INFECTIONS BACTERIENNES — ANTIBIOTIQUES

Mécanismes d’action et de résistance de l’isoniazide,un antituberculeux de première ligneMechanisms of action and resistance to INH, a first-line antituberculous drug

F. Brossier a,b,*

aCentre national de reference des mycobacteries et de la resistance des mycobacteries aux antituberculeux,hopital Pitie-Salpetriere, AP—HP, 75013 Paris, Franceb Faculte de medecine Pitie-Salpetriere, universite Pierre-et-Marie-Curie (UPMC), universite Paris-06, ER5, 75013 Paris, France

MOTS CLÉSMycobacteriumtuberculosis ;Isoniazide ;Catalase-peroxydase ;KatG ;InhA

Résumé L’isoniazide (INH) est l’antituberculeux le plus largement utilisé depuis la recon-naissance de son activité clinique contre Mycobacterium tuberculosis au début des années 1950.Il possède une puissante activité bactéricide contre M. tuberculosis. C’est une pro-drogue qui estactivée par l’enzyme KatG de M. tuberculosis, une catalase-peroxydase. La principale cible del’INH est la protéine InhA, une enoyl-ACP réductase appartenant au système d’élongation desacides gras FAS-II impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques. L’INH inhibe ainsi lasynthèse de la paroi mycobactérienne, ce qui entraîne la mort cellulaire. Les mécanismes derésistance à l’INH sont particulièrement complexes car ils impliquent plusieurs gènes. Environ80 % des souches résistantes à l’INH portent des mutations ponctuelles ou des délétions partiellesvoire complètes du gène katG, la mutation Ser315Thr étant retrouvée dans �70 % des souches etdonnant un haut niveau de résistance à l’INH. De 8 à 35 % des souches possèdent des mutationsdans le promoteur du gène inhA, majoritairement en position �15c!t, et de 0 à 5 % des souchesdans le gène inhA lui-même, ces mutations se traduisant par un bas niveau de résistance. Moinsde 5 % des souches résistantes à l’INH ne possèdent pas de mutations dans KatG, InhA ou sonpromoteur.# 2011 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

KEYWORDSMycobacteriumtuberculosis;Isoniazid;Catalase-peroxidase;KatG;InhA

Summary Isoniazid is the most widely used antituberculosis drug since the recognition of itsclinical activity against Mycobacterium tuberculosis in the early 1950s. It has a powerfulbactericidal activity against M. tuberculosis. It is a prodrug that is activated by the enzymeKatG of M. tuberculosis, a catalase-peroxidase. The main target of isoniazid is the protein InhA,an enoyl-acyl carrier protein reductase belonging to the system of fatty acid elongation FAS-IIinvolved in mycolic acid biosynthesis. Isoniazid inhibits the synthesis of mycobacterial cell wall,causing cell death. The mechanisms of isoniazid resistance are particularly complex becausethey involve several genes. About 80% of isoniazid-resistant strains carry mutations or partial orcomplete deletions of katG gene, the mutation Ser315Thr being found in �70% of the strains andproviding a high level of isoniazid resistance. Fifteen to 35% of strains have a mutation in the inhA

Journal des Anti-infectieux (2011) 13, 217—227

* Auteur correspondant. Laboratoire de bactériologie-hygiène, 47—83, boulevard de l’Hôpital, 75634 Paris cedex 13, France.Adresse e-mail : florence.brossier@psl.aphp.fr.

Disponible en ligne sur

www.sciencedirect.com

2210-6545/$ — see front matter # 2011 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

doi:10.1016/j.antinf.2011.10.003

promoter, mostly in �15c!t, and 0—5% of strains in the inhA gene itself, these mutationsresulting in a low level of isoniazid resistance. Less than 5% of isoniazid-resistant strains have nomutations in KatG, InhA or its promoter.# 2011 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

218 F. Brossier

Introduction

Parasite strict de l’homme, Mycobacterium tuberculosis estle principal agent de la tuberculose humaine. La contamina-tion est essentiellement interhumaine et se fait principale-ment par voie aérienne lors de l’inhalation demicrogouttelettes de secrétions bronchiques infectées. Ellese traduit par une tuberculose maladie dans 10 % des cas. Ledevenir à deux ans des tuberculoses bacillifères est sombreen absence de traitement : 50 % de mortalité. L’atteintepulmonaire est la plus fréquente au cours de la tuberculosemaladie. Le diagnostic clinique et radiologique est confirmépar la bactériologie. Le temps de division de M. tuberculosisétant de 20 heures en moyenne, les cultures sur milieu solidene sont positives qu’après trois à quatre semaines, et l’étudede la sensibilité aux antibiotiques n’est disponible qu’aprèssix à huit semaines, d’où l’intérêt de la biologie moléculaireet des techniques de diagnostic rapide de la tuberculose etdes mécanismes de résistance aux antituberculeux.

La tuberculose est la deuxième cause de mortalité dans lemonde par maladie infectieuse devant le paludisme et der-rière le VIH/Sida. Chaque année 1,8 millions de personnesmeurent de la tuberculose dont 14 % sont infectés par le VIH[1]. Quatre antibiotiques de première ligne sont utilisés dansle traitement standard des 9,4 millions de nouveaux cas detuberculose recommandé par l’Organisation mondiale de lasanté : l’isoniazide (INH), la rifampicine, le pyrazinamide etl’éthambutol (les quatre antituberculeux pendant deuxmois, puis la rifampicine et l’INH pendant quatre moissupplémentaires). Cette quadrithérapie permet de guérirplus de 95 % des patients lorsqu’elle est bien administrée.Ce traitement est efficace si (a) il est administré au moins sixmois et (b) si la souche de M. tuberculosis est sensible auxantibiotiques administrés. Deux facteurs d’échec de ce trai-tement sont bien identifiés : (a) les difficultés organisation-nelles pour assurer un traitement aussi long sur le terrain et(b) la fréquence de la résistance aux antituberculeux etsurtout la fréquence de la multirésistance (MDR, définiepar la résistance à la rifampicine et à l’INH). Les maladesayant des antécédents de traitement sont à risque d’êtreinfectés par des bacilles résistants à un ou plusieurs anti-biotiques. Le traitement des tuberculeux à bacilles multi-résistants est problématique car les antibiotiques utilisés,souvent de seconde ligne, sont moins efficaces et plus toxi-ques que les antibiotiques de première ligne. La proportionde la résistance parmi tous les cas de tuberculose dans lapopulation mondiale est de 13,3 % pour la résistance à l’INHet de 5,3 % pour la multirésistance (qui est encore rare enFrance : 1 % des cas, mais représente jusqu’à 35 % del’ensemble des cas de tuberculose dans certains pays,notamment en Europe de l’Est) [2]. La mortalité associéeà ces cas est de 20 à 50 % [3].

Depuis une vingtaine d’années, le développement d’outilsgénétiques efficaces et utilisables chez les mycobactéries,associé à un regain d’intérêt pour la résistance du bacille

tuberculeux aux antibiotiques, consécutif aux épidémies detuberculoses nosocomiales à bacilles multirésistants surve-nues dans les années 1990 (en particulier aux États-Unis) et àl’épidémie de Sida, ont notamment encouragé l’étude desmécanismes moléculaires de résistance aux antituberculeux.L’activité de l’INH contre M. tuberculosis, un analoguestructural dérivé du nicotinamide, a été découverte il y apresque 60 ans. Pourtant, le mécanisme d’action de cetantituberculeux est encore controversé et n’a pu êtreapproché jusqu’à ce que des systèmes de transfert de gènessoient développés chez M. tuberculosis. L’INH est une pro-drogue qui est activée par une enzyme bactérienne, KatG(une catalase-peroxydase) et sa cible est l’enzyme InhAintervenant dans la synthèse des acides mycoliques de laparoi mycobactérienne. La résistance à l’INH est principa-lement due à des mutations au niveau de la protéine activa-trice KatG (mutation S315T dans �70 % des souches cliniquesrésistantes à l’INH), ou à des mutations dans le promoteur dugène codant pour la cible, InhA (mutation �15c!t dans 15 à35 % des souches) ou le gène inhA lui-même (dans 0 à 5 % dessouches).

Informations générales et cliniques sur l’INH

Informations générales

L’INH, ou hydrazide de l’acide isonicotinique, est un analo-gue du nicotinamide, tout comme l’éthionamide et le pyra-zinamide. L’INH a été synthétisé à partir d’isonicotinated’éthyl et d’hydrazine en 1912 à Prague par Meyer et Mallydans le cadre de leur doctorat en chimie. Son activité anti-tuberculeuse n’a été découverte que 40 plus tard, en 1952.L’INH fait partie du groupe 1 des médicaments antitubercu-leux (médicaments antituberculeux de première ligne oraux)de l’OMS.

Spectre d’activité

L’INH n’est actif que sur les mycobactéries, et presqueuniquement sur les mycobactéries du complexeM. tuberculosis [4]. L’INH est l’antituberculeux le plus lar-gement utilisé depuis la reconnaissance de son activitéclinique contre M. tuberculosis en 1952. L’INH présentedes concentrations minimales inhibitrices (CMI) pourM. tuberculosis entre 0,01 à 0,5 mg/mL selon la littérature,dépendant du type de milieu, de l’inoculum et du tempsd’incubation [5]. Approximativement 50 % des souches sontsensibles à 0,06 mg/mL et 80 % à 0,1 mg/mL d’INH [5]. Laconcentration minimale bactéricide est égale à la CMI [6].Les souches de M. bovis sont légèrement moins sensibles àl’INH que M. tuberculosis.

L’INH est efficace contre les bacilles tuberculeux enréplication, mais pas en phase stationnaire (bacilles dor-mants cultivés dans des conditions de carence nutritionnelleou d’appauvrissement en oxygène in vitro) [7]. La proportion

Mécanismes d’action et de résistance de l’isoniazide 219

de mutants résistants à 0,2 mg/mL d’INH est de l’ordre de1 pour 106 [8]. Malgré sa puissante activité bactéricide, l’INHa une mauvaise activité de stérilisation par rapport àd’autres antituberculeux tels que la rifampicine.

La résistance à l’INH se définit selon la méthode desproportions sur milieu de Löwenstein-Jensen [8] par uneproportion critique de mutants résistants supérieure ouégale à 1 % à 0,2 mg/mL. On teste les concentrationssuivantes : 0,1 ; 0,2 ; 1 et 10 mg/mL pour l’INH. Un basniveau de résistance à l’INH est défini par une résistance àdes concentrations d’INH supérieures ou égales à 0,2 maisinférieures à 1 mg/mL, alors qu’un haut niveau de résistanceest défini par une résistance à des concentrations d’INHsupérieures ou égales à 1 mg/mL.

Les autres mycobactéries sont beaucoup moins sensibles,avec des CMI allant de 0,3 à 100 mg/mL d’INH. Les autresespèces bactériennes en dehors du genre mycobactériensont hautement résistantes à l’INH avec une CMI d’au moins600 mg/mL [4].

Informations cliniques

L’INH est normalement pris oralement mais peut êtreadministré aux patients gravement malades en intramus-culaire ou en intraveineux. Il existe sous forme decomprimés seuls, ou en combinaison avec la rifampicine(Rifinah1) ou la rifampicine et le pyrazinamide (Rifater1),et à différentes posologies. L’INH est bien absorbé aprèsprise orale et est distribué à tous les fluides corporels etcompartiments intracellulaires [9]. La dose recommandéeest de 5 mg/kg (4—6 mg/kg) par jour, avec un maximum de300 mg/j, ou de 10 mg/kg (8—12 mg/kg) trois fois parsemaine, avec un maximum de 900 mg trois fois parsemaine [1]. L’INH est transformé en composé inactif parle foie par acétylation et déhydrazination et est excrétédans l’urine dans les 24 heures, principalement sous formede métabolites inactifs [5]. En fonction de l’activité de la N-acétyltransférase de l’hôte (codée par le gène nat2 localisésur le chromosome 8p22), la vitesse d’acétylation est plusou moins grande [9,10]. Les polymorphismes du locusnat2 déterminent si l’individu est un acétylateur rapideou lent [10]. Approximativement 50 % des sujets caucasiensou africains sont des acétylateurs rapides, contre 85 % dessujets asiatiques [10]. Le taux d’acétylation n’altère passignificativement l’efficacité du médicament avec les dosesd’INH couramment utilisées. Chez les acétyleurs rapides lademi-vie est de 60 à 90 minutes, contre 120 à 180 chez lesacétyleurs lents. Après administration d’une dose orale de5 mg/kg d’INH chez l’homme, le pic sérique se situe entre2,5 et 7,5 mg/mL.

L’INH est généralement bien toléré aux doses recomman-dées. Certains effets secondaires peuvent se produireoccasionnellement : réactions d’hypersensibilité systémiqueou cutanée, léthargie, neuropathie périphérique (prévenu siles patients vulnérables reçoivent des compléments de pyri-doxine tous les jours), autres formes moins communes detroubles neurologiques (névrite optique, psychose toxique etconvulsions généralisées), augmentation asymptomatiquedes concentrations sériques de transaminases hépatiques àhépatite symptomatique potentiellement sévère, ou rare-ment un syndrome lupique, une pellagre, une anémie,un empoisonnement aux monoamines après l’ingestion

d’aliments et de boissons avec une haute teneur en mono-amine, et des arthralgies.

L’INH inhibe le métabolisme de certains médicamentset peut augmenter leur concentration plasmatiquejusqu’à la toxicité (benzodiazépines, acétaminophène, val-proate, antidépresseurs sérotoninergiques, disulfiram,warfarine. . .). Cependant, la rifampicine a l’effet opposépour bon nombre de ces médicaments. Les données disponi-bles indiquent que l’administration concomitante de rifam-picine et d’INH cause une diminution des concentrationsplasmatiques de phénytoïne et de diazépam, les concentra-tions sériques de ces médicaments devraient donc êtredosées si possibles.

Mécanisme d’action de l’INH

Winder et al. ont publié les premières études sur l’inhibitionpar l’INH [11] de la biosynthèse des acides mycoliques,composants essentiels de la paroi cellulaire mycobac-térienne. En outre, ils n’ont pas constaté une telle inhibitiondans les souches résistantes à l’INH [11]. L’inhibition de labiosynthèse des acides mycoliques par l’INH a été confirméepar la suite par Takayama et al. [12] qui ont montré quel’inhibition de la biosynthèse des acides mycoliques étaitcorrélée avec la mort cellulaire [12] et l’accumulation desacides gras à longue chaîne [13].

L’introduction d’ADN étranger dans les mycobactéries àpartir de 1987 [14,15] et la disposition de la séquencecomplète du génome de M. tuberculosis en 1998 [16] se sontavérées extrêmement précieuses dans l’identification de lacible et du mécanisme d’action de l’INH. Le gène katG,codant pour une catalase-peroxydase, a ainsi été identifiécomme responsable de l’activation de l’INH en 1992 [17] et legène inhA, codant une enoyl-ACP réductase intervenant dansla biosynthèse des acides mycoliques de la paroi mycobac-térienne, a été identifié en 1994 comme codant une ciblepour l’INH [14] (Fig. 1). Dans sa forme active, l’INH inhiberaiten fait plusieurs cibles intracellulaires mais son effet létalest exercé par l’inhibition de la synthèse des acides myco-liques [11,12,18].

KatG, activateur de l’INH

Après l’observation initiale selon laquelle les isolats cliniquesrésistants à l’INH de M. tuberculosis étaient souvent catalasenégative et d’une virulence plus faible chez les cobayes [19],il a été démontré que le gène katG code pour la seulecatalase de M. tuberculosis [17], et que des mutationsponctuelles ou des délétions dans katG entraînent l’atténua-tion de la virulence et la résistance à l’INH [20—22].

KatG, facteur de virulence pour combattre le stressoxydant chez M. tuberculosisTous les organismes se développant en atmosphère aérobiedoivent faire face aux espèces réactives de l’oxygène. Lescatalases (enzyme catalysant la dismutation du peroxyded’hydrogène en eau et en oxygène) et les peroxydases(enzyme catalysant les réactions d’oxydation) constituentla principale défense de la cellule contre les dérivés toxiquesde l’oxygène. Comme c’est le cas avec la plupart desbactéries pathogènes, M. tuberculosis a développé des

Figure 1 Schéma des mécanismes d’action et de résistance de l’isoniazide.

220 F. Brossier

mécanismes de protection globale et spécifique contre lestress oxydant. En effet, M. tuberculosis est un pathogèneintracellulaire facultatif qui doit survivre et persister dansl’environnement hautement oxydant des cellules phagocy-taires de l’hôte infecté [23]. Ainsi, les gènes et les facteursimpliqués dans la protection contre le stress oxydant chezM. tuberculosis jouent un rôle clé dans la détoxification desespèces réactives de l’oxygène rencontrées dans les macro-phages infectés. Ces systèmes de défense comprennentessentiellement KatG, une catalase-peroxydase. KatG estla seule catalase exprimée chez M. tuberculosis et estimportante pour sa virulence grâce à son rôle dans la réponseau stress oxydant, et pour la survie intracellulaire deM. tuberculosis et la persistance chez l’hôte [21,24,25].

Chez M. tuberculosis, la protéine FurA (codée par le gènefurA situé juste en amont de katG, les deux gènes consti-tuant un opéron) régule négativement l’expression de katG,en se liant au niveau d’un promoteur inductible par le stressoxydant, immédiatement en amont du gène furA, modulantainsi la réponse contre le stress oxydant [26,27].

Structure de KatGLes protéines KatG sont des enzymes bifonctionnelles àhème, avec une activité catalase-peroxydase. Elles mon-trent à la fois une forte activité catalase similaire à celledes catalases monofonctionnelles (en dépit d’avoir unefaible homologie de séquence avec les catalases monofonc-tionnelles et des structures tertiaires et quaternaires trèsdifférentes) [28] et une activité peroxydase à large spectrecomparable à celle des peroxydases monofonctionnellespour laquelle aucun substrat physiologique n’a été identifiéà ce jour. Les protéines KatG sont classées dans la famille desperoxydases de classe I (fongiques, bactériennes et deplante) à cause de leur haute homologie de séquence etde structure globale (en particulier au niveau des sites actifsqui sont constitués d’une poche proximale et une pochedistale de part et d’autre de l’hème avec des acides aminésconservés à des positions presque identiques) [29]. Dans les

environs du site actif, une caractéristique structurale intri-gante commune à toutes les protéines KatG est la présenced’un adduit covalent, de deux liens covalents entre leschaînes latérales de trois résidus distaux et n’est pas retro-uvée dans les catalases monofonctionnelles ou les peroxy-dases de classe I [30].

KatG contient un hème de type b (= protoporphyrine IXcontenant du fer) qui n’a pas de lien covalent avec laprotéine dans laquelle il est trouvé. L’atome de fer dansl’hème peut être pentacoordonné (quatre liens équatoriauxavec l’hème et un lien axial avec un acide aminé du côtéproximal de l’hème) ou hexacoordonné (quatre liens équa-toriaux et deux liens axiaux dont un avec un ligand exogène).

Mécanisme d’activation de l’INHLe mécanisme d’activation de l’INH par KatG est aujourd’huiencore sujet à controverse, en partie parce qu’il n’existe pasde structure cristallographique disponible de KatG deM. tuberculosis en complexe avec l’INH. Il est généralementadmis que KatG active l’INH par oxydation en convertissant lapro-drogue en une gamme d’espèces réactives, comme unradical isonicotinoyl qui peut acyler de nombreux composés[31,32]. Ce radical isonicotinoyl réagit alors avec les coen-zymes nucléotidiques pyridine cellulaires, NAD(P)H/NAD(P)+/NAD(P)�, pour produire des complexes isonicoti-noyl-NAD(P) [INH-NAD(P)] [18,31—33], le site de cette liga-tion dans les cellules ayant besoin d’être localisé [18]. Cecomplexe isonicotinoyl-NAD(P) agit comme un puissant inhi-biteur de InhA, l’enoyl-ACP réductase de M. tuberculosis, etinterfère avec la biosynthèse de la paroi cellulaire [34,35].

Lors de l’activation de l’INH, la protéine KatG passerait parplusieurs états d’oxydo-réduction. Historiquement, le pre-mier schéma proposé pour rendre compte des activités cata-lase et peroxydase de KatG a été établi à partir des donnéesdisponibles pour les catalases et les peroxydases monofonc-tionnelles. La première étape des réactions catalase et per-oxydase est commune et aboutit à la formation du composé Ide KatG (avec l’hème sous forme oxydée à deux électrons). Le

Mécanismes d’action et de résistance de l’isoniazide 221

composé I est réduit en composé II (forme oxydée à unélectron) puis le composé II est réduit en enzyme au repos[36]. Les composés I et II sont des intermediaires dans le cycleperoxydase traditionnel, alors que le composé I est l’inter-médiaire clé dans le traditionnel cycle catalase, qui est l’autreactivité majeure de KatG. Comme KatG appartient à la familledes peroxydases de classe I, il a été proposé que KatG oxyde etactive l’INH d’une manière similaire en utilisant le peroxyded’hydrogène ou des peroxydes d’alkyl, via la voie descomposés I/II de KatG, l’INH servant de source d’électronpour réduire l’intermédiaire produit par l’oxydation de KatGavec les peroxydes [37]. À la suite de différents travaux, lescycles catalase et peroxydase des enzymes bifonctionnellesKatG se sont avérés plus compliqués et ont amené à laspéculation que l’entité superoxyde O2

��, un agent réducteur,pourrait jouer un rôle clé dans la formation du complexeisonicotinoyl-NAD(P) [38—40]. Une corrélation a été démon-trée entre l’activité antimycobactérienne de l’INH et sa capa-cité à former des radicaux (comme les superoxydes) [38,39].KatG sous forme de composé III (une forme de KatG oxyferreuxformé par la voie superoxyde) a aussi été proposé comme unintermédiaire critique pour l’activation et la sensibilité à l’INH[38,39]. Un mécanisme général d’activation de l’INH qui prenden compte les composés intermédiaires I, II, III de KatG a étéproposé et suggère que KatG sous forme de composé III est leprincipal facteur dans l’activation de l’INH, avec des contri-butions secondaires des composés I et II de KatG [38,40].

Toutes les hypothèses formulées à ce jour sur le site defixation de l’INH dans KatG dérivent de modélisation dans lastructure tridimensionnelle de KatG de M. tuberculosis ou destructures cristallographiques obtenues à partir de peroxy-dases (lactoperoxydase bovine [41] et les peroxydases declasse I [42]) ou de KatG de Burkholderia pseudomallei quiplacent l’INH près du bord d-méso de l’hème [37,43]. L’INHdans ces complexes rentrerait par un court et petit canal quiva de la surface moléculaire à la poche distale de l’hèmedélimitée par l’acide aminé Ser315 de KatG au point le plusétroit du canal. Le col étroit dans le canal d’entrée crée unebarrière stérique pour l’accès au site actif de KatG.

L’enoyl-ACP réductase InhA, cible de l’INH

La combinaison de plusieurs données fournit la preuvegénétique qu’InhA est la cible principale de l’INH chezM. tuberculosis [14,44]. InhA est une enoyl-ACP réductaseNADH-dépendante [34,45] appartenant au système FAS-II[46], qui est impliquée dans la biosynthèse des acides myco-liques de la paroi mycobactérienne (ACP pour « acyl carrierprotein » : protéine porteuse d’acyl). Les complexes isoni-cotinoyl-NAD(P) issus de l’activation de l’INH par KatG selient à l’enzyme InhA et empêchent la synthèse des acidesmycoliques en bloquant son site actif, ce sont de puissantsinhibiteurs compétitifs d’InhA par rapport au NAD(H)[32,35,47—49]. Le traitement de M. tuberculosis avecl’INH cause ainsi l’accumulation d’acides gras C26 saturésou C24 insaturés [13].

Cibles hypothétiques de l’INH

La b-cétoacyl ACP synthase KasA [50], la b-cétoacyl ACPréductase NADPH-dépendante MabA (autres enzymes dusystème FAS-II) [51], les enzymes respiratoires (cytochrome

c oxydase) [52] et la dihydrofolate réductase DHFR deM. tuberculosis [53] ont également été proposées commedes cibles de l’INH, mais il manque encore de véritablespreuves.

Mécanismes de résistance à l’INH

Les mécanismes de résistance à l’INH sont particulièrementcomplexes car ils impliquent plusieurs gènes. Les principauxmécanismes de résistance à l’INH sont : (1) une mutationdans la protéine KatG responsable de l’activation de l’INH(�80 % des souches cliniques résistantes à l’INH, avec lamutation Ser315Thr représentant 70 % des souches) ; (2) unemutation dans la région promotrice du gène inhA (8 à 35 %des souches cliniques résistantes à l’INH, et majoritaire-ment en �15c!t) ; (3) une mutation dans la protéine InhAcible de l’INH (0—5 % des souches cliniques résistantes àl’INH) [14,44,49,54] (Fig. 1). Un certain nombre d’isolatscliniques résistants à l’INH (< 5 %) de M. tuberculosis n’ontaucune mutation dans les gènes connus pour être impliquésdans la résistance à l’INH i.e. katG, inhA et son promoteur[55,56].

Il existe des tests de diagnostic rapide par biologie molé-culaire de la résistance à deux antituberculeux de premièreligne, la rifampicine (gène rpob) et l’INH (gène katG codon315, et promoteur du gène inhA en positions �15, �16 et �8)par amplification génique et séquençage ou hybridationinverse sur bandelette de nitrocellulose sur les souches oudirectement sur le prélèvement [55].

Mutations dans KatG

La résistance à l’INH dans les isolats cliniques deM. tuberculosis est le plus souvent associée à des mutationsdans katG (�80 %), codant l’activateur de l’INH [17,20].Jusqu’à présent, au moins 280 mutations dans KatG ontété décrites, allant des acides aminés 1 à 735, avec desCMI allant de 0,2 à 256 mg/mL. Des mutations ponctuelles,des insertions, des délétions et, plus rarement, une délétiontotale du gène [17,56,57] ont été observées.

Mutation KatG S315TLa résistance à l’INH est surtout associée avec la mutationKatG S315T qui est retrouvée dans 31 à 92 % des isolatscliniques résistants à l’INH de M. tuberculosis, avec unemoyenne à 70 % [54—59]. La mutation S315T augmented’un facteur 10 à 180 la CMI pour l’INH [20,54]. Quatre-vingt-neuf pour cent des souches avec une mutation S315Tont une CMI de 5—10 mg/mL (contre 0,01—0,5 mg/mL pourune souche sensible).

À partir de la structure cristallographique de KatG S315T[33], plusieurs hypothèses peuvent expliquer la résistance àl’INH des souches avec KatG S315T :

� cette mutation crée une barrière stérique pour l’accès ausite de liaison de l’hème pour l’INH dans KatG : le groupeméthyle introduit par Thr315 restreint l’accessibilité àl’hème en rétrécissant la partie la plus étroite du canal(de 6 Å dans KatG sauvage à 4,7 Å dans le mutant KatGS315T) et entraîne une perte de la liaison à haute affinitéde l’INH [33] ;

222 F. Brossier

� cette mutation amène une organisation différente dusolvant dans le site actif de KatG : une molécule d’eaustructurale coordonnée au fer de l’hème (faisant passerKatG d’un état 5-coordonné à un état 6-coordonné) estplus souvent retrouvée dans KatG sauvage que dans KatGS315T [33,43,60], or il a été montré que la liaison de l’INHà KatG est bien plus favorable lorsque le fer de l’hème estdans un état 6-coordonné que 5-coordonné [61] ;� le composé III (oxyferreux) de KatG S315T est incapable

d’oxyder l’INH, contrairement au composé III de KatGsauvage [39], or le composé III de KatG est l’intermédiairecritique impliqué dans l’activation de l’INH.

Il est important de noter ici que la mutation S315Tn’entraîne qu’une réduction partielle des activités catalyti-ques de KatG [62]. En effet, plusieurs rapports décriventl’efficacité catalytique de KatG S315T par rapport à KatGsauvage comme étant réduite en moyenne de 50 % pour lesactivités catalase et peroxydase, et de plus de 90 % pour laformation de radicaux libres et la formation d’isonicotinoyl-NAD(P) [33,38,40]. Le mutant KatG S315T, qui est déficientdans la formation de l’inhibiteur isonicotinoyl-NAD(P) deInhA par le composé III de KatG [40], conserve probablementune activité catalytique partielle grâce aux contributionssecondaires des composés I et II de KatG [38]. En conclusion,les remplacements au niveau du résidu 315 de KatG (commeS315T) nuisent à la liaison de l’INH et à son activation, etcompromettent partiellement la structure de l’hème et safonction. Les fonctions enzymatiques de S315T sont néan-moins en partie préservées permettant ainsi de maintenir lavirulence et la physiologie bactérienne [63], ce qui expli-querait que cette mutation est majoritairement retrouvéedans les souches résistantes à l’INH.

Délétions du gène katGPlusieurs publications rapportent des souches cliniques avecdes délétions du gène katG entier [57,64,65], suggérant quekatG n’est pas un gène essentiel et que M. tuberculosis ad’autres moyens de combattre le stress oxydant. De façonintéressante, la virulence des souches résistantes de tuber-culose a été liée à l’activité catalase de KatG du fait quecette fonction protège la mycobactérie des espèces oxydan-tes, notamment le peroxyde d’hydrogène produit par lesneutrophiles de l’hôte infecté [63]. On considère générale-ment qu’une bactérie qui possède une activité catalaserelativement haute est plus virulente parce qu’elle estcapable de surmonter les mécanismes de défense del’hôte. Dans les souches résistantes à l’INH, la perte desactivités catalase-peroxydase pourrait être partiellementcompensée. . . [24,64,66,67].

Autres mutations de KatG hors S315La plupart des 280 mutations connues dans KatG sont décri-tes à partir d’études mentionnant la présence de ces muta-tions dans des isolats résistants à l’INH. Moins d’unequarantaine de ces mutations ont été étudiées en détail,en particulier au niveau enzymatique, comprenant les acidesaminés de la poche proximale, de la poche distale et l’adduitcovalent qui montrent des activités catalase très réduites etdes activités peroxydase et de formation d’isonicotinoyl-NAD(P) variables. La résistance à l’INH peut être expliquéepar des différences de réactivité du composé III de KatG ou

de l’affinité de liaison de l’INH, mais aussi par une perturba-tion de la dimérisation de la protéine KatG (KatG est unhomodimére fonctionnel), une réduction de la stabilité glo-bale de KatG ou une modification des interactions putativesKatG/protéine qui peuvent se produire in vivo, en particulierpour des mutations qui sont situées à des distances consi-dérables du site actif ou du canal d’accès du substrat [43].

Finalement, la mutation R463L est considérée comme unpolymorphisme silencieux avec très peu d’impact sur l’acti-vité enzymatique ou la structure du site actif de KatG [40].

Mutations du promoteur du gène inhA

La seconde mutation la plus courante dans les isolats clini-ques résistants à l’INH de M. tuberculosis est la mutation�15c!t dans le promoteur du gène inhA [55—58]. En effet,de 8 à 35 % des souches cliniques résistantes à l’INH ont desmutations dans le promoteur d’inhA, majoritairement (80—90 %) en �15c!t [54,56]. Il a été montré que cette mutation�15c!t augmente le niveau d’ARNm (augmente la trancrip-tion) de inhA de 20 fois par rapport au promoteur sauvage, cequi entraîne une surexpression de InhA (augmente la concen-tration d’INH nécessaire pour inhiber la cible) et une aug-mentation de huit fois de la résistance à l’INH (résistance àl’INH par titrage du médicament) [44,49]. Cette mutation setrouve au niveau du site d’initiation ribosomal [68].Au total, 13 mutations ont été décrites dans lepromoteur d’inhA incluant �15c!t, �5t!a, �8t!g/a/c,�16a!g, �17g!t, �22g!c, �24g!t, �47g!c, �55a!g,�102g!a, �147c!t [5,55,57,58,69]. Les mutations du pro-moteur sont habituellement associées avec un bas niveau derésistance à l’INH (CMI = 0,2 à 1 mg/mL) [5,14,20,54].

Mutation de la cible InhA

Les mutations au niveau de la cible InhA sont trouvées dans0 à 5 % des souches cliniques résistantes à l’INH. Dix muta-tions distinctes dans InhA ont été rapportées à partir desouches cliniques résistantes à l’INH (I16T, I21V/T, I47T,V78A, I95P, S94A, P107S, I194T, I258T) [5,56,69]. Les muta-tions dans InhA sont habituellement associées avec un basniveau de résistance (CMI = 0,2 à 1 mg/mL) ; la mutation InhAS94A cause une augmentation de la résistance à l’INH de cinqfois [5]. Les mutations V78A et P107S ne seraient pas res-ponsables de la résistance mais des polymorphismes associésà des lignées phylogénétiques [70].

Les mutations de la protéine InhA empêchent la formeactivée d’INH, le complexe isonicotinoyl-NAD(P), d’inhiberInhA. Les mutations S94A, I16T, I21V, I47T et I95P, situéesdans la poche de fixation du cofacteur NADH de InhA, dimi-nuent l’affinité pour le cofacteur NADH de InhA et l’inhibi-teur isonicotinoyl-NAD(P) [34,45,71]. La résistance à l’INHest donc corrélée à la diminution de la liaison de l’inhibiteurisonicotinoyl-NAD(P) à InhA muté par rapport à InhA sauvage,la protéine InhA mutée est donc plus résistante à l’inhibitionpar l’isonicotinoyl-NAD(P) [35,45,47,49,72]. Cependant,d’après certains auteurs, la résistance à l’INH ne résulteraitpas simplement d’une réduction de l’affinité de l’isonicoti-noyl-NAD(P) pour InhA, mais aussi d’une modification desinteractions protéine-protéine dans le complexe FAS-II quiseraient essentielles pour le mécanisme d’action de l’INH

Mécanismes d’action et de résistance de l’isoniazide 223

[46,48] ou d’une modification de la réponse allostérique à laliaison de ligands dans InhA [48,71].

Mécanismes de résistance non confirmés

D’autres gènes potentiellement impliqués dans la résistanceà l’INH ont été étudiés sans que leur implication dans larésistance à l’INH ait été démontrée (ndh, msh, nat, dfrA,kasA, ahpC. . .).

Le gène ndh code la NADH déshydrogénase NdhII, uneenzyme essentielle de la chaîne respiratoire qui régule leratio NADH/NAD+ dans les cellules et qui est utile pour ladétoxification des radicaux libres [57,73]. Les mutationsdans ndh résultent en une augmentation de la concentrationintracellulaire de NADH qui agit comme un inhibiteur compé-titif pour la liaison de l’isonicotinoyl-NAD(P) à InhA, pro-tégeant ainsi InhA contre cet inhibiteur et résultant en larésistance à l’INH [74,75]. Les mutations de ndh sont retro-uvées dans 10 % des isolats cliniques résistants à l’INH deM. tuberculosis [73] mais ont également été observées dansdes isolats sensibles à l’INH [57,58,73].

Les quatre gènes mshA, mshB, mshC et mshD sont impli-qués dans la biosynthèse du mycothiol. Les thiols jouent unrôle dans l’activité de plusieurs enzymes, ils servent decofacteurs pour certaines enzymes impliquées dans la déto-xification et l’efflux de composés toxiques hors des cellules,et le mycothiol est le principal thiol de faible poids molécu-laire trouvé chez M. tuberculosis. La biosynthèse de myco-thiol serait essentielle pour la sensibilité à l’INH chezM. tuberculosis [76,77]. Bien que la raison pour laquelleles mutants déficients en mycothiol sont résistants à l’INHne soit pas encore bien comprise, on suppose que le myco-thiol est requis pour l’activation de l’INH [77].

Le gène nat code une arylamine N-acétyltransférase.L’enzyme NAT2 trouvée chez l’homme peut inactiver l’INHpar acétylation de l’azote in vivo au niveau du foie [10]. Deshomologues de NAT ont été identifiés chez M. tuberculosis,et ces enzymes NAT purifiées montrent une activité deconversion de l’INH en N-acétyl-INH in vitro [78] qui empê-cherait l’activation de l’INH par KatG [78].

Le gène dfrA code la dihydrofolate réductase, uneenzyme essentielle à la synthèse des acides nucléiques. Ladihydrofolate réductase a été proposée comme cible pos-sible de l’INH. En effet, l’INH activé par KatG pourrait réagiravec le NADP pour former un complexe isonicotinoyl-NADPqui inhiberait la dihydrofolate réductase de M. tuberculosis[53].

Le gène kasA code une b-kétoacyl ACP réductase, enzymeintervenant dans le système FAS-II de synthèse des acidesgras et des acides mycoliques. Des mutations ponctuellesdans le gène kasA ont été identifiées dans des isolats clini-ques résistants mais aussi sensibles à l’INH de M. tuberculosis[50,56,57,65].

Le gène ahpC code une alkyle hydroperoxyde réductase.Dans les souches résistantes à l’INH par mutation du gènekatG, la perte des activités catalase-peroxydase pourrait êtrepartiellement compensée par une seconde mutation du pro-moteur d’ahpC qui résulte dans la surexpression de AhpC(normalement faiblement exprimée chez M. tuberculosis)qui peut protéger la bactérie contre les peroxydes organiques[24,64,66,67]. Cependant, mêmes si certains isolats ayant desdélétions du gène katG ont une mutation dans le promoteur

d’ahpC [57,65], tous ne l’ont pas [64,65]. Il s’agirait d’unmécanisme de rééquilibrage de protection contre le stressoxydant dû à la perte d’un KatG fonctionnel. Cependant, desétudes avec différents modèles animaux n’ont pas réussi àdémontrer la surexpression d’AhpC comme un mécanismecompensatoire pour la virulence [24,67].

D’autres gènes, en particulier ceux qui sont surexpriméspar traitement à l’INH, pourraient être impliqués dans larésistance à l’INH : gènes codant pour des protéines poten-tiellement impliquées dans le mode d’action de l’INH, gènescodant des enzymes du système FAS-II ou gènes dont lesproduits sont probablement impliqués dans les effets toxi-ques de l’INH : fadE23 (codant une déshydrogenaseimpliquée dans la b-oxydation des acides gras), efpA (codantune protéine d’efflux qui aiderait à enlever les radicauxtoxiques durant l’activation de l’INH), furA (codant pourle répresseur transcriptionnel de katG), acpM, fabD, accD6 etenfin des gènes de fonction inconnue (Rv1592c, Rv1772,Rv0340, Rv0341, Rv0342, Rv0343) [26,27,57,79].

Tuberculose et INH

La tolérance à l’INH

Le gène iniA serait associé non pas avec la résistance maisplutôt avec la tolérance à l’INH. L’opéron iniBAC (qui code untransporteur membranaire pour lequel le substrat spécifiquedemeure inconnu et qui est induit par l’INH) a été analysépour sa capacité à protéger M. tuberculosis contre desinhibiteurs de la synthèse de la paroi cellulaire commel’INH et l’éthambutol et la surexpression de iniA chezM. tuberculosis est capable de conférer un phénotype detolérance à l’INH et à l’éthambutol [80]. Même si la protéineIniA seule ne fonctionne pas comme un transporteur d’anti-biotique, son rôle probable est d’éliminer les composéstoxiques des cellules. Ainsi, la réduction de l’activité bac-téricide au bout de quelques jours dans des modèles animauxserait associée non pas avec l’émergence de souches résis-tantes à l’INH mais plutôt avec la sélection de bacillesphénotypiquement tolérants à l’INH [79,81].

« Fitness » et virulence des souches résistantes àl’INH

Le « fitness » est la mesure de la capacité reproductive d’unindividu possédant un génotype donné. La perte d’activitécatalasique des souches résistantes à l’INH est connue depuisde nombreuses années [19,82]. Il est classique de considérerque cette perte d’activité se voit chez des souches présen-tant un haut niveau de résistance tandis qu’elle ne se voit pasdans les souches présentant un bas niveau de résistance.Cette perte d’activité catalasique a été considérée commeresponsable d’une perte de virulence des souches présentantun haut niveau de résistance à l’INH et il est généralementadmis que ces souches sont moins transmissibles que lessouches sauvages ou de bas niveau de résistance[21,22,26]. Ces données ont été appuyées par l’explorationgénétique des mécanismes de résistance responsables de cesphénotypes. Les souches présentant un bas niveau de résis-tance ont le plus souvent une mutation dans la régionrégulatrice du gène inhA et ont donc une activité catalasique

224 F. Brossier

conservée. À l’inverse, les souches présentant un hautniveau de résistance ont le plus souvent une mutation dansle gène katG et ont donc une activité catalasique altérée.Toutefois, des études épidémiologiques ont démontré queparmi les souches multirésistantes, classiquement consi-dérées comme moins virulentes, certaines se transmet-taient aussi bien que des souches sensibles (c’est-à-diregénéraient autant de cas secondaires) [83—85]. L’étudemoléculaire du mécanisme de résistance à l’INH a montréque les souches ayant une mutation S315T dans KatG ou�15c!t dans le promoteur d’inhA se transmettaient mieuxque les souches ayant d’autres mutations [59,64]. Il a aussiété démontré que la mutation KatG S315T est à l’origined’une activité catalasique peu altérée et d’une virulenceconservée chez la souris [63]. Ainsi, la vision classique selonlaquelle les souches résistantes à l’INH de M. tuberculosissont de faible virulence, qui prévaut depuis la descriptionoriginale de Middlebrook d’isolats de M. tuberculosis résis-tants à l’INH, catalase négative et de virulence atténuée[19], doit être modifiée. Il existe effectivement des muta-tions sélectionnées sous traitement qui sont à l’origined’une perte de virulence de M. tuberculosis. Toutefois,celles qui sont vues le plus souvent et qui sont responsablesdu plus grand nombre de cas secondaires sont justementcelles associées à une virulence conservée. Il faut ajouter iciqu’une association apparente existe entre des mutationsspécifiques de résistance à l’INH et les principales lignées deM. tuberculosis, suggérant que des différences génétiquesentre les lignées pourraient influencer leur propension à desmutations différentes [64].

L’INH est-il encore bénéfique en cas de basniveau de résistance à l’INH ?

Il existe une controverse pour savoir si les patients ayant desbacilles résistants à l’INH peuvent encore être traités avec del’INH [86]. En effet, certains experts considèrent que dehautes concentrations d’INH pourraient avoir un effetbénéfique sur les bacilles avec un bas niveau de résistanceà l’INH (> 1 % de bacilles résistants à 0,2 mg/mL maissensibles à 1 mg/mL d’INH), mais pas sur les bacilles à hautniveau de résistance (> 1 % de bacille résistants à 1 mg/mL)[5]. Cette considération est basée sur le fait que la concen-tration sérique d’INH au pic (3 à 5 mg/mL) est supérieure à laCMI des souches dites de bas niveau de résistance (ayant engénéral une CMI de 0,5 mg/mL). Toutefois la distinction entrehaut et bas niveau de résistance n’ayant en général pas étéfaite dans les essais cliniques, il est difficile de savoir si cettesupposition est confirmée dans la réalité.

Il existe des arguments indirects pour estimer l’activité del’INH sur les souches de bas niveau de résistance. En effet desauteurs ont étudié l’activité bactéricide initiale de l’INH enfonction de sa posologie et des concentrations sériquesgénérées [87]. Il apparaît que l’activité bactéricide optimaleest obtenue avec 5 mg/kg générant un pic sérique de 3 mg/mL. Lorsque le pic sérique est réduit d’un facteur 10, l’acti-vité bactéricide est réduite de moitié. Basé sur ces éléments,on peut considérer qu’une souche de bas niveau de résis-tance, qui a une CMI (0,5 mg/mL) dix fois plus élevée quecelle d’une souche sauvage, correspond à une souche sau-vage traitée avec une posologie dix fois inférieure ce quireviendrait à avoir une activité bactéricide initiale diminuée

de moitié. Ainsi, à posologie conservée, l’INH aurait uneactivité sur les souches de bas niveau de résistance diminuéede moitié par rapport à celle sur des souches sensibles.

Qu’en est-il des données existantes sur les cas où l’INH aeffectivement été utilisé pour traiter les tuberculoses à bacil-les résistants ? Une étude dans un pays à faible ressource où untraitement standard est utilisé (et où les tests de sensibilité àl’INH à différentes concentrations ne sont pas disponibles)suggère que l’inclusion en routine de l’INH à haute dose (16—20 mg/kg par jour) pourrait améliorer le devenir des patientstuberculeux [88]. Dans la résistance primaire à l’INH, de basniveau, le traitement à l’INH paraît être bénéfique [89]. Parceque la concentration d’INH au pic sérique est de 5 mg/mL [9], ilest probable que les bacilles résistants à l’INH de bas niveau,avec une activité catalase positive, peuvent encore répondreau traitement par l’INH, mais que les bacilles qui sont haute-ment résistants (CMI > 5 mg/mL) ne le peuvent pas. Cepen-dant, le retraitement de la résistance secondaire à l’INH avecl’INH est plus controversé [86]. Dans un essai de retraitementcontrolé avec différentes combinaisons d’éthionamide, decyclosérine et de pyrazinamide, l’addition d’INH (300 mg/j)n’a pas montré de bénéfice [90]. Cependant, dans un autreessai avec un nombre plus petit de patients utilisant l’éthio-namide et le pyrazinamide, l’addition de plus hautes dosesd’INH (1 à 1,5 g/j) a montré un bénéfice marqué [91]. Lesraisons pour ces résultats discordants pourraient être dues àdes différences de traitement et de dose d’INH utilisée [92].Dans une étude rétrospective des essais menés par le BritishMedical Council, Denis Mitchison affirme que la résistance àl’INH n’a pas d’impact sur la durée du trainement pour peu quel’on puisse utiliser les trois autres antituberculeux. Toutefoisle niveau de résistance à l’INH n’était pas précisé et il n’estdonc pas possible de savoir à quelle population s’appliquentces résultats [93].

Dans le cadre de la gestion des patients avec une tuber-culose ultrarésistante (XDR-TB, qui est une forme de MDR-TBrésistante aux fluoroquinolones et aux antituberculeux injec-tables de seconde ligne : kanamycine, amikacine ou capréo-mycine), il ne faut pas exclure le traitement par INH à hautedose si un bas niveau de résistance est documenté [92].L’OMS recommande de l’ajouter lorsque les antituberculeuxde seconde ligne les plus actifs ne peuvent pas être utilisés.L’INH à haute dose (16—20 mg/kg par jour), classé commeantibiotique d’activité incertaine, peut alors être ajouté(groupe 5 de l’OMS).

Pourquoi le pourcentage de mutants résistants àl’INH est-il si élevé ?

La résistance à l’INH est avec celle à la streptomycine la plusfréquente parmi les isolats cliniques résistants aux antitu-berculeux, avec une incidence de 20 à 30 % dans certainesrégions. Plusieurs hypothèses permettent d’expliquer lafréquence et la prévalence plus élevées des isolats résistantsà l’INH par rapport aux isolats résistants à d’autresantituberculeux : (1) marque du passé : l’INH est, avec lastreptomycine, un des antituberculeux les plus anciens, cequi peut expliquer que ces deux antituberculeux possèdentles plus forts taux de résistance ; (2) utilisation fréquente dela substance en monothérapie (dans le cadre de la prophy-laxie antituberculeuse) ; (3) propriété intrinsèque de l’INHd’induire sa propre résistance : en dépit d’être un puissant

Mécanismes d’action et de résistance de l’isoniazide 225

antituberculeux, l’INH a l’inconvénient potentiel d’induiresa propre résistance génétique stable dans les cellules deM. tuberculosis par un mécanisme non expliqué, contraire-ment aux autres antituberculeux [94] ; (4) radicaux dérivésde l’oxygène hautement réactifs qui sont générés au cours del’activation de l’INH et qui peuvent provoquer la mutagenèsede l’ADN ; (5) proportion élevée de mutants résistants : laproportion naturelle de mutants résistants de l’ordre de10�6 est supérieure à celle de la rifampicine qui a unefréquence de mutation de 10�7 à 10�8 et pourrait expliquerl’émergence plus fréquente de mutants résistants.

Conclusion

Alors que la découverte de l’activité antituberculeuse del’INH remonte à presque 60 ans, ses mécanismes d’action etde résistance sont encore sujets à controverse. Plus de 95 %des souches cliniques de M. tuberculosis résistantes à l’INHpossèdent une mutation au niveau du gène katG responsablede l’activation de l’INH, ou du gène inhA ou son promoteurcodant pour la cible de l’antibiotique. Pour moins de 5 % desouches restantes, les mécanismes de résistance restentencore à découvrir. . .

Déclaration d’intérêts

L’auteur déclare ne pas avoir de conflits d’intérêts en rela-tion avec cet article.

Références

[1] World Health Organization. Global Tuberculosis Control 2009.Epidemiology, Strategy, Financing. WHO/HTM/TB/2009.411.Geneva, Switzerland: WHO; 2009.

[2] World Health Organization. Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB). 2010 Global report on Surveillanceand Response. WHO/HTM/TB/2010.3. Geneva, Switzerland:WHO; 2010.

[3] Flament-Saillour M, Robert J, Jarlier V, Grosset J. Outcome ofmulti-drug-resistant tuberculosis in France: a nationwide case-control study. Am J Respir Crit Care Med 1999;160:587—93.

[4] Pansy F, Stander H, Donovick R. In vitro studies on isonicotinicacid hydrazide. Am Rev Tuberc 1952;65:761—4.

[5] Zhang Y. Isoniazid. In: Rom WN, Garay SM, editors. Tubercu-losis. . 2nd ed, Philadelphia, PA, USA: Lippincott Williams andWilkins; 2004. p. 739—58.

[6] Heifets L. Antituberculosis drugs: antimicrobial activity invitro. Drug susceptibility in the chemotherapy of mycobacterialinfections. Boca Raton: CRC Press; 2001. p. 13—58.

[7] Mitchison DA, Selkon JB. The bactericidal activities of anti-tuberculous drugs. Am Rev Tuberc 1956;74:109—16.

[8] Canetti G, Rist N, Grosset J. Measurement of sensitivity of thetuberculous bacillus to antibacillary drugs by the method ofproportions. Methodology, resistance criteria, results andinterpretation. Rev Tuberc Pneumol (Paris) 1963;27:217—72.

[9] Kucers A. Isoniazid. In: Kucers A, Crowe SM, Grayson ML, HoyJF, editors. The use of antibiotics: a clinical review of anti-bacterial, antifungal and antiviral drugs. . 5th ed, Boston:Butterworth-Heineman; 1997. p. 1179—210.

[10] Sim E, Payton M, Noble M, Minchin R. An update on genetic,structural and functional studies of arylamine N-acetyltransfe-rases in eucaryotes and procaryotes. Hum Mol Genet 2000;9:2435—41 [Review].

[11] Winder FG, Collins PB. Inhibition by isoniazid of synthesis ofmycolic acids in Mycobacterium tuberculosis. J Gen Microbiol1970;63:41—8.

[12] Takayama K, Wang L, David HL. Effect of isoniazid on the in vivomycolic acid synthesis, cell growth, and viability of Mycobac-terium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 1972;2:29—35.

[13] Davidson LA, Takayama K. Isoniazid inhibition of the synthesisof monounsaturated long-chain fatty acids in Mycobacteriumtuberculosis H37Ra. Antimicrob Agents Chemother 1979;16:104—5.

[14] Banerjee A, Dubnau E, Quemard A, Balasubramanian V, Um KS,Wilson T, et al. inhA, a gene encoding a target for isoniazid andethionamide in Mycobacterium tuberculosis. Science 1994;263:227—30.

[15] Jacobs Jr WR, Tuckman M, Bloom BR. Introduction of foreignDNA into mycobacteria using a shuttle phasmid. Nature1987;327:532—5.

[16] Cole ST, Brosch R, Parkhill J, Garnier T, Churcher C, Harris D,et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosisfrom the complete genome sequence. Nature 1998;393:537—44.

[17] Zhang Y, Heym B, Allen B, Young D, Cole S. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacteriumtuberculosis. Nature 1992;358:591—3.

[18] Vilchèze C, Jacobs Jr WR. The mechanism of isoniazid killing:clarity through the scope of genetics. Annu Rev Microbiol2007;61:35—50.

[19] Middlebrook G. Isoniazid resistance and catalase activity oftubercle bacilli. Am Rev Tuberc 1954;69:471—2.

[20] Heym B, Alzari PM, Honore N, Cole ST. Missense mutations inthe catalase-peroxidase gene, katG, are associated with iso-niazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol1995;15:235—45.

[21] Li Z, Kelley C, Collins F, Rouse D, Morris S. Expression of katG inMycobacterium tuberculosis is associated with its growth andpersistence in mice and guinea pigs. J Infect Dis 1998;177:1030—5.

[22] Wilson TM, de Lisle GW, Collins DM. Effect of inhA and katG onisoniazid resistance and virulence of Mycobacterium bovis. MolMicrobiol 1995;15:1009—15.

[23] Armstrong JA, Hart PD. Response of cultured macrophages toMycobacterium tuberculosis, with observations on fusion oflysosomes with phagosomes. J Exp Med 1971;134:713—40.

[24] Heym B, Stavropoulos E, Honoré N, Domenech P, Saint-Joanis B,Wilson TM, et al. Effects of overexpression of the alkyl hydro-peroxide reductase AhpC on the virulence and isoniazid resis-tance of Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun 1997;65:1395—401.

[25] Manca C, Paul S, Barry 3rd CE, Freedman VH, Kaplan G. Myco-bacterium tuberculosis catalase and peroxidase activities andresistance to oxidative killing in human monocytes in vitro.Infect Immun 1999;67:74—9.

[26] Pym AS, Domenech P, Honore N, Song J, Deretic V, Cole ST.Regulation of catalase-peroxidase (KatG) expression, isoniazidsensitivity and virulence by furA of Mycobacterium tuberculo-sis. Mol Microbiol 2001;40:879—89.

[27] Zahrt TC, Song J, Siple J, Deretic V. Mycobacterial FurA is anegative regulator of catalase-peroxidase gene katG. MolMicrobiol 2001;39:1174—85.

[28] Jakopitsch C, Vlasits J, Wiseman B, Loewen PC, Obinger C.Redox intermediates in the catalase cycle of catalase-peroxi-dases from Synechocystis PCC 6803, Burkholderia pseudomal-lei, and Mycobacterium tuberculosis. Biochemistry 2007;46:1183—93.

[29] Welinder KG. Bacterial catalase-peroxidases are gene duplica-ted members of the plant peroxidase superfamily. BiochimBiophys Acta 1991;1080:215—20.

226 F. Brossier

[30] Ghiladi RA, Knudsen GM, Medzihradszky KF, Ortiz de MontellanoPR. The Met-Tyr-Trp cross-link in Mycobacterium tuberculosiscatalase-peroxidase (KatG): autocatalytic formation and effecton enzyme catalysis and spectroscopic properties. J Biol Chem2005;280:22651—63.

[31] Johnsson K, Schultz PG. Mechanistic studies of the oxidation ofisoniazid by the catalase peroxidase from Mycobacteriumtuberculosis. J Am Chem Soc 1994;116:7425—6.

[32] Lei B, Wei CJ, Tu SC. Action mechanism of antitubercularisoniazid. Activation by Mycobacterium tuberculosis KatG, iso-lation, and characterization of inhA inhibitor. J Biol Chem2000;275:2520—6.

[33] Zhao X, Yu H, Yu S, Wang F, Sacchettini JC, Magliozzo RS.Hydrogen peroxide-mediated isoniazid activation catalyzed byMycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase (KatG) and itsS315T mutant. Biochemistry 2006;45:4131—40.

[34] Quémard A, Sacchettini JC, Dessen A, Vilcheze C, Bittman R,Jacobs Jr WR, et al. Enzymatic characterization of the targetfor isoniazid in Mycobacterium tuberculosis. Biochemistry1995;34:8235—41.

[35] Rozwarski DA, Grant GA, Barton DH, Jacobs Jr WR, SacchettiniJC. Modification of the NADH of the isoniazid target (InhA) fromMycobacterium tuberculosis. Science 1998;279:98—102.

[36] Vidossich P, Alfonso-Prieto M, Carpena X, Loewen PC, Fita I,Rovira C. Versatility of the electronic structure of compound I incatalase-peroxidases. J Am Chem Soc 2007;129:13436—4.

[37] Pierattelli R, Banci L, Eady NA, Bodiguel J, Jones JN, Moody PC,et al. Enzyme-catalyzed mechanism of isoniazid activation inclass I and class III peroxidases. J Biol Chem 2004;279:39000—9.

[38] Ghiladi RA, Medzihradszky KF, Rusnak FM, Ortiz de MontellanoPR. Correlation between isoniazid resistance and superoxidereactivity in Mycobacterium tuberculosis KatG. J Am Chem Soc2005;127:13428—42.

[39] Wengenack NL, Hoard HM, Rusnak F. Isoniazid oxidation byMycobacterium tuberculosis: a role for superoxide which cor-relates with isoniazid susceptibility. J Am Chem Soc 1999;121:9748—9.

[40] Cade CE, Dlouhy AC, Medzihradszky KF, Salas-Castillo SP, Ghi-ladi RA. Isoniazid-resistance conferring mutations in Mycobac-terium tuberculosis KatG: catalase, peroxidase, and INH-NADHadduct formation activities. Protein Sci 2010;19:458—74.

[41] Singh AK, Kumar RP, Pandey N, Singh N, Sinha M, Bhushan A,et al. Mode of binding of the tuberculosis prodrug isoniazid toheme peroxidases: binding studies and crystal structure ofbovine lactoperoxidase with isoniazid at 2.7 Å resolution. JBiol Chem 2010;285:1569—76.

[42] Metcalfe C, Macdonald IK, Murphy EJ, Brown KA, Raven EL,Moody PC. The tuberculosis prodrug isoniazid bound to activat-ing peroxidases. J Biol Chem 2008;283:6193—200.

[43] Bertrand T, Eady NA, Jones JN, Jesmin, Nagy JM, Jamart-Grégoire B, et al. Crystal structure of Mycobacterium tubercu-losis catalase-peroxidase. J Biol Chem 2004;279:38991—9.

[44] Larsen MH, Vilcheze C, Kremer L, Besra GS, Parsons L, SalfingerM, et al. Overexpression of inhA, but not kasA, confers resis-tance to isoniazid and ethionamide in Mycobacterium smegma-tis, M. bovis BCG and M. tuberculosis. Mol Microbiol 2002;46:453—66.

[45] Dessen A, Quemard A, Blanchard JS, JacobsWR Jr, SacchettiniJC. Crystal structure and function of the isoniazid target ofMycobacterium tuberculosis. Science 1995;267:1638—41.

[46] Marrakchi H, Laneelle G, Quemard A. InhA, a target of theantituberculous drug isoniazid, is involved in a mycobacterialfatty acid elongation system, FAS-II. Microbiology 2000;146:289—96.

[47] Argyrou A, Vetting MW, Blanchard JS. New insight into themechanism of action of and resistance to isoniazid: interactionof Mycobacterium tuberculosis enoyl-ACP reductase with INH-NADP. J Am Chem Soc 2007;129:9582—3.

[48] Rawat R, Whitty A, Tonge PJ. The isoniazid-NAD adduct is aslow, tight-binding inhibitor of InhA, the Mycobacterium tuber-culosis enoyl reductase: adduct affinity and drug resistance.Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:13881—6.

[49] Vilchèze C, Wang F, Arai M, Hazbon MH, Colangeli R, Kremer L,et al. Transfer of a point mutation in Mycobacterium tubercu-losis inhA resolves the target of isoniazid. Nat Med 2006;12:1027—9.

[50] Mdluli K, Slayden RA, Zhu Y, Ramaswamy S, Pan X, Mead D, et al.Inhibition of a Mycobacterium tuberculosis beta-ketoacyl ACPsynthase by isoniazid. Science 1998;280:1607—10.

[51] Ducasse-Cabanot S, Cohen-Gonsaud M, Marrakchi H, Nguyen M,Zerbib D, Bernadou J, et al. In vitro inhibition of the Myco-bacterium tuberculosis beta-ketoacyl-acyl carrier proteinreductase MabA by isoniazid. Antimicrob Agents Chemother2004;48:242—9.

[52] Timmins GS, Master S, Rusnak F, Deretic V. Requirements fornitric oxide generation from isoniazid activation in vitro andinhibition of mycobacterial respiration in vivo. J Bacteriol2004;186:5427—31.

[53] Argyrou A, Vetting MW, Aladegbami B, Blanchard JS. Mycobac-terium tuberculosis dihydrofolate reductase is a target forisoniazid. Nat Struct Mol Biol 2006;13:408—13.

[54] Musser JM, Kapur V, Williams DL, Kreiswirth BN, van SoolingenD, van Embden JD. Characterization of the catalase-peroxidasegene (katG) and inhA locus in isoniazid-resistant and -suscep-tible strains of Mycobacterium tuberculosis by automated DNAsequencing: restricted array of mutations associated with drugresistance. J Infect Dis 1996;1731:196—202.

[55] Brossier F, Veziris N, Jarlier V, Sougakoff W. Performance ofMTBDRplus for detecting high/low levels of Mycobacteriumtuberculosis resistance to isoniazid. Int J Tuberc Lung Dis2009;13:260—5.

[56] Hazbón MH, Brimacombe M, Bobadilla del Valle M, Cavatore M,Guerrero MI, Varma-Basil M, et al. Population genetics study ofisoniazid resistance mutations and evolution of multidrugresis-tant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemo-ther 2006;50:2640—9.

[57] Ramaswamy SV, Reich R, Dou SJ, Jasperse L, Pan X, Wanger A,et al. Single nucleotide polymorphisms in genes associated withisoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. AntimicrobAgents Chemother 2003;47:1241—50.

[58] Guo H, Seet Q, Denkin S, Parsons L, Zhang Y. Molecular cha-racterization of isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobac-terium tuberculosis from the USA. J Med Microbiol 2006;55:1527—31.

[59] van Soolingen D, de Haas PE, van Doorn HR, Kuijper E, Rinder H,Borgdorff MW. Mutations at amino acid position 315 of the katGgene are associated with high-level resistance to isoniazid,other drug resistance, and successful transmission of Mycobac-terium tuberculosis in the Netherlands. J Infect Dis 2000;182:1788—90.

[60] Ranguelova K, Suarez J, Magliozzo RS, Mason RP. Impact ofdistal side water and residue 315 on ligand binding to ferricMycobacterium tuberculosis catalase-peroxidase (KatG). Bio-chemistry 2008;47:12583—92.

[61] Zhao X, Yu S, Magliozzo RS. Characterization of the binding ofisoniazid and analogues to Mycobacterium tuberculosis cata-lase-peroxidase. Biochemistry 2007;46:3161—70.

[62] Yu S, Girotto S, Lee C, Magliozzo RS. Reduced affinity forisoniazid in the S315T mutant of Mycobacterium tuberculosisKatG is a key factor in antibiotic resistance. J Biol Chem2003;278:14769—75.

[63] Pym AS, Saint-Joanis B, Cole ST. Effect of katG mutations on thevirulence of Mycobacterium tuberculosis and the implicationfor transmission in humans. Infect Immun 2002;70:4955—60.

[64] Gagneux S, Burgos MV, DeRiemer K, Encisco A, Muñoz S, Hope-well PC, et al. Impact of bacterial genetics on the transmission

Mécanismes d’action et de résistance de l’isoniazide 227

of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog2006;2:e61.

[65] Lee AS, Lim IH, Tang LL, Telenti A, Wong SY. Contribution ofkasA analysis to detection of isoniazid-resistant Mycobacteriumtuberculosis in Singapore. Antimicrob Agents Chemother1999;43:2087—9.

[66] Sherman DR, Mdluli K, Hickey MJ, Arain TM, Morris SL, Barry 3rdCE, et al. Compensatory ahpC gene expression in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis. Science 1996;272:1641—3.

[67] Springer B, Master S, Sander P, Zahrt T, McFalone M, Song J,et al. Silencing of oxidative stress response in Mycobacteriumtuberculosis: expression patterns of ahpC in virulent and avi-rulent strains and effect of ahpC inactivation. Infect Immun2001;69:5967—73.

[68] Kiepiela P, Bishop KS, Smith AN, Roux L, York DF. Genomicmutations in the katG, inhA and ahpC genes are useful for theprediction of isoniazid resistance in Mycobacterium tubercu-losis isolates from Kwazulu Natal, South Africa. Tuber Lung Dis2000;80:47—56.

[69] Sekiguchi J, Miyoshi-Akiyama T, Augustynowicz-Kopec E,Zwolska Z, Kirikae F, Toyota E, et al. Detection of multidrugresistance in Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol2007;45:179—92.

[70] Projahn M, Köser CU, Homolka S, Summers DK, Archer JA,Niemann S. Polymorphisms in isoniazid and prothionamideresistance genes of the Mycobacterium tuberculosis complex.Antimicrob Agents Chemother 2011;55:4408—11.

[71] Basso LA, Zheng R, Musser JM, Jacobs Jr WR, Blanchard JS.Mechanisms of isoniazid resistance in Mycobacterium tubercu-losis: enzymatic characterization of enoyl reductase mutantsidentified in isoniazid-resistant clinical isolates. J Infect Dis1998;178:769—75.

[72] Dias MV, Vasconcelos IB, Prado AM, Fadel V, Basso LA, deAzevedo Jr WF, et al. Cristallographic studies on the bindingof isonicotinyl-NAD adduct to wild-type and isoniazid resistant2-trans-enoyl-ACP (CoA) reductase from Mycobacterium tuber-culosis. J Struct Biol 2007;159:369—80.

[73] Lee AS, Teo AS, Wong SY. Novel mutations in ndh in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates. AntimicrobAgents Chemother 2001;45:2157—9.

[74] Miesel L, Weisbrod TR, Marcinkeviciene JA, Bittman R, JacobsJr WR. NADH dehydrogenase defects confer isoniazid resistanceand conditional lethality in Mycobacterium smegmatis. J Bac-teriol 1998;180:2459—67.

[75] Vilchèze C, Weisbrod TR, Chen B, Kremer L, Hazbón MH, WangF, et al. Altered NADH/NAD+ ratio mediates coresistance toisoniazid and ethionamide in mycobacteria. Antimicrob AgentsChemother 2005;49:708—20.

[76] Buchmeier NA, Newton GL, Koledin T, Fahey RC. Association ofmycothiol with protection of Mycobacterium tuberculosis fromtoxic oxidants and antibiotics. Mol Microbiol 2003;47:1723—32.

[77] Rawat M, Newton GL, Ko M, Martinez GJ, Fahey RC, Av-Gay Y.Mycothiol deficient Mycobacterium smegmatis mutants arehypersensitive to alkylating agents, free radicals, and anti-biotics. Antimicrob Agents Chemother 2002;46:3348—55.

[78] Upton AM, Mushtaq A, Victor TC, Sampson SL, Sandy J, SmithDM, et al. Arylamine Nacetyltransferase of Mycobacteriumtuberculosis is a polymorphic enzyme and a site of isoniazidmetabolism. Mol Microbiol 2001;42:309—17.

[79] Karakousis PC, Williams EP, Bishai WR. Altered expression ofisoniazid-regulated genes in drug-treated dormant Mycobac-terium tuberculosis. J Antimicrob Chemother 2008;61:323—31.

[80] Colangeli R, Helb D, Sridharan S, Sun J, Varma-Basil M, HazbónMH, et al. The Mycobacterium tuberculosis iniA gene is essen-tial for activity of an efflux pump that confers drug tolerance toboth isoniazid and ethambutol. Mol Microbiol 2005;55:1829—40.

[81] Ahmad Z, Klinkenberg LG, Pinn ML, Fraig MM, Peloquin CA,Bishai WR, et al. Biphasic kill curve of isoniazid reveals thepresence of drug-tolerant, not drug-resistant, Mycobacteriumtuberculosis in the guinea pig. J Infect Dis 2009;200:1136—43.

[82] Burgos M, DeRiemer K, Small PM, Hopewell PC, Daley CL. Effectof drug resistance on the generation of secondary cases oftuberculosis. J Infect Dis 2003;188:1878—84.

[83] Cohen T, Sommers B, Murray M. The effect of drug resistance onthe fitness of Mycobacterium tuberculosis. Lancet Infect Dis2003;3:13—21.

[84] Godfrey-Faussett P, Sonnenberg P, Shearer SC, Bruce MC, MeeC, Morris L, et al. Tuberculosis control and molecular epide-miology in a South African gold-mining community. Lancet2000;356:1066—71.

[85] van Soolingen D, Borgdorff MW, de Haas PE, Sebek MM, Veen J,Dessens M, et al. Molecular epidemiology of tuberculosis in theNetherlands: a nationwide study from 1993 through 1997. JInfect Dis 1999;180:726—36.

[86] Moulding TS. Should isoniazid be used in retreatment of tuber-culosis despite acquired isoniazid resistance? Am Rev Respir Dis1981;123:262—4.

[87] Donald PR, Singel FA, Venter A, Parkin DP, Seifart HI, van de WalBW, et al. The influence of human N-acetyltransferase geno-type on the early bactericidal activity of isoniazid. Clin InfectDis 2004;39:1425—30.

[88] Katiyar SK, Bihari S, Prakash S, Mamtani M, Kulkarni H. Arandomised controlled trial of high-dose isoniazid adjuvanttherapy for multidrug-resistant tuberculosis. Int J Tuberc LungDis 2008;12:139—45.

[89] Devadatta S, Bhatia AL, Andrews RH, Fox W, Mitchison DA,Radhakrishna S, et al. Response of patients infected withisoniazid-resistant tubercle bacilli to treatment with isoniazidplus PAS or isoniazid alone. Bull World Health Organ1961;25:807—29.

[90] International Union Against Tuberculosis. A comparison ofregimens of ethionamide, pyrazinamide and cycloserine inretreatment of patinets with pulmonary tuberculosis. Bull IntUnion Tuberc 1969;42:7—57.

[91] Petty TL, Mitchell RS. Successful treatment of advanced iso-niazid- and streptomycin-resistant pulmonary tuberculosis withethionamide, pyrazinamide, and isoniazid. Am Rev Respir Dis1962;86:503—12.

[92] World Health Organization. Guidelines for the programmaticmanagement of drug-resistant tuberculosis. Emergency update2008. WHO/HTM/2008.402. Geneva, Switzerland: WHO; 2008.

[93] Mitchison DA, Nunn AJ. Influence of initial drug resistance onthe response to short-course chemotherapy of pulmonarytuberculosis. Am Rev Respir Dis 1986;133:423—30.

[94] Siddiqi S, Takhar P, Baldeviano C, Glover W, Zhang Y. Isoniazidinduces its own resistance in nonreplicating Mycobacteriumtuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 2007;51:2100—4.