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22/05/2013
1
Henriette Poaty10ème RENCONTRE DE BIOLOGIE TECHNIQUE
BRAZZAVILLE
14-05-2011
CHORIOCARCINOME
� Cancer utérin
� Maladie gestationnelle
trophoblastique
� 20 % - 50 % complication de la môle
hydatiforme complète
Droz, 1999; Shapter et coll., 2001; Xue coll., 2004
� Grossesse anormale
� Dégénérescence hydropique des
villosités choriales placentaires
� Absence d’embryon
� Origine Androgénique++ou biparentale
Absence de gènes maternelle
MÔLE HYDATIFORME COMPLETE
�Faible incidence Pays du Nord • Europe : Amérique du Nord: 0,6 –1/1000 nces
• France: 1/1000 nces (800 cas /an)
�Forte incidence pays du Sud
• Sud-est asiatique: 3,2 - 9,9/1000 nces
• Afrique: 3,7 /1000 - 4,3/1000 nces
Incidence de la Môle
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Variable selon les régions (France: 50 à 100 cas /an)
� Sénégal 5 %
� Maroc (254 MHC) 6 %
� Congo (47 MHC) 18 %
� Afrique du Sud (112) 20 %
Incidence transformation MH en CC
Bouffetal et coll., 2010; Moodeley et coll., 2003; Moukassa, 1997
OBJECTIFS DE L’ ETUDE
Choriocarcinome
Maintien déséquilibre ?Evolution ?
Anomalies chromosomiques ?
Gains oncogènes/antioncogènes ?
Certains responsables ? transformation maligne
Immunité
Régulation anarchique d’autres gènes
Empreinte de type paternel
Môle
Caryotype diploïde
Tumeur greffée
MATERIEL ET METHODES
� Môles Hydatiformes (20)10 ADN, 10 coupes paraffine
� Choriocarcinomes post môlaires (47) 14 ADN, 33 Coupes en paraffines
� Lignées cellulaires choriocarcinome (3) BeWo JAR JEG
� Placenta normal 9 SA 10 SA 11 SA
MATERIEL D’ETUDE
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TECHNIQUES D’ETUDE
� ADN: CGH-array 244K
� Cultures cellulaires: caryotypes pour lignées
� FISH
� Coupes & immunohistochimie
TECHNIQUE DE CGH
�Technique de cytogénétique moléculaire:
Combine caryotype à la biologie moléculaire
�Analyse global du génome: visualise à la fois
anomalie CH (CNA, CNV) et moléculaire (profil du
génome par gain/pertes) avec faible résolution 1Mb
�Type puces:
1. Génome complet: 44K, 60K, 105K, 180K, 244K
2. 1 chromosome donné
3. Région dédiée: région d’intérêt, ADN
mitochondrial (30K)
Détection quantitative des signaux
Mesure rapport rouge - vert
CalculGains - Pertes
ADN test Marqué
Cy3 vert
ADN référenceMarqué
Cy5 rouge
Mélange équimolaire + ADN compétiteurcot 1
Lame microarray + oligonucléotidessynthétiques 60 mers n = 244 000 spots
Hybridation
Normalisationet
Segmentation
ADM2 Algorithm
Hybridation Génomique Comparée
Prénatal
• Malformations fœtales , SAE
• Cytogénétique : DPN, FCS, MFIU
• Caryotype anormal
� Postnatal = constitutionnel
�Tumeurs solides: cancer sein, chorioK…
� Retard mental idiopathique� Maladies psychiatriques: Schizophrénie…
Indications
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RESULTATS
CGH
� Môles: profils normaux. 10 mCGH
� Choriocarcinome de novo: anomalies
modérées. 5/11 mCGH ; 7/11 aCGH
� Lignées cellulaires anomalies 3/3
chromosomiques complexes
aCGH
M176+14q
aCGH
M26-18q
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aCGH
JEG
+5
-18
-8
+9q
-X+14q
+1q32
+20q+16q
FISH
M176
Sonde 14q32 (IGH-V) et 16q23 (MAF-R) Cellule avec
3 copies du 14 illustrant une trisomie du 14q32 et 2
copies normale du 16.
Trisomie 14
FISH Perte du 18
Sonde BCL2 / SERPINB2. 1 copie du 18
JEG
CNA (Copy Number Abnormalities) des choriocarcinomes par aCGH (partiel)
Tumeurs CNA Position (Mb), [ratio] LC CNA Position (Mb), [ratio]
+14q24.2q24.3 72.40-77.45 [1.20] JAR +5q23.2q35.2 121.69-174.48 [1.25]
+14q32.3q32.3 100.26-105.67 [1.23] -7q31.1q34 110.84-138.80 [0.67]
+17 - 8p23.1p12 7.25-36,32 [0.70]
+19 - 8q13.1q22.1 66.29-84.72 [0.6]
+20q 26.56-35.35 [1.27] - 8q21.1q22.1 84.72-96.49 [0.48]
M176 + 1p36.3p36.1 2.53-19.06 [1.24] +8q23.3q24.3 115.85-146.26 [1.25]
+1p35.3p34.1 29.56-44.84 [1.7] +9q32q34.3 115.26-139.30 [1.25]
+ 1p13.2 115.13-115.36 [1.3] -10p15.3q23.2 0.12-88.26 [0.73]
- 1q21.2 148.74-148.86 [0.72] -10q25.2q25.3 113.91-116.56 [0.51]
+14q 19.38-106.30 [1.5] -10q25.3qter 116.63-133.66 [0.74]
M232 -X -11pterp11.2 0.19-46.69 [0.75]
M26 +11q13.1 63.41-65.54 [1.25] +12p13.3 0.03-9.81 [1.35] (3)
-18q12.2q23 34.20-75.22 [0.75] +12p13.2p13.1 11.72-13.28 [2.3] (3)
+19p13.1 16.46-19.64 [1.22] +12p12.3 15.00-16.27 [2.1] (3)
M27(2) +11q13.1 63.47-65.55 [1.20] +12p12.3p12.2 18.89-20.50 [3.6] (3)
+12p12.2p11.2 20.83-31.62 [2.1] (3)
+12q12q13.1 37.37-44.71 [1.3] (3)
+12q13.1 52.33-52.67 [2.29] (3)
CNAs (126): CC 21, BEWO 27,
JAR 47, JEG 31
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+12p13.2p13.1
+14q24.3
+14q32.2q32.3
+16q11.2q24.3
-18q21.2q21.3
-18q21.3
+19q13.4
+20q11.2
-Xp22.2p21.3
-Xp22.3
+1p36.2p35.1
+1p35.3p34.3
+ 1p13.2
+1q21.2q23.1
+5p13.3p12
+5q23.2q35.2
+5q35.2q35.3
-8p23.3p12
-8q13.1q22.1
+9q32q33.1
11p14.3p12
+11q13.1
Régions minimales communes (MCR)
CNA (126): CC 21, BEWO 27, JAR 47, JEG 31 40 MCR
MCR et GENESMCR Position (Mb) Taille
(Mb)Gain
/PerteCC LC Gènes sélectionnés
14q32.2q32.3 <100,26-101,22> 0.9 G 2 2 DIO3 DLK1 RTL1
16q11.2q24.3 <45.05-88.69> 43.64 G 2 MMP2 MMP15
18q12.2q21.3 <50,15-59,79> 9.67 P 1 2
SERPINB2 PMAIP1 BCL2MBD2 MDEA TCEB3
19q13.1 3.6 G INSL3
19q13.4 <58.76-58.98> 0,22 G 1 3 DPRX ZNF33
20q11.2 <32,34-34,90> 2,5 G 1 3 PROCR MMP24 DNMT3B
Xp22.31 <7,25-7,37> 0.12 P 2 3 STS
Xp22.2p21.3 <12,57-25,24> 12.6 P 2 3 PRDX4
2 groupes de gènes:
• Métalloproteïnases: MMP2 MMP7 MMP9
MMP14 MMP24
• et leurs inhibiteurs: TIMP2² SERPINB2
• ²Gènes soumis Empreinte
ETUDE FONCTIONNELLEpar immunohistochimie
� Technique qui associe les principes
d’immunologie à l’histochimie
� Permet la détection d’un antigène
(protéine) dans un tissu donné grâce
à l’utilisation d’un anticorps
� Détermine marqueurs moléculaires
(membranaire, cytoplasmique, nucléaire, intercellulaire)
L’ IMMUNOHISTOCHIMIE
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� Utilisation des AC primaires
correspondants qui se fixe à l’Ag
� AC secondaire
� AC couplé à un traceur permet
de visualiser liaison Ag-AC
• Avidine biotine (vitamine H) ou
streptavidine biotine ou polymère Antigène
Anticorps I
Anticorps II
Biotine
Avidine
Peroxydase
Applications IHC
Multiples: anapath, cancérologie…
�Confirmation de certains diagnostics
�Prise en charge thérapeutique
�Valeur pronostic dans certains cas
�Permet une meilleure recherche
� Oncogène. Dégrade collagène IV, Clive KISS1
� Reproduction, développement embryonnaire, régulation vascularisation, réponse inflammatoire
� Plusieurs voies de régulation: TIMPs (TIMP2+), PTK œstrogène, progestérone
MMP2(Matrix metalloproteinase 2/72 kDa type IV collagenase/72 kDa gelatinase)
16q12.2
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Placenta Môle Choriocarcinome
x40M176x40M269x40
MMP2
Placenta 10 SA cytoplasme CTB+ Lame basale, MH + +, CC +++
CC M281x40 CC M176x40
MMP2
Choriocarcinome: marque Cytoplasme et membrane des CTB des villosités en prolifération , MEC
SERPINB2[serine proteïnase inhibitor /serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin)/ plasminogen activator-inhibitor 2/PAI-2)]
18q21.2q23
� Antioncogène,
� dégrade les proteïnases
� Contribution FCS + AP, rôle inflammation, immunité
� invasion tumorale
SERPINB2
Cytoplasme STB + microvillosités +++
Placenta x40 M176 x 40
Môle M114
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CONCLUSION
CONCLUSION (4)
� Maladie polygénique
� dérèglements géniques secondaires se superposeraient au déséquilibre génique initial des gènes soumis à empreinte parentale
� Modèle classique de cancer avec une signature génomique spécifique (empreinte et
miRNA)
Intérêt de présenter ce travail
Importations des techniques au Congo:
1. FISH2. Immunohisochimie
Poster
Poaty H. et al.
�Genome-wide High-Resolution aCGH
Analysis of Gestational
Choriocarcinomas. PloS one 2012, 7(1):
e29426
�Etude cytogénomique de la môle
hydatiforme et du choriocarcinome
gestationnels. Bull du Cancer 2012,
20(10) 1-17
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REMERCIEMENTS
A. Bernheim
P. Coullin
P. Dessen
AL Diata
E. Leguern
C. Gombé
D Carles
JF. Peko
A. Valent
S. Prevost
A. Ngolet
B. M Lebwaze
JY. Picard
MERCI A TOUS
Danse des Moyes à Tongo
Villosité œdémateuse
d’une môle partielle
Cordon
ombilicalFœtus
mortifié
(Kierszenbaum, 2006)
2323
Duplication SPZ → Môle complète homozygote 46,XX
46p
23
Fécondation Ovocyte II anucléé → Môle complète
hétérozygote 46,XX ou 46,XY
23
A
ou
Maturation ovocytedéfectueuse
23
23
23B 46p
46
D23
692323
23→ Môle partielle
69,XXX / XXY / XYY23
ou
Fécondation anormale
4623
2323
Môle complète biparentale 46,XX/XY ou partielleC
Mère mutation NLRP7
Présents dans 2 MCR au moins (hg18)et deux des critères ci-dessous
1. Expression dans le placenta
2. Implication dans développement embryonnaire /placentaire
3. Implication dans le cancer/apoptose
4. soumis à l’empreinte parentale
Critères de sélection des gènes
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BeWo
71-72,XXY,add(X)(p21-22), +1, add(1)(p36),+2,
-4,+5,-6, add(7)(p22),-11,-13x2, i(13q),-18,der(19)t(9;19)(q13;p13), +mar[cps16].
JEG
71-74,XXY,add(X)(p21-22),+2,+5, add(7)(p22), add(7)(q32),
+9,t(10;15)(p10;q10),-11,-13, i(13q),t(14;11)(q15;p13),
-18, del(18)(q22), +mar[cps21].
JAR
66-68,XXY, add(X)(p22),del(1)(p31), t(1;13)(p13;q14),
t(3;3)(q12;qter), add(4)(q22),+5, -8, del(8)(q22),-10,
add(11)(q10), der(13)(q11q34), add(17)(p12),-19,-21,
+mar[cps18]
Caryotype des lignées
3
1 1
2
3 3 3 3 3
3
3
2
2
1
3
3
2
3
3
1
3
0
1
2
3
4
5
6
7
1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 22 x
No
mb
re d
’éch
anti
llon
s
CC + CL
CC
Môle
CH
Chromosomes impliqués
CNAs (126): CC 21, BEWO 27, JAR 47, JEG 31
TIMP2
Chorio M281 x 40Placenta 9SA x 40 Môle M114x20
Placenta 9SA, cytoplasme CTB ++Môle et choriocarcinome. Négatifs
17q25.3