Matériauxpour la microscopie optique non linéaire intra vitale

Conseil Scientifique du CPER « Nouvelles Approches Physiques des Sciences du Vivant »

Jeudi 14 avril 2005

Un projet à l’interface Biologie/Physique/Chimie

Une problématique biologique.J. Coles « Neuroimagerie Fonctionnelle et Métabolique » INSERMM. Albrieux, « Laboratoire de Canaux Ioniques et Signalisation » CEA-

INSERM

Des mesures physiques.J.-C. Vial, P. Baldeck « Spectrométrie Physique » UJF

Des sondes chimiques.A. Ibanez « Matériau pour l’optique » CNRSC. Andraud « Chimie pour l’optique » ENS-Lyon

Deux projets de chimistes

« Elaboration de nanocristaux moléculaires fluorescents pour l'imagerie du cortex cérébral de

souris par luminescence excitée à 2 photons »

N. Sanz, A. Ibanez

Ingénierie moléculaire de chromophores pour l'imagerie du

potentiel membranaire de neurones par microscopie optique non-

linéaire » C. Andraud, C. Barsu,

Y. Bretonnière, O. Maury

Mertz, Current Opinion in Neurobiology

Les microscopies non linéairesTerme générique qui englobe toute les techniques basées sur l’optique non linéaire

Fluorescence induite par absorption à deux photons TPEF Génération de seconde harmonique SHG

ground

excitedTPEF

ONL du 3e ordreProcessus résonnant incohérentSignal de phase aléatoireProp n

SHG

ONL du 2e ordre sensible à l’ordre localNon centrosymétrieProcessus non résonnant cohérentSignal de phase contrôléeProp n2

Les microscopies non linéaires pour l’imagerie cellulaireDes techniques complémentaires

TPEF

SHG

Excitation 1) confocale (résolution 3D, limite les photo-dommages sur le trajet optique)2) a lieu dans l’IR (profondeur de pénétration accrue, domaine de transparence des milieux biologiques)

Non-centrosymétrie locale par orientation dans une membrane

Mertz & Blanchard-Desce, Biophys.J.2001, 1568.

Centrosymétrie locale à la jonction des deux GUV

Me Me

H

OMe

Me

Me

rétinal

Yuste & al, J. Biomed.Optics, 2004, 9, 873

La SHIM pour la mesure du potentiel membranaire Vm

Image SHG de neurones de ratVm imposé par patch-clamp

Potentiel membranaire (diffusion Ca+)0-100 mV

Démonstration de principe concluante mais 1) Addition de co-solvant (DMSO, EtOH)20 min de durée de vie cellulaire2) Photo-dommage (ADP)3) Désorientation dans la membrane (flip-flop)

Contrainte de fonctionsNon centrosymétrique (SHG)Fluorescente Répondre au Vm

(électrochromisme, réorientation)

Le cahier des charges de la sonde

Contraintes de formeAmphiphileSoluble dans l’eauS’orienter dans la membrane sans traverserStable photochimiquementNon toxique

Ordre de GrandeurImager le Vm (SHG 100.10-30 esu varie de 20%)Résolution spatiale (0,6 m)Résolution temporelle (1 ms)Solubilité (100 nMol)max (laser) = 800 nm

donc max(sonde) vers 400nm

Me Me

H

OMe

Me

Me

N

N

O3S

NN

O3S

N N

O3S

rétinal (Yuste)

ANEPPS (Loew)

ASPBS (Mertz & Blanchard-Desce)

(Webb & Blanchard-Desce)

Les sondes actuelles

Elles ont toutes permis la mise en évidence du phénomène mais aucune ne remplit complètement le cahier des charge Contraintes de fonction respectées mais pas les contraintes de forme

Faible diversité

« Better dyes and optimized microscope optics could ultimately lead to the imaging of neuronal activity with SHIM »Leslie Loew, Nature Biotech. 2003, 21, 1356

N N

ON

ON

NH O

n

n

n

n m

x

x

phospholipide constituant la membrane

X X

m O

OH

HO

OH

HO

HNO

O

OH

HO

OH

HO

Projet 1 : Hydrosolubilité

Rouge:contrainte de fonction (chromophore dipolaire, donneur et accepteur fort, neutre, important, stabilité)Bleu: Contrainte de fonction(Glucose pour assurer la solubilité dans l’eau, x profondeur d’ancrage dans la membrane, n caractère amphiphile, m et X balance hydrophile/hydrophobe)

Projet 1 : Synthèse d’une molécule modèle (C. Barsu)

ClN

ON

ON

IN

ON

ON

TMS

N

ON

ON

TMS N

ON

ON

K2CO3OHN

OOH

OOH

PdCl2(PPh3)2CuI,

Et3N / THF

Acide chélidamiqueCommercial

HI aqH3PO3

1) SOCl2, DMF

2) Et2NH, CH2Cl2

87-93 %

88 -92 %

CH2Cl2 / MeOH

94 %

77 %

FeAcOH

I NH2

I NO2I NO2

I N

NO2

Commercial

1) I2, AcOH

2) H2SO4, NaNO2

67 %

NaOH, Et3BnNCl cat

n-Hex-BrDMSO

91 %

69 %

n-HexBr 4 éq. Na2CO3 1,8 éq. DMF NaI 4éq. 72 %

N

ON

ON

NHex2

Hex Hex

9 étapes de synthèseEchelle gramme

PdCl2(PPh3)2CuI, Et3N / THF 50%

N

O

N

O

N

NHex2

HexHex

Projet 1 : Caractérisation d’une molécule modèle

Simulation théorique TD-DFT R. Fortriemax = 438 nm; f = 1 =

Fort transfert de chargemax = 411 nm, = 36600 soit f = 0,71

Activité ONL significativeForte réponse électrochromisme

0

10000

20000

30000

40000

200 300 400 500 600

longueur d'onde

ceff

. d

'ext

inct

ion

mo

lair

e

Projet 1 : Introduction des contraintes de forme

N N

ON

ON

NH O

Hex Hex O

OH

HO

OH

HO

HNO

O

OH

HO

OH

HO

Chaînes hydrophobesC2 C8

1, 2 groupements hydrosolubles5 étapesEspaceur C2 C4

Balance C6 ?

Forte modularité de la structure

D

A A

D

En présence de champ

champ statique

Projet 2 : Chromophore à forte réponse orientationnelle

Chromophore qui se réoriente dans la membrane en présence du champ etqui se désoriente en l’absence de champ : BIS-DIPOLE

D

A

A

DEn l'absence de champ

Encombrement stérique et la répulsion électrostatique implique la désorientationdes deux dipôles, important

Orientation parallèle des deux dipôles dans le sens du champ, faibleadditivité des activités ONL

N

NO2

O

O

R

R

R

R

Projet 2 : Molécule cible et simulation

Simulation théorique DFT R. Fortrie= 115°

Bis-dipôle, Donneur rouge Accepteur bleu

Conclusion

Approche du chimiste sur une problématique biologie/physique/chimie« mesure du potentiel de membrane de neurone »

Développer une véritable ingénierie moléculaire dévolue à la conception de sondes en tenant compte des contraintes de fonction et de forme.

Hydrosolubilité (projet 1) Réorientation sous champs (projet 2)

Assurer le développement des ces sondes en étroites interactions avec nos collègues biologistes et physiciens.

Projet à Quatre ans sur lequel travaillent 1 doctorant et 1stagiaire puis 1 étudiante en Master recherche (Sept 05)