Les métalloprotéases matricielles 2 et 9 et la ...thesesups.ups-tlse.fr/62/1/De_Barros_Sandra._pdf.pdf · Remerciements En préambule à ce travail, je tiens à exprimer toute ma

UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER

U.F.R sciences de la vie et de la terre

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III

Discipline : Innovation pharmacologique

Présentée et soutenue par

Sandra DE BARROS

Le 29 octobre 2007

Les métalloprotéases matricielles 2 et 9 et la différenciation des

cellules progénitrices du tissu adipeux humain

JURY

Professeur Marie-Christine RIO Rapporteur

Docteur Jean-Philippe BASTARD Rapporteur

Docteur Annie QUIGNARD-BOULANGE Examinateur

Professeur Philippe VALET Président

Docteur Jean GALITZKY Directeur de thèse

1

A mes parents

A Christophe, Carole et Adrien,

A Laurent.

2

Remerciements

En préambule à ce travail, je tiens à exprimer toute ma reconnaissance et mes sincères

remerciements à tous ceux qui ont participé de près ou de loin à ce travail.

Je tiens à remercier le Professeur Marie-Christine RIO et le Docteur Jean-Philippe

BASTARD d’avoir spontanément accepté d’évaluer ce travail en tant que rapporteur.

J’exprime également ma gratitude au Professeur Philippe VALET et au Docteur Annie

QUIGNARD-BOULANGE pour avoir si gentiment acceptés de participer à ce jury de thèse.

Les recherches qui ont fait l’objet de cette thèse ont été effectuées dans l’unité

INSERM U858 équipe 1, encadrées par les Docteurs Jean GALITZKY, Virginie

BOURLIER, Coralie SENGENES et Anne BOULOUMIE. Je leur suis très profondément

reconnaissante de m’avoir apporté leur soutien, leur confiance et leur disponibilité au cours

de ces trois années de thèse.

Je tiens tout particulièrement à remercier Max LAFONTAN pour ses précieux

conseils.

Je dis un grand merci à tous les membres (ou ex-membres) de l’équipe des allées et

particulièrement à Karine, Alec et Marie-Adeline pour toute l’aide qu’elles ont pu

m’apporter.

J’adresse mes remerciements à l’ensemble du personnel de l’unité INSERM U858 et

plus particulièrement à l’ex-unité INSERM U586 dirigé par le professeur Dominique

LANGIN, pour les nombreux services rendus. Une petite attention particulière pour Danièle,

Carine et Corinne régulièrement « nounous » des plaques taqman, ainsi que Pascale et Lydia

pour toutes les questions administratives que j’ai pu rencontrer… Je tiens également à

remercier les personnes du Laboratoire de Pharmacologie Médicale et Clinique, ainsi que

celle du Centre de Pharmacovigilance, deux services dirigés par le Professeur Jean-Louis

MONTASTRUC que je remercie.

Enfin, je ne saurai clore cette partie sans adresser mes sincères remerciements à ma

famille. J’adresse un grand merci à mes parents, à mon frère, à Carole et à Adrien. Je

remercie également Laurent pour sa présence, sa patience et son soutien quotidien.

3

Table des matières

Table des matières 4

Liste des figures 7

Liste des tableaux 9

Principales abréviations utilisées 10

Avant propos 12

Introduction 14

I- Le tissu adipeux 14

A) Les fonctions du tissu adipeux 14

A.1) Les fonctions métaboliques du tissu adipeux 15

A.1.1) Le stockage des lipides : la lipogenèse et la synthèse des

triglycérides 15

A.1.2) La mobilisation des lipides : la lipolyse 16

A.2) Les fonctions sécrétoires du tissu adipeux 17

B) Le développement normal du tissu adipeux 18

B.1) Le processus de détermination adipocytaire 19

B.2) Le processus de différenciation adipocytaire 22

B.2.1) Les étapes du processus de différenciation adipocytaire 22

B.2.2) Contrôle transcriptionnel de la différenciation adipocytaire 23

B.2.2.1) Les PPARs 23

B.2.2.2) Les C/EBPs 24

B.2.2.3) Le facteur SREBP-1 24

B.2.2.4) Les autres facteurs de transcription 25

B.2.3) Régulation hormonale et intracellulaire de la

différenciation adipocytaire 25

B.3) La vascularisation du tissu adipeux 26

C) Le développement excessif du tissu adipeux : l’obésité 28

C.1) Les modifications cellulaires du tissu adipeux 29

C.1.1) Les adipocytes et les cellules progénitrices/souches 29

C.1.2) Les cellules endothéliales 29

C.1.3) Les macrophages 30

4

C.2) Les modifications des fonctions métaboliques du tissu adipeux 31

C.3) Les modifications des fonctions sécrétoires du tissu adipeux 32

D) La régression du tissu adipeux : la lipoatrophie 34

D.1) Les modifications cellulaires du tissu adipeux 35

D.1.1) Les adipocytes 35

D.1.2) Les cellules progénitrices/souches 37

D.1.3) Les cellules endothéliales 39

D.1.4) Les macrophages 40

D.2) Les modifications des fonctions métaboliques du tissu adipeux 40

D.3) Les modifications des fonctions sécrétoires du tissu adipeux 41

II- Les métalloprotéases matricielles 43

A) Classification et structure 43

B) Les régulations des MMPs 45

B.1) Les Régulations transcriptionnelles et post-transcriptionnelles 45

B.2) Les régulations de la sécrétion 46

B.3) Les processus de maturation des MMPs 46

B.4) Les processus d’inhibition des MMPs 48

C) Mode d’action des MMPs 49

D) Les fonctions biologiques et pathologiques des MMPs 50

III- Les métalloprotéases matricielles dans le tissu adipeux 54

A) La régulation de l’adipogenèse 54

B) La régulation de l’angiogenèse 55

C) La régulation de l’infiltration macrophagique 55

D) Les régulateurs des MMPs dans le tissu adipeux 56

Objectifs 58

Résultats 59

I- Implication des MMPs dans la différenciation adipocytaire des

cellules de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux humain 59

A) Influence d’un inhibiteur des MMPs et des inhibiteurs de la protéase du VIH sur

5

la différenciation adipocytaire 59

B) Influence d’un anticorps neutralisant dirigé contre MMP-9 sur la

différenciation adipocytaire 61

C) Détermination des mécanismes impliqués dans la chute de l’expression de

MMP-9 par les inhibiteurs de la protéase du VIH 62

D) Études préliminaires et perspectives sur l’étude des cibles moléculaires de

MMP- 9 65

II- Implication des MMPs dans la différenciation des cellules CD34+/CD31-

isolées de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux humain 68

A) Influence d’un inhibiteur des MMPs sur la différenciation adipocytaire

des cellules CD34+/CD31- 69

B) Mise au point d’une condition de culture permettant simultanément les

capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31- 70

B.1) Etude de l’accumulation intracellulaire des triglycérides et de la

formation d’un réseau cellulaire positif pour le CD31 par les cellules

CD34+/CD31- cultivées dans un milieu mixte 70

B.2) Etude de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et

endothéliaux par les cellules CD34+/CD31- cultivées dans un milieu

mixte 72

B.3) Etude cinétique sur l’évolution des cellules CD34+/CD31- au cours de la

culture en milieu mixte. 73

C) Implication des contacts cellule-cellule dans les capacités adipogéniques et

angiogéniques des cellules CD34+/CD31- 76

C.1) Influence de la densité cellulaire sur les cellules CD34+/CD31- cultivées

en milieu mixte 76

C.2) Influence de la communication cellulaire via les jonctions gaps sur les

cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte 77

Conclusions et perspectives 80

Références bibliographiques 83

Annexes 103

6

Liste des figures

Figure 1 : Le tissu adipeux

Figure 2 : Lipogenèse et synthèse des triglycérides dans l’adipocyte

Figure 3 : Contrôle de la lipolyse dans l’adipocyte humain

Figure 4 : Les sécrétions du tissu adipeux

Figure 5 : Détermination et différenciation adipocytaires

Figure 6: Evolution de la matrice extracellulaire et de la forme cellulaire au cours de la

différenciation adipocytaire

Figure 7 : Progression des facteurs de transcription au cours de l’adipogènese dans les

préadipocytes de la lignée 3T3-L1

Figure 8 : Balance entre les facteurs de transcription pro- et anti-adipogéniques

Figure 9 : Comparaison entre les modifications du tissu adipeux lors d’une obésité ou d’une

lipoatrophie

Figure 10 : Les métalloprotéases matricielles

Figure 11 : Régulation de l’activité des métalloprotéases matricielles

Figure 12 : Eléments de liaison aux facteurs de transcription sur les promoteurs des

métalloprotéases matricielles

Figure 13 : Mode d’action des métalloprotéases matricielles

Figure 14 : Effet d’un anticorps neutralisant pour la MMP-9 sur la différenciation

adipocytaire des cellules de la FSV du tissu adipeux humain

Figure 15 : Hypothèse du mode d’action des IPs-VIH sur l’expression génique de MMP-9

Figure 16 : Influence d’un substrat matriciel sur la différenciation adipocytaire des cellules

de la FSV du TA humain

Figure 17 : Technique d’isolement des différentes populations de la FSV du tissu adipeux

humain

Figure 18 : Sécrétion des MMP-2 et -9 au cours de la différenciation adipocytaire des

cellules progénitrices CD34+/CD31- isolées

Figure 19 : Influence du batimastat sur la différenciation adipocytaire des cellules

progénitrices CD34+/CD31-

Figure 20 : Détermination de l’accumulation des TGs et de la formation d’un réseau

cellulaire positif pour le CD31 des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu adipogénique,

endothélial ou mixte

7

Figure 21 : Détermination de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et

endothéliaux des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu adipogénique, endothélial ou

mixte

Figure 22 : Evolution du contenu en ADN, TGs et du réseau cellulaire positif pour le CD31

des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte

Figure 23 : Evolution de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et endothéliaux

des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte

Figure 24 : Influence de la présence de cellules endothéliales matures sur la formation du

réseau cellulaire positif pour le CD31 des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte

Figure 25 : Influence de la densité cellulaire sur les capacités adipogéniques et

angiogéniques des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte

Figure 26 : Evolution de l’expression en ARNm des connexines 43 et 45 des cellules

CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte

Figure 27 : Effet d’un inhibiteur des jonctions gaps sur les capacités adipogéniques et

angiogéniques des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte

8

Liste des tableaux

Tableau 1: Les différents modèles de culture cellulaire utilisés pour l’étude de l’adipogenèse

Tableau 2: Facteurs extracellulaires et molécules de signalisation régulant l’adipogenèse

Tableau 3 : Classification des adultes maigres, normaux, en surpoids et obèses selon l’IMC

Tableau 4: Sécrétions du tissu adipeux modulées ou non au cours de l’obésité

Tableau 5: Classification des différentes lipoatrophies humaines

Tableau 6: Impact des IPs-VIH et des INRTs sur les sécrétions adipocytaires in vitro et in

vivo

Tableau 7: Classification des métalloprotéases matricielles

Tableau 8 : Les activateurs des MMPs

Tableau 9: Phénotypes des souris déficientes pour les MMPs

Tableau 10: Les inhibiteurs des MMPs dans le cancer

Tableau 11: Composition des milieux adipogénique, endothélial et mixte utilisés

Tableau 12: Détermination de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et

endothéliaux par des adipocytes matures, des cellules progénitrices CD34+/CD31- et des

cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+

Tableau 13: Expression en ARNm des connexines 43, 45, 40 et 37 dans des adipocytes

matures, des cellules progénitrices CD34+/CD31- et des cellules endothéliales capillaires

CD34+/CD31+

9

Principales abréviations utilisées

ACC : Acetyl Co-A carboxylase

ADAM: A Disintegrine And Metalloprotease domain

AGA: 18α-glycyrrhetinic acid

AGNE: acide gras non estérifié

AP-1: Activator protein-1

aP2 : fatty acid binding protein

ATGL : adipocyte triacylglycerol lipase

bFGF : basic fibroblast growth factor

bHLH : basic helix-loop helix

BMP : Bone morphogenetic protein

CD : Cluster de différenciation

C/EBP : CCAAT/enhancer binding protein

CHOP-10 : C/EBP homologous protein 10

CRABP-1 : Cytoplasmic retinoic acid binding protein-1

ECBM : Endothelial cell basal medium

ECGM : Endothelial cell growth medium

FAS : Fatty acid synthase

FSV: Fraction stroma-vasculaire

GLUT : Glucose transporteur

GZA : glycyrrhizic acid

IDV : Indinavir

IGF : Insulin growth factor

IκB: Inhibitor NF-κB

IL : Interleukine

IMC : Indice de masse corporelle

INRT : Inhibiteur nucléosidique de la réverse transcriptase

INNRT: Inhibiteur non nucléosidique de la réverse transcriptase

IPs-VIH : Inhibiteur de la protéase du VIH

LHS : Lipase hormono-sensible

LPL : Lipoprotéine lipase

MCP-1 : Monocyte chemoattractant proteine 1

10

MEC : Matrice extracellulaire

MMP : Métalloprotéase matricielle

MT-MMP : Métalloprotéase matricielle de type membranaire

NF-κB : Nuclear factor kappa B

NFV : Nelfinavir

PAI-1 : Plasminogen activator inhibitor 1

PDGF : Platelet-derived growth factor

PKA : Protein kinase A

RT-PCR :Real-time polymerase chain reaction

RTV : Ritonavir

RXR : Récepteur de l’acide 9-cis-rétinoique

SDF-1 : Stromal cell-derived factor-1

SQV : Saquinavir

SREBP: Sterol regulatory element binding protein

TA : Tissu Adipeux

TCF/LEF : T-cell factor/lymphoid enhancer factor

TIMP : Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases

TGs : Triglycérides

TNF-α : Tumor necrosis factor α

VEGF : Vascular endothelial growth factor

VIH : Virus de l’immunodéficience humaine

VLDL : Very low density lipoprotein

vWF : von Willebrand Factor

11

Avant-propos

Le tissu adipeux (TA) adulte peut subir des processus de développement excessif

(surpoids, obésité) mais aussi des processus de régression (lipoatrophie). Ces deux

phénomènes entraînent des altérations de la composition cellulaire et des fonctions du TA. Il

est désormais reconnu qu’un excès ou une perte de masse grasse constitue un facteur

aggravant de nombreuses pathologies telles que le diabète de type 2 et les désordres

cardiovasculaires.

Le surpoids touche, aujourd’hui, près d’un milliard de personnes à l’échelle de la

planète, soit un sixième de la population mondiale. Parmi elles, 300 millions sont obèses et

l’obésité infantile est en plein essor. Les causes de l’obésité sont multiples et dépendent aussi

bien de facteurs génétiques qu’environnementaux. A l’heure actuelle, quelques médicaments

avec une indication pour l’obésité (orlistat, sibutramine) ont été développés mais leur

efficacité reste insuffisante.

Les syndromes de lipodystrophies étaient des événements rares (moins de 1 cas sur

100000) et de causes principalement génétiques. Ces dix dernières années sont apparues des

formes de lipodystrophies liées aux traitements antirétroviraux de l’infection par le virus de

l’immunodéficience humaine (VIH). En effet, si l’utilisation des inhibiteurs de la protéase du

VIH (IPs-VIH) et des inhibiteurs nucléosidiques de la reverse transcriptase (INRTs) ont

permis de diminuer significativement la morbidité et la mortalité des patients infectés par le

VIH, plus de 50% des patients traités ont développé un syndrome lipodystrophique se

caractérisant par une redistribution des dépôts adipeux et des complications métaboliques. Le

signe clinique majeur du syndrome lipodystrophique est une lipoatrophie au niveau de la face

et des membres associée ou non à une accumulation du TA au niveau des régions dorso-

cervicales et abdominales. Quelques approches thérapeutiques pour le traitement des

lipoatrophies ont été développées (thiazolidinedione, metformine) mais elles agissent plus sur

les complications métaboliques associées que sur l’altération du TA elle-même.

Ainsi, une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans l’extension et la

régression de la masse grasse est maintenant nécessaire afin d’identifier de nouvelles cibles

thérapeutiques. Dans ce chapitre d’introduction, nous allons dans une première partie nous

intéresser au TA, à ses fonctions et à son développement normal. Nous aborderons aussi les

modifications tant cellulaires que fonctionnelles que le TA subit lors d’une obésité ou d’une

lipoatrophie. Puis dans une deuxième partie, nous nous intéresserons aux principaux acteurs

12

impliqués dans la régulation des phénomènes de remodelage tissulaire, les métalloprotéases

matricielles ou MMPs. Leur classification, leur structure ainsi que la régulation de leur

activité seront présentées. Enfin, leur mode d’action et les fonctions biologiques auxquelles

ces protéases sont associées seront décrits. Enfin nous aborderons le rôle potentiel de ces

enzymes dans la plasticité du TA.

Nos travaux de recherche portant sur la caractérisation (i) du rôle de la MMP-9 dans

les processus de différenciation adipocytaire et (ii) des interactions entre les inhibiteurs de

protéases utilisées lors de la thérapie du VIH avec les voies dépendantes de MMP-9, seront

ensuite exposés. Enfin, une dernière partie de notre travail portant sur la caractérisation des

cellules progénitrices du TA humain en condition de culture permettant d’exprimer leurs

capacités angiogéniques et adipogéniques sera décrite.

13

Introduction

I. Le tissu adipeux

Le tissu adipeux (TA) est doué d’une importante plasticité. Il est en effet capable de

croître ou d’involuer de manière spectaculaire. Avant de nous intéresser au développement

excessif du TA ainsi qu’à sa capacité de régression, un aperçu de la fonction propre du TA

nous semble nécessaire.

A) Les fonctions du tissu adipeux

Deux grands types de TA sont présents chez les mammifères : le TA blanc et le TA

brun. Ces deux tissus ont des propriétés biochimiques et fonctionnelles distinctes. Le TA

brun se retrouve surtout chez les rongeurs et, chez l’homme, il est initialement présent chez le

nouveau-né et joue un rôle clé dans la gestion de la thermogenèse (libération d’énergie sous

forme de chaleur). Le TA blanc, dont nous parlerons exclusivement dans la suite de ce

travail, constitue la principale réserve d’énergie de l’organisme. Il comprend différents dépôts

anatomiques localisés dans les territoires sous-cutanés et viscéraux. Cette notion de

localisation du TA est essentielle puisque selon que le TA soit sous-cutané ou viscéral, son

organisation cellulaire va varier ainsi que son activité métabolique et sécrétoire (81, 136,

270).

Au cours de ces dernières années, les recherches sur le TA ont permis de faire

émerger les concepts et rôles clés du TA dans le contrôle des flux métaboliques ainsi que la

notion de TA endocrine. Ainsi, le TA n’est plus décrit comme un simple tissu de soutien et de

protection. Les adipocytes sont le type cellulaire majeur du TA. Ils assurent la fonction

métabolique du tissu (stockage et dégradation des triglycérides (TGs)) mais sont également

considérés comme une source cellulaire des sécrétions du TA. L’adipocyte est caractérisé par

une morphologie polygonale et une grande taille avec un diamètre moyen de 70µm chez le

sujet normo-pondéré. La quasi-totalité de la cellule est occupée par une unique vacuole

lipidique et le cytoplasme et les organites constituent un fin liseré périphérique (figure 1A).

Ces caractéristiques ainsi que sa flottaison in vitro permettent de le distinguer et de l’isoler

facilement de la fraction non adipocytaire du TA, la fraction stroma-vasculaire (FSV),

14

Figure 1 : Le tissu adipeux(A)

Morphologie des adipocytes(B)

Composition cellulaire

B

A

Microcirculation

Adipocyte

Préadipocyte

Macrophage

Cellule

souche/progénitrice

Vacuole lipidique

Noyau de l’adipocyte

Membrane cytoplasmique de l’adipocyte

contenant principalement des cellules progénitrices/souches, des cellules vasculaires et des

cellules immuno-inflammatoires (figure 1B).

A.1) Les fonctions métaboliques du tissu adipeux

Brièvement, nous aborderons dans les paragraphes suivants les mécanismes et les

voies de régulation des principales fonctions métaboliques adipocytaires : le stockage des

lipides (lipogenèse et synthèse de TGs) et leur dégradation (la lipolyse).

A.1.1) Le stockage des lipides : la lipogenèse et la synthèse des triglycérides

Le stockage des lipides dans l’adipocyte se fait par 2 voies (figure 2). La première

voie correspond à la capture directe des TGs associés aux chylomicrons et aux lipoprotéines

de très faible densité (ou VLDL pour « very low density lipoprotein ») circulants, provenant

de l’alimentation ou de la lipogenèse hépatique. La LPL (lipoprotéine lipase), produite et

sécrétée par les adipocytes, est ancrée par des protéoglycanes à héparane sulfate à la surface

endothéliale (87). En coopération avec GPIHBP1 (glycosylphosphatidylinositol-anchored

high density lipoprotein-binding protein 1) récemment décrite comme étant exprimée à la

surface endothéliale et comme jouant le rôle de récepteur potentiel aux chylomicrons et

VLDL, la LPL hydrolyse les lipoprotéines (11, 297). Les acides gras non estérifiés issus de

ce clivage sont ensuite recaptés par l’adipocyte, qui les transforme alors en acyl-Co enzyme

A (Acyl-CoA). Ils seront ré-estérifiés en TGs en présence de glycérol. La deuxième voie

correspond à la lipogenèse de novo. Le terme de lipogenèse proprement dit désigne la

néosynthèse d’acides gras à partir du glucose. Après l’entrée du glucose dans l’adipocyte,

grâce à des transporteurs spécifiques (GLUT-1 et 4), le glucose est dégradé en pyruvate par le

processus de la glycolyse. A partir du pyruvate, l’acétyl-CoA carboxylase (ACC) et la

synthase des acides gras (FAS, « fatty acid synthase ») interviennent de façon successive

pour catalyser la formation des acides gras à longue chaîne saturée. L’action des différentes

désaturases permet de synthétiser des acides gras plus ou moins saturés. Comme

précédemment, ces acides gras sont ensuite ré-estérifiés pour donner les TGs. Il est nécessaire

de préciser que chez les rongeurs, la lipogenèse est réalisée dans le foie et le TA. Par contre,

chez l’homme, la lipogenèse est majoritairement hépatique et elle n’est qu’accessoire dans le

TA (145), excepté suite à un régime alimentaire riche en glucides (105). De nombreux

facteurs endocrines et paracrines tels que les catécholamines, l’hormone de croissance et la

15

Figure 2 : Lipogenèse et synthèse des triglycérides dans l’adipocyteGLUT: glucose transporter; DHAP: dihydroxyacétone

phosphate; TG: triglycérides; ACC: acétyl

Coenzyme A (CoA) carboxylase; FAS: fatty

acid

synthase; AGNE: acide gras non estérifié; LPL: lipoprotéine lipase; VLDL: very

low

density

lipoprotein

D’après Fève B., Médecine clinique, 2003

Glucose

GLUTGlucose

TG

Glucose-6-P

Transporteur

AGNE

AGNE

TG:Chylomicrons

VLDL

LPL

LPL

Vaisseaucapillaire

Acétyl-CoA

Palmitate

Acyl-CoA

Pyruvate

DHAPGlycéro

l-3-P

Malonyl-CoAEstérification ACC

FAS

Lipogenèse de novoGlycolyse

Origine alimentaire des acides gras

leptine sont capables de contrôler le stockage des TGs mais le facteur majeur est l’insuline

qui stimule cette voie en augmentant le captage du glucose via le recrutement du transporteur

GLUT-4 à la membrane, et en activant les enzymes glycolytiques et lipogéniques (120). De

façon intéressante, les effets inhibiteurs de la leptine et de l’hormone de croissance sur le

stockage des TGs passent par l’inhibition des effets stimulateurs de l’insuline.

A.1.2) La mobilisation des lipides : la lipolyse

La lipolyse assure la dégradation des TGs contenus dans les vacuoles lipidiques de

l’adipocyte, en glycérol et acides gras non estérifiés. Plusieurs lipases interviennent de façon

séquentielle dans cette hydrolyse des réserves lipidiques (figure 3). La lipase hormono-

sensible (LHS) clive les TGs en diglycérides puis les diglycérides en monoglycérides, et

constitue l’enzyme limitante du processus lipolytique. La lipase des monoglycérides (LMG)

dégrade ensuite les monoglycérides en glycérol et acides gras non estérifiés. Cependant, la

mise en évidence d’une activité lipolytique diminuée mais toujours présente chez des souris

invalidées pour le gène de la LHS a laissé supposer l’existence d’au moins une autre lipase

capable d’hydrolyser les TGs dans les adipocytes (196). Trois laboratoires différents ont

identifié une nouvelle lipase dénommée « adipocyte triacyglycerol lipase » (ATGL),

isoforme ζ d’une phospholipase indépendante du calcium (iPLA2ζ) ou desnutrine (113, 277,

303). L’ATGL jouerait un rôle clé dans la lipolyse basale, mais l’hydrolyse des TGs et des

diglycérides par la LHS demeurerait l’étape limitante dans la lipolyse stimulée par les

principaux agents lipolytiques chez l’homme, les catécholamines et le peptide atrial

natriuretique (142). Les mécanismes susceptibles de réguler l’activité de la LHS sont bien

connus et sont présentés dans la figure 3 (135). L’activité de cette lipase dépend

spécifiquement de sa phosphorylation réversible par une kinase dépendante de l’AMPc

(PKA) (100) ou du GMPc (PKG) (240). La phosphorylation de la LHS active l’enzyme, en

démasquant le site catalytique. Par ailleurs, cette phosphorylation permet une redistribution

de la lipase du cytoplasme vers la vacuole lipidique. Les périlipines, protéines abondamment

exprimées à la surface des gouttelettes lipidiques, interviennent dans la localisation et la

stabilisation de la LHS à la surface des vacuoles. La phosphorylation des périlipines par la

PKA et la PKG réduit leur ancrage à la gouttelette lipidique et favorise ainsi l’accès de la

LHS à ses substrats lipidiques.

16

Figure 3 : Contrôle de la lipolyse dans l’adipocyte humainLes catécholamines activent les récepteurs α2

-adrénergiques (α2

–AR) et β1/2/3

-adrénergiques (β1/2/3

–

AR) modulant négativement et positivement l’activité de l’adénylyl-cyclase

(AC) respectivement. Outre le récepteur α2

–AR, de nombreux autres récepteurs sont couplés négativement à l’AC. C’est notamment le cas des récepteurs à l’adénosine (A1

-R), aux prostaglandines (EP3

-R), au neuropeptide Y (NPY-Y1

-R) et à l’acide nicotinique (HM74A). L’AC produit de l’AMPc

qui va activer une protéine kinase dépendante de l’AMPc

(PKA). L’insuline possède une action antilipolytique. Son mécanisme d’action implique la phosphatidyl-inositol

3 kinase (PI3-K), la protéine kinase B (PKB/Akt) et la phosphodiestérase-3B (PDE-3B) qui diminue les taux intracellulaires d’AMPc

transformé

en 5’-AMP. L’ANP et le BNP stimulent le NPR-A dont l’activité guanylyl-cyclase

(GC) génère du GMPc. Le GMPc

stimule une protéine kinase dépendante du GMPc

(PKG ou cGK-I). La PKA et la PKG activent par phosphorylation les périlipines

et la lipase hormono-sensible

(LHS) qui va transloquer à la vacuole lipidique et participer, avec l’adipocyte triacylglycérol

lipase (ATGL) et la monoglycéride

lipase (LMG), à l’hydrolyse des triglycérides (TGs) en glycérol et acides gras non estérifiés (AGNE).

Ade

nyly

lcyc

lase

αsγβ αi

γβ

Gs Gi

InhibitionAdrénaline (α2A -AR)Adénosine (A1 -R)Prostaglandines (EP3 -R)Neuropeptide Y/peptide YY (NPY1 -R)Acide nicotinique (HM74A)

ActivationNoradrénalineAdrénaline (β1 - β2 -AR)Parathormone (PTH-R)

ATPAMPc

PKA

R CR C

InhibitionInsuline (I-R)

GCGC

KH

D

GTP

GMPc

ActivationAtrial Natriuretic PeptideBrain Natriuretic Peptide(NPR-A)

P-Tyr-PPI3K

PKBAkt

PDE-3BPDE-3B

Ser-P

-

+

+

PKG

R CR C

5’-AMP

LHS

Ser-P

MembranePlasmique

+ +

+

TG

Diacylglycérol

Monoglycéride

AGNE Glycérol

AGNE

AGNEATGL

LMG

A.2) Les fonctions sécrétoires du tissu adipeux

D’un point de vue quantitatif, les acides gras libres, issus de la lipolyse et libérés dans

la circulation sanguine, représentent le principal produit de sécrétion du TA (265). Cependant

le TA est également capable de synthétiser et de sécréter une multitude de facteurs qui

agissent soit localement de façon autocrine et/ou paracrine, soit parfois de façon endocrine.

On désigne sous le terme « adipokines », l’ensemble des facteurs bioactifs produits et

sécrétés par le TA. Historiquement, la LPL est la première adipokine découverte (49).

Toutefois, c’est la découverte de la leptine, hormone synthétisée par le TA et intervenant

dans le contrôle de la prise alimentaire, qui a permis au TA d’acquérir le statut d’organe

endocrine (302). Suite à cette découverte, d’autres facteurs produits et sécrétés par le TA ont

été décrits, on en compte actuellement plus d’une cinquantaine qui diffèrent tant au niveau de

leur structure que de leur fonction : des hormones (stéroïdes et glucocorticoïdes), des

cytokines (TNFα, IL-6, IL-8), des facteurs de croissance (TGF-β), des protéases (MMP-2 et

9) et des anti-protéases (TIMP, PAI-1) (81). Plusieurs fonctions physiologiques leur sont

associées, du contrôle du métabolisme lipidique, à l’angiogenèse et l’inflammation (figure 4).

Excepté la leptine et l’adiponectine considérées comme spécifiques des adipocytes, les

adipokines apparaissent comme étant également exprimées et produites par les cellules de la

fraction non adipocytaire du TA, i.e la FSV (72). Des différences dans l’activité de sécrétion

mais également dans le type d’adipokines ont été décrites dans les TA humains sous-cutanés

et viscéraux (72, 136).

En résumé, l’adipocyte présente deux fonctions principales, le stockage des

lipides selon le processus de lipogenèse ainsi que celui de la synthèse des TGs, et la

mobilisation des lipides via le processus de lipolyse. Ces activités métaboliques sont

étroitement régulées par des signaux neuro-humoraux. De plus, grâce à une capacité

sécrétoire aussi multiple que variée, le TA joue un rôle endocrine permettant d’assurer

une communication avec de nombreux organes et tissus mais aussi un rôle paracrine et

autocrine permettant une communication locale entre les différents types cellulaires qui

le composent.

Voyons à présent les mécanismes impliqués dans le développement normal de la masse

grasse. Nous nous intéresserons ensuite aux modifications cellulaires du TA et de ses

principales fonctions au cours d’un développement excessif ou d’une régression.

17

Figure 4 : Les sécrétions du tissu adipeux

Adipocytes

Métabolisme lipidique et des lipoprotéines

Lipoprotéine lipaseAcylation stimulating

protein

(ASP)Prostaglandines Acide lysophosphatidique

(LPA)Retinol

binding

protein

(RBP)Cholesteryl

ester transferase

protein

(CETP)Autotaxine

(phospholipase

D)

Tonus vasculaire et angiogenèse

Vascular

endothelial

growth

factor

(VEGF)MonobutyrineLeptineFIAF (PGAR ou angiopoietin

like

4)Angiopoietin

2Angiotensinogène

et Angiotensine IIMetalloprotéases

de type 2 et 9 (MMP-2 et

-9)Apeline

Réponse immunitaire et inflammatoire

Tumor

necrosis

factor

α

(TNF-α)Interleukines 6 et 8 (IL-6 et

IL-8)Plasminogen

activator

inhibitor-1 (PAI-1)HaptoglobineSerum

amyloïd

A (SAA)Monocyte chemoattractant

protein

(MCP-1)Métallothionéïne

Métabolisme et homéostasie énergétique

LeptineAdiponectineRésistineInterleukine 6 (IL-6)Apeline

B) Le développement normal du tissu adipeux

Le développement de lignées cellulaires fibroblastiques pluripotentes ou unipotentes a

largement contribué à l’identification et à la compréhension des événements cellulaires et

moléculaires impliqués dans la formation des adipocytes, i.e. la différenciation adipocytaire

ou adipogenèse. Le tableau 1 présente les principaux modèles de préadipocytes utilisés in

vitro pour l’analyse de l’adipogenèse ainsi que leur origine tissulaire (d’après (91)). Notons

que la majorité de ces modèles cellulaires sont d’origine embryonnaire et murine.

Tableau 1: Les différents modèles de culture cellulaire utilisés pour l’étude de l’adipogenèse

Nature de la culture Phénotype Nom Origine tissulaire

Lignées totipotentes Cellules ES Blastocystes murins

Lignées

pluripotentes

Muscle,

adipocyte blanc

10T1/2

hMADS

Embryons de souris C3H

TA humain

Lignées unipotentes Adipocyte blanc

Adipocyte brun

3T3-L1,

3T3-F442A

Ob17

Clone TA1

Clone A31T

Clone 1246

PAZ6

HIB 1B

Embryon de souris Swiss

TA épididymaire de souris ob/ob adulte

Clone dérivé des 10T1/2 traités par 5-

azacytidine

Lignée murine Balb/c3T3

Carcinome embryonnaire de souris C3H

Fœtus humain

TA brun de souris

Cultures Primaires Adipocytes

blanc ou bruns

FSV du TA TA blanc ou brun (rongeurs, lapins,

porcs, hommes…)

Voyons à présent les voies de régulation des processus de détermination et de

différenciation adipocytaires.

18

B.1) Le processus de détermination adipocytaire

Comme l’indique la figure 5, la détermination adipocytaire correspond à l’orientation

d’une cellule précurseur, supposée d’origine mésenchymateuse, vers la lignée adipocytaire.

Bien que les mécanismes impliqués dans ce processus soient encore peu connus, certains

facteurs susceptibles d’orienter le précurseur mésenchymateux vers le lignage adipeux ont été

identifiés (pour revue (79, 226)). C’est notamment le cas des voies de signalisation de delta

fos B et de l’acide rétinoïque mais aussi de Wnt, une glycoprotéine sécrétée impliquée dans

la croissance et le devenir cellulaire et des BMPs (bone morphogenic protein) appartenant à

la superfamille du TGF-β et impliqués dans le devenir des cellules mésenchymateuses. Le

facteur delta fos B inhibe l’adipogenèse en favorisant la différenciation ostéogénique (234).

L’activation de la voie Wnt inhibe également la différenciation adipocytaire en favorisant

l’orientation myogénique (230). Enfin, une exposition des cellules mésenchymateuses

multipotentes CH310T1/2 à du BMP-4 engage les cellules vers un lignage adipogénique

(261). L’influence du BMP-2 sur ces cellules CH310T1/2 semble en revanche plus complexe

puisqu’à faibles concentrations il stimule l’engagement vers le lignage adipogénique alors

qu’à de fortes concentrations il stimule l’engagement vers le lignage ostéogénique (283).

Il est à noter que l’origine des précurseurs des adipocytes n’est pas claire. Chez

l’embryon, l’apparition d’adipocytes est concomitante à l’apparition du système vasculaire

(52) et la culture de cellules souches embryonnaires murines en présence d’acide rétinoïque

promeut la différenciation adipocytaire (58, 207). Chez l’adulte, des cellules

mésenchymateuses de la moelle osseuse caractérisées par leur capacité d’adhésion sur

plastique, leur capacité de prolifération et leur expression de différents marqueurs de surface

tels que le CD105 et l’absence du marqueur des cellules souches hématopoïétiques CD34,

sont capables in vitro de s’orienter vers des voies adipogéniques, chondrogéniques et

ostéogéniques (210). De plus, des analyses clonales ont permis de montrer qu’une même

cellule conservait ces capacités multiples de détermination (210). Récemment, une étude

réalisée chez des souris soumises à un régime gras a permis de montrer par l’utilisation

d’approches de repopulation des cellules de la moelle osseuse par des cellules souches qui

expriment une protéine fluorescente verte (GFP) que certains adipocytes des dépôts profonds

pourraient être originaires de cellules de la moelle osseuse (54). De plus, des cellules

sanguines circulantes ont été montrées comme pouvant exprimer une capacité de

différenciation adipocytaire, suggérant que des cellules de la moelle osseuse peuvent, sous

des stimuli à préciser, être mobilisées dans la circulation sanguine et être recrutées dans les

19

Figure 5 : Détermination et différenciation adipocytaires

D’après Gregoire

F. M., Physiol. Rev., 1998.

Type cellulaire Evènements moléculaires Etapes

Précurseur multipotent

AdipoblasteChondrobastesOstéoblastes Myoblastes

Détermination•Voie Wnt•Delta Fos B•Acide rétinoïque

Différenciation

Phase exponentielle de croissance

Préadipocyte

Arrêt de croissance (confluence)

Remodelage de la MEC et du cytosquelette

Pref

1

C/EBP β

et δPPAR γ

C/EBP α

•Gènes adipocytaires

•Enzymes lipogéniques et synthèse de TG

•Lipolyse

•Activités sécrétoires

Adipocyte mature

Maturation terminale

Expansion clonale (mitoses post-confluence)

Engagement(commitment)

dépôts adipeux (101). Le TA adulte contient également au sein de la FSV des cellules

résidentes capables d’exprimer des capacités multiples de différenciation (304). De plus,

diverses approches in vivo ont montré la capacité réparatrice de ces cellules dans des modèles

animaux d’ischémie vasculaire et cardiaque ou de dommages osseux et musculaires. La revue

qui suit : « le TA un donneur de cellules souches » présente ces données.

20

Cah. Nutr. Diét., 42, 2, 2007

73

biologie générale

biologie générale

LE TISSU ADIPEUX : UN DONNEUR DE CELLULES SOUCHES ?*

Anne BOULOUMIÉ, Sandra DE BARROS, Marie MAUMUS, Jean GALITZKY, Coralie SENGENES

Les cellules souches sont caractérisées par leur capacité d’autorenouvelle-ment et leur capacité à produire des cellules différenciées fonctionnelles.Différents types de cellules souches sont définis en fonction de leur ori-gine et de leur devenir : (1) les cellules souches embryonnaires totipoten-tes capables de former toutes les couches embryonnaires ainsi que lesannexes extra-embryonnaires qui supportent la croissance de l’embryon,(2) les cellules souches embryonnaires pluripotentes qui donnent nais-sance au mésoderme, endoderme et ectoderme, (3) les cellules souchesmultipotentes, capables de générer plusieurs types cellulaires, (4) lescellules progénitrices ou précurseurs qui présentent une capacité limitéed’autorenouvellement et qui se différencient en un type cellulaire défini[1].

Des progrès récents dans l’isolement et la caractérisa-tion des cellules souches/progénitrices ont conduit à lamise en évidence de cellules présentant certaines pro-priétés de cellules souches/progénitrices dans divers tissusadultes, tels que le cœur, le rein, le cerveau, le muscleet également le tissu adipeux. Ces cellules constitue-raient un réservoir de cellules réparatrices prêtes à êtremobilisées et à se différencier en réponse à une isché-mie et/ou à un dommage. Ces cellules présentent unintérêt croissant en médecine réparative et régénérativeavec un rôle thérapeutique potentiel dans une grandevariété d’applications cliniques. Cependant, la présencede cellules souches/progénitrices dans les tissus adultesa conduit à de nombreuses questions et controversesquant à leurs identités et potentialités réelles de diffé-renciation [2].

Chez l’adulte, la moelle osseuse est considérée comme letissu réservoir de cellules souches [3]. Deux familles au moinsde cellules souches/progénitrices qui représentent une frac-tion mineure de la population totale de la moelle (0,001 à0,01 % des cellules nuclées), ont été identifiées : les cellulessouches hématopoiétiques qui comprennent des cellulesmultipotentes capables de reconstituer l’ensemble deslignées hématopoiétiques, des cellules progénitrices mono-potentes donnant naissance à un lignage, et les cellules sou-ches mésenchymateuses qui présentent la capacité de sedifférencier en cellules des tissus connectifs, dont les os, letissu adipeux et le cartilage. Une population de cellulesimmatures capables de prolifération sans sénescence etcapables de s’orienter vers des lignages distincts, i.e. endo-thélial, endodermal et neural

in vitro

et

in vivo

, a été égale-ment décrite dans la moelle adulte et définie comme « cellulessouches adultes multipotentes » [4]. Cependant, leur exis-tence est soumise à de fortes controverses. Finalement, descellules endothéliales progénitrices sont également présentesdans la moelle osseuse. Ces cellules contribueraient à la néo-vascularisation de tissus ischémiques après leur mobilisationet leur recrutement vers les sites ischémiques [5].En plus de la moelle osseuse, d’autres sources de cellulessouches/progénitrices ont été décrites chez l’adulte, telsque la peau [6], le muscle [7], le cerveau [8] et le tissuadipeux humain [9].

Inserm, Équipe Avenir, INSERM U858, Institut de médecine moléculaire de Rangueil, Toulouse ; Université Paul Sabatier, Institut Louis Bugnard IFR31, Toulouse.

Correspondance : Anne Bouloumié, INSERM équipe AVENIR, Faculté de méde-cine, 37, allées Jules Guesde, 31000 Toulouse.Email : [email protected]

* Conférence donnée dans le cadre de la 47e Journée Annuelle de Nutrition et de Diététique, le vendredi 26 janvier 2007.

74

Cah. Nutr. Diét., 42, 2, 2007

biologie générale

Caractéristiques

in vitro

des cellules souches/progénitrices du tissu adipeux humain

La présence de cellules progénitrices dans le tissu adipeuxhumain est reconnue depuis les travaux de Bjorntorp surl’évolution de la cellularité de la masse adipeuse avec ledéveloppement de l’obésité.

Les préadipocytes

En effet, ses travaux ont montré clairement que l’obésitéchez l’homme se caractérise par une phase d’hypertro-phie adipocytaire suivie d’une phase d’hyperplasie adi-pocytaire [10, 11]. Les adipocytes étant des cellulesmatures différenciées, incapables de proliférer. L’aug-mentation du nombre d’adipocytes dans le tissu adipeux(TA) de patients obèses est expliquée par la différencia-tion de cellules progénitrices présentes dans la fractionstroma-vasculaire (FSV), i.e. la fraction non-adipocytaire,du TA [12]. En effet, l’isolement de la FSV de TA humainet sa mise en culture

in vitro

en condition adipogénique[13, 14], i.e. en présence de facteurs favorisant la diffé-renciation adipocytaire tels que l’insuline, la triodothryro-nine et le cortisol, conduit à la formation de cellules

invitro

qui expriment des transcripts spécifiques des adipo-cytes. De plus, ces cellules différenciées présentent desactivités fonctionnelles métaboliques, i.e. lipolyse et lipo-génèse, et sécrétoires (production de leptine) des adipo-cytes matures. Des expériences chez les rongeurs ontpermis de plus de montrer que ces cellules forment

invitro

des adipocytes matures fonctionnels au site de leurinjection [15, 16]. Ces résultats démontrent la présence,au sein du TA, de cellules immatures capables de se dif-férencier

in vitro

et

in vivo

en adipocytes fonctionnels.

Différenciation

in vitro

des cellules de la FSV du TA humain

Outre leur capacité de différenciation en adipocyte

invitro

, de nombreux laboratoires ont, par la suite, montréque les cellules de la FSV humaine pouvaient acquérirselon les conditions de culture

in vitro

des marqueursbiochimiques caractéristiques de lignages cellulaires variés[17] : lignage ostéogénique [18], chondrogénique [19,20] et myogénique [21, 22] mais également l’expressionde marqueurs du lignage neuronal [21, 23], endothélial[24-26], épithélial [27-29] et même cardiaque [30]. Deplus, des approches « clonales », c’est-à-dire d’analysedes capacités de différenciation des cellules dérivantd’une cellule unique après multiples passages, ont montréque plusieurs clones cellulaires pouvaient se différencieren plusieurs lignages [22, 23], suggérant la présence decellules de type « cellules souches adultes multipotentes »et non pas seulement un mélange de population de cel-lules progénitrices unipotentes. Ces résultats sont enaccord avec les résultats obtenus par le groupe de Chris-tian Dani [31] montrant dans la FSV isolée à partir deTA de jeunes donneurs, la présence de cellules plusimmatures et multipotentes (hMADS ou Human Multipo-tent Adipose Derived Stem Cell). Des expériences paral-lèles chez les rongeurs mettaient également en évidenceune plasticité importante des cellules de la FSV des TAsmurins [32-34].

Limites des approches

in vitro

sur les cellules de la FSV du TA humain

La majorité des approches réalisées

in vitro

utilisentdes phases d’expansion cellulaire en présence de fortesconcentrations de sérum, conditions associées à des alté-rations phénotypiques des cellules [35]. En effet, alors queles cellules natives, i.e. directement isolées, de la FSVhumaine expriment des marqueurs membranaires de typeCD34, marqueur des cellules souches hématopoiétiques,et sont dépourvues des marqueurs des cellules souchesmésenchymateuses Stro-1 et CD105, les cellules placéesen culture expriment un profil inverse, i.e. perte du CD34et gain de CD105 et Stro-1 [25, 36-38]. De plus, peu oupas d’analyses fonctionnelles ont été associées aux étudesrelatives aux potentialités de différenciation des cellules.Ces analyses sont cependant nécessaires pour statuerclairement quant à la capacité réelle de différenciation encellules fonctionnelles. De plus, certains résultats obtenuschez les rongeurs n’ont pas été confirmés chez l’hommesuggérant que les capacités de différenciation des cellulesde la FSV humaine sont plus restreintes que chez le rongeur.Enfin, la FSV du TA n’est pas constituée d’une populationde cellules homogènes mais contient, comme son nom l’indi-que, des populations cellulaires de la composante vascu-laire [25] et de la composante stromale, i.e. macrophageset lymphocytes infiltrés [39].

Isolement des cellules progénitrices/souches natives de la FSV du TA humain

Afin d’isoler et de caractériser la population de cellulesprogénitrices présentes dans la FSV du TA humain, notregroupe a développé une approche d’immunosélection/déplétion permettant d’isoler les différentes populationscellulaires. Nous avons ainsi démontré que les cellules« natives » positives pour le CD34 et négatives pour lemarqueur endothélial CD31 sont la seule population cel-lulaire parmi les cellules endothéliales capillaires (CD34+/CD31+), les macrophages (CD34–/CD14+) et les cellulesCD34–/CD31–/CD14–, à présenter la capacité de se dif-férencier en adipocytes

in vitro

[38]. De plus, une partiede cette même population cellulaire possède, en milieu deculture endothélial, la capacité d’exprimer des marqueursendothéliaux et de s’organiser en structures semblables àdes capillaires [25]. Ces résultats montrent que la fractioncellulaire CD34+/CD31– native, i.e. n’ayant subi aucuneétape d’expansion

in vitro

, de la FSV du TA humain pré-sente des propriétés de cellules progénitrices capables dedonner naissance à des cellules qui expriment des mar-queurs phénotypiques des adipocytes et des cellules endo-théliales. Il reste à déterminer si cette population cellulairenative est constituée d’un mélange de cellules progénitricesunipotentes ou de cellules souches multipotentes.

Caractéristiques

in vivo

des cellules souches/progénitrices du TA humain

Les approches

in vitro

ont donc apporté des observationsintéressantes sur la plasticité potentielle des cellules dérivéesde la FSV du TA humain, justifiant la mise en place d’appro-ches

in vivo

d’injection de cellules humaines dans desmodèles animaux présentant des ischémies/dommages

Cah. Nutr. Diét., 42, 2, 2007

75

biologie générale

tissulaires afin de suivre la potentialité réparatrice de cescellules. Les mécanismes responsables des interactionsentre cellules implantées et cellules hôtes restent à êtrecaractérisés. Cependant, des travaux récents apportent desdonnées intéressantes concernant la réponse de l’hôteainsi que le comportement des cellules injectées en fonctiondes environnements locaux distincts.

Réponse immune de l’hôte

Les cellules dérivées de la FSV des TAs humains semblentprésenter une nature non-immunogénique [40]. En effet,

in vitro

les cellules ne provoquent pas d’alloréactivité delymphocytes incompatibles mais apparaissent de plusexercer des propriétés immunosuppréssives [40, 41]. Deplus,

in vivo

, l’implantation des cellules humaines chezdes souris immunocompétentes n’induit pas d’accumulationde lymphocytes au site d’implantation [31]. Les processusexacts impliqués nécessitent une caractérisation plus appro-fondie. Cependant, ces observations pourraient avoir unimpact important en termes de thérapie allogénique ou pourle transfert de cellules dans un organisme hôte dérivéesd’un autre donneur [42].

Mécanismes d’adressage des cellules

Plusieurs types de modes d’administration des cellules ontété utilisés de l’injection intraveineuse à l’application directeau site endommagé. Quand les cellules sont injectées parvoie systémique chez la souris, les cellules s’infiltrent enconditions basales dans différents tissus [43] dont lespoumons, le foie, le cœur, le thymus et le cerveau [44].Toutefois, en présence de dommages tissulaires, une infil-tration plus élevée est observée au niveau du site endom-magé. Par exemple, une hépatectomie partielle chez lasouris conduit à l’augmentation de l’infiltration des cellulesdérivées de la FSV dans le foie [44]. Les mécanismes quiguident les cellules aux sites endommagés ne sont pasconnus. Nous avons initié des expériences sur la capacitéde migration des cellules CD34+/CD31–. Nos résultatsmontrent que les cellules migrent fortement en réponseà un gradient de facteurs produits par les cellules endo-théliales. Des recherches complémentaires sont nécessairespour déterminer quels facteurs, tels que des chimiokinesou des signaux relatifs à l’état hypoxique, sont responsablesde l’attraction des cellules souches/progénitrices de laFSV des TAs humains.

Devenir

in vivo

Le principe de la thérapie cellulaire est que les cellules sou-ches/progénitrices vont au niveau du site endommagé sedifférencier sous l’influence de facteurs locaux en cellulesd’un phénotype approprié. Cependant la différenciation« réelle » des cellules souches/progénitrices

in vivo

estsoumise à controverse et plusieurs processus alternes ontété suggérés comme participant aux activités réparatricesdes cellules telles que la fusion cellulaire aboutissant à lareprogrammation nucléaire et la production par les cellulessouches/progénitrices de facteurs trophiques et « répara-teurs » agissant de manière paracrine sur les cellules hôtes.La capacité réparatrice des cellules souches/progénitricesde la FSV du TA humain a été clairement mise en évidencedans différents modèles chez la souris. Dans un modèle desouris immunotolérante avec une ischémie de la patte arrièreprovoquée par ligature de l’artère fémorale, l’injection decellules de la FSV brute [24, 45, 46] ou des cellules

CD34+/CD31– [25] conduit à une amélioration de lanéovasularisation du membre ischémique. Toutefois, il resteà déterminer si cette néovascularisation est due à uneincorportion des cellules injectées dans la vasculature dela souris et à leur différenciation en cellules endothélialesou à la production locale par les cellules injectées de fac-teurs proangiogéniques [46, 47]. Des activités réparatricesde dommages osseux ont été également rapportées dansdifférents modèles murins [48, 49]. Enfin, l’injection descellules souches multipotentes chez des souris « mdx »,modèle de myopathie de Duchenne, est associée à uneexpression importante et prolongée de la dystrophinehumaine, protéine nécessaire à l’intégrité de la fibre muscu-laire [31]. Des expériences en parallèle sur les cellules dela FSV murine montrent également des capacités réparatricesmultiples [50-52].

Limites et questions

Un nombre important d’observations suggère que le proces-sus néoplastique impliquerait des cellules souches [53].Une étude récente montre le risque de transformation descellules de la FSV. En effet, la culture à long terme descellules de la FSV du TA humain adulte a été associée àl’immortalisation et la transformation spontanée des cellules,conduisant

in vivo

à la formation de tumeur après injec-tion des cellules chez la souris athymique [54]. Des étudescomplètes sont donc nécessaires pour établir clairement lerisque associé à l’expansion

in vitro

des cellules de la FSVhumaine.Le déclin du potentiel régénératif est une signature duvieillissement et pourrait être dû à des changements relatifsà l’âge des cellules souches spécifiques des tissus. Des étudesrécentes chez la souris montrent que le déclin de l’activitédes cellules progénitrices lié au vieillissement peut êtreréversible suite à une exposition à un environnement« jeune » alors qu’à l’inverse l’environnement d’un animalâgé empêche la régénération tissulaire stimulée par descellules progénitrices issues d’animaux « jeunes » [55]. Lesétudes de l’équipe de C. Dani montrant la présence decellules souches multipotentes dans la FSV ont été réali-sées chez des patients jeunes [31]. Il serait maintenantintéressant de déterminer l’impact de l’âge sur les cellulessouches/progénitrices du tissu adipeux tant au niveau de leurpotentialité intrinsèque que sur leur interaction avec l’envi-ronnement.Finalement, la présence de ces cellules dans la FSV posela question de leur origine et de leur spécificité. Récem-ment, Hong

et al.

[56] a décrit que les fibrocytes circulantCD45+ étaient capables en culture d’accumuler des trigly-cérides. Les études de Crossno

et al.

[57] réalisées chezla souris en transplantant des cellules de la moelle osseusede souris transgéniques qui expriment la protéine fluores-cente verte (GFP) à des souris sauvages soumises à unrégime riche en graisse, montrent l’apparition d’adipocytesGFP positifs dans les tissus adipeux. Ces deux études sug-gèrent que certaines cellules progénitrices du tissu adipeuxpourraient avoir une origine sanguine/moelle osseuse.Nos expériences montrent que les cellules CD34+/CD31–circulantes sanguines ne présentent cependant pas lesmêmes potentialités que les cellules CD34+/CD31– dutissu adipeux humain, i.e. production de colonies de cellulessanguines mais absence de différenciation adipocytaire[38], ce qui suggère que si ces cellules ont la même ori-

76

Cah. Nutr. Diét., 42, 2, 2007

biologie générale

gine, le micro-environnement dans lequel elles résidentdéfinit leur potentialité et leur spécificité. Des étudescomplémentaires sont donc nécessaires pour mieux définirl’influence du micro-environnement sur la potentialité descellules souches/progénitrices.

Conclusion

De nombreuses données obtenues

in vitro

et

in vivo

montrent la présence au sein des TAs humains de popu-lations cellulaires présentant des capacités similaires auxcellules progénitrices/souches. La capacité multiple de dif-férenciation reste soumise à controverse et nécessite desrecherches supplémentaires pour statuer clairement. Entreautres, des méthodes standardisées et validées d’isolement,de caractérisation, de sélection, de purification, de culture,de stockage et d’injection des cellules à partir du TA humaindoivent être développées. Les cellules souches/progénitricesdu TA humain pourraient, de part leur accessibilité et leurnombre au sein de la FSV, devenir un modèle cellulaireintéressant pour des approches de thérapie cellulaire pourla régénération et la réparation tissulaire [58, 59]. Toute-fois, de nombreux challenges scientifiques restent encoreà être réalisés avant d’envisager de telles approches. Lesmécanismes d’infiltration et d’adressage des cellules doiventêtre mieux caractérisés ainsi que le rôle relatif de la diffé-renciation, fusion et production de facteurs paracrines dansles effets réparateurs de ces cellules.

Résumé

De nombreux laboratoires ont montré que les cellules issuesde la fraction stroma-vasculaire des tissus adipeux humainspouvaient exprimer

in vitro

selon les conditions de culturedes marqueurs biochimiques de lignages cellulaires variés :adipogénique, ostéogénique, chondrogénique, myogénique,endothélial, neuronal et épithélial. De plus, diverses appro-ches

in vivo

ont montré la capacité réparatrice des cellulesde la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux humaindans des modèles animaux d’ischémie vasculaire et cardiaqueou de dommages osseux et musculaires. Ces résultats sug-gèrent fortement que le tissu adipeux humain contient descellules qui présentent des propriétés similaires à cellesdes cellules souches ou progénitrices. Toutefois, la natureexacte de ces cellules, leur potentialité réelle de différen-ciation

in vivo

ainsi que les mécanismes impliqués dansleur capacité de réparation et de régénération restent à êtrecaractérisés pour envisager leur utilisation dans des appro-ches de régénération et réparation tissulaire.

Mots-clés :

Cellule progénitrice – Préadipocyte – Cellulesendothéliales – Réparation – Régénération.

Abstract

Several laboratories have shown that the cells from thestroma-vascular fraction of the human adipose tissueexpress, depending on cell culture conditions, bioche-mical markers of multiple cell lineages including adipo-genic, osteogenic, chondrogenic, myogenic, endothelial,neuronal and epithelial cell lineage. Furthermore, various

in vivo approaches revealed the ability of the cells deri-ved from the stroma-vacsular fraction of adipose tissueto repair ischemic or damaged tissues. Altogether thesedata strongly suggest that the stroma-vascular fractionof the human adipose tissue contains cells that exhibitproperties like stem/progenitor cells. However, the exactnature of the cells, their potentiality to lead to diffe-rentiated cells in vivo as well as the mechanisms involvedin their repair capability remain to be characterized toconsider their use in regenerative and reparative medi-cine.

Key-words:

Progenitor – Preadipocyte – Endothelial cell– Repair – Regeneration.

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Afin d’isoler et de caractériser la population de cellules progénitrices présentes dans

la FSV, notre groupe a développé une technique d’isolement des différentes populations

cellulaires de la FSV qui se fonde sur l’utilisation de nanoparticules magnétiques couplées à

des anticorps dirigés spécifiquement contre les marqueurs de surface CD34 (marqueur des

cellules souches hématopoïétiques et des cellules endothéliales capillaires), CD31 (marqueur

des cellules endothéliales et de la lignée hématopoïétique) et CD14 (marqueur des

monocytes/macrophages). Nous avons ainsi démontré que les cellules positives pour le CD34

et négatives pour le CD31 (CD34+/CD31-) sont la seule population cellulaire présente dans

la FSV capable de présenter la capacité de différenciation adipocytaire en condition

adipogénique (241). De plus, notre groupe a récemment mis en évidence que cette population

cellulaire CD34+/CD31- possède, en milieu endothélial, la capacité d’exprimer des

marqueurs endothéliaux et de s’organiser en structures semblables à des capillaires (173). Ces

résultats indiquent que la fraction cellulaire CD34+/CD31- de la FSV du TA humain, n’ayant

subi aucune étape d’extension in vitro, présente des propriétés de cellules progénitrices

capables de donner naissance à des cellules qui expriment des marqueurs phénotypiques des

adipocytes et des cellules endothéliales. Il reste cependant à déterminer si cette population

cellulaire est constituée d’un mélange de cellules progénitrices unipotentes ou de cellules

souches multipotentes. D’autre part et de façon inattendue, les cellules CD34+/CD31-

présentent des caractéristiques différentes des cellules souches mésenchymateuses et

hématopoïétiques puisqu’elles ne sont capables ni d’exprimer le marqueur CD105, propre

aux cellules souches mésenchymateuses, ni douées d’activité hématopoïétique, en conditions

de culture adaptées (241). Ainsi, l’origine mésenchymateuse des précurseurs adipocytaires

communément admise jusqu’ici est remise en question. Toutefois, il est important de noter

que la quantité de cellules souches mésenchymateuses dans la moelle osseuse est très faible

et que leur isolement requiert des phases d’expansion in vitro (210). Ainsi, aucune étude n’a

pu pour l’instant être réalisée sur des cellules souches mésenchymateuses fraîchement

isolées. L’expression de nombreux marqueurs de surface est modulée par la culture et l’état

de prolifération des cellules (112). Ainsi, l’expression du marqueur CD34 est connue pour

être diminuée alors que celle de CD105 est augmentée par l’état de prolifération cellulaire

(170, 173, 174, 241). On peut donc penser que l’expression du CD34 des cellules

progénitrices CD34+/CD31- du TA et l’absence du marqueur CD105 est relative au fait que

ces cellules n’ont pas subi de phases d’expansion. Il est à noter que certaines équipes

suggèrent que les précurseurs adipocytaires pourraient être originaires d’une

dédifférenciation des adipocytes matures (5, 186, 211). Cependant, peu de données sont en

21

accord avec cette hypothèse et l’on peut supposer que cette dédifférenciation apparente des

adipocytes pourrait être due à une contamination des adipocytes matures par des cellules

progénitrices. En effet, les études de Miyazaki et al. montrent qu’en condition de culture

flottantes (c’est-à-dire quand la surface cellulaire adhérente se trouve au-dessus des cellules),

des progéniteurs adipocytaires, fixés sur les adipocytes, sont capables de migrer sur la surface

de culture et de se différencier en adipocytes (175).

B.2) Le processus de différentiation adipocytaire

B.2.1) Les étapes du processus de différenciation adipocytaire

La différenciation adipocytaire proprement dite ou adipogenèse représente le passage

du préadipocyte à l’adipocyte mature. Après une phase de croissance exponentielle, le

précurseur déterminé vers la lignée adipocytaire ou adipoblaste marque un arrêt de croissance

à confluence (figure 5). Ces cellules deviennent alors des préadipocytes et s’engagent dans

l’adipogenèse proprement dite. Tout au long du processus d’adipogenèse vont se succéder

différents événements morphologiques, biochimiques et moléculaires, que l’on regroupe en

deux catégories, les événements précoces et tardifs.

Les événements précoces concernent en particulier le remodelage de la matrice

extracellulaire (MEC) et du cytosquelette (figure 6). Au cours de la différenciation

adipocytaire, la composition de la MEC est fortement modifiée. D’une structure riche en

fibronectine, sa composition va évoluer vers une structure de type lame basale, composée

essentiellement de laminine, collagène IV et d’entactine (151). En effet, une diminution de la

production du collagène fibrillaire de type I et III et de la fibronectine et une augmentation de

la production de la laminine, des protéoglycans, de l’entactine et du collagène de type IV ont

été observés au cours de la différenciation des préadipocytes d’origine murine et bovine (132,

133, 184). Des cultures de préadipocytes murins, porcins et humains réalisées sur différents

supports matriciels ont souligné la variation d’adipogenèse selon le type de matrice utilisé

suggérant le rôle essentiel de la composition et de l’organisation de la MEC dans la

différenciation adipocytaire (95, 98, 133). Ainsi, l’ensemble de ces données suggère

l’importance du remodelage de la MEC durant le processus adipogénique. Grâce à un

remodelage matriciel, les tensions avec le cytosquelette sont modifiées. Des changements

dans la forme de la cellule sont possibles par une réorganisation du réseau intracellulaire

d’actine (252). L’ensemble de ces remodelages matriciels, du cytosquelette et de la forme de

22

Figure 6 : Evolution de la matrice extracellulaire et de la forme cellulaire au cours de la différenciation adipocytaire

D’après Lilla

J, Am J Path, 2002

FibronectineCollagène I, III

Collagène IV et Entactine

Structure fibroblastique des préadipocytes

Confluence et engagement des préadipocytes

Remodelage matriciel via des protéases

Remodelage du cytosqueletteet transcription de gènes

adipogéniques

(C/EBP et PPARγ)

Synthèse de la MEC par les préadipocytes

au coursde la différenciation

Adipocytes matures

C/EBPPPARγ

Synthèse d’aP2, LPL, FAS …

la cellule permet alors aux préadipocytes de subir une étape d’expansion clonale liée à une

série de réplications de l’ADN ou mitoses dites post-confluentes.

A la suite de ces événements précoces, les préadipocytes sont dits « engagés dans la

différenciation adipocytaire ». En anglais, on parle encore de « commitment » des

préadipocytes. Enfin, une étape de maturation terminale permet d’obtenir les adipocytes

matures. Cette maturation terminale est marquée par l’acquisition des propriétés

métaboliques et sécrétoires des adipocytes matures (91).

B.2.2) Contrôle transcriptionnel de la différenciation adipocytaire

Les changements morphologiques majeurs qui accompagnent la différenciation

adipocytaire, tels que l’arrondissement des cellules et l’accumulation progressive de vacuoles

lipidiques dans le cytoplasme, sont la conséquence de variation d’expression d’un très grand

nombre de gènes. Cette reprogrammation génétique profonde est sous le contrôle de facteurs

de transcription pro- ou anti-adipogéniques dont les principaux sont les facteurs PPARs

(Peroxisome proliferator-activated receptors), les C/EBPs (CCAAT/enhancer binding

proteins) et le facteur ADD1/SREBP-1c (Adipocyte determination and differentiation factor

1/sterol regulatory element binding protein-1c) (pour revue (74, 226).

B.2.2.1) Les PPARs

Les facteurs de transcription PPARs appartiennent à la superfamille des récepteurs

nucléaires. Une fois activés par la liaison à leur ligand, ils forment des hétérodimères avec les

récepteurs de l’acide 9-cis-rétinoïque (RXR) qui reconnaissent spécifiquement des éléments

de réponse PPRE (« PPAR Responsive Element ») situés dans les régions promotrices de

gènes cibles. Chez les mammifères, trois isoformes de PPARs α, β (ou δ ou NUC-1 (nuclease

abnormal-1)), et γ ont été décrites, chacun codé par un gène différent et caractérisés par une

distribution tissulaire, des ligands, des co-facteurs et des fonctions qui leur sont propres. De

multiples études démontrent que PPARγ, et plus particulièrement PPARγ2, est

préférentiellement exprimée dans les adipocytes et joue un rôle majeur dans le contrôle

transcriptionnel de la maturation terminale de l’adipocyte. En effet, il transactive de

nombreux gènes marqueurs de la différenciation adipocytaire, tels que celui de la LPL ou

celui codant pour la protéine de transport aux acides gras (aP2) (228). Plusieurs ligands

capables d’activer le PPARγ majorent le taux de conversion adipocytaire et l’amplitude de la

23

différenciation. C’est notamment le cas des thiazolidinediones qui sont utilisées dans le

traitement du diabète et de l’insulino-résistance. De plus, la 15-déoxy-δ prostanglandine et

l’acide lysophosphatidique (LPA) sont décrits comme des activateurs du facteur de

transcription (23, 171). Toutefois leur affinité pour le PPARγ est beaucoup plus faible que

celle habituellement décrite pour les récepteurs nucléaires avec leurs ligands physiologiques.

B.2.2.2) Les C/EBPs

Les facteurs C/EBPs appartiennent à la famille des facteurs de transcription à motifs

basiques et glissières de leucines (bHLH, « basic Helix Loop Helix »). Le domaine basique

permet à ces facteurs de se lier à l’ADN alors que le motif en glissières de leucines leur

permet de s’homo- ou de s’hétéro-dimériser. Trois isoformes de C/EBPs, α, β et γ, possèdent

un rôle inducteur dans l’adipogenèse (227, 228). Les C/EBPs β et γ sont induits de façon très

précoce et transitoire au cours de l’adipogenèse, et jouent un rôle clé dans l’enclenchement de

la maturation terminale. L’induction de C/EBPα se fait plus tardivement et permet de

transactiver différents gènes marqueurs de la différenciation adipocytaire tels qu’aP2, PPARγ

et la leptine mais également d’induire sa propre expression (227, 228). Récemment, des

travaux ont montré que des souris déficientes pour CHOP-10 (CCAAT/enhancer binding

protein (C/EBP) homologous protein), un facteur de transcription anti-adipogénique

appartenant à la famille des C/EBPs présentent une adiposité importante mais aucun désordre

métabolique associé (6). Cet effet semble impliquer les facteurs C/EBPs.

Les nombreuses données expérimentales obtenues depuis ces dernières années et sur

les lignées murines principalement, ont permis de proposer un modèle de progression des ces

facteurs de transcription au cours de l’adipogenèse (figure 7) (7).

B.2.2.3) Le facteur SREBP-1

Le facteur ADD1/SREBP-1 fait partie de la famille des facteurs à motifs hélice-

boucle-hélice (bHLH-LZ pour basic helix-loop-helix-leucine zipper). Le domaine HLH

permet à ces facteurs de former des homo- ou hétero-dimères avec des protéines de la même

famille. Après dimérisation, le complexe se lie par le domaine basique à des séquences

spécifiques dites E-box, situées au niveau des promoteurs de gènes cibles. De nombreuses

études ont montré l’implication de SREBP-1 au niveau hépatique et adipocytaire dans la

24

Figure 7 : Progression des facteurs de transcription au cours de l’adipogènese

dans les préadipocytes

de la lignée 3T3-L1

D’après Avram

MM., J. Am. Acad. Dermatol., 2007

régulation de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol, des TG et des

acides gras (65, 103). Au niveau du TA, il favorise l’adipogenèse en induisant l’expression de

PPARγ (73, 122).

B.2.2.4) Les autres facteurs de transcription

En dehors de ces intervenants essentiels dans l’adipogenèse, d’autres facteurs

transcriptionnels aux fonctions pro- ou anti-adipogéniques constituent potentiellement des

régulateurs importants de la différenciation adipocytaire. Ces différents facteurs sont

identifiés et présentés dans la figure 8 (d’après revue (78)). Notons que les facteurs de

transcription Kruppel-like factor 15 et 5 (KLF15 et 5), appartenant à la famille des facteurs à

doigts de zinc, sont décrits comme étant pro-adipogéniques alors que KLF2 est anti-

adipogénique (177, 194, 292). Le facteur Krox 20 apparaît comme le facteur le plus précoce

induit directement par les signaux hormonaux (39). De manière intéressante, le facteur de

transcription CREB (cAMP-response-element binding protein) a été impliqué dans

l’accumulation des TGs dans des préadipocytes murins soumis à une dysfonction

mitochondriale par un traitement avec l’antimycin A (272).

B.2.3) Régulation hormonale et intracellulaire de la différenciation adipocytaire

Le processus d’adipogenèse que nous venons d’aborder est hautement contrôlé par de

nombreux facteurs de nature très variée: hormones, cytokines, nutriments et molécules de

signalisation cellulaire. Les principaux facteurs connus sont présentés dans le tableau 2 et

classés selon leur effet pro- ou anti-adipogénique.

25

CHOP CUPIds

δ-IPδ-FosB

GATA-2 et -3RARα

SMADsTCF/LEF

KLF2

PPARγ

et δC/EBP α, β

et γSREBP-1

CREBs

STATs

NFATsFOXC2 Foxa-2

HMGs

LXRKLF5 et 15 Krox20Rev-erb-

α

Notch

Facteurs de transcriptionpro-adipogéniques

Facteurs de transcriptionanti-adipogéniques

Figure 8 : Balance entre les facteurs de transcription pro-

et anti-adipogéniques

(CHOP: C/EBP homologous

protein; CUP: C/EBP unidentified

protein; Ids: inhibitor

of

DNA binding; RARα: retinoic

acid

receptor

α;TCF/LEF: T-cell

factor/Lymphoid

enhancer

factor; KLF: Kruppel

like

factor; CREBs: cAMP

responsive element

binding

protein;

STATs: signal transducers

and

activators

of

transcription; NFATs: nuclera

factor

of

activated

T cells; FOXC2: Forkhead

box C2; HMGs: high

mobility

group proteins; LXR: liver

X receptor)

D’après Fève B. , Best. Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., 2005

Tableau 2: Facteurs extracellulaires et molécules de signalisation régulant la différenciation adipocytaire

Facteurs pro-adipogénique Facteurs anti-adipogéniques

Hormone Hormone de croissance, Prolactine

Insuline, T3

Glucocorticoïdes

Vitamine D (selon les modèles)

Prostaglandines I2 et J2

Angiotensinogène (via la synthèse de

prostaglandines)

Déhydroépiandrostérone

Vitamine D (selon les modèles)

Endothéline

Résistine

Prostaglandines F2α

Cytokines et

facteurs de

croissance

IGF1 (insulin-like growth factor 1)

LIF (leukaemia inhibitory factor)

FGF10 (fibroblast growth factor 10)

BMPs (Bone morphogenetic proteins)

MCSF (macrophage colony stimulating

factor)

Adiponectine

EGF (epidermal growth factor)

PDGF (plateled-derived growth factor)

TGF-α et β (transforming growth factor)

bFGF (basic fibroblast growth factor)

TNF-α (tumor necrosis factor α)

Interleukine 1, 6 et 8, Interféron γ

Nutriments Acides gras, glucose, acides aminés

Molécules de

signalisation

AMPc, H202 (à faibles doses)

Ras et Erk1 et 2 (à un stade précoce et

transitoire)

MAP Kinase p38

Phosphatidy-inositol 3-kinase

Protéine kinase B

Protéine kinase C

MAP kinase Erk1 et 2 (à un stade tardif)

Kinase AMP-dépendante (AMPK)

c-Jun amino-terminal kinases (JNK)

Autres Voie NF-κB Pref 1, Wnt10b,

B.3) La vascularisation du tissu adipeux

Au cours du développement embryonnaire du TA, l’angiogenèse est étroitement liée à

l’adipogenèse (52, 285). Des études d’implantation sous-cutanée de préadipocytes de la

lignée 3T3F442A chez des souris athymiques, ont clairement associé l’apparition de

marqueurs adipocytaires aux marqueurs endothéliaux au site d’injection (90, 185). Ces

résultats sont confirmés par les travaux de Fukumura et al. montrant que des préadipocytes

26

transfectés par un dominant négatif de PPARγ empêchant l’adipogenèse, inhibe

l’angiogenèse au site d’implantation. En parallèle, l’inhibition de l’angiogenèse par un

traitement avec un anticorps neutralisant anti-VEGF-R2, inhibe l’adipogenèse (83). Ainsi,

adipogenèse et angiogenèse sont donc deux phénomènes étroitement liés.

Le rôle de l’endothélium dans le développement du TA est reconnu depuis longtemps

(285). Cependant, il a été négligé par le fait que le TA était généralement considéré comme

peu vascularisé. Cette observation est essentiellement liée à la difficulté d’accès aux

capillaires du TA, du fait de la grande taille des adipocytes matures et de leur organisation en

couches multiples. En effet, l’analyse du TA après une période de jeûne chez l’animal qui

s’accompagne d’une diminution du diamètre des adipocytes a permis de mettre en évidence

l’ensemble du réseau vasculaire de ce tissu (225). Ainsi, en évaluant la densité capillaire du

TA ou en marquant les érythrocytes au chrome 51, des études ont montré que le réseau

vasculaire du TA est aussi important que celui du muscle squelettique et que chaque

adipocyte présente des contacts étroits avec au moins un capillaire sanguin (94, 107).

L’importance de l’endothélium pourrait en partie s’expliquer par le rôle clé de la surface

endothéliale dans le contrôle de la lipogenèse adipocytaire via la LPL, enzyme sécrétée par

les adipocytes et active à la surface des cellules endothéliales. En effet, les cellules

endothéliales semblent jouer un rôle direct dans les phénomènes de trafic intercellulaire de la

LPL par la sécrétion d’un facteur qui, sous stimulation de l’insuline, libèrerait la LPL des

protéoglycans à héparane sulfate adipocytaires (126).

En résumé, les lignées cellulaires murines ont permis une étude approfondie des

processus de détermination et de différenciation adipocytaires. Le processus de

détermination adipocytaire est cependant peu connu contrairement à la différenciation

adipocytaire qui a suscité de nombreuses études. Par ailleurs, la mise en évidence

récente de cellules souches multipotentes au sein de la FSV permet au TA d’acquérir un

nouveau statut de « source d’approvisionnement de cellules souches/progénitrices »

pour d’éventuelles thérapies cellulaires. Cependant, de nombreux points restent encore

à élucider, notamment déterminer si la FSV du TA renferme un pool de cellules souches

aux potentialités variées ou bien une seule et unique cellule multipotente. De même,

malgré des similitudes, il est nécessaire de déterminer si les cellules

souches/progénitrices issues du TA adulte sont identiques aux préadipocytes d’origine

embryonnaire et si des différences inter-espèces sont observées (hommes vs rongeurs).

27

C) Le développement excessif du tissu adipeux : l’obésité

L’indice de masse corporelle (IMC), rapport du poids sur la taille au carré, permet

d’évaluer la corpulence d’un individu adulte. Le tableau 3 présente la classification des

adultes de poids normal, en surpoids, obèse ou maigre (sous-poids).

Tableau 3: Classification des adultes maigres, normaux, en surpoids et obèses selon l’IMC

Classification IMC (kg/m2)

Sous-poids

Maigreur sévère

Maigreur modérée

Maigreur légère

< 18,50

< 16,00

16,00 - 16,99

17,00 - 18,49

Poids normal 18,50 - 24,99

Surpoids

Pré-obèse

≥ 25,00

25,00 - 29,99

Obésité

Obésité de classe I

Obésité de classe II

Obésité de classe III

≥ 30,00

30,00 - 34,99

35,00 - 39,99

≥ 40,00 Classification définie par l’organisation mondiale de la Santé D’après WHO expert consultation, The Lancet, 2004,.(48)

L’obésité correspond à une surcharge pondérale résultant d’un développement

excessif du TA. Les potentialités d’extension du TA sont uniques. En effet, la masse grasse

peut-être multipliée par quatre chez un individu obèse et peut représenter jusqu'à 60 à 70% de

sa masse corporelle.

De nombreux événements cellulaires et biochimiques sont responsables de la

croissance excessive du TA adulte. Dans les paragraphes suivants, nous allons voir les

modifications du TA lors de l’obésité, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans ses

fonctions métaboliques et sécrétoires.

28

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=14726171

C.1) Les modifications cellulaires du tissu adipeux

C.1.1) Les adipocytes et les cellules souches/progénitrices

Les changements dans la masse du TA sont associés à des modifications de la taille et

du nombre des adipocytes (214). L’augmentation du volume des adipocytes correspond à une

hypertrophie adipocytaire. Le diamètre moyen d’un adipocyte peut aller jusqu’à 120µm chez

le sujet obèse. Selon l’hypothèse dite de la « taille critique », la cellule adipeuse se chargerait

en TGs jusqu'à atteindre une taille critique au-delà de laquelle une phase d’hyperplasie

apparente apparaîtrait au sein du tissu. Ces nouveaux adipocytes proviendraient de la

prolifération et/ou du recrutement de cellules progénitrices associés à leur différenciation. Les

études de Crossno et al montrent que des souris soumises à un régime gras sont capables de

recruter des cellules souches de la moelle osseuse dans le TA afin de former de nouveaux

adipocytes (54), cependant les mécanismes impliqués ne sont pas caractérisés. Ainsi deux

phases adipocytaires auraient lieu dans le TA une phase d’hypertrophie cellulaire suivie dans

les cas d’obésité sévère d’une hyperplasie adipocytaire (15, 249). Les mécanismes

responsables de l’hypertrophie adipocytaire s’expliquent par des altérations des activités

métaboliques (lipogenèse et lipolyse) des adipocytes. Nous le verrons dans le chapitre

suivant. L’augmentation du nombre d’adipocytes est moins bien définie. Récemment, les

travaux de Tchoukalova et al. indiquent que la proportion des préadipocytes de la FSV,

positifs pour le marqueur aP2 et négatifs pour le CD68 (un marqueur des macrophages), est

diminuée avec l’obésité (262). Ces travaux peuvent être associés à ceux de van Harmelen

indiquant que la capacité de différenciation adipocytaire des cellules de la FSV est

négativement corrélée avec l’IMC (271).

C.1.2) Les cellules endothéliales

Des travaux de notre groupe indiquent que l’évolution du réseau vasculaire est

parallèle à celui de la masse adipeuse suggérant que le développement du TA est associé à

une néovascularisation. En effet, le pourcentage de cellules endothéliales des capillaires

sanguins, caractérisées par la double expression CD34 et CD31, au sein de la FSV, reste

constant avec l’augmentation de l’IMC (173). La dépendance du TA vis-à-vis de son réseau

vasculaire au cours de l’obésité a été mise en évidence grâce à de récents travaux montrant

que des facteurs anti-angiogéniques limitent le développement de la masse grasse dans

29

différents modèles de souris obèses (19, 233). De plus, l’apoptose sélective des cellules

endothéliales, in vivo par l’utilisation d’un phage contenant un peptide pro-apoptotique

associé à la prohibitine, une protéine membranaire de surface, entraîne une réversion de

l’obésité chez la souris (129). Ainsi, le réseau vasculaire joue un rôle déterminant dans la

croissance mais également dans le maintien de la masse grasse. Les mécanismes impliqués

dans l’extension du réseau vasculaire lors du développement du TA ne sont pas connus.

Cependant, de nombreuses évidences montrent que les adipocytes sécrètent de nombreux

facteurs angiogéniques (16, 17, 154, 301) et que cette production est augmentée avec l’état

d’obésité (247). De plus, on peut supposer que les cellules CD34+/CD31- pourraient

également via des processus de vasculogenèse, i.e. différenciation en cellules endothéliales,

participer à l’augmentation du résseau vasculaire du TA. Récemment, une étude réalisée sur

un modèle de souris obèse db/db a évalué simultanément l’angiogenèse et l’adipogenèse et a

montré une étroite relation spatiale et temporelle entre la formation de nouveaux vaisseaux

sanguins à partir de vaisseaux préexistants et le processus de différenciation adipocytaire

(189).

C.1.3) Les macrophages

La présence de macrophages au sein du tissu adipeux a été mise en évidence depuis

longtemps par les histologistes (263) mais n’a suscité que très peu d’intérêt jusqu'à ces

dernières années. Des observations récentes suggèrent l’implication de cette population

cellulaire dans l’installation d’un état pro-inflammatoire, au sein du TA, lors de son

développement excessif. En effet dans différents modèles animaux d’obésités, une

accumulation de macrophages a été observée lors du développement de la masse grasse (286,

293). De plus, notre groupe a montré que le pourcentage de macrophages au sein de la SVF

est corrélé de façon positive avec l’IMC dans les tissus adipeux sous-cutanés (55) et

viscéraux (56) humains. Inversement, l’équipe de K. Clément a montré que la quantité de

macrophages infiltrés dans le TA est diminuée après une perte de poids chez des sujets

obèses (24, 46).

L’origine de cette augmentation de la population macrophagique au sein du TA des

sujets obèses n’est pas bien comprise. De par les similitudes d’expression génique entre

adipocytes et macrophages et l’observation des capacités de phagocytose décrites dans le

préadipocyte humain, il a été suggéré que les macrophages puissent provenir de la

différenciation des préadipocytes (235). Cependant notre équipe n’a pu mettre en évidence

30

d’activité hématopoïétique à partir de précurseurs adipocytaires humains (241). Des

expériences de transplantation de moelle osseuse chez la souris démontrent que 80% des

macrophages du TA sont d’origine médullaire, suggérant ainsi que les macrophages du TA

sont issus de l’infiltration de monocytes sanguins circulants (286). De plus, notre groupe a

montré que les sécrétions adipocytaires stimulent l’activation endothéliale conduisant à une

augmentation de l’adhérence et de la transmigration des monocytes sanguins à travers

l’endothélium du TA humain (55). En conditions normales, la fonction majeure des

macrophages résidents au sein d’un tissu est d’éliminer le matériel étranger et les cellules

apoptotiques, processus essentiel dans le maintien de l’homéostasie tissulaire. Le rôle des

macrophages au niveau du TA lui-même reste à être clairement défini. Toutefois, des travaux

récents chez la souris indiquent que l’infiltration des macrophages due à une obésité induite

par un régime hypercalorique semble être plus liée à l’insulino-résistance associée à l’obésité

qu’à l’augmentation de la masse grasse (155, 192, 286).

C.2) Les modifications des fonctions métaboliques du tissu adipeux

Au cours de l’obésité, une augmentation de la lipogenèse semble évidente. Quelques

études ont rapporté que l’activité de la LPL était associée à la taille des adipocytes (66, 75).

Un excès de masse grasse s’accompagne également d’une altération de la fonction lipolytique

du TA au repos et au cours de l’exercice physique (102). Plusieurs travaux in vitro menés au

laboratoire ont évalué l’effet de l’obésité et du surpoids sur la régulation adrénergique de la

lipolyse. Le nombre de récepteurs α2A-adrénergiques a été corrélé positivement avec la taille

des adipocytes. Ainsi, les récepteurs α2A-adrénergiques sont fortement exprimés dans le TA

sous-cutané où les adipocytes sont hypertrophiés, et bien plus dans le tissu fémoral

qu’abdominal suggérant une faible activité lipolytique de l’adrénaline dans le TA abdominal

voire antilipolytique dans le TA fémoral chez la femme (13, 166). Chez le sujet obèse, les

réponses lipolytiques mesurées in situ dans le TA sous-cutané, sont très diminuées par

rapport à des sujets de poids normal au cours d’un exercice physique. Ceci s’explique par une

activation soutenue des récepteurs α2A-adrénergiques, surnuméraires dans les adipocytes

hypertrophiés de l’obèse (255). Par ailleurs, de nombreux travaux mentionnent une perte de

sensibilité du TA sous-cutané aux catécholamines au repos, ce qui entraîne une diminution

des réponses β-adrénergiques. Cette résistance aux catécholamines dans l’adipocyte d’obèse

pourrait provenir d’une diminution de la fonction β2-adrénergique (70), d’une diminution de

l’activité et de l’expression de la LHS (143), ou encore de l’expression majoritaire d’une

31

isoforme catalytiquement inactive (219). Notons que des différences dans la lipolyse et la

lipogenèse ont été décrites dans les TA humains sous-cutanés et viscéraux de patients obèses

(72, 136).

C.3) Les modifications des fonctions sécrétoires du tissu adipeux

Comme nous l’avons précédemment évoqué, le TA se comporte comme un organe

endocrine. Ainsi, de nombreuses études se sont focalisées sur les modifications des sécrétions

de ce tissu au cours de l’obésité (72). Dans le tableau 4 sont présentés les principaux facteurs

connus pour être modulés lors du développement excessif de la masse grasse.

Tableau 4: Sécrétions du tissu adipeux modulées au cours de l’obésité

Augmentation Diminution

Hormone Leptine

Facteurs de croissance

et cytokines

TNF-α

IL-1, 6, 8 et 10

Résistine

Apeline

iNOS

TGF-β

MCP-1

HGF

Adiponectine

Protéases et inhibiteurs

de protéases

PAI-1

Cathepsine K et S

MMP-9

Autres Angiotensine

Tissue factor

Facteur VII

C-reactive protein

(TNF-α: tumor necrosis factor- α, IL: interleukine, iNOS: inducible nitric oxide synthase, TGF-β: transforming

growth factor-β, MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1, HGF: hepatocyte growth factor, PAI-

1:plasminogen activator inhibitor 1, MMP-9 : matrix metalloprotease 9)

32

En résume, l’obésité chez l’homme s’accompagne d’un remodelage important de la

masse grasse associé à des modulations des fonctions métaboliques et sécrétoires du TA.

Les mécanismes responsables de ces changements ne sont pas totalement définis mais

ces altérations semblent être impliquées directement dans la genèse des pathologies

associées à l’obèsité. Ainsi l’augmentation de la population macrophagique

inflammatoire et les changements dans la production d’adipokines dont principalement

la leptine et l’adiponectine sont deux éléments clés dans le développement de l’insulino-

résistance et de la dysfonction endothéliale, évènements précoces impliqués dans le

diabète de type II et les pathologies cardiovasculaires.

33

D) La régression du tissu adipeux : la lipoatrophie

En plus de ces capacités de croissance, le TA est également capable de régression. On

parle de lipoatrophie ou lipodystrophie. La classification des syndromes de lipoatrophies est

indiquée dans le tableau ci-dessous.

Tableau 5: Classification des différentes lipoatrophies humaines

D’après Reitman et al, TEM, 2000 et Garg et al, Clinical Cornestone, 2006

Classification des lipoatrophies humaines

1) Génétiques

- Lipodystrophie congénitale généralisée (Syndrome de Berardinelli-Seip)

Type 1 : mutations d’une acyltransférase codée par AGPAT2

Type 2 : mutations de la séipine

- Lipodystrophie familiale partielle

Type Dunnigan : mutations de la lamine A/C

Associée à PPARγ : mutations de PPARγ

Associée à Akt2/PKB : mutations de Akt/PKB

- Dysplasie mandibuloacrale

Type A, partielle, mutations de la lamine A/C

Type B, généralisée, mutations de ZMPSTE24 (une métalloprotéase à zinc)

- Syndromes progéroïdes (Syndrome de Werner, syndrome Cockayne)

- Syndrome de déficience en carbohydrate glycoprotéine

- Syndrome SHORT (Short stature, Hyperextensibility, Hernia, Ocular depression, Rieger

anormaly and Teething delay)

2) Présumées inflammatoires ou autoimmunes

- Lipoatrophie acquise généralisée (Syndrome de Lawrence)

- Lipoatrophie acquise partielle (Syndrome de Barraquer-Simons)

- Lipoatrophie acquise associée à des dermatomyosites

- Lipodystrophie associée à une hypocomplémentémie

3) Acquises, de causes inconnues

- Lipodystrophie associée aux traitements anti-VIH

34

Dans certains syndromes de lipoatrophie, l’absence localisée au niveau de la face et

des membres ou généralisée de TA est associée à une accumulation du TA au niveau des

régions abdominales, dorso-cervicales et mammaires. On parle dans ce cas de

lipodystrophies. Ces syndromes peuvent avoir des causes génétiques, immunes ou associées

aux traitements thérapeutiques lors d’infection en particulier pour le VIH (pour revue (25,

222). Paradoxalement elles sont, comme l’obésité, associées à des complications

métaboliques telles que l’hypertriglycéridémie, l’insulino-résistance, la stéatose hépatique et

les pathologies cardio-vasculaires.

Les syndromes lipoatrophiques étaient très rares (moins de 1 cas pour 100 000)

jusqu’à ces dix dernières années où sont apparues les formes liées aux traitements

antirétroviraux de l’infection par le VIH. Ce sont les inhibiteurs de la protéase du VIH (IPs-

VIH) qui ont été initalement associés à l’émergence de ce syndrome (31, 33, 34). Cependant,

des travaux démontrent que des patients séropositifs recevant des inhibiteurs nucléosidiques

de la reverse transcriptase du VIH en particulier la stavudine et la zidovudine (INRTs) et

naïfs pour les IPs-VIH développent également une lipoatrophie périphérique (20, 32, 157).

Par ailleurs, il a été rapporté que ces traitements pourraient agir en synergie entraînant une

atrophie profonde du TA (158, 269).

Au cours de ce paragraphe, nous allons faire le point sur les modifications cellulaires,

métaboliques et sécrétoires du TA lors d’une régression importante. Nous nous appuierons

essentiellement sur les données des lipoatrophies associées aux traitements anti-VIH qui sont

actuellement les lipoatrophies les plus fréquentes et les plus étudiées (276).

D.1) Les modifications cellulaires du tissu adipeux

Les études réalisées sur le TA sous-cutané des patients traités par les IPs-VIH et les

INRTs montrent une atteinte profonde de la morphologie du TA (62, 110, 152). Les effets

décrits des IP-VIH et des INRTs sur les différents types cellulaires qui composent le TA vont

être abordé dans les paragraphes suivants.

D.1.1) Les adipocytes

Une perte de poids est forcément associée à une diminution de la taille et/ou du

nombre des adipocytes. Si l’existence d’une différenciation adipocytaire après les phases de

développement normal est maintenant connue, la possibilité d’une perte des adipocytes est

35

moins bien documentée. Les études sur l’apoptose dans le TA sont peu abondantes (250).

Cependant, il est admis que l’apoptose peut se produire dans le TA et notamment dans les

adipocytes matures. Un certain nombre de facteurs ont été rapportés pour entraîner l’apoptose

des adipocytes in vitro, notamment des cytokines inflammatoires telles que le TNFα (213),

des flavonoïdes et des acides gras polyinsaturés (121, 188).

Une augmentation de l’apoptose des adipocytes a été décrite chez des patients infectés

par le VIH et ayant développé une lipoatrophie du TA suite aux traitements antirétroviraux

(62, 63, 110). Il est admis que les traitements antirétroviraux influent sur ce processus

apoptotique. En effet, il a été rapporté que le nelfinavir (NFV), un IP-VIH, favorise

l’apoptose des préadipocytes différenciés murins des lignées 3T3-L1 et 3T3F442A (12, 64).

Notons que les mécanismes directement mis en jeu ne sont pas encore définis. Par ailleurs,

ces effets apoptotiques ne sont pas retrouvés dans les préadipocytes murins non différenciés

(64). Le NFV a également été rapporté pour induire la nécrose des préadipocytes différenciés

de la lignée 3T3F442A via une augmentation des espèces réactives de l’oxygène (278)

associée à un stress du réticulum endoplasmique (264).

Concernant les INRTs, une étude indique que la stavudine (un INRT) entraîne une

apoptose des préadipocytes différenciés murins de la lignée 3T3F442A (28). De plus, des

patients traités avec la stavudine ont une augmentation de l’apoptose dans le TA mise en

évidence par la technique TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP digoxigenin

nick-end labeling) (168). Il semblerait que l’apoptose adipocytaire induite par les INRTs soit

due à la genèse d’une toxicité mitochondriale. En effet, le TA des patients infectés par le VIH

et traités avec les INRTs, dont principalement la stavudine, présente des dysfonctionnements

mitochondriaux tels qu’une baisse des taux d’ADN mitochondrial (ADNmt) et des anomalies

de structure des mitochondries (169, 281). De plus, le remplacement de la stavudine par

d’autres INRTs tels que l’abacavir ou la zidovudine améliore les taux d’ADNmt et prévient

l’apoptose (168). Ces phénomènes peuvent s’expliquer par le fait que les INRTs pourraient

inhiber, outre la réverse transcriptase du VIH, d’autres ADN polymérases et notamment,

l’ADN polymérase mitochondriale γ. Cette polymérase est impliquée dans la réplication de

l’ADNmt et son inhibition conduit à une déplétion des taux d’ADNmt et/ou à des altérations

de la structure génomique de l’ADNmt (245) provoquant ainsi une augmentation des espéces

réactives de l’oxygène et l’apoptose cellulaire. L’apoptose des adipocytes joue donc un rôle

important dans l’apparition du syndrome de lipoatrophie associée aux traitements

antirétroviraux. Les travaux de Pajvani et al. ont permis de montrer par l’utilisation de souris

transgéniques surexprimant de manière conditionnelle la caspase 8, une enzyme pro-

36

apoptotique, spécifiquement dans les adipocytes, l’expression du transgène étant sous le

contrôle du promoteur d’aP2, que le déclenchement de l’apotose adipocytaire par activation

de la caspase 8 s’accompagnait d’un phénotype lipoatrophique. Ces travaux démontrent ainsi

que l’induction et le maintien d’une apoptose adipocytaire pourraient contribuer à la genèse

des lipoatrophies (201, 266)

D.1.2) Les cellules progénitrices/ souches

Outre les effets des composés antirétroviraux sur l’apoptose adipocytaire, de

nombreux travaux montrent que ces composés altèrent également le processus de

différenciation adipocytaire. De nombreuses études ont évalué l’effet des IPs-VIH tels que le

saquinavir (SQV), le nelfinavir (NFV) et l’indinavir (IDV) sur la différenciation des

préadipocytes murins des lignées 3T3-L1 et 3T3F442A et ont montré que ces inhibiteurs de

protéases limitent leur différenciation adipocytaire (64, 144, 176, 300). Chez l’homme, il

existe peu de données concernant les effets des IPs-VIH sur la différenciation adipocytaire.

Deux études réalisées sur des cellules de la FSV du TA humain d’origine mammaire et des

cellules souches mésenchymateuses humaines confirment les effets anti-adipogéniques de

l’IDV et du SQV (109, 288). A l’inverse, les effets des INRTs sur la différenciation des

préadipocytes murins ne sont pas clairs. Certaines études rapportent que ces inhibiteurs

entraînent une diminution de l’adipogenèse (224) et d’autres n’observent aucun effet (28,

198). Récemment un inhibiteur non nucléosidique de la reverse transcriptase du VIH

(INNRT), l’efavirenz, a également fait l’objet d’une étude in vitro. Il a été observé que cet

INNRT inhibe la différenciation des préadipocytes murins de la lignée 3T3-L1 et humains

(68) suggérant que la troisième classe de médicaments utilisée pour le traitement du VIH

contribue à l’altération de la masse grasse. In vivo, sur des biopsies de TA sous-cutané

provenant de patients infectés par le VIH et ayant développé une atrophie adipocytaire, suite

au traitement antirétroviral, des altérations des taux de CEBP/α, de PPARγ et de SREBP-1

ont également été décrites (10). Ces résultats suggèrent que les IPs-VIH altèrent les processus

de différenciation adipocytaire dans les étapes précoces. Cependant, les cibles exactes de ces

composés ne sont pas encore totalement définies.

L’effet anti-adipogénique des IPs-VIH pourrait tout d’abord s’expliquer par des

interactions avec la voie de signalisation de l’acide rétinoïque. En effet, la région catalytique

de la protéase du VIH qui lie les IPs-VIH a environ 60% d’homologie avec CRABP-1

(cytoplasmic retinoic acid binding protein-1), un régulateur intracellulaire des taux d’acide

37

rétinoïque. Ainsi, les IPs-VIH peuvent inhiber la fonction de CRABP-1 et limiter le processus

d’adipogenèse qui nécessite l’expression des gènes dépendants de l’acide rétinoïque (34). De

plus, les IPs-VIH ont été également décrits pour être des inhibiteurs du cytochrome P450 3A,

l’unique enzyme connue pour convertir l’acide rétinoïque en acide cis-9-rétinoïque, le ligand

du RXR (Retinoïd X Receptor) qui par la suite s’hétérodimérise avec PPARγ (34).

Cependant, il faut rester prudent quant à ces données puisque des études ont rapporté que des

altérations du facteur de transcription PPARγ n’expliquent pas la diminution, induite par les

IPs-VIH, de la différenciation des préadipocytes murins et humains (144, 288, 300).

Des interactions entre SREBP-1 et les IPs-VIH ont également été décrites. Ainsi, le

traitement des préadipocytes de la lignée 3T3F442A par l’IDV et le NFV s’accompagne

d’une séquestration du facteur de transcription SREBP-1 au niveau de l’enveloppe nucléaire

des préadipocytes contrairement aux préadipocytes contrôles qui accumulent SREBP-1 au

niveau nucléaire (30). Le mécanisme responsable de cette séquestration de SREBP-1

consécutive à un traitement par les IPs-VIH n’est pas totalement élucidé. Cependant, certains

travaux suggèrent un rôle clé de la lamine A, protéine majeure de l’enveloppe nucléaire. Le

facteur SREBP-1 est synthétisé sous forme d’un précurseur inactif ancré au niveau du

réticulum endoplasmique ou de l’enveloppe nucléaire puis maturé par clivage protéolytique.

La forme mature active de SREBP-1 peut ensuite être transférée dans le noyau et activer

directement la transcription génique (21, 22, 284). Une interaction entre SREBP-1 et la

lamine A/C a déjà été décrite (153). La lamine A est synthétisée sous forme de prélamine A

et sa maturation est assurée par clivage à l’aide d’une métalloprotéinase, FACE chez

l’homme et Zmpste24 chez la souris. Les souris déficientes pour Zmpste24 présentent une

lipoatrophie associée à une accumulation de prélamine A au niveau de l’enveloppe nucléaire

(206). Le rôle clé de la lamine A et de la régulation de l’interaction lamineA/SREBP-1 dans

le contrôle de la différenciation adipocytaire est de plus souligné par les syndromes majeurs

de lipoatrophies génétiques qui sont dus à des mutations de la lamine A. Enfin, récemment il

a été montré que les IPs-VIH provoquaient une accumulation de prélamine A dans des

fibroblastes humains, suggérant que les IPs-VIH pourraient interagir avec FACE pour inhiber

la maturation de la lamine et empêcher l’accès du noyau au facteur adipogénique SREBP-1

(27, 47).

Enfin, une interaction des IPs-VIH avec le protéasome qui constitue la principale

machinerie de dégradation protéique chez les eucaryotes (51) a été envisagée. Des études ont

rapporté que les IPs-VIH sont des inhibiteurs de l’activité protéasomique de certaines cellules

cancéreuses (239) mais aussi de préadipocytes murins de la lignée 3T3-L1 (202). Or, les

38

inhibiteurs spécifiques du protéasome tels que la lactacystine inhibent la différenciation des

myoblastes (124), des ostéoclastes (299) mais aussi la différenciation des préadipocytes de la

lignée 3T3-L1 (212). Nous verrons dans le chapitre Résultats les données que nous avons

obtenues sur les interactions entre les IPs-VIH et le protéasome dans les préadipocytes

humains.

A ce jour, les mécanismes moléculaires des INRTs responsables de la baisse de

l’adipogenèse observée dans les travaux de Roche et al. sont inconnus. Etant donné l’action

des INRTs sur la fonction mitochondriale, il est tentant de spéculer que les INRTs peuvent

diminuer l’adipogenèse via une augmentation des espèces réactives de l’oxygène. En effet,

les espèces réactives de l’oxygène diminuent la prolifération et la différenciation adipocytaire

des lignées murines (35, 36).

Ainsi, l’ensemble de ces données suggère que la lipoatrophie associée au traitement

antirétroviral semble également être due à un défaut du processus de différenciation

adipocytaire. D’ailleurs, une étude récente implique majoritairement une altération de

l’adipogenèse plutôt qu’une induction de l’apoptose des adipocytes dans la lipoatrophie de

patients infectés par le VIH et sous tri-thérapie (181).

D.1.3) Les cellules endothéliales

Chez les patients infectés par le VIH et sous traitement antirétroviral, peu de données

concernent les cellules endothéliales. On peut noter que l’infection au VIH est associée à

l’activation de cellules endothéliales, observée par une augmentation plasmatique des

marqueurs cellulaires de surface tels que VCAM (Vascular Cell Adhesion Molecule), E-

selectin et ICAM1 (Intercellular Adhesion Molecule) chez des patients séropositifs (40). Par

ailleurs, les traitements antirétroviraux entraînent des altérations de la fonction endothéliale

chez des patients sains (244) et des dommages de l’ADNmt dans les cellules endothéliales

humaines (114). Enfin, il a été observé, comme pour les adipocytes, une apoptose des cellules

endothéliales chez des patients infectés par le VIH et sous traitement antirétroviral (62).

Cependant, une augmentation de la densité des vaisseaux du TA atrophié de patients infectés

par le VIH et traités a également été observée (110) et on peut se demander si cette

augmentation apparente n’est pas relative en fait à la diminution du nombre et du volume

adipocytaire. Toutefois, il récemment a été observé que les INRTs favorisent l’angiogenèse

des cellules endothéliales humaines in vitro (61). A ce jour, il est difficile de conclure sur

39

l’effet de la régression du TA au niveau des cellules endothéliales. D’autres investigations

sont nécessaires.

D.1.4) Les macrophages

Dans le TA sous-cutané de patients infectés par le VIH et sous tri-thérapie est

observée une infiltration macrophagique (10, 62, 110, 190) similaire à celle observée dans le

TA de patients obèses (24, 286). Cette accumulation de macrophages pourrait être due à

l’apoptose des adipocytes. En effet, les travaux de Cinti et al. indiquent la présence de

macrophages dans les TA de souris et d’humains obèses au niveau des adipocytes nécrosés

(45). De manière identique, dans le modèle de souris lipoatrophiques surexprimant la caspase

8 dans le TA, il a été rapporté une augmentation du nombre de macrophages à proximité des

adipocytes en cours d’apoptose (201).

D.2) Les modifications des fonctions métaboliques du tissu adipeux

Les traitements antirétroviraux affectent également les deux grandes fonctions

métaboliques du TA. Ainsi, des études ont mis en évidence que les IPs-VIH diminuent la

lipogenèse des préadipocytes murins différenciés (64, 137, 144). Ces effets semblent être dus

à une diminution de l’activité de la LPL et de la synthèse de novo de lipides (218). Etant

donné que les IPs-VIH ont la capacité d’interagir avec le transporteur du glucose GLUT-4, il

a été suggéré que les effets des IPs-VIH sur la synthèse de novo de lipides passe par une

inhibition de l’activité de GLUT-4 et du captage du glucose (99, 179, 180). Récemment, une

inhibition de la lipogenèse a également été observée sur des préadipocytes murins

différenciés et traités avec des INRTs mais aussi avec l’efavirenz, un INNRT (68, 137).

La lipolyse est également touchée par les traitements antirétroviraux puisqu’ils sont

associés à une augmentation des taux circulants d’AGNE (93). L’activation de la lipolyse

semble être due à une combinaison complexe entre l’infection au VIH et les traitements

associés. En effet, une augmentation de la lipolyse a été rapportée chez des patients infectés

par le VIH et ce indépendamment du type de thérapie (268). In vitro, de nombreuses études

ont mis en évidence que les IPs-VIH stimulent la lipolyse des préadipocytes différenciés

murins (111, 144, 218, 231). De plus, une interruption de la prise de ces inhibiteurs diminue

l’activation de la lipolyse et les taux d’AGNE chez les patients (268). Récemment, une étude

40

indique que l’effet stimulateur des IPs-VIH sur la lipolyse semble être du à une baisse des

taux de périlipine par une augmentation de leur protéolyse lysosomale (130).

L’ensemble de ces phénomènes pourraient donc expliquer la diminution de la taille

des adipocytes chez des patients infectés par le VIH sous traitement antirétroviral (10, 152).

D.3) Les modifications des fonctions sécrétoires du tissu adipeux

Comme nous l’avons vu précédemment, le profil sécrétoire du TA varie au cours de

l’obésité. Aussi, il n’est pas surprenant que lors d’une perte importante de TA, ce profil soit

également modifié. Quelques études se sont intéressées aux modifications des sécrétions

adipocytaires dues aux IPs-HIV et aux INRTs in vitro sur des préadipocytes différenciés

murins et humains (118, 137, 139, 274) et in vivo dans le plasma et le TA de patients

séropositifs sous traitement antirétroviral (43, 110, 115, 182, 259, 275). Les principaux

facteurs connus pour être modulés par les traitements antirétroviraux in vitro et in vivo sont

présentés dans le tableau 6. Notons que l’effet des traitements antirétroviraux sur la leptine

n’est pas clair puisque deux études réalisées sur des préadipocytes différenciés humains

diffèrent (138, 274). Par ailleurs, la diminution de la sécrétion de leptine observée in vivo est

directement corrélée à la diminution de la quantité de TA des patients (275).

Tableau 6: Impact des IPs-VIH et des INRTs sur les sécrétions adipocytaires in vitro et in vivo

Augmentation Diminution Pas de modification

IPs-VIH

IL-6 (137, 138, 274)

TNF-α (137, 138, 274)

IL-1β (137, 138)

Leptine (274)

Adiponectine

(137, 138, 274)

Leptine (138)

INRTs

IL-6 (137, 138)

TNF-α (137, 138)

IL-1β (137, 138)

Adiponectine

(137, 138)

Leptine (138)

Patients sous

IPs-VIH et INRTs

IL-6 (43, 115)

TNF-α (43, 115)

Adiponectine (259)

Leptine (115) IL-1β (43)

41

Les modifications importantes des sécrétions adipocytaires dues aux traitements

antirétroviraux in vitro et in vivo pourraient contribuer à l’atrophie du TA et aux

complications métaboliques qui lui sont associées. En effet, ces sécrétions peuvent altérer les

principales fonctions métaboliques des adipocytes ainsi que leur survie cellulaire. De plus,

certaines d’entre elles peuvent également moduler l’adipogenèse telles que le TNF-α et l’IL-6

(pour revue (89)).

Pour conclure, les lipoatrophies résultent donc d’une profonde altération de la

composition cellulaire et des grandes fonctions métaboliques et sécrétoires du TA. Suite

à un défaut du maintien de l’homéostasie énergétique lors d’une perte de TA, ces

phénomènes sont associés à des complications métaboliques similaires à celles

rapportées lors d’un excès de TA. A l’heure actuelle, quelques approches

thérapeutiques pour le traitement des lipoatrophies ont été développées

(thiazolidinedione, metformine) mais elles agissent plus sur les complications

métaboliques associées que sur l’altération du TA elle-même. Ainsi, une meilleure

connaissance des mécanismes impliqués dans la régression de la masse grasse est

nécessaire afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

En conclusion de cette première partie, le TA subit donc un remodelage important

lors d’un développement excessif (obésité) ou d’une régression (lipoatrophie) (pour

illustration figure 9). Ainsi, la modification de la composition cellulaire du TA et les

altérations des fonctions métaboliques et sécrétoires de ce tissu pourraient jouer un rôle clé

dans les pathologies associées à l’obésité et aux lipoatrophies telles que le diabète de type II

et les pathologies cardiovasculaires. Une meilleure compréhension des mécanismes

impliqués dans la perte et le gain de poids ainsi que la découverte de nouvelles cibles

thérapeutiques sont donc nécessaires.

Il est évident que la plasticité du TA est possible grâce à fort remodelage tissulaire, au

niveau cellulaire mais aussi au niveau matriciel. De nombreuses protéases ont été décrites

pour être impliquées dans la régulation du remodelage tissulaire. Toutefois, les MMPs sont

les acteurs majeurs du remodelage matriciel. Dans le chapitre suivant, nous aborderons la

classification, la structure ainsi que la régulation de l’activité des MMPs. Puis, les modes

d’action et les fonctions biologiques auxquels les MMPs sont associées seront présentés.

Enfin nous aborderons le rôle potentiel de ces enzymes dans la plasticité du TA.

42

Figure 9 : Comparaison entre les modifications du tissu adipeux lors d’une obésité

ou d’une lipoatrophie

D’après Villaroya

F., Int J Obes (Lond), 2007

Monocyte/macrophage

Adipocyte

Macrophage

Adipocytenécrosé

Cellules endothéliales

OBESITE LIPOATROPHIE

Monocyte/macrophage

Adipocyte Macrophage

Adipocytenécrosé

Cellules endothéliales

Acides gras libres

Adiponectine

Insulino-résistance

Dyslipidémie

Syndrome métabolique

pro-inflammatoiresCytokines

II. Les métalloprotéases matricielles

Les MMPs font partie de la grande famille des metzincines. Elles sont impliquées

dans tous les processus nécessaires au développement et jouent un rôle majeur dans le

remodelage tissulaire via la dégradation de la MEC. Ainsi, elles sont associées à différentes

pathologies telles que l’arthrite rhumatoïde, les maladies cardiovasculaires et le

développement tumoral. Au cours de ce chapitre, nous allons nous intéresser aux MMPs en

général, à leur régulation, leur mode d’action et aux principales fonctions biologiques qui

leurs sont associées. Enfin, nous aborderons leur rôle dans le TA.

A) Classification et structure

Les MMPs constituent une famille d’endopeptidases à doigt de zinc comprenant, à ce

jour, au moins 24 membres dénommés soit par un nom descriptif, soit par un numéro. En

accord avec la spécificité de leur substrat et de leur structure, les membres de la famille des

MMPs ont été classés en au moins 5 familles distinctes: les collagénases, les gélatinases, les

stromélysines, les matrilysines et les MMPs de type membranaires (MT-MMPs) (Tableau 7).

Malgré une certaine spécificité de substrats, les spectres protéolytiques des différentes MMPs

sont assez larges et se recouvrent permettant ainsi la dégradation de l’ensemble des

composants de la MEC. Dans le tableau 7 se trouvent les différents substrats matriciels des

MMPs répertoriés grâce à des études in vitro (37, 254). Il est important de préciser qu’à ce

jour, tous les substrats des différentes MMPs ne sont pas encore connus et restent à être

déterminés. C’est notamment le cas des MMP-11 et -18.

La structure primaire des MMPs contient au minimum trois domaines: un pré-

domaine, un pro-domaine et un domaine catalytique proprement dit. Le pré-domaine, au

niveau N-terminal, correspond à un peptide signal. Il est nécessaire à la sécrétion des MMPs

puis est rapidement dégradé. Le pro-domaine maintient l’activité enzymatique sous forme

latente et est classiquement constitué d’une séquence peptidique comprenant un résidu

cystéine qui interagit avec l’atome de zinc au niveau du domaine catalytique (figure 10). Les

MMPs sont donc sécrétées sous forme latente ou zymogène. Pour être actives, le pro-

domaine doit être éliminé ou modifié par clivage protéolytique, libérant ainsi l’atome de zinc

du résidu cystéine et entraînant l’activation du domaine catalytique qui peut alors se lier à son

substrat. La plupart des MMPs possèdent en plus un domaine charnière riche en proline et un

domaine C-terminal contenant une séquence homologue à de l’hemopexine ou de la

43

vitronectine. Ce dernier domaine intervient dans la reconnaissance du substrat des MMPs.

Des particularités de structure sont observées pour certaines MMPs. Les MMP-2 et -9

possèdent, à l’intérieur de leur domaine catalytique, un domaine homologue à la fibronectine

qui est responsable de la forte affinité de ces enzymes pour la gélatine et le collagène. Les

MT-MMPs possèdent un domaine additionnel qui leur permet l’ancrage à la membrane

plasmique (254).

Tableau 7: Classification des métalloprotéases matricielles

(FN: fibronectine ; PG: protéoglycanes)

Nom MMPs Substrats matriciels Collagénases

1 2 3 4

1 8 13

18

Collagènes (I, II, III, VII, VIII et X), gélatine, PG Collagènes (I, II, III, V, VII, VIII et X), gélatine et PG

Collagènes (I, II, III, IV, IX, X et XIV), gélatine, PG, FN, laminine, tenascine, ostéonectine, fibrilline

? Gélatinases

A

B

2 9

Gélatine, collagènes (I, IV, V, VII, X, XI, et XIV), élastine, tenascine, fibrilline, laminine, FN, ostéonectine et PG

Gélatine, collagènes (IV, V, VII, X, XI et XIV), élastine, fibrilline, FN, laminine, entactine, ostéonectine et PG

Stromélysines

1 2 3

3

10

11

Collagènes (II, III, IV, V, IX et X), FN, élastine, gélatine, laminine, fibrilline, FN, tenacsine, entactine, ostéonectine et

PG Collagènes (II, III, IV, V, IX et X), FN, élastine, gélatine,

laminine, caséine et PG ?

Matrilysines

1 2

7

26

Collagènes (IV et X), élastine, FN, laminine, tenascine, entactine, ostéonectine, gélatine, caséine et PG

Collagène IV, gélatine et FN MT-MMPs

1 2 3 4 5 6

14

15 16 17 24 25

Collagènes (I, II, III et IV), gélatine, élastine, FN, laminine, vitronectine, perlecan, fibrilline, tenascine, entactine et PG

FN, laminine, tenascine, perlecan, entactine et PG Collagène III, FN, gélatine, PG, laminine, caséine

Fibrine, fibrinogène PG

Collagène IV, FN, fibrine, gélatine Autres 12

19 20 21 22 23 28

Collagène IV, gélatine, FN, laminine, vitronectine, élastine, fibrilline, caséine et PG

Gélatine ? ? ? ? ??

44

Figure 10 : Les métalloprotéases

matricielles

(A)

Structure(B)

Activation par clivage du pro-domaine

D’après Page-McCaw

A., Nat Rev Mol Cell Biol, 2007

Structure de base des MMPsMMP-1MMP-3MMP-8MMP-10MMP-11MMP-12MMP-13MMP-19MMP-20MMP-21MMP-27MMP-28

MMPs

avec un domaine fibronectineMMP-2MMP-9

MMP liées à

la membraneTransmembranaire:MMP-14MMP-15MMP-16MMP-24

Ancré

au GPIMMP-17MMP-25MMP-13

Domaine minimum des MMPsMMP-7MMP-26

A

B

Pro-domaine

Protéase

Domainemembranaire

Domainecatalytique

Domainehémopoxine

Domainecharnière

Domaine fibronectine

de type II

B) Les régulations des MMPs

Pour éviter une protéolyse excessive et des dommages tissulaires, l’activité des MMPs

est régulée par de multiples contrôles aussi bien au niveau de leur transcription, traduction et

sécrétion que de leur localisation, activation et inhibition (figure 11 et pour revue (254)).

Nous aborderons dans ce paragraphe les principales régulations des MMPs.

B.1) Les régulations transcriptionnelles et post-transcriptionnelles

L’expression des MMPs est normalement faible dans les tissus et est induite lorsqu’un

remodelage tissulaire est requis. Une large variété de facteurs solubles incluant des facteurs

de croissance et des cytokines tels que les interleukines 1α et β, les interférons α, β, et γ,

l’EGF, le FGF, le PDGF, le TGF-β et le TNF-α influent sur l’expression des MMPs. Il en est

de même pour les protéines de la MEC notamment les collagènes (290). De plus, des facteurs

non solubles tels que les contacts cellule-cellule et cellule-MEC ainsi que la forme de la

cellule modulent l’expression des MMPs (183, 254, 290). En effet, il a été observé que des

altérations morphologiques de divers types cellulaires entraînent une augmentation de

l’expression des collagénases (2) ainsi que l’activation de certaines intégrines (106).

L’étude des promoteurs des différentes MMPs a mis en évidence la présence de

plusieurs éléments de liaison pour divers facteurs de transcription tels qu’AP1 (activator

protein-1), PEA3 (polyoma enhancer A binding protein-3), NF-κB (nuclear factor-κB) et la

β-catenin (figure 12) (289, 295). Il est connu qu’AP1 lie les facteurs de transcription c-fos et

c-jun et que les sites PEA3 lient ceux de la famille ETS (E26 transformation specific). Le

facteur de transcription NF-κB est connu pour être impliqué dans les processus

d’inflammation et la β-caténine répond à la voie de signalisation de Wnt (187, 294). Comme

on peut l’observer dans la figure 12, plusieurs promoteurs des MMPs sont similaires en terme

de composition en éléments de liaison aux facteurs de transcription suggérant que plusieurs

MMPs sont co-régulées dans leur expression. Cependant et de manière surprenante, les

promoteurs des MMPs appartenant à la même famille telles que les MMP-2/MMP-9

(gélatinases) et les MMP-1/MMP-8 (collagénases) n’ont aucune similitude. Des groupes de

promoteurs de MMPs ont pu ainsi être formés en fonction de leur composition en élément de

liaison (figure 12 et pour revue (37). Il a ainsi été observé que l’expression des MMP-2, 14 et

28 est majoritairement « constitutive » avec tout de même une induction possible par certains

facteurs de croissance ou cytokines (37).

45

Figure 11 : Régulation de l’activité

des métalloprotéases

matricielles

D’après Page-McCaw

A., Nat Rev Mol Cell Biol, 2007

1) mRNA

transcription2) Traduction

3) Sécrétion

4) Localisation

5) Activation 6) Inhibition 7) Dégradation

Domaine catalytique

Pro-domaine

Protéase

Liaison à

la MEC

Sécrétion régulée

Noyau

Sécrétion constitutive

Transmembranaireou GPI liée Associée à

la membrane

α2-macroglobuline TIMP

Figure 12 :

Eléments de liaison aux facteurs de transcription sur les promoteurs des métalloprotéases

matricielles

(AP-1: activator

protein-1; AP-2 : activator

protein-2; C/EBP-β

: CCAAT/enhancer

binding

protein-β

; GC : Sp-1 binding

site ; HBS : HIF-binding

site ; KRE-M9 : keratinocyte

differentiation

factor-

1responsive element-4 ; LBP-1 : leader-binding

protein

; NF-1 : nuclear

factor-1 ; NF-κB : nuclear

factor-

κB ; OSE-2 : osteoblast-specific

element-2 ; p53/AP-2 : p53/AP-2 composite binding

site ; PA : polyadenylation

signal ; PEA3 : polyoma

enhancer

A binding

protein-3 ; RARE : retinoic

acid

responsive element

; SBE : STAT-binding

element

; Si : silencer

sequence

; SPRE : stromelysin-1 PDGF-responsive

element

; TATA : TATA box ; Tcf-4 : T-cell

factor-4/β-catenin-binding

site ; TIE : TGF-β

inhibitory element

; TRF : octamer

binding

protein

; SAF-1 : serum

amyloid

A activating

factor-1.

D’après Yan

C., J. Cell. Physiol., 2007

MMP-8

MMP-11

MMP-21

MMP-2

MMP-14

MMP-28

Groupe 2

Groupe 3

MMP-1

MMP-3

MMP-13

MMP-7

MMP-9

MMP-10

MMP-12

MMP-19

MMP-26

Groupe 1

Il est important de signaler que la régulation transcriptionnelle des MMPs ne dépend

pas uniquement de la présence de site de liaison au niveau de leur promoteur. En effet, des

polymorphismes du promoteur et des régulations épigénétiques (i.e, la méthylation de l’ADN

ou des altérations de la structure de la chromatine) jouent également un rôle dans l’expression

des MMPs. Enfin des régulations post-transcriptionnelles des MMPs sont possibles et

correspondent le plus souvent à des processus de stabilisation ou de dégradation des transcrits

(pour revue (295)).

B.2) Les régulations de la sécrétion

Les MMPs sont sécrétées par de nombreux types cellulaires notamment les

fibroblastes, neutrophiles, macrophages, cellules épithéliales et endothéliales (290). Certains

types cellulaires tels que les macrophages et les neutrophiles, qui ont la capacité de stocker

les MMPs dans des granules intracytoplasmiques, régulent la sécrétion des MMPs par les

actions de la plasmine ou de la thrombine sur le processus de libération des granules (220).

B.3) Les processus de maturation des MMPs

Comme il a été précisé un peu plus tôt, l’activation des MMPs dépend de

l’élimination ou de la modification de leur pro-domaine par clivage protéolytique. Différents

types d’activation des MMPs ont été décrits.

En général, l’activation des MMPs se produit à l’extérieur de la cellule. Le tableau 8

présente les principaux activateurs des MMPs (pour revue (37)). La plasmine issue de la

dégradation du plasminogène est l’un des activateurs physiologiques majeur des MMPs et de

ce fait les activateurs de sa production tels que les activateurs du plasminogène de type

urokinase (uPA) ou de type tissulaire (tPA) le sont également (26). Les MMPs elles-mêmes

sont capables d’activer d’autres MMPs. De plus, il a été rapporté que d’autres protéases telles

que les kallikréines, les cathepsines et les chymases permettaient la maturation des MMPs

(67). Les espèces réactives de l’oxygène ont aussi été impliquées dans l’activation des MMPs

(217, 287).

Les travaux de Pei et Weiss ont démontré pour la première fois que la pro-MMP11

(ou pro-stromélysine 3) était activée à l’intérieur de la cellule avant sa sécrétion. Cette

activation se fait par les furines, une famille de sérine protéases (204). Plus tard, il a été

montré que cette activation par les furines concerne les MMPs contenant une séquence

46

spécifique (RRKR) dans leur pro-domaine. C’est également le cas pour la MMP-14 (ou

MT1-MMP) (37).

Tableau 8 : Les activateurs des MMPs

MMP Activée par Activateur de

Collagénases

1

8 13 18

MMP-3 et 10, plasmine, kallikréine et chymase

MMP-3 et 10 et plasmine MMP-2, 3, 10, 14 et 15 et plasmine

?

MMP-2 ?

MMP-2 et 9 ?

Gélatinases

2 9

MMP-1, 7, 13, 14, 15, 16, 17 24 et 25 MMP-2, 3 et 13 et plasmine

MMP-9 et 13 ?

Stromélysines

3 10 11

Plasmine, kallikréine, chymase et tryptase Elastase et cathepsine G

Furine

MMP-1, 7, 8, 9 et 13 MMP-1, 7, 8, 9 et 13

? Matrilysines

7 26

MMP-3 et 10 et plasmine ?

MMP-2 ?

MT- MMPs

14 15 16 17 24 25

Plasmine et furine ? ? ? ? ?

MMP-2 et 13 MMP-2 et 13

MMP-2 MMP-2 MMP-2 MMP-2

Autres 12 19 20 21 22 23 28

? Trypsine

? ? ? ? ?

? ? ? ? ? ? ?

Un troisième mécanisme d’activation a été décrit au niveau de la surface de la cellule.

Il s’agit d’un mécanisme unique de régulation de la gélatinase-A (MMP-2). La forme inactive

de cette MMP peut se lier à une MMP transmembranaire, la MT1-MMP, ainsi qu’à une

protéine nommée TIMP-2 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 2) qui agit ici comme

une molécule adaptatrice (nous aborderons les TIMPs dans le paragraphe suivant). La

formation de ce complexe à trois partenaires au niveau de la surface cellulaire permet à une

seconde molécule de MT1-MMP de couper le peptide N-terminal de la pro-MMP-2 et

d’activer ainsi la protéase (258). Ici, MT1-MMP joue un double rôle de molécule réceptrice

et activatrice. Il faut préciser que les autres MT-MMPs sont également capables d’activer

47

MMP-2 même si la protéolyse par la MT1-MMP reste prédominante (37). En revanche, les

activateurs physiologiques de nombreuses MMPs sont encore inconnus (tableau 8).

Une fois leur pro-domaine clivé, les MMPs sont protéolytiquement actives mais très

rapidement elles peuvent être inactivées par liaison à des protéines inhibitrices. Ces protéines

vont se fixer directement au niveau du domaine catalytique empêchant l’accès au substrat.

Dans le paragraphe qui suit nous nous intéresserons aux différents inhibiteurs endogènes des

MMPs.

B.4) Les processus d’inhibition des MMPs

In vivo, l’activité des MMPs est contrôlée par les TIMPs (tissue inhibitors of matrix

metalloproteinases). A ce jour, quatre TIMPs différents ont été identifiés (TIMP-1 à -4). Ce

sont des protéines de petites tailles (20 à 29 kDa), sécrétées mais qui peuvent être retrouvées

à la surface cellulaire associées à des protéines liées à la membrane plasmique ou séquestrées

au niveau de la MEC. C’est le cas de TIMP-3 qui peut interagir avec des protéoglycanes

(298). Les TIMPs sont exprimés par de nombreux types cellulaires incluant les fibroblastes,

les cellules épithéliales et endothéliales, les ostéoblastes, les chondroblastes, les cellules du

muscle squelettiques ainsi que des cellules cancéreuses. Tandis que l’expression de TIMP-2

est constitutive, celle des TIMP-1, 3 et 4 est inductible. Avec un certain degré de spécificité,

les TIMPs sont capables d’inhiber l’activité des MMPs. Ils forment un complexe

équimoléculaire avec les formes actives des MMPs où le domaine amino-terminal des TIMPs

se lie au domaine catalytique des MMPs et, de ce fait, bloque l’accès à la poche contenant

l’atome de zinc. Cette inhibition est réversible. Les TIMPs ont aussi la capacité d’inhiber

d’autres protéases telles que les ADAMs (A Disintegrine And Metalloprotease domain)

(141). La régulation des MMPs par les TIMPs est un facteur majeur dans le contrôle de la

dégradation de la MEC. Elles jouent également un rôle dans le contrôle de nombreux

processus cellulaires tels que la prolifération mais aussi l’apoptose et des événements

physiologiques tels que l’angiogenèse et pathophysiologiques tels que le développement

tumoral (41). Toutefois, de plus en plus d’évidences indiquent que certaines de ces fonctions

semblent être complètement indépendantes des MMPs. Par exemple, récemment, il a été

rapporté que TIMP-2 et 3 pouvaient lier l’intégrine α3 β1 et entraîner une cascade de

signalisation négative conduisant à un arrêt du cycle cellulaire des cellules endothéliales

(243). De la même manière, TIMP-3 est capable d’interagir avec le récepteur 2 du VEGF

empêchant ainsi l’accès à son substrat et entraînant une inhibition de l’angiogenèse (216).

48

Ces effets étant retrouvés quand les TIMPs sont mutés au niveau de leur domaine nécessaire

pour l’inhibition des MMPs, il est donc fortement suggéré que les TIMPs pourraient exercer

des fonctions indépendamment de leurs effets sur les MMPs.

L’α2-macroglobuline, une protéine de 722 KDa, peut également inhiber l’activité des

MMPs (251). Trouvée en abondance dans le plasma, elle serait, de ce fait, l’inhibiteur

endogène majeur des MMPs dans les liquides physiologiques alors que les TIMPs agiraient

plus localement dans l’espace extra- et péri-cellulaire.

D’autres protéines ont été rapportées pour inhiber certaines MMPs. C’est le cas de la

protéine RECK (Reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs), une

glycoprotéine GPI-ancrée qui inhibe les MMP-2, -9 et -14, et bloque l’angiogenèse (193).

Une déficience de cette protéine chez des souris est létale suggérant des fonctions

importantes de RECK dans le développement. Enfin, un certain nombre de protéines

contenant des séquences similaires au TIMPs peuvent inhiber les MMPs. Ce sont les « TIMP-

like molecules » qui incluent notamment les neltrines, les protéines frizzled, la PCPE (type 1

collagen C-proteinase enhancer protein) et le TFPI-2 (tissue factor pathway inhibitor 2) (pour

revue (8)).

Ainsi, l’activité des MMPs dans l’espace extracellulaire dépend de l’équilibre entre

leur inhibition et leur activation. C’est cet équilibre qui régule le renouvellement de la MEC

et le remodelage tissulaire durant les processus de développement normal ou pathologique.

Voyons à présent les différents modes d’action des MMPs.

C) Mode d’action des MMPs

La MEC est un réseau dynamique de protéines incluant du collagène, de la

fibronectine, de la laminine et des protéoglycanes qui forme une barrière structurale. La

dégradation de la MEC a été longtemps considérée comme un simple remodelage de cette

barrière structurale. Depuis, des études ont montré que la MEC n’était pas juste une structure

passive. Elle peut influencer le comportement des cellules et notamment leur détermination et

leur différenciation (257). Jusqu'à récemment, on pensait que les MMPs participaient à ces

processus via leurs effets sur la MEC mais il est maintenant clair que les MMPs ont d’autres

mécanismes d’action (figure 13 et pour revue (178)). Il a ainsi été rapporté que la dégradation

des composants de la MEC par les MMPs peut générer des fragments matriciels

49

Interactions cellule-cellule

Interactions cellule-matrice

Récepteurs et autres protéines de surface

Protéines de liaison et autres protéines solubles

Facteurs de croissance,facteurs angiogéniques,

chémoattractants

et inhibiteurs

Fragments matriciels

actifs

Figure 13 : Mode d’action des métalloprotéases

matricielles

D’après Sternlicht

and

Werb, Annu Rev Cell Dev Bio,

2001

biologiquement actifs tels que l’endostatine (fragment du collagène XVIII) (77),

l’angiostatine (fragment du plasminogène) (195), des fragments de laminine et certains

peptides dérivés de la fibronectine (178). La MEC est également un réservoir de facteurs de

croissance et de cytokines qui sont libérés lors de la dégradation matricielle. C’est notamment

le cas du TGF-β lors de la dégradation de la décorine par les MMP-2, -3 ou -7 (108). En plus

de leur capacité à dégrader l’ensemble des composants de la MEC, les MMPs peuvent

également cliver de nombreuses protéines cellulaires de surface, péri-cellulaires ou

circulantes. Ainsi, les MMPs peuvent activer la forme pro-TGF-β et pro-TNF-α ou cliver les

IGFBPs (insulin-like growth factor binding protein) et par conséquent augmenter la

biodisponibilité de l’IGF (80). De plus, le changement de l’environnement cellulaire peut

indirectement moduler des voies dépendantes des protéines d’ancrages telles que celles des

intégrines. Enfin des études récentes suggèrent que certaines MMPs (MMP-2, -3, -11 et -14)

pourraient avoir également des cibles intracellulaires telles que PARP (poly ADP-ribose

polymérase, une enzyme de réparation à l’ADN (88, 134, 156, 248). Ces nouvelles données

rendent le champ d’action des MMPs encore plus large qu’il ne l’était.

D) Les fonctions biologiques et pathologiques des MMPs

Comme nous l’avons déjà évoqué, la MEC joue un rôle prépondérant dans le

comportement cellulaire (257). Il n’est donc pas surprenant que les principaux acteurs de son

remodelage aient un rôle tout aussi important.

Au niveau cellulaire, ces enzymes jouent un rôle majeur dans la migration cellulaire,

la prolifération, l’apoptose et la différenciation de nombreux types cellulaires notamment les

neurones, les chondrocytes, les ostéoblastes et les adipocytes (dont nous parlerons un peu

plus tard) (pour revue (162)). Récemment, des études ont également suggéré un rôle des

MMPs dans le devenir des cellules souches mésenchymateuses (159). En effet des travaux

indiquent que la composition et la rigidité de la MEC modulent l’orientation des cellules

souches mésenchymateuses vers différents lignages (69) par des modifications des adhésions

focales. De par leurs fonctions au niveau cellulaire, les MMPs régulent plusieurs processus

du développement incluant la morphogenèse, l’angiogenèse, la cicatrisation, la menstruation

et le développement mammaire et osseux (pour revue (280). Des approches de transgenèse

ont permis d’étudier les fonctions biologiques des MMPs dans le développement. A ce jour,

16 modèles de souris déficientes pour les MMPs ont été développés. Toutes les souris

déficientes pour les MMPs sont viables avec cependant des différences notoires sur les

50

phénotypes des animaux qui sont présentés dans le tableau 9 (199). Le fait que ces souris

soient viables, malgré l’importance des MMPs dans le développement, suggère de forts

mécanismes de compensation vis-à-vis d’autres MMPs.

Tableau 9: Phénotypes des souris déficientes pour les MMPs

Géne invalidé

Phénotype des animaux

MMP-2 Diminution de la taille corporelle, réduction de la néovascularisation, diminution de l’invasion primaire du conduit de la glande mammaire ; réduction du développement pulmonaire

MMP-3 Altération de la structure des jonctions neuromusculaires, altération de la morphogenèse de la glande mammaire

MMP-7 Défaut de l’immunité innée, diminution de la re-épithélialisation après une blessure du poumon

MMP-8 Augmentation des tumeurs de la peau, résistance aux hépatites létales induites par le TNFα

MMP-9 Défauts du développement osseux, défaut de la re-myélinisation neuronale après une blessure nerveuse, retard de la cicatrisation des fractures osseuses, altération du remodelage vasculaire, altération de l’angiogenèse

MMP-10 Augmentation de l’inflammation et de la mortalité en réponse à une infection ou une blessure

MMP-11 Retard de la tumorigenèse mammaire MMP-12 Diminution de la récupération d’une compression de la moelle épinière,

augmentation de l’angiogenèse due à une diminution de l’angiostatine MMP-13 Défaut du remodelage osseux, réduction des fibroses hépatiques, augmentation

de l’accumulation du collagène dans les plaques d’athérosclérose MMP-14 Défaut du remodelage squelettique, défaut de l’angiogenèse, inhibition de

l’éruption dentaire et de l’élongation des racines, défauts au niveau des poumons et des glandes submandibullaires

MMP-19 Obésité MMP-20 Défaut de l’émail dentaire MMP-23 Pas de phénotype rapporté MMP-24 Réponse anormale à une blessure du nerf sciatique MMP-28 Augmentation de la réponse inflammatoire D’après Page-McCaw A., Nat Rev Mol Cell Biol, 2007

En plus de ces données sur les principales fonctions des MMPs, il est important de

préciser la complexité des MMPs, en terme d’activité biologique. En effet, certaines d’entre

elles sont paradoxales, puisqu’une MMP peut avoir des effets diamétralement opposés. Par

exemple, il est connu que les MMP-2 et -9 favorisent l’angiogenèse mais des effets anti-

angiogéniques leurs sont également attribués (pour revue (232)). Il en est de même pour les

51

processus apoptotiques puisque les MMP-2, -3, -7 et -9 peuvent être pro- et anti-apoptotiques

(pour revue (160)).

Du fait de leurs fonctions biologiques, les MMPs ont été associées à diverses

pathologies. Ce sont des modulateurs importants de l’inflammation (pour revue (203)) et elles

sont fortement augmentées dans toutes les pathologies associées à une inflammation

notamment l’arthrite rhumatoïde. A ce jour, un inhibiteur des MMPs, le périostat, est utilisé

pour le traitement de la parodontite, une inflammation des tissus de soutien qui relient la dent

au maxillaire.

Des dérégulations des MMPs ont également été impliquées dans diverses pathologies

cardiovasculaires telles que l’athérosclérose et l’infarctus du myocarde (85, 253).

Enfin, l’importance des MMPs dans la progression du cancer n’est plus à démontrer

(60). Leur expression est fortement augmentée dans de nombreux cancers. Elles interviennent

dans toutes les phases du cancer c’est-à-dire de la croissance tumorale, l’invasion,

l’extravasation dans des sites plus éloignés ainsi que dans l’effet angiogénique requis pour

nourrir la formation de la nouvelle tumeur. Ainsi, les MMPs sont devenues la première cible

pour les programmes de découverte de nouveaux médicaments à but anti-cancéreux. De

nombreux inhibiteurs des MMPs ont été développés (tableau 10). Malgré un début très

prometteur, la survenue d’effets indésirables au cours des phases de développement clinique

et le peu de bénéfice par rapport aux effets indésirables a conduit à l’arrêt de nombreux

d’entre eux. A l’heure actuelle, d’autres inhibiteurs plus spécifiques sont en cours de

développement (pour revue (161).

52

Tableau 10: Les inhibiteurs des MMPs dans le cancer

Inhibiteurs MMPs Spécificité Effets indésirables Phase

clinique Collagènes synthétiques peptidomimétiques

Batimastat (BB-94)

Large spectre des MMPs et ADAM-17 Péritonite Arrêt en

phase II Solimastat (BB-3643) Large spectre Courbatures musculosquelettiques Arrêt en

phase II Marimastat (BB-2516)

MMP-1, -2, -3, -7, -9 et -12

Douleur musculaire et articulaire (Légère à sévère)

Arrêt en phase III

Collagènes synthétiques non peptidiques

Prinomastat (AG3340)

MMP-1, -2, -3, -7, -9 et -14

Arthralgie et affection associée aux articulations

Arrêt en phase II

Tanomastat (BAY 12-9566) MMP-2, -3, -9 et -13

Légère douleur articulaire, élévation des enzymes hépatiques,

nausée et thrombocytopénie

Arrêt en phase III

D2163 MMP-1, -2 et -9 ? En phase II et III

Tétracycline modifiée

Métastat (Col-3)

MMP-1, -2, -8, -9 et -13

Toxicité systémique limitée, légère phototoxicité, anémie

sidéroblastique réversible

Utilisé dans le sarcome de Kaposi

Biphosphonate synthétique

Alendronate MMP-2 ? En Phase I

Composés naturels

Néovastat (AE-941)

MMP-2, -9, -12 et -13

Douleur musculosquelettiques et raideur articulaire

En Phase III

Catéchines MMP-2 et -9 Toxicité légère à modérée, effets neurologiques et gastrointestinaux En Phase I

Acide acétylsalicylique MMP-2 ? En cours

d’étude D’après Mannello F., Curr. Cancer Drug Targets, 2005

53

III. Les métalloporotéases matricielles dans le tissu adipeux

L’intérêt des MMPs dans le remodelage du TA est très récent et la majorité des études

ont été effectuées chez le rongeur. In vivo, dans des modèles de souris génétiquement obèses

(ob/ob et db/db) ou rendues obèses à l’aide d’un régime hyperlipidique, des variations

d’expression de différentes MMPs dans le TA ont été observées. On peut noter une

augmentation des MMP-2, -3, -11, -12, -13, -14, -19 et une diminution des MMP-7, -9, -16 et

-24 (38, 149, 164). De plus, un traitement au galardin, un inhibiteur des MMPs à large

spectre, limite le développement du TA de ces animaux (148). Ces premières données

suggèrent un rôle primordial du remodelage matriciel dans le développement de la masse

grasse.

A) La régulation de l’adipogenèse

In vitro, des travaux menés par notre équipe et celle de Croissandeau, indiquent que

des préadipocytes murins des lignées 3T3F442A (17) et 3T3L1 (53) produisent au cours de

leur différenciation adipocytaire deux MMPs appartenant à la famille des gélatinases : MMP-

2 et -9. Par ailleurs, l’inhibition de la différenciation adipocytaire est également observée

dans ces préadipocytes murins traités par des inhibiteurs des MMPs à large spectre

(batimastat et illomastat) ou des anticorps neutralisants dirigés contre les MMP-2 ou -9

suggérant un rôle majeur de ces deux MMPs dans l’adipogenèse chez les rongeurs (17, 53).

Récemment, la MT1-MMP a été identifiée comme importante dans le développement

de la masse grasse. En effet, les travaux de Chun et al. montrent que des souris déficientes

pour la MT1-MMP présentent un phénotype lipodystrophique (44). In vitro et de manière

surprenante, les préadipocytes issus de ces souris sont doués d’une adipogenèse normale dans

un modèle de culture classique en 2 dimensions. Cependant, lorsque ces préadipocytes sont

cultivés sur un support en 3 dimensions, leur adipogenèse est inhibée. Les auteurs démontrent

qu’in vivo les précurseurs adipocytaires sont entourés d’un riche réseau de fibres de collagène

de type 1. Ce réseau est profondément modifié notamment par la MT1-MMP en début de

différenciation. Ce remodelage modifie les contraintes physiques que fait subir la matrice de

collagène au cytosquelette des préadipocytes et induit des cascades de signalisation pour la

poursuite de la différenciation adipocytaire. En l’absence de MT1-MMP, le réseau de

collagène reste très dense, les contraintes du cytosquelette ne sont pas modifiées et le

54

programme de différenciation ne peut pas continuer. La MT1-MMP serait un facteur

adipogénique qui permet la croissance de l’organe adipeux en 3 dimensions.

De façon intéressante, trois autres MMPs, MMP-3 et -11 appartenant à la famille des

stromélysines (Stro1 et Stro-3 respectivement) et MMP-19, ont été décrites comme ayant des

effets inhibiteurs sur le développement du TA et sur l’adipogenèse. In vivo, des souris

transgéniques mutées pour la MMP-3 ont une adipogenèse au niveau de la glande mammaire

accélérée et une hypertrophie adipocytaire (3) et des souris déficientes pour les MMP-3, -11

et -19 soumises à un régime gras développent plus de TA que des souris contrôles (150, 163,

205). In vitro, Alexander et al. rapportent que la MMP-3 augmente au cours de la

différenciation des préadipocytes murins de la lignée 3T3 L1 et qu’un traitement avec des

inhibiteurs des MMPs (GM6001 et TIMP-1) accélère l’accumulation des lipides (3). Ces

données sont à l’opposé de celles obtenues par l’équipe de Croissandeau sur le même type

cellulaire. La spécificité et la sélectivité des inhibiteurs des MMPs utilisés pourraient

expliquer ces différences.

Enfin, en plus de leur rôle majeur dans la différenciation adipocytaire, il a récemment

été suggéré une implication des MMPs dans la détermination des cellules précurseurs vers le

lignage adipocytaire. En effet, les travaux d’Otto et al, indiquent qu’un traitement au BMP-4

entraîne une diminution des MMP-3 et -13 associée à l’engagement des cellules C3H10T1/2

vers le lignage adipogénique (197).

B) La régulation de l’angiogenèse

A ce jour, il existe peu de données concernant les MMPs et la régulation de

l’angiogenèse dans le TA. Toutefois, il a récemment été rapporté in vivo chez des rongeurs

que des macrophages positifs pour LYVE-1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan

receptor 1) et originaire de la moelle osseuse, induisent une angiogenèse notamment à travers

la sécrétion des MMP-9, -12 et -7 (42).

C) La régulation de l’infiltration macrophagique

La MMP-12 est requise pour la dégradation de la MEC par les macrophages et

l’invasion tissulaire (246). De plus, cette MMP est fortement augmentée chez des souris

obèses (38, 164). Les travaux de Huber et al. montrent que la MMP-12 est exprimée et

produite par les macrophages et les adipocytes matures suggérant que ces deux types

55

cellulaires contribuent à la production de MMP-12 dans le TA de sujets obèses. Ainsi, les

auteurs suggèrent que la production de MMP-12 pourrait favoriser l’infiltration

macrophagique mais aussi faciliter la croissance des adipocytes durant le développement de

la masse grasse (104). Toutefois cette hypothèse reste encore à démontrer. Récemment, les

travaux de Cho et al. montrent qu’un traitement avec un inhibiteur de l’activité des MMPs,

l’acide zoledronique, diminue le recrutement et l’infiltration des macrophages positifs pour

LYVE-1. Ces macrophages exprimant principalement les MMP-7, -9 et -12, l’implication de

l’activité de ces MMPs dans l’infiltration macrophagique est suggérée (42).

Chez l’homme, les études concernant les MMPs dans le TA sont peu nombreuses.

Notre équipe a rapporté que des préadipocytes humains en culture primaire produisent et

sécrètent les MMP-2 et -9 au cours de leur différenciation. Sachant qu’il existe de grandes

différences entre les modèles humains et murins, la confirmation de l’implication des MMPs

dans l’adipogenèse chez l’homme est nécessaire et a fait l’objet d’une partie de notre étude.

De plus, de manière intéressante, une augmentation de la MMP-9 plasmatique a été associée

à l’obésité (86) et sa diminution à une perte de poids (140) suggérant un rôle clé de cette

protéase dans le remodelage du TA humain.

D) Les régulateurs des MMPs dans le tissu adipeux

Des travaux ont impliqués TIMP-1 et -3 dans le développement de la masse grasse

chez la souris. Les travaux de Fata et al. sur l’involution de la glande mammaire dans des

souris déficientes pour TIMP-3 montrent une reconstitution adipocytaire accélérée durant le

remplacement des cellules épithéliales de la glande mammaire par la formation du TA (76).

Toutefois, un effet de TIMP-3 sur les autres dépôts de TA de ces souris n’est pas décrit. Les

travaux de Lijnen et al. indiquent que des souris déficientes pour TIMP-1 sont protégées

d’une obésité induite par un régime gras (147). De plus, une augmentation de l’adipogenèse

du TA mammaire est observée in vivo chez des souris surexprimant TIMP-1 et l’addition

d’une protéine recombinante TIMP-1 accélère la différenciation des préadipocytes de la

lignée 3T3L1 in vitro (3). Toutefois, les travaux de Demeulemeester et al. ne sont pas en

accord avec ces résultats et indiquent qu’une surexpression de TIMP-1 par un adénovirus

n’affecte pas le développement du TA des souris, in vivo et in vitro, et n’affecte pas

l’adipogenèse des préadipocytes de la lignée 3T3F442A (59). Concernant l’expression et la

sécrétion de TIMP-1, une augmentation de l’expression de TIMP-1 chez des souris

56

génétiquement obèses ou soumises à un régime gras a été décrite (38, 164) et au cours de

l’adipogenèse in vitro les résultats ne sont pas très clairs puisque des études indiquent qu’au

cours de la différenciation des préadipocytes de la lignée 3T3F442A, l’expression de TIMP-1

augmente (164), et d’autres, notamment notre groupe, que son expression et sa sécrétion

diminuent (17, 116). Chez l’homme, les taux plasmatiques de TIMP-1 sont corrélés avec le

pourcentage de la masse grasse mais pas à l’IMC ni au tour de taille (131). Des travaux

complémentaires seraient nécessaires pour mieux comprendre le rôle précis des TIMPs dans

le TA, notamment chez l’homme, et si leurs effets sont directement liés aux MMPs ou

indépendants.

En plus des TIMPs, d’autres régulateurs des MMPs tels que le système

plasminogène/plasmine jouent un rôle majeur dans le remodelage du TA. Toutefois, ce

dernier a déjà fait l’objet de nombreuses études et ne sera pas abordé ici.

Pour conclure, les MMPs sont nécessaires à tous les processus du développement

de l’organisme. Elles constituent une grande famille de protéases dont l’activité est

régulée à de multiples niveaux. Il est clairement admis que les substrats des MMPs

peuvent être des composants matriciels ou des facteurs solubles cellulaires rendant ainsi

le champ d’action des MMPs très vaste. Elles sont considérées comme des protéases

majeures dans le remodelage tissulaire. Cependant, quelques études seulement se sont

intéressées à l’implication des MMPs dans le remodelage du TA et aucune étude n’a

encore démontré un rôle de ces protéases dans le TA humain.

57

Objectifs

Comme nous l’avons déjà évoqué, le TA est soumis à des processus de

développement excessif (obésité) mais aussi de régression (lipoatrophie). Il est admis que

cette plasticité du TA n’est possible que grâce à un remodelage cellulaire et matriciel. Les

MMPs, comme nous venons de le voir, sont des acteurs majeurs du remodelage tissulaire.

Quelques études ont montré l’importance des MMPs dans la différenciation adipocytaire des

préadipocytes de lignées murines. De plus, les inhibiteurs de la protéase du VIH, décrits

comme associés à l’émergence du syndrome de lipodystrophie, sont également associés à une

inhibition de l’adipogenèse chez les rongeurs. Les effets anti-adipogéniques observés avec les

inhibiteurs de protéases matricielles et de protéases du VIH nous ont conduit à émettre

l’hypothèse d’un lien entre les IPs-VIH et les MMPs. L’influence de ces protéases dans

l’adipogenèse chez l’homme reste cependant à être déterminée.

Dans la première partie de ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à

l’implication des MMPs dans la différenciation des cellules issues de la fraction stroma-

vasculaire (FSV) du TA humain en culture primaire. L’effet des IPs-VIH sur la

différenciation de ces cellules en culture primaire a également été étudié ainsi qu’un lien

potentiel entre les IPs-VIH et les MMPs. Nous avons ainsi observé que les IPs-VIH affectent

l’expression génique de la MMP-9. Peu de données étant connues quant à la régulation

génique de la MMP-9 et aux cibles potentielles des IPs-VIH, les mécanismes moléculaires

responsables de la diminution de l’expression de MMP-9 par les IPs-VIH ont été déterminés.

Dans une deuxième partie de ce travail, sachant que la FSV est formée de plusieurs

populations cellulaires telles que les cellules progénitrices aux capacités adipogéniques et

angiogéniques (241), les cellules endothéliales capillaires et les cellules immuno-

inflammatoires, nous avons voulu confirmer l’influence de MMP-9 sur l’adipogénèse des

cellules progénitrices isolées. Puis, afin de déterminer les mécanismes qui contrôlent le

devenir des cellules progénitrices, une condition de culture permettant l’étude simultanée de

leurs capacités adipogéniques et angiogéniques a été mise au point.

58

Résultats

I) Implication des MMPs dans la différentiation adipocytaire des cellules de la

fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux humain

Un rôle primordial des MMPs et du remodelage matriciel dans le développement du

TA est maintenant suggéré (38, 148, 149, 164). En effet, des travaux menés par notre équipe et

celle de Croissandeau, indiquent que des préadipocytes murins produisent les MMP-2 et -9

(17, 53). De plus, un traitement par des inhibiteurs des MMPs à large spectre (batimastat et

illomastat) ou des anticorps neutralisants dirigés contre les MMP-2 ou -9 limitent

l’adipogenèse suggérant un rôle majeur de ces 2 MMPs dans l’adipogenèse des préadipocytes

murins (17, 53). Toutefois, chez l’humain, les données concernant les MMPs dans le TA sont

peu nombreuses. Des travaux menés par notre équipe ont mis en évidence que des cellules

issues de la FSV du TA humain en culture primaire sécrètent les MMP-2 et -9 au cours de leur

différenciation adipocytaire.

Dans la publication 1, nous avons donc cherché à déterminer l’implication de ces

MMPs dans l’adipogenèse chez l’homme. En parallèle, nous avons également voulu confirmer

l’effet anti-adipogénique des IPs-VIH chez l’homme. En effet, si de nombreuses études ont

mis en évidence un effet inhibiteur des IP-VIHs sur la différenciation de préadipocytes murins

(64, 144, 176, 300), deux études seulement ont été réalisées sur des cellules souches

mésenchymateuses humaines et sur des préadipocytes humains d’origine mammaire (109,

288). Enfin, un lien potentiel entre les MMPs et les IPs-VIH a été recherché.

A) Influence d’un inhibiteur des MMPs et des inhibiteurs de la protéase du VIH

sur la différenciation adipocytaire

Publication 1 : Protease inhibitor treatments reveal specific involvement of matrix

metalloproteinase-9 in human preadipocyte differentiation.

V. Bourlier, A. Zakaroff-Girard, S. De Barros, C. Pizzacalla, V. Durand de Saint Front, M.

Lafontan, A. Bouloumié and J. Galitzky. J Pharmacol Exp Ther, 312:1272-1279, 2005

59

Protease Inhibitor Treatments Reveal Specific Involvement ofMatrix Metalloproteinase-9 in Human Adipocyte Differentiation

Virginie Bourlier, Alexia Zakaroff-Girard, Sandra De Barros, Christophe Pizzacalla,Veronique Durand de Saint Front, Max Lafontan, Anne Bouloumie, and Jean GalitzkyUnite de Recherche sur les Obesites, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Institut Louis Bugnard, HopitalRangueil, Universite Paul Sabatier, Toulouse, France (V.B., A.Z.-G., S.D.B., C.P., V.D.d.S.F., M.L., J.G.); and Institut furKardiovaskulare Physiologie, Frankfurt/Main, Germany (A.B.)

Received September 6, 2004; accepted November 9, 2004

ABSTRACTWe previously showed that human and murine 3T3-F442Apreadipocytes produced and released matrix metalloprotein-ases (MMPs) 2 and 9 and that a treatment by MMP inhibitorsresulted in the blockade of murine fat cell adipose conversion.In parallel, investigators reported that other protease inhibitors,the human immunodeficiency virus (HIV) protease inhibitors(PIs) involved in lipodystrophy in humans, also reduced theadipocyte differentiation process of several murine cell lines.The present work was performed to define the effects of MMPinhibitors and HIV-PIs on the human adipocyte differentiationprocess, to clarify the involvement of MMPs in the control ofhuman adipogenesis, and to determine whether HIV-PIs inter-act with MMPs in the control of this process. The effect of twoMMP inhibitor and four HIV-PI treatments on the differentiation

of primary culture human preadipocytes, as well as the putativerelationships between HIV-PIs and MMP-2 and -9 expression,release, or activity were investigated. We showed that MMPinhibitors and HIV-PIs reduced the human adipocyte differen-tiation process as assessed by the decrease of cell proteinand/or triglyceride contents and expression of fatty acid bind-ing protein and hormone-sensitive lipase, two adipocyte mark-ers. Unlike MMP inhibitors, HIV-PIs were devoid of any effectper se on recombinant MMP-2 and 9 activities but reduced theexpression and release of MMP-9 by human preadipocytes.Thus, the present study indicates that the modulation of theextracellular matrix components through the production and/oractivity of MMPs, and, more precisely, MMP-9 might be a keyfactor in the regulation of human adipose tissue development.

The mechanisms responsible for the growth of adiposetissue (AT) are still not well defined. Adipocyte hypertrophyand hyperplasia, due to the recruitment and differentiationof adipocyte precursor cells, or preadipocytes, into adipocytesare major cellular events in the development of the fat mass.Together with the hypertrophy and the hyperplasia events,recent investigations have clearly demonstrated that angio-genesis and extracellular matrix (ECM) remodeling are re-quired for coordinated growth of the fat depot (Lijnen et al.,2002; Rupnick et al., 2002). Among the enzymes involved inthe degradation of the ECM components, the matrix metal-loproteinase (MMP) family is considered to play a major role(Sternlicht and Werb, 2001). In a previous report, we dem-onstrated that mature human adipocytes and preadipocytes

produce and release two members of the MMP family,MMP-2 and -9, the expression and activity of which wereshown to be dependent on the adipocyte differentiation pro-cess (Bouloumie et al., 2001). Interestingly, we also reportedthat treatment of the murine 3T3-F442A preadipocytes,which also produced MMP-2 and -9 during adipose conver-sion, with MMP inhibitors decreased the rate of adipocytedifferentiation, suggesting that MMP activities are requiredfor adipogenesis in rodents. However, no data are availableconcerning the potential role of MMPs in the regulation of ATdevelopment in humans.

A lipodystrophy syndrome, characterized by body fat redis-tribution, hyperlipidemia, and insulin resistance, has beenassociated with the recent use of protease inhibitors (PIs) inthe therapy of AIDS as consequence of human immunodefi-ciency virus (HIV) infection (Carr et al., 1998). The mostprominent clinical sign of HIV-PI-associated lipodystrophy isa loss of subcutaneous fat (lipoatrophy) in the face and theextremities that can be accompanied, in some cases, by fat

This work was supported by Grants 01 128 and 02 197 from the AgenceNationale de Recherche sur le SIDA.

Article, publication date, and citation information can be found athttp://jpet.aspetjournals.org.

doi:10.1124/jpet.104.077263.

ABBREVIATIONS: AT, adipose tissue; ECM, extracellular matrix; MMP, matrix metalloproteinase; PI, protease inhibitor; HIV, human immunode-ficiency virus; IDV, indinavir; RTV, ritonavir; SQV, saquinavir; NFV, nelfinavir; RT-PCR, reverse transcriptase-polymerase chain reaction; HSL,hormone-sensitive lipase; aP2, fatty acid binding protein; NF-�B, nuclear factor-�B; IL, interleukin.

0022-3565/05/3123-1272–1279$20.00THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS Vol. 312, No. 3Copyright © 2005 by The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics 77263/1194036JPET 312:1272–1279, 2005 Printed in U.S.A.

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accumulation in the neck, back, and visceral depots, suggest-ing that it most likely involves HIV-PI-mediated dysregula-tion of the balance between the development and the regres-sion of the AT depending on the anatomical location of the fatdeposits. Numerous studies have examined the effect of HIV-PIs on adipocyte differentiation of murine cell lines and evi-denced that they are potent inhibitors of adipogenesis in vitro(Zhang et al., 1999; Vernochet et al., 2003). Further analysisof the putative targets of HIV-PIs has focused on the tran-scription factors that regulate the expression of adipocyte-specific markers (Dowell et al., 2000; Caron et al., 2001).

The present work was performed to define the effects ofMMP inhibitors and HIV-PIs on the differentiation of prea-dipocytes isolated from the stroma vascular fraction of hu-man AT. It was also expected to clarify the involvement ofMMPs in the control of the adipocyte differentiation processin human AT and to determine whether HIV-PIs interactwith MMPs in the control of this process. We evidenced thatthe broad-spectrum MMP inhibitor batimastat strongly in-hibited human adipocyte differentiation. Moreover, HIV-PIssuch as indinavir (IDV), ritonavir (RTV), saquinavir (SQV),and nelfinavir (NFV) also lead to a strong reduction of thehuman adipocyte differentiation process by a mechanismthat may involve their inhibitory effect on MMP-9 expressionand release by treated preadipocytes. Finally, we showedthat MMP-9 inhibitor also reduced the differentiation of hu-man preadipocytes, suggesting that MMP-9 is specificallyinvolved in the batimastat-mediated inhibition of humanadipogenesis. These data suggest that the modulation of theECM components through the production and/or activity ofMMPs and, more precisely, MMP-9 might be a key regulatorof human AT development.

Materials and MethodsCell Culture and Treatment. Chemicals were from Sigma-Al-

drich (Saint-Quentin Fallavier, France), and cell culture reagentswere from Invitrogen (Cergy Pontoise, France), Roche Diagnostics(Meylan, France), or Cambrex Bio Science (Verviers, Belgium).

Human subcutaneous abdominal white AT was obtained frommoderately overweight women undergoing plastic surgery (mean age39 � 2 years, mean body mass index 26.5 � 0.8 kg/m2). The isolationof human AT-derived stromal cells and the culture of stromal prea-dipocytes (i.e., fat cell precursors) differentiated into adipocytes wereperformed as previously described (10). Briefly, sterile AT was cutinto small pieces and digested under agitation with collagenase (300U/ml) for 1 h 30 min at 37°C. After centrifugation, washing, andfiltration steps, the stromal cells were suspended in Dulbecco’s Mod-ified Eagle’s medium F-12 supplemented with 10% fetal calf serumand plated at 60,000 cells/cm2. After 24 h, the medium was changedfor medium consisting of Dulbecco’s Modified Eagle’s medium F-12supplemented with 33 �M biotin, 17 �M pantothenate, and 50 �g/mlgentamycin (basal medium) in the presence of 66 nM insulin, 1 nMtriiodothyronine, 100 nM cortisol, 10 �g/ml human transferrin (adi-pogenic medium), and, for the first 3 days, 1 �g/ml ciglitazone. Afterthe 3-day priming period, the cells were cultured in the adipogenicmedium supplemented with 1) the MMP inhibitor batimastat [BB94or [4-(N-hydroxyamino)-2R-isobutyl-3S-(thienylthiomethyl)-succi-nyl]-L-phenylalanine-N-methylamide, kindly provided by BritishBiotech, Oxford, UK] or MMP-9 inhibitor [MMP-9/MMP-13 inhibitorII or N-hydroxy-1-(4-methoxyphenyl)sulfonyl-4-benzyloxycarbon-ylpiperazine-2-carboxamide from Calbiochem, VWR International,Strasbourg, France]; or 2) HIV-PIs IDV (kindly provided by Merck,Whitehouse Station, NJ), SQV (kindly provided by Roche, WelwynGarden City, UK), RTV (kindly provided by Abbott Diagnostics,

Abbott Park, IL), or NFV (kindly provided by Roche Diagnostics) for10 days. Batimastat was dissolved in ethanol, whereas HIV-PIs andMMP-9 inhibitor were dissolved in pure dimethylsulfoxide. Controlcells were treated using an appropriate concentration of each vehicle.Medium was replaced every 2 days. Before the experiments, the cellswere placed in basal medium with or without 0.1% bovine serumalbumin (MMP inhibitors versus HIV-PIs, respectively) overnight,supplemented with the various treatments.

The medium was then collected and used in zymography analysis.Cell triglyceride and total protein contents were determined usingkits from Sigma-Aldrich and Bio-Rad S.A (Marnes-la-Coquette,France), respectively.

Gelatin Zymography. Proteins with gelatinolytic activity wereidentified by electrophoresis in the presence of SDS in 8% polyacryl-amide gels containing 1 mg/ml gelatin. Briefly, culture mediumbatches (20 �l) were directly loaded onto gels; after electrophoresis,proteins were renatured by exchanging SDS with 2.5% Triton X-100(20-min incubation repeated twice). The gels were then incubated for16 h at 37°C in 50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM CaCl2, and 0.02%NaN3 and stained with Coomassie Blue. The presence of gelatino-lytic activity in the culture medium batches was visualized as un-colored areas on an otherwise blue gel. Migration of proteins wascompared with that of prestained molecular weight markers. Thegels were scanned by an imaging densitometer and quantified usingthe NIH image program (developed at the U.S. National Institutes ofHealth).

Fluorometric Activity Assay on Recombinant MMP-2 and-9. In vitro assays were performed on 96-well plates. Human recom-binant activated MMP-2 (2 nM) or MMP-9 (4 nM) (Calbiochem) werepreincubated in the presence or absence of increasing concentrationsof batimastat (from 0.01 nM to 0.01 �M) or HIV-PIs (from 1 nM to100 �M) for 30 min at 37°C. Twenty micromolar of the fluorogenicsubstrate Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dnp-Ala-Arg (Bachem, Bubendorf,Switzerland) were then added to each well, and fluorescence (exci-tation, 325 nm; emission, 390 nm) was recorded every 2 min for 60min. MMP activity was evaluated by the maximum rate per minuteon five separate measurements in each well.

Real-Time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reac-tion (RT-PCR). Changes in mRNA levels from specific genes werequantified by real-time RT-PCR. Total RNAs were extracted usingQiagen Rneasy Mini Kit according to the manufacturer’s instruc-tions, and RNA concentrations were determined using a fluorometricassay (Ribogreen; Molecular Probes, Eugene, OR). RNA (0.5 �g) wasreverse-transcribed using the ThermoScript RT system (Invitrogen)according to the manufacturer’s instructions. Reverse transcriptionwas also performed without Thermoscript enzyme on RNA samplesto check for any genomic DNA contamination. PCR primers weredesigned using Primer Express software according to the recommen-dations of Applied Biosystems (Foster City, CA). The forward andreverse primer sequences for fatty acid binding protein (aP2), hor-mone-sensitive lipase (HSL), and MMP-9, respectively, were as fol-lows: aP2, GCATGGCCAAACCTAACATGA (forward) and CCTGG-CCCAGTATGAAGGAAA (reverse); HSL, GTGCAAAGACGGAGGA-CCACTCCA (forward) and GACGTCTGGAGTTTCCCCTCAG (re-verse); and MMP-9, CCCTGGAGACCTGAGAACCA (forward) andCCACCCGAGTGTAACCATAGC (reverse).

Each amplification reaction was performed with 15 ng of cDNAsample in duplicate in 96-well optical reaction plates with a Gene-Amp 5700 sequence detection system. The PCR mixture containedforward and reverse primer mix (final concentration, 900 nM forHSL or MMP-9 and 300 nM for aP2) and SYBR Green PCR MasterMix. For ribosomal RNA control (18S rRNA), a mixture containingprimers and fluorogenic probe mix, TaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems) was used. All reactions were performedunder the same conditions: 50°C for 2 min and 95°C for 10 min,followed by 40 cycles of 95°C for 15 s and 60°C for 1 min. Resultswere analyzed with the GeneAmp 5700 software, and all values werenormalized to the levels of 18S rRNA.

MMP-9 Involvement in Human Adipocyte Differentiation 1273

Statistical Analysis. Values are expressed as means � S.E.M.Data were analyzed with one-way analysis of variance coupled withpost hoc Dunnett’s multiple comparison test. Statistical significancewas set at p � 0.05.

ResultsMMP Inhibitor Batimastat Treatment Decreases the

Differentiation of Human Preadipocytes. To determinewhether the broad spectrum MMP inhibitor batimastat couldaffect the human adipocyte differentiation process, primarycultures of human preadipocytes were treated with 1 or 5 �Mbatimastat for 10 days. Total protein and cell triglyceridecontents were quantified, and the expression of two adipocytedifferentiation markers, aP2 and HSL, was analyzed by real-time RT-PCR.

As is clearly shown in Fig. 1A, 5 �M batimastat led to astrong inhibition of the adipocyte differentiation processsince treated cells exhibited no changes in shape and lesscytoplasmic accumulation of lipid droplets. Quantification oftotal protein and triglyceride contents, used as lipogenic in-dices, demonstrated that batimastat treatment statisticallydecreased adipogenesis (23 and 44% decrease in protein andtriglyceride concentrations, respectively) (Fig. 1B). Moreover,the analysis of aP2 and HSL mRNA levels showed thatbatimastat led to a reduction of the expression of both adi-pocyte differentiation markers (29 and 33% decrease in aP2and HSL mRNA expression, respectively) (Fig. 1B). Batimas-tat at 1 �M had no effect on the differentiation process (datanot shown).

HIV-PI Treatments Decrease the Differentiation ofHuman Preadipocytes. We then investigated the effect offour HIV-PIs on the human adipocyte differentiation process.Thus, primary cultures of human preadipocytes were treatedfor 10 days with increasing concentrations of HIV-PIs: 5, 10,25, or 50 �M for SQV and IDV; 1, 5, and 10 �M for NFV; and5, 10, and 25 �M for RTV. These concentrations were chosen

according to those usually found in the plasma of treatedpatients and proved to be effective on murine adipocyte dif-ferentiation (Lenhard et al., 2000; Roche et al., 2002). Totalprotein and cell triglyceride contents were quantified, andthe expression of aP2 and HSL was analyzed by real-timeRT-PCR. Only the concentrations for which a maximal effecton the differentiation process was observed, without detectedtoxicity (measured by the Toxilight kit, Cambrex Bio Sci-ences; data not shown), are presented.

As shown in Fig. 2, A and B, the protein and/or triglyceridecontents of the cells were decreased under HIV-PIs: 25%decrease in triglyceride concentration for IDV (50 �M), 28%decrease in triglyceride concentration for RTV (10 �M), and27 and 46% decrease in protein and triglyceride concentra-tions, respectively, with SQV (10 �M); and 34 and 56% de-crease in protein and triglyceride concentrations, respec-tively, with NFV (5 �M). The expressions of aP2 and HSLmRNAs were also decreased, respectively, by: 28 and 42%with IDV (50 �M), 38 and 47% with RTV (10 �M), 72 and 82%with SQV (10 �M), and 76 and 87% with NFV (5 �M) (Fig. 2,C and D). These results indicate an alteration of the differ-entiation process with the four HIV-PIs used. However, it isnoticeable, as shown for the protein and triglyceride con-tents, that SQV and NFV exhibited stronger effects on aP2and HSL expression than IDV or RTV. It should be notedthat higher concentrations of SQV (25 and 50 �M), RTV (25�M), and NFV (10 �M) lead to cell death within a few days inour model.

HIV-PIs Do Not Modify the Activity of Human Re-combinant MMP-9 or MMP-2. To establish whether HIV-PIs could affect the human adipocyte differentiation processby interacting with the MMP-dependent pathways, we firstanalyzed the capacity of HIV-PIs to inhibit MMP activities.The MMP inhibitor batimastat was used as control. MMP-2and -9 activities were determined by in vitro fluorescenceassays using human recombinant activated MMP-2 and -9

Fig. 1. Effect of the MMP inhibitor batimastat on thedifferentiation of human preadipocytes. Stromal preadipo-cytes from human subcutaneous AT were cultured in anadipogenic medium in the presence of 5 �M batimastat orits vehicle (control). A, light microscopy analysis performedafter 10 days of treatment. Photomicrographs (�100) arerepresentative of eight independent experiments. B, totalprotein and cell triglyceride contents, as well as aP2 andHSL mRNA expression, determined in cells maintainedovernight in basal medium with treatments. For aP2 andHSL expression, total RNAs were extracted from cells, andreal-time RT-PCR analysis was performed using specificcDNA primers. The results obtained were normalized to thelevels of 18S rRNA. Data are means � S.E.M. expressed asa percentage of the control for eight independent experi-ments. �, p � 0.05 versus control; ��, p � 0.01 versuscontrol.

1274 Bourlier et al.

together with a fluorogenic MMP substrate, in the presenceof increasing concentrations of HIV-PIs (from 1 nM to 100�M) or batimastat (from 0.01 nM to 0.01 �M). As expected,batimastat reduced, in a concentration-dependent manner,the fluorescence emission induced by the cleavage of theMMP substrate. However, none of the four HIV-PIs testedhad an effect per se on the basal fluorescence detected in theMMP-9 or -2 activity assays (Fig. 3).

HIV-PI Treatments Reduce MMP-9 Gelatinase Activ-ity Released by Human Preadipocytes. To determinewhether HIV-PIs could affect the gelatinase activities re-leased by 10-day-differentiated human preadipocytes, me-dium conditioned overnight by preadipocytes treated withIDV (50 �M), RTV (5 �M), SQV (10 �M), or NFV (5 �M) wascollected and analyzed by gelatin zymography.

As observed in Fig. 4, MMP-9 (92 kDa) and MMP-2 (72kDa) proforms (artificially activated by the gelatin zymogra-phy technique) were the major forms detectable in preadipo-cyte-conditioned media. An active form was visible forMMP-2 (62 kDa) but not for MMP-9 (82 kDa). Densitometricanalysis of the lytic areas showed that HIV-PI treatments

reduced the MMP-9 gelatinase activity (proform) released bytreated preadipocytes (53, 40, 74, and 91% decrease withIDV, RTV, SQV, and NFV, respectively). Interestingly, thisdecrease of MMP-9 gelatinase activity in the medium, corre-sponding to the proform, was not accompanied by an increaseof the active MMP-9 form (still not detectable), suggestingthat this reduction was due to a decrease in the secretion ofthe enzyme rather than to an increase in the maturation.

Unlike for MMP-9, the MMP-2 gelatinase activity (pro �active forms) released into the medium by treated preadipo-cytes did not present a common pattern for the four HIV-PIsused. Indeed, IDV treatment enhanced the MMP-2 activityreleased into the medium (27% increase), RTV and SQV weredevoid of effect, and NFV reduced it (20% decrease) (Fig. 4).

HIV-PI Treatments Reduce MMP-9 Expression byHuman Preadipocytes. Considering the results obtainedwith the gelatin zymography technique, real-time RT-PCRanalysis was performed on mRNAs extracted from the same10-day-treated preadipocytes to investigate any effect ofHIV-PIs on MMP-9 expression.

As depicted in Fig. 5, all HIV-PI treatments led to a sta-

Fig. 2. Effect of HIV-PIs on the differen-tiation of human preadipocytes. Stromalpreadipocytes from human subcutaneousAT were cultured for 10 days in an adipo-genic medium with vehicle (control) or inthe presence of HIV-PIs IDV, RTV, SQV,or NFV at various concentrations. Thecells were maintained overnight in basalmedium with treatments before use. To-tal protein and cell triglyceride contentswere then determined (A and B). For aP2and HSL mRNA expression, total RNAswere extracted from cells, and real-timeRT-PCR analysis was performed usingspecific cDNA primers. The results ob-tained were normalized to the levels of18S rRNA (C and D). Only the concentra-tions for which a maximal effect on thedifferentiation process was observed,without detected toxicity, are presented.Data are means � S.E.M. expressed as apercentage of the control for four to sevenindependent experiments. �, p � 0.05 ver-sus control; ��, p � 0.01 versus control.


tistically significant reduction of MMP-9 expression: 64%decrease with IDV (50 �M), 75% decrease with RTV (10 �M),82% decrease with SQV (10 �M), and 96% decrease with NFV(5 �M). These data are in accordance with those obtained bygelatin zymography, suggesting that the observed decrease ofMMP-9 gelatinase activity released into the medium underHIV-PI treatments is probably due to a reduction of MMP-9expression.

MMP-9 Inhibitor Treatment Decreases the Differen-tiation of Human Preadipocytes. Following the previousresults with batimastat and HIV-PI treatments, suggesting aparticular involvement of MMP-9 subtype in human adipo-genesis, primary cultures of human preadipocytes weretreated or not with 1 or 5 �M MMP-9 inhibitor for 10 days.

Total protein and cell triglyceride contents were assayed, andthe expression of aP2 and HSL was analyzed by real-timeRT-PCR.

As observed in Table 1, protein and triglyceride contentswere significantly decreased (44 and 52% decrease in proteinand triglyceride concentrations, respectively) as well asmRNA expression of aP2 and HSL (67 and 73% decrease inaP2 and HSL, respectively) in cultures receiving 5 �MMMP-9 inhibitor, indicating an alteration of the differentia-tion process of treated preadipocytes. As for batimastat,MMP-9 inhibitor at 1 �M had no effect on human adipocytedifferentiation (data not shown).

MMP-9 Inhibitor Treatment but Not BatimastatTreatment Decreases MMP-9 Gelatinase Activity Re-leased by Human Preadipocytes. To determine whetherthe two MMP inhibitors could modify the release of thenative preadipocyte-derived MMP-9 and -2, we performedgelatin zymography on medium conditioned overnight bypreadipocytes treated for 10 days with 5 �M batimastat orMMP-9 inhibitor.

As previously reported (Fig. 4), MMP-9 (92 kDa) andMMP-2 (72 kDa) proforms (artificially activated by the gela-tin zymography technique) were the major forms detectablein preadipocyte-conditioned media. Surprisingly, densito-metric analysis of the lytic areas showed that a 10-day treat-ment with MMP-9 inhibitor reduced MMP-9 gelatinase ac-tivity released into the medium by preadipocytes (84%decrease), without affecting that of MMP-2 (pro � activeforms) (Fig. 6). This decrease of MMP-9 gelatinase activity inthe medium, corresponding to the proform, was not accom-panied by an increase of the active-MMP-9 form (still notdetectable), suggesting that this reduction was due to a de-crease in the secretion of the enzyme rather than an increasein the maturation. Real-time RT-PCR analysis performed onmRNAs extracted from the same 10-day-treated preadipo-cytes revealed a decrease of MMP-9 expression (data notshown), confirming the results obtained with gelatin zymog-raphy. Batimastat treatment had no effect on MMP-9 orMMP-2 gelatinase activities released into the medium bytreated human preadipocytes (Fig. 6).

DiscussionWe previously reported that human mature adipocytes and

preadipocytes as well as murine preadipocytes produced andreleased two key enzymes of ECM remodeling, the matrixmetalloproteinases MMP-2 and -9 (Bouloumie et al., 2001).Moreover, we showed that treatment of murine 3T3-F442Apreadipocytes with MMP inhibitors decreased the rate ofadipocyte differentiation. These data were recently con-firmed by others, suggesting that MMP activities were re-quired for adipogenesis in rodents (Croissandeau et al., 2002;Chavey et al., 2003). In the present work, we found thatbatimastat, a broad-spectrum MMP inhibitor, also reducedthe differentiation of human preadipocytes in primary cul-tures, demonstrating for the first time that MMP activitiesare required for adipogenesis in humans too. This effect wasstrictly mediated by its action per se on MMP activities sincebatimastat strongly inhibited the activity of human recom-binant MMP-2 and -9 without affecting their secretion bytreated preadipocytes.

Other protease inhibitors, i.e., HIV-PIs, involved in lipo-

Fig. 3. Effect of the MMP inhibitor batimastat or HIV-PIs on the activityof human recombinant activated MMP-2 and -9. Human recombinantactivated MMP-2 (2 nM) or MMP-9 (4 nM) was preincubated with orwithout increasing concentrations of batimastat (from 0.01 nM to 0.01�M) or HIV-PIs (from 1 nM to 100 �M). The MMP fluorogenic substrateMca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dnp-Ala-Arg was then added, and fluorescence(excitation, 325 nm; emission, 390 nm) was recorded. Data are means �S.E.M. of maximum rate/minute for five separate measurements, ex-pressed as a percentage of the control for three independent experiments.


dystrophy seen in HIV-patients receiving PI therapy (Carr etal., 1998), have been recently linked to alterations of adipo-cyte differentiation in murine cell lines in vitro (Zhang et al.,1999; Lenhard et al., 2000; Mondal et al., 2001). We reportedhere that treatments with HIV-PIs IDV, RTV, SQV, and NFVreduced the differentiation of human preadipocytes in pri-mary cultures. The effectiveness of these products on the

human differentiation process, NFV, SQV�RTV, and IDV,was comparable with that described in other in vitro studies(Lenhard et al., 2000; Jain and Lenhard, 2002).

According to the inhibitory action of both batimastat andHIV-PIs on the human differentiation process, we then in-vestigated the potential relationships between MMPs and,more particularly, MMP-2 and -9 and HIV-PIs. We did notfind any direct effect of HIV-PIs on human recombinantMMP-2 and -9 activities. However, we found that all HIV-PItreatments reduced the release of MMP-9 by treated preadi-pocytes. This effect was specific to the MMP-9 gelatinasesubtype since MMP-2 release did not present the same profileof changes as MMP-9 but depended on which HIV-PI wasused as treatment. The decrease of MMP-9 secretion mightbe due to the reduction of MMP-9 mRNA expression observedwith preadipocytes under HIV-PI treatments. Interestingly,the effectiveness of HIV-PIs (NFV and SQV versus RTV and

Fig. 5. Effect of HIV-PIs on MMP-9 expression by human preadipocytes.Stromal preadipocytes from human subcutaneous AT were cultured in anadipogenic medium with vehicle (control) or in the presence of 50 �MIDV, 10 �M RTV, 10 �M SQV, or 5 �M NFV. After 10 days of culture, thecells were washed and maintained overnight in basal medium with treat-ments. Total RNAs were extracted from cells, and real-time RT-PCRanalysis was performed using specific primers for MMP-9 cDNAs. Theresults were normalized to the levels of 18S rRNA and expressed as apercentage of the control. Data are means � S.E.M. for four to sixindependent experiments. ��, p � 0.01 versus control.

Fig. 4. Effect of HIV-PIs on MMP-2 or MMP-9 gelatinaseactivities released into culture medium by human preadi-pocytes. Stromal preadipocytes from human subcutaneousAT were cultured in an adipogenic medium with vehicle(control) or in the presence of 50 �M IDV, 10 �M RTV, 10�M SQV, or 5 �M NFV. After 10 days of culture, the cellswere washed and maintained overnight in basal mediumwith treatments. Media were then collected and analyzedby gelatin zymography. Densitometric analysis of the lyticareas was performed, and results are expressed as a per-centage of the control. Data are means � S.E.M. for four toseven independent experiments. �, p � 0.05 versus control;��, p � 0.01 versus control.

TABLE 1Effect of MMP-9 inhibitor on the differentiation of humanpreadipocytesStromal preadipocytes from human subcutaneous AT were cultured for 10 days in anadipogenic medium in the presence of 5 �M MMP-9 inhibitor or its vehicle (control).Total protein and cell triglyceride contents, as well as aP2 and HSL mRNA expres-sion, were determined in cells maintained overnight in basal medium with treat-ments. For aP2 and HSL expression, total RNAs were extracted from cells, andreal-time RT-PCR analysis was performed using specific cDNA primers. The resultsobtained were normalized to the levels of 18S rRNA. Data are means � S.E.M.expressed as a percentage of the control for five independent experiments.

MMP-9 Inhibitor(5 �M)

% of Control

Proteins 56.24 � 8.47**Triglycerides normalized with proteins 48.25 � 13.89**aP2 mRNA expression 32.77 � 2.71**HSL mRNA expression 26.64 � 6.35**

** p � 0.01 vs. control.


IDV) on MMP-9 secretion and/or expression was similar tothat observed on the differentiation process.

Although few data are available in the literature concern-ing the potential relationships between MMPs and HIV-PIs,Mondal et al. (2001) have recently reported a strong increasein the release of active MMP-2 and a slight increase in therelease of pro and active MMP-9 by differentiating 3T3-L1cells under IDV and RTV treatment. Paradoxically, the sameauthors described inhibition of 3T3-L1 adipocyte differentia-tion with both HIV-PIs. These results are unexpected sinceother studies have reported an increase of secreted MMP-2and/or -9 in murine preadipocyte models in vitro, includingthe 3T3-L1 cell type, during adipose conversion (Bouloumieet al., 2001; Croissandeau et al., 2002; Chavey et al., 2003).Furthermore, the use of MMP inhibitors in this model hadled to a decrease of the differentiation process (Croissandeauet al., 2002). Culture conditions and experimental protocolsmay explain these discrepancies. Regarding our results, thedifferences may also be explained by the in vitro model used,i.e., murine preadipocytes versus human preadipocytes.

According to the effect of HIV-PIs on the release and ex-pression of MMP-9, an involvement of this MMP subtype inthe batimastat-mediated effect was suspected. Thus, we in-

vestigated the effect of MMP-9 inhibitor treatment on humanpreadipocytes and observed a decrease in the differentiationprocess. However, unlike batimastat, MMP-9 inhibitor notonly decreased the activity of human recombinant MMP-9(data not shown) but also strongly reduced MMP-9 release bytreated preadipocytes. These results associated with thoseobtained with HIV-PI treatments strongly suggest a partic-ular role of MMP-9 subtype in human adipogenesis.

The way in which HIV-PIs affect MMP-9 expression inhuman preadipocytes may reside in a specificity of theMMP-9 gene, i.e., the presence of a nuclear factor-�B (NF-�B)binding site in its promoter region. Indeed, recent publica-tions have reported an inhibition of the 20S and/or 26S pro-teasome in various cellular types using HIV-PIs (Gaedicke etal., 2002; Pajonk et al., 2002; Piccinini et al., 2002). Theseproteasomes are involved in the degradation of the I�B fam-ily inhibitory molecules that sequester NF-�B transcriptionfactors in the cytosol in resting conditions, masking theirnuclear location necessary for gene transcription (Palombellaet al., 1994). It can be speculated, according to some recentworks (Gaedicke et al., 2002; Pati et al., 2002), that HIV-PIsreduced proteasome activities in our model, decreasingNF-�B translocation and MMP-9 gene transcription. Thishypothesis is currently being investigated by our group.

Thus, by reducing MMP-9 secretion, HIV-PIs may alter notonly its direct influence on the degradation of structuralmatrix molecules but also the cleavage of several circulating,cell surface, and pericellular proteins which regulate cellbehavior in numerous ways (Sternlicht and Werb, 2001).Adipocytokines (IL-8, IL-1�, IL-6, or tumor necrosis factor-�)and transforming growth factor-�, whose extracellular leveland/or activity can be regulated by MMPs, may be involved inthe MMP-9-dependent pathway leading to inhibition of hu-man adipocyte differentiation.

In conclusion, our data reveal the specificity of impact ofMMP inhibitors and HIV-PIs on the human fat cell precur-sors, the preadipocytes. They show that the modulation of theextracellular matrix components through the production ofMMPs and, more precisely, MMP-9 might be a key factor inthe regulation of human adipose tissue development. Theyalso suggest that, by affecting the production of MMP-9,HIV-PIs promote human adipose tissue atrophy by prevent-ing replacement of lost adipocytes.

Acknowledgments

We thank Marie-Therese Canal for technical assistance.

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Fig. 6. Effect of batimastat and MMP-9 inhibitor on MMP-2 or MMP-9gelatinase activities released into culture medium by human preadipo-cytes. Stromal preadipocytes from human subcutaneous AT were cul-tured in an adipogenic medium in the presence of 5 �M batimastat, 5 �MMMP-9 inhibitor (MMP-9 Inh), or its vehicle (control). After 10 days ofculture, the cells were washed and maintained overnight in basal me-dium with treatments. Media were then collected and analyzed by gelatinzymography. Densitometric analysis of the lytic area was performed, andresults are expressed as a percentage of the control. Data are means �S.E.M. for five to seven independent experiments. ��, p � 0.01 versuscontrol.


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Address correspondence to: Dr. Virginie Bourlier, Institut National de laSante et de la Recherche Medicale U586, 37 Allees Jules Guesde, 31073Toulouse, France. E-mail: [email protected]


Discussion de la publication 1

Nous avons travaillé sur des cultures primaires de cellules de la FSV du TA humain,

issues de dermolipectomies abdominales. Nos résultats montrent que les cellules de la FSV

cultivées dans un milieu adipogénique et traitées pendant 10 jours avec un inhibiteur des

MMPs à large spectre, le batimastat, ont une adipogenèse altérée. En effet, il a été constaté

que les cellules traitées ont un contenu intracellulaire en TGs diminué par rapport aux cellules

contrôles. Il en est de même pour l’expression en ARNm de deux marqueurs adipocytaires,

aP2 et la LHS. Ces données indiquent que le batimastat limite la différenciation adipocytaire

des cellules de la FSV du TA humain suggérant un rôle majeur des MMPs dans l’adipogenèse

chez l’homme.

En parallèle, nous avons déterminé l’effet de quatre inhibiteurs de la protéase du VIH:

l’indinavir (IDV), le ritonavir (RTV), le saquinavir (SQV) et le nelfinavir (NFV) sur la

différenciation des cellules de la FSV du TA humain. Nous avons observé que les quatre IPs-

VIH utilisés limitent la différenciation adipocytaire des cellules de la FSV en culture

primaire. En accord avec nos résultats, une étude récente indiquent que le RTV bloque

l’adipogenèse des préadipocytes humains de type SGBS (Syndrome de Simpson-Golabi-

Behmel) (92, 123). Il faut préciser que dans notre étude en accord avec des résultats décrits

dans d’autres études in vitro sur des préadipocytes murins que le SQV et le NFV montrent

des effets plus marqués sur la différenciation adipocytaire que l’IDV et le RTV (109, 144).

Ainsi, le syndrome de lipoatrophie associé aux IPs-VIH pourrait donc être relatif aux effets

apoptotiques observés sur les adipocytes matures (12, 64) mais également aux effets négatifs

sur l’adipogenèse.

Les effets anti-différenciant obtenus avec les inhibiteurs de protéases matricielles tels

que le batimastat et les inhibiteurs de la protéase du VIH, nous ont conduit à émettre

l’hypothèse d’un lien entre les MMPs et les IPs-VIH. Afin de déterminer si les IPs-VIH

affectent la différenciation adipocytaire via une voie dépendante des MMPs, nous avons

étudié leur capacité à inhiber directement l’activité des MMP-2 et -9 par une approche in

vitro en utilisant un substrat synthétique des MMPs qui libère un peptide fluorescent après

l’action des MMP-2 et -9 recombinantes en présence des IPs-VIH ou d’inhibiteurs des

MMPs. Aucun effet direct des IPs-VIH sur l’activité des protéines humaines recombinantes

MMP-2 et -9 n’a été observé contrairement au batimastat. Cependant et de manière

surprenante, nous avons observé que les quatre IPs-VIH diminuent spécifiquement l’activité

gélatinase de MMP-9 relarguée dans le milieu de culture alors que l’activité de MMP-2 reste

60

maintenue. Cette diminution de la sécrétion de MMP-9 par les IPs-VIH est associée à une

diminution des taux de transcrits pour MMP-9 suggérant que l’effet anti-adipogénique des

IPs-VIH est associé à l’inhibition spécifique de MMP-9 via un effet transcriptionnel sur son

expression. Le rôle spécifique de MMP-9 dans l’adipogenèse a été confirmé par un inhibiteur

dirigé contre MMP-9 (MMP-9/MMP-13 inhibitor II). Cet inhibiteur diminue la

différenciation des cellules de la FSV du TA humain et réduit l’activité mais également

l’expression de MMP-9. De plus, l’effet d’un anticorps neutralisant dirigé contre la MMP-9

dans la différenciation adipocytaire des cellules de la FSV du TA humain a fait l’objet d’une

étude complémentaire.

B) Influence d’un anticorps neutralisant dirigé contre la MMP-9 sur la

différenciation adipocytaire

Comme pour les précédents traitements décrits dans la publication 1, les cellules de la

FSV ont été cultivées en milieu adipogénique et traitées avec un anticorps neutralisant dirigé

spécifiquement contre la MMP-9 (Chemicon). Comme le montre la figure 14, après 10 jours

de traitement, le contenu intracellulaire en TGs est fortement diminué ainsi que l’expression

en ARNm des marqueurs adipocytaire aP2 et LHS. Ces résultats indiquent donc que l’activité

de MMP-9 est spécifiquement requise pour le bon déroulement de la différenciation

adipocytaire chez l’homme et suggèrent que les effets anti-adipogéniques des IPs-VIH

pourraient être médiés par la chute de l’expression de MMP-9.

Comme nous l’avons évoqué dans le chapitre d’introduction, les mécanismes

d’actions des IPs-VIH sur l’adipogenèse sont encore peu connus. Des travaux ont rapporté

que les IPs-VIH peuvent altérer la maturation et la stabilité de la lamine A/C, perturbant ainsi

la localisation cellulaire de SREBP-1 et l’adipogenèse de préadipocytes murins (29). Il a

également été décrit que les IPs-VIH pouvaient inhiber l’activité du protéasome de certaines

cellules cancéreuses (4, 239) et plus récemment celle des préadipocytes murins de la lignée

3T3-L1 (202). En revanche, l’effet des IPs-VIH sur l’activité du protéasome des

préadipocytes humains reste à déterminer et a fait l’objet de la suite de ce travail. L’activité

du protéasome a de plus été associée à de nombreuses fonctions cellulaires telles que la

progression dans le cycle cellulaire, l’apoptose et la régulation de l’expression de nombreux

gènes notamment en modulant l’activité du facteur de transcription NF-κB (1, 125). Quelques

données parcellaires montrent que l’expression génique de MMP-9, contrairement à celle de

61

TGs aP2 LHS0

25

50

75

100

**

***

ARNm

Mar

queu

rs d

e la

dif

fére

ncia

tion

adip

ocyt

aire

(en

% d

u co

ntrô

le)

Contrôle

Ac

neutralisant MMP-9(0.5 µg/ml)

A B

Figure 14 : Effet d’un anticorps neutralisant pour la MMP-9 sur la différenciation adipocytaire

des cellules de la FSV du tissu adipeux humainLes cellules de la FSV sont cultivées en conditions adipogéniques

et traitées avec un anticorps neutralisant MMP-9 ou un IgG

contrôle pendant 10 jours. (A) Une photographie représentative de 3 expériences indépendantes est présentée. (B) Le contenu intracellulaire en TGs

normalisé

à

la quantité

d’ADN ainsi l’expression en ARNm

d’aP2 et de la LHS ont été

évalués. Les résultats sont exprimés en % du contrôle. * P<0.01, **P< 0.001 vs contrôle

MMP-2, peut-être régulée par NF-κB. En effet, au niveau du promoteur de MMP-9, un site de

liaison pour ce facteur de transcription a été décrit (236, 256). Ainsi, en regroupant

l’ensemble de ces données, nous avons émis l’hypothèse que les IPs-VIH diminuent l’activité

protéasomique des préadipocytes humains empêchant ainsi la dégradation d’IκB, l’inhibiteur

de NF-κB, qui interagit avec NF-κB et le séquestre dans le cytoplasme. Par conséquent, NF-

κB ne peut pas être transféré dans le noyau et entraîner la transcription de gènes notamment

celui de MMP-9. Pour plus de clarté, cette hypothèse est schématisée dans la figure 15.

C) Détermination des mécanismes impliqués dans la chute de l’expression de

MMP-9 par les inhibiteurs de la protéase du VIH

Publication 2 : Inhibition of human preadipocyte proteosomal activity, by HIV protease

inhibitor or specific inhibitor lacatacystin, leads to a defect in adipogenesis which involves

matrix metalloproteinase-9. S. De Barros, A. Zakaroff-Girard, M. Lafontan, J. Galitzky and

V. Bourlier J Pharmacol Exp Ther, 320:291-299, 2007

62

MMP-9NF-κB

NF-κBIκB

Noyau

Cytoplasme

PROTEASOME

IPs-VIH

Figure 15 : Hypothèse du mode d’action des IPs-VIH

sur l’expression génique de MMP-9A l’étal basal, NF-κB est séquestré

dans le cytoplasme par son inhibiteur IκB. La translocation nucléaire de Nf-kB

permettant l’activation des gènes cibles de ce facteur, dépend de la

dégradation de son inhibiteur IκB par le protéasome. Les IPs-VIH

ont été

décrits comme des inhibiteurs de l’activité

du protéasome

de certaines cellules cancéreuses et préadipocytes

murins. Ainsi, une inhibition de l’activité

du protéasome

par les IPs-VIH

pourrait empêcher la

dégradation d’IκB et la translocation nucléaire de NF-κB diminuant ainsi la transcription de ces gènes cibles et notamment MMP-9.

Inhibition of Human Preadipocyte Proteasomal Activity byHIV Protease Inhibitors or Specific Inhibitor LactacystinLeads to a Defect in Adipogenesis, Which Involves MatrixMetalloproteinase-9

Sandra De Barros, Alexia Zakaroff-Girard, Max Lafontan, Jean Galitzky,and Virginie BourlierUnite de Recherche sur les Obesites, Institut National de la Sante et de la Recherche Medical Unite 586, Institut LouisBugnard, Hopital Rangueil, Universite Paul Sabatier, Toulouse, France

Received August 2, 2006; accepted October 10, 2006

ABSTRACTIn a previous publication, we reported that human immunode-ficiency virus (HIV) protease inhibitors (PIs) inhibited the differ-entiation of human preadipocytes in primary culture, reducingthe expression and secretion of matrix metalloproteinase 9(MMP-9). The present work was performed to clarify this mech-anism. Interestingly, HIV-PIs have been reported to be inhibi-tors of the proteasome complex, which is known to regulatenuclear factor (NF)-�B activation and transcription of its targetgenes, among them MMP-9. We thus investigated the potentialinvolvement of the proteasome in the antiadipogenic effects ofHIV-PIs. The effect of four HIV-PIs was tested on preadipocyteproteasomal activity, and chronic treatment with the specificproteasome inhibitor lactacystin was performed to evaluatealterations of adipogenesis and MMP-9 expression/secretion.Finally, modifications of the NF-�B pathway induced by eitherHIV-PIs or lactacystin were studied. We demonstrated that

preadipocyte proteasomal activity was decreased by severalHIV-PIs and that chronic treatment with lactacystin mimickedthe effects of HIV-PIs by reducing adipogenesis and MMP-9expression/secretion. Furthermore, we observed an intracellu-lar accumulation of the NF-�B inhibitor, I�B�, with chronictreatment with HIV-PIs or lactacystin as well as a decrease inMMP-9 expression induced by acute tumor necrosis factor-�stimulation. These results indicate that inhibition of the protea-some by specific (lactacystin) or nonspecific (HIV-PIs) inhibitorsleads to a reduction of human adipogenesis, and they thereforeimplicate deregulation of the NF-�B pathway and the relateddecrease of the key adipogenic factor, MMP-9. This study addssignificantly to recent reports that have linked HIV-PI-relatedlipodystrophic syndrome with altered proteasome function, en-doplasmic reticulum stress, and metabolic disorders.

Proteasomes are highly conserved multimeric peptidasespresent in all eukaryotic cells. Whereas various forms ofproteasomes exist, the 20S proteasome (multicatalytic core ofall proteasomes) and the 26S proteasome (20S core cappedwith two 19S regulatory units) are major proteasomes. Pro-teasomes were initially thought to be just recyclers of dam-aged or misfolded proteins, but over the last decade theactivity of this enzymatic complex has been found to be of

critical importance for many cellular functions. Cell-cycleprogression, oncogenesis, apoptosis, regulation of gene ex-pression, and inflammation or immune surveillance are allphysiological functions regulated by the proteasome pathway(Kisselev and Goldberg, 2001). Among the substrates of theproteasome, cyclins (e.g., cyclin B1), cyclin-dependent kinaseinhibitors (e.g., p21 and p27), tumor suppressors (e.g., p53),and inhibitors (I�B) or precursors (e.g., p105) of the tran-scription factor NF-�B are well established (Kisselev andGoldberg, 2001; Adams, 2004). Accordingly, the proteasomecomplex has emerged as an attractive target for cancer ther-apy, and numerous proteasome inhibitors have been devel-oped (Adams, 2004; Voorhees and Orlowski, 2006).

This work was supported by Grants 01 128 and 02 197 from the AgenceNationale de Recherche sur le SIDA et les hepatites virales.

Article, publication date, and citation information can be found athttp://jpet.aspetjournals.org.

doi:10.1124/jpet.106.111849.

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0022-3565/07/3201-291–299$20.00THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS Vol. 320, No. 1Copyright © 2007 by The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics 111849/3162833JPET 320:291–299, 2007 Printed in U.S.A.

291

Recently, human immunodeficiency virus (HIV) proteaseinhibitors (PIs), central components of highly active antiret-roviral therapy, have been reported by some authors to di-rectly inhibit the activities of murine and human 20S and/or26S proteasomes in purified fractions or cellular extracts(Andre et al., 1998; Gaedicke et al., 2002; Pajonk et al., 2002;Piccinini et al., 2002). Indeed, several cleavage sites used bythe HIV protease, which were once thought to be unique anddistinct from those of mammalian proteases (predicting in-hibitor selectivity), were found to be similar to those recog-nized by the 20S proteasome (Schmidtke et al., 1999). Al-though HIV-PIs have been successfully used in clinicaltherapy of HIV infection, they were also rapidly associatedwith the emergence of a lipodystrophic syndrome observed inpatients treated with highly active antiretroviral therapy,which includes dyslipidemia, insulin resistance, central adi-posity, and peripheral lipoatrophy. It is now clear that themechanism associated with PI-induced metabolic abnormal-ities is multifactorial (for reviews, see Hui, 2003; Rudich etal., 2005) but whether the action of HIV-PIs on proteasomalactivity is related to their side effects has been poorly inves-tigated to date.

We previously reported, in accordance with in vivo studiesperformed on adipose tissue biopsies from HIV-infected lipo-dystrophic patients (Bastard et al., 2002; Lloreta et al., 2002),that PIs reduced the differentiation of human preadipocytes(i.e., adipocyte precursors) in primary culture isolated fromsubcutaneous abdominal adipose tissue (AT) (Bourlier et al.,2005). This effect was attributed to an indirect action ofHIV-PIs on the expression and secretion of the matrix met-alloproteinase-9 (MMP-9), an enzyme implicated in extracel-lular matrix remodeling and significantly involved in thehuman adipogenic process in vitro (Bourlier et al., 2005).Because the MMP-9 promoter contains an NF-�B site (Satoand Seiki, 1993; St-Pierre et al., 2004) and because protea-somal activity is involved in the activation of NF-�B path-way, we investigated the potential role of the proteasome inthe antiadipogenic effect of HIV-PIs. We demonstrate herethat HIV-PIs, particularly saquinavir (SQV) and nelfinavir(NFV), were direct inhibitors of the human preadipocyte 20Sand 26S proteasomes. We found that chronic lactacystin (aspecific proteasome inhibitor) treatment mimicked the ef-fects of HIV-PIs by decreasing the differentiation process andthe expression and secretion of MMP-9. Chronic treatmentwith either HIV-PIs (SQV or NFV) or lactacystin led to theaccumulation of the I�B� protein, the inhibitor of the tran-scription factor NF-�B and a substrate of the proteasome.Finally, acute treatment with TNF-� (activator of NF-�B)induced a potent increase in MMP-9 expression, which wassignificantly reduced by SQV, lactacystin, or (E)-3-[(4-meth-ylphenyl)-sulfonyl]-2-propenenitrile (Bay 11-7082) (inhibitorof NF-�B activation) cotreatments. Overall, our data indicatethat HIV-PIs, by affecting proteasomal activity, alter theNF-�B pathway and implicate the reduction of MMP-9 activ-ity in their antiadipogenic effect.

Materials and MethodsCell Culture and Treatment. Chemicals were from Sigma-

Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France). Cell culture reagentswere either from Life Technologies (Cergy Pontoise, France), RocheDiagnostics (Meylan, France), or Cambrex Biosciences (Verviers,Belgium).

Human subcutaneous abdominal white AT was obtained frommoderately overweight women undergoing plastic surgery (mean age46 � 2 years and mean body mass index 27.5 � 0.7 kg/m2). Theisolation of human AT-derived stromal cells and the culture of stro-mal preadipocytes differentiated into adipocytes were performed asdescribed previously (Bouloumie et al., 2001). In brief, sterile AT wascut into small pieces and digested under agitation with collagenase(2 mg/ml) (Serva; Coger, Paris, France) for �1 h at 37°C. Aftercentrifugation, washing, and filtration steps, the stromal cells weresuspended in Dulbecco’s modified Eagle’s medium F-12 supple-mented with 10% fetal bovine serum and plated at 60,000 cells/cm2.After 24 h, the medium was replaced by a medium consisting ofDulbecco’s modified Eagle’s medium F-12 supplemented with 33 �Mbiotin, 17 �M pantothenate, and 50 �g/ml gentamicin (basal me-dium) in the presence of 66 nM insulin, 1 nM triiodothyronine, 100nM cortisol, and 10 �g/ml human transferrin (adipogenic medium)and 1 �g/ml ciglitazone for the first 3 days. After the 3-day primingperiod, the cells were used for experiments or cultured in the adipo-genic medium supplemented with 1) the proteasome inhibitor lacta-cystin or 2) HIV-PIs IDV (kindly provided by Merck Laboratories,Rahway, NJ) or SQV (kindly provided by Roche, Welwyn GardenCity, UK), RTV (kindly provided by Abbott Laboratories, Chicago,IL), or NFV (kindly provided by Roche Diagnostics, Mannheim,France) for 10 days. Lactacystin and HIV-PIs were dissolved in puredimethyl sulfoxide. Control cells were treated using an appropriateconcentration of vehicle (�0.25%) after verification that dimethylsulfoxide was without effect on the various parameters analyzed (i.e.,lipogenic index, adipogenic gene, or MMP secretion). Medium wasreplaced every 2 days. Before some experiments, cells were placedovernight in basal medium supplemented with the various treat-ments.

The medium was then collected and used in zymography analysis.Cellular triglyceride and DNA contents were determined using kitsfrom Sigma-Aldrich and Molecular Probes (PicoGreen; Interchim,Montlucon, France), respectively, according to the manufacturer’sinstructions. DNA content was used to normalize data (triglyceridecontent and MMP secretion) and to evaluate any cytotoxic effect oftreatments.

Gelatin Zymography. Proteins with gelatinolytic activity (in-cluding the gelatinase A “MMP-2” and the gelatinase B “MMP-9”)were identified by electrophoresis in the presence of SDS in 8%polyacrylamide gels containing 1 mg/ml gelatin. In brief, culturemedium aliquots (20 �l) were directly loaded onto gels, and, afterelectrophoresis, proteins were renatured by exchanging SDS with2.5% Triton X-100 (20-min incubation repeated twice). The gels werethen incubated for 16 h at 37°C in 50 mM Tris-HCl (pH 8.8), 5 mMCaCl2, and 0.02% NaN3 and stained with Coomassie Blue. Thepresence of gelatinolytic activity in the culture medium aliquots wasvisualized as clear areas on an otherwise blue gel. Migration ofproteins was compared with that of prestained molecular weightmarkers. The gels were scanned by an imaging densitometer andquantified using the NIH Image program (developed at the NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD).

Fluorimetric Proteasome Activity Assay. Chymotrypsin-likeproteasome activity was performed on 96-well plates using the spe-cific fluorogenic substrate N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr7-amido-4-methylcoumarin (Sigma). In brief, cells contained in one well werescraped in 35 �l of lysis buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 7.5),0.1% Nonidet P-40, 10% glycerol, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, and 10mM KCl. Protein concentration was determined using a Bio-Rad kit(Bio-Rad, Marnes-la Coquette, France), and 10 �g were incubatedalone or with increasing concentrations of lactacystin (0.01–10 �M)or HIV-PIs (1, 10, and 50 �M) for 30 min at 37°C in 20 mM Tris-HCl(pH 8), 0.5 mM EDTA, and 0.035% SDS to assess 20S proteasomeactivity or in 20 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM ATP, and 2 mM MgCl2to assess 26S proteasome activity, according to the method of Rock etal. (1994). Then, fluorogenic substrate was added to a final concen-tration of 50 �M, and fluorescence was monitored at �excitation 360

292 De Barros et al.

nm/�emission 460 nm every 5 min over a 2-h period using a FluoroscanAscent FL (Labsystems, Cergy Pontoise, France). Chymotrypsin-likeproteasome activities of 20S and 26S were evaluated by the maximalrate (relative fluorescence units per minute) on seven separate mea-surements in each well.

Western Blot. For Western blot analysis of I�B� and I�B�, cellscontained in two wells were scraped in 70 �l of lysis buffer containing20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2,1 mM Na3VO4, 1% Nonidet P-40, 10% glycerol, and a mix of proteaseinhibitors (Complete; Roche Diagnostics). The protein concentrationwas determined, and 35 to 50 �g of protein were loaded and sepa-rated by electrophoresis on a 12% SDS-polyacrylamide gel underdenaturing conditions. After transfer to polyvinylidene difluoridemembranes (Immobilon; Millipore, Bedford, MA) and Ponceau stain-ing to verify equal loading of the lanes, membranes were blocked for1 h with TBST [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween20] containing 5% nonfat milk, following by incubation overnight at4°C with primary antibody against I�B� (ab7545) or I�B� (ab7547)(Abcam, Cambridge, UK) at a dilution of 1:1000 in TBST containing1% nonfat milk. Then, membranes were washed with TBST andincubated for 1 h with a peroxidase-conjugated secondary antibody(Pierce Chemical, Brebieres, France) at a dilution of 1:50,000 inTBST containing 1% nonfat milk and washed again. The immuno-complexes were detected using a chemiluminescence reagent kit(SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate; PierceChemical, Rockford, IL). Human Daudi cell lysate (Imgenex, SanDiego, CA) was used as positive control.

For Western blot analysis of NF-�B p65, cells contained in 12 wellswere washed twice with cold phosphate-buffered saline and preparedusing NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents kit(Pierce) according to the manufacturer’s instructions. Protein con-centrations in nuclear and cytoplasmic extracts were determined asdescribed above: 20 to 45 �g of proteins were loaded and separated byelectrophoresis on a 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresisunder denaturing conditions. After transfer to polyvinylidene diflu-oride membranes and Ponceau staining to verify equal loading of thelanes, a WesternBreeze Chemiluminescent Western Blot Immuno-detection Kit (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) was used for sig-nal detection. Briefly and according to the manufacturer’s instruc-tions, membranes were blocked, washed, and then incubated with aprimary antibody against NF-�B p65 N-terminal (Santa Cruz Bio-technology, Le Perray-en-Yvelines, France) at a dilution of 1:1000.After washing, membranes were incubated with an alkaline phos-phatase-conjugated secondary antibody provided with the kit, andimmunocomplexes were detected after the addition of chemilumines-cent substrate. Human nuclear extract from A-431 cells (Santa CruzBiotechnology) was used as positive control.

The autoradiographs were scanned by an imaging densitometerand quantified using the NIH Image program. To normalize results,the densitometric value of each band of interest (i.e., I�B�, I�B�, andNF-�B p65) was reported to the densitometric value of total loadedproteins in the corresponding lane, obtained after scanning andquantification of the Ponceau staining (NIH Image program).

Real-Time RT-PCR. Changes in mRNA levels from specificgenes were quantified by real-time RT-PCR. Total RNAs were ex-tracted using a QIAGEN RNeasy Mini Kit according to the manu-facturer’s instructions, and RNA concentrations were determinedusing a Molecular Probes fluorimetric assay (RiboGreen; Interchim).RNA (0.5 �g) was reverse-transcribed using the Superscript II sys-tem (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. Re-verse transcription was also performed without Thermoscript en-zyme on RNA samples to check for any genomic DNA contamination.PCR primers were designed using Primer Express software accord-ing to the recommendations of Applied Biosystems (Courtaboeuf,France). The forward and reverse primer sequences for fatty acidbinding protein (aP2), hormone-sensitive lipase (HSL), MMP-9,MMP-2, and I�B� were as follows (5�–3�): aP2, GCATGGCCAAAC-CTAACATGA (forward) and CCTGGCCCAGTATGAAGGAAA (re-

verse); HSL, GTGCAAAGACGGAGGACCACTCCA (forward) andGACGTCTCGGAGTTTCCCCTCAG; MMP-9, CCCTGGAGACCTG-AGAACCA (forward) and CCACCCGAGTGTAACCATAGC (re-verse); MMP-2 CACCCATTTACACCTACACCAAGA (forward) andAGAGCTCCTGAATGCCCTTGA (reverse), and I�B� TACGACGAC-ATTGTGGTTCACA (forward) and GGGTCGTCAGGAAGAGGTTTT(reverse).

Each amplification reaction was performed with 15 ng of cDNAsample in duplicate in 96-well optical reaction plates with a Gene-Amp 7500 sequence detection system. The PCR mixture containedforward and reverse primer mix (final concentration: 900 nM forHSL, MMP-9, or MMP-2 and 300 nM for aP2 or I�B�) and SYBRGreen PCR Master Mix. For ribosomal RNA control (18S rRNA), amixture containing primers and fluorogenic probe mix, TaqMan Uni-versal PCR Master Mix (Applied Biosystems) was used. All reactionswere performed under the same conditions: 50°C for 2 min and 95°Cfor 10 min, followed by 40 cycles of 95°C for 15 s and 60°C for 1 min.Results were analyzed with the GeneAmp 7500 software, and allvalues were normalized to the levels of 18S rRNA. An interindividualvariability of 10.46% within the control values was observed for allPCR data (aP2, HSL, MMP-2, MMP-9, and I�B�).

Statistical Analysis. Values are expressed as means � S.E.M.from n independent experiments. Statistical analysis was performedusing Student’s t test for paired data or one-way analysis of variance(ANOVA) coupled with post hoc Dunnett’s multiple-comparison test(GraphPad Prism 4; GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Val-ues of p � 0.05 were considered statistically significant.

ResultsHIV-PIs or Lactacystin Reduced Proteasome Activ-

ity from Human Preadipocyte Homogenates. To vali-date our hypothesis, we first investigated the effect of HIV-PIs on proteasome activity of human preadipocytes. After the3-day priming period, undifferentiated preadipocytes werescraped into specific lysis buffer, and cellular homogenateswere obtained. Then, homogenates were pretreated (30 min,37°C) with increasing concentrations of the proteasome in-hibitor lactacystin (from 0.01 to 10 �M) or HIV-PIs (1, 10,and 50 �M), and 20S and 26S chymotrypsin-like proteasomeactivities from these lysates were determined by in vitrofluorescence assays with the specific fluorogenic substrateN-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr7-amido-4-methylcoumarin.

As expected, lactacystin reduced, in a concentration-depen-dent manner, the fluorescence emission induced by the cleav-age of the substrate by the 20S and 26S proteasome (controlmaximal rate: 1.62 � 0.84 and 1.13 � 0.21 RFU/min, respec-tively) (Fig. 1, top and bottom). Similar results were obtainedwith another known proteasome inhibitor, carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal (MG-132) (data not shown). Asshown on the top of Fig. 1, HIV-PIs, except IDV, decreasedchymotrypsin-like activity of the 20S proteasome in a con-centration-dependent manner with the following rank of ef-ficiency: SQV � NFV � RTV. Higher concentrations of HIV-PIs were necessary to reduce the 26S chymotrypsin-likeproteasome activity in the cellular extracts (Fig. 1, bottom).

Chronic Lactacystin Treatment Decreased the Dif-ferentiation of Human Preadipocytes. To determinewhether the inhibition of the proteasome per se could affectthe human adipocyte differentiation process, primary cul-tures of human preadipocytes were placed in an adipogenicmedium in the presence of 0.1 or 0.5 �M lactacystin for 10days. Cellular triglyceride was quantified, and the expres-sion of two adipocyte differentiation markers, aP2 and HSL,was analyzed by real-time RT-PCR.

Proteasome Inhibition Reduces Human Adipogenesis 293

As clearly shown in Fig. 2A, 0.5 �M lactacystin led to astrong inhibition of the adipocyte differentiation process be-cause treated cells exhibited less cytoplasmic accumulationof lipid droplets. Quantification of cellular triglyceride (TG)content, used as a lipogenic index, demonstrated that lacta-cystin treatment significantly decreased adipogenesis (36%decrease in triglyceride concentration, i.e., 26.58 � 8.28 mg ofTGs/mg of DNA for controls to 13.68 � 3.12 mg of TGs/mg ofDNA for lactacystin) (Fig. 2B). Moreover, the analysis of aP2and HSL mRNA levels showed that lactacystin led to a re-duction of the expression of both adipocyte differentiationmarkers (41 and 60% decreases in aP2 and HSL mRNAexpression, respectively) (Fig. 2B). It has to be noticed thatlactacystin at 0.1 �M had no effect on the differentiationprocess and that both 0.1 and 0.5 �M lactacystin were free ofany cytotoxic effects (data not shown). However, the use ofconcentrations higher than 1 �M was associated with celldeath within several days (data not shown).

Chronic Lactacystin Treatment of Human Preadipo-cytes Reduced MMP-9 Expression and MMP-9 Gelati-nase Activity Released into the Medium. MMP-9 activityhas been shown 1) to be involved in the human adipocytedifferentiation process (Bouloumie et al., 2001; Bourlier etal., 2005) and 2) to be reduced in human preadipocytestreated by HIV-PIs (Bourlier et al., 2005). To evaluatewhether the inhibition of the proteasome per se could affectMMP-9 secretion and expression, overnight-conditioned me-dium from preadipocytes treated with 0.5 �M lactacystin for10 days was collected to be analyzed by gelatin zymography,and real-time RT-PCR analysis was performed on mRNAs.

As observed in Fig. 3A, MMP-9 (92 kDa) and MMP-2 (72kDa) proforms (artificially activated by the gelatin zymogra-phy technique) were the major forms detectable in preadipo-cyte-conditioned media. The active form was visible forMMP-2 (62 kDa) but not for MMP-9 (82 kDa). Densitometricanalysis of the lytic areas showed that lactacystin treatmentreduced the MMP-9 gelatinase activity (proform) released bytreated preadipocytes (53.2 � 2.7% of the control value, n �4, p � 0.001). Interestingly, this decrease of MMP-9 gelati-nase activity in the medium, corresponding to the proform,was not accompanied by an increase of the active-MMP-9form (still not detectable), suggesting that this reduction wasdue to a decrease in the secretion of the enzyme rather thanto an increase in the maturation. In contrast to MMP-9, theMMP-2 gelatinase activity (proform � active forms) was notaffected by lactacystin treatment (112.2 � 11.8% of the con-trol value, n � 4).

The analysis of MMP mRNA expression (Fig. 3B) wasconsistent with the data obtained by gelatin zymographybecause lactacystin treatment led to a statistically signifi-cant reduction of MMP-9 expression (45% decrease), whereasno change was observed for MMP-2 expression. Thus, theobserved decrease of MMP-9 gelatinase activity released intothe medium under lactacystin treatment was probably due toa reduction of MMP-9 expression.

Chronic Treatment with HIV-PIs or Lactacystin HadNo Effect on I�B� but Increased I�B� Protein Level inHuman Preadipocytes. To identify the link between theinhibition of the proteasome activity and the decrease inMMP-9 expression, we studied the effect of chronic lactacys-tin or HIV-PI treatment on I�B� and I�B� proteins, knownsubstrates of the proteasome. The degradation of these twowell-known I�B family members leads to NF-�B transloca-tion to the nucleus (Whiteside and Israel, 1997) and tran-scription of NF-�B target genes, among them MMP-9 (St-Pierre et al., 2004). Human preadipocytes were placed in anadipogenic medium and treated for 10 days with lactacystinor various HIV-PIs at concentrations for which no cytotoxiceffect was detected and the inhibition of the differentiationwas maximal according to our previous publication (Bourlieret al., 2005). Cellular extracts were obtained and analyzed bythe Western blot technique.

As shown in Fig. 4A, none of the treatments led to theaccumulation of I�B� in human preadipocytes. In contrast,the quantification of the I�B� band clearly indicated thatSQV, NFV, and lactacystin treatment increased the totalcellular level of I�B� protein (83, 36, and 75% increases,respectively) in human preadipocytes (Fig. 4B). This effectwas not observed with the two other HIV-PIs, IDV and RTV.

Fig. 1. Effect of HIV-PIs on chymotrypsin-like proteasome activity inhuman preadipocyte homogenates. Stromal preadipocytes were isolatedfrom human subcutaneous AT. After the 3-day priming period, cells werewashed and maintained overnight in basal medium before being scrappedin specific lysis buffer. Ten micrograms of protein obtained from cellularhomogenates were then preincubated (30 min, 37°C) with or withoutincreasing concentrations of lactacystin (0.01 and 10 �M) or HIV-PIs (1,10, and 50 �M). The proteasome fluorogenic substrate N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr7-amido-4-methylcoumarin was added and fluorescence(�excitation 360 nm/�emission 460 nm) was recorded every 5 min over a 2-hperiod. Data are means � S.E.M. of maximal rate (relative fluorescenceunits per minute) for seven separate measurements, expressed as apercentage of the control for four to five independent experiments. �, p �0.05 versus control; ��, p � 0.01 versus control.


It has to be noticed that homogeneity of the controls (i.e.,IDV, RTV, NFV, SQV, and lactacystin controls) was checkedusing one-way ANOVA (not significant, p � 0.83). The con-trol raw value obtained for the densitometric analysis of I�B�band normalized to total loaded proteins per lane was0.095 � 0.019 (arbitrary units).

To verify that the increase in I�B� protein level was notdue to an effect of treatments on I�B� expression, RT-PCRanalysis was performed on mRNAs of preadipocytes treatedfor 10 days with NFV (5 �M), SQV (10 �M), or lactacystin(0.5 �M), when accumulation of the protein was observed. Asshown in Fig. 4C, none of the treatments significantly af-fected I�B� expression, suggesting that the accumulation ofthe protein in the cytosol was due mainly to a decrease of itsdegradation, i.e., a decrease in proteasomal activity. How-ever, a contribution of I�B� mRNA expression with NFV cannot be excluded, whereas no statistical significance wasfound compared with control values (p � 0.07, n � 6), accord-ing to the particular variability of the data in this condition.As for the Western blot experiment, homogeneity of the con-trols (i.e., NFV, SQV, and lactacystin controls) was checkedusing one-way ANOVA (not significant, p � 0.90). The con-trol raw value obtained for the relative amount of I�B�mRNA normalized to 18S rRNA (i.e., 2�Ct 104) was 1.42 �0.25 (arbitrary units).

Chronic Treatment with SQV or Lactacystin Did NotLead to NF-�B p65 Accumulation in the Cytoplasm ofHuman Preadipocytes. According to the very similar pro-file in I�B� protein increase between SQV and lactacystinchronic treatment, we measured the NF-�B p65 activity in10-day-treated preadipocytes because this subunit containsthe transactivation domain necessary for gene transcription(Hayden and Ghosh, 2004) and has been recently implicated

Fig. 3. Effect of chronic lactacystin treatment on MMP-9 and -2 gelati-nase activities released into the medium and on their expression byhuman preadipocytes. Stromal preadipocytes from human subcutaneousAT were cultured in an adipogenic medium with 0.5 �M lactacystin or itsvehicle (control). After 10 days of culture, the cells were washed andmaintained overnight in basal medium with or without treatment. A,culture media were then collected and analyzed by gelatin zymography.The presented gel is representative of four independent experiments.Quantification of the lytic areas was performed with the NIH Imageprogram. B, total RNAs were extracted from cells and real-time RT-PCRanalysis was performed using specific primers for MMP-9 and MMP-2cDNAs. The results were normalized to the levels of 18S rRNA. Thepresented data are means � S.E.M. expressed as a percentage of thecontrol for five independent experiments. ��, p � 0.01 versus control.

Fig. 2. Effect of chronic lactacystin treatment on thedifferentiation of human preadipocytes. Stromal prea-dipocytes from human subcutaneous AT were culturedin an adipogenic medium in the presence of 0.5 �Mlactacystin or its vehicle (control). A, light microscopyanalysis was performed after 10 days of treatment.Photomicrographs (100) are representative of five in-dependent experiments. B, cellular TGs, as well as aP2and HSL mRNA expression, were determined in cellsmaintained overnight in basal medium with treatment.Cellular triglycerides were normalized to DNA content.For aP2 and HSL expression, total RNAs were ex-tracted from cells and reverse-transcribed, and real-time RT-PCR analysis was performed using specificcDNA primers. The results obtained were normalized tothe levels of 18S rRNA. The presented data aremeans � S.E.M. expressed as a percentage of the con-trol for five independent experiments. �, p � 0.05 ver-sus control; §, p � 0.001 versus control.


in adipocyte differentiation of the 3T3-L1 cell line (Berg etal., 2004). Unfortunately, we were unable to detect NF-�Bp65 activity in any of our conditions (control or treated prea-dipocytes) using the TransAM NF-�B chemiluminescenttranscription factor assay kit (Active Motif Europe, Rixen-sart, Belgium), following the manufacturer’s instructions.Assays were performed with either cellular or nuclear prea-dipocyte extracts, but signal corresponding to free activeNF-�B p65 was always at the blank level (even with thehighest protein concentration required), whereas signal fromthe positive control (Jurkat nuclear extract) of the kit wasdetected. One possible explanation was a very low presence ofactive NF-�B p65 under basal conditions.

We decided to also perform NF-�B p65 Western blot anal-ysis of cytoplasmic and nuclear extracts from 10-day-treatedpreadipocytes to investigate whether NF-�B p65 transloca-tion was affected by I�B� protein accumulation induced bySQV or lactacystin. As observed in Fig. 5A (left panel), NF-�Bp65 subunit was undetectable (n � 3) or not analyzable (n �2) in nuclear extracts from control or treated human preadi-pocytes. This observation was in agreement with the nega-tive results obtained with the TransAM assay kit. However,NF-�B p65 was clearly present in the cytoplasmic extracts,but quantification of the corresponding bands did not revealany significant difference in protein level between control

versus treated preadipocytes (Fig. 5B). To validate the cyto-plasmic to nuclear translocation of the NF-�B p65 assay,control experiments were performed using human preadipo-cytes stimulated with TNF-� (25 ng/ml) for 1 h. Indeed,TNF-� is a standard activator of the NF-�B pathway in avariety of cells (Viatour et al., 2005). As observed in Fig. 5A(right panel), cytoplasmic NF-�B p65 was decreased withTNF-� compared with controls (55% decrease, n � 3, p �0.05). Furthermore and although no NF-�B p65 was detect-able in the nucleus, a new band of �35 kDa was clearlyvisible under TNF-� stimulation. This band has already beenidentified as a product of nuclear proteolysis of NF-�B p65(N-terminal fragment), termed NF-�B p35, and observed inthe physiological turnover of the transcription factor (Cress-man and Taub, 1994). This result indicates that NF-�B p65has been translocated to the nucleus, validating our tech-nique.

Acute Treatment with SQV, Lactacystin, or BAY 11-7082 Reduced TNF-�-Induced MMP-9 Expression inHuman Preadipocytes. Because one of the possible limita-tions of our experiments to clearly identify NF-�B was thatcells were under basal conditions, we decided to investigatethe acute effect of SQV and lactacystin on MMP-9 expressioninduced by TNF-�. After the 3-day priming period, humanpreadipocytes were placed in an adipogenic medium and

Fig. 4. Effect of chronic HIV-PIs or lactacystin treat-ment on I�B� and I�B� protein level in human preadi-pocytes. Stromal preadipocytes from human subcutane-ous AT were cultured in an adipogenic medium withvehicle (control) or in the presence of lactacystin(Lacta.; 0.5 �M) or HIV-PIs: IDV (50 �M), RTV (10 �M),SQV (10 �M), or NFV (5 �M). After 10 days of culture,the cells were washed and maintained overnight inbasal medium with treatment before being scrapped ina specific lysis buffer. Thirty-five to 50 �g of total pro-teins obtained after lysis were then analyzed by West-ern blot using a specific antibody. A, representativeautoradiographs of the I�B� and the I�B� blots fromfour to seven independent experiments are shown. Sta-tistically significant results are expressed as ratio ofthe control values. NS, nonsignificant. �, p � 0.05 ver-sus control. B, quantification of the correspondingbands was performed with the NIH Image program andnormalized to the density of the total loaded proteinsper lane, obtained from the analysis of the Ponceaustaining. The control value of the densitometric ratiowas 0.095 � 0.019. The presented data are means �S.E.M. expressed as a percentage of the control. �, p �0.05 versus control. C, total RNAs were extracted fromcells and reverse-transcribed, and real-time RT-PCRanalysis was performed using specific primers for I�B�cDNAs. The results were normalized to the levels of 18SrRNA. Control value of the 2�Ct 104 was 1.42 � 0.25.The presented data are means � S.E.M. expressed as apercentage of the control for five to six independentexperiments.


treated for 24 h with TNF-� (25 ng/ml) alone or in cotreat-ment with SQV (10 �M), lactacystin (0.5 �M), or BAY 11-7082 (1 �M), an inhibitor of I�B phosphorylation, which isinvolved in the NF-�B activation (Pierce et al., 1997). MMP-9expression was analyzed by real-time RT-PCR.

As shown in Fig. 6, TNF-� treatment strongly enhancedMMP-9 expression (10 times) in human preadipocytes. Asexpected, cotreatment with BAY 11-7082, the inhibitor of theNF-�B pathway, reduced the MMP-9 expression induced byTNF-� (27% decrease). Similar results were obtained withSQV or lactacystin cotreatment, because MMP-9 expressionwas decreased by 48 and 22%, respectively, implicatingNF-�B as the link between proteasome activity and MMP-9expression in our experiments. It should be noted that simi-lar data were obtained when SQV was replaced by NFV (5�M) or when stimulation was performed with interleukin-1�(20 ng/ml) in place of TNF-� (data not shown). Comparedwith TNF-�, which has been shown to involve preferentiallyI�B�, interleukin-1� is known to induce both I�B� and I�B�degradation when activating the NF-�B pathway (Thompsonet al., 1995).

DiscussionWe previously reported that HIV-PIs reduced the differen-

tiation of human preadipocytes in primary culture. This ef-fect was attributed to the HIV-PI-induced decrease of MMP-9expression and secretion since we showed that blocking ofMMP-9 activity by pharmacological agents led to the inhibi-tion of human adipogenesis (Bourlier et al., 2005). In thepresent work, we report that HIV-PIs decreased the activityof the two major proteasome complexes, the 20S and the 26Sproteasomes, in human preadipocytes. Interestingly, weshowed that lactacystin, a proteasome inhibitor, mimickedthe effects of HIV-PIs in reducing both human adipogenesisand MMP-9 expression and secretion. Finally, some of ourresults suggested that perturbations of the NF-�B pathwayare the link between the inhibition of proteasomal activityand the decrease in MMP-9 expression. Indeed, even if wewere unable to detect NF-�B p65 signal changes under basalconditions, we did observe that chronic treatments (10 days)with HIV-PIs (SQV and NFV) or lactacystin induced cellularI�B� accumulation. Furthermore, SQV or lactacystin re-duced the expression of MMP-9 induced by acute treatment(24 h) with TNF-�, a classic activator of NF-�B.

The inhibition of proteasomal activity and, more precisely,proteasome chymotrypsin-like activity by HIV-PIs was ini-tially reported few years ago by Andre et al., (1998) andlinked to a decrease of antigen presentation and T-cell re-sponse in infected mice. Here we show, for the first time, thatproteasomes from human adipocyte precursors, which aremajor cell targets of HIV-PIs involved in the lipodystrophicsyndrome, are also directly inhibited by several HIV-PIs attherapeutic concentrations. These data agree with recentobservations made with the murine the 3T3-L1 cell linemodel of preadipocytes (Parker et al., 2005). As have otherinvestigators, we found that the 20S proteasome was more

Fig. 5. Effect of chronic SQV or lactacystin (Lacta.) treatment on cyto-plasmic and nuclear NF-�B p65 protein level in human preadipocytes.Stromal preadipocytes from human subcutaneous AT were cultured in anadipogenic medium with vehicle (control) or in the presence of lactacystin(0.5 �M) or SQV (10 �M). After 10 days of culture, the cells were washedand maintained overnight in basal medium with treatment before beingscrapped and prepared using NE-PER nuclear and cytoplasmic extrac-tion reagents kit. Twenty to 45 �g of proteins from cytoplasmic (Cyto.) ornuclear (Nucl.) extracts were then analyzed by Western blot using aspecific anti-NF-�B p65 subunit antibody. A representative autoradio-graph of five independent experiments is shown (A, left panel). Quanti-fication of the corresponding bands in the cytoplasmic extracts was per-formed with the NIH Image program and normalized to the density of thetotal loaded proteins per lane, obtained from analysis of Ponceau staining(B).The data presented are means � S.E.M. expressed as a percentage ofthe control. N/A, not analyzable. To validate the technique, human prea-dipocytes were acutely stimulated with TNF-� (25 ng/ml, 1 h), and West-ern blot analysis was performed. A representative autoradiograph of 3independent experiments is shown (A, right).

Fig. 6. Effect of acute SQV or lactacystin treatment on TNF-�-inducedMMP-9 expression in human preadipocytes. Stromal preadipocytes wereisolated from human subcutaneous AT. After the 3-day priming period,cells were placed in an adipogenic medium for 24 h, with or withoutTNF-� (25 ng/ml) alone or in cotreatment with lactacystin (0.5 �M), SQV(10 �M), or BAY 11-7082 (1 �M), an inhibitor of NF-�B activation. TotalRNAs were then extracted from cells and reverse-transcribed, and real-time RT-PCR analysis was performed using specific primers for MMP-9cDNAs. The results were normalized to the levels of 18S rRNA. Thepresented data are means � S.E.M. expressed as a percentage of theTNF-� effect alone for three to four independent experiments. �, p � 0.05versus TNF-� alone; ��, p � 0.01 versus TNF-� alone.


sensitive to HIV-PIs than the 26S proteasome (Gaedicke etal., 2002; Pajonk et al., 2002). One reason may be the differ-ent tertiary structure between the 20S and 26S proteasomes,leading to better accessibility of the inhibitors to the pro-teolytic sites of the 20S proteasome (Piccinini et al., 2005,Voorhees and Orlowski, 2006). We found that all HIV-PIs didnot have the same potency in inhibiting the chymotrypsin-like proteasome activity in our model. Indeed SQV and NFVwere the most effective, followed by RTV, whereas IDV waswithout effect. Similar observations were made in the rarepublications comparing the effect of HIV-PIs on human pro-teasomal activity measured on purified proteasome fromerythrocytes (Piccinini et al., 2002, 2005; Parker et al., 2005).It has to be noted that even if all HIV-PIs were weakerinhibitors of proteasomal activity than the specific lactacys-tin inhibitors in our in vitro assay, SQV and NFV (not RTVnor IDV), can accumulate greatly into cells (20 to �80 times)(Jones et al., 2001; Janneh et al., 2003). Thus, it can beexpected that intracellular concentrations of these HIV-PIsare much higher that the ones tested here.

Interestingly, SQV and NFV were the HIV-PIs with themajor effect on the differentiation of human preadipocytes inour previous work (Bourlier et al., 2005). We thus investi-gated whether a blockade of proteasomal activity can affecthuman adipogenesis. We showed that chronic lactacystintreatment of preadipocytes in an adipogenic medium led to adecrease of the various differentiation markers studied (tri-glyceride content and aP2 and HSL expression). Althoughsome authors have already implicated the proteasome inadipogenesis, their observations were on a different model,the murine 3T3-L1 cell line, using more or less specific pro-teasome inhibitors (calpain/proteasome), and contradictoryresults were obtained (Patel and Lane, 1999; Nguyen et al.,2000; Prince et al., 2002). As expected and in association withthe reduction of adipogenesis, we found that lactacystintreatment, as that with HIV-PIs, selectively decreasedMMP-9 expression and activity released into the culturemedium by preadipocytes. The reduction of MMP-9 activityper se may be responsible for the antiadipogenic effect oflactacystin since we have previously demonstrated thattreatment of human preadipocytes with pharmacological in-hibitors of MMP-9 activity decreased their differentiation(Bourlier et al., 2005). However we cannot exclude any otheradditional phenomenon implicated in adipogenesis thatmight be disturbed by proteasome inhibitor treatment.

Reduction of MMP-9 secretion with proteasome inhibitorshas previously been reported for distinct cellular types invitro involving NF-�B pathway perturbations (Ikebe et al.,1998; Kolev et al., 2003; Lu and Wahl, 2005). We were notable to find any modification in the activity and repartition ofNF-�B p65 within the cytosol and the nucleus in associationwith chronic SQV or lactacystin treatment in our model,using two different techniques (enzyme-linked immunosor-bent assay-based TransAM NF-�B assay kit and Westernblot). This may be partly explained by the fact that in theresting conditions that we studied, the part of active NF-�Bp65 was too weak to be detected. This hypothesis is in agree-ment with one of the rare published reports on the subjectshowing that NF-�B p65 is mostly cytosolic in unstimulatedhuman preadipocytes (Chung et al., 2005). Nevertheless, weshowed that the same chronic treatment with NFV, SQV, orlactacystin (but not with IDV nor RTV) led to intracellular

accumulation of I�B� protein. In contrast, none of the HIV-PIs or lactacystin was effective in modifying the I�B� proteinlevel. These results agree with the presumed roles of thesetwo members of the same family because 1) I�B� has beencorrelated to transient activation of NF-�B and I�B� to per-sistent activation that yields a more permanent change(Thompson et al., 1995) and 2) I�B�, but not I�B�, has beenshown to function as a classic cytoplasmic inhibitor of NF-�Bdimers in resting cells (Malek et al., 2001). Because bothNF-�B inhibitors have been shown to be substrates of theproteasome (Weil et al., 1997) and because no parallel in-crease in I�B� mRNA expression was observed under ourconditions, the increase in I�B� protein most probably re-flects the reduction of its degradation resulting from protea-somal activity inhibition induced by the treatments. Further-more, a different set of experiments conducted with theclassic NF-�B pathway activator TNF-� (Viatour et al., 2005)showed that MMP-9 expression was up-regulated within 24 hof treatment in our model, but also that this up-regulationcould be reduced either by SQV, lactacystin, or the NF-�Binhibitor, Bay 11-7082. Overall, according to these data onresting and TNF-�-stimulated human preadipocytes, we caneasily imagine that the decrease in MMP-9 expression ob-served with lactacystin and some HIV-PIs (SQV and NFV)arose in part from perturbations in the NF-�B pathway.

To our knowledge, this is the first investigation showingthat HIV-PIs are potent inhibitors of human preadipocyteproteasomal activity and that chronic low-level proteasomeinhibition reduces human adipogenesis. Disorders of theNF-�B pathway, resulting from proteasome inhibition maypartly explain the decrease in MMP-9 expression and secre-tion potentially responsible for adipogenesis reduction (Bour-lier et al., 2005) and observed with both lactacystin andHIV-PI treatment. Our in vitro results suggest that HIV-PI-induced perturbation of preadipocyte to adipocyte balancenoted in clinical studies (Bastard et al., 2002; Lloreta et al.,2002) may also target preadipocyte proteasome function. In-terestingly, a role for the proteasome in more metabolic as-pects of the HIV-related lipodystrophic syndrome has previ-ously been reported. Indeed, apolipoprotein B and sterolregulatory element binding protein degradation have beenshown to be altered by HIV-PI-related proteasome inhibitionand involved in lipid metabolism disorders (Liang et al.,2001; Hui, 2003). More recently, Parker et al. (2005) haslinked the reduction of proteasomal activity induced by HIV-PIs and the dyslipidemia to endoplasmic reticulum stress.Finally, attention is now being focused on HIV-PI-inducedproteasomal alterations and disturbances of glucose metab-olism because proteasome dysfunction and/or endoplasmicreticulum stress has been closely related to insulin resistance(Ozcan et al., 2004; Rome et al., 2004). All of this informationwill help to better understand the etiology of the lipodystro-phic syndrome but may also be of great interest for the recentclinical use of proteasome inhibitors in cancer therapy (i.e.,bortezomib treatment for multiple myeloma) and possibleeffects on adipose tissue development.

Acknowledgments

We thank Drs. Benarous, Belhaouri, and Jougla for help in ob-taining the adipose tissue samples. We also thank Dr. Sorisky forcritical review of this article.


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Address correspondence to: Dr. Virginie Bourlier, INSERM U586, 37Allees Jules Guesde, 31000 Toulouse, France. E-mail: [email protected]


Discussion de la publication 2

Dans cette étude, nous avons voulu déterminer les mécanismes impliqués dans la

diminution de l’expression de MMP-9 par les IPs-VIH. Nous avons tout d’abord évalué

l’effet des IPs-VIH sur l’activité du protéasome des cellules de la FSV du TA humain.

L’activité chymotrypsine des deux formes majeures du protéasome, le protéasome 20S qui

constitue la partie multicatalytique de tous les protéasomes et le protéasome 26S constitué du

protéasome 20S coiffé par deux sous-unités régulatrices 19S a été déterminée sur des extraits

protéiques de cellules de la FSV non différenciées. Nous avons observé que le SQV, le NFV

et le RTV diminuent l’activité du protéasome 20S et dans une moindre mesure celle du

protéasome 26S. Cette différence de sensibilité entre les activités des protéasomes 20S et le

26S a déjà été rapportée (84, 200) et pourrait s’expliquer par un problème d’accessibilité des

IPs-VIH aux sites catalytiques situés sur le protéasome 20S quand celui-ci est coiffé par les

sous-unités 19S c’est-à-dire sous une forme 26S (208, 279). Il est important de préciser que

l’inhibition de l’activité protéasomique observée par les IPs-VIH est très inférieure à celle

observée avec un inhibiteur spécifique du protéasome, la lactacystine. De plus, les

concentrations des IPs-VIH effectives sur l’inhibition du protéasome d’extraits protéiques des

cellules de la FSV sont plus élevées que celles requises pour l’inhibition de la différenciation

adipocytaire in vitro. Toutefois, les IPs-VIH tels que le SQV et le NFV ont été décrits comme

s’accumulant dans le cytoplasme cellulaire conduisant à une augmentation de la

concentration intracellulaire de 20 à 80 fois (111, 117, 273, 274).

Afin de déterminer si l’inhibition du protéasome affecte le processus de

différenciation adipocytaire, les cellules de la FSV du TA humain ont été traitées avec la

lactacystine. Après 10 jours de traitement, nous avons observé une diminution de

l’adipogenèse associée à une baisse de la sécrétion et de l’expression de MMP-9, sans atteinte

de MMP-2. Récemment, en accord avec nos résultats, les travaux de Li et al. ont montré que

la lactacystine inhibe également la différenciation des préadipocytes murins de la lignée 3T3-

L1 (146). L’ensemble de ces données suggère que le protéasome joue un rôle majeur dans

l’adipogenèse des cellules de la FSV ainsi que dans le contrôle de l’expression génique de

MMP-9. Il est tentant de spéculer que l’un des mécanismes impliqués dans l’effet anti-

adipogénique de la lactacystine est lié à une inhibition de l’activité de MMP-9. Toutefois,

d’autres voies peuvent être impliquées. Ainsi, il a été décrit que l’inhibition du protéasome

des préadipocytes murins entraîne une augmentation de CHOP-10, un facteur de transcription

anti-adipogénique (146). Les mécanismes impliqués dans cet effet sont encore inconnus.

63

Nous avons ensuite recherché des éventuelles perturbations de la voie NF-κB. Dans

un premier temps, nous nous sommes intéressés à IκB et avons observé, par des analyses de

western blot, une augmentation de la protéine IκBβ dans les préadipocytes humains traités

avec le SQV et le NFV pendant 10 jours suggérant une diminution de sa dégradation via le

protéasome. Dans un second temps, nous avons souhaité mettre en évidence un effet direct

des IPs-VIH sur le facteur de transcription NF-κB. Cependant, malgré plusieurs tentatives,

aucun effet direct des IPs-VIH et de la lactacystine sur l’activité et la localisation cellulaire

(cytoplasmique ou nucléaire) de NF-κB n’a pu être mis en évidence. Ces résultats pourraient

s’expliquer par le fait que nous avons travaillé dans des conditions basales c’est-à-dire non

stimulées. Nous avons donc stimulé les cellules de la FSV avec un activateur connu de la voie

NF-κB, le TNF-α. Comme attendu, suite à un traitement aigu avec le TNF- α, l’expression de

MMP-9 est fortement augmentée et lors d’un co-traitement avec la lactacystine et les IPs-VIH

tels que le SQV et le NFV, cette réponse est diminuée. Si l’on considère ces différents

résultats sur les préadipocytes humains en conditions basales et stimulées, on peut penser que

la chute de l’expression de MMP-9 induite par les IPs-VIH et la lactacystine est en partie due

à des perturbations de la voie NF-κB.

Nos résultats obtenus in vitro suggèrent donc que les IPs-VIH participent à l’atrophie

du TA en inhibant l’activité du protéasome des cellules de la FSV du TA humain. De manière

intéressante, l’inhibition du protéasome par les IPs-VIH a également été associée aux

complications métaboliques décrites dans les lipoatrophies induites par les IPs-VIH telles que

l’insulino-résistance et les désordres dans le métabolisme lipidique. Ainsi, compte tenu de

l’ensemble de ces données, il est nécessaire de rester vigilant quant aux effets indésirables

potentiels des inhibiteurs du protéasome dont l’un d’entre eux, le bortezomib est à ce jour

utilisé pour le traitement du cancer.

En résumé de cette première partie, nos résultats montrent que les MMPs et

particulièrement la MMP-9 est un acteur majeur dans la différenciation adipocytaire des

cellules de la FSV du TA humain. De plus, MMP-9 semble être une cible potentielle des IPs-

VIH. En effet, l’expression génique et la sécrétion de cette MMP est diminuée par les IPs-

VIH. Les mécanismes impliqués dans cet effet ont été déterminés et passent en partie par une

inhibition de l’activité protéasomique des cellules de la FSV par les IPs-VIH, entraînant des

perturbations de la voie NF-κB, facteur de transcription impliqué dans l’expression génique

de MMP-9. La MMP-9 joue donc un rôle majeur dans le processus de différenciation

adipocytaire chez l’homme.

64

En perspective à ce travail, les cibles moléculaires de MMP-9 responsables de l’effet

modulateur de la différenciation adipocytaire restent à définir. Nos études préliminaires ainsi

que les perspectives envisagées dans cet axe vont être brièvement présentées dans le

paragraphe qui suit.

D) Etudes préliminaires et perspectives sur l’étude des cibles moléculaires de

MMP-9

Comme nous l’avons évoqué l’effet des MMPs s’exerce via leurs actions sur les

composants de la MEC mais aussi via leurs actions sur des facteurs solubles activables par

ces MMPs et/ou des facteurs piégés dans la MEC.

Afin de déterminer si l’action de MMP-9 passe par la dégradation des composants

matriciels, nous avons d’abord évalué l’influence de différents supports matriciels tels que

des supports de collagène, fibronectine et gélatine, connus pour être des substrats de la MMP-

9 (57, 254), sur l’adipogenèse des cellules de la FSV du TA humain. Pour cela, des cellules

de la FSV du TA ont été ensemencées (60 000 cellules/cm2) sur ces différents supports et

mises en conditions adipogéniques. Après 10 jours de culture, le contenu intracellulaire en

TGs a été quantifié. Comme on peut l’observer dans la figure 16, aucun des supports

matriciels testés n’affecte l’accumulation lipidique des préadipocytes humains, un résultat ne

suggérant aucune altération de leur adipogenèse.

Ces données sont en accord avec d’autres travaux soulignant l’absence d’effet d’un

support de collagène (191) et de fibronectine (95) sur l’adipogenèse des cellules de la FSV de

TA humains et porcins, respectivement. A l’inverse, d’autres travaux ont rapporté un effet

anti-différenciant d’un support de fibronectine sur des préadipocytes d’origine murine et

humaine (98, 191, 260). Les différences observées dans ces études sont surprenantes et

pourraient s’expliquer par le modèle cellulaire et/ou les conditions de culture utilisées. On

note qu’un support de laminine décrit pour activer l’adipogenèse des préadipocytes porcins

(95) a également été testé mais ce support n’a pas permis l’adhérence des cellules de la FSV

du TA humain. Ainsi, ces résultats ne révélant aucun effet du support matriciel sur

l’adipogenèse, il est tentant de suggérer que l’activité de MMP-9 n’est pas due à la

dégradation de la MEC. Il faut cependant rester prudent car il est fort possible que l’action de

MMP-9 passe par la dégradation d’une MEC sécrétée par la cellule, elle-même, et non pas par

celle déposée au préalable sur un support. De plus, il est possible que le modèle de culture en

2 dimensions utilisé pour nos cellules ne permette pas d’observer un effet du support

65

Plastiq

ue

Collag

ène

Fibron

ectine

Gélatin

e0

25

50

75

100

125

Con

tenu

en

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lycé

ride

(mg/

mg

d'A

DN

)

Figure 16 : Influence d’un substrat matriciel sur la différenciation adipocytaire

des cellules de la FSV du tissu adipeux humainLes cellules de la FSV sont cultivées sur un support plastique ou coaté

avec du collagène de type IV, de la fibronectine, ou de la gélatine en conditions adipogéniques. A 10 jours de différenciation, le contenu intracellulaire en TGs

normalisé

à

la quantité

d’ADN a été

évalué

pour 4 expériences indépendantes. Les résultats sont exprimés en % du contrôle sur support plastique.

matriciel. L’influence de différents supports matriciels dans un modèle de culture en 3

dimensions est à envisager. En effet, une étude récente montre que des effets de la MT1-

MMP ne sont révélés que sur un modèle de culture en 3 dimensions (44).

En parallèle, il serait très intéressant de caractériser les principaux composants

matriciels sécrétés par les cellules de la FSV du TA humain en cours de différenciation

traitées ou non avec un inhibiteur de MMP-9. Une telle étude permettrait non seulement de

déterminer l’évolution de la MEC au cours de l’adipogenèse chez l’homme mais aussi de

définir les effets de cette métalloprotéase sur les composants matriciels. De plus, MMP-9

étant connu pour générer des fragments matriciels biologiquement actifs tels que

l’endostatine (77) et certains peptides dérivés de la fibronectine (82), un traitement des

cellules de la FSV du TA humain par des fragments matriciels pourraient être envisagé. En

effet, les travaux de Kamiya et al. montrent qu’un fragment issu de la dégradation de la

fibronectine stimule la différenciation des préadipocytes de la lignée ST-13 (119).

Enfin, la recherche des cibles non matricielles susceptibles de moduler et réguler le

comportement cellulaire pourrait également être envisagée. De nombreuses protéines

cellulaires de surface, péri-cellulaires ou circulantes peuvent être clivées par les MMPs

régulant ainsi leur biodisponibilité. Cependant, peu de données existent chez l’homme. Il

nous semblerait donc intéressant de caractériser notamment la production des facteurs de

croissance et/ou cytokines par les cellules de la FSV du TA humain au cours de la

différenciation. Cette approche pourrait être réalisée grâce à l'utilisation de la technique des

immunoarrays dédiés aux « cytokines » qui permet d’identifier et de quantifier, dans un

milieu de culture ou dans un lysat cellulaire, des protéines différentes décrites comme étant

des cibles de MMP-9 dans d’autres modèles cellulaires et dont les effets sur la différenciation

cellulaire ont été également mis en évidence telles que les TGFs, TNFs, ILs, IGF-I, IGFBPs.

En parallèle, l’influence d’un traitement avec un inhibiteur de MMP-9 pourra être évaluée et

ce, afin de mettre en évidence les facteurs de croissance et/ou cytokines dont le taux

extracellulaire est modifié par la présence de MMP-9 soit par leur clivage direct soit par leur

libération de la MEC.

Pour conclure, l’étude des cibles moléculaires de MMP-9 constitue donc un axe de

recherche dont le développement pourrait permettre de mieux comprendre les effets de la

MMP-9. Cependant, les cellules de la FSV étant une population cellulaire hétérogène, on peut

se demander quels types cellulaires sont les cibles de MMP-9. Récemment, des travaux de

notre groupe ont permis d’isoler et de caractériser la population cellulaire contenant les

66

précurseurs adipocytaires (241). Dans la suite de ce travail, nous avons déterminé si l’effet de

la MMP-9 est retrouvé dans ces précurseurs adipocytaires spécifiquement isolés.

67

II- Implication des MMPs dans la différenciation des cellules progénitrices

CD34+/CD31- isolées de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux humain

La caractérisation et l’isolement de la population cellulaire contenant les précurseurs

adipocytaires a été possible grâce au développement d’une technique d’isolement des

différentes populations cellulaires de la FSV qui se fonde sur l’utilisation de nanoparticules

magnétiques couplées à des anticorps dirigés spécifiquement contre les marqueurs de surface

CD34 (marqueur des cellules souches hématopoïétiques et des cellules endothéliales

capillaires), CD31 (marqueur des cellules endothéliales et de la lignée hématopoïétique) et

CD14 (marqueur des monocytes/macrophages) (figure 17). La fraction cellulaire

CD34+/CD31- est la seule à exprimer les marqueurs de différenciation spécifiques des

adipocytes et à acquérir les activités métaboliques adipocytaires, en réponse aux conditions

adipogéniques (241).

Notre groupe a également mis en évidence que ces cellules CD34+/CD31-, cultivées

en condition de culture endothéliales, changent de morphologie et d’organisation et

expriment des marqueurs spécifiques des cellules endothéliales tels que le CD31 et le facteur

de Von Willebrand (vWF). De plus, leur injection dans la patte ischémiée d’une souris

athymique entraîne une augmentation du flux sanguin et de la densité capillaire au niveau du

membre ischémié (173). D’autres laboratoires ont rapporté des capacités pro-angiogéniques

similaires des cellules issues de la FSV du TA (211, 221, 291). Par conséquent, la fraction

cellulaire CD34+/CD31- pourrait constituer un pool local de cellules progénitrices/souches

qui serait impliqué dans la formation non seulement des nouveaux adipocytes mais aussi des

capillaires accompagnant le développement de la masse grasse.

Les mécanismes impliqués dans le contrôle du devenir des cellules progénitrices

CD34+/CD31- restent à déterminer. Il a été rapporté que le microenvironnement pouvait

réguler le devenir des cellules souches hématopoïétiques et mésenchymateuses (127, 229). En

effet, de nombreux facteurs solubles (cytokines et facteurs de croissance) ainsi que la

composition et l’élasticité de la MEC contrôlent le devenir des cellules souches (14, 69, 71,

172). De plus, une récente publication indique que l’engagement des cellules souches

mésenchymateuses vers le lignage adipogénique et ostéogénique est régulé par la densité

cellulaire d’ensemencement qui altère la forme de la cellule et module les interactions

cellulaires (167).

Dans la deuxième partie de ce travail de thèse, nous avons d’abord vérifié et confirmé

l’implication des MMPs dans la différenciation adipocytaire des cellules CD34+/CD31-

68

Fraction stroma-vasculaire(FSV)

CD34-

Cellules progénitices CD34+/CD31-

CD34+

Billes anti-CD34

Billesanti-CD14

Digestion à

la collagénase

Adipocytes matures

Billesanti-CD31

Macrophages CD34-/CD14+

CD34-/CD14-

Figure 17 : Technique d’isolement des différentes populations de la FSV du tissu adipeux humain

Tissu adipeux humain

Cellules endothéliales CD34+/CD31+

spécifiquement isolées. Suite à cet ensemble de résultats sur les cellules CD34+/CD31-, nous

nous sommes ensuite demandés si l’effet anti-adipogénique observé avec des inhibiteurs de

l’activité et/ou de l’expression des MMPs, particulièrement MMP-9, modulait également les

autres capacités de ces cellules dont la capacité angiogénique. Ainsi, afin d’étudier les

mécanismes qui contrôlent le devenir des cellules CD34+/CD31- nous avons mis au point

une condition de culture permettant l’étude simultanée de l’adipogenèse et de l’angiogenèse.

A) Influence d’un inhibiteur des MMPs sur la différenciation adipocytaire des

cellules CD34+/CD31-

Nous avons isolé puis cultivé les cellules CD34+/CD31- dans des conditions

adipogéniques similaires à celles décrites dans la première partie de ce travail. L’activité

gélatinase des MMP-2 et -9 relarguée dans le milieu de culture au cours de la différenciation

a tout d’abord été évaluée par la technique de zymographie à la gélatine comme décrite dans

les précédentes publications. Comme le montre la figure 18, la sécrétion des MMP-2 et -9 par

les cellules CD34+/CD31- augmente au cours de la différenciation adipocytaire des cellules

CD34+/CD31- isolées. Ces données indiquent que la production de MMP-2 et -9 est

strictement modulée par la différenciation adipocytaire et ne peut être attribuée à la

modulation de la présence ou de l’état d’activation des autres types cellulaires (macrophages,

cellules endothéliales) de la FSV.

L’implication des MMPs dans la différenciation adipocytaire des cellules

CD34+/CD31- a ensuite été déterminée. Pour cela et de manière similaire à la FSV, les

cellules CD34+/CD31- ont été traitées avec un inhibiteur des MMPs à large spectre, le

batimastat. Après 10 jours de traitement, une diminution de l’accumulation des gouttelettes

lipidiques a été observée et confirmée par le dosage du contenu intracellulaire en TGs (figure

19). Ces données sont en accord avec celles obtenues sur les cellules de la FSV. Elles

suggèrent un rôle majeur des MMPs dans le processus de différenciation adipocytaire des

cellules progénitrices CD34+/CD31- isolées. Cependant, une étude complète serait nécessaire

afin de préciser les effets du batimastat sur l’expression de gènes marqueurs de la

différenciation adipocytaire (gènes précoces tels qu’aP2 et PPARγ et gènes tardifs tels que la

LHS et FAS).

69

StandardJ0 J10MMP-9

MMP-2

Figure 18 : Sécrétion des MMP-2 et -9 au cours de la différenciation adipocytaire

des cellules progénitrices

CD34+/CD31-

isoléesAprès avoir été

isolées de la FSV, les cellules CD34+/CD31-

sont cultivées en conditions adipogéniques. L’activité

gélatinase

des MMP-2 et -9 relarguée

dans le milieu de culture à

0 (J0) et 10 (J10) jours de différenciation est évaluée par zymographie

à

la gélatine. L’utilisation d’un standard MMPs

nous a permis de détecter les bandes spécifiques de MMP-2 et -9 actives. Le gel présenté

est représentatif de 2 expériences indépendantes.

0

25

50

75

100

*

Contrôle Batimastat (5 µM)

Con

tenu

en

trig

lycé

ride

(en

% d

u co

ntro

le)

Contrôle

Batimastat(5 µM)

A B

Figure 19 : Influence du batimastat

sur la différenciation adipocytaire

des cellules progénitrices

CD34+/CD31-Après avoir été

isolées de la FSV, les cellules CD34+/CD31-

sont cultivées en conditions adipogéniques

traitées ou non avec le batimastat

pendant 10 jours. Une photographie représentative de 4 expériences indépendantes est présentée ainsi que la quantification du contenu intracellulaire en TGs

normalisé

à

la quantité

d’ADN. Les résultats sont exprimés en % du contrôle. * P<0.05 vs contrôle

Des travaux de notre groupe ayant démontré que les cellules progénitrices

CD34+/CD31- sont également capables d’angiogenèse dans des conditions de culture

endothéliales (173), il nous a semblé intéressant de déterminer si l’effet anti-adipogénique

observé avec le batimastat pouvait correspondre à une réorientation des cellules

CD34+/CD31- vers le lignage endothélial et/ou à une simple inhibition de la différenciation

adipocytaire. Ainsi, afin de déterminer les mécanismes impliqués dans le devenir des cellules

progénitrices CD34+/CD31-, nous avons mis au point une condition de culture permettant

l’étude simultanée des capacités adipogéniques et angiogéniques.

B) Mise au point d’une condition de culture permettant simultanément les

capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31-

B.1) Etude de l’accumulation intracellulaire des triglycérides et de la formation d’un réseau

cellulaire positif pour le CD31 par les cellules CD34+/CD31- cultivées dans un milieu mixte

Des cellules progénitrices CD34+/CD31- ont été ensemencées (120 000 cellules/cm2)

dans un milieu de type ECBM (endothelial cell basal medium) supplémenté avec 10% de

sérum de veau foetal et dans des puits coatés avec de la fibronectine (5 µg/cm2) afin de

favoriser l’angiogenèse. Après 24 heures, les cellules ont été mises en présence d’un milieu

adipogénique, endothélial ou d’un milieu mixte correspondant à une combinaison des milieux

adipogéniques et endothéliaux. La composition de ces trois milieux est présentée dans le

tableau 11. Notons que dans cette étude, étant donné les effets apoptotiques de la ciglitazone

sur les cellules endothéliales (165), cet agoniste PPARγ a été remplacé par la rosiglitazone

décrite à l’inverse comme pro-angiogénique (209, 282).

Après 10 jours de culture, les cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu

adipogénique et mixte montrent un phénotype adipocytaire caractérisé par l’accumulation de

gouttelettes lipidiques (figure 20A). Comme on peut le voir sur la figure 20B, une forte

augmentation du contenu intracellulaire en TG est observée au cours de la différenciation des

cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu adipogénique et mixte. Cependant, aucune

différence dans le contenu intracellulaire en TG n’est observée si l’on compare le milieu

adipogénique versus le milieu mixte. En effet, le pourcentage de cellules différenciées en

adipocytes est similaire dans les milieux adipogénique et mixte (66.4 ± 4.4 % et 70.1 ± 1.5 %,

respectivement). En revanche, après 10 jours de culture en milieu endothélial, les cellules

CD34+/CD31- ne stockent pas de lipides.

70

J0 Adipo Endo Mixte0

25

50

75

100

125

150 **

**

J10

£

Long

ueur

du

rése

au p

ositi

fpo

ur le

CD

31 (U

.A.)

J0 Adipo Endo Mixte0

10

20

30

40

50**

*

J10

Con

tenu

en

trigl

ycér

ides

(mg/

mg

d'A

DN

)

B

A

C

MixteEndothélialeAdipogéniqueJ0

Figure 20

: Détermination de l’accumulation des TGs

et de la formation d’un réseau cellulaire positif pour le CD31 des cellules CD34+/CD31-

cultivées en milieu adipogénique, endothélial ou mixte Les cellules CD34+/CD31-

sont ensemencées à

120

000 cellules/cm2 et cultivées en milieu adipogénique

(Adipo), endothélial (Endo) ou mixte. Après 10 jours, les cellules sont fixées et marquées au Red

Oil, au Hoechst

(un colorant nucléaire) et avec un anticorps dirigé

contre le CD31. Des photographies représentatives de 4 à

11 expériences indépendantes sont présentées. (A). Le contenu intracellulaire en TGs

(B) ainsi que la longueur du réseau cellulaire pour le CD31 (C) ont été

évalués. Les valeurs sont exprimées en mg/mg

d’ADN pour le contenu en TGs

et la longueur du réseau cellulaire pour le CD31 en unité

arbitraires normalisées à

la quantité

d’ADN. ** P<0.001 et * P<0.01 vs J0 et £

P<0.001 vs Endo

Tableau 11: Composition des milieux adipogénique, endothélial et mixte utilisés

Milieu adipogénique Milieu endothélial Milieu mixte

ECBM

Insuline (66 nmol/L)

T3 (1 nmol/L)

Cortisol (100 nmol/L)

Transferrine (10 µg/mL)

Rosiglitazone (3 µmol/L)

ECGM

VEGF (0.5 ng/mL)

IGF-1 (20 ng/mL)

ECGM

Insuline (66 nmol/L)

T3 (1 nmol/L)

Transferrine (10 µg/mL)

Rosiglitazone (3 µmol/L)

VEGF (0.5 ng/mL)

IGF-1 (20 ng/mL) (ECBM: endothelial cell basal medium, ECGM: endothelial cell growth medium constitué d’un milieu de type ECBM supplémenté avec des facteurs de croissance tels que l’EGF (0.1 ng/ml), le bFGF (1 ng/ml) et l’hydrocortisone (1 µg/ml)) et 2 % de sérum de veau foetal)

En parallèle, des analyses d’immnunohistochimie ont permis d’évaluer l’apparition

d’un marquage spécifique pour le CD31, un marqueur des cellules endothéliales (pour les

méthodes voir (173)). Comme on peut l’observer dans les figures 20A et C, la culture des

cellules CD34+/CD31- en milieu endothélial et mixte entraîne la formation d’un réseau

cellulaire positif pour le CD31. Cependant, en milieu mixte, la longueur du réseau cellulaire

positif pour le CD31 est plus faible qu’en milieu endothélial suggérant une perte du potentiel

angiogénique en milieu mixte. En effet, le pourcentage de cellules positives pour le CD31 est

plus faible en milieu mixte comparé au milieu endothélial (14.4 ± 1.1 % et 19.1 ± 2.4 % en

milieu mixte et endothélial, respectivement, P<0.05, milieu endothélial vs mixte). En

revanche, la culture des cellules CD34+/CD31- en milieu adipogénique n’entraîne pas la

formation d’un réseau positif pour le CD31. Il est important de préciser que le milieu mixte

comme le milieu endothélial est constitué d’un milieu de base de type ECGM qui contient

des facteurs de croissance et 2% de sérum de veau foetal. Ainsi, les cellules CD34+/CD31-

montrent une prolifération en milieu mixte et endothélial mais pas en milieu adipogénique.

Cette donnée est mise en évidence dans les photographies présentées dans la figure 20A

grâce au marquage des noyaux par le Hoechst, un colorant nucléaire, et confirmée par la

quantification du contenu cellulaire en ADN. En effet, au cours de la culture, une forte

augmentation (3,5 fois) du contenu en ADN dans les milieux endothélial (données

personnelles) et mixte (figure 22A) est observée. Toutefois, notons qu’aucune différence dans

le contenu en TGs, lorsqu’il est normalisé à la quantité d’ADN, n’a été observé lors de la

culture des cellules CD34+/CD31- dans un milieu adipogénique constitué d’une base ECBM

71

ou d’une base ECGM, suggérant que la prolifération de ces cellules dans le milieu ECGM ne

modifie pas le niveau de différenciation adipocytaire.

L’ensemble de ces résultats montre que les cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu

mixte peuvent à la fois accumuler des lipides et former un réseau cellulaire positif pour le

CD31.

B.2) Etude de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et endothéliaux par les

cellules CD34+/CD31- cultivées dans un milieu mixte

Afin de confirmer les capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules

CD34+/CD31- en milieu mixte, nous avons voulu évaluer l’expression en ARNm des

marqueurs adipocytaires et endothéliaux par des analyses de RT-PCR. L’expression de ces

marqueurs a été tout d’abord déterminée dans des cellules CD34+/CD31-, des adipocytes

matures et des cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+ fraîchement isolées. Les

résultats présentés dans le tableau 12, montrent comme attendu que les transcrits pour les

marqueurs adipocytaires sont détectés majoritairement dans les adipocytes matures et les

transcrits pour les marqueurs endothéliaux sont détectés majoritairement dans les cellules

endothéliales CD34+/CD31+. On peut cependant noter l’expression non négligeable d’aP2 et

de PPARγ dans les cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+. Concernant PPARγ, ces

résultats sont en accord avec d’autres observations (18). En revanche, aucune autre étude ne

s’est intéressée à l’expression d’aP2 dans les cellules endothéliales. L’ensemble de ces

résultats suggèrent donc que les cellules CD34+/CD31- fraîchement isolées expriment peu les

marqueurs adipocytaires et endothéliaux comparés aux adipocytes matures et aux cellules

endothéliales CD34+/CD31+, respectivement.

L’expression de ces différents marqueurs adipocytaires et endothéliaux dans les

cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu adipogénique, endothélial et mixte pendant 10

jours a ensuite été déterminée. Comme le montre la figure 21A, en milieu mixte, une

augmentation significative des taux de transcrits codant pour les marqueurs adipocytaires,

excepté PPARγ, est observée par rapport au milieu endothélial. De plus, une augmentation en

ARNm de tous les marqueurs endothéliaux est observée dans les cellules CD34+/CD31- en

milieu mixte par rapport au milieu adipogénique (figure 21B). L’ensemble de ces résultats

montre que la culture des cellules CD34+/CD31- en milieu mixte pendant 10 jours induit

l’expression des ARNm codants pour des marqueurs adipocytaires d’une part et des

marqueurs endothéliaux d’autre part.

72

A B

0

100

200

300

FASLHSPPARγaP2

***

*** *

Endo Mixte

Mar

queu

rs a

dipo

cyta

ires

(en

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u m

ilieu

adi

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e)

0

25

50

75

100

CD31 vWF VE-cadherin VEGF-R1

****

*

***

Adipo Mixte

Mar

queu

rs e

ndot

hélia

ux(e

n %

du

mili

eu e

ndot

hélia

l)

Figure 21 : Détermination de l’expression en ARNm

des marqueurs adipocytaires

et endothéliaux des cellules CD34+/CD31-

cultivées en milieu adipogénique, endothélial ou mixteLes cellules CD34+/CD31-


120

000 cellules/cm2

et cultivées en milieu adipogénique

(Adipo), endothélial (Endo) ou mixte (mixte). Après 10 jours, l’expression en ARNm


(aP2, PPARγ, LHS et FAS) (A) et

des marqueurs endothéliaux (CD31, vWF, VE-cadherin

et VEGF-R1) (B) a été

déterminée par des analyses de RT-PCR. Les résultats sont exprimés en pourcentage du milieu adipogénique

et endothélial pour les marqueurs adipocytaires

et endothéliaux respectivement pour 3 à

6 expériences indépendantes. *** P<0.001, ** P<0.01 et P<0,05 vs milieu adipogénique

ou endothélial

Tableau 12: Détermination de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et endothéliaux par des adipocytes matures, des cellules progénitrices CD34+/CD31- et des cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+

Adipocytes matures

Cellules progénitricesCD34+/CD31-


Marqueurs adipocytaires aP2 42.67 ± 3.98 5.67 ± 1.47 *** 12.19 ± 3.43 *** PPARγ 5.34 ± 0.77 1.22 ± 0.17 *** 2.84 ± 0.62 * LHS 21.89 ± 1.85 0.14 ± 0.04 *** 0.55 ± 0.14 *** FAS 2.23 ± 0.55 <0.02 *** <0.02 *** Marqueurs endothéliaux CD31 0.23 ± 0.03 * 0.17 ± 0.04 ** 0.40 ± 0.05 vWF 0.52 ± 0.08 * 0.36 ± 0.06 ** 1.00 ± 0.17 VE-cadherin 0.41 ± 0.05 * 0.22 ± 0.05 * 1.21 ± 0.32 VEGF-R1 0.07 ± 0.01 * 0.03 ± 0.01** 0.17 ± 0.04 L’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires (aP2, PPARγ, LHS et FAS) et des marqueurs endothéliaux (CD31, vWF, VE-cadherin et VEGF-R1) a été déterminée par des analyses de RT-PCR dans des adipocytes matures, des cellules CD34+/CD31- et des cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+ fraîchement isolées. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires pour 3 à 4 expériences indépendantes. *** P<0.001, ** P<0.01,* P<0.05 vs les adipocytes matures pour les marqueurs adipogéniques et vs les cellules endothéliales CD34+/CD31+ pour les marqueurs endothéliaux

B.3) Etude cinétique sur l’évolution des cellules CD34+/CD31- au cours de la culture en

milieu mixte

Dans le développement du TA, angiogenèse et adipogenèse sont étroitement liées.

Toutefois, il est décrit que l’angiogenèse précède l’adipogenèse (52). Afin de déterminer si

un tel effet est observé dans nos conditions de culture. Nous avons réalisé une étude cinétique

sur l’évolution des cellules CD34+/CD31- à différents jours de culture (2, 4, 6, 8 et 10) en

milieu mixte. Dans un premier temps, la quantification intracellulaire en TGs ainsi que la

formation du réseau cellulaire positif pour le CD31 ont été réalisées. Dans un second temps,

nous avons quantifié l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et endothéliaux des

cellules CD34+/CD31-.

Comme on peut l’observer dans la figure 22, l’augmentation du contenu en ADN

devient significative à partir du 6ème jour de culture. De manière intéressante, la longueur du

réseau cellulaire positif pour le CD31 apparaît et atteint son niveau maximal au 6ème jour de

culture tandis que le contenu intracellulaire en TGs n’augmente significativement qu’à partir

du 8ème jour de culture. Ces résultats laissent penser que la formation du réseau cellulaire

73

C

B

A

0 2 4 6 8 100.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

***

*****

Jours de différenciationC

onte

nu e

n A

DN

(mg/

ml)

0 2 4 6 8 100

25

50

75

100

***

***

Jours de différenciation

Long

ueur

du

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au p

ositi

fpo

ur le

CD

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.A.)

0 2 4 6 8 100

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20

30

40

**

***


Con

tenu

en

trig

lycé

ride

s (m

g/m

g d'

AD

N)

Figure 22

: Evolution du contenu en ADN, TGs

et du réseau cellulaire positif pour le CD31 des cellules CD34+/CD31-

cultivées en milieu mixteLes cellules CD34+/CD31-


120

000 cellules/cm2

et cultivées en milieu mixte. Après 10 jours, le contenu intracellulaire en ADN (A) et TGs

(B) ainsi que la longueur du réseau cellulaire positif pour le CD31 (C) ont été





la quantité

d’ADN pour 5 à

6 expériences indépendantes. *** P<0.001, ** P<0.01, *P<0,05 vs J0

positif pour le CD31 précède l’accumulation des TGs. Cependant, il est difficile de comparer

l’apparition d’un marqueur avec la mise en place d’une activité métabolique.

L’étude de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et endothéliaux, au

cours de la culture des cellules CD34+/CD31- en milieu mixte nous a permis de compléter

ces résultats. En effet, on note que l’expression d’aP2 et PPARγ, des marqueurs précoces du

processus adipogénique, apparaît et atteint son maximum dès le 4ème jour tandis que

l’expression de FAS, connu pour être un marqueur de l’activité métabolique, apparaît dès le

4ème jour mais atteint son maximum au 8ème jour de culture (figure 23). Concernant les

marqueurs endothéliaux, nous avons constaté que l’expression du CD31 augmente

significativement dès le 4ème jour de culture et une tendance similaire pour le facteur vWF

semble être observée même si aucune différence significative n’a pu être mise en évidence du

fait d’une forte variabilité interindividuelle. Ces résultats semblent indiquer qu’au cours de la

culture l’expression des marqueurs endothéliaux étudiés atteint un niveau maximal plus

rapidement que l’expression de FAS suggérant que les capacités angiogéniques apparaissent

plus précocement que les capacités adipogéniques. Toutefois, il n’est pas exclu que

l’accumulation des TGs nécessite plus de temps que l’organisation d’un réseau cellulaire

positif pour le CD31. Il est important de préciser que les marqueurs endothéliaux utilisés pour

ce travail sont décrits dans la littérature comme des marqueurs détectés spécifiquement dans

les cellules endothéliales matures (223). Leur expression en fonction de la différenciation

endothéliale n’est pas connue et à ce jour il n’est pas décrit de marqueurs géniques

spécifiques de la différenciation des cellules endothéliales. Par ailleurs, il faut également

rester prudent quant à la spécificité des marqueurs de la différenciation adipocytaire. En effet,

certains sont également détectés dans les cellules endothéliales matures notamment PPARγ et

aP2.

Pour conclure, l’ensemble de ces résultats indique que les cellules CD34+/CD31-

cultivées en milieu mixte pendant 10 jours expriment à la fois des marqueurs adipocytaires et

endothéliaux. Cette condition de culture constitue donc un nouvel outil pour l’étude des

mécanismes contrôlant le devenir des cellules progénitrices CD34+/CD31-.

74

2 4 6 8 100.0

0.5

1.0

1.5

2.0

* *


Expr

essi

on e

n A

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e PP

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(U.A

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2 4 6 8 100

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*


Expr

essi

on e

n A

RN

m d

u C

D31

(U.A

.)

A CB

ED

Figure 23

: Evolution de l’expression en ARNm


et endothéliaux des cellules CD34+/CD31-



120

000 cellules/cm2

et cultivées en milieu mixte. Après 10 jours, l’expression en ARNm


aP2 (A), PPARγ

(B) et FAS (C) et

des marqueurs endothéliaux CD31 (D) et vWF

(E) a été

déterminée par des analyses de RT-PCR. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires pour 4 expériences indépendantes. ** P<0.01 et P<0,05 vs J2

Toutefois, nous nous sommes demandés si l’effet angiogénique observé par les

cellules CD34+/CD31- n’est pas du à une contamination par des cellules endothéliales

matures CD34+/CD31+. Des analyses de cytométrie de flux ont été effectuées pour

déterminer la pureté de la fraction CD34+/CD31-. Il a été observé que 92.9 ± 0.8 % des

cellules retrouvées dans cette fraction sont CD34+/CD31- (données personnelles). Ainsi, la

possibilité d’une contamination par des cellules endothéliales est faible. Cependant, afin de

déterminer l’influence de la présence des cellules endothéliales capillaires matures sur les

cellules CD34+/CD31- en milieu mixte, des expériences de coculture (CD34+/CD31- et

CD34+/CD31+) ont été réalisées. Les cellules CD34+/CD31- ont été ensemencées dans un

milieu ECBM/10% sérum de veau fœtal à 120000 cellules/puits en présence ou non de

cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+ (5000 cellules/puits). Après 24 heures (J0) et

10 jours de culture en milieu mixte (J10), le marquage positif pour le CD31 a été quantifié.

Les résultats présentés à la figure 24, montrent qu’après 24 heures, le nombre de cellules

positives pour le CD31 lors de la coculture est augmenté (P<0,05 contrôle vs coculture) du à

la présence de cellules endothéliales capillaires matures CD34+/CD31+. Cependant, après 10

jours de culture, aucune différence dans la longueur du réseau cellulaire pour le CD31 n’est

observée entre les cellules CD34+/CD31- seules ou en coculture. Ce résultat indiquent que

les cellules endothéliales matures quiescentes CD34+/CD31+ cultivées en milieu mixte ne

s’organisent pas en réseau à la différence des cellules CD34+/CD31-. L’ensemble de ces

données suggère donc que l’effet angiogénique observé est du à un potentiel angiogénique

des cellules CD34+/CD31- plutôt qu’à une contamination par des cellules endothéliales

CD34+/CD31+.

La mise au point de cette condition de culture permettant de révéler simultanément les

capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31- nous a permis d’initier

des études sur les mécanismes potentiels impliqués dans la régulation de l’expression de cette

double fonctionnalité des cellules CD34+/CD31-. Trois axes ont été envisagés : l’influence

des contacts cellule-cellule, l’influence de la MEC et de son remodelage notamment via les

MMPs et l’influence des facteurs paracrines. Les résultats préliminaires que nous avons

obtenus sont présentés dans le paragraphe suivant.

75

Figure 24

: Influence de la présence de cellules endothéliales matures sur la formation du réseau cellulaire positif pour le CD31 des cellules CD34+/CD31-



120

000 cellules/cm2

seules ou en présence de cellules endothéliales matures CD34+/CD31+ (CECs) (5 000 cellules/cm2) puis

cultivées en milieu mixte. Après 0 (A) et 10 (C) jours, les cellules sont fixées et marquées au Red

Oil, au Hoechst

(un colorant nucléaire) et avec un anticorps dirigé

contre le CD31. Des photographies représentatives de 4 expériences indépendantes sont présentées. Le marquage positif pour le CD31 a ensuite été

évalué. Les valeurs sont exprimées en unité


la quantité

d’ADN.*P<0,05 vs CD34+/CD31-

seules.

CD34+/31- + CECs0

200

400

600 *

Mar

quag

e pos

itif p

our l

e C

D31

(en

% C

D34

+/C

D31

- seu

les)

J0

J0

J10

A

B

Cellules CD34+/CD31-


+ CECs



+ CECs CD34+/31- + CECs0

20

40

60

80

100

120

J10

Long

ueur

du

rése

au p

ositi

f pou

r le

CD

31(e

n %

CD

34+3

1- s

eule

s)

C) Implication des contacts cellule-cellule dans les capacités adipogéniques et

angiogéniques des cellules CD34+/CD31-

C.1) Influence de la densité cellulaire sur les cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte

Etant donné que les cellules CD34+/CD31- ont une capacité de prolifération

importante en milieu mixte, la densité cellulaire augmente avec le temps. L’influence des

contacts cellule-cellule sur le devenir des cellules progénitrices CD34+/CD31- a donc été

déterminée en modulant la densité cellulaire d’ensemencement. Pour cela, les cellules ont été

ensemencées à trois densités différentes (2 000, 20 000 ou 120 000 cellules/cm2) et cultivées

pendant 10 jours en milieu mixte. Comme on peut le voir dans la figure 25A, quelle que soit

la densité cellulaire d’ensemencement, la quantité cellulaire d’ADN augmente au cours de la

culture et à 10 jours de culture cette quantité d’ADN est identique pour les trois densités. Une

augmentation du contenu intracellulaire en TGs est également observée quelque soit la

densité cellulaire (figure 25B). Cependant, le contenu intracellulaire en TGs est plus faible si

l’on compare la densité d’ensemencement la plus basse (2000 cellules/cm2) et la plus élevée

(120000 cellules/cm2) suggérant un retard de l’adipogenèse lorsque les cellules sont

ensemencées à faible densité. Concernant, la formation du réseau cellulaire positif pour le

CD31, il n’est observé qu’à la plus forte densité (figure 25C) suggérant que les contacts

cellule-cellule initiaux sont nécessaires à l’expression des capacités angiogéniques des

cellules CD34+/CD31-. L’ensemble de ces données suggère donc que la densité cellulaire

d’ensemencement peut moduler le devenir des cellules CD34+/CD31-.

L’influence de la densité cellulaire sur le devenir cellulaire est connue puisque des

travaux ont déjà suggéré que la densité cellulaire influence la différenciation des cellules

souches mésenchymateuses (210). Cependant, ce sont les travaux de Mc Beath et al. qui ont

clairement montré que la densité cellulaire d’ensemencement module l’engagement des

cellules souches mésenchymateuses vers le lignage adipogénique et ostéogénique (167). Ces

effets relatifs à la densité cellulaire peuvent être dus à des modulations de la forme de la

cellule et des tensions du cytosquelette comme il a déjà été suggéré (167) mais également à la

modulation des contacts et des communications entre les cellules.

De nombreuses études ont montré l’importance des jonctions gaps dans le contrôle

des processus de myogenèse (9, 215), d’ostéogenèse (237) mais aussi d’adipogenèse (238).

Récemment, une étude indique que la communication par les jonctions gaps est nécessaire à

l’expansion clonale durant la différenciation des préadipocytes de la lignée 3T3-L1 (296).

76

B

A

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0 10 0 10 0 10

2 000

jours

20 000 120 000 cellules/cm2

***

******

Con

tenu

en

AD

N(m

g/m

l)

0

10

20

30

0 10 0 10 0 10

2 000

jours

20 000 120 000 cellules/cm2

**

***

**

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(mg/

mg

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N)

0

20

40

60

80

0 10 0 10 0 10

2 000

jours

20 000 120 000 cellules/cm2

***

Long

ueur

du

rése

au p

ositi

fpo

ur le

CD

31 (U

.A.)

C

*

Figure 25 : Influence de la densité

cellulaire sur les capacités adipogéniques

et angiogéniques

des cellules CD34+/CD31-



120

000, 20

000 ou 2

000 cellules/cm2

et cultivées en milieu mixte. Après 10 jours, le contenu intracellulaire en ADN (A) et TGs

(B) ainsi que la longueur du réseau cellulaire pour le CD31 (C) ont été





la quantité

d’ADN pour 4 à

10 expériences indépendantes. *** P<0.001, ** P<0.01, *P<0,05 vs J0

Dans la suite de ce travail, l’implication de la communication par les jonctions gaps dans les

capacités angiogéniques et adipogéniques des cellules CD34+/CD31- a été évaluée.

C.2) Influence de la communication cellulaire via les jonctions gaps sur les cellules

CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte

Les jonctions gaps forment un canal intercellulaire essentiellement constitué d’un

assemblage de connexines. Nous avons tout d’abord évalué l’expression en ARNm des

connexines 43, 45, 40 et 37 dans des adipocytes matures, des cellules progénitrices

CD34+/CD31- et des cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+ fraîchement isolées.

Comme on peut le voir dans le tableau 13, toutes les connexines, excepté la connexine 37,

sont détectées dans les trois types cellulaires testés. Le niveau d’ARNm de la connexin 40 est

cependant très faible et on note que les cellules endothéliales capillaires expriment des

niveaux plus élevés de connexine 43 que les adipocytes matures.

L’expression en ARNm des connexines 43 et 45 a ensuite été évaluée au cours de la

culture des cellules progénitrices CD34+/CD31- en milieu mixte. Les résultats sont présentés

dans la figure 26 et indiquent clairement que l’expression en ARNm de ces connexines

diminue au cours de la culture. Ces résultats sont en accord avec les travaux d’Umezawa et

al. montrant que l’expression de la connexine 43 est diminué au cours de la différenciation

adipocytaire des cellules stromales de la moelle osseuse H-1/A d’origine murine (267).

Tableau 13: Expression en ARNm des connexines 43, 45, 40 et 37 dans des adipocytes matures, des cellules progénitrices CD34+/CD31- et des cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+

Types de connexines

Adipocytes matures

Cellules progénitricesCD34+/CD31-


Connexine 43 0.20 ± 0.06 0.51 ± 0.06 0.85 ± 0.21 *

Connexine 45 0.05 ± 0.01 0.14 ± 0.06 0.18 ± 0.08

Connexine 40 <0.02 <0.02 0.04 ± 0.01

Connexine 37 Non détectable Non détectable Non détectable L’expression en ARNm des connexines 43, 45, 40 et 37 a été déterminée par des analyses de RT-PCR dans des adipocytes matures, des cellules CD34+/CD31- et des cellules endothéliales CD34+/CD31+ fraîchement isolées. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires pour 3 expériences indépendantes. * P<0.05 vs les adipocytes matures

77

2 4 6 8 100.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

*****


Expr

essi

on e

n A

RN

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ela

con

nexi

n 43

(U

.A.)

2 4 6 8 100.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

******


Expr

essi

on e

n A

RN

m d

ela

con

nexi

n 45

(U.A

.)

Figure 26 : Evolution de l’expression en ARNm

des connexines

43 et 45 des cellules CD34+/CD31-



120

000 cellules/cm2

et cultivées en milieu mixte. Après 10 jours, l’expression en ARNm

des connexines

43 (A) et 45 (B) a été

déterminée par des analyses de RT-PCR. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires pour 4 expériences indépendantes. ** P<0.01 et ***P<0,001 vs J2

BA

Le rôle direct de la communication par les jonctions gaps sur les capacités

adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31- a été déterminé grâce à

l’utilisation d’un inhibiteur des jonctions gaps, le 18α-glycyrrhetinic acide (AGA). Les

cellules ont été traitées pendant 10 jours avec 5 et 10 µM d’AGA ou de GZA (glycyrrhizic

acide) un analogue peptidique de l’AGA sans effet sur les jonctions gaps. Comme on peut le

voir dans la figure 27, le GZA n’a aucun effet significatif ni sur le contenu intracellulaire en

TGs ni sur l’apparition du réseau cellulaire positif pour le CD31. En revanche, l’AGA à 10

µM diminue de façon significative le contenu intracellulaire en TGs mais n’affecte pas

significativement le réseau CD31 même si une tendance à l’augmentation du réseau est

observée. Il est important de noter qu’à une concentration de 10 µM, l’AGA n’a pas effet sur

le contenu cellulaire en ADN (données personnelles). Cependant, l’utilisation de cet

inhibiteur à des concentrations supérieures à 30 µM est associée à une mort cellulaire au bout

de quelques jours de culture.

Ces résultats indiquent que la communication cellulaire via les jonctions gaps est

requise pour l’adipogenèse des cellules CD34+/CD31- en accord avec les travaux de

Yanagiya et al. sur les préadipocytes murins (296). Toutefois, l’effet observé sur les cellules

CD34+/CD31- ne semble pas être du à une altération de l’expansion clonale comme c’est le

cas pour les préadipocytes murins décrit par les résultats de Yanigaya et al. car aucune

différence du contenu cellulaire en ADN dans les cellules contrôles et traitées n’a été

observée (données personnelles). Une étude plus complète est toutefois nécessaire afin de

préciser les effets d’un inhibiteur des jonctions gaps sur l’expression en ARNm des

marqueurs de la différenciation adipocytaire et de déterminer à quel stade de l’adipogenèse

les jonctions gaps sont requises.

En résumé de cette deuxième partie, nous avons mis au point une condition de

culture permettant simultanément l’étude des capacités angiogéniques et adipogéniques des

cellules CD34+/CD31-. Ce nouvel outil va permettre l’étude des mécanismes qui contrôlent

le devenir des cellules CD34+/CD31- et notamment l’influence du microenvironnement. Des

premiers résultats indiquent que les contacts cellule-cellule ainsi que la communication via

les jonctions gaps peuvent moduler le devenir des cellules CD34+/CD31-.

78

0

50

100

150

*

5 10 105 µM

GZA AGA

Con

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con

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5 10 105 µM

GZA AGALo

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ur d

u ré

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pos

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our

le C

D31

(en

% d

u co

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le)

BA

Figure

27 : Effet d’un inhibiteur des jonctions gaps sur les capacités adipogéniques

et angiogéniques

des cellules CD34+/CD31-



120

000 cellules/cm2, cultivées en milieu mixte et traitées avec un inhibiteur des jonctions gaps, l’AGA, ou son analogue peptidique GZA. Après 10 jours, le contenu intracellulaire en TGs

(A) ainsi que la longueur du réseau cellulaire positif pour le CD31 (B) ont été

évalués. Les valeurs sont exprimées en pourcentage du contrôle après avoir été

normalisées à

la quantité

d’ADN pour 3 à

4 expériences indépendantes. *P<0,05 vs GZA 10 µM

En perspective à ce travail, l’influence des MMPs sur le devenir des cellules

CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte est envisagé. En effet, nos résultats indiquent que

les cellules CD34+/CD31- isolées et cultivées en milieu adipogénique sécrètent les MMP-2 et

-9 et une inhibition de leur activité par le batimastat limite l’adipogenèse de ces cellules. Il

serait maintenant indispensable d’étudier les effets d’une inhibition des MMPs sur les

capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31-. L’influence directe de

la MEC et notamment de ses composants matriciels tels que la fibronectine, le collagène, la

gélatine sur les capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31-

cultivées en milieu mixte pourrait ensuite être déterminée. Ces études permettraient de définir

le rôle de la matrice et de sa dégradation dans le devenir des cellules progénitrices du TA

humain. Enfin, un troisième axe serait également intéressant et concerne l’influence de

facteurs paracrines sur le devenir de ces cellules. En effet, ces cellules contribuent

certainement à la croissance du TA en fournissant adipocytes et cellules endothéliales

nécessaires à son développement. Comme nous l’avons décrit dans l’introduction, le TA est

une source de nombreux facteurs ou adipokines, elles-mêmes originaires des différentes

populations cellulaires qui composent le TA. Ces sécrétions sont modulées au cours des

phases de croissance des dépôts adipeux. On peut donc se demander si ces adipokines

exercent un rôle dans le contrôle de la différenciation des cellules progénitrices. Ainsi,

l’influence des sécrétions par les autres types cellulaires du TA environnant les cellules

CD34+/CD31- tels que les macrophages, les cellules endothéliales, et les adipocytes matures

doit être envisagée par l’utilisation de milieu conditionnés en base ECBM (condition de

culture que nous avons vérifié comme étant favorable à la survie des cellules endothéliales,

macrophages et adipocytes matures isolés du TA humain) sur les cellules CD34+/CD31- en

milieu mixte.

79

Conclusions et perspectives

Ce travail de thèse a eu pour objectif de déterminer l’implication des MMPs dans la

différenciation des précurseurs adipocytaires humains. Nous avons démontré un rôle majeur

de l’activité des MMPs et plus particulièrement MMP-9 dans la différenciation adipocytaire

des cellules de la FSV du TA humain. De plus, MMP-9 pourrait être une cible de l’effet

inhibiteur des IPs-VIH sur la différenciation adipocytaire des cellules de la FSV du TA

humain. En effet, nous avons mis en évidence que les IPs-VIH diminuent l’expression et la

sécrétion de MMP-9. Les mécanismes impliqués dans cet effet passent en partie par une

inhibition de l’activité protéasomique des cellules de la FSV par les IPs-VIH, entraînant des

perturbations de la voie NF-κB, facteur de transcription impliqué dans l’expression génique

de MMP-9. L’étude des cibles moléculaires de MMP-9 impliquées dans les effets de cette

protéase sur la différenciation adipocytaire, telles que la dégradation des composants de la

MEC puisque celle-ci évolue au cours de la différenciation adipocytaire et/ou la

biodisponibilité de facteurs solubles qui modulent l’adipogenèse doit maintenant être

envisagé. De même les cibles cellulaires de MMP-9 au sein du TA doivent être mieux

définies.

L’ensemble de nos travaux a montré que la fraction cellulaire CD34+/CD31- contient

un pool de cellules progénitrices présentant une potentialité adipocytaire et endothéliale. A

présent, une nouvelle condition de culture permet simultanément l’étude des capacités

adipogéniques et angiogéniques de ces cellules. Cependant, il reste à déterminer si cette

population cellulaire CD34+/CD31- est constituée d’un mélange de cellules progénitrices

unipotentes ou de cellules bi ou multipotentes. Notons que, la différenciation in vitro en

adipocyte n’atteint jamais le pourcentage total de cellules, même si elle est nettement

supérieure aux cellules exprimant des marqueurs endothéliaux tels que le CD31. Cette

observation semble suggérer que les cellules CD34+/CD31- constituent une population

cellulaire hétérogène. Une expérience d’analyse clonale pourrait permettre de déterminer

l’homogénéité ou l’hétérogénéité de cette fraction cellulaire. Cependant ce type d’analyse est

basé sur l’évaluation des capacités angiogéniques et adipogéniques de cellules dérivées après

prolifération d’une cellule initiale. Or, l’effet de la prolifération sur le devenir cellulaire est à

définir étant donné que jusqu'à présent nos études ont été réalisées sur des cellules en culture

primaire non passagées. Nos résultats préliminaires sur les cellules CD34+/CD31- passagées

80

montrent une diminution des capacités angiogéniques alors que leur capacité adipogénique

est maintenue (données personnelles).

La présence de cette population cellulaire CD34+/CD31- au sein du TA humain pose

la question de leur provenance et de leur mobilisation potentielle. En effet, ces cellules

peuvent être résidentes et capable d’autorenouvellement, et/ou elles peuvent être recrutées à

partir des cellules progénitrices circulantes issues de la moelle osseuse comme l’ont suggéré

les travaux de Hong et al. (101). Différents types de signaux tels que le SDF-1 (stromal

derived factor-1) mais également MMP-9 ont été montrés comme participant au recrutement

des progéniteurs CD34+ avec un potentiel hématopoïétique et/ou hépatique dans le foie des

souris NOD/SCID après un dommage hépatique (128). On peut donc poser l’hypothèse d’un

rôle potentiel de MMP-9 sur le recrutement de cellules progénitrices circulantes au sein du

TA.

Une mobilisation potentielle des cellules CD34+/CD31- du TA est-elle possible ? Ces

cellules sont-elles capables de migrer et de quitter le TA ? Le phénomène de mobilisation a

été très étudié pour les cellules souches hématopoïétiques et consiste en leur libération depuis

la moelle osseuse jusqu'à la circulation sanguine. Cette mobilisation est stimulée par de

nombreux facteurs tels que le SDF-1 et le G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor). De

manière intéressante, ces facteurs entraînent la production de MMPs et notamment MMP-9

dans les cellules hématopoïétiques (50, 128). De plus, l’administration de ces composés à des

souris déficientes pour MMP-9 ne permet pas la mobilisation cellulaire (96). Les mécanismes

impliqués dans la migration des cellules souches vers la circulation sanguine passe par

l’augmentation des quantités solubles de kit ligand, une glycoprotéine transmembranaire,

induite par MMP-9 (96) qui permet non seulement la mobilisation des cellules progénitrices

dans la circulation mais aussi la prolifération et la migration des mastocytes dans le tissu

(97). Récemment notre groupe a montré que les cellules CD34+/CD31- migrent en réponse à

des milieux conditionnés par des cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+ du TA

humain. Cet effet est inhibé par la toxine pertussique (un inhibiteur de la protéine Gi) et par

un anticorps dirigé contre le CXCR4, le récepteur du SDF-1. De plus, nous avons mis en

évidence que les cellules endothéliales CD34+/CD31+ produisent et sécrètent du SDF-1 et

que les sécrétions des cellules endothéliales CD34+/CD31+ permettent l’expression des

capacités angiogéniques des cellules CD34+/CD31- (242). L’ensemble de ces résultats est

présenté en annexe dans la publication 3. Le rôle de MMP-9 dans la migration des cellules

CD34+/CD31- est à envisager d’autant plus que les expériences de migration des cellules

81

CD34+/CD31- présentés dans ce travail ont été réalisés sur un support de gélatine (données

personnelles).

Enfin, l’implication de MMP-9 in vivo reste à être définie. Afin de déterminer si les

effets de MMP-9 observés in vitro ont une signification physiologique ou physiopathologique

lors d’un développement ou d’une régression de TA, la caractérisation du TA et de ses

capacités d’extension dans un modèle original de souris invalidées pour le gène de MMP-9

(souris KO MMP-9) sont à envisager. Nos premiers résultats, obtenus sur les souris KO

MMP-9, sous tendent l’implication de cette métalloprotéase dans le développement du TA.

En effet, en conditions nutritionnelles standard, l’absence de MMP-9 est associée à une

diminution de 37% du TA sous cutané et de 27% du TA intra-abdominal (n=6), sans

variation de la masse corporelle totale par rapport aux souris contrôles. De plus, la quantité de

triglycérides stockés dans ces tissus est deux fois plus faible chez les souris KO MMP-9.

Suite à ces résultats, il nous apparaît nécessaire de mieux caractériser ce modèle. Pour cela,

dans un premier temps nous envisageons l’analyse du TA des souris KO MMP-9 aussi bien

dans sa structure que dans sa composition cellulaire et matricielle. En effet, il est important

de définir si la différence de masse adipeuse entre les souris KO MMP-9 et les souris

contrôles est due à une diminution du nombre et/ou de la taille des adipocytes matures. Des

éventuelles modifications de la vasculature, de la présence de macrophages et de la MEC

dans les TA des souris KO MMP-9 et contrôles seront recherchées. De la même manière, il

serait intéressant de définir la composition cellulaire de la FSV isolée des souris KO MMP-9

et contrôles. Enfin, l’isolement des différentes populations cellulaires de la FSV issues des

souris KO MMP-9 et contrôles, par l’utilisation de nanoparticules magnétiques couplées à

des anticorps d’intérêt ainsi que l’évaluation des capacités adipogéniques et angiogéniques in

vitro sur les cellules progénitrices ainsi obtenues pourraient être envisagé. Dans un second

temps, une cinétique de développement et/ou de régression du TA des souris KO MMP-9

pourrait être envisagée. L’étude des différents types cellulaires des TA et des composants

matriciels de ces souris devenues obèses ou maigres pourra être réalisée, comme

précédemment décrit .

Pour conclure, ce travail démontre l’importance des MMPs dans le processus de

différenciation adipocytaire des cellules progénitrices du TA humain. Les MMPs pourraient

ainsi contribuer au développement de la masse grasse. Bien que leur rôle exact reste à

déterminer les MMPs pourraient devenir de nouvelles cibles d’intérêt dans le développement

de traitements efficaces pour l’obésité et la lipoatrophie.

82

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Annexes

Publication 3 :

Chemotaxis and Differentiation of Human Adipose Tissue CD34+/CD31- Progenitor

Cells: Role of SDF-1 Released by Adipose Tissue Capillary Endothelial Cells

Coralie Sengenès, Alexandra Miranville, Marie Maumus, Sandra de Barros, Rudi Busse and

Anne Bouloumié. Stem Cells, 2007

Chemotaxis and Differentiation of Human Adipose Tissue CD34�/CD31� Progenitor Cells: Role of Stromal Derived Factor-1 Releasedby Adipose Tissue Capillary Endothelial Cells

CORALIE SENGENÈS,a ALEXANDRA MIRANVILLE,b MARIE MAUMUS,a SANDRA DE BARROS,a RUDI BUSSE,b

ANNE BOULOUMIÉa

aInstitut National de la Sante et de la Recherche Medicale, U858, AVENIR Team, I2MR, Paul Sabatier University,IFR31, Toulouse, France; bInstitute of Cardiovascular Physiology, Johann Wolfgang Goethe University,Frankfurt am Main, Germany

Key Words. Human CD34� cells • Stromal derived factor-1 • Endothelial differentiation • Chemotaxis • CXCR-4 • MatrigelMicrovasculature • Progenitor cells

ABSTRACT

The native CD34�/CD31� cell population present in thestroma-vascular fraction of human adipose tissue (hAT)displays progenitor cell properties since they exhibit adipo-cyte- and endothelial cell-like phenotypes under appropriatestimuli. To analyze the signals within hAT regulating theirphenotypes, the influence of hAT-derived capillary endothe-lial cells (CECs) was studied on the chemotaxis and differ-entiation of the hAT-CD34�/CD31� cells. Conditioned me-dium from hAT-CECs led to a strong chemotaxis of thehAT-CD34�/CD31� cells that was inhibited with pretreat-ments with pertussis toxin, CXCR-4 antagonist, or neutral-izing antibodies. Furthermore, hAT-CECs produced andsecreted the CXCR-4 ligand, that is, the stromal derivedfactor-1 (SDF-1). Finally, hAT-CECs induced the differen-

tiation of hAT-CD34�/CD31� cells toward an endothelialcell (EC) phenotype. Indeed, hAT-CECs and -CD34�/CD31� cell coculture stimulated in a two-dimensional sys-tem the expression of the EC CD31 marker by the hAT-progenitor cells and, in a three-dimensional approach, theformation of capillary-like structures via a SDF-1/CXCR-4dependent pathway. Thus, the migration and differentiationof hAT progenitor cells are modulated by hAT-CEC-derivedfactors. SDF-1, which is secreted by hAT-derived CECs, andits receptor CXCR-4, expressed by hAT-derived progenitorcells, may promote chemotaxis and differentiation of hAT-derived progenitor cells and thus contribute to the forma-tion of the vascular network during the development of hAT.STEM CELLS 2007;25:2269–2276

Disclosure of potential conflicts of interest is found at the end of this article.

INTRODUCTION

The excessive human adipose tissue (hAT) development isassociated with adipocyte hypertrophy and hyperplasia [1, 2] aswell as an extension of the capillary network [3–5]. The pro-cesses involved in the increased number of mature adipocytes aswell as the neovascularization within the fat mass are still to beclearly defined. We have described a cell population, present inthe native stroma-vascular fraction (SVF) of hAT, characterizedas positive for the hematopoietic stem cell marker CD34 andnegative for the endothelial cell marker CD31. The CD34�/CD31� cell population was the only cell population of the SVFunder adipogenic culture conditions among the capillary endo-thelial cells (CECs), the macrophages, and the cells negative forthe CD34, CD31, and CD14 markers able to express adipocyte-specific markers and metabolic lipolytic and lipogenic activities.Furthermore, under endothelial cell culture conditions, theCD34�/CD31� cells changed their morphology and organiza-tion and expressed endothelial cell (EC)-specific markers suchas CD31 and von Willebrand factor [5]. In vivo, their injectionled to an increase in blood flow and capillary density within the

ischemic muscle in the athymic mouse model of hindlimbischemia, whereas injection with native hAT-derived CD34�

cells exerted no effects [5]. Other laboratories have reportedsimilar proangiogenic abilities of the whole adipose tissue (AT)adherent SVF cells [6, 7]. The further characterization of thenative CD34�/CD31� cells has shown that they did not expressthe classic mesenchymal stem cell markers (CD105 and Stro-1)and displayed different features from the adult hematopoieticstem cells since they did not form blood colony in hematopoieticassays [8]. Thus, the native CD34�/CD31� cell population ofhAT can be considered a local pool of adipocyte as well asendothelial progenitor cells that might play a role in the forma-tion of adipocytes but also of capillaries accompanying thedevelopment of the fat mass. Since the microenvironment, thatis, soluble factors such as the stromal derived factor-1 (SDF-1)[9–11], cellular, and extracellular matrix components have beenshown to regulate the biology of hematopoietic and mesenchy-mal stem cells [12–14], the present study was undertaken tocharacterize the effects of signals arising from hAT microenvi-ronment on the chemotaxis and differentiation of the hATprogenitor cells. Our data delineate the concept that hAT-de-rived CECs induce the chemotaxis and support the endothelial

Correspondence: Coralie Sengenes, Ph.D., Team 1, “Vascular network, progenitor cells and immune cells from adipose tissue,” InstitutNational de la Sante et de la Recherche Medicale U858/I2MR, BP84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France. Telephone: �33 5 6114 5975;Fax: �33 5 6125 5116; e-mail: [email protected] Received March 14, 2007; accepted for publication May 17,2007; first published online in STEM CELLS EXPRESS May 24, 2007. ©AlphaMed Press 1066-5099/2007/$30.00/0 doi: 10.1634/stemcells.2007-0180

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differentiation potential of the hAT-derived progenitor cells viathe SDF-1/CXCR-4 axis within hAT.

MATERIALS AND METHODS

Isolation of the SVF from hATHuman AT was obtained from individuals undergoing plastic sur-gery by lipoaspiration. The study was approved by the ethicalcommittees of Toulouse and Frankfurt am Main hospital universi-ties. Subcutaneous AT was obtained from a total of 38 individuals(mean body mass index: 26.07 � 1.01 kg/m2). The AT was digestedusing collagenase (300 U/ml in phosphate-buffered saline [PBS],2% bovine serum albumin [BSA], pH 7.4) for 30 minutes underconstant shaking. Following removal of the floating mature adipo-cytes, the lower layer containing the SVF was centrifuged (300g, 10minutes) and the pellet resuspended in erythrocyte lysis buffer (155mmol/l NH4Cl; 5.7 mmol/l K2HPO4; 0.1 mmol/l EDTA, pH 7.3) for10 minutes. After successive filtrations through 100-, 70-, and40-�m sieves, the cells were resuspended in PBS/2% fetal calfserum (FCS).

Isolation of the CD34�/CD31� Progenitor Cells andthe CD34�/CD31� CECs from the SVF of hATCD34� cells were isolated from the SVF using CD34-coupledmagnetic microbeads as previously described [5]. Briefly, the SVFwas incubated (room temperature, 15 minutes) with the StemCellTechnologies (St. Katharinen, Germany, http://www.stemcell.com)positive selection cocktail. Following the addition of magneticnanoparticles, cells were recovered by successive magnetic sortingsteps. The CD34� cells were suspended in PBS/0.1% BSA. TheCD34� population was depleted from the CD31� cells using DynalBiotech (Hamburg, Germany, http://www.dynalbiotech.com) CD31-coupled magnetic microbeads (50 �l/ml). After incubation (4°C, 20minutes), the cell suspension containing the beads, suspended in 10ml of PBS/0.1% BSA, was exposed to the magnet for 1 minute. Themagnetic bead-free fraction, the CD34�/CD31� cells (hAT-derivedprogenitor cells), was collected, centrifuged (250g, 10 minutes), andsuspended in the culture medium and the CD34�/CD31� cellfraction (hAT-derived CECs) was removed from the magnet andsuspended in endothelial cell culture medium. The CD34�/CD31�

cell content of the selected fraction was 92.2% � 1.2%.

Cell CultureThe hAT-derived CECs were cultured in Endothelial Cell GrowthMedium MV (ECGM-MV) (PromoCell, Heidelberg, Germany,http://www.promocell.com) on human fibronectin coated culturedishes. Human AT-derived CECs were used until passage 2 [5, 15].The human AT-derived progenitor cells were cultured in Endothe-lial Cell Basal Medium (ECBM, which contains no growth factors)(PromoCell) supplemented with 10% FCS. Progenitor cells wereused until passage 1 [5]. Human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were isolated [16] and cultured until passage 8.

Preparation of Conditioned Media and Enzyme-Linked Immunosorbent AssayHuman AT-derived CECs, hAT-derived progenitor cells, hAT-res-ident macrophages (CD14�/CD31�) that were isolated as previ-ously described [15], and HUVECs were incubated with an equalamount of basal ECBM supplemented with 0.1% BSA for 24 hours.Mature adipocytes (400,000 cells) were included in fibrin gels (1.5mg fibrinogen/ml ECBM supplemented with 25 units/ml �-throm-bin) and cultured in ECBM supplemented with 0.1% BSA for 24hours. Control gels were prepared without adipocytes. The condi-tioned media were collected, centrifuged (1,000g, 10 minutes, 4°C),and stored at �70°C until use. Release of SDF-1 was measured inconditioned media by enzyme-linked immunosorbent assay accord-ing to the instructions of the manufacturer (RayBiotech Inc.,Norcross, GA, http://www.raybiotech.com). Note that the SDF-1levels were measured in conditioned media from P0, P1, and P2

human AT-derived CECs and no statistical significant differenceswere found (not shown).

Transmigration AssayTransmigration assays of hAT-derived progenitor cells were per-formed using 8-�m pore HTS FluoroBlock inserts (Falcon; BDBiosciences, San Diego, http://www.bdbiosciences.com) coatedwith bovine gelatin (0.15 mg/cm2). The progenitor cells wereloaded at 50,000 cells per insert (upper chamber) and conditionedmedia, SDF-1 in the presence or not of AMD3100 (Sigma-Aldrich,St. Louis, http://www.sigmaaldrich.com) or CXCR-4 neutralizingantibody (clone 12G5; R&D Systems Inc., Minneapolis, http://www.rndsystems.com), were added to the lower chamber. The cellswere allowed to migrate into the lower chamber for 20–24 hours.After the assays, the inserts were fixed (4% paraformaldehyde) andthe nuclei were stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole. Forblocking experiments, the progenitor cells were preincubated withthe indicated inhibitors at 37°C for 1 hour. The cell transmigrationwas quantified by counting the number of nuclei using a computer-assisted microscope (Nikon, Dusseldorf, Germany, http://www.nikon.com) at three distinct positions.

RNA Extraction and Real-Time QuantitativePolymerase Chain Reaction AssayTotal RNAs were extracted from human mature adipocytes, hAT-CD34�/CD31� cells, hAT-macrophages, and hAT-CD34�/CD31�

CECs using the RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Germany, http://www1.qiagen.com). RNA concentrations were determined using afluorometric assay (RiboGreen). RNA (0.5 �g) was reverse-tran-scribed using the SuperScript III RNase H RT system (Invitrogen,Carlsbad, CA, http://www.invitrogen.com) according to the manu-facturer’s instructions (random hexamers and deoxynucleoside-5�-triphosphates were from Life Technologies, Rockville, MD, http://www.lifetech.com). Reverse transcription was also performedwithout superscript enzyme on RNA samples to ensure the absenceof contaminating genomic DNA. Primers for human SDF-1(CXCL12), hypoxia inducible factor-1� (HIF-1�), and CXCR-4were provided by Applied Biosystems (Assay-On-Demand:Hs00171022_m1, Hs00153153_m1, and Hs00607978_m1, respec-tively; Foster City, CA, http://www.appliedbiosystems.com). Allamplification reactions were performed in duplicate from 20 ngcDNA using the Mx4000 Multiplex Quantitative PCR System(Stratagene, La Jolla, CA, http://www.stratagene.com) using thefollowing conditions: 50°C for 2 minutes and 95°C for 10 minutesfollowed by 40 cycles at 95°C for 15 seconds and 60°C for 1minute. Results were analyzed with Stratagene MX4000 software,and all values were normalized to the levels of the ribosomal RNAs.

Coculture Between hAT-Derived CECs andhAT-Derived CD34�/CD31� Progenitor CellsHuman AT-derived CECs plated at 60,000 cells per cm2 werecultured in ECGM-MV on human fibronectin-coated 48-well cellculture plates until confluence. Then, hAT-derived progenitor cellswere labeled with PHK26 according to the instructions of themanufacturer (Sigma-Aldrich) and 2,000–3,000 cells per well wereplaced in each well in ECBM/2% SVF. After 10 days of coculture,the cocultured cells were fixed and stained with the indicatedantibodies.

Three-Dimensional Coculture ModelHuman AT-derived CECs plated at 60,000 cells per cm2 werecultured in ECGM-MV on human fibronectin-coated 48-well cellculture plates. Once confluent, the hAT-CECs were covered with200 �l of unpolymerized BD Matrigel Matrix Growth Factor Re-duced (BD Biosciences) and incubated at 37°C for 30–45 minutes.Human AT-derived progenitor cells were harvested with trypsin andlabeled with PHK26 according to the instructions of the manufac-turer. The progenitor cells were resuspended in ECBM/0.1% BSAand 2,000–3,000 cells per well were loaded onto the matrigel-coated wells (200 �l of cell suspension per well). After 24 hours of“coculture,” progenitor cell tube formation (red fluorescent net-

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work) was assessed with a computer-assisted microscope (Nikon).Microphotographs of the center of each well were taken, and tubeformation was quantified by measuring the total tube length usingLucia image software (Nikon, Tokyo, http://www.nikon.com). Tubeformation of progenitor cells alone was used as a control. Forblocking experiments, the progenitor cells were preincubated withthe indicated inhibitors at 37°C for 1 hour.

ImmunocytochemistryCells were fixed with 4% paraformaldehyde and immunostainedwith anti-human CXCR-4 monoclonal antibody (Abcam, Cam-bridge, U.K., http://www.abcam.com) (1:50) or platelet endothelialcell adhesion molecule-1 (CD31) monoclonal antibody (Dako,Glostrup, Denmark, http://www.dako.com) (1:10) followed bystaining with fluorescently labeled secondary antibody (1:200) (In-vitrogen).

Statistical AnalysisData are expressed as mean � SEM from at least three independentexperiments. Statistical analysis was performed by Student’s t testor one-way analysis of variance followed by a Bonferroni post hoctest when appropriate. Differences were considered significantwhen p � .05.

RESULTS

AT-Derived CECs Induce the Chemotaxis of theCD34�/CD31� CellsThe effect of hAT-CECs on the migration of hAT-derived CD34�/CD31� cells was assessed in modified Boyden chamber assaysconsisting of two cell chambers separated by a polycarbonate filter(8-�m pores). The lower chamber was filled up with control mediaor 24 hour-conditioned media from confluent hAT-CECs, matureadipocytes, or confluent HUVECs, and the cell suspension ofhAT-derived CD34�/CD31� cells was placed in the upper cham-ber. Cells that migrated across the filter and attached to the underpart of the filter after 24 hours were counted after nuclei staining.As depicted in Figure 1A, conditioned media from mature adipo-cytes or from HUVECs did not induce any cell migration. Con-versely, conditioned media from hAT-CECs led to the robustmigration of the CD34�/CD31� cells (5.7 � 0.7-fold increase, n �21, p � .001). Human AT-CEC conditioned media failed to inducethe migration of hAT-derived CD34�/CD31� cells after proteindenaturation of the conditioned media (Fig. 1B). Moreover, thestimulatory effect of conditioned media derived from hAT-CECswas lost when the conditioned media were applied in the upperchamber together with the CD34�/CD31� cells. Taken together,the results showed that secreted proteins from hAT-CECs stimu-lated the directed chemotactic migration of the hAT-derivedCD34�/CD31� (Fig. 1B). In addition, preincubation of hAT-de-rived progenitor cells with increasing concentrations of pertussistoxin (PTX) (200 and 400 ng/ml) led to a concentration-dependentinhibition of the hAT-CEC-mediated migration (76% � 9% ofinhibition for 400 ng/ml of PTX, p � .001, n � 4) (Fig. 1B).

The CXCR-4/SDF-1 Axis Is Involved in theChemotaxis of the CD34�/CD31� Cells Mediated byAT-Derived CECsTo further identify the nature of the factor(s) involved in suchan effect, the CD34�/CD31� cells were preincubated with aCXCR-4 antagonist (AMD3100, 10 �g/ml) or with neutralizinganti-CXCR-4 antibody (10 �g/ml), and the effect of hAT-CECconditioned media was then assessed. As shown in Figure 2, the

Figure 1. Human adipose tissue (AT)-derived CECs induce the che-motaxis of hAT-derived CD34�/CD31� progenitor cells. (A): Trans-well migration of human AT-derived progenitor cells in the presence ofcontrol medium (Control) or conditioned media from adipocytes (n �14), hAT-CECs (n � 21), and HUVECs (n � 3). � p � .001 whencompared with control migration. (B): Transwell migration of hAT-derived progenitor cells in response to hAT-CEC conditioned mediumin the lower chamber (hAT-CEC conditioned medium), in the upperchamber (upper chamber hAT-CECs) (n � 3), after 1-hour preincuba-tion with increasing concentrations of pertussis toxin (n � 4) or afterprotein denaturated hAT-CEC-conditioned medium (heated AT-CECs)(n � 4). � p � .01, �� p � .001 when compared with migration inducedby hAT-CEC-conditioned medium. Abbreviations: CECs, capillary en-dothelial cells; hAT, human adipose tissue; HUVECS, human umbilicalvein endothelial cells; PTX, pertussis toxin.

Figure 2. The stromal derived factor-1/CXCR-4 axis is involved in thehAT-derived progenitor cell chemotaxis toward hAT-CEC conditionedmedia. Transwell migration of hAT-derived progenitor cells in thepresence of hAT-derived CEC-conditioned media after 1 hour of pre-incubation with 10 �g/ml of the CXCR-4 antagonist AMD3100(�AMD3100) (n � 6) or with 10 �g/ml of an anti-CXCR-4 neutralizingantibody (�Anti-CXCR-4) (n � 6). � p � .01 when compared withmigration induced by hAT-CEC-conditioned media. Abbreviations:CECs, capillary endothelial cells; hAT, human adipose tissue.

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hAT-CEC-mediated chemotaxis was suppressed when the pro-genitor cells were incubated with AMD3100 or with anti-

CXCR-4 neutralizing antibody (77% � 11% and 96% � 4% ofinhibition, respectively, p � .01, n � 6). Moreover, as depictedin Figure 3A, increasing concentrations of recombinant SDF-1�or -1�, ligands for the CXCR-4, induced a concentration-depen-dent chemotaxis of hAT-derived progenitor cells that was sig-nificantly inhibited when the progenitor cells were preincubatedwith AMD3100 (58% � 7% of inhibition, p � .01, n � 3) orneutralizing anti-CXCR-4 antibody (72% � 3% of inhibition,p � .01, n � 3) (Fig. 3B). Of note, the chemotaxis of theCD34�/CD31� cells toward granulocyte monocyte colonystimulating factor (20–100 ng/ml), stem cell factor (20–100ng/ml), monocyte chemoattractant protein 1 (1–20 ng/ml), andinterleukin 8 (20 ng/ml) was also evaluated, and none of thechemokines induced a statistically significant migration (datanot shown).

CXCR-4 Is Expressed on CD34�/CD31� Cells andSDF-1 Is Produced by hAT-Derived CECsThe expression of CXCR-4 in hAT-derived CD34�/CD31�

cells was then investigated by real-time polymerase chain reac-tion (PCR) analysis. The results showed that transcripts forCXCR-4 were present in hAT-derived CD34�/CD31� cells(Fig. 4B). Moreover, as presented in Figure 4A, the CXCR-4protein expression was detected by immunocytochemistry onhAT-CD34�/CD31� cells. Additionally, there was a positivecorrelation between the level of transcripts encoding forCXCR-4 in hAT progenitor cells and the one of HIF-1� in thecorresponding hAT-CECs (Fig. 4B, p � .04, n � 14). Inparallel, SDF-1 mRNA expression was assessed in hAT-derivedCECs and compared with the one of HUVECs and other cellsfrom the SVF such as hAT-macrophages. As depicted in Figure4C, the SDF-1 mRNA was mainly expressed by hAT-derivedCECs and was below Ct values of 40 in HUVECs. Consistentwith the mRNA expression, SDF-1 release was significantlyhigher in hAT-derived CECs as compared with other cell frac-tions present in AT-derived SVF such as macrophages (412.2 �92.9 pg/ml vs. 34.4 � 18.1 pg/ml, respectively, p � .001, n �3–9) (Fig. 4D). The production of SDF-1 by HUVECs was 42

Figure 3. Functionality of the CXCR-4/SDF-1 axis in human adiposetissue. (A): Human adipose tissue (AT)-derived progenitor cells wereexposed to increasing concentrations of SDF-1� or SDF-1� (10–100ng/ml), and transwell migration was evaluated after 24 hours (n � 3–8);� p � .01 and �� p � .001 compared with control. (B): HumanAT-derived progenitor cells were preincubated (1 hour) with 10 �g/mlCXCR-4 antagonist AMD3100 (n � 3) or with 10 �g/ml anti-CXCR-4neutralizing antibody (n � 3). Transwell migration toward 100 ng/mlSDF-1� was then evaluated after 24 hours. $ p � .001 compared withcontrol, � p � .01 and �� p � .001 compared with SDF-1� inducedmigration. Abbreviation: SDF-1, stromal derived factor-1.

Figure 4. Expression of SDF-1 andCXCR-4 in hAT. (A): Upper panel: hAT-derived CD34�/CD31� progenitor cellswere fixed and stained with antibodies di-rected against CXCR-4 receptor followedby fluorescein isothiocyanate (FITC)-con-jugated secondary antibodies. Lower panel:hAT-CD34�/CD31� cells were stainedwith FITC-conjugated secondary antibodies.Representative fluorescence microscopyanalysis is shown from n � 3. (B): Correla-tion between mRNA levels of CXCR-4 inhAT-progenitor cells and HIF-1 levels inhAT-CECs quantified by real-time polymer-ase chain reaction (PCR) experiments (p �.04, n � 14). (C): SDF-1 mRNA expressionin hAT-macrophages (n � 3), HUVECs(n � 4), and hAT-CECs (n � 6) quantifiedby real-time PCR experiments. (D): En-zyme-linked immunosorbent assay of 24-hour conditioned media from hAT-macro-phages (n � 3), HUVECs (n � 4), andhAT-CECs (n � 9). � p � .05 versus mac-rophage SDF-1 secretion. Abbreviations:A.U., arbitrary units; CECs, capillary endo-thelial cells; hAT, human adipose tissue;HIF-1, hypoxia inducible factor-1; HUVECS,human umbilical vein endothelial cells;SDF-1, stromal derived factor-1.


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times lower than the one of hAT-CECs (9.84 � 3.81 pg/ml,n � 4).

AT-Derived CECs Support the Differentiation ofAT-Derived Progenitor Cells Toward an EndothelialCell PhenotypeCoculture experiments of hAT-derived CECs and CD34�/CD31� cells were performed. Human AT-derived CD34�/CD31� cells were labeled with PKH26 and seeded onto con-fluent hAT-derived CECs (Fig. 5A). After 10 days of coculture,CD31 expression in the formal CD31 negative AT-derivedprogenitor cells (Fig. 5B) was analyzed. hAT-derived CECsformed a dense CD31 positive network into which PKH26positive AT-derived progenitor cells incorporated and expressedthe CD31 marker (Fig. 5C). To further analyze the effect of thehAT-derived CECs on the differentiation of the CD34�/CD31�

cells, a three-dimensional coculture model was developed.PKH26 labeled CD34�/CD31� cells were seeded on the top of

a growth factor-reduced matrigel under which confluent hAT-derived CECs were present or not. As shown in Figure 6A,CD34�/CD31� cells alone did neither migrate nor form capil-lary-like structures. Interestingly, the presence of hAT-derivedECs under the matrigel dramatically promoted the organizationof hAT-CD34�/CD31� cells into branched structures andpseudotubes (360% � 48% of the total length obtained withhAT-CD34�/CD31� cells alone, p � .01, n � 7) (Fig. 6B).Given the chemotactic effect mediated by the CXCR-4/SDF-1axis, we studied the involvement of this system in the hAT-CEC-dependent tube formation by using a neutralizing anti-CXCR-4 antibody, the CXCR-4 antagonist AMD3100, or per-tussis toxin (not shown). As depicted in Figure 6C and 6D, thetube formation induced by hAT-derived CECs was significantlyinhibited in a concentration-dependent manner by the inhibitors(24% � 12% and 67% � 5% of inhibition with 10 �g/ml and100 �g/ml AMD3100, respectively; 41% � 15% and 93% �2% of inhibition for 10 �g/ml and 20 �g/ml neutralizing anti-CXCR-4 antibody, respectively; 85% � 0.5% of inhibition for200 ng/ml pertussis toxin, n � 4–7).

DISCUSSION

Although reports show that adipogenesis and angiogenesis aretightly correlated during the growth of fat mass [3, 17–20], littleis known about the mechanisms that regulate the extension of itsvasculature. In the present study we report that hAT-derivedCECs induce the chemotaxis of hAT-derived progenitor cells.Moreover, we demonstrate that the presence of hAT-derivedCECs promotes the differentiation and organization of hAT-derived hAT-CD34�/CD31� progenitor cells into capillary-likestructures via a SDF-1/CXCR-4-dependent pathway.

In the last years, several reports have contributed to theevidence that the SVF cells are phenotypically heterogeneousand can express under specific culture conditions adipogenic,osteogenic, chondrogenic, and myogenic lineage markers butalso endothelial, epithelial, and neural markers [5, 8, 21–23].We have previously shown that native immunoselected CD34�/CD31� cells present in the hAT-derived SVF display angio-genic and adipogenic potentials. Indeed, this cell population isable to differentiate into adipocyte-like cells [8] and into endo-thelial-like cells in vitro and in vivo to promote the neovascu-larization of ischemic muscle in mice [5]. Similar results werealso described using adherent hAT-SVF [6, 7]. The mechanismsunderlying such proangiogenic effects are still to be defined.Although the hAT-derived progenitor cells were shown to inte-grate into vessels in vivo [5, 6], they could also contribute toneovascularization through the production of proangiogenic fac-tors [7, 24]. Nevertheless, such a population of progenitor cellsmay participate locally to the extension of the blood capillarynetwork known to be associated with fat mass development. Thepresent study was undertaken to analyze the potential crosstalkwithin the hAT between hAT-CD34�/CD31� progenitor cellsand CECs. Indeed, the EC barrier has already been shown tointeract with progenitor/stem cells [25–27]. Human AT-derivedCECs specifically stimulated the migration of hAT-derivedCD34�/CD31� progenitor cells through the release of solubleproteins. Human AT-derived CECs induced a chemotactic re-sponse since no random motility was observed when the cellswere incubated in the same compartment with endothelial cell-derived conditioned media. Moreover, since hAT-derivedCD34�/CD31� progenitor cell chemotaxis was inhibited in thepresence of pertussis toxin, which specifically prevents activa-tion of Gi proteins coupled to chemokine receptors, the involve-ment of a chemokine ligand/receptor interaction was strongly

Figure 5. Human AT-derived progenitor cells incorporate into thenetwork formed by hAT-CECs and express platelet endothelial celladhesion molecule-1 (PECAM-1). (A): Confluent hAT-CECs werefixed and stained with antibodies directed against PECAM-1 followedby fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated secondary antibodies.(B): Confluent PKH26 hAT-CD34�/CD31� progenitor cells werefixed and stained with antibodies against PECAM-1 followed by FITC-conjugated secondary antibodies. (C): Confluent hAT-CECs were cul-tured in the presence of PKH26-labeled hAT-derived progenitor cellsfor 10 days of coculture in endothelial basal medium/2% fetal calfserum. Cells were fixed and stained with antibodies directed againstPECAM-1 followed by FITC-conjugated secondary antibodies. Repre-sentative fluorescence microscopy analysis is shown from n � 3 inde-pendent experiments. Abbreviations: CECs, capillary endothelial cells;DAPI, 4,6-diamidino-2-phenylindole; hAT, human adipose tissue.


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suggested. Finally, when CXCR-4 from hAT-CD34�/CD31�

progenitor cells was neutralized by antibodies [28] or by theCXCR-4 antagonist (AMD3100) [29], hAT-derived CD34�/CD31� progenitor cells failed to migrate in response to hAT-derived CEC conditioned medium. Since real-time PCR andimmunocytochemistry analyses showed the expression ofCXCR-4 in native hAT-derived CD34�/CD31� progenitorcells, the present results demonstrate that activation of CXCR-4of the hAT-derived CD34�/CD31� progenitor cells is involvedin the hAT-derived CEC-dependent chemotaxis. In agreement,earlier work reported immunoreactivity to CXCR-4 in hAT [30],and a recent publication showed that CXCR-4 overexpression inhAT-stromal cells regulated cell motility [31]. The sole ligandof CXCR-4, described so far, is the CXCL12 chemokine alsoknown as SDF-1 [32–34]. SDF-1, initially described as a prod-uct of bone marrow stromal cells [35], is expressed by severaltissues including dendritic cells, endothelial cells and pericytesfrom normal skin [36], osteoblasts, and ECs from the bonemarrow [37–39] and astrocytes and neurons from the brain [40].SDF-1 exists as two isoforms, � and �, originating from alter-native splicing of the CXCL12 gene [41–43]. Human AT-CECs

expressed and released more SDF-1 than the other cell typespresent in hAT. Moreover, SDF-1 was detected in very lowamounts in conditioned media from HUVECs that did notstimulate the CD34�/CD31� progenitor cell chemotaxis. Hu-man AT-progenitor cells exhibited a concentration-dependentchemotaxis toward SDF-1� and SDF-1� that was inhibited inthe presence of CXCR-4 antagonist or neutralizing antibodies.Taken together, the present findings suggest that SDF-1 releasedby hAT-CECs plays a major role in the CXCR-4-mediatedchemotaxis of hAT-progenitor cells, although further experi-ments are needed to clearly rule out the involvement of otherendothelial-derived factors. The couple SDF-1/CXCR-4 plays apivotal role in multiple checkpoints of stem/progenitor cellbiology in the bone marrow compartment including survival,proliferation, mobilization, and homing [10, 44, 45]. In a two-dimensional coculture system, hAT-derived progenitor cellswere shown to incorporate into the network formed by hAT-CECs and to express the EC marker CD31, suggesting thathAT-CECs may, in addition to their effect on the migration,regulate the differentiation of hAT-CD34�/CD31�. To betterdefine the role of paracrine factors, three-dimensional coculture

Figure 6. hAT-CECs induce the forma-tion of capillary-like structures by hAT-derived progenitor cells via the stromalderived factor-1/CXCR-4 axis. hAT-CECswere cultured until confluence. Once con-fluent, hAT-CECs were covered with ma-trigel and PKH26 labeled hAT-derivedprogenitor cells were seeded onto the ma-trigel. After 24 hours, tube length wasmeasured. (A): Representative pictures ofhAT-derived progenitor cells alone (phasemicroscopy and fluorescent microscopyanalyses, inset picture). (B): Representa-tive picture of hAT-derived progenitorcells cocultured with hAT-CECs (phasemicroscopy and fluorescent microscopyanalyses, inset picture). (C, D): Represen-tative picture of 1-hour pretreated hAT-progenitor cells with AMD3100 (100 �g/ml) (C) or neutralizing anti-CXCR-4 (20�g/ml) antibody (D) that were coculturedwith hAT-CECs (phase microscopy andfluorescent microscopy analyses, inset pic-ture). (E): Total length of the networkformed by PKH26 labeled hAT-derivedprogenitor cells pretreated or not with in-creasing concentrations of AMD3100 or aneutralizing CXCR-4 antibody. � p � .05,�� p � .01, �� p � .001 when comparedwith the network formed by adipose tissue(AT)-derived progenitor cells in the pres-ence of AT-CECs (n � 4–7). Abbrevia-tions: 3D, three-dimensional; CECs, capil-lary endothelial cells; hAT, human adiposetissue.


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experiments were performed. The results clearly showed thathAT-derived progenitor cells migrate and assemble into capil-lary-like structures only in the presence of hAT-CECs. More-over, when CXCR-4 either was antagonized or neutralized,hAT-progenitor cells failed to appropriately migrate and assem-ble into tubular structures on matrigel substrate.

Taken together, the present results show that hAT-derivedCECs, through their production of paracrine factors such asSDF-1, modulate the migration but also the differentiation andorganization of the hAT-derived CD34�/CD31� progenitorcells through the activation of CXCR-4. CXCR-4 mRNA levelsare known to be upregulated by hypoxia through HIF-1 activa-tion via the hypoxia responsive element in the 5� region of theCXCR4 gene [46, 47]. In the murine AT, hypoxic areas havebeen shown to be associated with obesity [48]. Interestingly, themRNA levels of CXCR-4 from the CD34�/CD31� were foundto be positively correlated to HIF-1� transcripts of the CECs. Arecent publication has reported that the recruitment of CXCR-4positive progenitor cells to regenerating foci or tissues wasmediated by hypoxic gradients via HIF-1 induced expression ofCXCR-4/SDF-1 axis [28]. Moreover, SDF-1 expression in isch-emic tissue has been shown to primarily localize in ECs [36]. Itis thus tempting to speculate that hypoxia within the hAT maypromote the migration of resident hAT-derived CD34�/CD31�

progenitor cells at active sites of neovascularization in the fatmass.

All together, the present results show that the migration anddifferentiation of hAT-derived progenitor cells are modulatedby factors originating from hAT-derived CECs. The SDF-1/CXCR-4 axis appears to play a key role. Such an effect may beinvolved in the recruitment of hAT-derived progenitor cells tofoci where SDF-1 is highly expressed such as neovasculariza-tion sites to promote the extension of the capillary network thatoccurs during the growth of the fat mass.

ACKNOWLEDGMENTS

We are grateful to Valerie Wegner and Pauline Decaunes fortheir excellent technical assistance. We also thank Dr. MarieSanson for her special help with HUVECs. This work wassupported by grants from AVENIR INSERM, Alexander vonHumboldt Foundation, and Sofja Kovalevskaja Price (HumboldtFoundation and the German Federal Ministry of Education andResearch).

DISCLOSURE OF POTENTIAL CONFLICTS

OF INTEREST

The authors indicate no potential conflicts of interest.

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Titre et résumé en anglais

Matrix metalloproteases 2 and 9 and the differentiation of human adipose

tissue progenitor cells

Human adipose tissue (AT) has long attracted attention because of its capacity for

excessive development and regression. Cellular and matrix remodelling can explain human

AT plasticity. The matrix metalloproteinase (MMP) family is considered to play a major role

in tissue remodelling. In a previous report, we demonstrated that the stroma-vascular fraction

(SVF) of human AT produce and release MMP-2 and -9 during adipocyte differentiation in

vitro. In this work, we evidenced that decrease of MMP-9 activity by batimastat and

expression by HIV protease inhibitors decrease adipocyte differentiation of SVF cells. We

showed that the way in which HIV protease inhibitor affect MMP-9 expression involve

perturbations of proteasome and transcription factor NF-κB activities. Since the SVF of

human AT represents a heterogeneous cell population containing capillary endothelial cells,

inflammatory cells and progenitor cells that are able, under appropriate culture conditions, to

express adipogenic and angiogenic abilities, we would like to determine MMP-9 involvement

in the fate of progenitor cells. We defined a new culture condition in which progenitor cells

express simultaneously adipogenic and angiogenic abilities. These data strongly suggests that

MMP-9 modulate the differentiation of human progenitor cells and contribute to human AT

remodelling and thus in this excessive development and/or regression.

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Auteur : Sandra DE BARROS

Titre : Les métalloprotéases matricielles 2 et 9 et la différenciation des cellules progénitrices

du tissu adipeux humain

Directeur de thèse : Dr Jean GALITZKY

Lieu et date de soutenance : Toulouse, le 29 octobre 2007 Résumé : Le tissu adipeux (TA) peut se développer de manière excessive (obésité) mais

aussi régresser (lipoatrophie). Cette plasticité peut s’expliquer par un remodelage cellulaire et

matriciel. Les métalloprotéases matricielles (MMPs) sont des acteurs majeurs du remodelage

tissulaire. Des travaux précédents menés au sein de l’équipe ont montré que les cellules de la

fraction stroma vasculaire (FSV) du TA humain sécrètent les MMP-2 et -9 au cours de la

différenciation adipocytaire in vitro. Durant ce travail, nous avons observé que l’inhibition de

l’activité de MMP-9 par le batimastat et de son expression par les inhibiteurs de la protéase

du VIH limite la différenciation adipocytaire des cellules de la FSV. L’étude des mécanismes

moléculaires responsables de la diminution de l’expression de MMP-9 par les inhibiteurs de

la protéase du VIH a montré que l’expression de MMP-9 est régulée par une voie impliquant

l’activité du protéasome et le facteur de transcription NF-κB. Sachant que la FSV est une

population cellulaire hétérogène contenant des cellules endothéliales, des cellules immuno-

inflammatoires et des cellules progénitrices aux capacités adipogéniques et angiogéniques,

nous avons souhaité déterminer l’implication de MMP-9 dans le devenir des cellules

progénitrices. Pour cela, une condition de culture permettant simultanément l’expression des

capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules progénitrices a été mise au point.

L’ensemble de ce travail indique que MMP-9 influence la différenciation des cellules

progénitrices du TA humain et contribuent au remodelage du TA lors de son développement

et/ou de sa régression. Mots clés : tissu adipeux, MMP, adipogenèse, cellules progénitrices Discipline : Innovation pharmacologique Intitulé et adresse du laboratoire :

Equipe 1/Avenir - Réseau vasculaire, cellules progénitrices et cellules immnunitaires du tissu

adipeux- INSERM U858/I2MR, 37 Allées Jules Guesde, 31000 Toulouse

Documents

Les métalloprotéases matricielles 2 et 9 et la ...thesesups.ups-tlse.fr/62/1/De_Barros_Sandra._pdf.pdf · Remerciements En préambule à ce travail, je tiens à exprimer toute ma