Lundi 21 novembre 2011

UE7

Séverine Létuvé

Ronéotypeurs :Amandine Poinot

Et Caroline Pibault

LA TRANSDIFFERENCIATION

PLAN DU COURS

I-Généralités

A-Les implications

B-Différents types de transdifférenciation

C-Les implications de la TEM en pathologie et physiologie humaines

D- Stimuli inducteurs de la TEM

II- Signalisation intracellulaire de la TEM

III- Les marqueurs de la TEM

A-Les plus fréquemment utilisés sont liés à une :

B-Nouveaux marqueurs de phénotype: les miRNAs

C-Les ZEBs

IV- Mise en évidenc de la transdifférenciation

A-Les outils de mise en évidence de la transdifférenciation

B- Mise en évidence in vitro de la TEM

1- Détection d’une capacité migratoire accrue : expérience de la chambre de

Boyden

2-Mise en évidence de la TEM par immunofluorescence des cellules

bronchiques immortalisées

3-Mise en évidence de la TEM des cellules bronchiques primaires

4-Mise en évidence par Western Blot et par qPCR de l’expression des

marqueurs de TEM au niveau des cellules épithéliales bronchiques

5-Signalisation intracellulaire de la TEM au niveau des cellules épithéliales

bronchiques humaines

6-Implication des facteurs de transcription Snail et ZEB1 dans la TEM des

cellules épithéliales bronchiques

C-Outils de détection in vivo de la transdifférenciation

D-Mise en évidence in vivo de la transdifférenciation: modèles animaux

Conclusion

I-Généralités

Définition : la transdifférenciation est la conversion d’une cellule différenciée en un autre

type cellulaire.

Une cellule polarisée, sous l’effet de l’environnement peut acquérir une nouveau phénotype

cellulaire.

Cette plasticité cellulaire implique une modification

- de morphologie

- de fonction

La transdifférencation peut être un phénomène

- Direct

- impliquant une dédifférentiation

- nécessitant le passage par un intermédiaire (cellule souche)

Mise en évidence historique d’une transition de phénotype: apparition du sillon primitif

au cours de l’embryogenèse

Les cellules de l’épiderme perdent leur adhésion et migrent dans l’hypoderme lors de la

gastrulation.

A-Les implications

Implication en pathologie humaine

• Conversion des cellules endothéliales et des fibroblastes en cellules

musculaires vasculaires et myofibroblastes ( SMA+): hypertension

pulmonaire artérielle

• Conversion des cellules étoilées du foie en myofibroblastes

Application en thérapie cellulaire

• Conversion des cellules du pancréas (glucagon +) en cellules (insuline +):

régénération tissulaire en réponse à la disparition massive des cellules

(modèle de diabète type I)

• Plasticité des cellules souches mésenchymateuses: différenciation en cellules

d’autres lignages (cellules , neurones, cellules musculaires cardiaques…)

B-Différents types de transdifférenciation

• Transition épithélio-mésenchymateuse (TEM= Epithelial- mesenchymal transition,

EMT/ métaplasie):

Génération de cellules capables de migrer à partir de cellules épithéliales

- différenciation en cellules mésenchymateuses, fibroblastes

- acquisition de propriétés de cellules souches

• Mésenchymal- epithelial transition (MET): phénomène inverse de la TEM

Ex: formation des somites/embryogenèse

• Endothelial- mesenchymal transition (EndoMT): acquisition d’un phénotype

mésenchymateux par les cellules endothéliales

C-Les implications de la TEM en pathologie et physiologie humaines

• Initialement décrite dans le cadre de l’embryogenèse

TEM de type I

• Mise en évidence dans les phénomènes de réparation tissulaire et les pathologies à

composante fibrotique (rejet de greffe, fibrose rénale, fibrose pulmonaire

idiopathique…)

TEM de type II

• Impliquée dans la dissémination des cellules épithéliales tumorales (métastases)

TEM de type III

Polarité apico-basale Phénotype statique

Jonctions

adhérentes + serrées

E-cadhérine

Cytokératines

Absence de polarité Extensions membranaires

Réorganisation du

cytosquelette

Cytokératines Vimentine

-caténine nucléaire

Polarité ‘avant-arrière’ Phénotype migratoire

Absence de jonctions

intercellulaires

Production de matrice extracellulaire

et médiateurs fibrogéniques

Phénotype épithélial Phénotype métastable

Phénotype mésenchymateux

D- Stimuli inducteurs de la TEM

La cellule arrive dans un nouvel environnement et va devoir survivre par l’expression de

molécules d’adhérence.

Les stimuli pouvant induire la TEM sont :

• Facteurs solubles (facteurs embryogéniques, médiateurs inflammatoires: TGF-,

PDGF, EGF, FGF-2, IGF-BP5)

• Réarrangements matriciels (ex: matrice fibrillaire vs. Laminine)

• Agression épithéliale (ex: protéases, lésion)

Dans l’asthme, des protéases digèrent les jonctions intercellulaires et permettent aux

éléments extérieurs de pénétrer l’épithélium bronchique.

II- Signalisation intracellulaire de la TEM

Les cadhérines sont normalement reliées aux béta-caténines. Si la beta-cat est libre dans

cytoplasme, elle est dégradée via la gsk3-beta dans le protéasome. Si elle n’est pas dégradée,

il y a alors une accumulation dans le cytoplasme.La beta-cat migre alors dans le noyau grâce à

BCL9-2 et induit l’expression de :

- vimentine

- métallo protéase matricielles qui dégradent la matrice

- répression de E-cad, spécifiquement épithéliale

Via les intégrines, il existe un signal de stabilisation de beta catenine.

Les TGF beta stimulent les Smad impliquées dans la TEM.

Rôle clé de Snail au cours de la TEM

Snail est induit par différents facteurs (entre autres wnt) et réprime des molécules

d’adhérence, notamment la E cadhérine.

III-Les marqueurs de la TEM

La recherche de marqueurs permet de mettre en évidence une perte d’adhérence ou une

capacité accrue de migration

A-Les plus fréquemment utilisés sont liés à une:

• Altération de l’expression de protéines membranaires:

– Adhérence cellule-cellule

switch E-cadhérine/ N-cadhérine

– Adhérence à la matrice

5 intégrine, discoidin domain receptor tyrosine kinase 2 (= kinase spécifique au

récepteur du collagène)

– Forme de la cellule

cytosquelette: switch cytokératine/ vimentine

• Modification de la fonction cellulaire:

– Migration

protéines du cytosquelette: FSP-1 ± -SMA, métallo-protéases matricielles

– Synthèse de protéines matricielles

fibronectine, collagène I (réparation en cas de lésion)

– Résistance à l’apoptose permet à la cellule de survivre dans le nouveau milieu.

+ Néo-expression de facteurs de transcription et translocation nucléaire de la -caténine

Marqueurs épithéliaux

Marqueurs mésenchymateux

Remaniements du cytosquelette

B-Nouveaux marqueurs de phénotype: les miRNAs

- Petits ARN (19-22 nts) simple-brins non-codants

- Répriment l’expression de gènes de façon post-transcriptionnelle:

Les miRNA utilisent le complexe RISK pour se fixer par complémentarité totale ou partielle

avec séquence 3’UTR des ARNm cibles dont la transcription doit être régulée :

- si le miRNA est complètement complémentaire de la séquence 3’UTR de

l’ARNm cible, alors l’ARNm est clivé

- si le miRNA est partiellement complémentaire de la séquence 3’UTR de

l’ARNm cible, alors la traduction de l’ARNm cible est inhibée.

Leur expression est :

- tissu-spécifique

- temporelle

- modulée par l’environnement tissulaire chez l’adulte

Fonctions (entre autres!)

- réguler la différenciation

- réguler la prolifération

Les miRNA et la transdifférenciation

• Induction de conversion de phénotype sans retour à un état pluripotent (régulation

épigénétique: inactivation par hyperméthylation de l’ADN)

• Expression réduite de Dicer associée avec un état moins différencié des cellules

(moindre maturation des miRNAs)

C- Les ZEBs

Il s’agit de facteurs de transcription qui induisent la répression de l’E-cadhérin et des

miRNAs.

a: Ségrégation des membres de la famille miR-200 en fonction de leur séquence ‘seed’

b: Sites de fixation des miR-200s au niveau des régions 3’UTR régions of de l’ARNm des

ZEBs

c: Boucle de rétro-régulation négative impliquant les miR-200s et les ZEBs au cours de la

TEM

IV- Mise en évidence de la transdifférenciation

Pour mettre en évidence l’apparition d’un nouveau phénotype différencié il est nécessaire

de :

bien caractériser le phénotype initial, connaître tous les marqueurs du phénotype

initial (type de cellule, mais également type de tissu! Exemple: cellule épithéliale

bronchique vs. alvéolaire)

définir si mise en évidence précoce? (facteurs de transcription, nouveau phénotype

transitoire)

ou détection plus tardive (maladie chronique: nouveau phénotype stable)

A-Les outils de mise en évidence de la transdifférenciation

• Etude morphologique: microscopie classique

• Caractérisation et distribution cellulaire des marqueurs de phénotype + facteurs de

transcription par Immunocytochimie ± fluorescence et microscopie confocale

• Quantification de l’expression à l’échelle protéique par Western Blot et

transcriptionnelle par PCR, puces à ADN

! Attention !

- choix du modèle cellulaire déterminant pour les marqueurs à étudier (origine

tissulaire) et la ‘facilité’ de mise en évidence de la TEM (cellules immortalisées

résistent plus à l’apoptose que les cellules primaires)

- choix du mode de préparation des échantillons: ex. analyse des miRNAs/ ne pas

éliminer les petits ARNs…

- et du mode de culture (certains milieux influencent le phénotype des cellules/ culture

en interface air-liquide pour différenciation épithéliale…)

B- Mise en évidence in vitro de la TEM

Les cellules fibroblastoïdes vont acquérir :

• Morphologie ‘allongée’ (spindle-shape) avec perte de polarité et réorganisation des

fibres de stress

• Disparition des marqueurs épithéliaux (E-cadhérine, cytokératine, ZO-1)

• Néo-expression de marqueurs mésenchymateux (N-cadhérine, FSP-1)

• Induction de Snail/ Slug/ Twist

• Translocation de la -caténine

• Augmentation de l’expression de collagène/ vimentine/ HSP-47

• Augmentation de la capacité migratoire

• Augmentation de l’expression de MMPs

• Résistance à l’apoptose/ anoïkis

Au départ, on a des cellules épithéliales au dessus de la membrane. Suite à l’incubation

avec le TGF beta, les cellules perdent leurs molécules d’adhérence et peuvent migrer à

travers la membrane. Elles deviennent alors des fibroblastes. => mise en évidence de la

TEM

2-Mise en évidence de la TEM par immunofluorescence des cellules

bronchiques immortalisées :

1- Détection d’une capacité migratoire accrue : expérience de la chambre de Boyden

Collagène

Migration de ‘fibroblastes’ suite à l’induction de TEM?

TGF-1

Cellules épithéliales (différentiées?)

Vimentine

E-cadhérine

Milieu TGF-1

- Au départ on a des épithéliales qui expriment :

- La E-CAD au niveau des membranes (molécule d’adhérence, marqueur des

cellules épithéliales)

- Peu de vimentine dans le cytoplasme

Puis on ajoute du TGF-beta

- les cellules deviennent mésenchymateuses, en effet :

- la E-cad aux membranes est réprimée

- l’expression de la vimentine (marqueur des cellules mésenchymateuses)

augmente fortement.

3-Mise en évidence de la TEM des cellules bronchiques primaires

De même la Ecad est inhibée alors que l’on a production de vimentine.

4-Mise en évidence par Western Blot et par qPCR de l’expression des marqueurs de

TEM au niveau des cellules épithéliales bronchiques

E-cadhérine /

Vimentine

Milieu TGF-1

On voit bien qu’en présence de TGF beta1 l’expression de E cad est diminuée et celle de

vimentine augmentée.

Pendant la TEM, la N cad est exprimée transitoirement.

Par qPCR

5-Signalisation intracellulaire de la TEM au niveau des cellules épithéliales

bronchiques humaines

Western blot : en présence de TGF1 beta, smad3 phosporylée est augmentée quelque soit le

traitement. Mais est ce du à une augmentation de la phosphorylation ou une augmentation de

la quantité de smad3 ?

On remarque que quelque soit le traitement la quantité de smad3 totale est constante. C’est

donc une augmentation de la phosphorylation de smad3 par tgfbeta.

6-Implication des facteurs de transcription Snail et ZEB1 dans la TEM des

cellules épithéliales bronchiques

C-Outils de détection in vivo de la transdifférenciation

• Phénomène souvent rare!

• Localisation préférentielle selon origine de la stimulation?

(ex: détection de marqueurs de TEM au voisinage d’une lésion épithéliale ou d’une rupture de

la membrane basale)

• Mise en évidence de cellules exprimant de façon concomitante des marqueurs du

phénotype originel et du nouveau phénotype

(voir marqueurs in vitro)

- Echelle protéique: Immunohistochimie/Immunofluorescence ± microscopie

confocale

- Echelle transcriptionnelle: hybridation in situ

Exemple : implication de la TEM dans le remodelage des voies aériennes

Sous l’effet de l’environnement les cellules épithéliales bronchiques vont acquérir une

nouveau phénotype. L’agression répétée des VA provoque la synthèse de médiateurs de

l’inflammation, notamment les MMPs qui induisent une TEM. Ce remodelage bronchique,

associé à une inflammation abouti à un trouble ventilatoire obstructif.

Indices de TEM dans l’asthme?

On observe une :

• Augmentation de l’expression de TGF-1 (et corrélation avec épaisseur lame basale

et hyperéactivité bronchique)

• Altération de la barrière épithéliale ( E-cadhérine/ ZO-1, cohésion)

• Accumulation de (myo)fibroblastes au niveau sous-épithélial

• Activation de la voie du TGF-1 au niveau des cellules épithéliales bronchiques :

• Augmentation de l’expression de phospho-Smad-2

• Diminution de l’expression de Smad-7 (augmentation de la sensibilité au TGF-1 ?)

Les premières expériences réalisées dans la

TEM de l’asthme utilisaient marquage avec

anticorps anti-Pan-cytokératine. Le problème

est que la cytokératine est n’est PAS

spécifique du tissu épithéliale. Elle est

également présente dans les cellules

musculaires.

Donc attention aux marqueurs

lorsque l’on veut mettre en

évidence une TEM !!

Cytokératine 5 = spécifique des cellules épithéliales bronchiques basales. On peut donc

l’utiliser pour étudier les cellules épithéliales et leur éventuelles TEM :

On observe qu’une cellule qui synthétise la

cytokératine 5 n’est pas dans l’épithélium

bronchique. On remarque par ailleurs la

présence de vimentine, marqueur de la TEM.

TEM et rejet de greffe pulmonaire

D-Mise en évidence in vivo de la transdifférenciation: modèles animaux

Vimentine

CK5

Dans la fibrose hépatique 30% des fibroblastes sont issus de l’épithélium :

On piste le promoteur de l’albumine : Lac-z, normalement au niveau de l’épithélium. On

remarque qu’il est présent dans 30% des fibroblastes hépatiques lors de la fibrose.

Dans le cas du diabète, on piste le gène YFP, présent dans les cellules alpha du pancréas : on

remarque que le gène est également exprimé dans les cellules beta régénérées du pancréas :

elles proviennent donc des cellules alpha.

Conclusion

Dans ce domaine, rien n’est figé.

Le changement de phénotype d’une cellule tient compte de l’environnement.

La transdifférenciation est impliquée en physiologie, pathologie et thérapie