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MARTKN GUILBERT
Étude de la transmigration de l'éosinophile sanguin à travers une membrane basale
artificielle. Comparaison de sujets asthmatiques et normaux.
Mémoire
présenté
à la facuité des études supérieures
de l'université Laval
po-m l'obtention
du grade de maître ès sciences (MSc.)
O Martin Guilbert, 1999
Bibliothèque nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions et BibliographicÇervices se~kesbibliographiques
395 Wellington Street 395. rue Wellington OttawaON K1AON4 Ottawa ON K1A ON4 Canada Canada
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L'asthme est caractérisé par une inflammation bronchique où prédomine l'éosinophile. Ce
travail a pour but d'étudier les mécanismes régissant le passage de L'éosinophiIe sanguin à
travers la matrice extraceUulaire. Nos résultats suggèrent qu'au niveau basal, l'éosinophile
n'a pas la capacité de traverser une membrane basaie artificielle alors que sous l'influence
d'agents chimiotactiques tels que le 5-0x0-ETE et le PAF, la cellule devient apte à traverser
cette membrane. L'ajout d'une cytokine inflammatoire (IL4 potentialise l'effet de ces
agents. De plus, la transmigration est dépendante de la capacité de l'éosinophile à dégrader
la membrane à l'aide de protéases puisque l'ajout d'inhibiteurs de ces protéases entraîne une
diminution significative de la transmigration. Aucune différence significative entre les
éosinophiles provenant de sujets asthmatiques et normaux n'a été décelée. Ces résultats
suggèrent que le recrutement de l'éosinophile 1 . le site inflammatoire nécessite une
combinaison de facteurs chimiotactiques et d'enzymes impliquées dans la dégradation du
tissu.
Martin Guilbert (étudiant-candidat) Michel Laviolette (directeur)
AVANT-PROPOS
Mon travail réalisé tout au long des 24 mois de ma maîtrise a été ponctué de grands moments.
Plusieurs personnes ont cheminé avec moi dans toutes les étapes de ma maîtrise et ont ainsi
rendu le travail beaucoup plus facile et agréable. Je tiens donc à remercier tous ces gens qui
m'ont éclairé de leur savoir et connaissances, mais également et surtout, qui ont voulu
partager avec moi leur amitié, leur confiance et leurs encouragements.
J'aimerais remercier tout d'abord Dr. Michel Laviolette de m'avoir offert ma chance et de
m'avoir encouragé dans la poursuite de mes travaux. J'ai apprécié être sous sa direction' ses
conseils et ses nombreuses comaissances m'ont permis de mieux comprendre l'éosinophile
et l'asthme. J'aimerais également le remercier de m'avoir offert l'opportunité de présenter
mes résultats lors de plusieurs congrès.
C'est avec empressement que je tiens à remercier les professiomels(1es) de recherche et
étudiants gradués de l'équipe du Dr. Laviolette, soit Sophie Lavigne, Geneviève Lafiamme,
Marc Bossé et Claudine Ferland. Je remercie Sophie pour son incroyable professionnalisme,
de m'avoir fait découvrir le monde de la cytométrie et également pour m'avoir facilité la
transition entre le baccalauréat et la recherche en laboratoire. Ses nombreux conseils et sa
gentillesse ne me laissent que de bons souvenirs. Merci à Geneviève Laflamme pour m'avoir
appris quelques rudiments de la biologie moléculaire et m'avoir souvent transmis sa bonne
humeur. Merci au grand Marc pour son excellent esprit d'analyse et pour ses innombrables
conseils. Finalement, merci à Claudine pour m'avoir étroitement supervisé pendant toutes
ces journées. Une large part de mes comaissances proviennent de son enseignement et ce fut
un réel plaisir que de la côtoyer le matin, l'après-midi et parfois le soir. Sa générosité, sa
h c h i s e et bien d'autres qualités font d'elle une femme digne d'admiration.
Je désire également souligner l'aide de plusieurs chercheurs de l'unité de recherche, soit
Bruno Battistini, Jamila Chakir, Jacques Couet, Azzédine Dakhama et Guy Trembiay pour
m'avoir prodigué de nombreux conseils théoriques ou techniques sans quoi, la réalisation de
ce projet aurait été grandement affectée. Il ne faudrait pas passer sous silence l'agréable
présence de Leurs professiomeiles de recherche : Evelyne Assayag, Nathalie Pagé, Sylvie St-
Martin et Claudia Racine qui m'ont apporté leur riche enseignement technique et leur support
tout au Iong de ma maîtrise.
Je désire remercier mes vampires préférés pour leur excellent travail mais également leur très
grande disponibilité dans le recrutement et la prise de sang des volontaires. Merci à Luce
Trépanier, Franche Deschesnes, Johanne Milot, Marie-Josée Breton et Marthe Bélanger.
Je remercie tous mes arnis(es) étudiants(es) et professio~els(les) du centre de recherche pour
tous les bons moments que nous avons partagés ensemble. Je tiens à remercier plus
particulièrement Nicolas Flamand un collègue de travail hors pair et tout simplement un ami
qui m'a appris beaucoup.
Je remercie Le centre de recherche ainsi que l'organisme subventionnaire FCAR-FRSQ pour
avoir cru en mon projet et pour m'avoir versé des bourses d'études.
Finalement, plusieurs personnes restent malheureusement souvent dans l'ombre et je veux les
remercier car ils ont été ma source de motivation, et d'encouragement. Merci à mon père
Louis, ma mère Claire, ma soeur Amélie et mon fière Vincent pour avoir été ce qu'ils sont et
pour avoir contribué d'une manière ou d'une autre au succès de mon entreprise. De plus, un
merci bien spécial à mon grand-père Côme pour avoir revisé le manuscrit.
Je dédie donc ce mémoire à tous mes ami(e)s mais surtout à Julie, qui m'a offert son support
et sa confiance et bien plus tout au long de mes études.
TABLE DES MATIÈREs
RÉsuMÉ ......,............ ..........................................................*..*..............................**.*.*..***......... 1
AVm.PROPOS.. ................................................................................................................... H . TABLE DES MATIERES.... .................................................................................................. VI
LISTE DES TABLEAtlX......... ............................................................................ .œ***.***e.*toe~eVrr
LIS= DES FIGURES ........................................................................................................ VLIT
LISTE DES ABRÉVIATIONS .............................................................................................. IX
1.1. L'ASTHME ...................................................................................................................... 1
1.1.1. DÉFINIT~ON .......... .-....,. ..................... L
.................................................................................... 1.1 .2 . E~OLOGIE .....-.. .................... 2
1.1.3. ÉPIDÉMIOLOGIE ........................................................................................................ 4
1 . 1.4. CELLULES EFFECTRICES DANS L'ASTHME .......................................... ....... 6
1.2.2.1. Constituants intracellulaires ................... ..,. .................................................... 8 C .. . .......... 1.2.3. EOSINOPHILOPO~ESE ...........,..... .., ................................................ 10
1 .2.4. PROPMÉTES PRO-RWLAMMATOIRES DE L'ÉOSINOPHILE .......................................... I I
1.2.4.1. Cytokines ..................................... ,., ............................... 11
1.2.4.2. Métabolites de l'acide arachidonique ................................................................. 12 . .
1.2.4.3. Proteines basiques (cationiques) .................................. ...,.. ............................ 14
1 2.5 . RECRUTEMENT DES LEUCOCYTES VERS LE TISSU MFLAMMÉ ............................ ...... 17
1.2.5.1. Séquence d'évènements survenant lors du recrutement ..................... .... ........ 18
................................................................................. 1 .2.5.2. Molécules chimiotactiques 21
A. Chimiohes ........ .,. ......................................................................... 21 ............................................................................. B . Peptides et protéines 23
........................................................ . C Dérivés de l'acide arachidonique -25
................................................................................ 1 .3 . MATRICE EXTRACELLULARE 26
- . 1.3 3.1. Métalloproteinases ............. .. ............................................................................ 33
13 .32 . Système du plasminogène et de la plasmine ......................................... 3 4
CHAPITRE 2 : HYPOTHÈSES ET BUTS ..................................................... 37
2-1 . HYPOTHÈSES DE TRAVAIL ...................................................................................... 37
2.2. BUTS .............................................................................................................................. 38
CHAPITRE 3 : ARTICLE œ œ e e e m m m œ œ œ œ m œ œ œ œ œ œ œ m œ œ œ œ œ œ œ œ œ œ œ œ œ œ m œ œ œ œ ~ œ m m œ œ œ œ œ m œ œ œ œ œ m œ œ e œ œ œ m œ œ œ m œ m m m 40
3.1. TITRE .......................................................................................................................... 40
......................................................................................................... 3 .4 . INTRODUCTION -43
3.5. METHODS ..................................................................................................................... 46
3.6. RESULTS .............................................................. ,... .............................................. A 0
3.7. DISCUSSION ............................................ ......... ............................................................ 53
............................................................................................................. 3.9. REFERENCES 57
3.10 . LEGENDS .................................................................................................................... 63
...................................................................................................................... 3.1 1 . FIGURES 65
CHAPITRE 4 : DISCUSSION .......................................................................... 70
LISTE DES TABLEAUX
TABLEAU I : STRUCTURES CYTOPLASMIQUES GRANULAIRES DES ÉOSINOPHILES 9
TABLEAU 2 : DESCRIPTION DES PROTÉINES CAnONIQUES ASSOCIEES AUX GRANULES 17
TABLEAU 3 : MEMBRES DE LA FAMILLE DES CHIMIOKINES a 23
TABLEAU 4 : MEMBRES DE LA FAMILLE DES CHIMIOKINES P 24
TABLEAU s : PRINCIPAUX MÉDIATEURS LPIDIQUES AYANT DES PROPRIÉTÉS ATTRACTIVES
SUEZ L*ÉOSMOPHILE 25
TABLEAU 6 : COMPOSANTES MAJEURES DE LA MEMBRANE BASALE 29
TABLEAU 7 : PRMCiPALES PROTÉASES DE TYPE SÉFUNE, LEURS SUBSTRATS ET LEURS
MHIBIEURS 32
TABLEAU 8 : PRINCIPALES PROTÉASES DE TYPE MÉTALLO, LEURS SUBSTRATS ET LEURS
INHLBITEURS 33
LISTE DES FIGURES
FIGURE 1: VOIE MÉTABOLIQUE DE L'ACIDE ARACJ3DONIQUE PAR LA 5-LIPOXYGÉNASE CHEZ
L~ÉOSMOPHILE. 10
FIGURE 2 : L~ÉOSINOPMLE ET LE SYSTÈME D'ACTNATION DU PLASMINOGÈNE 39
LISTE DES ABRÉVIATIONS
C5a :
CAM :
CD :
CFU :
CLA :
ECP :
EDN :
ENA-78 :
EPO :
ESL-1 :
fMLP :
GM-CSF :
GR0 :
5-HETE :
5-HpETE :
HB-EGF :
E N :
k IP-10 :
IL:
5-LO :
LT :
LW :
MAPK :
MCP-1,2,3
<< Complement factor-5a »
<< CeH Adhesion Molecule »
(< Cluster of Dserentiation »
<< Colony Fomüng Unit »
<< Cutaneous Lymphocyte Antigen »
<< Eosinophil Cationic Protein »
<< Eosinophil-Derived Neurotoxin »
<< Epithelial Derived Neutrophil Attractant-78 >>
<< Eosinophil Peroxidase »
<< E-Selectin Ligand- 1 »
a formyl-Methyl-Leucine-Phenylalanine »
<< Granulocyte-Macrop hage Colony S timulating Factor »
<< Growth-Related Oncogenes »
acide 5-hydroxy-6,8,11,14-éicosatétraénoïque
acide 5-hydroperoxy-6,8,11,14-éicosatétraénoïque
<( Heparin-Binding Epidermal Growth Factor »
Interféron
Immu~1oglobuline
Interferon-inducible Protein- 1 O »
Interleukine
5-lipoxygénase
Leucohiène
<< Landsteiner-Wiener Antigen »
<( Mitogen-Activated Protein Kinase >>
a Monocyte Chemotactic Peptide »
MIP-1: a Macrophage Inflammatory Protein- 1 »
MMPs : a Matrix Metalloproteinases »
NADPH : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
NAP: << Neutrophil Activating Peptide »
5-0x0-ETE : Acide 5-0x0-6,8,1 I ,14-éicosatétraénoïque
PAF :
PM- 1 -2 :
PDGF :
PF-4 :
PMA :
RANTES :
SLPI :
TrME':
TGF :
TNF :
VEGF :
<< PIatelet A c t i v a ~ g Factor »
<< Plasminogen Activator Inhibitor-1 -2 »
Platelet-Derived Growth Factor »
a Platelet ~ictor-4 »
G Phorbol 12-Myristate 13 -Acetate »
<< Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted »
<< Secretory Leukoprotease inhibitor »
<< Tissue inhibitor of Metdoprotease »
<< Transforming Growth Factor »
a Tumor Necrosis Factor »
<< Vascular Endothelid Ce11 Growîh Factor »
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION
1.1. L'ASTHME
i -1.1. DÉFINITION
L'asthme est une affection caractérisée par des accès de dyspnée (respiration difficile et
pénible), Liés au spasme, à la congestion et à l'hypersécrétion des bronches et pouvant
persister pendant plusieurs jours. Ainsi, l'asthme est une maladie qui se manifeste par des
épisodes d'obstruction bronchique variables et réversibles et par une hyperréactivité
bronchique associée à l'établissement d'un état inflammatoire. Cette inflammation peut
mener progressivement à des modifications physiologiques et histopathologiques des
bronches et de sa m c t u r e (1,2)-
L'asthme se caractérise par une inflammation chronique des muqueuses des voies
bronchiques. Cette inflammation cause une hyperréactivité des bronches qui se manifeste
dans plusieurs contextes cliniques :
1) Lors d'infections Wales respiratoires (bronchite asthmatique Wale).
2) Sans cause connue (asthme intrinsèque). Il y apparition ou aggravation des
symptômes qui surviennent suite à un changement de l'environnement, de la
température ou suite à une exposition à une odeur forte, à différentes poussières ou à
de la h é e de cigarette.
3) Suite à la prise de certains médicaments (aspirine, inhibiteur de la cyclooxygénase)
qui ont la propriété de déclencher une crise d'asthme chez certains individus.
4) Lors de contact avec un allergène. L'asthme allergique ou extrinsèque survient
chez les sujets allergiques (atopiques) lors de contact avec un allergène auquel ils sont
sensibilisés. L'asthme allergique est souvent associé à une rhino-conjonctivite, c'est-
à-dire à une inflammation des muqueuses nasales et de la conjonctive de l'œil.
5) Enfin, suite à une exposition spécifique sur le site de travail (asthme professionnel).
Les symptômes peuvent être déclenchés soit par un mécanisme allergique comme une
exposition aux pellicules d'animaux chez un vétérinaire ou la farine chez les
cuisiniers, ou bien par un mécanisme encore mal cerné comme dans les cas d'asthme
aux isocyanates, au cèdre rouge ou à la formaldéhyde.
L'allergie des voies respiratoires est un état de sensibilité spécifique pour des substances7
appelées aussi allergènes, qui sont habituellement tolérés par la plupart des individus.
L'organisme hôte se défend alors d'une manière exagérée, en produisant des anticorps
spécifiques de type IgE spécialement dirigés contre les allergènes. La réaction allergique
peut se manifester soit toute l'année ou d'une façon saisonnière. Elle peut se traduire par une
rhinite allergique, c'est-à-dire reliée à un écoulement et une congestion nasale ainsi qu'à des
éternuements souvent associés a une conjonctivite.
La toux peut être annonciatrice de l'asthme lorsqu'elle survient pendant la nuit ou lors d'un
exercice physique intense. La sensation d'étouffement ou d'oppression respiratoire survenant
lors d'épisodes d'asthme s'explique par plusieurs mécanismes. Premièrement,
l'aéroallergène inhalé entre en contact avec la muqueuse bronchique et déclenche une
réaction imniuno-allergique. Celle-ci provoque plusieurs phénomènes dont la fermeture des
bronches (bronchospasme), le gonflement de la paroi des bronches (oedème) et finalement la
production d'un mucus épais et collant. Dans le temps, la réaction bronchique peut être
divisée en deux étapes : la réaction immédiate et la réaction retardée. La réaction immédiate
correspond aux symptômes de I'asthme survenant durant l'heure suivant le contact avec un
allergène. La réaction asthmatique immédiate est la conséquence surtout d'une contraction
exagérée des muscles lisses bronchiques et d'un oedème de la muqueuse causés par des
médiateurs inflammatoires principalement d'origine mastocytaire (1 ) . Chez certains
individus, l'inhalation d'allergènes cause une réaction tardive qui débute de 3 à 6 heures
après ce contact allergénique et peut se poursuivre jusqu'à 12 à 24 heures après l'inhalation.
La réaction tardive accentue l'hyperréactivité bronchique pour quelques jours. L'examen
histologique de biopsies bronchiques et du contenu du lavage bronchoalvéolaire révèle une
infiltration pulmonaire de cellules inflammatoires, en particulier les éosinophiles (3-5).
Les bronches d'individus asthmatiques démontrent des caractéristiques particulières. En plus
de l'inflammation persistante, le remodellage des tissus est maintenant considéré comme un
constituant essentiel du phénotype asthmatique. En effet, certaines modifications de la
matrice extracellulaire, induites par l'inflammation, sont probablement responsables de
l'irréversibilité de l'hyperréactivité bronchique, aggravant les conséquences des poussées
inflammatoires survenant lors des contacts allergéniques (6). Ces modifications se
caractérisent notamment par une déposition de collagène sous la membrane basale et dans la
sous-muqueuse, une desquamation épithéliale, une hypertrophie des cellules à mucus, une
néovascularkation ainsi qu'à une hypertrophie ou hyperplasie des cellules musculaires Iisses
(1 1-
La prévalence de l'asthme est en augmentation constante dans la société et ce, malgré une
meilleure compréhension de la pathogénèse de cette maladie (7). Les conséquences au plan
humain et socio-économique sont importantes et significatives. Chaque année, au Québec
seulement, l'asthme est responsable de plus de 750 000 consultations médicales, 50 000 jours
d'hospitalisation et plus de 40 000 visites à l'urgence. Le nombre de jours de travail ainsi
perdu au Québec et au Canada annuellement à cause de l'asthme est estimé à 1'3 million. Le
poaefeuille de l'État en matière de santé n'est pas épargné avec des dépenses de plus de 600
millions de dollars dont 150 milLions au Québec seulement. Les raisons suspectées pouvant
expliquer l'augmentation de la prévalence de l'asthme ou des allergies incluent la
construction d'édifices et de logements plus hermétiques permettant ainsi une plus forte
concentration des allergènes contenus dans la poussière. On assiste alors à une augmentation
de l'exposition et de la sensibilisation des gens à ces mêmes allergènes. À cela s'ajoute les
effets des polluants atmosphériques et intérieurs pouvant contribuer à cette hausse. La
mortalité reliée à l'asthme demeure toutefois faible comparativement à d'autres maladies
pulmonaires chroniques et ne semble pas augmenter dans les pays où la médication, les
facteurs socio-économiques et psychologiques sont mieux controlés et les soins de santé plus
disponibles (7).
Plusieurs études démontrent clairement une association entre l'asthme et la rhinite allergique
(8). Une d'elles a par ailleurs démontré chez une cohorte de 1836 sujets que la prévalence de
ces deux maladies augmente avec l'âge des sujets (9). Elle démontre également que I'asthme
a trois fois plus de chance de se développer chez les sujets faisant une rhinite allergique et
ayant un test d'allergie positif. II a aussi été démontré qu'une infection des voies aériennes
supérieures peut accentuer la réponse des voies aériennes inférieures. En plus de causer une
exacerbation chez des personnes s o m t d'asthme, les infections m e s peuvent modifier la
réponse des bronches à des irritants inhalés comme l'histamine et la métacholine chez des
sujets sains et normaux (8)-
L'asthme est plus fiéquent chez les enfants que chez les adultes et les garçons sont plus
touchés que les Nles (10). Aujourd'hui, la participation de composantes génétiques dans le
développement de L'asthme ne fait plus de doute. Plusieurs études épidérniologiques
suggèrent qu'un enfant possédant une histoire familiale de maladie allergique a plus de
chance de soutnir d'asthme, de rhinite allergique ou de dermatite allergique ( 8 1 Malgré
cette contribution héréditaire' l'asthme demeure une maladie génétique complexe comme
I'hypertension, l'athérosclérose, l'arthrite ou le diabète et ne peut être associé en totalité à un
mode de transmission autosomal dominant, récessif ou lié au sexe.
L'exposition aux allergènes durant les 2 à 3 premières années de la vie apparait comme un
aspect important puisqu'elle pouCrait engendrer un stimulus de sensibilisation des voies
aériennes inférieures. Il a été suggéré que les trois premières années de la vie sont critiques
quant aux événements environnementaux qui peuvent influencer le développement du
phénotype de l'asthme. C'est ainsi que plusieurs pensent que certaines infections virales des
voies aériennes qui arrivent tôt dans la vie peuvent protéger l'individu d'un développement
éventuel d'asthme. Ceci pourrait expliquer en partie la relation inverse entre le statut socio-
économique et le développement de l'asthme. En effet, de fréquentes infections durant le
jeune âge permettrait une suppression de la voie allergique et de la sensibilisation
allergénique (1 2, 13). Cependant, cette théorie demeure hypothétique puisque certaines
infections virales, comme les bronchiolites, peuvent être impliquées dans la sensibilisation
allergéniaue chez Ies enfants nés chez une faniille ~ossédant une histoire d'aller~ies (14).
1.1-4. CELLULES EFFECTRICES DANS L'ASTHME
L'examen histologique des bronches de sujets asthmatiques montre une infiltration de
cellules inflammatoires tant au niveau de l'épithélium que dans la sous-muqueuse. La paroi
bronchique est oedematiée, l'épithélium est desquamé et une perte de cils est visible sur
certaines cellules épithéliales. Un plus grand nombre de mastocytes est présent et ils
présentent un phénotype activé. Le mastocyte, le basophile et l'éosinophile sont des cellules
effectrices importantes dans les phénomènes allergiques (15). IL est démontré que les
protéines associées aux granules cytoplasmiques ainsi que leurs produits dérivés des lipides
contribuent à la pathogénèse des maladies allergiques comme l'asthme. Ces trois cellules
contribuent à un rôle de protection de l'hôte face aux parasites mais peuvent également
sécréter un large éventail de médiateurs dont les cytokines et exprimer un phénotype qui leur
permet de réguler le développement ou la perpétuation de la réponse allergique.
1.2. ÉOSINOPHILES
Z -2. 1. INTRODUCTION
L'éosinophile est une cellule dérivée de la moëlle osseuse et fait parti de la grande famille des
globules blancs ou leucocytes. 11 a été pour la première fois décrit par Paul Ehrlich en 1879
et sa dénomination provient de la capacité de cette cellule à se colorer de façon intense en
présence du colorant acide éosine (16). L'éosinophile constitue de 3 à 5 % des leucocytes
totaux et n'est habituellement pas une cellule prédominante dans le sang. Le nombre
d'éosinophiles sanguins varie selon un cycle circadien, atteignant un sommet durant la nuit
lorsque les taux de corticostéroïdes sériques sont à leur plus bas (17). Le nombre
d'éosinophiles dans les tissus et le sang peut cependant augmenter dramatiquement lors de
dinérentes pathologies comme Lors d'une infection parasitaire (18-20) et dans certaines
maladies inflammatoires, telles les allergies et l'asthme (6'20-23)' les dermatites et certaines
maladies immunitaires (24). Cependant, même si les cellules dans le sang sont facilement
disponibles pour décompte et investigation, les éosinophiles sont surtout des cellules
tissulaires. En effet, le ratio éosinophile tissulaire/sanguin est supérieur à cent Les
éosinophiles prédominent principalement dans les tissus avec un interface épithélial comme
les tractus gastro-intestinaux, respiratoires et génito-urinaires infëneurs (19).
L'éosinophile possède plusieurs rôles, certains bénéfiques, d'autres potentiellement nuisibles
pour l'hôte. Sa capacité à libérer plusieurs médiateurs toxiques (radicaux Libres d'oxygènes
et protéines basiques) fait de L'éosinophile une arme puissante contre les gros organismes,
habituellement non-phagocytables, comme les helminthes ou vers parasites (18). Cependant,
ce rôle important dans la lutte aux parasites est de nouveau remis en question et toujours à
l'étude puisque de nouvelles idormations v i e ~ e n t mettre en doute ce rôle anti-parasitaire de
l'éosinophile. En effet, de récentes études effectuées chez la souris, où la réponse
éosinophilique était diminuée volontairement, ne démontraient pas de diminution de la
réponse de l'hôte face aux parasites (25'26). En plus de l'activité possible face aux parasites,
des évidences suggèrent que l'éosinophile aurait la capacité de réduire la transcription
rétrovirale par un mécanisme dépendant de la ribonucléase, une enzyme sécrétée par
l'éosinophile (27). De plus, de nouvelles informations mettent en lumière un rôle non-
négligeable de l'éosinophile dans la lutte aux cancers. En effet, cette cellule démontre une
puissante activité tumoricide lorsqu'elIe se retrouve dans un environnement riche en IL-4,
une cytokine impliquée dans l'infiltrat éosinophilique et dans les phénomènes allergiques
(28) -
Cependant, les agents cytotoxiques utilisés par l'éosinophile dans la défense de l'hôte
peuvent s'avérer dommageables pour les cellules avoisinantes et pour les fonctions normales
de certains tissus (6, 29, 30). La réponse effectrice de l'éosinophile peut contribuer aux
dommages et aux modifications physiologiques associées à une éosinophilie, incluant les
réactions d'hypersensibilité et les allergies. Une étude démontre par ailleurs un lien entre la
présence de l'éosinophile et la pathogénèse de plusieurs maladies allergiques (3 1).
En plus de ces fonctions effectrices, l'éosinophile peut avoir des rôles dans la réponse
immunitaire. Par exemple, l'éosinophile qui normalement réside dans les tissus muqueux
participe probablement à l'immunité mucosaie, mais ses fonctions spécifiques n'ont toujours
pas été déterminees. L'éosinophile peut servir de cellules présentatrices d'antigènes ou
d'allergènes (15). Ce rôle peut être particulièrement important dans les tissus muqueux
exposés régulièrement à l'environnement externe, oii l'éosinophile est particulièrement
abondant. L'éosinophile a probablement plusieurs autres rôles comme dans la cicatrisation et
la réparation tissulaire ahsi que dans la modulation de la réponse immunitaire par une
communication avec le lymphocyte T (3 2).
1.2.2. MORPHOLOGIE
Une caractéristique morphologique de l'éosinophile est la présence de granules
intracytoplasmiques qui prennent une teinte rosée lorsque I'on place la cellule en présence du
colorant éosine et d'autres colorants acides. L'éosinophile possède un noyau bilobé,
caractéristique de la lignée granulocytaire. Son diamètre varie de 10 à 15 p, soit Iégèrement
plus grand que celui du neutrophile (33).
1.2.2.1. Constituants intracellulaires
Les g r d e s éosinophiliques sont des éléments importants tant du point de vue
morphologique que du point de vue fonctionnel et leur composition ainsi que leurs
constituants sont détaillés dans le tableau 1 (19, 33, 34). Les granules secondaires sont
visibles au microscope optique conventionnel alors que les petits granules et les
microgranules spécifiques ne sont visibles que par microscopie électronique (19,34).
Les Iarges grandes primaires, présents chez les éosinophiles immatures sonf du moins en
partie, les précurseurs des grandes secondaires qui apparaissent lorsque l'éosinophile anive à
maturit& Les grandes primaires contiennent du lysophosphatase qui peut se cristalliser en
cristaux de Charcot-Leyden (35). Ce cristal hexagonal, qui peut être formé in viîro par des
éosinophiles éclatés, se retrouve souvent dans les tissus en association avec des maladies
inflammatoires comme l'asthme (1 7).
Tableau 1 : Structures cytoplasmiques granulaires des éosinophiles
Structure cytoplasmique
Granule primaire
Grande secondaire ou
spécifique
Petite grande
Étape de maturation 1 Constituantdfonction
Éosinophile immature
hydrolase, CO llagénase,
Lysophosphatase 1
1 peroxidase et cytokines
Eosinophile mature Protéines cationiques,
Éosinophile mature
Éosinophile mature
Les granules secondaires ou spécinques sont responsables de la teinte typique de
l'éosinophile et contiennent des protéines ayant des fonctions primordiales dans les multiples
Arylsulphatase B,
phosphatase acide
Système de transport
Corps lipidique
rôles de cette cellule. Ces granules sont étroitement liés à la membrane et possèdent une
structure unique, un coeur crystalloïde. La MBP (Major Basic Protein) est le constituant
Éosinophile mature activé
majeur de ce coeur par rapport aux autres protéines cationiques comme I'EPO (Eosinophil
Peroxydase), I'ECP (Eosinophil Cationic Protein) et I'EDN (Eosinophil-Derived Neurotoxin)
qui sont des protéines d'importance physiologique et qui se situent dans Ia matrice de ce
Entreposage des acides gras
insaturés
granule.
Les éosinophiles humains originent de cellules précurseures de la moelle osseuse appelées
cellules pluripotentes CFU (Colony Formïng Unit) ou cellules CD34 positives. Ces cellules
se différentient en myéloblaste puis, par une série de divisions mitotiques, dorment
l'éosinophile (36). Cette différentiation est sous le contrôle de nombreux facteurs de
croissance et de cytokines provenant des lymphocytes T et de celluies mésenchymateuses
(22, 34, 37). Trois cytokines: le GM-CSF (Granulocyte-Monocyte Colony Stimulating
Factor), L'IL- (Interleukine)-3 et l'IL-5 sont reconnues comme facteurs qui augmentent
17éosinophilopoïèse. Les deux premiers sont cependant des agents non-spécifiques de la
différentiation de la lignée granulocytaire. 11 existe maintenant de bonnes évidences que
l'IL-5 est la cytokine majeure et spécifique associée au processus de maturation de
l'éosinophile. L'augmentation des niveaux d'IL-5 dans certaines maladies comme l'asthme
et la bronchite chronique permet de prévoir une éosinophilie importante (38). Une réponse
maximale requiert un synergisme entre les différentes cytokines (39-41). De plus, i'éotaxine,
une chimiokine, est impliquée dans le recrutement des éosinophiles. Elle est augmentée dans
l'inflammation et agit comme une cytokine de différentiation sur les progéniteurs de la lignée
éosinophilique (42). L'administration d'éotaxine chez le cobaye induit une éosinophilie
sanguine ainsi qu'une augmentation des progéniteurs dans la moelle et dans la circulation
sanguine (43).
Suivant une période de maturation et de différentiation d'environ 5 jours, l'éosinophile
mature quitte la moëlle osseuse et circule dans le sang périphérique avec une demie-vie
estimée entre 13 à 18 heures avant d'effectuer une migration dans les tissus. La longévité des
éosinophiles au niveau tissulaire est d'au moins six jours et peut augmenter significativement
en présence de cytokines inflammatoires (34). La mort de la cellule au niveau tissulaire est
un phénomène normalement bien contrôlé. En effet, la nécrose cellulaire où l'on assiste à la
perte de l'intégrité membranaire et le relarguage du contenu cellulaire, deviendrait
problématique pour les tissus environnants s'il n'existait pas un processus d'élimination des
cellules sans la nécrose et des effets secondaires qui y sont reliés- La mort cellulaire
programmée ou apoptose permet donc le retrait des cellules indésirées sans initiation d'une
cascade inflammatoire. L'ADN de la cellule devient hgmenté et des signaux apoptotiques
apparaissent à la surface membranaire. De plus, l'éosinophile en apoptose diminue de
volume et se contracte suite à une perte importante d'ions. Les macrophages peuvent alors
reconnaître L'élément en apoptose et le phagocyter (20, 44). In vitro, plus de la moitié des
éosinophiles sont en apoptose après 72 heures lorsqu'incubés en absence de cytokines mais
démontrent cependant une plus grande résistance à l'apoptose que les neutrophiles provenant
du même sujet (45).
1.2.4. PROPRIÉTÉS PRO-INFLAMMATOIRES DE L'ÉOSINOPHILE
Une partie des propriétés inflammatoires de l'éosinophile provient du fait qu'il est capable de
libérer une foule de médiateurs dans le milieu environnant. Ces médiateurs inflammatoires
peuvent être soit préformés ou formés de novo par la cellule lorsque la situation l'exige.
1.2.4.1. Cytokines
Une cytokine est un polypeptide sécrété par une cellule qui se fixe à un récepteur cellulaire
pour y déclencher divers phénomènes tels la division, la différentiation ou la stimulation de la
cellule. La reconnaissance, dans les dernières années, que l'éosinophile est une source
potentielle de plusieurs cytokines suggère que cette cellule peut jouer un rôle important dans
le contrôle, le maintien des réactions inflammatoires et plusieurs autres réponses biologiques
(46). De façon intéressante, plusieurs des cytokines dérivées de l'éosinophile semblent être
entreposées à l'intérieur des granules spécifiques avec les protéines basiques, foumissant
ainsi un réservoir de cytokines préformées disponibles pour une utilisation rapide par
l'éosinophile. De plus, il semble y avoir une disparité de localisation des cytokines à
l'intérieur même du granule, se distribuant entre le coeur ou la matrice granulaire. Cette
différence de localisation laisse croire à un mécanisme de sélection du contenu du granule
afin de permettre une sécrétion précise à l'extérieur de la cellule (37).
Les cytokines élaborées par l'éosinophile peuvent être divisées en trois catégories:
La première contient les facteurs de croissance et les chimiokines. Les facteurs de
croissance sont le GM-CSF, l'IL-5 et l'IL-3 qui peuvent exercer un effet autocrine et
paracrine sur l'éosinophile et d'autres cellules. Leurs effets connus sur I'éosinophile
sont principalement une augmentation de la suMe et de la réponse effectrice. Les
chimiokines font partie d'une famille de cytokines ayant des effets d'attraction sur
plusieurs les cellules. L'éosinophile a la capacité de libérer le RANTES (Regulated
on Activation, Normal T Expressed and Secreted) (47), le MIP-la (Macrophage
Inflammatory Protein-1) (48) et I'éotaxine (49).
La seconde catégorie comprend les cytokines impliquées dans l'inflammation, la
fibrose, et la réparation tissulaire. Il s'agit de TGF-a et p l (Transforming Growth
Factor), TNF-a (Tumor Necrosis Factor), IL-la, IL-6, LL-8, VEGF (Vascular
Endothelid Cell Growth Factor), PDGF-P (Platelet-Derived Growth Factor), HB-EGF
(Heparin-Binding Epidermal Growth Factor) (1 5).
La dernière catégorie implique les cytokines ayant une activité de régulation du
système immunitaire et de la communication intercellulaire. Ce groupe inclut l'IL-2
(50), l'IL-4, l'IL-IO (51), l'IL-6 (52), l'IL-12 (53)' I'IFN-y (interfëron) et findement
l'IL-16 (47).
1.2.4.2. Métabolites de l'acide arachidonique
Les dérivés oxygénés de l'acide arachidonique, appelés aussi éicosaddes, sont des
médiateurs lipidiques ayant des propriétés innammatoires. Ces composés possèdent une
grande activité biologique et contribuent la pathogénèse de certaines réactions
inflammatoires (54'5 5).
La structure primaire de toute membrane biologique est composée d'une bicouche
phospholipidique. Elle est principalement constituée de molécules de phospholipides c'est-à-
dire d'un glycérol avec un groupe de phosphate hydrophile et une queue hydrophobe de deux
chaînes d'acides gras. Les phospholipides membranaires des cellules idammatoires sont
e ~ c h i s d'acide arachidonique (acide 5,8J l7l4-éic0satétraén~ique ou C20:4). L'acide
linoléique (C18:2) retrouvé dans l'huile végétale est le précurseur de l'acide arachidonique.
L'acide arachidonique est lié en position sn-2 sur le glycérol du phospholipide. L'étape
iimitante dans la mobilisation de l'acide arachidonique et de la formation d'éicosanoïdes est
la coupure de ce lien par l'activité d'une classe d'enzymes : les phospholipases A,.
La stimulation de la cellule par un stimulus inaammatoire peut mener à l'activation d'une
phospholipase A2 qui hydrolyse l'acide arachidonique couplé aux phospholipides
niembranaires (56). L'acide arachidonique libéré devient donc disponible pour différentes
enzymes impliquées dans sa conversion en médiateurs lipidiques. La phospholipase A2 est
produite par la plupart des cellules de la lignée myélocytaire et par certaines cellules
structurales et peut être divisée en plusieurs groupes. Chez l'homme, quatre protéines ont été
séquencées : une protéine de 85 kDa (groupe IV) qui est contenue dans le cytoplasme de la
cellule. Les trois autres protéines sont de type sécrétoire PLA,s (groupes 1, II et V). Durant
certains processus inflammatoires, la présence d'une importante quantité de PLA,s a été
démontrée (57) et !'éosinophile semble être le leucocyte qui produit le plus de PLA2s (58).
Le métabolisme de l'acide arachidonique s'effectue principalement par les lipoxygénases ou
par les cyclooxygénases. L'éosinophile utilise majoritairement la voie de l'enyme 5-
Iipoxygénase qui transforme l'acide arachidonique en leucotriène (figure 1).
Le premier métabolite de la 5-lipoxygénase est le 5-HpETE (acide 5-hydropero~y-6~8,11,14-
éicosatétraénoïque) qui est converti en leucotriène A,. Selon le type cellulaire, ce métabolite
sera converti en leucotriène B, ou C, (59). Ce dernier est instable et rapidement converti en
leucotriène D, puis E, par l'action d'enqmes distinctes. Les leucotriènes C,, D, et E,
contiennent tous un résidu cystéine d'où l'appelation cystéinyl-leucotriènes. Ces trois
leucorriènes ont la caractéristique d'induire un oedème, d'augmenter la perméabilité
vasculaire et la production de mucus. Un autre phénomène produit par ces leucotriènes est
l'induction d'une bronchoco~ct ion nettement supérieure à celle causée par L'histamine
(55). L'éosinophile synthétise surtout le leucotriène C, (60, 61) et cette libération rapide
induite par des agonistes inflammatoires explique en partie les effets bronchoconstricteurs
remarqués chez les asthmatiques (62). Les éosinophiles isolés de sujets asthmatiques de
différentes sévérités démontrent par ailleurs un profil différent de Libération de leucotriène C,
par rapport aux éosinophiles de sujets normaux (54, 55, 63, 64). L'acide arachidonique est
aussi le précurseur du PAF (Platelet Activahg Factor), un puissant médiateur. Les
éicosanoïdes et le PAF sont impliqués dans la pathogénèse de l'asthme bronchique et d'autres
maladies allergiques (65). Le PAF induit plusieurs effets in vivo et Nt vitro. U provoque le
chimiotactisme de L'éosinophile (66), permet un changement de forme et une mobilisation de
calcium intracellulaire (67) puis finalement mène à la formation de corps Lipidiques (68). Du
point de vue physiologique, le PAF a la capacité de produire une bronchoconstriction et une
vasoconstriction pulmonaire en plus d'entraîner une sécrétion de mucus plus importante (65).
Chaque médiateur (PAF, leucotriène, prostaglandine ou thromboxane) interagit avec un
récepteur distinct présent à la siirface de la cellule et indGt une cascade d'événements dont
une mobilisation du calcium intracellulaire (65).
1 -2.4.3. Protéines basiques (cationiques)
Les protéines préformées contenues dans les granules ont pour la plupart été clonées et leurs
propriétés biochimiques et fonctionnelles sont de mieux en mieux définies. Les fonctions
effectrices des éosinophiles contre les parasites et indirectement contre les cellules humaines
apparaissent comme étant la conséquence d'une dégrandation et de la relâche des protéines
cationiques. Cette dégranulation semble être différentiellement sélectionnée lors d'une
activation des éoshophiles de sujets allergiques par la voie des IgE (69). De plus, la présence
de certaines cytokines inflammatoires ou le contact de la cellule avec la matrice
extracellulaire peut mener à une dégranulation (70, 71). La MBP, I'ECP et I'EPO sont
hautement toxiques pour les cellules épithéliales. Les dommages à l'épithélium bronchique
par ces protéines sont bien connus in vitro et in vivo (72) et particulièrement dans l'asthme où
l'on assiste à un décoliement des cellules épithéliales et à une perte de l'activité cilliaire de
ces mêmes cellules (29, 30). De plus, le niveau de ces protéines retrouvées dans les
sécrétions respiratoires des asthmatiques est significativement augmenté (73). Le
développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but d'inhiber la dégrandation
permettrait une diminution importante de la réponse inflammatoire excessive et des
dommages tissulaires. Le tableau 2 offie un résumé des diverses fonctions des principales
protéines cationiques retrouvées chez l'éosinophile (34,74).
Figure 1: Voie métabolique de l'acide arachidonique par la 54ipoxygénase chez I'éosinophile.
tl déshydrogénase
U LTC4 synthase
CYS - GLY
Tableau 2 : Description des protéines cationiques associées aux granules
Fonctions et activités
Toxique pour les parasites et cellules de l'hôte,
stimule la libération d'histamine chez le
mastocyte.
Puissante toxine pour les parasites, diminue la
prolifération des lymphocytes, cause la
formation de pores dans la membrane de cellules
hôtes-
Puissante neurotoxine, toxique pour les
parasites, diminue la prolifération des
lymphocytes, activité RNAse.
En présence de H202 et halide : cause la mort de
microorganismes et des dommages à
l'épithélium.
Site
granulaire
Coeur
- -
Matrice
Matrice
Matrice
1.2.5. RECRUTEMENT DES LEUCOCYTES VERS LE nssu MFLAMMÉ
Les leucocytes circulants sont constamment en attente d'un signal leur indiquant de fhnchir
la barrière hémato-tissulaire et ainsi poursuivre leur but d'assurer une surveillance des
différents tissus. L'endothélium (cellules formant l'enveloppe interne des vaisseaux
sanguins) discrimine parmi les globules blancs en circulation, les cellules qui vont quitter le
sang et entamer leur migration par diapédèse vers les tissus avoisinants. Ce phénomène de
sélection est spécifique. C'est ainsi que lors d'une réponse inflammatoire, les leucocytes sont
recrutés dans la circulation et vont adhérer à la paroi vasculaire par plusieurs mécanismes
d'adhésion. Cependant, la localisation anatomique et le type de stimulus inflammatoire
déterminent en grande partie la nature des cellules qui seront recrutées. Il existe donc une
communication étroite entre les cellules circulantes, qui vont exprimer des molécules
d'adhérences spécifiques, et les celiules endothéliales qui à leur tour vont exprimer à leur
surface des molécules d'adhésion en réponse aux signaux provenants du tissu sous-jacent.
Ces informations traduites par les cellules endothéliales doivent être disponibles rapidement
pour être lues par les leucocytes circulants.
1-25 1. Séquence d'évènements survenant lors du recrutement
Le recrutement leucocytaire se déroule en plusieurs étapes interdépendantes. Dans les
veinules, les Leucocytes tendent à se diriger vers les parois des cellules endothéliales plutôt
que vers le centre du vaisseau. Ce mécanisme, appelé margination, dépend de l'interaction
entre les globules blancs et rouges (75). L'adhérence de la cellule à la paroi vasculaire est la
première étape du recrutement cellulaire. Cette adhérence se déroule en plusieurs phases,
chacune ayant ses caractéristiques, ce qui permet de sélectionner parmi Ies globules blancs
circulants, ceux qui seront préférentiellement recrutés.
La première étape est constituée d'une adhérence primaire, suivie du roulement de la cellule
sur la paroi, puis finalement la capture à la paroi vasculaire. Les cellules endothéliales
expriment de longues molécules d'adhérence, soit les sélectines P et E, le CD34, le
MadChM-1 et le VCAM-1. Ces molécules ont la propriété de saisir le leucocyte en
mouvement. Les sélectines sont les molécules critiques du phénomène de l'adhérence
primaire (76-78). Elles sont des glycoprotéines membranaires possédant un domaine de type
lectine C qui leur permet d'interagir avec des ligands oligosidiques exprimés à la surface des
cellules circulantes. Bien que les sélectines permettent une adhésion dans des conditions
statiques, leur principale fonction consiste à permettre le roulement des cellules sous des
conditions de force de cisaillement. Il existe plusieurs types de sélectines. La sélectine-E est
retrouvée majoritairement sur l'endothélium post-capillaire et son expression peut augmenter
dans un contexte inflammatoire (79). Une étude a par ailleurs démontré que cette sélectine se
lie de façon préférentielle aux monocytes, aux éosinophiles et à une sous-population de
lymphocytes T (80). La sélectine-P se retrouve sur l'endothélium ainsi que sur les plaquettes
et agit principalement comme un récepteur pour la plupart des globules blancs possédant le
ligand spécifique (81). Son expression est également inductible rapidement puîsqu'elle est
principalement entreposée dans les granules des cellules endothéliales. Plusieurs agents
inflammatoires comme l'histamine, les leucotriènes, le CSa et des dérivés de l'oxygène
induisent l'expression de la Sélectine-P à la surface cellulaire. La sélectine-L est exclusive
aux leucocytes et est constitutive. Cependant, son expression peut être modulé chez certains
types cellulaires lors d'un processus d'activation (77). Les ligands des sélectines sont des
structures fortement électronégatives, formées principalement de O-glycannes sialylés et
parfois sulfatés, eux-mêmes portés par des glycoprotéines particulières appelées mucines
(78)-
La deuxième étape de la cascade d'adhérence consiste à l'activation de la cellule apposée à la
paroi vasculaire. Le roulement lors de la première étape cause le rapprochement des cellules
et leur permet d'être plus réceptives aux signaux présents à la surface de l'endothélium. Ces
signaux peuvent être divisés en deux groupes de molécules : les facteurs ou agents
chimiotactiques provenant des cellules endothéliales ou les tissus environnants et les
molécules transmembranaires de l'endothélium. Les leucocytes qui ne possèdent pas les
récepteurs pour ces agents ou molécules ne s'activent pas et demeurent indifférents.
L'adhésion ne pourra jamais être forte et les cellules f ~ o n t par se détacher de la paroi. Les
facteurs chimiotactiques peuvent être de nature lipidique (leucotriènes ou PAF) ou peptidique
(substance P, C5a ou chimiokines) et sont produits localement par les cellules endothéliales.
Plusieurs molécules chimiotactiques se fixent aux protéoglycans du pôle luminal de
l'endothélium, limitant leur diffusion et ainsi augmentant leur concentration locale. Lorsque
ces molécules se fixent sur les récepteurs de surface présents sur le leucocytey il y a activation
des protéines G associées à ces récepteurs, ce qui provoque une augmentation du niveau de
calcium intracellulairey un changement de forme de la cellule et une modification
conformationnelle des intégrines situées à la surface des cellules. Tous ces changements
donnent lieu à un état adhésif optimal.
Les cellules ayant reçu un message positif s'activent et adhèrent fermement à l'endothélium.
Cette adhésion, la troisième étape du processus de migration, dépend de l'interaction des
intégrines leucocytaires avec les molécules de types ICAM-1 et 2, ainsi que VCAM-1
confinées à la surface des cellules endothéliales (82). ICAM-1 est préférentiellement
augmenté sur l'endothélium activé par un stimulus idamrnatoire et est nécessaire et même
essentiel à la migration de plusieurs cellules dont les neutrophiles, les lymphocytes, les
monocytes et les éosinophiles (83). Les cytokines telles TNF-a et I L 4 augmentent
l'expression de ICAM-1 à sufàce des cellules endothéliaies. Chez l'éosinophile humain, le
principal ligand de I'ICAM-1 est le LFA-I (CD1 la-CD18) (4). Alors que l'expression du
CD 1 la est constitutive, l'expression du CD 1 1 b augmente en présence de plusieurs cytokines
et médiateurs i~ammatoires (84).
Un autre type d'interaction se produit entre le VCAM de la cellule endothéliale et le VLA-4,
une intégrine présente chez l'éosinophile, le monocyte et le lymphocyte mais pas le
neutrophile (80, 85). Cette interaction différentielle permet d'expliquer en partie le
recrutement sélectif de ces cellules dans certaines maladies allergiques. L'activité
fonctionnelle des intégrines sur l'éosinophile peut être modifiée positivement ou
négativement selon la présence ou non de niédiateurs inflammatoires (86). Le GM-CSF, une
cytokine largement exprimée par un endothélium inflammé, permet d'ailleurs d'induire des
changements fonctio~els de l'intégrine VLA-4 exprimée par l'éosinophile, augmentant ainsi
son adhérence au VCAM-1 (87). En contre partie, une expression accrue de VCAM-1
aboutit au même résultat. L'IL-4, une cytokine impliquée dans la réponse allergique, permet
une plus grande expression de VCAM-1 sur les cellules endothéliales et module aimi la
transmigration de l'éosinophile à travers l'endothélium (88). Par ailleurs, il a été démontré
qu'il existe une forte corrélation entre le nombre d'éosinophiles, l'expression de VCAM-1 et
la concentration d'IL-4 dans les bronches d'asthmatiques (89). Plusieurs facteurs peuvent
contribuer de façon non-négligeable à une Liaison des molécules d'adhérence. Premièrement,
les molécules sur le leucocyte sont situées bien au sommet sur des microvillosités. De plus,
les conditions circulatoires locales (vasodilatation) peuvent augmenter la probabilité d'une
liaison. Finalement, la présence de plaquettes ou de leucocytes déjà adhérés peut amplifier le
phénomène d'adhérence (78).
1.2.5.2. Molécules chimiotactiques
Comme dans le cas de tous les leucocytes, les mécaaismes permettant le recrutement de
l'éosinophile dans des sites spécifiques impliquent l'interrelation de plusieurs molécules. De
plus, le recrutement d'une sous-population spécifique en réponse à une aggression au
poumon est un mécanisme fondamental de l'inflammation pulmonaire. Le chimiotactisme
est un processus dans lequel la migration des leucocytes s'effectue dans la direction d'un
gradient de concentration alors que la chirniokinésie est plutôt un mouvement aléatoire des
cellules. Les agents chimiotactiques sont des molécules solubles qui sont produites surtout
lors de processus inflammatoires. Ces agents ont l'habileté d'induire un recrutement, c'est-à-
dire d'attirer les cellules et jouent donc un rôle dans la réponse protectrice de l'hôte et dans
certains processus pathologiques. Ces facteurs peuvent être de nature Lipidique ou
peptidique. La réponse des éosinophiles à certains agents chimiotactiques permet donc
d'expliquer, en partie du moins, les mécanismes pathophysiologiques de l'accumulation de
l'éosinophile au niveau tissulaire.
Les chimiokines sont une famille de protéines de structure semblable et possèdent l'habileté
d'induire la migration de sous-groupes de cellules. Le nom chimiokine provient du fait que
ces molécules sont des cytokines spécialisées dans le chimiotactisme. De plus, elles sont
impliquées dans l'activation leucocytaire, l'angiogénèse et dans certaines fonctions anti-
microbiennes (90). Il existe 28 chimiokines connues et eiles sont classées en deux groupes
ou familles selon leur séquence d'acide aminé. Le premier groupe est appelé chimiokuie a
(CXC) alors que les deux premières cystéines de la molécule sont séparées par un résidu. Le
second groupe appelé P (CC) ne possède pas ce résidu, donc les deux cystéines sont
adjacentes. De plus, la découverte récente d'une nouvelle molécule appelée lymphotactine
suggère la présence d'une autre famille au sein des chimiokines. Cette dernière partage
plusieurs homologies avec les deux autres familles, mais a pour principde caractéristique de
ne posséder que deux cystéines au Lieu des quatre qui composent les deux autres
groupes (9 1)-
Toutes ces distinctions structurales sont importantes dans la compréhension du phénomène de
recrutement spécifique d'un sous-groupe de leucocyte. En effet, chaque famille de
chimiokine agit sur certaines cellules en particulier. Les membres de la famille a sont
chimiotactiques surtout pour les neutrophiles et les lymphocytes alors que la famille j3 cause
une réponse des monocytes, des lymphocytes, des basophiles et des éosinophiles. La
lymphotactuie apparaît comme étant spécifique aux lymphocytes.
Les chimiokines sont exprimées par une multitude de cellules et de tissus. L'expression des
chimiokines est rapidement augmentée lors de l'activation de la cellule. Leur sécrétion est
normalement induite par de nombreuses cytokines pro-inflammatoires tels L I , IL-2, IL-4,
TNF-a, IFN-y et les lipopolysaccarides (90,92). L'action des chimiokines est dépendante de
leur Liaison à des récepteurs spécifiques, possédant sept domaines transmembmaires couplés
à des protéines G (93). Les récepteurs des chimiokines peuvent être exprimés
constitutivement ou différentiellement dans un contexte inflammatoire. Au moins sept
récepteurs des chimiokines P (CCR) et plus de 5 récepteurs des chimiakines a (CXCR)
existent (94). Les deux prochains tableaux indiquent les principaux membres de chaque
famille de chhiokines ainsi que les cellules qui réagissent à ces molécules (90).
Tableau 3 : Membres de la famille des chimiokines a
1 Chimiokines a I Cellules cibles
I I L 8 1 ~eut ro~hi les , lymphocytes, basophiles, cellules endothéliales
ENA-78 Neutrophiles
GRO-a,P,y Neutrophiles, cellules endothéliales
P-10 Lymphocytes T, lymphocytes NK, neutrophiIes
GCP-2 Neutrophiles
H M G Monocytes, lymphocytes T activés et NK
PF-4
B. Peptides et protéines
Fibroblastes, neutrophiles
SDF-1
Plusieurs peptides et protéines possèdent un rôle dans le recrutement de l'éosinophile. Une
protéine de la cascade du complément, le C5a, ainsi qu'un peptide correspondant à une
portion de la paroi bactérienne, le fMLP (formyl-Methyl-Leucine-Phenyldanine), ont la
capacité d'induire une chimioattraction relative chez Les éosinophiles (4). Cependant, la
réponse à ces agonistes peut augmenter significativement lorsque l'éosinophile est préincubé
en présence de cytokines inflammatoires telles que l'IL-5, le GM-CSF ou l'IL-3 (4,98). Ces
mêmes cytokines peuvent induire directement une chimioattraction des éosinophiles. En
effet l'IL-3 et le GM-CSF induisent une certaine attraction des éosinophiles (99). Cependant,
pour ce qui est de I'IL-5, la réponse est moins précise. Bien qu'au début des années 1990,
l'IL-5 semblait induire réellement un chimiotactisme des éosinophiles (100), il est de plus en
plus reconnu que 1'IL-5 induit plutôt le cliimiokinésisme (101).
Lymphocytes, monocytes
Tableau 4 : Membres de la famille des chimiokines B
Chimiokines B Cellules cibles
MCP-1 Monocytes, lymphocytes T, mastocytes, basophiles
MCP-2
MCP-3
Monocytes, lymphocytes T, mastocytes, éosinophiles
Monocytes, lymphocytes T, mastocytes, éosinophiles, cellules
dendritiques
MCP-4
Éo taxine
Eotaxine-2
MIP- la
Monocytes, Lymphocytes T, eosinophiles
Eosinophiles, sous-population de lymphocytes, basophiles (95,96)
Eosinophiles (97)
Monocytes, lymphocytes T, B et NK, mastocytes, éosinophiles,
basophiles, cellules dendritiques
MIP-1 p
RANTES
La classe des neuropeptides, comprenant Les molécules sécrétées par les terminaisons
nerveuses, joue un rôle de grande importance dans le recrutement cellulaire mais le rôle
principal de ce groupe de molécules est la régulation de la mécanique pulmonaire. En plus de
leur rôle dans le contrôle du tonus des bronches, de la sécrétion glandulaire, de la
perméabilité vasculaire ainsi que de l'élimination mucocilliaire, les neuropeptides influencent
la croissance et la différentiation de certaines cellules et la migration de cellules
inflammatoires (102). De ce groupe, la substance P et la sécrétoneurine démontrent le plus
d'effets sur le chhiotactisme des éosinophiles (103). En plus de l'effet sur la migration,
certains de ces médiateurs dérivés des fibres nerveuses peuvent activer et stimuler
l'éosinophile à Libérer à son tour des médiateun inflammatoires (104).
Monocytes, lymphocytes T
Monocytes, lymphocytes T et NK, éosinophiles, basophiles et cellules
dendritiques
1309 Monocytes
C . Dérivés de l'acide arachidonique
De nombreux médiateurs Lipidiques ont la capacité d'induire un recrutement ou
chimiotactisme cellulaire. Plusieurs de ces médiateurs possèdent un effet non-négligeable sur
l'éosinophile. Les principaux médiateurs et les cellules répondantes sont présentés dans le
tableau 5.
Tableau 5 : Principaux médiateurs lipidiques ayant des propriétés attractives sur l'éosinophile
I Agent 1 Autres cellules répondantes 1 Références
I I Basophiles I PAF
Neutrophiles, Monocytes
Neutrophiles, Monocytes,
Malgré leur contribution à la migration des leucocytes vers les tissus inflammatoires, la
(4,66, 105)
50x0- 15-HETE
plupart de ces dérivés Lipidiques sont peu spécifiques quant au type cellulaire visé.
Cependant, le 5-oxo-E=, découvert récemment, possède une spécificité et une puissance
I
importante pour le recrutement des éosinophiles (106, 108). Ce composé résulte de l'action
d'une déshydrogénase S(S)-hydroxyéicosanoïde qui transforme le 5(S)-HETE en 5-0x0-ETE.
Neutrophiles
La réaction d'oxidation engendrée par la déshydrogénase se situe principalement dans la
(106, 107)
hction microsomale de la cellule (109) et nécessite la présence de NADP' comme cofacteur.
La synthèse de ce cofacteur est dépendante de l'action de la NADPH oxidase dont son
activité est inductible par certains agonistes, dont le PMA (1 10). Plusieurs cellules
synthétisent le 5-0x0-ETE, soit le neutrophile, l'éosinophile (106), le monocyte et le
lymphocyte (1 1 1).
En plus de sa spécificité dans le recrutement de I'éosinophile, le 5-0x0-ETE est un
éicosauoïde qui possède plusieurs autres fonctions. Le 5-0x0-ETE est beaucoup plus puissant
que le (25% le PAF, le LTB, ou le fMLP pour induire le chirniotactisme chez l'éosinophile
(106, 108). De plus, il induit une légère dégrandation au niveau basal mais lorsque la cellule
est potentialisée par le GM-CSF, la dégranulation est considérablement augmentée. Dans
cette même étude, il a d'ailleurs été démontré que le 5-0x0-ETE multiplie la dégranulation
induite par d'autres stimuli de dégranulation (1 08).
Tout récemment, Czech et ses collègues ont démontré que le 5-0x0-ETE induit la
polymérisation de l'actine, la mobilisation du calcium intracellulaire et la Iibération d'espèces
réactives dérivées de l'oxygène chez l'éosinophile. De plus, tous ces changements peuvent
être bloqués par la toxine pertussis, suggérant fortement que le récepteur du 5-0x0-ETE est
couplé à une protéine Gi (1 22).
Tous ces résultats suggèrent que le 5-0x0-ETE est non seulement un puissant agent
chimiotactique spécifique à l'éosinophile mais induit aussi une cascade d'événements menant
la cellule à un état d'activation augmenté (108). Le 5-0x0-ETE possède donc un profil
biologique bien défini pour la pathogénèse des maladies où sont impliqués les éosinophiles.
1.3. MATRICE EXTRACELLULW
Tous les organismes multicellulaires sont formés d'un grand nombre de cellules assemblées
sous forme de tissus. Chaque cellule isolée interagit directement avec les cellules de son
entourage et égaiement avec la matrice extracellulaire, c'est-à-dire avec un réseau de
protéines et de carbohydrates qui remplissent les espaces intercellulaires et qui constituent le
squelette du tissu. La matrice extracellulaire module les interactions cellules-cellules et
différentes fonctions cellulaires comme l'adhésion, la migration, la prolifération et la
différenciation. Cette matrice est composée de macromolécules sécrétées localement par les
cellules environnantes. Les deux principales composantes sont les polysaccharides
glycosaminoglycans et les protéines fibreuses. Les premières sont généralement liées à des
protéines pour former les protéoglycans alors que les secondes sont diaises et peuvent être
de deux types fonctionnels : structurales (collagène et élastine) ou adhésives (fibronectine,
laminine et vitronectine) (1 13).
La matrice extracellulaire ne joue pas seulement un rôle de support cellulaire mais joue
également un rôle dans les propriétés mécaniques d'un tissu et dans les fonctions des cellules
de ce même tissu. Les tendons démontrent un bon exemple des propriétés mécaniques de la
matrÏce extracellulaire. L'agencement particulier de ses composantes leur permet d'être
particulièrement résistantes aux étirements dors que le cartilage et l'os résistent à la fois à
l'étirement et la compression. Durant l'embryogénèse, la matrice extracellulaire innuence la
prolifération, la différenciation ainsi que la migration des cellules. La migration est
particulièrement importante dans les étapes de la morphogénèse oii les cellules doivent se
déplacer vers leu. site final et se différencier. L'adhésion à la matrice innuence également la
capacité des cellules à former des tissus ou de migrer à travers la matrice et les tissus. Toutes
les implications de la matrice extracellulaire prennent leur importance lors de certains
processus pathologiques comme le cancer et le psoriasis (1 13).
De plus, la matrice extracellulaire peut Lier un grand nombre de facteurs de croissance,
d'hormones et de cytokines. Ce phénomène permet d'augmenter la concentration locale de
signaux et médiateurs rendant plus susceptibles les cellules en contact avec la matrice à
modifier leur pZzc%~c.
1.3.1. MEMBRANE BASALE
La membrane basale est une structure mince et continue de matrice extracellulaire et est
distribuée presque partout dans le corps humain. Elle peut être vue comme une barrière
séparant certains complexes cellulaires, comme l'épithélium et 17endothélium7 du tissu
conjonctif adjacent. La membrane basde permet une croissance cellulaire ordonnée et est
responsable du maintien adéquat de l'architecture tissulaire. De plus, on lui attribue une
fonction d'orientation pour les cellules prolifératives durant La différenciation de l'embryon
ainsi que plusieurs processus de reghération comme I'épithélialisation et la renervation.
Certaines composantes de la membrane jouent un rôle dans la régulation des échanges
ioniques et moléculaires entre les tissus qu'elles séparent (1 14).
En microscopie électronique, la membrane basale apparaît comme une structure de 100 nm
d'épaisseur composée de deux à trois couches distinctes, Elle comprend la lame basale,
d'origine épithéliale avec ses deux parties, la lamina densa et la lamina rara, ainsi que la
lame réticulée dérivée du tissu conjonctif., qui peut cependant être absente (36).
La membrane basale est composée de plusieurs glycoprotéines qui forment un réseau bien
relié. La plupart des composantes sont maintenant connues et caractérisées et sont présentées
dans le tableau 6.
Plusieurs anomalies reliées à la membrane basale ont été identifiées a Ia suite de dommages
aux tissus par des agents toxiques associés à l'asthme, au diabète et à plusieurs désordres
génétiques. La présence de pores ou la fkgmentation éventuelle de la membrane basale peut
permettre le passage inapproprié de cellules ou de molécules ainsi que causer des altérations
aux propriétés mécaniques du tissu. L'épaississement sous-épithélial remarqué chez les
asthmatiques permet de supposer que les cellules épithéliales et les fibroblastes soumis à une
multitude de facteurs fibrosants, comme les cytokines TGF et IGF, augmentent la production
de certaines protéines de la membrane basale. Cette déposition semble se situer surtout au
niveau de la lame réticulée et être de nature irréversible. 11 est postulé qu'un dérèglement au
niveau de la synthèse des protéines de la matrice ou au niveau de son métabolisme par les
cellules environnantes pourrait expliquer l'accumulation constante de protéines. Ceci serait
donc une conséquence non-spécifique d'me inflammation soutenue au niveau de l'épithélium
et des tissus environnants. Cependant, la thérapie visant à diminuer l'inflammation ne permet
pas une diminution de cet épaississement.
Tableau 6 : Composantes majeures de la membrane basale
Protéoglycans
(sulfate d'héparan a
chondroïtine) t-- Entactine
Nidogène r- Fibronectine I Tenascine r-
Structure
Triple-hélice
3 polypeptides
reliés par des
ponts disulfures
Protéine centrale
avec 3 à 6 chaines
de saccharides - - --
1 chaîne
glycoprotéique
2 chaînes
glycoprotéiques
6 chaînes
glycoprotéiques
Caractéristiques
Spécifique et principale composante (60%) de la
membrane basale, s'assemble pour former un réseau
où s'attache le sulfate d'héparan et la fibronectine,
possède des séquences de liaison aux cellules.
Spécifique à la membrane basale, facilite
l'attachement des cellules. Interagit avec les
protéoglycans et L'entache.
Rôle possible dans la filtration des molécules de
différentes charges. Interagit avec le collagène, la
laminine et la fibronectine.
fique que à la membrane basale, forme un complexe
non-covalent avec la laminine. Adhésion possible aux
cellules.
Guide la migration cellulaire, permet l'adhésion des
cellules.
Occupe la lame réticulée et influence les interactions
cellules épithéliales-mésenchyme, adhésion.
L'étude de la membrane basale in vitro ainsi que l'étude de l'invasion cellulaire à travers
celle-ci demeure difficile étant donné sa faible abondance et sa faible solubilité. Cependant,
il est maintenant possible de se procurer des membranes basales artificielles reconstituées
provenant de cellules cancéreuses de souris, plus précisément du sarcome de Engelbreth-
Hoh-Swarm, qui est caractérisé par une atteinte du tissu conjonctif et qui est naturellement
riche en membrane basale. Ce produit appelé Matrigel0 est utilisé dans les modèles
d'invasion cellulaire et dans les études où l'effet de la membrane basale sur les cellules est
mesuré. Les composantes de cette membrane sont semblables à celles retrouvées in vivo chez
l'hmain soit la laminine, le collagène de type IV, certains protéogiycans et l'entactine. Le
système d'invasion cellulaire développé par Falcon@ consiste en une membrane neutre
contenant des pores de 8 prn de diamètre. La matrice de Matrigel@ bouche ces orifices,
bloquant ainsi les cellules non-migratoires ou ne possédant pas les outils nécessaires pour se
fiayer un chemin.
1 -3.2. PROTÉASE ET DÉGRADATION TISSULAIRE
Le remodellage tissulaire est un processus physiologique et physiopathologique
(embryogénèse, cicatrisation, progression tumorale etc.). 11 implique plusieurs enzymes
capables de modifier les composantes de la matrice extracellulaire et aussi les protéines de la
cascade du complément et de la coagulation (1 15). Le remodellage du tissu bronchique est
maintenant considéré comme un élément important du phénotype de l'asthme (6). Les
protéases sont des protéines qui agissent comme enzyme et qui ont la capacité d'hydrolyser
les Liens peptidiques et ainsi dégrader les protéines de la matrice et les liens réunissants les
cellules à cette même matrice. Pour qu'un tissu conserve son intégrité, la dégradation et la
nouvelle synthèse doit se faire de façon ordonnée et simultanée. Un désordre à ce niveau
explique, en partie du moins, certaines pathologies menant à une fibrose désordomée ou à
une destruction massive du tissu (1 16). Les pathologies impliquant le tissu résultent d'une
altération à la fois des cellules et de la matrice extracellulaire. Donc, lors d'un état
pathologique, l'homéostasie entre les éléments cellulaires et la matrice environnante est
brisée, conduisant à des désordres dans la distribution, la composition et la fonction de la
matrice extraceildaire.
La nomenclature actuelle définit ies peptidases selon leurs activités fonctionnelles de
dégradation, c'est-à-dire selon si l'activité de l'enzyme se situe aux extrémités N ou C-
terminale (exopeptidase) du peptide ou tout le long du peptide (endopeptidase). Les termes
endopeptidase et protéase signifient la même chose et sont interchangeables. De plus, la
famille des protéases peut être subdivisée selon le groupe actif ou le centre actif de I'eozyme.
11 existe quatre principaux groupes de protéases : sérine, cystéine, aspartate et
métalloprotéase. Les protéases qui exercent les effets les plus évidents au niveau pulmonaire
sont les endopeptidases qui ont une fonction catalytique de type métallo ou s é ~ e (tableaux 7
et 8)-
Les principales sources de protéases dans le poumon sont les cellules inflammatoires,
particulièrement le neutrophile (1 17, 1 18). Cependant, d'autres cellules inflammatoires sont
capables de relâcher des protéases, dont le macrophage alvéolaire, le lymphocyte-T,
l'éosinophile, le basophile et le mastocyte. Il existe des évidences que certaines cellules du
parenchyme, dont le fibroblaste, peuvent libérer ces enzymes. Cependant, les protéases
relâchées par les cellules du parenchyme ne semblent pas impliquées dans les dérangements
tissulaires contrairement aux protéases provenant des cellules inflammatoires. Il s'agirait
plutôt d'une fonction normale de la croissance et du développement et dans la régulation du
remodelage naturel. Les protéases provenant des tissus autres que les poumons causent
rarement des dommages aux poumons puisque le plasma contient une grande quantité
d'inhibiteurs naturels (1 15). Les métalloprotéinases de la matrice extracellulaire V s )
constituent une famille multigénique de plus de 14 enzymes ayant la capacité de dégrader la
quasi-totalité des composantes de la matrice e-acellulaire (interstitium et membrane basale).
Le site actif de l'enzyme renferme un ion métallique znZ' ou plus rarement Cu". Les MMPs
possèdent plusieurs caractéristiques dont une structure homologue, un ion Pnc impliqué dans
le mécanisme catalytique de l'enzyme, une synthèse et une sécrétion sous forme inactive
(zymogène), une activation dans le milieu extracellulaire et une capacité à dégrader les
composantes de la matrice extracellulaire in vivo. Une autre caractéristique intéressante est
leur inhibition par une famille d'inhibiteurs spécifiques : les inhibiteurs tissulaires des
métalloprotéinases (TIMP) (1 19, 120).
Tableau 7 : Principales protéases de type sérine, leurs substrats et leurs inhibiteurs
Sérines protéases (115,121)
Protéase
Trypsine
Activateur du plasminogène
Protéinase-3
Cathepsin G
Substrats principaux
Collagène
Fibrine, collagène, laminine
P lasmino gène
Élastine, Collagènes 1-IV,
fibronectine et laminine
Collagène IV, fibronectine et
larninuie
Collagènes 1-III-IV,
fibronectine, laminine et
protéoglycans
Inhibiteurs naturels
al -antitrypsine, SLPI
PAL 1,2, antithrombine ID,
Protéase nexin 1
al -antifrypsine, SLPI, élafine
Elafine
a 1 -antichyrnotrypsine, SLPI
La présence d'enzymes protéolytiques au cours des processus d'invasions tumorales associés
à la dégradation de la matrice extracellulaire est bien documentée (122-126). De nombreux
articles démontrent une activité accrue des protéases dans les tissus tumoraux
comparativement aux tissus sains. Lors de certaines blessures ou maladies chroniques où
l'on assiste à une fibrose différente du processus normal de réparation, il a été démontré que
le TIMP-1 est diminué et en contre-partie l'activité gélatinase est augmentée (127). Par
ailleurs, il a été démontré que le lymphocyte T possède une activité de dégradation via la
libération de MMPs et que cette libération permet la transmigration des cellules à travers une
membrane basale artificielle (128). De plus, cette libération d'enzymes peut contribuer à
I'évolution de certaines pathologies comme la goutte (129). La production du précurseur de
la MMP-9 ainsi que son inhibiteur TIMP-1 chez le lymphocyte sanguin est modulée par
plusieurs cytokines et chimiokines (1 3 0).
Tableau 8 : Principales protéases de type métallo, leurs substrats et leurs inhibiteurs
Métailoprotéinases
Classe
Collagénases
Matrilysine
Elastase
macrophagique
Membranaire
Enzyme 1 Principaux substrats
Collagène dénaturé
Collagène dénaturé
Collagène IV, protéoglycans + Collagènes V-VII-X
Protéoglycans, fibronectine,
laminine collagène IV
Elastine, fibronectine, laminine,
collagéne dénaturé, protéoglycans
Elasthe, collagène dénaturé,
fibronectine
Inhibiteurs naturels
a2-macroglo buline
TIMP- l,2,3
a2-macroglo buline
TIMP- 1,2,3
a2-macroglobuline
TIMP- 1 -2-3
a?-macroglo buline
Le neutrophile possède également cette capacité de dégrader la membrane basale par la
libération de gélatinase (13 1). D'une auee manière, certains fibroblastes provenant de sujets
souffrant de fibrose démontrent une production altérée de collagénases et d'inhibiteurs. Ceci
permet d'expliquer certaines altérations pouvant conduire à la fibrose (132).
1.3 .3.1. Métalloprotéinases
L'éosinophile sanguin normal synthétise peu d'enzymes de dégradation (133) mais les
éosinophiles de sujets atteints d'un carcinome épidermoïde expriment fortement la MMP-9
(134). De plus, 1'ARNm de la collagénase N (MMP-9) est augmenté chez l'éosinophile de
sujets atteints d'un carcinome des cellules basales (135). Ces résultats suggèrent que
l'éosinophile migre vers les cellules cancéreuses et 'libèrent la MMP-9. Ce processus pourrait
avoir un rôle critique dans la croissance et l'invasion tumorale. D'une autre manière, le
remodellage de la paroi bronchique des asthmatiques implique la participation de plusieurs
enzymes de dégradation dont la MMP-9. Comme l'une des cellules effectrices dans l'asthme
est l'éosinophile, il est possible que cette cellule, placée dans un contexte inflammatoire
favorable, aurait la capacité de synthétiser cette enzyme. Cette hypothèse a dernièrement été
vérifiée par une équipe qui a démontré une grande quantité dYARNm spécifique à la MMP-9
chez les éosinophiles présents dans les biopsies bronchiques d'asthmatiques. Une plus faible
quantité de protéines a été immunolocaiïsée dans l'espace périnucléaire de l'éosinophile et
dans la matrice extracellulaire environnante (136). De plus, un autre groupe a mesuré le taux
de glycosarninoglycans dans l'urine qui correspond aux dommages infligés à la matrice
pulmonaire chez des individus asthmatiques sévères. Ce taux s'est révélé plus élevé chez les
asthmatiques en exacerbation et correspond à une expression plus forte de la MMP-9 chez les
éosinophiles tissulaires et sanguins (137). Une étude a par ailleurs démontré que
L'éosinophile synthétise des protéinases dans son microenviromeinent pour pouvoir traverser
une membrane basale artificielle de type MatrigelB. Cette étude Nt vitro montre également
que l'éosinophile possède d'autres outils pour couper la membrane basale puisque l'ajout
d'inhibiteurs pour les sérines protéases, en autre, diminue la transmigration de l'éosinophile à
travers cette même membrane basale (138). 11 est maintenant clair que l'éosinophile possède
une activité contre les collagènes de type 1 et II et que cette activité est indépendante des
enzymes déjà connues et suggère que l'éosinophile possède sa propre enzyme (1 39).
1 -3.3.2. Système du plasminogène et de la plasmine
En plus de la MMP-9 et de la colIagénase spécinque à l'éosinophiIe, un autre système de
dégradation existe chez l'éosinophile. Il s'agit du système du plasminogène/plasmine qui
consiitue un outil de plus pour les cellules invasives visant la dégradation de la matrice
(figure 2). Les activateurs du plasminogène sont des sérines protéases ayant une spécificité
tryptique. Il existe deux enzymes dans ce groupe qui se distingue par l'organisation du site
actif et la fonction de leurs régions non-catalytiques. 11 s'agit de 17activateur du
plasminogène de type urokinase (uPA) ou tissulaire (PA) (1 15). Ils sont tous Les deux
sécrétés en une seule chaîne, mais contrairement au tPA, 1'uPA est essentiellement inactif
(pro-uPA) lors de la sécrétion. Le clivage en 2 chaûies mène à l'enzyme active. Ce clivage
peut être réalisé par une série d'enzymes comme la plasmine, la kdikréine ou la cathepsine
B. L'activation de l'enzyme inactive est fortement augmentée lorsque celle-ci est liée à son
récepteur membranaire, I'uPAR ou le CD87. Le plasminogène est le substrat de choix pour
les activateurs du plasminogène et se retrouve en grande quantité dans le plasma (1-2 @l)
(140). Ces activateurs catalysent la coupure d'un lien Arg-Val, ce qui mène à la conversion
du plasminogène en plasmine. La plasmine est une protéase de type sérine et consiste en
deux chaînes polypeptidiques reliées par un pont disulfure. Plusieurs autres enzymes peuvent
convertir le plasminogène en plasmine mais seulement les deux activateurs ont la capacité de
le faire dans des conditions physiologiques. La plasmine, contrairement aux activateurs du
plasminogène, possède un large éventail de substrat. En effet, elle peut dégrader une
multitude de composantes de la matrice extracellulaire dont la plupart des protéines de la
membrane basale (140-143). De plus, elle peut convertir certaines métalloprotéinases, de
leur forme inactive, à leur forme active (140). La liaison de 1'uPA à son récepteur facilite
l'invasion de granulocytes et de cellules de Jurkat à travers une matrice de fibrine (144, 145)
ainsi que la dégradation de la membrane basale par des cellules tumorales humaines (146).
Une autre preuve de l'importance physiologique de l'uPA a été démontrée lorsque des souris
ne pouvant pas synthétiser cette molécule, voyaient leur système immunitaire grandement
affecté à cause d'une diminution importante du recmtement de cellules inflammatoires (147).
En effet, en plus de son rôle dans la dégradation, 17uPA possède une action chimiotactique
intrinsèque pour certains types cellulaires (1 48).
L7uPAR est présent sur la membrane plasmatique de plusieurs types cellulaires dont
l'éosinophile (140, 149). est ancré à la membrane par un lien de type glycosyl-
phosphatidylinositol et son expression peut être modulée par une multitude de facteurs (150).
Le récepteur CD87 peut s'associer avec un autre récepteur de type intégrine (CR3 ou
CD1 lbKDl8). Comme cette intégrine joue un rôle important lors de l'adhésion, la
migration dans les tissus et dans le degré d'activation de la cellule, l'association de ces deux
molécules peut influencer grandement l'activité physiologique de la cellule (1 5 1, 152). On
peut supposer alors que cette association permettrait une action locale de dégradation, et ce
en présence d'une forte adhérence de la cellule. Cette association semble également cruciale
dans le phénomène de migration et de chimiotactisme. Chez le neutrophile et le monocyte, le
récepteur joue un rôle crucial dans le chimiotactisme in vitro, et ce mécanisme est
indépendant de l'activité enzymatique de 1'uPA mais plutôt de l'abilité du CD87 d'interagir à
l'intégrine CR3 (153, 154). La figure 2 schématise la cascade de dégradation protéique
initiée par le système de génération de la plasmine ainsi que de I'irnplication du récepteur du
I'uPA (CD87) à la surface des cellules.
CHAPITRE 2 : HYPOTHÈSES ET BUTS
L'éosinophilie tissulaire observée dans l'asthme témoigne d'un recrutement massif de
cellules en provenance de la circulation sanguine qui fait probablement intervenir une
multitude de facteurs et médiateurs agissant spécifiquement sur l'éosinophile. Le passage de
l'éosinophile à travers la membrane basale sous-endothéliale nécessite sa digestion préalable
par des enzymes protéolytiques. 11 a été démontré par ailleurs que le 5-0x0-ETE possède des
effets chimiotactiques importants sur I'éosinophile mais aucune étude a évalué précisément
ses effets sur la transmigration. Nous postulons donc que le 5-0x0-ETE initie une
transmigration significative des éosinophiles. Comme les éosinophiles provenants de sujets
asthmatiques démontrent un phénotype activé à plusieurs égards, nous postulons aussi que
les éosinophiles d'asthmatiques démontreront un chimiotactisme plus important et une
activité protéolytique plus importante, menant ainsi à une transmigration augmentée
comparativement aux éosinophiles de sujets normaux.
2.2. BUTS
Le but principal de ce projet est d'évaluer la capacité de l'éosinophile sanguin a migrer à
travers une membrane basale sous 1 7 i ~ u e n c e d'agents chimiotactiques comme le 50x0-
ETE, et ce en comparaison au PAF qui a été évalué antérieurement. La dynamique de
transmigration des éosinophiles purifiés sera évaluée in vitro à travers une membrane basale
artincielle. De plus, l'activité de dégradation des protéines de la matrice extracellulaire par
des agents comme les métalloprotéinases ou les sérines protéases sera mesurée puisque ces
groupes d'enzymes sont impliqués dans le remodellage pulmonaire et sont des enzymes
pouvant être directement reliées à l'éosinophile. Les éosinophiles de sujets normaux et
asthmatiques seront utilisés dans notre modèle dans le but d'évaluer l'impact de
l'inflammation chronique retrouvée chez les asthmatiques sur le phénotype de l'éosinophile.
Figure 2 : L'éosinophile et le système d'activation du plasminogène
pro-uPA '
membrane basale fibrine f \ * fibronectine- peptides collagène larninine
Légende : Le précurseiir de 1'uPA (pro-uPA) est sécrété par la cellule. Ce précurseur se lie à
son récepteur @PA-R) pour être tramformé en uPA. L' uPA est nécessaire à la conversion
du plasminogène (Pgn) en plasmine. Cette dernière possède une forte activité protéolytique
sur différentes protéines de la matrice extracellulaire. De plus, la plasmine transforme les
pro-métalloprotéinases en métalloprotéinases actives qui possèdent également une certaine
activité de dégradation.
CHAPITRE 3 : ARTICLE
3.1. TITRE
L'acide 5-oxo-6, 8, 11, 14-eicosatehaénoïque induit une importante transmigration de l'éosinophile à travers des composantes de la membrane basale : comparaison d'éosinophiles provenant de sujets asthmatiques et normaux.
Ce chapitre reproduit le texte intégral d'un article intitulé :
5-oxo-6, 8, 11, 14-eicosateb-aenoic acid induces important eosinophil transmigration
through basement membrane components: cornparison of eosinophils fiom normal and asthmatic subjects.
Cet article a été soumis en juillet 1998 au journal Arnerican Journal of Respiratory Ce22 and Molenrlor Biology, Chicago, États-unis.
AUTEUR(E)S: Martin Guilbert B-Sc., Claudine Ferland B.Sc., Marc Bossé Ph.D., Nicolas
Flamand, BSc., Sophie Lavigne M.Sc. et Michel Laviolette M.D.
La transmigration à travers la membrane basale est une étape importante dans le recrutement
de l'éosinophile vers les tissus. De récentes études ont montré que ce phénomène est modulé
par le PAF en combinaison avec les cytokines IL-5, IL-3 ou GM-CSF. Dans cette étude,
nous avons évalué in viîro l'efficacité de l'acide 5-0x0-6, 8, 11, 14-eicosatétraénoïque (5-
0x0-ETE), un métabolite de 1' acide arachidonique connu comme un puissant facteur
chimiotactique pour l'éosinophile, à promouvoir la transmigration d'éosinophiles de sujets
asthmatiques et normaux à travers une membrane basale de type MatrigelB. Le 5-0x0-ETE
s'est révélé être un bien plus puissant inducteur de la transmigration de l'éosinophile que le
PAF (> 10 fois), et cet effet est similaire dans les deux groupes de sujets. De plus, le 50x0-
ETE est actif en l'absence d'IL-5 bien que cette cytokine amplifie l'action du 5-0x0-ETE. Le
récepteur membranaire pour l'activateur du plasminogène (CD87)' une sérine protéase, est
observé sur l'éosinophile et son expression est augmentée par L'IL-5 ou le 5-0x0-ETE.
Toutefois, en combinaison, ces deux médiateurs n'ont pas d'effet additif sur cette expression.
L'inhibition des métalloprotéinases par un inhibiteur spécifique (BB3103) ou un anticorps
monoclonal anti-MMP-9, et l'inhibition du CD87 avec un anticorps monoclonal anti-CD87
diminuent la transmigration d'environ 50%. L'utilisation de ces inhibiteurs en combinaison
n'a pas d'effet additif. Ces données montrent que le 5-0x0-ETE est un promoteur efficace de
la transmigration de l'éosinophile in vitro, et ce plus que le PAF. Ceci suggère que ce
médiateur pourrait jouer un important rôle dans le recrutement de l'éosinophile in vivo. De
plus, ces données démontrent qu'en plus de la métalloprotéinase-9, le système de l'activateur
du plasminogène est impliqué dans la transmigration de l'éosinophile.
Basement membrane transmigration is an important step in eosinophil tissue recruitment into
innamed tissue. Recent reports showed that this phenomenon is modulated by PAF in
combination with cytokines and protehases. We investigated the Ni vitro efficacy of 50x0-
6, 8, 11, 14-eicosatetraenoic acid (5-0x0-ETE), a metabolite of the arachidonic acid known as
a potent eosinophil chernotactic factor, to promote normal and asthmatic blood eosinophil
transmigration through a Matrigel@ basement membrane. 5-0x0-ETE proved to be a more
potent (HO-fold) inducer of eosinophil transmigration than PAF and this effect was similar
in normal and asthmatic ceus (82.0 k 3.7% and 88.1 + 3.7%, respectively). Moreover 5-0x0-
ETE was active in absence of IL-5 although this cytokine amplified the eEect of 5-0x0-ETE
fiom 61.3 + 3.3 to 92.8 t 1.8% @ = 0.003). The membraneous receptor for urokuiase
plasrninogen activator (CD87), a serine protease, was observed on eosinophils and its
expression was increased by IL-5. Both inhibition of metalloproteinases (MMP) and
plasmin/plasmulogen cornplex with inhibitor or monoclonal antibodies decreased cell
transmigration by about 50%. Combination of MMP inhibitor and anti-CD87 antibodies did
not have additive effects. These data show that 5-0x0-ETE is an efficient promotor of
eosinophil transmigration in viîro, much more potent than PAF. They suggest that this
lipidic mediator could play an important role in eosinophil recruitment in vivo. Moreover
they demonstrate that, beside MMP, the pIasmin/plasminogen system couid be involved in
eosinophil transmigration.
3.4. INTRODUCTION
Eosinophils are potent innammatory cells recniited to inflamed tissue in various pathological
conditions such as allergy and asthma (1, 2). This recruitment involves different steps:
eosinopoiesis, chemotaxis, celi activation and adhesion molecule expression, rolling and finn
adherence to endothelium, and finally migration through vascular wall into tissue (3).
Mediators and cytokines, which promote eosinophil chemotaxis and chemokinesis, likely
play an important role in the flrst steps of eosinophil recruitment but their actions in
eosinophil transmigration must be M e r defined. Transmigration of eosinophils through
vascular wall implies many cellular functions such as modification of ce11 skeleton and
digestion of extracellular matrix. This last phenornenon has been evaluated in lymphocyte
and neutrophil transmigration, and it has been reported that these cells use proteinases, the
matrix metalloproteinases (MMP) 9 and 2, to accomplish this function (4-6).
Recentl y, Okada et al. (7) investigated eosinophil transmigration through Matrigela, a gel
containing basement membrane components used as an in vitro mode1 of basement
membrane (8). They tested several mediators and cytokines known to be active eosinophil
chemotactic factors. They f k t showed that platelet-activating factor (PAF) and eotaxin, in
presence of interleukin-5 (IL)-5, IL-3 or granulocyte monocyte-colony stimulating factor,
promoted eosinophil transmigration through basement membrane components in vino. At
optimal concentration, PAF was more potent than eotaxin aithough the induced
transmigration remained rather low, = 8% of the total number of eosinophils. Both PAF as
chemotactic factor in the lower chamber, and an eosinophil active cytokine as activating
factor in both chambers, were required for eosinophil migration. In this study, leukooiene
B4, CSa, the chemokines RANTES and macrophage inflammatory protein-la, and IL-8 did
not induce measurable eosinophil msrnigration Moreover, other cytokines such as tumor
necrosis factor-a, RANTES, IL-8, interferon-y and IL-4 did not promote eosinophil
transmigration in presence of PAF. These data suggest that basement membrane
transmigration requires specific eosinophil activation which is optimal through the actions of
a combination of specific mediators and cytokines.
Recently, Powell et al. (9) identified a new class of arachidonic acid metabolite, the 5-0x0-6,-
8,-11,-14-eicosatetraenoic acid (5-0x0-ETE). 5-0x0-ETE is formed fiom 5-hydroxy-6, 8? 1 1,
14-eicosatetraenoic acid (5-HETE) by a highly specific dehydrogenase which is found in
lymphocytes, monocytes, neutrophils and eosinophils (9-12). 5-0x0-ETE is a
chemoattractant for neutrophils 100-fold more potent than 5-HETE (13). It activates this cell
type in many functions but appears less potent than leukotriene B4 (13, 14). In contrast, 5-
0x0-ETE is a potent and specinc stimulator of human eosinophil migration, even more
effective than other lipid mediaton such as PAF, 5-0x0-15-hydroxy-ETE, and Ieukotrienes
B4 and C4 (12). In vitro, it also activates many eosinophil functions and appears more potent
in stunulating eosinophils than neutrophils (15, 16). In vivo, 5-0x0-ETE induces pulmonary
eosinophilia in Brown Nonvay rats M e r supporting the possibility that it may act as a
potent physiological mediator in eosinophilic inflammatory process (1 7). Structure-activity
studies suggest that 5-0x0-ETE likely acts through a specific receptor (1 3, 18, 19). However
this receptor has not been yet characterized.
Eosinophils issued nom carcinoma (20, 2 1) and blood (22) express MW-9. Moreover, there
is some evidence that MMP-9 levels are increased in branchial tissue of asthmatic subjects
and eosinophils seem to be implicated in this phenornenon (23, 24). In a second report,
Okada et al. (25) M e r showed that combination of PAF and IL-5 appeared to induce M W -
9 activation in the supematants of eosinophils migrating through Matrigel0 membrane,
indicating that this protease was involved in eosinophil basement membrane transmigration.
However, their data also showed that other proteases could be involved in the eosinophil
migration through the basement membrane components. An inhibitor of serine proteases
decreased the eosinophil migration, suggesting that these proteases were also implicated in
eosinophil migration.
The urokinase plasminogen activator @PA) and its receptor uPA-R (CD87) play an important
role in a number of physiological and pathological extracellular degradative processes and
remodeling (26, 27). This system promotes mat& degradation by generating plasmio, a
serine protease, fiom the abundant zymogen plasmùiogen (26). Moreover, plasmin can act as
promoter of local stroma degradation by converting inactive zymogen pro-MMP into active
MMP (26, 28). It was demonstrated that uPAR rapidly redistributes at the leading edge of
the moving cells (29). nius uPAR plays a pivotal role by modulating and concentrathg the
uPA activity at the required sites of the cell surface. StahI et al. showed that the uPAR
played an important role in melanoma ce11 invasion through artificid basement membrane
which could be strongly inhibited by an anEi-CD87 mAb (30). This receptor has also been
observed on eosinophils (31, 32). Overall, these data suggest that the uPA-uPAR system
could be involved in eosinophil basement membrane transmigration.
Blood eosinophil count increases with asthrna severity (33). These eosinophils display
features of activation : they are hypodense and present an increased capacity to release
mediators (34, 35). Consequently, it is possible that blood eosinophils of asthmatic subjects
better respond to chemotactic factors and migrate more 'efficiently through the vascular
basement membrane barrier. This would explain at least in p a the greater number of
eosinophils observed in asthmatic branchial mucosa. In th is study, we postulated that effect
of 5-0x0-ETE on eosùiophil basement membrane transmigration would be greater than that
observed with PAF since chemotactic activity of 5-0x0-ETE on eosinophils was much greater
than that of PAF. Consequently, we evaluated the effect of 5-0x0-ETE on eosinophil
migration in cornparison to PAF, investigated the modulation effect of IL-5 and the role of
MMP and uPAR in 5-0x0-ETE-induced eosinophil migration, and compared the response of
normal and asthmatic eosinophils.
3.5. METHODS
Reagents
Human recombinant IL-5 was purchased £kom Peprotech Inc (Rocky Hill, NJ), 5-0x0-ETE
(5-0~0-6,8,11,14-ei~o~atetrae110i~ acid) nom Cayman Chemical (Ann Arbor, h4I), the
monoclonal mouse IgG, against MMP-9 (Ab-1) clone 6-68 fkom Calbiochem (San Diego,
CA), the monoclonal mouse IgG, against CD87 (uPAR) clone 3936 kom American
Diagnostics Inc. (Greenwich, CT), mouse IgG, (isotypic control) fkom Pharmingen (San
Diego, CA), FITC-conjugated goat anti-mouse IgG fiom Caltag (Burlingarne, CA) and
monoclonal antibody against CD 16 conjugated to magnetic beads fiom Miltenyi Biotec
(Bergisch-Gladbach, Gemany). The Bovine serum albumin (BSA, fiaction V), EDTA
(Ethylenediamine tetraacetic acid) and PAF (L-a-Phosphatidylcholine) were purchased fiom
Sigma Chemicai Co, (St-Louis, MO); Dexttan T-500 and FicoI1-Paque were purchased fiom
Pharmacia LKB (Uppsala, Sweden), RPMI 1640 medium, Hanks Balanced Salt Solution
without calcium/magnesium, Penicillin/Streptomycin and fetal bovine senun (FBS) heat-
inactivated from Gibco BRL (Grand Island, NY). The E-aminocaproic acid, a plasmin
inhibitor, was purchased fiom Sigma. BB-3 103, an inhibitor of MMP, was generously
provided by British Biotechnology (Oxford, UK). The MMP-9 human enzyme immunoassay
system was obtained fiom Amersham Pharmacia Biotech piscataway, NJ). According to
information provided by Calbiochem, the monoclonal mouse IgG, against MMP-9 (Ab-1)
clone 6-6B is specific for MMP-9 and has not been shown to cross-react with other
proteinases. The IC, of BB-3 103 for different MMP are: collagenase: 2.0 nM; gelatinase
A: 10.0 nM; gelatinase B: 7.0 r i ; stromelysin: 30.0 n M and matrilysin: 20.0 nM.
Evaluation of subjects
Normal subjects without history of dlergy or asthma, and asthmatic subjects meeting the
cntena of the American Thoracic Society for the diagnosis of asthma were recmited in this
study (36). The asthmatic subjects had mild asthma defined by a rnorning pre-bronchodilator
forced expiratory volume in one second (FEV,) > 85% of the predicted value, and
requirement of short-acting Pz-agonist on dernand or moderate asthma defined as moming
baseline FEV, c 85 % or use of short-acting inhaled Pz-agonist more than three times a week.
The inclusion cnteria were: stable treatment for more than 3 months, no use of Ïnhaled
steroids over the 3 months preceeding the study, no use of other dmgs and no other disease
than asthma Approval from the local Ethics Committee was obtained. AU subjects
underwent blood sampling early in the morning. FEV, were measured in the moniing at least
8 h after any pz-agonist inhalation on a PFT II Vitalograph Spirometer, and were expressed as
percentage of predicted values (37). Blood eosinophil counts were measured on a Coulter
STKS (mode1 809) fiom Coulter Electronic (Hiateah, FL).
Blood cell processing and eosinophil purification
Venous blood (150 ml) was centrifuged to remove platelet-rich plasma, and the ce11 pellet
was sedïmentated 30 min on Dextran 6%. Leukocytes were centrifuged on Ficoll-Paque for
20 min at 700 x g. The cell pellet containing the granulocytes was resuspended and red cells
Iysed with distilled water. Eosinophils were purified using the technique described by Hanse1
et al. (38) and modified in our laboratory (39). Briefly, granulocytes were resuspended in
cold HBSS + 1% BSA (106 cellslpl), incubated with bead-conjugated anti-CD 16 (FcyR ID)
monoclonal antibody for 20 min at 4 OC (100 pV2 x 108 cells). Cells were washed once in
HESS + 1% BSA (700 x g). The granulocyte suspension was depleted fiom neutrophils by
negative selection using a Magnetic Ce11 Sorter. An aliquot of the resulting ce11 suspensions
was used to determine the total ce11 count (hemacytometer) and ce11 viability (trypan blue
exclusion) and prepared smears for differential ce11 counts @iff-Quik). The punty of the
eosinophil preparations used in this study was greater than 98% and the contaminating cells
were mostly neutrophils. Eosinophils were resuspended in RPMI medium containing 25 mM
Hepes, 1 % PenicilLin/Streptomycin and 10% FBS.
Experiment design and trammigraton assay
The migration of eosinophils through basement membrane components was evaiuated using
24-weil Biocoat Matrigel Invasion chambers@ (Becton Dickinson; Bedford, MA). To
optimally induce migration of eosinophils, we incubated eosinophils with or w i o u t IL-5 (10
ng/ml), 30 min at 37OC, 5% CO2 before the transmigration assay. Plates were incubated at
37O~, 5% CO2 for 18 h except for kùietics where celis were incubated for 1 to 18 h. To
evaluate the number of cells that had migrated into the lower chambers, cells in both
chambers were removed by aspiration and remainhg cells on both sides of the pore
membranes were gently washed and harvested twice with cold RPMIl5mM EDTA. Cells of
each chamber were cenû-ihged (700 x g) and resuspended in cold RPMI 1640 and counted
on an hernacytometer. For each condition, percentage of transmigration was calculated as the
number of cellç in the lower charnber of the Matrigel Invasion chamber@ divided by the
number of cells in the lower chamber of a control invasion chamber without the ~ a t r i ~ e l @
membrane.
The recovery fiom the washing procedure was evaluated by calculating the number of cells in
both chambers after transmigration and cornparing with the number of cells prior to the
transmigration assay. The recovery was always superior to 95%. The control invasion
chambers had the same pore size (8 pm) and density and were made of the same material as
the Biocoat Matrigel Invasion chambers@. Most eosinophils migrated through the uncoated
control invasion chambers when they were incubated in presence of IL-5 (> 95%).
To study the role of proteinases in transmigration, eosinophil suspensions (1O6 cells/ml in
complete RPMI) were preincubated with or without monoclonal antibody against MMP-9 (2
pglml) or CD87 (10 pg/ml) for 30 min at 37OC+ in 5 % CO2. Cells (500 pi) were added to
the upper chamber and, in specinc wells, BB-3103 at different concentrations or 6-
aminocaproic acid (500 pg/ml) was added directly to cell suspensions after IL-5 incubation.
PAF (1 FM) or 5-0x0-ETE (1 PM) was used as chernotactic factor and added in the lower
chambers. In some experiments, PAF and 5-0x0-ETE diluents, DMSO and ethanol
respectively, were used as control and did not show any effects on eosinophil transmigration.
Flow cytomehic analyss of eosinophil CD87 expression
Eosinophils were incubated at 1 o6 cells/mi in complete RPMI and stimulated for 30 min with
or without recombinant IL-5 (10 ng/ml) at 37OC, 5 % COz. Eosinophils were then washed
once with cold PBS 1X supplemented with 0.1 % BSA, and labeled with monoclonal
antibodies. Briefly, 250 000 cellsA00 pl were incubated 45 min at 4OC with 1 &ml of mAb
specinc for CD87 or n4B mouse IgG2a (isotype control). Cells were washed once with
PBS + 0.1 % BSA, resuspended in 100 pl and incubated 45 min at 4OC with 1 p g M of mAb
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG. Expression of CD87 on eosinophils (mean
fluorescence) was analyzed by flow cytometry (EPICSO ELITE ESP, Coulter Elec~onic).
Measurement of Ml@-9 in superna fants of eosinophils
MMP-9 was measured in supematants of eosinophils incubated on Matrigel@ membrane in
various conditions: RPMI alone, with FBS 10 %, with FBS 10 % and IL-5, or with FBS 10
%, IL-5 and 5-0x0-ETE (1 pM)- Some Matrigel0 chambers were incubated in absence of
cells with RPMI plus FBS 10 %, IL-5 and 5-0x0-ETE. The MMP-9 enzyme imrnunoassay
sensitivity was 0.6 ng/ml.
Means and standard errors of the mean (SEM) were deterrnined for continuous variables.
Mean values of quantitative variables were compared using a two-way anova (randomized
biock design) for unpaired data as normaiïty and variance assumptions were met. Tests were
adjusted when designs were unbalanced. At posteriori cornparisons were performed with
Tukey's method. Cornparisons between 5-0x0-ETE and 5-0x0-ETE + IL4 were performed
using Student paired t-test. AU reported p-values are two-sided. The results were considered
signincant when p values were < 0.05. The data were anaiyzed using the statistical package
program SAS, SAS Imtitute Inc. (Cary, NC).
3.6. RESULTS
Characteristics of subjects
Fifty-one subjects, twenty-two normal subjects (1 1F/1 IM, mean age: 32.2 t 2.3 years) and
twenty-nine asthmatics (15F/14M7 age: 26.1 + 1.9 years) were recruïted into this study. Al1
were nonsmokers. Mean FEV, of normal and asthmatic subjects were 105.1 + 2.9 % and
86.6 + 3.7 % of predicted respectively. Mean blood eosinophil counts were increased in the
asthmatic group compared to the normal group: 0.48 f 0.04 and 0.15 f 0.02 x 10g/liter
respectively (p < 0.0001).
Kinetics and dose-response of 5-0x0-ETE on eosinophil îransmigration
In presence of IL-5, 5-0x0-ETE induced an important transmigration through the Matrigel@
both in normal and asthmatic purified blood eosinophils (Figure 1A). This effect increased
over time and plateaued at 6 hours in both groups. The optimal eosinophil migration rate
observed was 90.8 f 2.2 % in normal eosinophils and 94.1 + 2.4 % in asthmatic cells. A very
weak migration was observed in presence of IL-5 alone: < 3.2 % (Figure 1B). The dose-
response data showed that the 5-0x0-ETE maximal effect was obtained with a concentration
of 1 pM in both ce11 preparations. At a much lower concentration (0.001 PM), 5-0x0-ETE
still induced significant eosinophil transmigration (14.6 + 3 -6 %). Compared to 1 PM, higher
concentrations of 5-0x0-ETE (5 and 10 FM) decreased eosinophil transmigration but did not
abolish it. In these two sets of experiments, the effects of 5-0x0-ETE on normal and
asthmatic eosinophils were similar.
Cornparison of the eflects of 5-0x0-ETE and PAF on eosinophil b-unsrnigration
The figure 2 compares eosinophil transmigration obtained with IL-5 alone, PAF and IL-5,
and 5-0x0-ETE and IL-5. As observed above, IL-5 induced a weak eosinophil migration
(mean: 1.4 %). Compared to IL-5 alone, PAF (1 pM) in presence of IL-5 promoted
significant and similar eosinophil migration in both normal and asthmatic eosinophils: 7.7 t
3.1 % and 5.4 + 1.7 % respectively (p = 0.0001), a mean of 6.5 1.7 % for al1 subjects.
However this effect remains much lower compared to that observed with 5-0x0-ETE 1 pM
and IL-5 which induced large and similar eosinophil migration in both normal and asthmatic
eosinophils: 82.0 k 3.7% and 88.1 f 3.8% respectively @ = 0.0001, compared to IL-5 alone
and PAF + IL-5). In fact, it was even slightly lower than that observed with 5-0x0-ETE
0.001pM (Figure 1B).
Modularion of 5-0x0-ETE-induce eosinophil migration by IL-5
In the experiments presented above, eosinophils were treated with both IL-5 and a
chernotactic factor, either 5-0x0-ETE or PAF. Since Okada et al. (7) showed that IL-5, which
alone did not induce eosinophil migration, was nevertheless essential for PAF-induced
eosinophil migration, we evaluated the effect of IL-5 on 5-0x0-ETE ce11 migration.
Interestingly 5-0x0-ETE alone was capable of inducing a significant eosinophil migration in
normal and asthmatic cells and this efTect was similar in both groups: 63.4 + 0.4 % and 59.2
f 7.0 % respectively (Figure 3). The addition of IL-5 30 min prior to the transmigration
assay significantly increased the cell migration in both normal and asthmatic cells: 89.7 f 1.5
% and 95.9 + 2.2 % respectively @ = 0.003).
Modulation of eosinophil uPAR (CD87) expression by IL-5
CD87 was constitutively present on eosinophils as rneasured by flow cytometry (RPMI mean
fluorescence: 1.14 + 0.1). IL-5 significantly increased surface expression of CD87 (mean
fluorescence: 1.52 t 0.15, p = 0.0001, paired t-test) and thÎs effect was sùnilar between
normal and asthmatic eosinophiis.
Modulation of 5-0x0-ETE-induced eosinophil migration by UMP and serine proteuse
inhibition and, MMP-9 and Cm7 blocking
In normal eosinophils, the MMP inhibitor BB-3 103 used at concentrations of 1 to 10 FM
inhibited signincantly and progressively the cell migration kom 79.0 % to 45.9 % @ =
0.0001, figure 4). In cells fiom asthmatics, the inhibition was significant, 86.4 % to 42.3 %,
and similar to that observed with normal cells but interestingly was almost optimal with the
lowest inhibitor concentration,
In other experiments, the inhibitory effects obtained with anti-MMP-9 was measured and
compared with the ones of the MMP inhibitor (figure 5). The anti-MMP-9 monoclonal
antibody provided similar transmigration inhibition as the MMP inhibitor in both groups of
subjects: 54.3 + 9.8 % and 64.0 + 3.2 % respectively. The presence of anti-CD87
monoclonal antibody dso caused signincant eosinophil transmigration inhibition in both
groups, 51.8 + 3.9 % and 63.3 f 2.0 % respectively, and the range of this inhibition was
similar to the one obtained with MMP inhibitor and anti-MMP-9 monoclonal antibody.
However, combination of MMP inhibitor and anti-CD87 mAb did not provide better
inhibition of eosinophil migration (50.9 % for the combination versus 5 1.0 % for BB-3 103
and 52.9 % for CD87 alone, n = 3). The E-arninocaproic acid inhibited eosinophil
transmigration (61 + 5 %, n = 4, 2 normal and 2 asthmatic subjects) compared to IL-5 + 5-
0x0-ETE control condition (83 + 3 %). In these subjects, monoclonal anti-CD87 antibody
decreased eosinophil transmigration to a mean of 63 t 3 %. These data suggest that
inhibition of plasmin obtained by a plasmin inhibitor or an antibody to CD87 is sirnilar.
MMP-9 measured in supernatants of Matrigel@ chambers incubated without cells
@PMI + FBS 10% + 5-0x0-ETE), with utlstimulated (RPMI alone, RPMI + 10% FBS) and
stimulated (RPMI + FBS 10% and 5-0x0-ETE f IL-5) eosinophils (n = 3 for each condition)
remained below the assay sensitivity (dl data 1 0.26 nghl).
3.7. DISCUSSION
This study shows that 5-0x0-ETE, a potent eosinophil chemotactic factor, has a great capacity
of promoting eosinophil transmigration through basement membrane cornponents. In
presence of IL-5, his optimal effect on transmigration is much more important, >IO-folcl, than
the one observed herein or reported by Okada et al. with other chemotactic factors notably
PAF (7). Moreover on a molar basis, 5-0x0-ETE is 1000 times more potent than PAF since it
induced a sligthly higher transmigration at 0.001 FM than PAF at 1 p M (Figures 1 and 2).
To our knowledge, 5-0x0-ETE is the most powerfül promotor of eosinophil migration and
this significant in vitro effect suggests that it could be an eficient mediator involved in tissue
eosinophil recruitrnent in diseases such as asthma. Moreover, this study shows that
eosinophil transmigration is mediated by both MMP and the plasminogen-uPAR systems. It
suggests that a therapy inhibiting the activity of these enzymes, codd significantly decrease
eosinophil recniitment which is believed to be a significant event in the pathogenesis of many
diseases (2).
The magnitude of eosinophil transmigration obtained with PAF in this study is comparable to
the one reported by Okada et al. (7) even though different techniques were used to measure
ce11 transmigration. This observation M e r strengthens our results obtained with the 50x0-
ETE which revealed to be a much more potent inducer of eosinophil transmigration than
PAF. The greater capacity of 5-0x0-ETE to promote transmigration could be due to both its
capacity to activate proteases and ce11 chemokinesis. Indeed, 5-0x0-ETE has been shown tu
be a more potent chernotactic factor than PAF (15). Moreover, it codd also induce greater
gelatinase activity than PAF; however, in our experiments, we could not demonstrate a
greater eosinophil gelatinase activity with 5-0x0-ETE (data not shown) nor a release of
MMP-9 in supematants of UIlSfimulated or stimulated eosinophils incubated in Matrigel
chambers with or without FBS or IL-5 and 5-0x0-ETE. These data are in accordance with
the ones reported by Foissier et al who did not observed an increased eosinophil MMP-9
expression in presence of IL-5, PAF or eotaxin (22). This expression was increased at the
protein level but not the mRNA level after a stimulation with 10 pM PMA. In con-
Okada et al. (25) showed by zymography and immunoblotting that expression of MMP-9 was
increased in culture media of eosinophils by PAF, IL-5 or both but that its enzymatic activity
was increased only in presence of both PAF and IL-5. The reasons that could explain the
clifferences seen between these results and ours remain undefrned. On the other hand, the
mouse tumor derived Matrigel@ matrix contains a certain amount of MMP-9 (40)- However
this Matrigel-derived enzyme did not seem to interfer signincantly with ce11 transmigration
shce ahos t no transmigration was obsewed in absence of 5-0x0-ETE (Figures 1 and 2).
In contrast to PAF, 5-0x0-ETE induced a significant ce11 migration in absence of IL-5
priming. This could be explained in part by the greater capacity of 5-0x0-ETE to induce
eosinophil protehase activity and chemokinesis as mentioned above. 5-0x0-ETE could also
prime eosinophils via the production of an autocrine cytokine such as GM-CSF or IL-5. IL-5
arnplified the effect of 5-0x0-ETE likely by priming.
The plasminogen-uPAR system converts proenzyme plasminogen to plasmin which has
important effects in tissue homeostasis. Plasmin is a potent serine protease which degrades,
directly or indirectly by activation of MMP, the tissue extracellular matrix (26-28). Its role
has been demonstrated in granulocytes infiltration into a fibrin matrix (41). Herein, we
showed that it also plays an important role in eosinophil transmigration since an anti-uPAR
monoclonal antibody and a plasmin inhibitor, the E-aminocaproic acid, decreased
significantly eosinophil transmigration. These experiments do not allow to define if plasmin
is acting mostly directly on extracellular matrix components or indirectly via M b P activation
(26-2 8).
Interestingly, the inhibition of MMPs and of uPAR provideci significant and similar
inhibition of eosinophil transmigration but neither one nor their combination completely
blocked eosinophil transmigration. It codd niggest that protease inhibition was not cornplete
and that s a c i e n t protease activity was present for inducing ce11 transmigration. Indeed the
activity of these enzymes is localized and prevails on the ce11 membrane area engaged with
the basement membrane to be passed (29). This area codd be physically confined remaining
to a certain point out of reach of the inhibitors either the drug or the antibodies. This
possibility could aiso explain why MMP-9 activity and protein are hardly measured in
supematants of transmigrating eosinophils.
On the other hand, other types of proteases could be produced by eosinophils and be involved
in the transmigration process. Indeed the inability to demonstrate MMP-9 expression raises
the possibility that the MMP inhibitors used in our experiments might act on additional MMP
or on membrane proteins containing a disintegrin and metalloprotease domain (ADAM) (42).
Although BB-3 103 inhibits various MMP, the Calbiochem MMP-9 antibody is reported to be
specific for MMP-9 suggesting that its anti-MMP blocking activity is mostly through the
neutralization of MMP-9. To our knowledge, no pnor demonstration of ADAM with MMP-
9 activity has been described nor the presence of ADAM on eosinophils.
No difference was observed between normal and asthmatic eosinophil transmigration
response to 5-0x0-ETE. This may seem surprising since it has been suggested that 5-0x0-
ETE acts differently on normodense and hypodense eosinophils (12, 15). The asthmatic
subjects had increased blood eosinophil counts and did not take inhaled steroids, we could
therefore conclude that their eosinophils were activated and hypodense. Nevertheless, in our
experiments, they had similar transmigration response to 5-0x0-ETE that the normal
eosinophils. Consequently, our data do not suggest that eosinophils of asthmatic subjects had
a greater response to 5-0x0-ETE than celis of normal subjects. They also suggest that the 5-
0x0-ETE receptor number and activity would be similar in normal and asthmatic eosinophils.
Interestingly, the kinetic of BB-3 1 O3 effects suggest that asthmatic eosinophil MMP are more
sensitive to the inhibition. The reason for this eEect remains undefined.
In conclusion, this study shows that 5-0x0-ETE, an arachidonic acid metabolite released by
many ceU types, beside being a potent eosinophil chernotactic factor, is also an efficient
activator of eosinophil transmigration much more potent than PAF. This effect seems
mediated by various proteinases notably MMP-9 and the plasminogen-uPAR systern
produced by eosinophils. However more data on 5-0x0-ETE modulation of MMP, the serine
protease plasmin and possibly ADAM are needed. The eosinophil transmigration promoter
activity of 5-0x0-ETE should also be M e r confirmed in vivo (17) but it suggests that
inhibition of 5-0x0-ETE or its activity on proteases constitute a potential therapeutic avenue
in diseases where eosinophil recruitment is involved.
The authors thank Luce Trépanier for her precious help in recruitîng the subjects,
nurses for blood sampling, Serge Simard for the statistical analysis and Eric Rousseau for
reviewing the manuscript.
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Figure 1. Kinetics (A) and dose-response (B) of 5-0x0-ETE-induced eosinophil
transmigration through the ~ a t n ~ e l @ basement membrane. Eosinophils of healthy
voluntees (open bar) and asthmatics (dark bar) were preincubated with I L 5 (10 ng/rnl) for
30 min at 3 7 O ~ and added to the upper chamber. For the kinetic study, they were incubated
for variable penods (1 to 18 hours), 5-0x0-ETE (1 PM) being added to the Iower chamber (n
= 4 in each group). In the case of dose-response study, the 5-0x0-ETE was used at various
concentrations and cells were incubated 18 h (n = 5 for 5-0x0-ETE O and 1 FM, n = 3 for 0.1
and 5 pM, n = 2 for 0.001 and 10 FM).
Figure 2. Cornparison of the effects of 5-0x0-ETE (1 FM) and PAF (1 FM) on
eosinophil transmigration through the ~ a t r i ~ e l @ basement membrane. Eosinophils of
healthy volunteers (open bar) and asthmatics (dark bar) were preincubated with IL-5 (10
ng/ml) for 30 min, added to the upper chamber and incubated for 18 hours at 37Oc. 5-0x0-
ETE (1 pM) or PAF (1 PM) was added to the lower chamber. Bars identif~ed by different
letters are significantly different (anova, p = 0.0001). Nurnbers under bars represent the
number of subjects for each condition-
Figure 3. Modulation of 5-0x0-ETE-induced eosinophil transmigration through the
~ a t r i ~ e l @ basement membrane by IL-5. Eosinophils of healthy volunteers (open circles) and
asthmatics (closed circles) were preincubated with or without IL-5 (10 ng/ml) for 30 min,
added to the upper chamber and incubated for 18 hours at 37Oc. 5-0x0-ETE (1 PM) was
added in the Iower chamber. 5-0x0-ETE induced a signincant eosinophil transmigration
which was amplified by IL-5 (p = 0.003, Student paired t-test).
Figure 4. Modulation of eosinophil transmigration through the ~ a h 5 ~ e l @ basement
membrane by the metalloproteinase inhibitor BB-3 103. Eosinophils from healthy volunteers
(A) and asthmatics (B) were preincubated with IL-5 (10 ng/rnI) for 30 min at 3 7 O ~ . The cells
were incubated for 18 hours in the upper charnber with or without various concentrations of
BB-3 1 O3 (1 to 10 PM). 5-0x0-ETE (1 liM) was added in the Iower chamber. In each graph,
bars identified by different letters are significantly different (anova, p = 0.0001). Numbers
under bars represent the number of subjects for each condition.
Figure 5. Cornparison of different inhibitors on 5-0x0-ETE-induced eosinophil
transmigration through the ~atr&el@ basernent membrane. Eosinophils of healthy
volunteers (open bar) and asthmatics (dark bar) were preincubated with IL-5 (10 ng/ml) and
with or without anti-MMP-9 (2 FM) or anti-CD87 (1 0 PM) for 30 min. The ceiIs were added
to the upper charnber and incubated for 18 hours at 3 7 O ~ . In specific wells BB-3103 was
added directly to the upper chamber &er IL-5 incubation. 5-0x0-ETE (1 PM) was added in
the lower charnber. Bars identifïed by different letters are significantly different (anova, p =
0.0001). Nurnbers under bars represent the nurnber of subjects for each condition.
3.1 1. FIGURES
Figure 1
I L 5 PAF S-oxo-ETE + IL-5 + IL-5
Figure 2
Figure 3
S-oxo-ETE - + + + + + BB-3103 ( PM) - - 1 2 5 10
Figure 4
+ 5-0x0-ETE
and I L 5
Figure 5
CHAPITRE 4 : DISCUSSION
Le recrutement des éosinophiles de la circulation sanguine vers les tissus est une étape
importante lors de plusieurs maladies inflammatoires. Ce phénomène est observé dans
l'asthme où une éosinophilie sanguine et tissulaire corrèle avec la sévérité de la maladie.
L'éosinophile libère une multitude de médiateurs ayant des propriétés toxiques directes ou
capables de produire certains médiateurs qui perpétuent la réponse inflammatoire et
provoquent les anomalies physiologiques et morphologiques observées dans la muqueuse
bronchique de l'asthmatique-
Ce recrutement de la circulation sanguine nécessite une adhérence à la paroi vasculaire, un
passage entre les cellules endothéliales puis finalement, le passage à travers la membrane
basale et le tissu sous-jacent. Pour un recrutement et une migration optimale, l'éosinophiie
doit être en présence de facteurs chimiotactiques qui dirigent la cellule vers le site
inflammatoire. Cependant, la barrière offerte par ta membrane basale limite la migration des
cellules non-inflammatoires ou qui ne possèdent pas d'enrymes capables de la digérer. Il a
été démontré que L'éosinophile possède au moins deux types d'enzymes qui dégradent
plusieurs composantes de la matrice extracellulaire.
Cette étude avait pour but de vérifier la dynamique du recrutement de l'éosinophile induit par
le 5-0x0-ETE à travers une membrane basale artificielle de type MatrigelB. Le protocole
établi permet d'évaluer deux paramètres : celui de l'efficacité d'agents chimiotactiques sur la
transmigration de l'éosinophile et celui de l'implication d'enzymes de digestion des protéines
de la matrice extracellulaire sur cette même transmigration. Le 5-0x0-ETE, un médiateur
dérivé de l'acide arachidonique, est un facteur chuniotactique spécifique et a une grande
capacité d'induction de la transmigration. 11 est logique de croire que, dans un contexte
inflammatoire où la voie métabolique de la 5-lipoxygénase est augmentée, la synthèse du 5-
0x0-ETE soit accrue et participe ainsi au recrutement spécifique de l'éosinophile. Bien que
Powell et ses collaborateurs ont bien décrit les multiples rôles du 5-0x0-ETE, aucune étude
n'a réellement été effectuée sur la transmigration de l'éosinophile à travers une membrane
basale. Okada et ses coUaborateurs ont pour leur part démontré que Ie PAF, un agent
chimiotactique non-spécifique pour l'éosinophile, induit la transmigration d'environ 8%.
Nos résultats démontrent que le 5-0x0-ETE induit une transmigration beaucoup plus
importante, environ 10 fois supérieure à celle obtenue avec le PAF par notre équipe et par
celle d'Okada. Malgré les différences dans le protocole utilisé, il est intéressant de voir que
nos résultats avec le PAF sont similaires à ceux publiés par Okada, renforcant ainsi ceux
obtenus par le 5-0x0-ETE. De plus, les résultats démontrent que l'éosinophile doit être mis
en présence d'un agent chimiotactique pour pouvoir effectuer sa transmigration puisque les
éosinophiles ne transmigrent pas lorsqu'ils sont incubés uniquement avec une cytokine
inflammatoire tel l'IL-5. Ces données sont consistantes avec les résultats d'Okada et son
équipe qui ont décrit que la transmigration n'est pas possible uniquement avec les cytokines
mais nécessite la présence d'un agent chimiotactique. De plus en plus d'évidences montrent
également que l'IL-5 induit plutôt le c himio kinésisme et non le chimiotactisme (1 0 1).
Notre dewième but était d'évaluer le rôle des protéases dans la digestion de la membrane par
les éosinophiles. Il est reconnu que l'éosinophile est une source de MMP-9, par contre,
comparativement à d'autres types cellulaires, sa libération demeure faible (1 33). Cependant,
dans certaines conditions pathologiques comme l'asthme, l'éosinophile peut d e v e ~ une
importante source de MMP-9. L'utilisation d'un anticorps anti-MMP-9 ou d'un inhibiteur
spécifique de la famille des métalloprotéinases de la matrice, a considérablement diminué la
transmigration. Un second système de dégradation est présent chez l'éosinophile, il s'agit du
système du plasminogène. Un élément important de ce système est le récepteur de I'uPA,
présent à la surface de l'éosinophile. Ce récepteur catalyse la génération de la plasmine, une
puissante enzyme qui s'atîaque à plusieurs protéines de la matrice dont la plupart des
composantes de la membrane basale. Le bloquage de ce récepteur à l'aide d'un anticorps
diminue la transmigration de l'éosinophile. La combinaison de l'anticorps anti-uPAR et
l'inhibiteur des MMPs n'a pas petmis de diminer davantage la transmigration. Comme
l'inhibition de la transmigration n'a jamais été complète par l'ajout d'inhibiteurs, ceci
suggère que Les enqmes de dégradation sont localisés au contact de la membrane basale et
demeurent difficiles d'accès aux inhibiteurs- D'un autre côté, la présence d'autres protéases
n'est pas exclue,
IL est intéressant de remarquer que l'IL,-5 et le 5-0x0-ETE augmentent Ie nombre de
récepteurs CD87 à la surface de l'éosinophile. Ainsi, les cellules en mouvement et en
migration vers un site inflammatoire, où des cytokines et agents chimiotactiques
prédominent, bénéficient d'une activité protéolytique augmentée accélérant du même coup le
recrutement.
Le phénotype de l'éosinophile provenant de sujets asthmatiques differe de l'individu normal
à plusieurs égards. La libération de médiateurs inflammatoires comme le LTC, chez les
éosinophiles d'asthmatiques est accrue et on dénote par ailleurs plus d'éosinophiles
hypodenses que chez les individus normaux. Comme le 5-0x0-ETE pourrait agir
différemment sur L'éosinophile hypodense (1 1 1)' nous avons postulé que la transmigration
induite par le 5-0x0-ETE serait diffërente chez ces individus. Cependant, aucune différence
n'a été remarquée lors des essais de transmigration. Ceci peut s'expliquer par le fait que le 5-
0x0-ETE est très puissant, et de par sa transmigration de plus de 90% recrute tous les
éosinophiles peu importe leur statut. Le récepteur du 5-0x0-ETE est peut-être exprimé de
façon constitutive et non-inductible. Cependant, il a été remarqué que la cinétique
d'inhibition de la transmigration par l'inhibiteur des métalloprotéinases est différente entre
les deux groupes. Curieusement, les éosinophiles de sujets asthmatiques sont plus sensibles à
cet inhibiteur. Cette observation est difncilement explicable laissant supposer peut-être une
différence dans la structure même des protéases ou bien une libération accrue d'inhibiteur
naturel TIMP-1 par les éosinophiles de sujets asthmatiques.
Toutes ces données rassemblées, nous permettent de mieux cerner une étape du recrutement
de l'éosinophile vers le tissu. Eues permettent de conclure que le 5-0x0-ETE est un puissant
agent chuniotactique qui peut être impliqué de façon importante dans les pathogénèses à
éosinophile. De plus, elles suggèrent que l'inhibition des protéases impliquées dans la
dégradation des protéines de la membrane basale semit une avenue thérapeutique souhaitable
dans un contexte où il existe un recrutement cellulaire démesuré- L'ajout de ces inhibiteurs
au traitement anti-hfiammatoire actuel pourrait être envisageable dans l'asthme allergique.
CHAPITRE 5 : PERSPECTIVES
Le modèle in vitro pour l'étude de l'invasion cellulaire nous a pennis de répondre à certaines
questions. 11 est maintenant possible d'étudier des phénomènes beaucoup plus dynamiques et
les résultats peuvent être plus facilement corrélés avec les mécanismes réels retrouvés chez
l'humain. Nos travaux ont cependant ouvert plusieurs portes pour L'étude d'autres
phénomènes.
Le présent mémoire a mis l'accent sur la transmigration de l'éosinophile à travers une
membrane basale artificielle. La présence d'agent chllniotactique s'est révélée indispensable
dans le chimiotactisme de l'éosinophile. Il serait donc intéressant de mettre à l'essai d'autres
agents chimiotactiques dont l'éotaxine-2, récemment caractérisé (97), de façon à comparer
leurs effets respectifs sur la transmigration. Leur pouvoir d'attraction pourrait ainsi être
mesuré puis comparé. Les résultats permettronL peut-être de découvrir quelques agents
susceptibles d ' ê e de plus puissants modulateurs de la transmigration de l'éosinophile in
vitro.
La destruction de la membrane basale par l'éosinophile nécessite au moins deux types de
protéases. De façon à mieux cerner ie rôle des métalloprotéinases et du système d'activation
du plasminogène, l'étude de plusieurs autres inhibiteurs pourrait être envisagée. Comme le
système d'activation du plasminogène appartient au groupe des sérines protéases, l'aprotinine
peut être un inhibiteur de choix. L'acide E-aminocapronique, un inhibiteur de la plasmine, a
été étudié par plusieurs chercheurs et pourrait être également utilisé dans notre modèle. In
vivo, le système menant à la conversion du plasminogène possède ses propres inhibiteurs
naturels qui permettent de maintenir le tout dans un état d'homéostasie. Le PA14 est
l'inhibiteur p ~ c i p a l de la conversion du plasminogène en plasmine et pourrait diminuer la
transmigration de l'éosinophile.
La disponibilité de fibroblastes et de cellules épithéliales provenants de biopsies bronchiques
de volontaires normaux et asthmatiques permet d'imagher un protocole utilisant la
membrane de MatrigelB. Les cellules d'asthmatiques possèdent un phénotype différent et
peuvent exprimer différentiellement plusieurs molécules. Le milieu conditionné par ces
cellules pourraient servir dans l'étude de la transmigration et du recrutement de l'éosinophile.
Finalement, plusieurs protéines de la matrice extracellulaire modulent le phénotype cellulaire.
Le passage de l'éosinophile à travers notre modèle pourrait moduler plusieurs cascades
biochimiques et modifier la libération de médiateurs inflammatoires dont le leucotriène C,.
CHAPITRE 6 : BIBLIOGRAPHIE
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