytes (Petitclerc et coll., 1996), ou que ce récepteur puisse échapper à ce patron
d'expression spécifique aiLu tissus et devenir largement exprimé sous certaines conditions
stimulatrices (Sayah et coll., 1997) sont également des thèmes d'intérêt pour de futures
études moléculaires.
5.2 Le récepteur B, de lapin
Cette étude a portée essentiellement sur la caractérisation du comportement
antagoniste de différents ligands du RB2 de lapin et des effets de l'antagonisme de type non
compétitif et irréversible sur la population de récepteur. Elle a permis d'établir ou de
confirmer la nature non compétitive et irréversible du NPC 17731, de I'icatibant et du
composé 9 et la nature compétitive et réversible du LF 16.9687 chez le lapin. II a aussi été
possible d'établir un lien entre le type de compétitivité conféré à chacun de ces antagonistes
et leurs sites d'interactions probables avec le récepteur. qui dépend de la structure
moléculaire du ligand, en se basant sur un modèle proposé à d e w sites de liaison de la BK
sur le RB,. D'ailleurs, nos résultats suggèrent clairement que l'icatibant et la BK se lient à
deux domaines distincts du récepteur de lapin. l'un de ces domaines érmt commun pour ces
deux ligands et l'autre étant différent pour une interaction spécifique avec leur extrémiti C-
terminale. L'hypothèse la plus évidente suivant ces observations est que la liaison d'un
ligand à ce domaine du récepteur avec lequel la BK n'interagit pas conférerait a ce ligand un
comportement antagoniste de type non compétitif et irréversible, comme c'est le cas pour
l'icatibant, le NPC 17731 et le composé 9. La production de RB, ayant des mutations
ponctuelles empêchant La liaison de ces antagonistes et non celle de la BK semble nécessaire
pour confirmer l'existence d'un troisième site majeur de liaison exclusif a ~ x antagonistes non
compétitif. La construction de récepteurs chimériques humaidlapin est également envisagée
afin de codirmer cette hypothèse puisque l'antagonisme exercé par ces médicaments dépend
également de l'espèce (l'icatibant a un comportement compétitif et réversible avec le
récepteur humain).
Le peu de réversibilité des deux peptides antagonistes a également pu être élucidé en
partie grâce à la construction d'une protéine de fusion RB2-GFP pharmacologiquement
fonctionnelle. En effet, il a été possible d'observer la séquestration de ce récepteur
fluorescent suite a la liaison des peptides antagonistes testés ou de la BK et leur translocation
dans des structures intracellulaires mal définies ayant une densité semblable aux endosomes
et aux lysosomes. L'intemalisation induite par la BK du RBI-GFP ou du RBL sauvage (déjà
dicrite dans la littérature) est toutefois fort différente de celle provoquée par I'icatibant et le
NPC 1773 1, peut-être en lien avec le troisième site majeur de liaison suggéré sur le récepteur
avec lequel ces antagonistes peuvent interagir contrairement à la BK. D'autres hypothèses
comme un comportement agoniste partiel. une phosphorylation et des voies d'internalisation
semblables à ou différentes de celles utilisées par la BK peuvent également Stre avancées
pour expliquer la séquestration des récepteurs par les antagonistes irreversibles ainsi que les
diffërences avec l'internalisation induite par un agoniste. Actuellement. une lignée de
cellules HEK 293 exprimant de façon stable un RB2 muté dans son domaine C-terminal
intracellulaire au niveau des sites de phosphorylation sérinr et thréonine est en voie de
production. Ces sites de phosphorylation sont reconnus pour être necessaire a
l'intemalisation du récepteur par I'agoniste. Le récepteur mutant va donc nous permettre de
diterminer si l'absence de ces sites va affecter le comportement pharmacologique des
antagonistes non compétitif et irréversible. Bref. les expériences effectuées ont donné des
résultats excitants et les conclusions dégagées de nos observations permettent d'émettre bon
nombre d'hypothèses très intéressantes que le modèle développé du RBI-GFP exprimé dûns
un système hétérologue va certainement permettre d'investiguer.
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ANNEXE A
Liste des articles publiés ou soumis
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Bouthillier, J., Bachvarov, D. R., Stewart, J; M. et phmacological antagonism at the rabbit B, receptor.
![Paris tu m'a pris...[2][1]](https://img.pdfslide.fr/doc/110x75/58f3890b1a28abed088b4577/paris-tu-ma-pris21.jpg)
