Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et

Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence cellulairede protéines d’adhérence cellulaire

Laurence Martel

19 décembre 2002

UMR 5819 CNRS-CEA-UJF

Structures et Propriétés d’Architectures Moléculaires

Plan de l’exposéPlan de l’exposé

• Contexte : relations structure/fonction des protéines

• Méthodes d’analyse de surface– Élaboration de monocouches de protéines

– Techniques d’étude expérimentale

• Réflectivité X

• Ellipsométrie

– Modélisation des courbes expérimentales

• Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire– Présentation des cadhérines

– Rôle du calcium

– Interaction entre fragments

• Conclusions et perspectives

C-Cadhérine : résolution 0,308 nm(T. Boggon et al. 2002)

Positions des atomes

Relations structure/fonction des protéinesRelations structure/fonction des protéines

• Structure cristallographique de protéines obtenues à partir de

• Cristaux 3D par Rayons X

résolution atomique (jusqu’à 0,1 nm)

Objectifs de cette étudeDévelopper une méthodologie pour étudier les interactions

entre protéines immobilisées et protéines en solution

• Cristaux 2D par microscopie électronique à transmission ou AFM résolution ~ 1 nm

Hypothèses sur la fonction de la protéine

• Formation de complexes de protéines

– Immobilisation des protéines sur une surface

Informations sur les interactions entre protéines

Reconstruction 3D de la structureEnveloppe de la protéine

Sticholysine II : résolution 1,5 nm(Martin-Benito et al. 2000)

1,2nm






• Ellipsométrie






Élaboration de couches de protéinesÉlaboration de couches de protéines

1ère Étape : Formation d’une monocouche de lipides à la surface de l’eau– Dépôt de lipides ligands chélatant un ion Ni2+ : Ni-NTA-DLGE– + Lipides diluants pour la fluidité de la monocouche

lipides ligandslipides diluants

OO

O

O

O

O

NHO

N

O

OH

OOH

OOH


2ème Étape : Injection de protéines

Ancrage par liaison de coordination

histidine-nickel

Exemple: Injection de cadhérines-His6

Exemple: Injection de fragments


3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase

Étude des interactions entre protéines

3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase


Étude des interactions entre protéines

Techniques d’étude expérimentaleTechniques d’étude expérimentale

Informations recherchées

Mesurer la quantité de protéines ancrées aux lipides– Sans marqueur

– Sans transfert de la couche de protéines

Suivi de l’évolution en temps réel et in situ

– Ellipsométrie à la surface de l’eau

Résolution 0,5 mg/m2 = 0,5 ng/mm2

– Résonance des plasmons de surface sur surface solide

Déterminer la structure verticale de la couche

– Réflectivité des rayons X

Résolution verticale 1 nm

1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante

Ligne de lumière Troïka II, ESRF (Responsable O. Konovalov)

Goniomètre Cellule échantillon

Faisceau synchrotron monochromatique

10-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

100

Réf

lect

ivité

(I/I

0)

0.50.40.30.20.10q z (Å

-1)

qc


Mesure de l’intensité réfléchie spéculaire

sin4

irzq kk

Réflectivité I/I0

Cas d’une interface simple :Air-Eau

qz-4


10-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

100

Ré

flect

ivité

(I/I

0)

0.50.40.30.20.10q z (Å

-1)

Lipides Ni-NTA-DLGE

qc

Réflectivité I/I0

Cas d’une couche sur un substrat :Lipides sur eau


– Monocouche de fragments de C-cadhérine

– Lipides ligands Ni-NTA-DLGE

Cas d’une couche complexe sur un substrat :

Protéines ancrées aux lipides sur eau

Courbe de réflectivité complexe• Avantage de l’ESRF : la brillance du faisceau

synchrotron permet de mesurer jusqu ’à des vecteurs de diffusion q~0,5 Å-1 soit une résolution de ~6,5 Å

• Nécessité d’une méthode d’analyse des données avec un modèle du système étudié

2. Ellipsométrie2. Ellipsométrie

Suivi des variations des angles ellipsométriques et en fonction du temps, de , de

...,,,,.tan 110 dnnfer

r i

s

p

Relation entre la mesure et l’indice de réfraction 3

2

1

0

(°)

5554535251Angle d'incidence (°)

180

150

120

90

60

30

0

(°)


Cas des lipides sur l'eau

Indice eau n=1.333

Paramètres des lipides : n=1.448 d=2,5 nm

Mesure du rapport des coefficients de réflexion des polarisations p et s de la lumière autour de l’angle de Brewster

3

2

1

0

(°)


180

150

120

90

60

30

0

(°)


2. Ellipsométrie2. Ellipsométrie

Suivi de l’adsorption de C-cadhérine à une monocouche de lipides ligands Ni-NTA-DLGE [Ca2+] = 0,5 mM

Mesures angulaires après 2h, puis après 17h30

Conséquences– Non-linéarité de la variation de et de

avec l’adsorption à angle fixe– Interprétation des mesures cinétiques ?

Problème soulevé pour une couche épaisse (>10nm)

– Déplacement de la courbe ellipsométrique angulaire vers les grands angles

2h

2h17h30

17h30

Modélisation du système lipides+protéinesModélisation du système lipides+protéines

Objectif : Comparer les données expérimentales avec une courbe théorique pour déduire les paramètres (, d) caractérisant le système

Programmes de calcul : – Réflectivité X : Parratt32 (HMI Berlin), R. Ober

Paramètres ajustables : densité électronique , épaisseur d, rugosité – Ellipsométrie (et Résonance de Plasmon de Surface) : ce travail

Paramètres ajustables : indice de réfraction n, épaisseur d

Système à N couches (, d)N

• Équations de Fresnel

• Simulation des courbes par un calcul matriciel d’Abélès

10-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

100

Réf

lect

ivité

(I/I

0)

0.50.40.30.20.10q z (Å

-1)

Lipides Ni-NTA-DLGE

qc

Réflectivité des rayons X en incidence rasanteRéflectivité des rayons X en incidence rasante

Chaîne carbonée Tête polaire et groupement Ni-NTA

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

Den

sité

éle

ctro

niqu

e (e

.Å-3

)

6040200-20Distance (Å)

Lipides Ni-NTA-DLGE

eau

Réflectivité I/I0Modèle de profil de densité électronique des lipides • 2 couches : 7 paramètres d'ajustement (,d,)

Air Eau

Réflectivité des rayons X en incidence rasanteRéflectivité des rayons X en incidence rasante

Modèle de profil de densité électronique d’une monocouche de fragments de C-cadhérine

• 30 couches : d=0,7 nm, =0 nm 30 paramètres d'ajustement ()N

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

Den

sité

éle

ctro

niq

ue

(e.Å

-3)

2252001751501251007550250Distance (Å)

C-EC1-5His Lipides Ni-NTA-DLGE

eau

• Réflectivité X : Aire sous le profil de densité électronique, lipides soustraits

Comparaison ellipsomètrie et réflectivité X :Comparaison ellipsomètrie et réflectivité X :masse adsorbée par unité de surfacemasse adsorbée par unité de surface

dzRz

mmg emPOHP

OHelX

2

22 )()/(

Masse de C-cadhérine adsorbée aux lipidesEllipsométrie [Ca2+] = 0,5 mM Réflectivité X [Ca2+] = 5 mM

Après 2h : 6,0 ± 0,5 mg/m2 Après 4h : 8,1 mg/m2

Après 17h30 : 8,7 ± 0,5 mg/m2

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

Den

sité

éle

ctro

niqu

e (e

.Å-3

)

2252001751501251007550250Distance (Å)


eau

<P> ~ 0,417 e.Å-3 : densité électronique moyenne de la protéine

Rem rapport masse / électron dans la protéine sèche

• Ellipsométrie : Approximation de De Feijter et al. (1978)

)Å()/( 22

POHP

el h

dcdn

nnmmg

dn/dc ~ 0,19 cm3/g : incrément d’indice de la solution de protéine

RésultatsRésultats

Mises au point1. Technique d’élaboration de monocouches de protéines2. Techniques expérimentales d’analyse de surface complémentaires3. Modélisation du système en multicouches

Ellipsométrie

• Mesure des angles ellipsométriques et

• Ajustement pour obtenir <n> et <h>

• Estimation de la masse adsorbée apparente de protéines ancrées aux lipides

• Mesures cinétiques : 1 point / 3 secondes

Réflectivité des rayons X

• Mesure de l’intensité réfléchie

• Ajustement pour obtenir le profil de densité électronique perpendiculaire à la surface

• Calcul de la masse de protéines adsorbée aux lipides

Application à l’étude des interactions entre protéines d’adhérence cellulaire






• Ellipsométrie






Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérenceAdhérence cellulaire et molécules d ’adhérence

Exemple des cellules de l’endothélium vasculaire

Plusieurs familles de Protéines d’Adhérence Cellulaire

Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérenceAdhérence cellulaire et molécules d ’adhérence

Famille des cadhérines

– Glycoprotéines transmembranaires

– Sur tous types de cellules

– Différentes cadhérines selon les cellules :• VE-cadhérine humaine

(Vascular Endothelium)

• C-cadhérine de Xenopus

– 5 domaines extracellulaires homologues (EC)

– 12 ions Ca2+/cadhérine pour un bon repliement

~23nm

Interaction entre molécules d ’adhérenceInteraction entre molécules d ’adhérence

Interactions entre domaines extracellulaires de cadhérine

parallèles et anti-parallèles

Concentrations critiques en calciumPerz et al. 1999

mM [Ca2+]

0

0,05

0,5

1

pas d’interaction

dénaturation

cis

trans

Problématique : interaction entre cadhérines?Problématique : interaction entre cadhérines?

Quelle loi d’assemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ?

Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ?

Modèles actuels d’après résolutions de structure 3D et études en solution

C-cadhérine : Interactions transselon 3 alignements

(mesures de force de surface)

E- et N-cadhérine : Interaction trans par domaines N-terminaux

Problématique : interaction entre cadhérines?Problématique : interaction entre cadhérines?

VE-cadhérine : Formation d’hexamères du fragment VE-EC1-4

modèle d’interaction trans

Quelle loi d’assemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ?

Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ?

Modèles actuels d’après résolutions de structure 3D et études en solution

Les protéines recombinantes étudiéesLes protéines recombinantes étudiées

C-cadhérineCollaboration Deborah Leckband - UIUC, Urbana

Fragment principal : C-EC1-5 His

VE-cadhérineCollaboration Danielle Gulino - IBS, Grenoble

Fragment principal : VE-EC1-4 His

~19 nm

Parties extracellulaires seulement

~23 nm

Objectif de l’étude des cadhérinesObjectif de l’étude des cadhérines

Approche expérimentale

Caractérisation de couches de cadhérines• par ellipsométrie : masse adsorbée

• par réflectivité X : structure verticale

1) Variation de la concentration en calcium• Suivi de la masse adsorbée

• Évolution de la structure des couches

2) Interactions entre fragments de différentes longueurs

Questions posées

Structure et alignement cis ou trans

• le long des complexes de C-cadhérine?

• le long des hexamères de VE-cadhérine?

Monocouche de C-cadhérine en présence de Monocouche de C-cadhérine en présence de calciumcalcium

Monocouche de fragments C-EC1-5His avec [Ca2+] = 5 mM

– Lipides ligands Ni-NTA-DLGE

– Après 4 heures d’incubation

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

Den

sité

éle

ctro

niqu

e (e

.Å-3

)

2252001751501251007550250Distance (Å)


eau

Épaisseur totale ~16 nm

Modèle d’interactions des cadhérines dans la couche

Complexes cis ou trans ?

• D’après la structure de T. Boggon et al. (2002)• Inclinaison moyenne de 50° / surface

Influence de la concentration en calcium sur une Influence de la concentration en calcium sur une couche de cadhérinescouche de cadhérines

Cadhérine sensible aux variations de la concentration calcium ?

Monomères ou

complexes cis

Complexes trans

[Ca2+] > 1 mM

Perte de masse due àDécrochement de cadhérines Dissociation des complexes

Pas de variation attendue

- calcium

[Ca2+] < 0,5 mM

Influence de l’agent chélatant d’ions divalents EGTA sur une monocouche de C-cadhérine

Dissociation de complexes de C-cadhérineDissociation de complexes de C-cadhérine

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0

(°)

20191817Temps (h)

180

170

160

150

140

130

(°)

EGTACalcium10 mM10 mM

=459 nm, =52°5

A B C

Ellipsométrie : Suivi cinétique de et Masse apparente de protéine adsorbée

[Ca2+] =10mM[EGTA]=10mM[Ca2+] =5mM

-5%-17%

6,7 mg/m25,8 mg/m27,0 mg/m2

CBA

Perte de masse après l’ajout d’EGTA

La masse initiale de C-cadhérine est retrouvée à 95% par simple ajout de calcium

34% des fragments en complexes trans

Dissociation de complexes de C-cadhérineDissociation de complexes de C-cadhérine

À partir d’une couche élaborée sur forte concentration en calcium

3

4

5

6

789

10-8

2

3

4

5

6

789

10-7

2

Ré

flect

ivité

x q

z4

0.30.20.10q z (Å

-1)

C-EC1-5His 1 mM Ca2+

Lipides Ni-NTA-DLGE Expérience Ajustement

3

4

5

6

789

10-8

2

3

4

5

6

789

10-7

2

Ré

flect

ivité

x q

z4

0.30.20.10q z (Å

-1)

C-EC1-5His

Dilué à 0,1 mM Ca2+

Lipides Ni-NTA-DLGE Expérience Ajustement

Dilution de la sous-phaseRéflectivité X

Conclusion

Pertes de masse et déstructuration des couches de C-cadhérines

0.42

0.40

0.38

0.36

0.34

Den

sité

éle

ctro

niqu

e (e

.Å-3

)

200150100500Distance (Å)

[Ca2+

]=1 mM initial

Puis [Ca2+

]=0.1 mM

Profils de densité électronique

Perte de masse après dilution30% de fragments en complexes trans-15%

6,4 mg/m27,5 mg/m2

Conclusion sur la C-cadhérine Conclusion sur la C-cadhérine

• Cadhérines immobilisées sensibles au calcium

• Cadhérines inter-digitées dans la monocouche

• Dissociation de complexes trans de C-cadhérines

Mais …Les fragments possèdent tous une étiquette histidine

5

1

5

1 5

15

15

1

5

1

EGTA 75 mM

a) b) c)

NiCl2 75 mM

5

1

5

1

5

1

5

1

5

1

5

1

5

1

5

1

5

1 5

15

15

1

5

1

EGTA 75 mM

a) b) c)NiCl2 75 mM

5

1

5

1

5

1

5

1

5

1

5

1

5

1

[Ca2+] = 1 mM [Ca2+] = 0,1 mM

Interactions entre fragments de VE-cadhérineInteractions entre fragments de VE-cadhérine

Localisation des interactions entre cadhérine le long de la protéine ?

Interactions établies en solution entre fragments identiques de VE-cadhérine

(S. Bibert et al. 2002)

Trois mélanges de fragmentsVE-EC1-4 et de fragments courts

Rapport 1:100 (EC1-4:court) pour favoriser la formation de complexes mixtes en solution


Fragment 1-4 seul

His6

10-10

10-9

10-8

10-7

Réf

lect

ivité

x q

z4

0.40.30.20.10.0q z (Å

-1)

VE-EC1-4His 5 mM Ca2+

Lipides Ni-NTA-DLGE

Expérience Ajustement

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

De

nsi

té é

lect

ron

iqu

e (

e.Å

-3)

300250200150100500Distance (Å)

Lipides Ni-NTA-DLGEVE-EC1-4His

eau


Épaisseur totale ~ 21 nmHexamères en surface ?

Fragment 1-4 seul

~19 nm~23,3 nm

His6


Fragment 1-4 + fragment 1-3

10-10

10-9

10-8

10-7

Ré

flect

ivité

x q

z4

0.40.30.20.10.0q z (Å

-1)

VE-EC1-4His + VE-EC1-3Lipides Ni-NTA-DLGE

Expérience AjustementHis6

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30D

en

sité

éle

ctro

niq

ue

(e

.Å-3

)300250200150100500

Distance (Å)

Lipides Ni-NTA-DLGEVE-EC1-4His + VE-EC1-3

eau



Profil de densité électronique similaireau cas du fragment 1-4 seul

His6


Fragment 1-4 + fragment 2- 4

810

-9

2

4

6

810

-8

2

4

6

810

-7

2

Réf

lect

ivité

x q

z4

0.40.30.20.10.0q z (Å

-1)

VE-EC1-4His + fragmentsLipides Ni-NTA-DLGE

Lipides VE-EC2-4His6


Fragment 1-4 + fragment 2- 4

• Profil similaire à celui des lipides• Pas d'interaction lipide-cadhérine

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

De

nsi

té é

lect

ron

iqu

e (

e.Å

-3)

6040200Distance (Å)

Lipides Ni-NTA-DLGE VE-EC1-4His + VE-EC2-4

Fragment 1-4 +fragment 1-3

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

Den

sité

éle

ctro

niqu

e (e

.Å-3

)

300250200150100500Distance (Å)


eau

His6



810

-9

2

4

6

810

-8

2

4

6

810

-7

2

Ré

flect

ivité

x q

z4

0.40.30.20.10.0q z (Å

-1)

VE-EC1-4His + fragmentsLipides Ni-NTA-DLGE

Lipides VE-EC3-4His6



• Profil similaire à celui des lipides• Pas d'interaction lipide-cadhérine

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0D

en

sité

éle

ctro

niq

ue

(e

.Å-3

)




0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

De

nsi

té é

lect

ron

iqu

e (

e.Å

-3)




0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

Den

sité

éle

ctro

niqu

e (e

.Å-3

)

300250200150100500Distance (Å)


eau

His6

Modèles d’interaction entre cadhérines

• Ancrage de protéines aux lipides dans le cas du mélange EC1-4/EC1-3

• Pas d’ancrage de protéines aux lipides dans le cas des mélanges EC1-4/EC2-4 et EC1-4/EC3-4

Conclusion sur la VE-cadhérine Conclusion sur la VE-cadhérine

Entre fragments de longueurs différentes

Importance du domaine EC4La formation de complexes bloque l’étiquette histidine

Dans l’hexamère

?

Conclusion sur la VE-cadhérine Conclusion sur la VE-cadhérine

Modèles d’interaction entre cadhérines

En plusieurs étapes ?

Formation de complexes cis puis de complexes trans

Mélange de complexes en surface ?

Sur la méthodologie développée

• Ellipsométrie

– Nécessaire prise en compte de la non-linéarité de et de avec l’adsorption (mesures à angle fixe)

– Estimation quantité de matière adsorbée en surface, Résolution 0,5 mg/m2

– Suivi de la quantité de matière adsorbée en temps réel

• Réflectivité des rayons X

– Des profils de densité électronique complexes rendent compte de changements fins dans la couche de protéines

Résolution ~ 1 nm (suivant la normale à la couche)

ConclusionsConclusions

Sur l’étude des cadhérines

• Dissociation de complexes et déstructuration de la monocouche de C-cadhérine par appauvrissement de la sous-phase en calcium

Il existe des complexes anti-parallèles totalement enchevêtrés en surface

• Importance du domaine EC4 dans les interactions entre fragments de VE-cadhérine

Hexamères en surface ?

PerspectivesPerspectives

Étude des Cadhérines– Étude des interactions entre cadhérines immobilisées avec

• Un plus grand nombre de fragments courts différents

• Fragments sans étiquette histidine

– Structure de complexes cristallisés à 2 dimensions (VE-cadhérine : thèse R. Al-Kurdi)

– Questions ouvertes

• Observations de différences d’affinités en surface et en volume

• Faible action de l’agent chélatant EGTA sur le nickel des lipides ligands ?

Modélisation de la Réflectivité X– Améliorer la modélisation en tenant compte de

• Couches d’épaisseurs variables• Conservation du nombre d’électrons dans une couche

Monocouche de protéines sur Surfaces Solides– Manipulation des échantillons facilitée

– Étude par Résonance de Plasmons de Surface et Réflectivité de rayons X durs

PerspectivesPerspectives

Appareil de mesure de la Résonance de Plasmons de Surface

Documents

Méthodes danalyse de surface appliquées à létude de protéines dadhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et