Bull. Fr. Pêche Piscic. (1994) 335 : 147 -169 — 147 —

MÉTHODOLOGIE DE L'ÉTUDE ENDOCRINIENNE D'UNE ESPÈCE SAUVAGE, L'ANGUILLE.

S y l v i e D U F O U R , J . M A R C H E L I D O N , C. M l LET,

B. Q U E R A T , C. S A L M O N .

Laborato i re de Phys io log ie G é n é r a l e et C o m p a r é e , M u s é u m Nat iona l d 'His to i re Naturel le, U R A 90 C N R S , 7 rue Cuvier , 75231 Paris C e d e x 0 5 , France.

R É S U M É

L'étude des régu la t ions h o r m o n a l e s , reponsab les du con t rô le de g randes fonct ions te l les que le déve loppemen t , la c ro i ssance et la reproduc t ion , p résen te chez l 'anguil le un intérêt tout par t icu l ier du fait du cyc le b io log ique or ig inal de ce po i sson . Les object i fs d'une tel le é tude son t à la fo is f o n d a m e n t a u x ( conna i ssance de la b io log ie d e l 'espèce, not ion d ' espèce modè le , écophys io log ie , évolut ion) et app l iqués (carac tér isa t ion des populat ions, maî t r ise du cyc le b io log ique) .

Cependan t , la comp lex i té et la m é c o n n a i s s a n c e actue l le d e c e cyc le appo r t en t des d i f f i cu l t és s u p p l é m e n t a i r e s ( a b s e n c e de r é f é r e n c e n a t u r e l l e p o u r l es c a r a c t é r i s t i q u e s phys io log iques et env i ronnemen ta les des dern iè res é tapes d u cyc le) qui s 'a joutent à cel les conce rnan t c l ass iquemen t la mise en oeuv re d 'une tel le é tude c h e z une e s p è c e part icul ière (nécess i té de la m ise a u po in t d e s out i ls spéc i f i ques d ' inves t iga t ion) , e s p è c e d e surcroî t s a u v a g e (hé té rogéné i t é p h y s i o l o g i q u e et g é n é t i q u e d e s a n i m a u x é tud iés ) e t e n dange r ( l imi tat ion du nombre d 'an imaux expé r imen taux ) .

C'est la mise en oeuv re de tout un ensemb le de m é t h o d e s d ' inves t iga t ion , al lant de la m i s e au po in t d e s ou t i l s m o l é c u l a i r e s (pu r i f i ca t i ons d ' h o r m o n e s , o b t e n t i o n d 'an t i co rps , d o s a g e s immuno log iques , c l onage , ob ten t i on de sondes. . . ) à la réa l isat ion d 'expér iences in vitro (cu l tures de ce l lu les , i ncuba t ion ou pér i fus ion d ' o rganes ) e t in vivo (ab la t ions de g landes , t ra i tements h o r m o n a u x , p ré lèvemen ts sanguins. . . ) j u q u ' a u x é tudes sur le terrain, qu i pe rme t une app roche c o m p l è t e et in tégrée de l 'endocr ino log ie de ce po i sson .

M o t s - c l é s : e n d o c r i n o l o g i e , a n g u i l l e , Anguilla anguilla, m é t h o d e s , h o r m o n e , pur i f icat ion, dosage , c lonage , in vivo, in vitro.

M E T H O D S FOR E N D O C R I N E S T U D I E S O F A W I L D S P E C I E S , T H E E E L .

A B S T R A C T

Study ing ho rmona l regu la t ions wh i ch a re respons ib le for the cont ro l of ma in funct ions s u c h as deve lopment , g rowth a n d reproduc t ion , is of spec ia l in terest in the ee l , d u e to the pecul iar b io logical cyc le of th is f ish . Such a s tudy has bo th f ondamen ta l a i m s ( know ledge of e e l b i o l o g y , u s e of t h e ee l as a m o d e l , e c o p h y s i o l o g y , e v o l u t i o n ) a n d a p p l i e d o n e s (character is t ics of ee l popu la t ions , cont ro l of ee l b io log ica l cyc le) .

However , the c o m p l e x i t y a n d the p r e s e n t lack of d a t a o n t h e ee l b io log i ca l cyc le p r o v i d e s p e c i a l d i f f i c u l t i e s ( l a c k o f n a t u r a l r e f e r e n c e s c o n c e r n i n g t h e p h y s i o l o g i c a l character is t ics and the env i ronmen ta l cond i t ions of the last s teps of t he cyc le ) , in add i t ion to those encoun te red w i th the s tudy of a pecu l ia r spec ies (need for deve lopmen t of speci f ic research too ls ) , a w i ld spec ies (phys io log ica l and genet ica l he te rogene i t y of t he an imals) a n d an e n d a n g e r e d spec ies ( l imi tat ion of the n u m b e r of expe r imen ta l an ima ls ) .

Article available at http://www.kmae-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/kmae:1994011

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T h e use of va r ious invest igat ion methods, inc lud ing d e v e l o p m e n t of molecu lar too ls ( h o r m o n a l pu r i f i ca t ion , a n t i b o d i e s p roduc t ion , immuno log i ca l a s s a y s , c lon ing and p robe ob ten t i on ) , in vitro (cel l cu l tu re , o rgan incubat ion or per i fus ion) a n d in vivo (g land ab la t ion, h o r m o n a l t r e a t m e n t s , b l ood samp les . . . ) s tudies as we l l as f ie ld expe r imen ts , leads to a w h o l e a n d in tegrat ive a p p r o a c h of eel endocr inology.

K e y - w o r d s : endocr ino logy , ee l , Anguilla anguilla, me thods , h o r m o n e , pur i f icat ion, assay , c l o n i n g , in vivo, in vitro.

A . B U T S E T P R O B L È M E S D E L ' A P P R O C H E E N D O C R I N I E N N E C H E Z L ' A N G U I L L E

1 . P r o j e t f o n d a m e n t a l e t a p p l i q u é

1 . 1 . H o r m o n e s e t récepteurs

L 'Endocr ino log ie représen te l 'étude des régula t ions assu rées dans l 'organisme par d e s m e s s a g e r s c h i m i q u e s , l es h o r m o n e s . L e s h o r m o n e s s o n t s y n t h é t i s é e s par d e s o r g a n e s par t icu l iers ( les g landes endocr ines) et véh icu lées par le s a n g jusqu 'aux o rganes c i b l e s , d o n t e l l e s c o n t r ô l e n t l ' a c t i v i t é . L e s t i s s u s c i b l e s p o s s è d e n t d e s r é c e p t e u r s , m o l é c u l e s c a p a b l e s de l ier spéc i f i quement l 'hormone, ce qui a s s u r e la spéci f ic i té de la régu la t i on . La l ia ison de l 'hormone au récepteur ent ra îne toute une c a s c a d e d 'événements i n t race l l u la i res , d o n t la f o r m a t i o n d e seconds m e s s a g e r s , abou t i s san t a u x effets f i naux (d iv is ion , d i f férenc iat ion ou modi f i ca t ion d'activité de la cel lu le c ib le) ( F i g u r e l ) .

1.2. B u t s f o n d a m e n t a u x

Les régu la t ions h o r m o n a l e s sont responsables du cont rô le de fonct ions essent ie l les d e l ' o r g a n i s m e t e l l e s q u e d é v e l o p p e m e n t , c r o i s s a n c e , m é t a b o l i s m e , o s m o r e g u l a t i o n , m é t a m o r p h o s e , rep roduc t ion . Leur é tude es t donc ind ispensab le à la conna issance de la b io log ie d 'une espèce .

D e p lus , ce r ta ines e s p è c e s peuvent présenter, ou t re leur intérêt p ropre , un intérêt f ondamen ta l généra l du fait de régulations part icul ièrement spectacula i res (notion d 'espèce modè le ) ou du fait de relat ions particulières de leur cycle biololgique avec l 'environnement ( intérêt écophys io log ique) ou de leur posit ion dans l 'évolution des espèces (intérêt évolutif). C 'est le cas de l 'anguil le dont le cycle biologique présente des événemen ts marquants , tels q u e les d e u x m é t a m o r p h o s e s ( la m é t a m o r p h o s e la rva i re et l ' a rgen tu re ) et le b l o c a g e p r é p u b e r t a i r e d e la f onc t i on de reproduc t ion ( D U F O U R , 1986) , qu i e n font une e s p è c e "modè le " ; de m ê m e , la tota le dépendance de la maturat ion sexuel le vis-à-vis des facteurs env i ronnemen taux offre un intérêt particulier écophys io log ique. Enf in, les hypothèses sur la m i s e e n p lace, a u cou rs de l 'évolut ion, de ce cyc le migra to i re excep t ionne l appor tent un intérêt évolut i f cons idérab le (voir art ic les de S. D U F O U R et de Y.A. FONTAINE, ce numéro) .

1.3. B u t s a p p l i q u é s

D u po in t d e v u e a p p l i q u é , l ' é tude d e s r é g u l a t i o n s h o r m o n a l e s c h e z l ' angu i l l e p r é s e n t e p lus ieurs intérêts ma jeu rs :

— la par t ic ipat ion, à cô té des descr ip t ions ana tomiques , à la caractér isat ion des an imaux et des d i f férentes é tapes du cyc le bio logique. Il s 'agit , par exemp le , de l 'étude que nous e n t r e p r e n o n s ac tue l l emen t a v e c le C S P pour caractér iser les s tades j aune et a rgen té a ins i q u e les é t a p e s de l 'a rgenture qu i m è n e n t de l 'un à l 'autre (voir ar t ic le de Y.A. F O N T A I N E , c e n u m é r o ) . L e s v a r i a t i o n s h o r m o n a l e s i m p l i q u é e s d a n s c e t t e m é t a m o r p h o s e p e u v e n t rep résen te r , p o u r le g e s t i o n n a i r e , la b a s e de l ' é l abo ra t i on d 'out i ls de carac té r i sa t ion des populat ions des eaux cont inenta les (proport ion du s tock prêt à migrer, é ta t phys io log ique des an imaux sédenta i res et migrants. . . ) . Une é tude de c e t y p e dev ra i t ê t re e n t r e p r i s e é g a l e m e n t d a n s le fu tu r p o u r la ca rac té r i sa t i on d e s angu i l l es du point de v u e du sexe génét ique et phéno typ ique .

— la par t ic ipat ion à la conna i ssance des impac ts des modi f ica t ions de l 'env i ronnement (par e x e m p l e , l 'e f fet d e p o l l u t i o n s o u de pa ras i t es ) s u r l 'état san i t a i r e d e s a n i m a u x , e n appor tan t le po in t de v u e patho-phys io log ique.

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Milieu extracellulaire

Figure 1 : Présenta t ion s c h é m a t i q u e d e d ivers m é c a n i s m e s d 'ac t ion h o r m o n a u x . C h a q u e h o r m o n e (H) agit sur s o n (ses) o r g a n e ( s ) c ib le(s) e n s e f i xant de f a ç o n s p é c i f i q u e et révers ib le sur u n e pro té ine par t icu l iè re , le récepteur ( R ) . Q u e l q u e s r é c e p t e u r s (a : R 1 ) , p a r e x e m p l e c e u x d e s h o r m o n e s s téro ïdes , sont in t racel lu la i res et c a p a b l e s d e se déplacer , u n e fois l iés à l ' h o r m o n e , v e r s l e ( s ) s i t e ( s ) p r é c i s d e l ' a c t i o n h o r m o n a l e . D ' a u t r e s r é c e p t e u r s ( b : R 2 ) , p a r e x e m p l e c e u x d e s h o r m o n e s g o n a d o t r o p e et thyréot rope , s o n t d a n s la m e m b r a n e cel lu la i re ; la l ia ison d e l 'hormone sur leur e x t r é m i t é e x t r a c e l l u l a i r e e n t r a î n e l 'act ivat ion d ' e n z y m e s (Enz) e t la p roduct ion d e s e c o n d s m e s s a g e r s relayant l ' in format ion h o r m o n a l e .

F igure 1 : S c h e m a t i c p resen ta t ion of var ious h o r m o n a l m e c h a n i s m s of ac t ion . Each h o r m o n e (H) ac ts o n its target o rgane(s ) t h r o u g h speci f ic b ind ing to a spec ia l p ro te in , t h e receptor (R) . S o m e recep to rs (a : R1 ) , e . g . t h o s e of s teroid h o r m o n e s , a re intracel lular a n d , w h e n b o u n d to t h e h o r m o n e , able to m o v e t o w a r d s t h e p r e c i s e s i te (s ) of h o r m o n e a c t i o n . O t h e r receptors (b: R 2 ) , e . g . t h o s e of g o n a d o t r o p i n a n d t h y r o t r o p i n , a r e w i t h i n t h e cell m e m b r a n e ; b i n d i n g of t h e h o r m o n e to the i r ex t race l lu la r e n d i n g l e a d s to t h e a c t i v a t i o n of e n z y m e s ( E n z ) a n d p r o d u c t i o n of s e c o n d m e s s e n g e r s w h i c h relay h o r m o n a l i n f o r m a t i o n .

Membrane cellulaire

*

Substrat

pr odui t • 2 n d m e s s a g e r

Substrat

H 2

R 2 I

RI

Milieu intracellulaire E f f e t s ^

t p h y s i o l o g i q u e s ^

Noyau

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— l ' o u v e r t u r e v e r s u n e m a î t r i s e d ' é t a p e s - c l e f s d u c y c l e v i t a l p a r la m a n i p u l a t i o n e x p é r i m e n t a l e des régu la t ions hormonales : il peut s 'agir de la m é t a m o r p h o s e larvaire ( l ep tocépha le en c ive l le) , de la d i f férenciat ion sexuel le , de la c ro issance , de la seconde m é t a m o r p h o s e (a rgen tu re ) , de la maturat ion sexuel le et de la reproduc t ion .

2 . M é t h o d e s d e l ' a p p r o c h e e n d o c r i n i e n n e

2 . 1 . L e s m é t h o d e s c l a s s i q u e s d e l ' e n d o c r i n o l o g i e

Les m é t h o d e s qui ont pe rm is la mise e n év idence des régu la t ions ho rmona les chez d e n o m b r e u s e s espèces cons is ten t c lass iquement à rechercher l 'effet, sur les t issus c ib les, d e l 'ab la t ion de g landes endoc r i nes o u , inversement , de l 'administ rat ion d'extrai ts de ces g l a n d e s . La pur i f icat ion, à part i r de ces extraits g landula i res, des pr inc ipes act i fs sur les t i s sus c ib les pe rmet ensu i te la caractér isat ion des molécu les ho rmona les .

L a m i s e au po in t de d o s a g e s spéc i f iques of f re la poss ib i l i té de m e s u r e r les t aux h o r m o n a u x avec leurs va r ia t ions naturel les ou expé r imen ta les . Pendan t l ong temps , ces d o s a g e s ont é té basés sur la réponse du tissu cible à l'action hormona le (dosages biologiques in vivo sur l 'animal, puis in vitro sur le tissu cible isolé) ; plus récemment , se sont largement déve loppés les dosages immunolog iques (radioimmunologiques puis immunoenzymat iques) , b a s é s s u r la r e c o n n a i s s a n c e de l 'hormone par des an t i co rps spéc i f i ques . C e s d o s a g e s présentent l 'avantage d'être fac i lement mis en oeuvre et d'être très sensibles ; ils n'excluent pas cependan t l'intérêt propre des dosages biologiques, en particulier dans le cas d 'hormones p r o t é i q u e s d e g r a n d e ta i l le pou r lesque l les des mod i f i ca t i ons d e la con fo rma t i on de la m o l é c u l e p e u v e n t e n t r a î n e r d e s v a r i a t i o n s de s o n a c t i v i t é b i o l o g i q u e s a n s a f f e c t e r s igni f icat ivement sa reconnaissance ant igénique par l 'anticorps.

2 .2 . L e s m é t h o d e s récentes

E n p lus des m é t h o d e s p r é c é d e m m e n t c i tées , se son t r é c e m m e n t t rès l a rgemen t d é v e l o p p é e s des mé thodes d' invest igat ion à l 'échelle cel lulaire et molécula i re . L'action des h o r m o n e s est main tenant é tud iée au niveau de l 'unité fonct ionnel le du t issu cible : la cel lu le. C e s é tudes permet tent d 'ana lyser les étapes success ives de l 'act ion hormona le , depu is la l i a i son au r é c e p t e u r j u s q u ' à la réponse f i na le (F igure 1). Les t e c h n i q u e s de g é n é t i q u e mo lécu la i re ont par t icu l iè rement élargi les possibi l i tés d ' invest igat ions, aussi bien d 'un point d e v u e f o n d a m e n t a l ( é t u d e d e s r é g u l a t i o n s a u n i v e a u g é n o m i q u e ) q u ' a p p l i q u é (caractér isat ion et p roduct ion des molécules hormonales ; t rans format ions géniques) .

2.3. L ' intégrat ion d e s d i f férents n i v e a u x d 'é tude

Le d é v e l o p p e m e n t c o n s i d é r a b l e a c t u e l d e s m o y e n s d ' i n v e s t i g a t i o n ce l l u la i re et mo lécu la i re ne doit pas laisser de côté les approches plus tradi t ionnel les, qui conservent tout leur intérêt propre pour la compréhens ion des régulat ions au se in de l 'organisme ainsi que pour l 'étude du rôle des facteurs env i ronnementaux. Ains i , la conna issance des régulat ions h o r m o n a l e s c h e z u n e e s p è c e c o m m e l ' a n g u i l l e do i t i n t é g r e r l es d i f f é r e n t s n i v e a u x d ' invest igat ion, depu is l 'étude moléculaire j usqu 'à l 'étude des an imaux sur le terrain.

3. P r o b l è m e s m é t h o d o l o g i q u e s p r o p r e s à l 'étude d e l ' a n g u i l l e

3 . 1 . U n e e s p è c e o r i g i n a l e : d e s m é t h o d e s à d é v e l o p p e r

L'étude endoc r i n i enne d 'une espèce part icul ière, c o m m e l 'angui l le, ne permet pas de d i s p o s e r d e t o u t e la p a n o p l i e d e m é t h o d e s et d ' ou t i l s d i s p o n i b l e s p o u r u n e e s p è c e b e a u c o u p plus c o u r a m m e n t é tud iée c o m m e par exemp le le rat ! Une tel le é tude nécess i te d o n c la mise au po in t des mé thodes d ' invest igat ion. Pour les é tudes in vivo, il s 'agit par e x e m p l e d ' o p é r a t i o n s c h i r u r g i c a l e s , d e t e c h n i q u e s d e p r é l è v e m e n t s s a n g u i n s o u d 'admin is t ra t ion d ' h o r m o n e s . Pour les é tudes in vitro, il faut déf in i r les mi l ieux d ' incubat ion d e s t i ssus cibles et établ i r les techn iques de prépara t ion et cu l tu re des cel lu les. Enf in , il f au t déve loppe r les out i ls molécu la i res : pur i f icat ion, carac té r i sa t ion , c lonage d 'ho rmones et d e leurs récepteurs , m ise au point des dosages .

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C e r t a i n e s h o r m o n e s ne p o s e n t c e p e n d a n t p a s d e p r o b l è m e ca r leur s t r u c t u r e , re lat ivement s imp le , est to ta lement conservée chez l 'ensemble des ver tébrés, ce qui rend possib le l 'uti l isation des sys tèmes de dosage dé jà commerc ia l i sés : il s'agit par exemple d e s hormones s téro ïdes ( c o m m e l'estradiol ou la tes tos terone) ou des ho rmones thyroïd iennes.

En revanche , la major i té des h o r m o n e s , de na tu re p ro té ique (c 'est -à-d i re const i tuées d 'un e n c h a î n e m e n t , c o d é g é n é t i q u e m e n t , d ' ac ides a m i n é s ) , p résen ten t d e s d i f fé rences i n te rspéc i f i ques d u e s à l 'évo lu t ion g é n i q u e ; c e s va r i a t i ons son t s o u v e n t su f f i sammen t i m p o r t a n t e s p o u r n é c e s s i t e r la c a r a c t é r i s a t i o n d e s h o r m o n e s et la m i s e au po in t d e s dosages pour c h a q u e e s p è c e é tud iée .

3.2. U n e e s p è c e s a u v a g e : d e s di f f icul tés s u p p l é m e n t a i r e s

L'angui l le , e n tan t q u ' e s p è c e s a u v a g e , p résen te d e u x di f f icul tés par t i cu l iè res pour son é tude :

— tant que la reproduc t ion et l 'ensemble du cyc le b io log ique de l 'angui l le n 'auront pas é té maî t r isés, t ou tes les expér imen ta t ions devron t ê t re réa l isées sur des indiv idus pré levés dans les popu la t ions nature l les ; ce p ré lèvemen t do i t donc êt re restreint pour ne pas r e p r é s e n t e r l u i - m ê m e un r i sque s u p p l é m e n t a i r e p o u r ce t te e s p è c e d é j à m e n a c é e ( B R U S L E , 1 9 9 0 ) . C e t t e res t r i c t ion rend i m p o s s i b l e , pa r e x e m p l e , la pur i f i ca t ion d e c e r t a i n e s h o r m o n e s qu i son t en c o n c e n t r a t i o n e x t r ê m e m e n t fa ib le (c 'es t le cas d e l 'hormone g o n a d o t r o p e hypophysa i re et de cer ta ines n e u r o h o r m o n e s cérébra les) .

— les expér imen ta t ions son t réa l isées sur des ind iv idus s a u v a g e s et non sur des an imaux p r o v e n a n t d ' é l e v a g e s b ien ca rac té r i sés g é n é t i q u e m e n t et p h y s i o l o g i q u e m e n t c o m m e ce la est le cas chez le rat o u , à un cer ta in deg ré , chez des po i ssons c o m m e la truite, le po isson- rouge , e t c . . Les angui l les p ré levées d a n s les popu la t ions nature l les présentent d o n c d e s d i f f é r e n c e s p h y s i o l o g i q u e s ( t e l l e s q u e l ' â g e , l es e f f e t s d e s c o n d i t i o n s env i ronnemen ta les antér ieures) et géné t iques qui en t ra înen t d e s var ia t ions indiv iduel les impor tan tes d a n s leur é tat et dans leurs réponses aux t ra i tements expé r imen taux : ces v a r i a t i o n s r e p r é s e n t e n t u n e d i f f i cu l té p o u r la r e p r o d u c t i b i l i t é et l ' i n t e rp ré ta t i on des résu l ta t s , d ' a u t a n t p l us q u e le n o m b r e d ' a n i m a u x e x p é r i m e n t a u x doi t ê t re rest re in t c o m m e nous v e n o n s de le ment ionner .

3.3. L e s i n c o n n u e s d u c y c l e : a b s e n c e d e m o d è l e n a t u r e l

L 'absence enco re au jourd 'hu i de cap tu res d 'angui l les lors de la migra t ion océan ique et sur le s i te de p o n t e fai t q u e le de rn ie r s t ade na tu re l a c c e s s i b l e à l ' observa t ion et à l 'expér imenta t ion es t le s t ade a rgen té , enco re sexue l l emen t i m m a t u r e (voir art ic le de S. D U F O U R , ce numéro ) . Nous ne d i sposons donc d ' aucun m o d è l e nature l pour dé terminer les moda l i tés des régu la t ions ho rmona les de la reproduc t ion de l 'angui l le (nature e t taux d e s h o r m o n e s i m p l i q u é e s , c h r o n o l o g i e de leur p r o d u c t i o n , e t c . . ) ni pour c o m p a r e r les résul tats de nos t r a i t emen ts expé r imen taux avec l 'état d e s a n i m a u x dans les cond i t ions nature l les. N o u s d e v o n s d o n c agir e n aveug le , sans m o d è l e b io log ique de ré férence.

De la m ê m e façon, la méconna issance des condi t ions de la migrat ion océanique et du s i te de pon te n o u s m a i n t i e n t d a n s le d o m a i n e d e s h y p o t h è s e s p o u r t o u t e s les é tudes concernant les moda l i tés d e cont rô le , par les fac teurs env i r onnemen taux , des régulat ions hormonales de la reproduct ion. Ceci est d 'autant plus crucial que la maturat ion sexuel le de l'anguille, au delà du stade argenté , est jus tement un p h é n o m è n e ent ièrement dépendan t des facteurs env i ronnementaux (voir article de S. D U F O U R , ce numéro) . Là encore, nous devons donc pour le momen t expér imenter en aveugle, sans modè le env i ronnementa l de référence.

B. M I S E A U P O I N T D E S O U T I L S M O L É C U L A I R E S

1 . P u r i f i c a t i o n s h o r m o n a l e s

1 .1 . T e c h n i q u e s d e p u r i f i c a t i o n d e s h o r m o n e s p ro té iques

La pu r i f i ca t i on d ' u n e h o r m o n e peu t ê t re e f f ec tuée à par t i r de p r é l è v e m e n t s des g landes qui la p rodu isen t . La pur i f icat ion cons is te en la sépa ra t i on de l 'hormone des autres

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c o n s t i t u a n t s d e la g l ande , c e qu i es t réal isé pa r des mé thodes b a s é e s sur les d i f férences d e p r o p r i é t é s p h y s i c o - c h i m i q u e s d e s m o l é c u l e s : pa r e x e m p l e , s é p a r a t i o n s e l o n leur so lub i l i té (par préc ip i ta t ion sé lec t ive) , se lon leur tai l le (par f i l t rat ion sur tamis molécu la i re) , s e l o n leur c h a r g e é lec t r ique (par é lec t rophorèse) , e t c . .

U n e p u r i f i c a t i o n n é c e s s i t e e n g é n é r a l la c o m b i n a i s o n d e p l u s i e u r s t y p e s d e s é p a r a t i o n s , pouvan t avoi r d e s rendemen ts al lant de près de 1 0 0 % à mo ins de 1 0 % . A ins i , p l u s la pur i f icat ion nécess i te d 'é tapes , plus fa ib le sera la quant i té de produi t o b t e n u . Il est d o n c n é c e s s a i r e de d i s p o s e r au dépar t d'un s tock d 'o rganes impor tan t , ce qui p o s e un p r o b l è m e , lo rsqu 'on t ravai l le sur une espèce sauvage c o m m e l 'angui l le pour laquel le les p r é l è v e m e n t s sur les popu la t ions naturel les do ivent être restreints.

1.2. T e c h n i q u e s d e caractér isat ion d e s h o r m o n e s pur i f iées

A f i n d e s 'assu re r q u e l ' h o r m o n e pur i f iée n'est p lus c o n t a m i n é e pa r a u c u n au t re c o m p o s a n t et qu'e l le a c o n s e r v é son activité b io log ique au cours des di f férents t ra i tements d e s é p a r a t i o n , des carac tér isa t ions s 'avèrent ind ispensab les . Une part ie du produi t puri f ié do i t ê t re ut i l isé à cet effet. Le cont rô le de pureté peut être ef fectué par la v isua l isa t ion d 'une b a n d e u n i q u e en é lec t rophorèse et ne nécessi te que que lques m i c r o g r a m m e s de produi ts . L 'act iv i té b io log ique est é tud iée par des tests in vivo o u , pré férent ie l lement , in vitro pour ut i l iser une mo ind re quant i té d ' h o r m o n e .

En f in , les t echn iques récen tes de mic roséquençage, qui nécess i ten t une centa ine de m i c r o g r a m m e s , permet ten t de dé te rminer la séquence en ac ides a m i n é s des ex t rémi tés de la p ro té ine o u de f r agmen ts de cel le-c i après d igest ion enzyma t i que : cet te mé thode offre la p o s s i b i l i t é à la fo is de s ' a s s u r e r de la pure té de l ' ho rmone , de vér i f ie r s a na tu re (par c o m p a r a i s o n avec les s t ruc tures connues des m ê m e s h o r m o n e s chez d 'aut res espèces de p o i s s o n s ou de m a m m i f è r e s ) et de dé terminer des s é q u e n c e s par t ie l les qui seront à la b a s e de la fabr ica t ion de s o n d e s pour les techn iques de b io logie molécu la i re .

1.3. E x e m p l e s d e p u r i f i c a t i o n d ' h o r m o n e s h y p o p h y s a i r e s d ' a n g u i l l e

L 'hypophyse est une g l a n d e endocr ine d ' impor tance ma jeu re , s i tuée à la base du c e r v e a u , et p r o d u i s a n t p l u s i e u r s t y p e s d ' h o r m o n e s i m p l i q u é e s d a n s la régu la t i on d e s g r a n d e s fonc t ions de l 'o rgan isme te l les que c ro issance, m é t a m o r p h o s e , reproduct ion .

C h e z l 'angui l le , n o u s a v o n s r écemmen t réal isé la pur i f i ca t ion de deux h o r m o n e s h y p o p h y s a i r e s :

— l ' ho rmone de c ro i ssance ( G H ) , protéine impl iquée dans le cont rô le de la c ro issance et qu i j o u e auss i un rô le , c h e z les po issons , dans le con t rô le de la rep roduc t ion et de l ' osmorégu la t ion ;

— l ' ho rmone thy réo t rope ( T S H ) , g lycoproté ine c o m p o s é e de deux sous-un i tés a et p\ qui s t i m u l e l 'act iv i té d ' une au t re g l a n d e endoc r i ne , la t hy ro ïde , et qui es t imp l i quée , par l ' in termédia i re des h o r m o n e s thyro ïd iennes, dans le cont rô le du déve loppemen t , de la c r o i s s a n c e , d u m é t a b o l i s m e et de la m é t a m o r p h o s e . N o u s au r i ons souha i té pouvo i r é g a l e m e n t puri f ier l ' ho rmone gonadot rope (GTH) , une aut re g lycopro té ine de st ructure s imi la i re à cel le de la T S H , et qui joue u n rôle essent ie l dans la régulat ion de la fonct ion d e reproduc t ion en cont rô lan t l'activité des gonades ; ma is sa teneur hypophysa i re est b e a u c o u p t rop fa ib le, du fait de l'état immature des angui l les (voir art ic le de S. D U F O U R , ce numéro ) , pour pouvoi r en réal iser la pur i f icat ion.

A part i r d 'un mil l ier d 'hypophyses d 'angui l les (p réc ieusemen t co l lec tées depu is de n o m b r e u s e s années à l 'occas ion d 'expér imentat ions au laborato i re ou lors de c a m p a g n e s d e p r é l è v e m e n t s sur d e s s i t es d 'exp lo i t a t i on d e l ' angu i l l e ) , n o u s a v o n s pu réa l i se r la p u r i f i c a t i o n de la T S H et d e la G H , ap rès t ro i s é t a p e s de s é p a r a t i o n ( se lon le po ids mo lécu la i r e , la cha rge é lec t r ique et la solubil i té) ( M A R C H E L I D O N ef al., 1991) . Que lques m i l l i g r a m m e s de G H et q u e l q u e s centa ines de m i c r o g r a m m e s de T S H pur i f iées on t été o b t e n u s ! Une carac té r isa t ion part ie l le de la séquence en ac ides am inés de la G H et des s o u s - u n i t é s a et p d e la T S H a é té r é a l i s é e pa r la t e c h n i q u e d e m i c r o s é q u e n ç a g e ( M A R C H E L I D O N et al., 1991) . Il s'agit d e la p remière T S H pur i f iée chez un po isson ; la

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s i tua t ion p h y s i o l o g i q u e par t i cu l iè re de l 'angu i l le , si e l le r e p r é s e n t e un obs tac le pour la pur i f icat ion d e la G T H (du fait de sa très fa ib le teneur hypophysa i re ) , a en revanche facil ité la pur i f icat ion de la T S H en évi tant les con tam ina t i ons en G T H (ho rmone s t ruc tura lement t rès p roche) .

2. O b t e n t i o n d ' a n t i c o r p s et a p p l i c a t i o n s

L'obent ion d ' h o r m o n e pure pe rmet de produ i re d e s an t i co rps d i r igés spéc i f iquement cont re el le et de déve loppe r des d o s a g e s i m m u n o l o g i q u e s pour l 'étude des modi f icat ions d e s taux de ce t te h o r m o n e , au cou rs d 'é tapes impor tan tes de la v ie de l 'animal o u sous l'effet d e t ra i tements expé r imen taux . Les an t icorps , ut i l isés en h is to logie, pe rmet ten t aussi la v isua l isa t ion des ce l lu les p rodu isan t l ' ho rmone : c 'est l ' immunoh is toch imie .

2 . 1 . V a l i d a t i o n d e d o s a g e s déjà e n o e u v r e

C e r t a i n e s h o r m o n e s , c o m m e l e s h o r m o n e s t h y r o ï d i e n n e s o u l e s s t é r o ï d e s gonad iques , peuven t avoi r une s t ructure ch im ique ident ique depu is les po issons jusqu 'aux M a m m i f è r e s . D a n s c e c a s , une s i m p l e v a l i d a t i o n , c h e z le p o i s s o n , des t e c h n i q u e s de d o s a g e dé jà m ises en oeuv re chez les M a m m i f è r e s est nécessa i re . De p lus, ces ho rmones et les an t icorps co r respondan ts sont c o m m e r c i a l e m e n t d ispon ib les . C h e z l 'angui l le, nous met tons ainsi c o u r a m m e n t en oeuv re au laborato i re d e s d o s a g e s rad io immuno log iques des h o r m o n e s thy ro ïd iennes (T3 et T4) ( L E L O U P et D E L U Z E , 1980) e t d e s s té ro ïdes sexue ls (estradio l et t es tos te rone) ( L E L O U P - H A T E Y et al., 1985) .

P a r m i l es h o r m o n e s d e n a t u r e p e p t i d i q u e , la s t r u c t u r e de c e r t a i n e s p e u t êt re é g a l e m e n t c o n s e r v é e et p e r m e t t r e l 'u t i l i sa t ion d ' a n t i c o r p s d é j à p rodu i t s p o u r d ' a u t r e s espèces : c 'est le cas par exemp le des n e u r o h o r m o n e s cé rébra les de type gonado l ibér ine ( G n R H ) qui son t c h e z l 'angui l le iden t iques pour l 'une à la G n R H m a m m a l i e n n e e t pour l 'autre à l 'une des G n R H av ia i res. La pur i f icat ion de c e s deux n e u r o h o r m o n e s , m a l g r é leur t rès fa ib le concen t ra t ion cérébra le , avai t pu ê t re réa l isée chez des m a m m i f è r e s et o iseaux d 'abat to i r g râce aux quant i tés non l imi tées de c e r v e a u x d ispon ib les pour ces e s p è c e s . Par la su i te , la ca rac té r i sa t ion des s é q u e n c e s de ces h o r m o n e s et leur s impl ic i té (10 ac ides aminés ) a pe rmis leur syn thèse ch im ique à g rande éche l le et la p roduc t ion d 'an t i co rps ; ce sont de te ls an t i co rps qui nous sont fourn is par d i f férentes équ ipes de recherche (J . KING et R. M I L L A R , Répub l i que d 'A f r ique du S u d ; R. P E T E R , C a n a d a ; G . T R A M U , France ; F. V A N D E S A N D E , Be lg ique) et que nous pouvons ut i l iser chez l 'angui l le ( D U F O U R et al., 1993 ; M O N T E R O et al., s o u s presse) .

D 'au t res h o r m o n e s p ro té iques p résen ten t des va r ia t i ons in te rspéc i f iques m a i s qui peuven t êt re d a n s cer ta ins cas su f f i samment l imi tées pour pe rmet t re l 'ut i l isation d 'ant icorps et de d o s a g e s d é v e l o p p é s pou r une au t re e s p è c e . O n ut i l ise a lo rs le t e r m e de d o s a g e h é t é r o l o g u e . U n e va l i da t i on r i gou reuse de l ' emplo i de ce d o s a g e h é t é r o l o g u e do i t être réal isée : il s 'agi t e n par t icu l ier d 'une é tude de la spéc i f ic i té du d o s a g e v is-à-v is des aut res h o r m o n e s de l 'espèce hé té ro logue et d 'une c o m p a r a i s o n , pou r cet te espèce , des résul tats d e s d o s a g e s i m m u n o l o g i q u e et b i o l o g i q u e . C h e z l ' angu i l l e , n o u s u t i l i sons a i ns i pour l 'hormone g o n a d o t r o p e ( G T H ) un d o s a g e hé té ro logue ( D U F O U R et al., 1983) déve loppé par B U R Z A W A - G E R A R D et K E R D E L H U E (1978) pou r la G T H de carpe : la for te teneur hypophysa i re en G T H chez la ca rpe avai t e n effet p e r m i s à E. B U R Z A W A - G E R A R D (1971) d 'en réal iser la pur i f icat ion pou r la p remière fo is chez un po i sson .

2.2 . O b t e n t i o n d ' a n t i c o r p s

Pour la ma jo r i t é d e s h o r m o n e s p ro té i ques , s e u l e s d e s p répa ra t i ons de ce r ta ines espèces m a m m a l i e n n e s son t commerc i a l emen t d i spon ib les et les an t i co rps con t re cel les-ci ne réagissent pas avec les h o r m o n e s de po issons . Un an t i co rps d i r igé cont re la G H bov ine, p a r e x e m p l e , n e r e c o n n a î t r a p a s la G H d ' a n g u i l l e . C e c i e s t d û à d e s d i f f é r e n c e s i m p o r t a n t e s d a n s la s é q u e n c e p r o t é i q u e . L e s d i f f é r e n c e s p e u v e n t m ê m e ê t re t e l l es qu 'aucune réact ion c ro isée n'est obse rvée en t re d e u x e s p è c e s de po issons : c 'est l e cas pour la G H ent re les Sa lmon idés et l 'angui l le. L 'unique so lu t ion est de p réparer l 'ant icorps à part i r de l 'hormone pur i f iée et carac tér isée .

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N o u s a v o n s a ins i p r é p a r é r é c e m m e n t , en co l l abo ra t i on avec J . L. H O U D E B I N E ( I N R A ) , d e s a n t i c o r p s c o n t r e la G H d 'angu i l l e . P o u r c e l a , 2 0 0 à 3 0 0 m i c r o g r a m m e s d ' h o r m o n e pure son t nécessa i res et ont été in jectés à des lapins par vo ie sous -cu tanée , a p r è s c o u p l a g e d e la G H a v e c u n e g r o s s e p r o t é i n e , l ' o v a l b u m i n e , a f in d ' a u g m e n t e r l ' a n t i g é n i c i t é , et e n p r é s e n c e d ' a d j u v a n t de F r e u n d , a f i n d ' a u g m e n t e r la r é p o n s e i m m u n i t a i r e .

2 . 3 . M i s e a u p o i n t d e d o s a g e s r a d i o i m m u n o l o g i q u e s

L e s d o s a g e s i m m u n o l o g i q u e s reposent su r la réact ion de l ia ison spéc i f i que ent re a n t i g è n e e t an t icorps .

L e s d o s a g e s rad io immuno log iques (RIA = Radio I m m u n o Assay) met ten t en oeuv re d e s réac t i ons de compé t i t i on en t re l 'ant igène présent dans les échant i l lons à doser (par e x e m p l e : extrai ts de g landes endocr ines , s é r u m ) et l 'ant igène puri f ié et ma rqué avec un a t o m e radioact i f ( le t raceur ) , v is -à-v is de la l ia ison avec un ant icorps spéc i f ique . La réact ion se fai t e n t ube , la f ract ion de t raceur liée à l 'ant icorps est sépa rée de la f ract ion l ibre par i m m u n o p r é c i p i t a t i o n (u t i l i sa t i on d ' u n d e u x i è m e a n t i c o r p s d i r i gé c o n t r e le p r e m i e r ) , e t m e s u r é e a u m o y e n d ' u n c o m p t e u r à r a d i o a c t i v i t é . P l u s la q u a n t i t é d ' a n t i g è n e d e l ' échant i l l on est i m p o r t a n t e , p lus la fract ion de t raceur l iée es t fa ib le. Les m e s u r e s son t r a p p o r t é e s à une c o u r b e s t a n d a r d , r ep résen tan t l ' inh ib i t ion de la l i a i son du t r a c e u r à l 'an t icorps par des d o s e s c ro i ssan tes d'une p répara t ion de ré férence de l 'ant igène.

A u labora to i re , nous me t tons en oeuvre c o u r a m m e n t pour l 'angui l le des RIA pour l esque ls t raceurs et an t i co rps sont d isponib les commerc ia l emen t : RIA de l 'estradiol , de la t e s t o s t e r o n e , des h o r m o n e s thyro ïd iennes T 3 et T 4 .

N o u s avons auss i d é v e l o p p é des RIA d 'ho rmones pept id iques . Il faut dans ce cas me t t re a u po in t et réal iser la t echn ique de m a r q u a g e du t raceur : c o m m e l 'ant igène est de na tu re pep t id ique , on peut ut i l iser le marquage à l 'Iode 125, don t l 'atome est subst i tué à un a t o m e d ' h y d r o g è n e d 'un rés idu a m i n o - a c i d e t y ros ine . Les cond i t i ons de la réac t ion de subs t i t u t i on (cata lyse ch im ique ou enzymat ique) et de la sépara t ion du t raceur de l 'excès d ' I o d e 1 2 5 l ibre d o i v e n t ê t re m i s e s au po in t p o u r c h a q u e a n t i g è n e . C e t t e réac t i on de m a r q u a g e , qu i met e n jeu des quant i tés é levées de radioact iv i té, nécess i te l 'ut i l isation de l o c a u x e t d ' é q u i p e m e n t s s p é c i a l i s é s . La d e u x i è m e é tape d e la m i s e au po in t du RIA cons i s te à la carac tér isa t ion des ant icorps (aff ini té et spéci f ic i té de la l ia ison d e l 'ant igène). Pou r le d o s a g e des h o r m o n e s d 'angui l le , n o u s a v o n s ainsi m is au point au laborato i re les R IA d e s d e u x g o n a d o l i b é r i n e s cé rébra les ( type m a m m a l i e n : m G n R H et t ype av ia i re : c G n R H - l l ) ( D U F O U R et al., 1 9 9 3 ) , de la g o n a d o t r o p i n e h y p o p h y s a i r e ( G T H ) (dans un s y s t è m e h é t é r o l o g u e d e c a r p e ; D U F O U R et al., 1983) et r é c e m m e n t d e l ' ho rmone d e c r o i s s a n c e hypophysa i re (GH) ( M A R C H E L I D O N etal., 1994) .

Les RIA sont t rès spéci f iques, précis e t reproductibles, et offrent la possibi l i té de traiter un g rand nombre d'échant i l lons (plusieurs centa ines par dosage) . Ils présentent l ' inconvénient d e l 'u t i l i sa t ion de la rad ioac t i v i té e t d ' équ ipemen ts lourds de labora to i re ( cen t r i f ugeuse , c o m p t e u r s de radioactivité). Q u a n d les propriétés de l 'antigène et de l 'anticorps le permettent, on essa ie donc de subst i tuer aux RIA des dosages immunoenzymat iques, de mise en oeuvre p lus a i sée et éventue l lement appl icables sur le terrain.

2 . 4 . M i s e a u p o i n t d e d o s a g e s i m m u n o e n z y m a t i q u e s

L e tes t " E L I S A " ( E n z y m e L inked I m m u n o s o r b e n t A s s a y ) es t un m o y e n rap ide e t p réc is d e dosage d 'ant icorps ou d 'ant igènes. Une des méthodes emp loyées est la suivante : une quan t i té déf inie d 'an t igène est f ixée par adsorpt ion sur les paro is des puits d 'une p laque d e t i t r a t i on . L 'an t icorps spéc i f i que , dit de p r e m i è r e c o u c h e , p r é a l a b l e m e n t incubé a v e c l ' échan t i l l on ( con tenan t l ' an t igène à doser ) , est a jou té d a n s les pu i ts . P lus l 'échant i l lon con t ien t d 'ant igène, p lus la quant i té d'ant icorps l ibre et donc capab le de se lier à l 'ant igène f ixé a u x pui ts sera fa ib le . L 'excès d 'ant icorps non lié est é l iminé par lavage des pui ts. Un an t i co rps dit de d e u x i è m e couche , dir igé cont re l 'anticorps de première couche et coup lé à un e n z y m e (peroxydase , phospha tase alcal ine), est alors a jouté et sa p résence est détectée

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par addi t ion d 'un ch romogène (substrat incolore t rans formé par l 'enzyme en produit coloré). La quant i té d 'ant icorps f ixés est a lors dé te rminée par mesure de la dens i té opt ique.

C e d o s a g e t e n d à r e m p l a c e r le d o s a g e r a d i o i m m u n o l o g i q u e en r a i s o n de s a s i m p l i c i t é d e m i s e e n o e u v r e , d e l ' a b s e n c e d ' u t i l i s a t i o n d e r a d i o é l é m e n t e t de s a d ispon ib i l i té p e r m a n e n t e , ce que ne p e r m e t pas le R IA p u i s q u e la rad io lyse i m p o s e une p r é p a r a t i o n f r é q u e n t e d e l ' h o r m o n e m a r q u é e ( t o u s l e s q u i n z e j o u r s p o u r c e r t a i n s a n t i g è n e s pep t i d i ques ) .

C e r t a i n e s v a r i a n t e s du t e s t E L I S A p e r m e t t e n t d e g r e f f e r d e f a ç o n c o v a l e n t e l 'ant igène sur la paroi des pui ts au bout d 'un b ras de l ia ison, af in de respecter la s t ructure de la p ro té ine an t i gén ique et a ins i de la isser t o t a l e m e n t a c c e s s i b l e s aux an t i co rps ses dé te rm inan ts an t igén iques . Un sys tème d 'ampl i f i ca t ion du s igna l ( sys tème av id ine/b io t ine) pe rmet d ' augmen te r la sensibi l i té d u d o s a g e . Lo rsque l'on d i spose d 'ant icorps spéc i f iques d e s d e u x e x t r é m i t é s d e la p r o t é i n e , un d o s a g e d e t y p e " s a n d w i c h " peu t ê t re u t i l i sé , permet tan t d ' augmen te r g r a n d e m e n t sa spéci f ic i té .

Pour l 'angui l le, nous avons mis au po in t des d o s a g e s EL ISA pour les mo lécu les de type P T H ( h o r m o n e de t ype para thyro ïd ien , syn thé t i sée par les co rpuscu les de Stann ius et i m p l i q u é e d a n s la régu la t i on de la c a l c é m i e ) et d e t y p e P T H r p ( P T H re la ted pep t ide ) . L'uti l isation de d o s a g e s de type «sandwich» nous pe rme t de d is t inguer ces d i f férents types mo lécu la i res . Le d o s a g e de la v i te l logén ine d 'angu i l le es t éga lemen t réal isé par E L I S A (voir art ic le de E. B U R Z A W A - G E R A R D et al., ce n u m é r o ) .

2.5 . U t i l i s a t i o n d e s a n t i c o r p s e n i m m u n o h i s t o c h i m i e

L'uti l isation d 'ant icorps dir igés contre les mo lécu les hormona les permet la visual isat ion des cel lu les productr ices et la mise en év idence de var iat ions dans leur act ivi té. Le principe est s imi laire à celui décri t p lus haut pour les EL ISA : les coupes de t issus sont i ncubées avec le premier ant icorps, dir igé contre la molécu le hormona le et qui se f ixe donc spéci f iquement à l 'hormone con tenue dans les cel lu les. Cet ant icorps est ensui te révélé grâce à un deux ième ant icorps dir igé contre le premier et lu i -même coup lé à une enzyme ( comme par exemple la p e r o x y d a s e ) qu i ca ta l yse la t r ans fo rma t i on d 'un c h r o m o g è n e . Ce t te t e c h n i q u e p e u t être app l iquée à l 'échelle de la microscopie opt ique et é lect ron ique.

C h e z l 'anguil le, nous appl iquons cette techn ique à la v isual isat ion de nombreux types ce l lu la i res p r o d u i s a n t des h o r m o n e s o u d e s n e u r o h o r m o n e s : pa r e x e m p l e les ce l lu les hypophysa i res produisant l 'hormone gonado t rope (voir Point C § 2.2. et F igure 3 : pho to C), les n e u r o n e s con t rô l an t l 'act iv i té h y p o p h y s a i r e , te ls q u e les n e u r o n e s à gonado l i bé r i ne ( M O N T E R O et al., sous presse) et à G A B A ( M E D I N A et al., 1994) .

3. C l o n a g e e t a p p l i c a t i o n s

3 . 1 . P r i n c i p e

Les techn iques de b io logie molécu la i re in t rodu i tes à part i r de la f in des a n n é e s 1970 dans l 'é tude de l 'endocr ino log ie on t pe rm is de déb loque r un g rand n o m b r e de ver rous : d ' une par t , e l l es on t d o n n é a c c è s à la s t r uc tu re p r i m a i r e de p r o t é i n e s t rès f a i b l e m e n t r e p r é s e n t é e s e t d ' a u t r e pa r t , e l l e s o n t g r a n d e m e n t f a c i l i t é l ' é tude d e s m é c a n i s m e s cont rô lant la syn thèse des pro té ines .

R a p p e l o n s (F igure 2) que les pro té ines son t «codées» par des gènes (s i tués su r les c h r o m o s o m e s , d a n s le noyau de la cel lule) su ivant un m é c a n i s m e c o m p l e x e qui peu t être schémat i sé de la man iè re su ivante : le gène , mo lécu le d 'ac ide désoxy r ibonuc lé ique (ADN) , est tout d 'abord «transcr i t» dans le noyau en une mo lécu le d 'ac ide r ibonuc lé ique (ARN) , cop ie du g è n e . L 'ARN pr imai re subi t un p rocessus de matu ra t ion et l 'ARN message r qu i en résul te passe d a n s le cy top lasme de la cel lu le e t se f ixe sur les r i bosomes . C e s part icules von t « t radu i re» l 'ARN m e s s a g e r e n p ro té ine . En ef fet , pou r une par t ie de la mo lécu le , appe lée rég ion codan te , les r ibonuc leot ides cons t i tuan t l 'ARN m e s s a g e r sont o rgan i sés en t r ip le ts , les c o d o n s . C h a q u e c o d o n c o r r e s p o n d à un a c i d e a m i n é d o n n é (c 'es t le code g é n é t i q u e u n i v e r s e l ) . Les r i b o s o m e s « l i sen t» la s u c c e s s i o n d e s t r i p l e t s et a s s o c i e n t

Figure 2

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A D N

Transcription

R i b o s o m e s A

, P r o t é i n e

Aa1P

Aa2J c<a3J

k3 A c i d e s am inés I

A R N

Traduction

, A . G

• U

A R N I

C o d o n

G A

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1994) 3 3 5 : 147-169 — 157 —

F i g u r e 2 : L e s pro té ines s o n t c o d é e s p a r d e s g è n e s . L e g è n e e s t le matér ie l nuc léa i re q u i c o n t i e n t le c o d e d ' u n e pro té ine . Il es t f a i t d e d e u x b r i n s d ' a c i d e d é o x y r i b o n u c l é i q u e ( A D N ) e n r o u l é s e n d o u b l e hé l ice . C h a q u e b r i n d ' A D N e s t u n e cha îne or ientée d e q u a t r e c o n s t i t u a n t s d e b a s e , l es d é o x y n u c l é o t i d e s s y m b o l i s é s p a r A ,T ,G et C. L e s d e u x b r i n s s ' a p p a r i e n t p a r c o m p l é m e n t a r i t é : i l s u t i l i s e n t la capac i té d e A e t T, d ' u n e p a r t , e t d e G e t C, d ' a u t r e p a r t , d ' e n g a g e r d e s l i a i s o n s e n t r e b r i n s p o u r c o n s t r u i r e la d o u b l e hé l ice .

T r a n s c r i p t i o n : u n e m o l é c u l e i n t e r m é d i a i r e , l ' a c i d e r i b o n u c l é i q u e ( A R N ) m e s s a g e r , i n t e r v i e n t d a n s la s y n t h è s e d e s pro té ines . Sa s t r u c t u r e r a p p e l l e u n b r i n d ' A D N m a i s s e s c o n s t i t u a n t s , l es r i b o n u c l e o t i d e s , s o n t d i f férents e t n o t é s A , U, G e t C . I l s r e s p e c t e n t c e p e n d a n t la c o m p l é m e n t a r i t é , U r e m p l a ç a n t T. L ' A R N m e s s a g e r e s t p r o d u i t d a n s le n o y a u p a r u n e e n z y m e q u i c o p i e , p a r c o m p l é m e n t a r i t é , u n d e s b r i n s d u gène .

T r a d u c t i o n : T A R N m e s s a g e r p a s s e d a n s le c y t o p l a s m e o ù d e s s t r u c t u r e s c o m p l e x e s — les r i b o s o m e s — le t r a d u i s e n t e n proté ine . A c h a q u e t r i p l e t s u c c e s s i f d e r i b o n u c l e o t i d e s , o u c o d o n , c o r r e s p o n d u n a c i d e a m i n é et u n s e u l ; l e s r i b o s o m e s l i s e n t la s u c c e s s i o n d e s c o d o n s e t e n c h a î n e n t l e s a c i d e s a m i n é s c o r r e s p o n d a n t s , c e q u i c o n d u i t à la s y n t h è s e d e la proté ine.

F i g u r e 2 : P r o t e i n s a re e n c o d e d b y g e n e s . G e n e is t h e n u c l e a r m a t e r i a l w h i c h c o n t a i n s t h e c o d e f o r a p r o t e i n . It i s m a d e o f t w o s t r a n d s o f d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d ( D N A , A D N i n t h e f i g u r e ) e a c h o f t h e m c o i l e d a r o u n d t h e o t h e r in a d o u b l e h e l i x . E a c h D N A s t r a n d i s a c h a i n o f f o u r b a s i c c o m p o n e n t s — t h e d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s — s y m b o l i s e d A , T , G a n d C . B o t h s t r a n d s p a i r o n e t o t h e o t h e r b y c o m p l e m e n t a r i t y : t h e y u s e t h e a b i l i t y o f A a n d T, o n o n e h a n d , a n d of C a n d G , o n t h e o t h e r h a n d , t o f o r m b o n d s b e t w e e n s t r a n d s t o b u i l d t h e d o u b l e h e l i x .

T r a n s c r i p t i o n : a n i n t e r m e d i a r y m o l e c u l e , t h e m e s s e n g e r r i b o n u c l e i c a c i d ( R N A , A R N i n t h e f i g u r e ) , t a k e s p l a c e in p r o t e i n s y n t h e s i s . I ts s t r u c t u r e r e m i n d s a D N A s t r a n d b u t i t s c o m p o n e n t s — t h e r i b o n u c l e o t i d e s — are d i f f e r e n t a n d n o t e d A , U , G , a n d C. H o w e v e r t h e y r e s p e c t c o m p l e m e n t a r i t y , U s u b s t i t u t i n g f o r T. T h e m e s s e n g e r R N A is p r o d u c e d w i t h i n t h e n u c l e u s b y a n e n z y m e w h i c h c o p i e s o n e s t r a n d o f t h e g e n e b y c o m p l e m e n t a r i t y .

T r a n s l a t i o n : m e s s e n g e r R N A p r o c e e d s t o t h e c y t o p l a s m w h e r e c o m p l e x s t r u c t u r e s — t h e r i b o s o m e s — t r a n s l a t e it i n t o t h e p r o t e i n . To e a c h sér ie o f t h r e e n u c l e o t i d e s — a c o d o n — c o r r e s p o n d s o n e s i n g l e a m i n o a c i d ; r i b o s o m e s «read» t h e s u c c e s s i v e c o d o n s a n d l i n k u p t h e c o r r e s p o n d i n g a m i n o a c i d s t h u s b u i l d i n g t h e p r o t e i n .

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s u c c e s s i v e m e n t les ac ides a m i n é s co r respondan ts , cons t i tuants de base des pro té ines . La s é q u e n c e nuc léo t id ique d 'un A R N messager donné permet donc de dédu i re la s é q u e n c e en a c i d e s am inés de la p ro té ine pour laquel le il c o d e .

L e s t e c h n i q u e s d e b i o l o g i e m o l é c u l a i r e p e r m e t t e n t d e p u r i f i e r e t d ' a m p l i f i e r c o n s i d é r a b l e m e n t l a q u a n t i t é d ' u n A R N m e s s a g e r d o n n é : il s ' a g i t d u c l o n a g e . S c h é m a t i q u e m e n t , les A R N m e s s a g e r s son t ex t ra i ts du t issu qui syn thé t i se la p ro té ine d ' i n té rê t . C e s A R N son t « recop iés» sous f o r m e d ' A D N ( A D N c o m p l é m e n t a i r e s ) par un p r o c e s s u s inve rse d e ce lu i de la t ranscr ip t ion . Les A D N c o m p l é m e n t a i r e s p e u v e n t ê t re i n s é r é s d a n s des «vec teu rs de c l onage» (en généra l , d e s v i rus bac té r iens mod i f iés , les b a c t e r i o p h a g e s ) qu i , une fo is in tégrés dans u n e bactér ie , von t se mult ipl ier. L 'ensemble des p h a g e s con tenan t les A D N comp lémen ta i res cons t i tue ce que l'on appel le une « b a n q u e » , s p é c i f i q u e du t issu duque l on t é té extraits l es A R N message rs . Les p h a g e s ayan t inséré l ' A D N d ' i n t é r ê t ( l e s c l o n e s ) s o n t i d e n t i f i é s pa r « c r i b l a g e » , i s o l é s e t a m p l i f i é s ( v o i r A p p l i c a t i o n s ) . La s é q u e n c e de l 'ADN inséré peut a lors être fac i lement déc ryp tée . L 'ADN c o m p l é m e n t a i r e é tan t une cop ie à l ' ident ique de l 'ARN messager , la s é q u e n c e pept id ique p e u t ê t re dédu i te d e la s é q u e n c e nuc léot id ique en ut i l isant le c o d e génét ique un iverse l .

C o m m e n o u s l ' a v o n s d é j à s o u l i g n é p l u s h a u t d a n s le c a s d e s p u r i f i c a t i o n s h o r m o n a l e s , les p ré l èvemen ts sur les popu la t ions nature l les do ivent êt re rest re ints : d a n s le c a s d u c l onage , la t echn ique d 'ampl i f ica t ion enzyma t i que (Po lymerase Cha in Reac t ion : P C R ) p e r m e t d 'avo i r a c c è s à d e s s é q u e n c e s d ' A D N ou d ' A R N à par t i r de t rès peu de ma té r i e l . E n se basan t sur une s é q u e n c e pro té ique part ie l le de la proté ine à d o n e r ou sur la c o n n a i s s a n c e de rég ions de la séquence b ien conse rvées au cou rs de l 'évolut ion, on p e u t s y n t h é t i s e r d e s a m o r c e s nuc léo t i d iques , e n c a d r a n t la s é q u e n c e à d o n e r . La P C R c o n s i s t e à ut i l iser ces a m o r c e s , e n p résence d ' A D N ou d ' A R N de l 'échant i l lon et d ' une e n z y m e ( A D N po l ymerase , rés is tante à la t empéra tu re ) , pour copier, au cours de cyc les t h e r m i q u e s success i f s , la s é q u e n c e encad rée par les a m o r c e s . C h a q u e cyc le d o u b l e le n o m b r e d e cop ies : a u bou t de 3 0 cyc les, o n ampl i f ie en théor ie la s é q u e n c e d 'un fac teur 2 3 0 , so i t p rès d 'un mi l l iard de fo is . En fait, le rendemen t pra t ique est b e a u c o u p p lus fa ib le m a i s s u f f i s a n t p o u r d é t e r m i n e r la s é q u e n c e e t , s i n é c e s s a i r e , p r é p a r e r u n e s o n d e m o l é c u l a i r e qui pe rme t t ra de cr ib ler une b a n q u e (cf. p lus haut ) . Ce t te m é t h o d e d e P C R n o u s a p e r m i s de d o n e r et s e q u e n c e r la TSH(3 d 'angui l le ( S A L M O N et al., 1993) et es t a c t u e l l e m e n t ut i l isée pou r rechercher chez l 'angui l le les s é q u e n c e s des h o r m o n e s de type P T H et P T H r p a ins i que ce l le du récepteur ova r i en de la G T H .

3 .2 . A p p l i c a t i o n à la caractér isat ion d e la s é q u e n c e d e s h o r m o n e s p ro té iques : e x e m p l e d e s h o r m o n e s g o n a d o t r o p e e t thyréo t rope

Les techn iques de b io log ie molécu la i re ont é té ut i l isées pour connaî t re la s é q u e n c e d e s s o u s - u n i t é s a e t p d e l ' h o r m o n e g o n a d o t r o p e ( G T H ) , d o n t la c o n c e n t r a t i o n h y p o p h y s a i r e est t rop fa ib le pour permett re s a pur i f icat ion, a insi que de ce l les de la T S H , d o n t la quan t i t é pur i f iée n'a pe rm is d'obtenir q u e des s é q u e n c e s part ie l les.

U n e b a n q u e d ' A D N comp lémen ta i r es a été cons t i tuée à part i r d ' A R N m e s s a g e r s ex t ra i t s d e que lques d i za ines d 'hypophyses d 'angui l les . Cet te b a n q u e a été «cr ib lée» par h y b r i d a t i o n a v e c d e s « s o n d e s » r a d i o a c t i v e s c a p a b l e s , c h a c u n e , de r e c o n n a î t r e p a r c o m p l é m e n t a r i t é u n e d e s d i f f é ren tes sous -un i t és de la G T H et de la T S H : e n ce qu i c o n c e r n e la s o u s - u n i t é 13 d e la T S H , la s o n d e c o r r e s p o n d a i t à un f r a g m e n t d ' A D N s y n t h é t i s é par PCR, codan t pour une partie d e la s é q u e n c e de la sous-un i té o b t e n u e par le s é q u e n ç a g e p ro té i que par t ie l p réa lab le . D a n s le c a s de la sous -un i t é 13 d e la G T H , la s o n d e co r responda i t é g a l e m e n t à un f ragmen t d ' A D N synthé t ique, codan t pour une région p e p t i d i q u e par t i cu l iè rement c o n s e r v é e au cou rs de l 'évolut ion de cet te fami l le d ' ho rmones . D a n s le c a s de la sous -un i té a c o m m u n e à G T H et T S H , la sonde étai t cons t i tuée par un f r a g m e n t d e l ' A D N c o m p l é m e n t a i r e de la s o u s - u n i t é a du rat , d o n t la s é q u e n c e es t s u f f i s a m m e n t p roche pour qu' i l pu isse y avoir une comp lémen ta r i t é part ie l le.

L e s p h a g e s recomb inan ts const i tuant la b a n q u e son t int rodui ts dans des bac té r ies qu i son t répar t ies sur un mi l ieu de cul ture gé lose . Les p h a g e s se mult ip l ient à l ' intérieur de c h a q u e b a c t é r i e p u i s , a p r è s avo i r indui t la lyse ( la des t ruc t i on de la m e m b r a n e ) de la b a c t é r i e , v o n t i n f e c t e r les b a c t é r i e s a v o i s i n a n t e s , c o n d u i s a n t à d e s p l a g e s de l y s e

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fac i lement local isables sur le tap is bac té r ien . Les phages ainsi l ibérés des bac tér ies sont «t ransférés» sur une m e m b r a n e de ny lon , app l iquée d i rec tement à la sur face de la gé lose. Après t ra i tement adéquat , la s o n d e est m ise en p résence de la m e m b r a n e et v a se f ixer, par comp lémenta r i té , sur l 'ADN des phages ayan t inséré l 'ADN comp lémen ta i re de la sous-uni té co r respondan te . La m e m b r a n e est ensu i te mise en contact avec un f i lm d 'autorad iograph ie : la radioact iv i té ém ise par la sonde impress ionne le f i lm, ce qui pe rme t de local iser les p lages de lyse co r respondan tes . Les c lones son t pur i f iés, ampl i f iés , et la séquence en nuc leot ides dé te rminée . Les séquences en ac ides a m i n é s des sous-un i tés a , G T H p et T S H p on t ainsi pu être caractér isées chez l 'anguil le ( Q U E R A T etal., 1990 a,b; S A L M O N etal., 1993) .

C e s s é q u e n c e s p e u v e n t ê t r e c o m p a r é e s a u x s é q u e n c e s d e s h o r m o n e s co r respondan tes des d i f férents Ver téb rés : des a rb res des re la t ions phy lé t iques peuvent êt re const ru i ts , permet tan t de reconst i tuer l 'histoire, au cours de l 'évolut ion, de ces fami l les d ' ho rmones (QUERAT, 1994) .

3 .3. A p p l i c a t i o n à l ' é t u d e d e la b i o s y n t h è s e h o r m o n a l e : d o s a g e d e s A R N m e s s a g e r s

C o m m e nous l 'avons vu p lus haut , la syn thèse d 'une pro té ine nécess i te , en premier l ieu, la syn thèse de son A R N messager . L 'ADN comp lémen ta i r e pe rme t d 'es t imer le taux de d ' A R N m e s s a g e r co r respondan t p résen t d a n s la cel lu le.

P lus ieurs t echn iques ont é té d é v e l o p p é e s pour quant i f ier un A R N m e s s a g e r donné . Parmi ce l les-c i , l 'analyse en «Nor the rn blot» est la p lus ut i l isée (F igure 3 : pho to D) . Les A R N m e s s a g e r s sont extra i ts du t i ssu et sépa rés su ivant leur tai l le (par é lec t rophorèse) : les A R N , qu i s o n t d e s a c i d e s , d o n c c h a r g é s n é g a t i v e m e n t , m i g r e n t d a n s un c h a m p é lec t r ique ve rs le pôle posit i f à u n e v i t esse qu i d é p e n d de leur l ongueu r : p lus ils sont g rands , p lus ils sont re tardés par la mai l le du ge l . U n e m e m b r a n e de ny lon (le «blot») est e n s u i t e a p p l i q u é e sur le ge l et l es A R N s o n t t r a n s f é r é s su r la m e m b r a n e pa r s i m p l e cap i l l a r i t é . Les A D N c o m p l é m e n t a i r e s c l o n e s son t a lo rs u t i l i sés c o m m e s o n d e , ap rès m a r q u a g e p a r un n u c l e o t i d e r a d i o a c t i f . M i s en c o n t a c t a v e c la m e m b r a n e , i ls von t s 'hybr ider par comp lémen ta r i t é sur les A R N co r respondan ts : ce la pe rme t d e dé tec te r les A R N recherchés . Ap rès au to rad iog raph ie , le «s ignal» est quant i f ié par dens i tomét r i e : son intensi té est propor t ionne l le à la quan t i té de radioact iv i té ém ise , d o n c à la quant i té d 'ADN comp lémen ta i r e hybride, donc , en f in , à la quant i té d e l 'ARN co r respondan t .

Nous app l iquons cet te t echn ique c h e z l 'angui l le à l 'étude des var ia t ions des teneurs en A R N m e s s a g e r s de la pro lac t ine ( Q U E R A T et al., 1994) , des sous -un i tés d e l 'hormone g o n a d o t r o p e ( Q U E R A T et al., 1991 ) e t d e ce l l es de l ' h o r m o n e t h y r é o t r o p e ( P R A D E T -B A L A D E , 1 9 9 4 ) e n r é p o n s e à d e s c h a n g e m e n t s p h y s i o l o g i q u e s , à d e s m o d i f i c a t i o n s env i ronnemen ta les ou s o u s l'effet de t ra i t emen ts ho rmonaux .

3 .4 . U t i l i s a t i o n d e s s o n d e s e n h y b r i d a t i o n in situ

En h i s to log ie , de m ê m e q u e l ' app l i ca t ion d e s an t i co rps p e r m e t d e v i s u a l i s e r les c e l l u l e s p r o d u i s a n t les h o r m o n e s , l ' u t i l i sa t i on d e s s o n d e s , q u i s ' h y b r i d e n t a u x A R N m e s s a g e r s , p e r m e t de d é t e c t e r les c e l l u l e s qu i p r o d u i s e n t c e s A R N m e s s a g e r s . Des m e s u r e s de l ' intensité du s ignal p e r m e t t e n t é g a l e m e n t une es t ima t ion quant i ta t i ve de la concen t ra t ion en A R N par cel lu le et d o n c de dé tec ter des var ia t ions d 'act iv i té . L 'hybr idat ion in situ p e u t ê t re u t i l i sée s e u l e , e n pa r t i cu l i e r q u a n d l ' ob ten t i on d ' h o r m o n e p u r e e t la p r o d u c t i o n d ' a n t i c o r p s n ' o n t p u ê t r e r é a l i s é e s . U t i l i s é e e n c o n j o n c t i o n a v e c r i m m u n o h i s t o c h i m i e , el le pe rmet de c o m p a r e r les capac i tés de la cel lu le à t ranscr i re l 'ARN m e s s a g e r e t à le t radu i re en p r o t é i n e , c e s d e u x f onc t i ons n 'é tant p a s o b l i g a t o i r e m e n t co r ré lées . C e s techn iques peuven t ê t re é g a l e m e n t ut i l isées pour la v isua l isa t ion des t issus c ib les par la détec t ion d e s A R N m e s s a g e r s codan t pou r le récep teur ho rmona l .

Avec B. V I D A L , n o u s a v o n s r é c e m m e n t mis au point et app l i qué ce t te techn ique d ' h y b r i d a t i o n in situ à la v i s u a l i s a t i o n c h e z l ' angu i l l e d e s c e l l u l e s h y p o p h y s a i r e s à pro lac t ine ( Q U E R A T etal., 1994) et à h o r m o n e thy réo t rope ( P R A D E T - B A L A D E , 1994) ainsi qu 'à la dé tec t ion des cel lu les c ib les de la d o p a m i n e , possédan t des A R N m e s s a g e r s pour le récepteur de type D1 ( C A R D I N A U D etal., 1994) .

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1994)335 : 147 -169 — 160 —

3 .5 . A p p l i c a t i o n à la p r o d u c t i o n d ' h o r m o n e r e c o m b i n a n t e

L o r s q u e la pur i f icat ion d 'une hormone n'est pas réal isable, ou lorsque les quant i tés n é c e s s a i r e s sont t rop impor tan tes (par exemple , pour des t ra i tements chron iques in vivo , e n r e c h e r c h e f ondamen ta l e ou app l iquée, o u pour la fabr icat ion d 'ant icorps) , il peut ê t re poss i b l e d e les produ i re par «gén ie génét ique».

D i f fé ren ts m o y e n s ont é té déve loppés , ut i l isant d ivers o rgan i smes su ivant le t ype et la quan t i t é d e pro té ine à p rodu i re . La technique cons is te à faire fabr iquer la proté ine par ce t o r g a n i s m e en a jou tan t à s o n pat r imo ine géné t i que un g è n e art i f ic iel codan t pour la p r o t é i n e ( d ' o ù le t e r m e de p ro té ine r ecomb inan te ) . C e gène est const ru i t en assoc ian t l 'ADN c o m p l é m e n t a i r e codan t pour la protéine à d e s é lémen ts permet tant l '«express ion» d e c e g è n e dans l 'o rgan isme cons idé ré (c 'est la cons t ruc t ion d 'un vec teur d 'exp ress ion , s p é c i f i q u e d ' u n o r g a n i s m e d o n n é ) . D a n s le c a s le p l u s s i m p l e , t o u s l es é l é m e n t s n é c e s s a i r e s à la p roduc t ion de la proté ine sont p résents dans une bactér ie . Dans ce cas , le v e c t e u r d ' e x p r e s s i o n c o n t e n a n t l ' A D N c o m p l é m e n t a i r e de la p r o t é i n e à p r o d u i r e es t in t rodu i t d a n s la bac tér ie et cel le-c i est mise en cu l ture . Les bactér ies, dont le pa t r imo ine g é n é t i q u e e s t a ins i t r a n s f o r m é , se mu l t i p l i en t e n p r o d u i s a n t la p r o t é i n e en q u a n t i t é c o n s i d é r a b l e . Dans cer ta ins cas , la product ion de la pro té ine ne peut êt re fai te par d e s b a c t é r i e s . E n e f fe t , c e r t a i n e s p r o t é i n e s n ' a d o p t e n t l eu r s t r u c t u r e dé f i n i t i ve q u ' a p r è s a s s o c i a t i o n a v e c d 'au t res é l émen ts , no tamment des suc res , une réact ion q u e seu le d e s ce l l u les d ' o r g a n i s m e s p lus évo lués sont capab les de réaliser. C'est le cas , par e x e m p l e , d e s g l ycop ro té i nes c o m m e les sous-uni tés de la G T H ou de la T S H . Plus ieurs t ypes de ce l lu les son t ut i l isées à cet effet c o m m e cer ta ines cel lu les d ' insectes ou de m a m m i f è r e s cu l t i vées in vitro. La m é t h o d e ut i l isée est basée sur le m ê m e pr incipe mais nécess i te des v e c t e u r s d 'exp ress ion d i f férents, p lus comp lexes , et condu isen t à des quant i tés de pro té ine p rodu i t e in fér ieures . E l les son t auss i p lus oné reuses .

C h e z l 'angui l le, ces t echn iques ont été app l iquées , au J a p o n , à la product ion par des bac té r i es de l 'hormone de c ro i ssance (GH) (SA ITO et al., 1988) .

C. M I S E A U P O I N T D E S E X P É R I M E N T A T I O N S

1 . E t u d e s in vivo

1 . 1 . I m p o r t a n c e d e s é t u d e s in vivo

Les régu la t ions ho rmona les sont responsables du contrô le de fonct ions, tel les que c ro i ssance et reproduct ion, qui met tent en j eu un g rand nombre d 'organes ; des sys tèmes h o r m o n a u x de contrô le et rétrocontrôle permettent un vér i table d ia logue entre les o rganes c o n c e r n é s . Par exemp le , pour la reprodution (voir art icle de S. D U F O U R , ce numéro) , les n e u r o h o r m o n e s cérébra les contrô lent la product ion hypophysa i re d 'hormone gonadot rope qui cont rô le e l l e -même l'activité des gonades (product ion des gamètes et sécrét ion des s téroïdes sexue ls ) ; les ho rmones s téroïdes act ivent de nombreuses fonct ions pér iphér iques ( comme la p r o d u c t i o n hépa t ique de v i te l logén ine chez la feme l le ou la di f ferent iat ion des carac tè res sexue ls seconda i res) mais el les exercent éga lement des rétrocontrôles en régulant l 'activité d u c e r v e a u et d e l ' h y p o p h y s e . D e s é tudes in vivo ( sur l ' o r g a n i s m e en t ie r ) s o n t d o n c ind ispensab les à la compréhens ion de l 'ensemble de ces régulat ions.

D e p lus , le rôle que peuven t jouer les h o r m o n e s dans la média t ion des effets d e s f a c t e u r s e n v i r o n n e m e n t a u x su r les g r a n d e s f o n c t i o n s de l ' o rgan i sme rend é g a l e m e n t n é c e s s a i r e s d e s é t u d e s in vivo su r le te r ra in , d a n s d e s cond i t i ons e n v i r o n n e m e n t a l e s na tu re l les .

Tou te une panop l ie de m é t h o d e s d ' in tervent ion in vivo a été mise au point et es t c o u r a m m e n t en œ u v r e au laborato i re . Les angui l les on t une g rande capac i té à suppor te r l ' é m e r s i o n g r â c e à la p r o t e c t i o n de leurs b r a n c h i e s v i s -à -v i s de la d é s h y d r a t a t i o n (à l ' in tér ieur d e la p o c h e branch ia le ) : dans les cond i t ions nature l les, cet te capac i té pe rme t a u x angu i l l es de t raverser des c h a m p s humides o u de f ranchi r cer ta ins obs tac les lors d e l e u r s m i g r a t i o n s ; d a n s les c o n d i t i o n s d e l a b o r a t o i r e , ce t te c a p a c i t é n o u s p e r m e t la réa l isa t ion d 'un g rand n o m b r e d ' in tervent ions hors d e l 'eau.

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1994) 3 3 5 : 147 -169 — 161 —

1.2. P r é l è v e m e n t s s a n g u i n s

L e s p r é l è v e m e n t s s a n g u i n s p e u v e n t ê t r e e f f e c t u é s d e f a ç o n p o n c t u e l l e par p ré lèvemen t au m o y e n d 'une se r ingue d a n s le va i sseau c a u d a l . Ce t te in te rvent ion , rapide, ne n é c e s s i t e pas d ' a n e s t h é s i e c h e z l ' angu i l l e , c o n t r a i r e m e n t à un g r a n d n o m b r e de po issons é tud iés en laborato i re (Cypr in idés , Sa lmon idés ) , ce qu i p résen te l 'avantage d e ne pas per turber les fonc t ions cé réb ra les sens ib les à l 'anesthés ie.

Pour d e s p r é l è v e m e n t s répé tés (par e x e m p l e , pou r le su iv i de la c iné t ique d 'une d é c h a r g e ho rmona le ) , ou pour le d o s a g e d ' h o r m o n e s par t i cu l iè rement sens ib les au stress de l 'émers ion (par e x e m p l e , p o u r le Cortisol), on p rocède p r é a l a b l e m e n t à la p o s e d'un ca thé te r chez l 'angui l le a n e s t h é s i é e , se lon la m é t h o d e m ise au po in t a u labora to i re par L E L O U P - H A T E Y (1976) , pu is on la isse l 'angui l le récupérer de l 'anesthés ie et d e l 'opérat ion avan t d 'ef fectuer les p ré lèvemen ts (F igure 3 : Pho to A ) .

1.3. A b l a t i o n s d e g l a n d e s

Des opéra t ions ch i ru rg ica les d 'ab la t ion de g landes endoc r ines son t réa l isées chez l 'angui l le sous anes thés ie . D a n s t ous les c a s , des opé ra t i ons - t émo ins , cons is tan t en la m ê m e in tervent ion (anes thés ie , ouve r tu re et f e rme tu re , t r a i t emen t an t ib io t ique éventue l ) sauf l 'ablat ion e l l e -même , son t réa l i sées c o m m e cont rô le .

L 'hypophysec tomie est réa l isée se lon la mé thode m ise au point a u Labora to i re par M. F O N T A I N E et O. C A L L A M A N D et décr i te par L E L O U P - H A T E Y (1964) . A p r è s incis ion de la m u q u e u s e pa la t ine, l'os s p h é n o ï d e est f ra isé et l ' hypophyse est asp i rée . Le succès de l ' opéra t ion es t a t tes té au b o u t de q u e l q u e s j o u r s pa r la d é c o l o r a t i o n c o m p l è t e des angu i l les due à la d ispar i t ion de l ' ho rmone hypophysa i re mé lano t rope .

La cas t ra t ion es t pa r t i cu l i è remen t dé l ica te chez l 'angui l le d u fai t d e l ' é tendue des g o n a d e s (sur la moi t ié de la longueur du corps) et de leur a t t achemen t f e rme aux paro is du corps sur toute leur longueur , ce qui nécess i te d 'ef fectuer une ouver tu re t rès longue de la p a r o i d u c o r p s . C e t t e o p é r a t i o n a p u ê t re c e p e n d a n t m i s e a u p o i n t a v e c s u c c è s au Labora to i re par N. LE B E L L E c h e z le mâ le e t la f eme l l e . A p r è s l 'ab la t ion , la p e a u est r e c o u s u e e t la c i c a t r i c e s o u d é e pa r u n e c o l l e t i s s u l a i r e ; les a n i m a u x r e ç o i v e n t un t r a i t e m e n t a n t i b i o t i q u e p r é v e n t i f . D a n s c e s c o n d i t i o n s , u n e t r è s b o n n e s u r v i e a été obse rvée et des expér iences à long t e r m e ont pu être m e n é e s ( D U F O U R etal., 1989 ) .

Son t éga lemen t réa l isées des ab la t ions des co rpuscu les de S tann ius , deux pet i tes g l a n d e s endoc r i nes s i tuées sur les re ins et séc ré tan t l ' ho rmone de t ype P T H imp l iquée d a n s la régulat ion de la ca l cémie ( L E L O U P - H A T E Y , 1964) .

1.4. T r a i t e m e n t s h o r m o n a u x

L e s t r a i t e m e n t s s o n t e f f e c t u é s p a r i n j e c t i o n s o u i m p l a n t s p é r i v i s c é r a u x , des i n t e r v e n t i o n s r a p i d e s qu i ne n é c e s s i t e n t c h e z l ' angu i l l e a u c u n e a n e s t h é s i e . O n peut admin is t rer les ho rmones e l l e s - m ê m e s ou des molécu les syn thé t iques ag issan t de façon s im i la i re (agon is te ) ma i s p o u v a n t pa r e x e m p l e ê t re é l i m i n é e s m o i n s r a p i d e m e n t de la c i rcu la t ion sangu ine . O n peu t i n ve r semen t t ra i ter les an imaux a v e c d e s agen ts b loquan ts d e l ' ac t i on h o r m o n a l e ( a n t a g o n i s t e s ) , p a r e x e m p l e d e s m o l é c u l e s s e f i x a n t s u r les récepteurs ho rmonaux et e m p ê c h a n t la l ia ison de l 'hormone.

1.5. E f fe t d e s f a c t e u r s e x t e r n e s e n L a b o r a t o i r e

L'effet de ce r ta ins f ac teu rs e n v i r o n n e m e n t a u x sur les régu la t i ons e n d o c r i n i e n n e s peut êt re étudié expé r imen ta lemen t au Laborato i re :

— La sal in i té de l 'eau peut êt re m o d u l é e à vo lon té avec d e s s y s t è m e s d 'eau reconst i tuée en circui t f e rmé.

— La tempéra tu re et la lumière peuven t êt re con t rô lées en p laçant les aqua r i ums d a n s des p ièces the rmos ta tées et à éc la i rage et pho topér iode cont rô lés .

C e s é q u i p e m e n t s o n t c o u r a m m e n t u t i l i s é s p o u r r e c h e r c h e r l e s e f f e t s des c h a n g e m e n t s d e s a l i n i t é , d e t e m p é r a t u r e o u d e p h o t o p é r i o d e s u r d e s p r o d u c t i o n s ho rmona les chez l 'angui l le (par e x e m p l e : D U F O U R et F O N T A I N E , 1985 ; Q U E R A T et al.,

Figure 3 (Photos A et B)

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1994) 335 : 147-169 — 162 —

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1994).335 : 147 -169 — 163 —

c o n t r o l 2 d 4 d 7 d 2 w 6 w 1 0 w

t i m e a f t e r s t e r o i d s i m p l a n t a t i o n

Figure 3 (Photos C et D)

m R N A

a c t i n 1

b e t a

G T H - I I

a l p h a

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1994) 3 3 5 : 147 -169 — 164 —

F i g u r e 3 : I l l u s t r a t i o n d e m é t h o d e s v a r i é e s d ' i n v e s t i g a t i o n e n d o c r i n i e n n e c h e z l ' a n g u i l l e .

P h o t o A : E t u d e in vivo : p r é l è v e m e n t s a n g u i n r é a l i s é a u m o y e n d ' u n cathéter .

P h o t o B : E t u d e in vitro sur o r g a n e isolé : p e r f u s i o n d ' a r c s b r a n c h i a u x p o u r l 'é tude d e s f l u x d e c a l c i u m .

F lèches r o u g e s : e n t r é e d u m i l i e u d e p e r f u s i o n d a n s les a r c s b r a n c h i a u x ; f l è c h e s b l e u e s : s o r t i e d u m i l i e u à p a r t i r d e s a r c s b r a n c h i a u x o u d e s c h a m b r e s d e p e r f u s i o n .

P h o t o C : E t u d e in vitro s u r c e l l u l e s isofées : c u l t u r e p r i m a i r e d e c e l l u l e s h y p o p h y s a i r e s .

L e s c e l l u l e s g o n a d o t r o p e s s o n t m a r q u é e s ( m a r r o n f o n c é ) p a r i m m u n o c y t o c h i m i e a u m o y e n d ' u n a n t i c o r p s r e c o n n a i s s a n t l ' h o r m o n e g o n a d o t r o p e .

P h o t o D : A n a l y s e p a r « N o r t h e r n B lo t» d e s A R N m e s s a g e r s d e s s o u s -uni tés a e t p d e l ' h o r m o n e g o n a d o t r o p e , e x t r a i t s à p a r t i r d e s h y p o p h y s e s d ' a n g u i l l e s a y a n t reçu u n i m p l a n t s té ro ïd ien .

L e s s t é r o ï d e s p r o v o q u e n t une a u g m e n t a t i o n d e s t a u x d ' A R N c o d a n t p o u r l e s s o u s - u n i t é s a e t (3 d e l ' h o r m o n e g o n a d o t r o p e (GTH- I I ) j u s q u ' à d e u x s e m a i n e s ( 2 w ) a p r è s i m p l a n t a t i o n ; l ' A R N d e l ' a c t i n e s e r t d e ré férence .

F i g u r e 3 : I l l u s t r a t i o n o f v a r i o u s m e t h o d s f o r e n d o c r i n e i n v e s t i g a t i o n i n t h e e e l .

P h o t o A : In vivo s t u d y : b l o o d s a m p l i n g u s i n g a c a t h e t e r .

P h o t o B : In vitro s t u d y on i s o l a t e d o r g a n : p e r f u s i o n o f g i l l a r c h e s f o r s t u d y i n g c a l c i u m e x c h a n g e s .

R e d a r r o w s : p e r f u s i o n m e d i u m in le t i n t o g i l l a r c h e s ; b l u e a r r o w s : m e d i u m o u t l e t e i t h e r f r o m g i l l a r c h e s o r f r o m p e r f u s i o n c h a m b e r s .

P h o t o C : In vitro s t u d y o n i s o l a t e d c e l l s : p r i m a r y c u l t u r e o f p i t u i t a r y c e l l s .

G o n a d o t r o p i c c e l l s a r e l a b e l l e d ( d a r k b r o w n ) b y i m m u n o c y t o c h e m i s t r y , u s i n g a n a n t i b o d y r e c o g n i z i n g g o n a d o t r o p i c h o r m o n e .

P h o t o D : « N o r t h e r n B lo t» a n a l y s i s o f g o n a d o t r o p i n a a n d f i s u b u n i t m e s s e n g e r R N A s , a f t e r e x t r a c t i o n o f p i t u i t a r i e s f r o m s t e r o i d i m p l a n t e d e e l s .

S t e r o i d s i n d u c e a n i n c r e a s e i n g o n a d o t r o p i n ( G T H - I I ) a a n d p s u b u n i t m e s s e n g e r R N A s u p t o t w o w e e k s ( 2 w ) a f t e r i m p l a n t a t i o n ; a c t i n R N A i s u s e d a s a r e f e r e n c e .

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1994) 3 3 5 : 147 -169 — 165 —

1 9 9 4 ) . De p l u s , la poss ib i l i t é d ' e f f ec tue r d e s p r é l è v e m e n t s de s a n g s u r d e s angu i l l es c a t h é t é r i s é e s p e r m e t d e s u i v r e les v a r i a t i o n s de t a u x s a n g u i n s h o r m o n a u x p o u v a n t d é p e n d r e de la pho topé r i ode , en t ravai l lant sous lumière rouge d e fa ib le in tensi té, pendant la pér iode d 'obscur i té (pour l ' hormone gonado t rope : D U F O U R , 1985 ; pour la mé la ton ine : S. D U F O U R , N. LE B E L L E et B. V I V I E N , d o n n é e s inédi tes) .

Des é q u i p e m e n t s p lus c o m p l e x e s son t nécessa i res p o u r l 'é tude de l'effet de fac teurs e n v i r o n n e m e n t a u x p lus o r i g i naux : par e x e m p l e , les c a i s s o n s h y p e r b a f e s pe rmet ten t de faire var ier la p ress ion hydros ta t ique , l 'adjonct ion d 'un s y s t è m e d e renouve l l emen t d'eau s o u s p r e s s i o n o u v r a n t la v o i e à d e s e x p é r i m e n t a t i o n s à l o n g t e r m e ( e x e m p l e d e l ' équ ipement du g r o u p e de reche rche de L. B A R T H E L E M Y , Labora to i re de Phys io log ie de la Facul té de M é d e c i n e de Bres t : S E B E R T et al., 1990) .

1.6. E t u d e s in vivo s u r le t e r r a i n

Les é t u d e s e n d o c r i n i e n n e s s u r le t e r r a i n p e u v e n t a v o i r d e s o b j e c t i f s v a r i é s : f o n d a m e n t a u x ou app l i qués , descr ip t i fs ou expé r imen taux .

D'un point de vue descript i f , des pré lèvements ef fectués sur le s i te m ê m e de capture pe rmet ten t la dé te rm ina t i on d e s taux h o r m o n a u x d a n s les cond i t i ons env i r onnemen ta les n a t u r e l l e s . N o u s a b o r d o n s a c t u e l l e m e n t a v e c le C S P u n e é t u d e s u r le t e r r a i n d e s m o d i f i c a t i o n s a n a t o m i q u e s e t e n d o c r i n i e n n e s l i ées à l ' a r g e n t u r e . D 'un po in t d e v u e fondamenta l , une tel le é tude peut appor ter les premiers é lémen ts concernan t les var iat ions chez l 'anguil le d ' ho rmones impl iquées dans ce p h é n o m è n e d e m é t a m o r p h o s e (voir art icle de Y.A. FONTAINE , ce numéro ) ; d 'un point de vue app l iqué, el le peu t permet t re l 'élaborat ion d 'out i ls ( tests h o r m o n a u x ) d e ca rac té r i sa t i on des p o p u l a t i o n s d 'angu i l l es d a n s les eaux cont inenta les . La possib i l i té de réal iser re la t ivement a i s é m e n t des p ré lèvemen ts sangu ins chez l 'anguil le, a joutée aux techn iques récentes de d o s a g e s immunoenzyma t i ques , ouvre la voie à la mise en œ u v r e de ces tests sur le terrain m ê m e .

D'un point de v u e expé r imen ta l , l 'étude de l'effet de ce r ta ins fac teurs ex te rnes peut nécess i te r des expé r imen ta t i ons sur le ter ra in : c 'est le cas d e s e x p é r i e n c e s d ' immers ion en m e r p r o f o n d e qu i on t é t é r é a l i s é e s a f in de r e c h e r c h e r l 'ef fet , à l ong t e r m e , d 'une p r e s s i o n h y d r o s t a t i q u e é l e v é e sur la p r o d u c t i o n d ' h o r m o n e g o n a d o t r o p e h y p o p h y s a i r e ( D U F O U R et F O N T A I N E , 1985 et voi r art ic le de S. D U F O U R , ce n u m é r o ) .

2. E t u d e s in vitro

2 . 1 . Intérêt p r o p r e d e s é t u d e s in vitro

Les é tudes in vitro pe rme t ten t la mise en év i dence d 'une régu la t ion h o r m o n a l e ainsi que l 'analyse de s e s m é c a n i s m e s , à l 'échel le de l 'organe, de la ce l lu le ou d e la mo lécu le . L ' i so lement d 'un o r g a n e , ou de ce l l u les , les sous t ra i t à l ' e n s e m b l e d e s régu la t i ons qu i in terag issent n o r m a l e m e n t in vivo. Cet te s impl i f ica t ion est nécessa i r e à l 'étude et l 'analyse de c h a q u e r é g u l a t i o n ; c e p e n d a n t , e l le r i sque a u s s i d e r e p r é s e n t e r une s i t ua t i on t rop é lo ignée d e s cond i t i ons phys i o l og i ques na ture l les . C 'es t p o u r q u o i u n e con f ron ta t i on des résul tats ob tenus in vitro et in vivo est abso lumen t nécessa i re pou r va l ide r les données ob tenues in vitro et les in tégrer d a n s un s c h é m a plus g loba l de régu la t ion .

2.2. E t u d e s in vitro s u r o r g a n e s isolés

Le f o n c t i o n n e m e n t et la régu la t ion d ' o rganes iso lés p e u v e n t ê t re é tud iés p a r des expér iences d ' incubat ion ( l ' o rgane é tant i m m e r g é d a n s un mi l ieu s ta t ique) o u de per fus ion ( l 'o rgane é tant i m m e r g é d a n s un f lux con t inu de mi l ieu ou i r r igué par un f lux con t inu de mi l ieu d a n s le cas o ù la vascu la r i sa t ion de l 'organe peut ê t re ut i l isée et ca thé tér isée) .

Des expé r i ences d ' incubat ion de pet i ts f r agmen ts d 'ova i res d 'angu i l les ont é té mises en oeuvre au Labora to i re et on t pe rm is d 'é tud ier les capac i t és s t é r o ï d o g è n e s de l 'ovaire : les t i s s u s s o n t i n c u b é s a v e c d i f f é ren t s p r é c u r s e u r s d e la c h a î n e d e b i o s y n t h è s e des h o r m o n e s s té ro ïdes et on reche rche que ls dér i vés on t pu ê t re p rodu i ts d a n s les ext ra i ts de t issus et d a n s le m i l ieu . C e s é t u d e s pe rmet ten t d 'observe r les mod i f i ca t ions des capac i tés s té ro ïdogènes de l 'ovaire en t re les s tades j a u n e et a rgen té a ins i q u ' a u cou rs de d iverses expér imen ta t ions ( L E L O U P - H A T E Y etal., 1985) .

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1994) 3 3 5 : 147 -169 — 166 —

C e m ê m e d i s p o s i t i f a p e r m i s d ' é t u d i e r le m é c a n i s m e de l ' ac t ion de l ' h o r m o n e g o n a d o t r o p e sur l 'ovaire : d e s f r a g m e n t s d 'ovai res incubés avec de l ' ho rmone gonado t rope p r o d u i s e n t u n s e c o n d m e s s a g e r i n t race l l u l a i r e , l ' a d é n o s i n e m o n o p h o s p h a t e c y c l i q u e ( A M P c ) q u i es t é g a l e m e n t le s e c o n d m e s s a g e r d e s h o r m o n e s g o n a d o t r o p e s c h e z les M a m m i f è r e s . L 'AMPc est d o s é e d a n s les ext ra i ts de t issus et dans le mi l ieu d ' incubat ion. Le d o s a g e de l 'AMPc d e s échan t i l l ons est réal isé par une réac t ion de compét i t i on , s imi la i re à u n d o s a g e r a d i o i m m u n o l o g i q u e m a i s m e t t a n t e n j e u , à la p l a c e d e l ' an t i co rps , u n e p r o t é i n e d e l i a i son s p é c i f i q u e d e l 'AMPc e t i s o l é e à pa r t i r d u m u s c l e d e l a p i n . C e s e x p é r i e n c e s on t pe rm is d ' ana l yse r le mécan i sme d 'act ion de la G T H pour la p remière fo is c h e z un p o i s s o n et o f f ren t é g a l e m e n t la poss ib i l i té d 'un d o s a g e b io l og ique de l 'activité g o n a d o t r o p e , la p r o d u c t i o n d ' A M P c étant c o r r é l é e à la d o s e d ' h o r m o n e ( F O N T A I N E -B E R T R A N D et al., 1978) .

D e s e x p é r i e n c e s d e p e r f u s i o n ont é t é r é a l i s é e s p o u r l ' é t u d e d e la r é g u l a t i o n h o r m o n a l e d e s f lux d e ca l c i um à t ravers la b ranch ie (F igure 3 : Pho to B). La prépara t ion d ' a r c b r a n c h i a l i s o l é a é t é m i s e a u p o i n t a u L a b o r a t o i r e p o u r é t u d i e r l e s f l u x u n i d i r e c t i o n n e l s ( f l ux e n t r a n t e t f l ux so r t an t ) de c a l c i u m . E l le p e r m e t d e m e s u r e r les mod i f i ca t i ons de ces f lux à la su i te de l 'ablation de g landes endoc r i nes (par exemp le , les C o r p u s c u l e s d e S tann ius ) e t de met t re en év idence les ef fets de la per fus ion de di f férentes p r é p a r a t i o n s d 'ext ra i ts de c e s g l andes . L'étude de la vascu la r isa t ion d e s arcs branch iaux , en u t i l i sant des rés ines, n o u s a pe rm is de met t re au point un s y s t è m e de cathétér isa t ion . S i x a r c s b r a n c h i a u x a i ns i p r é p a r é s sont s u s p e n d u s d a n s d e s c h a m b r e s i nd i v i due l l es c o n t e n a n t le mi l ieu extér ieur . Tro is d 'entre e u x sont ut i l isés pou r la m e s u r e du f lux ent rant ( l ' i so tope 4 5 C a est p lacé d a n s le mi l ieu extér ieur et m e s u r é d a n s le mi l ieu ef f luent) , les trois a u t r e s p o u r la m e s u r e du f lux so r tan t ( l ' isotope est p lacé d a n s le mi l ieu de per fus ion et m e s u r é d a n s des a l iquots d u mi l ieu extér ieur) . Le débi t de per fus ion (0,1 m l / min.) a é té c h o i s i a p r è s d é t e r m i n a t i o n in situ d u d é b i t s a n g u i n à t r a v e r s l ' a r c . C e d i s p o s i t i f e x p é r i m e n t a l nous a p e r m i s de mon t re r que l 'ablat ion d e s co rpuscu les de S tann ius chez l 'angui l le, e n a u g m e n t a n t le f lux en t ran t branchia l de ca l c ium et e n rédu isant le f lux sor tant , e s t r e s p o n s a b l e d e l ' h y p e r c a l c é m i e o b s e r v é e in vivo. La p e r f u s i o n d ' ex t ra i t s de c e s g l a n d e s m o d i f i e n t l e s f l u x d e c a l c i u m d a n s l e s e n s d ' u n e r e s t a u r a t i o n d ' u n e n o r m o c a l c é m i e . La pe r fus ion du f r agmen t syn thé t ique 1-34 de l ' ho rmone para thyro ïd ienne h u m a i n e (1 -34 hPTH) mon t re q u e celu i -c i agit sur les f lux d e ca l c i um de man iè re ana logue à l ' h o r m o n e des c o r p u s c u l e s de S tann ius de l 'angui l le. A ins i , il a été poss ib le d'établ i r qu' i l ex i s ta i t u n e ana log ie de f onc t i on en t re ces deux h o r m o n e s e n p lus d 'une s imi l i tude de s t ruc tu re ( M I L E T et al., 1985 ) .

2.3 . E t u d e s in vitro s u r c e l l u l e s isolées

Des expér iences sont réa l isées sur des cel lules ob tenues par d issociat ion des t issus et m i s e en cu l ture. Ces cel lu les, qui peuvent ê t re ma in tenues en surv ie pendant deux à trois s e m a i n e s et qui conserven t leur dif férenciat ion initiale, sont qual i f iées de cul tures pr imaires.

Les techn iques de d issoc ia t ion enzymat ique et de cu l tu re des hépa tocy tes d 'angui l le on t é t é m i s e s au po in t par B U R Z A W A - G E R A R D et co l labora teurs : ces cu l tures permet ten t d ' é tud ie r les m é c a n i s m e s d e l ' in teract ion en t re les h o r m o n e s s té ro ïdes et l ' hormone de c r o i s s a n c e d a n s le con t rô le d e la product ion de v i te l logén ine (voir ar t ic le de E. B U R Z A W A -G E R A R D et al., ce numéro ) .

N o u s avons auss i m is au po in t les techn iques de d issoc ia t ion et cu l ture des cel lu les h y p o p h y s a i r e s d 'angui l le (F igure 3 : Photo C ) . Ces cu l tu res nous pe rmet ten t d 'é tudier les m é c a n i s m e s des con t rô l es e x e r c é s par les n e u r o h o r m o n e s cé réb ra l es et les h o r m o n e s p é r i p h é r i q u e s sur la p roduc t i on d e s ho rmones hypophysa i res ( D U F O U R et al., 1992) .

L'ut i l isat ion de cu l tu res p r ima i res offre d e nombreux a v a n t a g e s :

— L a ma î t r i se des f ac teu rs de régu la t ion e n p résence d a n s le mi l ieu de cu l ture pe rme t d ' a n a l y s e r s é p a r é m e n t l 'effet d e c h a q u e r é g u l a t e u r p o t e n t i e l p u i s d ' e n é t u d i e r les in te rac t ions . La d issoc ia t ion d e s cel lules pe rmet éga lemen t un a c c è s aux cel lu les t rès r ap i de d e s f ac teu rs de régu la t i on p lacés d a n s le m i l i eu , cond i t i on i nd i spensab le aux é t u d e s à t r è s c o u r t t e r m e d e s c i n é t i q u e s d ' a c t i o n e t d e p r o d u c t i o n d e s s e c o n d s m e s s a g e r s in t racel lu la i res.

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1994)335 : 147 -169 — 167 —

— D'un point de vue prat ique, l 'homogénéi té des lots expé r imen taux (réal isés à part i r de la répart i t ion d 'une m ê m e prépara t ion de cel lu les d ispersées) pe rme t d'évi ter, au se in d'une expé r i ence , le p r o b l è m e d e la var iab i l i té ind iv idue l le d e s r é p o n s e s (var iabi l i té qui es t impor tante dans le cas d 'un an ima l s a u v a g e c o m m e l 'angui l le). La possibi l i té de travai l ler sur un nombre rédui t d e cel lu les par pui ts de cul ture pe rme t auss i de l imiter le nombre d 'an imaux ut i l isés dans une expér ience par rapport aux expér imen ta t ions in vivo (ce qu i est impor tant éga lemen t pour un an ima l à pro téger c o m m e l 'angui l le) .

C e p e n d a n t , les c o n d i t i o n s a r t i f i c ie l les de c e s c u l t u r e s t e l l e s q u e l ' a b s e n c e d e s con tac ts cel lu la i res m e m b r a n a i r e s se p rodu isan t n o r m a l e m e n t d a n s le t issu et l 'absence de l ' e n s e m b l e d e s f a c t e u r s d e r é g u l a t i o n ( l o c a u x o u c i r c u l a n t s ) p e u v e n t e n t r a î n e r d ' impor tan tes mod i f i ca t ions d a n s les réponses des ce l lu les a u x fac teurs é tud iés . Il reste d o n c t o u j o u r s essen t i e l d e c o n f r o n t e r les résu l ta t s a ins i o b t e n u s in vitro a u x d o n n é e s d 'expér imenta t ions in vivo.

2.4 . E t u d e s in vitro s u b c e l l u l a i r e s

O n é v o q u e r a b r i èvemen t tout le d o m a i n e d 'é tudes réa l i sées au n iveau subcel lu la i re, c ' e s t à d i r e à l ' é c h e l l e d e s c o n s t i t u a n t s m o l é c u l a i r e s d e l a c e l l u l e . C e d o m a i n e d ' invest igat ion inclut l ' ensemb le des é tudes d ' in teract ions mo lécu la i res imp l iquées dans la p roduct ion et l 'act ion h o r m o n a l e te l les que l 'associat ion ho rmone- récep teu r , l 'associat ion récep teur -é lément de régu la t ion nuc léa i re , e t c . .

C h e z l ' a n g u i l l e , o n p e u t c i t e r p a r e x e m p l e les é t u d e s d e c a r a c t é r i s a t i o n d e récep teu rs h o r m o n a u x : r é c e p t e u r s m e m b r a n a i r e s o v a r i e n s de l ' ho rmone gonado t rope , ( S A L M O N e f a/ . ,1987); récep teurs cy toso l iques et nuc léa i res hépa t i ques de l 'estradiol (voir art ic le de E. B U R Z A W A - G E R A R D et al., ce numéro ) .

C O N C L U S I O N

L'étude endoc r i n i enne d 'une e s p è c e s a u v a g e , c o m m e l 'angui l le , nécess i te la mise au po in t de t ou te u n e p a n o p l i e d e m é t h o d e s d ' i nves t i ga t i on , d e p u i s les e x p é r i e n c e s à l 'échel le mo lécu la i re j u s q u ' a u x é t u d e s in vivo sur le te r ra in . Ce t e n s e m b l e d 'app roches représente la cond i t i on ind ispensab le à une é tude phys io log ique in tégrée d e ce po isson auss i b ien d u point de v u e de la recherche f ondamen ta l e q u e d e s po in ts de v u e app l iqués de la carac tér isa t ion , ges t ion et maî t r ise de ses popu la t ions .

R E M E R C I E M E N T S

N o u s r e m e r c i o n s les m e m b r e s d u Labora to i re , e n par t i cu l ie r M. F O N T A I N E , Y.A. F O N T A I N E , N. LE B E L L E , A. HARDY, B. V I D A L , M. M O N T E R O , B. P R A D E T - B A L A D E , E. B U R Z A W A - G E R A R D , S. B A L O C H E , E. F O N T A I N E - B E R T R A N D , J . L E L O U P , J . L E L O U P -HATEY, E. L O P E Z , A. D E L U Z E ains i q u e nos n o m b r e u x co l l abo ra teu rs en France et à l ' é t ranger , qu i on t p e r m i s le d é v e l o p p e m e n t de c e s é t u d e s . N o s r e m e r c i e m e n t s vont é g a l e m e n t a u M N H N , C N R S , C S P , D R E D , I F R E M E R , I N R A q u i o n t s o u t e n u ou sou t iennen t f i nanc iè rement ces t ravaux .

B I B L I O G R A P H I E

B R U S L E J . , 1990 . L 'Angui l le e u r o p é e n n e , Anguilla anguilla, une e s p è c e j u g é e c o m m u n e jusqu 'à la dern iè re d é c e n n i e , mér i te- t -e l le d 'acquér i r au jou rd 'hu i le statut d 'espèce m e n a c é e ? Bull. Soc. Zool., 114, 61 -73 .

B U R Z A W A - G E R A R D E., 1 9 7 1 . Pur i f icat ion d 'une h o r m o n e g o n a d o t r o p e hypophysa i re de po isson té léos téen , la C a r p e (Cyprinus carpio L.). Biochimie, 53, 5 4 5 - 5 5 2 .

B U R Z A W A - G E R A R D E., K E R D E L H U E B., 1 9 7 8 . E t u d e p a r r a d i o i m m u n o l o g i e d e s p rop r i é tés d e s i m m u n o s é r u m s de l ' ho rmone g o n a d o t r o p e de la C a r p e (Cyprinus carpio) et de ses sous -un i tés . Ann. Biol. anim. Bioch. Biophys., 18, 7 7 3 - 7 8 0 .

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B U R Z A W A - G E R A R D E., B A L O C H E S., LELOUP-HATEY J . , LE M E N N F., M E S S A O U R I H., N U N E Z - R O D R I G U E Z J . , P E Y O N P., R O G E R C , 1994. O v o g e n è s e chez l 'anguil le, (Anguilla anguilla L.) : u l t ras t ruc ture de l 'ovaire à di f férents s tades de déve loppemen t e t i m p l i c a t i o n d e s l i p o p r o t é i n e s au c o u r s d e la v i t e l l o g e n è s e . Bull. Fr. Pêche Piscic, 335.

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D U F O U R S., 1985. La fonc t ion gonadot rope de l 'anguil le eu ropéenne , Anguilla anguilla L., a u s t a d e a rgen té (au m o m e n t du dépar t pour la m ig ra t i on de rep roduc t ion ) : les m é c a n i s m e s de s o n b l o c a g e et sa s t imu la t ion e x p é r i m e n t a l e . T h è s e de Doc to ra t d 'E ta t , MNHN/Un i v . Par i s V I , 158 p.

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