Modifications De L'Activité Contractile et de la Structure De Fragments Isolés Du Cceur Embryonnaire De Poulet Par Les Variations Quantitatives De La Composition Du Liquide Nutritif

-Archives Internationales de Physlologle, 1929. Vol. XKXI, Fose. 3

Requ le 22 Juillet 1929

MODIFICATIONS DE L’ACTIVITg CONTRACTILE ET DE LA STRUCTURE DE FRAoMENTS ISOL&S

DU CCEUR EMBRYONNAIRE DE POULET PAR LES VARIATIONS QUANTITATIVES

DE LA COMPOSITION DU LIQUIDE NUTRITIF

P A R

Giulio BUCCIARDI et Vincenzo BISCECLIE ( I i rs l i t z i t de Phvsiologie. Dir. Prof. A. ACCAZZOTTI. - lnstrtut de Palhologie

ginlrlzle. Dir. inc. Prof. V. BISCEGLIE. - Uirioeisifd dc Mod&).

(I 1 figures).

1 . - Introduction et but des recherches

N Ctudiant les modifications fonctionnelles e t structuraies des E fragments enleves au c e u r de l’embryon de poulet et soumis a l’action de substances radioactives, nous avons pu observer, entre autres, que l’acetate d’uranile 1 oio0, en solution isotonique, determine une exaltation de l’activite contractile des fragments isolCs pulsant en culture. L’addition de KCl 1 oleo en solution hypotonique provoque I’arrCt de l’activiti contractile des fragments isolks. Si a p r b 1’arrCt produit par KCI 1 O i o 0 , on lave immediatement le fragment avec NaCl 8.5 oio0, l’activite contractile rkapparait et l’on ne trouve pas d’altkrations de structure a I’examen microscopique ; mais si les fragments arrCtb par KC1 1 Oleo viennent a skjourner longtemps (24 h.) dans cette solution hypotonique, on voit apparaitre de notables alterations cytoplasmatiques.

Nous nous promettons d’evaluer soigneusement I’action des substances employies communkment dans les liquides de perfusion, avant tout dans le but d’.etablir si les doses considCrees comme optimales pour favoriser la contraction des cceurs adultes, le sont aussi pour des fragments du c e u r embryonnaire, e t accessoirement pour recher- cher quelle est la quantitk maximale qui, pour chaque substance, peut encore agir comme stimulant, quelle est au contraire la concentration qui empCche la contractilite, quelle est la concentration qui produit des alterations dans la structure du cytoplasme ou mCme dans le noyau des cellules qui se reproduisent sur le fragment du c e u r isole place en culture et enfin de quelle nature sont les altCra- tions structurales even tuelles.

Nous avons pris en consideration NaC1, KCI, CaC1, e t nous avons

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auss i CtudiC l’action d u (CH, CO,) UO, + 2H,O pour c o m p l i t e r 1’Ctude prCcCdemment commencCe et en p a r t i e publ ike sur l ’acktate d’urani le . .

2. - Modifications de la contractilith du coeur adulte sous l’influence des variations

du liquide nutritif

L’action du NaCl, du KCI et du CaCI, sur le coeur normal adulte est t r o p connue pour que nous nous y arrCtions en de“tai1. En gineral, les etudes antirieures ont ktk conduites dans le but d’itablir qualitativement e t quantitativement les substances aptes a favoriser la fonction contractile cardiaque (liquide de perfusion de Ringer, de Tyrode, de Locke, etc.). Plus ta rd , les auteurs, e n faisant varier les rapports des substances de perfusion et parfois en supprimant l’une d’elles, on t clierche par le nioyen de conditions anormales de nutrition, a mieux connaitre l’importance que chacune des substances des liquides nutritifs peut acquir i r vis-A-vis de I’automatisnie cardiaque.

ZWAARDEMAKER a i tabl i que dans le cceur de Pefrornyzon des solutions de 0.6 a 1 de KCl sont activantes, que des solutions a plus de 1.50/00 arretent l’activitk cardiaque. l l s’agit d’ i tabl i r si I’arrCt de I’activitk contractile cardiaque par de fortes doses de KCI est due A une action spilcifique de cette sub.;tance, ou bien est due A l a rupture de l’iquilibre entre Ca et K, fait qui, selon ZWAARDEMAKER, serait plus que suffisant pour determiner I’arrCt de la contraction cardiaque.

LIBBRECHT a observe, par I’addition de K, u n arret des contractions cardiaques sur un coeur qui avait ete plongk pendant quelque temps dans une solution privee de K (phknom2ne paradoxal).

WITANOWSKI, par I’abaissement de la concentration d u Na dans la solution de Ringer, a vu se manifester la mime action produite par l’augmentation du K (augmentation de la dose employke) ; e t a n o t i que les c ~ e u r s placis dans u n liquide pr ivi de K pulsent plus longtemps quand on abaisse la concentration du Na.

Puis WITANOWSKI a observe que par l’abaissement de la concentration du NaCl d a m la solution de Ringer, il est possible de supprimer la tendance du coeur

ZWAARDEMAKER a pu ktablir que les pulsations cardiaques atteignent leur opt imum quand le rapport entre K e t Ca est constant, e t que le ceur s’arrCte par la suppression du K ; mais que si l’on irradie par l’urane u n coeur arrCti par privation de K , ce cceur se remet a bat t re (loi de la substitution radioactive).

LOEB a vu qu’une nieduse qui a cesse de pulser dans une solution de CaCI,, recommence a bat t re si I’on augmente ou si I’on diminue la concen- t ra t ion du Ca.

COLLE a vu que I’augmentation de l a concentration du NaCl Cleve

la formation paradoxale de groupes.

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l’excitabiliti du myocarde ; et d’apres BOUKAERT e t COLLE, on a aussi une ilevation de I’excitabiliti en augmentant l a concentration du Ca. . S ~ I O ~ V I A L E , un cceur de grcnouille a r r i t e par une perfusion prolongee

de NaCI, se remet A battre par I’administration de citrate sodique. I1 a aussi observe qu’un c a w r perfuse au moyen de NaC1, reprend pendant un certain temps ses pulsations si I’on augmente rapidernent la concentration du NaCl ; e t dans les solutions oh le K et le Ca se trouvent en iquilibre, le coeur fonctionne niieux avec peu de NaCI. Dans d’autres experiences, VIALE, aprks avoir a r r i t i un c c u r , d a m une solution de NaCl et de CaCI,, a observe la r iappari t ion des pulsations e n faisant agir la solution pure de NaCI. De ces phenomknes, VIALE conclut que la variation rapide de la concentration d’url sel peut constituer u n stimulus efficace pour le c a m ,

3. - Modifications de la contractilitk du coeur embryonnaire par variations

du liquide nutritif

W. LEWIS a applique I’etude des variations quantitatives des conipo- sants du liquide d e perfusion au caeur embryonnaire de poulet. 11 a expi- riniente sur I’embryon de poulet de 72 a 77 h. d’incubation. Les cceurs, s i p a r k du reste de I’embryon, etaient places en entier dans de petites capsules de Petri, dans lesquelles on ajoutait peu a peu les differentes solutions nutritives ; et les niouvements du c a m etaient observes au microscope.

LEWIS a Ctudie I’action de la temperature e t a constate qu’a la temperature ambiante (229, les pulsations sont ralenties (6 a 10 par minute), mais qu’a 390 e lks atteignent 200 et davantage par minute. Quand les cceurs embryonnaires passent d’une temperature elevte de la capsule de Petri a la temperature ambiante de 220, les pulsations s ’a rd ten t , mais reprennent ensuite apres u n petit nombre de minutes; si on les place dans une autre capsule de Petri ii 280, les cceurs s’arrCtent de nouveau pour se remettre a battre, quelques minutes aprks ; puis remis dans u’ne capsule A 300, ils recoinmencent imm6diatenient A battre avec une grande friquence. Dans ces experiences, les capsules de Petri contenaient du liquide de Locke sans dextrose.

On peut resumer brievement de l a faqon suivante les modifications rencontrkes par LEWIS sur le c m r embryonnaire e n faisant varier la composition du liquide de perfusion :

10 5 parties de L.--d (Locke sans dextrose) e t I partie H,O avec NaCl 0.75 O i 0 , ne montrent aucune influence sur les pulsations cardiaques. Aprks t ransport du camr dans une solution plus diluie (2 p. L.--d et 1 p. H,O avec NaCl 0.6 %), on observe au debut une augmentation marquee du nombre des pulsations, puis une diminution graduelle pendant les 6 h. suivantes. Si le c m r est place dans une solution encore plus diluee (1 p. L . 4 e t 1 p. H,O avec NaCI 0.450,(,), il y a une augmentation iinniC-

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diate du nombre des pulsations de 25 a 20056, A laquelle fait suite une diminution rapide e t u n arret des pulsations.

20 P a r transport dans L -d plus concpntri que le liquide normal, il y a ralentissernent imrnidiat du nombre des pulsations et diminution de leur force.

30 Dans du NaCl pur 0.90:, il y a une notable accdi ra t ion au debut , A laquelle fait suite le ralentissernent, puis I’arret en 1 h. environ.

4 O Dan; L . 4 sans CaCI,, les pulsations diminuent e t s’arrCtent e n quelques minutes. Les pulsations reprennent si l’on transporte de nouveau le cceur dans L.-d.

50 Dans L.-d sans KCl, les pulsations s’accilkrent rapidement de 30 a 80%,, puis diminuent e t s’arr i tent aprks environ 1 h. ; il y a reprise des pulsations d a m L.-d.

60 Dans L . 4 plus KCl e n quant i t i supirieure a la normale (0.126% KCI), il y a riduction du qombre des pulsations. Mais les pulsations re- viennent a la frequence normale, si le coeur est rernis de nouveau dans L.-d ordinaire.

70 Dans L . 4 plus CaCI, e n proportion supirieure a la normale, le coeur continue ii battre pendant 4-5 h. ; au d i b u t le nombre des pulsations est normal conime dans L . 4 , mais diminue ensuite aprks 4 h.

Le nombre des pulsations revient A la normale, quand on immerge de nouveau le cceur dans L . 4 .

Les rksultats obtenus par LEWIS sur le c e u r embryonnaire ne sont pas toujours identiques a ceux des auteurs citis pricidemment e t opkrant sur le cceur adulte. Nous verrons quels sont les points de concordance ou de discordance avec les risultats exposks plus haut, que prksentent les recherches que nous allons exposer e t qui ont toutes CtC rialisies sur le coeur embryonnaire du poulet. Mais nous rappelons que nos observations ont porti, non sur les pulsations de l’organe entier, extrait de l’embryon, mais sur de petits fragments enlevis au coeur e t cul t ivb in vitro, de maniere a permettre l’ktude simultanie e t parallele des modifications de la contractiliti e t des modifications de structure, provoquies par les differentes solutions salines sur les cellules qui se forment en abondance tout autour du caillot dans ces fragments cardiaques deculture. Les rQultats obtenus precidemment par OLIVO sur les modifications de l’activiti contractile du cceur embryonnaire du poulet sous l’influence des sels de Ca e t de K seront rappel& e t pris en considkration dans l’exposk des risultats que nous avons obtenus avec les mCmes substances.

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4. - Modifications de la contractilitk de fragments du coeur embryonnaire cultivks in vitro

par variations de composition du liquide nutritif

Les fragments de cceur embryonnaire itaient cultivb in vifro en suivant la m&me technique que dans nos recherches prickdentes, publiies dans Arch.f . exper. Zellforsch., 1928, VII, 444483. La seule diffirence, c’est qu’en appliquant le fragment de cceur au couvre- objet de mica, on y ajoutait seulement du plasma de sang de poulet au lieu du melange de solutions physiologiques et de plasma de sang de poulet.

Comme pricidemment, nous avons eu soin d’inscrire par un signal Depretz, intercali dam un circuit Clectrique, au moyen d’un manipu- lateur interrupteur, le nombre des contractions dans 1’unitC de temps. Aprb achkvement des recherches fonctionnelles et immersion des diffirents fragments dans les diverses solutions salines, les fragments de tissu cardiaque itaient fixis au MAXIMOW-LEVI, et .color& a l’himatoxyline ferrique, en ayant toujours soin de maintenir les cultures a 380 (thermostat) jusqu’au moment de leur fixation.

Certains fragments cultivb depuis plusieurs heures (36)’ en pleine pulsation et en piriode de prolifkration, furent subdivisb en plus petites portions pour en faire ainsi des subcultures. Ces subcultures, plongies dans le plasma de poulet, continutrent a battre dans un premier temps ; a p r b quelques heures (36-40), alors qu’elles Ctaient en pleine prolifiration, elles furent de nouveau divisies, de maniere B fournir de nouvelles subcultures, qui ont servi a quelques recherches priliminaires que nous exposerons partiellement plus loin.

Nous exposons pour cela les rbultats obtenus avec des liquides de perfusion de composition saline variable sur les fragments provenant de ceu r d’embryon de poulet en pleine pulsation.

a ) L’activite’ contractile dans les solutions iqquilibre’es physiologique- rnent ( S . E.). - Parmi les diffirents liquides de perfusion qui con- tiennent Na, Ca et’K en certaine proportion, nous nous sommes servi comme liquide nutritif de la solution suivante, que QUAGLIARIELLO a trouvie pricidemment la meilleure pour l’irrigation du ceu r isoli des mammifkres : NaCl 8.5 Oleo, KC1 0.0750/00, CaCl, 0.1 Oleo. Nous n’avons pas employi NaHCO, destine A neutraliser les acides qui se forment dans la contraction musculaire prolongie, ni ajoutC de dextrose qui figure dans la formule ordinaire du LOCKE en proportion de 1 oleo.

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Les fragments de caeur embryonnaire en culture, plongQ dans le plasma de sang de poulet, mis sous le microscope immediatement apres l’addition d’une goutte de solution Cquilibrke ( S . E.). cessent brusquement de battre, puis reprennent leurs pulsations. Notons immediaternent que l’arrCt temporaire qui suit l’addition de la solution Cquilibrie est immidiat, ce qui montre que cet arrCt depend non d’une action spCciale des sels contenus dans S. E., mais est due B l’influence du changement de temperature ambiante. En effet, pour l’addition de la solution, le verre porte-objet a cuvette contenarlt le fragment de tissu pulsant, est retire du thermostat Pfeiffer A 380, oh il etait soumis l’observation microscopique et soumis pendant une ou deux minutes a la temperature ambiante (170), temps necessaire pour la manaeuvre de l’addition de la nouvelle solution.

Le passage soudain du tissu cardiaque d’une temperature optima (380) a une temperature infirieure, provoque immediatement l’arret, oh parfois seulernent l’affaiblissement, des pulsations. Quelque chose de semblable a dkja ete observe par LEWIS lors du passage d’un caeur embryonnaire de poulet d’une solution a une autre de temperature differente ; et il donne le nom de pkriode rkjhctaire 5 1’arrCt subit de la fonction cardiaque dans cette condition. Cet arrCt momentank des pulsations, nous l’avons observe chaque fois que nous devions porter un fragment de culture a une temperature inferieure a celle qu’il avait dans le thermostat, lors du changement du liquide de perfusion. Cette pCriode d’arrCt dure en ge‘neral 2 a 3 min, a moins que l’exposition a la temperature plus basse ne se prolonge au delh de 5 minutes et que la temperature exterieure ne soit trop basse. 11 est entendu que pour toutes les experiences dicrites dans cette note, les observations sur les modifications dues au changernent du liquide nutritif, ne tiennent pas compte de cette periode d’arrCt bref, d t au refroidissement de la culture, mais seulement des variations de l’activitk contractile, dependant certainement du changement du liquide nutritif. N’ou- blions pas de dire que la reprise des pulsations a p r b la pkriode d’arrCt due au refroidissement est rapide ; au debut, les pulsations ne sont pas Cgales B ce qu’elles etaient avant le refroidissement, elles se montrent d’abord plus faibles, mais augmentent graduelle- ment, et apres 20 a 30 secondes a p r b l’apparition de la premiere pulsation, la fonction contractile reprend comme avant, plus ou moins modifiie par l’influence du nouveau liquide nourricier.

Apres le changement de la solution nutritive et la remise de la

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culture sous le microscope au thermostat a 380, on peut avoir une reprise plus rapide de I’activitC contractile et des battements.

Ceci Ctant dit,passons a la description des resultats dus B l’addition de S. E.

Faisant abstraction du temps d’arrCt d i a la manipulation, nous pouvons dire que l’addition de S. E. provoque l’augmentation de I’activitC contractile. Les contractions des fragments qui pulsent deviennent plus Cnergiques e t plus frequentes. Mais cette action favorable ne doit pas &tre attr ibuie entikrement au contenu salin du liquide de perfusion, parce qu’une bonne part de l’augmentation de l’activite contractile est due certainement au seul renouvellement du liquide de perfusion. En ef.fet, si nous ajoutons une goutte de plasma de poulet a un fragment en’ train de battre, nous obtenons une augmentation, bien que plus legkre, de l’activitk contractile du fragment de culture.

Que l’augmentation produite par S, E. est superieure a celle due au plasma de poulet, est demontrk par la simple expirience suivante : en ajoutant une goutte de plasma de poulet a un fragment de culture anime de pulsation, on augmente l’activitk contractile. Si aprks quelques minutes, on ajoute une seconde goutte de plasma, aprbs la periode rifractaire, les con tractions reparaissen t, mais celles-ci ne sont augmenties ni en frequence ni en intensite par rapport a la premikre addition de plasma de poulet.

Enfin, si aprks avoir obtenu l’augmentation de l’activitk contractile par une addition de plasma de poulet, on ajoute au bout de quelques minutes S. E., on observe apres l’immanquable pkriode refractaire, une augmentation ultirieure nette de l’activite contractile.

Ces experiences prouvent que la S. E. contenant les sels de K, Ca, Na dans les rapports indiques precidemment, montre une evidente propriCtC d’activation des contractions des fragments de c a m embryonnaire, propriitt d’activation qui n’est pas due seulement au simple renouvellement du liquide de perfusion, car elle est nettement supirieure a celle qui s’observe par l’addition de plasma de sang d’animal de la mCme espkce. La plus grande activite des fragments isoles animes de battements e t nourris avec S. E. dure 1 a 2 h., puis elle diminue lentement e t gknkralement, aprks la troisikme heure, les fragments additionnks de S. E. pulsent comme ceux auxquels on a a jout i du plasma de poulet et parfois leur activitk

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contractile aprks la troisihne heure est plus faible que pour les derniers.

Une addition ulterieure de S. E. (aprks plusieurs heures) provoque toujours le meme phinomene, mais beaucoup moins marqui que la premiere fois et le temps de duree de l’augmentation de l’activiti contractile se rkduit et peut meme ne pas de‘passer 30 a 40 minutes.

Parfois on a obseive que l’addition de S:E. ranime les pulsations dans des fragments arrCtCs ; et aussi l’addition de plasma de poulet pe it retablir l’activite contractile de fragments qui ne pulsaient plus.

)ans la fig. 1, nous donnons un exemple demonstratif du fait que

A B FIG. I. - Frkquence des pulsations de fragments de c e u r embryonnaire

de poulet cultivis dans plasma de poulet ( A ) e t dans plasma de poulet + solution physiologique iquilibrie (B) . La ligne 1 indique la friquence des pulsations h la 1ge h.

I 2 I a 10 min. aprh plasma de poulet.

a 3 B II 20 S. E. pour B.

l’addition de S. E. provoque une augmentation de I’activitC contractile supe‘rieure ii celle que provoque la simple addition du plasma de poulet.

Cultures no 442.443. - Fragments du meme embryon, pulsations frCquentes e t vigoureuses. On ajoute une goutte de sang de poulet : augmentation de la frCquence e t de la force des contractions dans les deux fragments. A p r h 15 min., on ajoute a la culture no 442 une goutte de plasma de poulet ; a la culture no 443 une goutte de S. E. et on observe que la culture no 442 conserve la meme frequence e t .la mCme vigueur des contractions; la culture no 443 conserve sa

m 3 a 3 20 a 1 pour A.

4 temps en minutes.

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force de contraction, rnais prkente une beaucoup plus grande frCquence des contractions. Dans la fig. 1, la colonne A correspond ii la culture 442 et la colonne B a la culture 443.

En cherchant a interpreter ces premiers rCsu!tats, il semble nature1 d’attribuer au renouvellement du liquide nutritif les meilleures conditions qui permettent I’augmentation de l’activiti contractile du fragment cardiaque. Le fait que l’addition de S. E. produit une augmentation de I’activitC contractile supirieure A celle qui suit l’addition de plasma de sang de poulet ne doit pas nous surprendre, car chacun peut admettre que le sang de poulet est Ie mieux adapt6 p ur nourrir les fragments de cceur embryonnaire de poulet, ceux-ci contenant certainement les substances n&ss&es qualitativement et quantitativement en Cquilibre.

L’augmentation plus forte due a l’addition de S. E. doit Ctre attribuie a la petite diffirence de la concentration saline entre les deux liquides nutritifs, et a p r b l’action de S. E. le ceu r fortifie davantage ses contractions par le mCme principe dCjh rencontrk chez le cceur adulte, en vertu duquel un changement brusque de la concentration d’un ou de plusieurs sels du liquide nutritif peut agir comme une stimulation efficace du cceur.

b) L’actiuite’ contractile en sdution hypehniqrre. - Outre NaCf 13 O/m, la solution hypertonique employee dans cette serie d’expi- riences contient : KCI 0.50 Oleo, CaCl, 0.65 “loo ; par consiquent dans cette solution K et Ca se trouvent en concentration 6.5 fois plus grande que dans la S. E employee pricedemment.

Aprb la cessation de la periode d’arr&t habituelle,,due a la manipulation, le fragment de cceur, a p r b l’addition de la solution hypertonique, se remet rapidement a battre avec une plus grande force et une plus grande friquence.

Les fragments a pulsations, laissk dans la solution hypertonique, continuent battre fortement pendant plusieurs heures (generale- ment 2), puis diminuent la frkquence et la force des contractions, qui persistent encore aprks 36 h., mais faiblenient.

Quand a p r b 40-48 h., les fragments battent, on a parfois une reprise partielle de l’activite contractile, par l’addition d’une goutte de S. E., mais le plus souvent, les fragments qui ont fonctionni pendant longtemps en solution hypertonique et qui sont a r r & t b depuis plusieurs heures, restant plongis dans la solution hypertoni-

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que, ne se remettent pas A battre ni par addition de S . E., ni par celle de solution hypertonique.

L’addition de solution hypertonique h un fragment en pulsation, qui n’a encore subi aucun traitement, y dCtermine une augmentation de I’activitC contractile supirieure ii celle que produit l’addition de S E. Ce fait dCmontre bien comme ies experiences du mCme type

donnkes en exemple dans le paragraphe prCcCdent, que l’addition de S . E. provoque un renforcement de I’activitC contractile plus grand que celui qui est dii h l’addition de plasma de poulet. Nous en donnons en dktail un exemple :

Culture no 456. - Caeur embryonnaire de poulet de 8 jours d’incubation. Fragment en culture depuis 6 h. Le fragment pulse quasi en entier ; les contractions sont pour la plupart Cnergiques, parfois cependant 1Cgkrement plus faibles et se suivent h intervalles de temps riguliers. On ajoute une goutte de S . E. Aprb 8 min., l’aire des pulsations est Cgale en extension a celle du dCbut, mais la friquence est augment&. On remet la culture au thermostat. Aprb 15 min., on ajoute ii nouveau une goutte de S . E., et l’on observe au microscope que cette nouvelle addition de S . E. n’a a p r b 20 min. produit aucun changement de rythme, de friquence, ni d’Cnergie des pulsations. On remet la culture dans le thermostat. Aprb 24 h., le fragment pulse encore, mais plus faiblement, et avec une moindre friquence, toujours rythmiquement. Aprb 48 h., le fragment pulse encore, mais trks faiblement et d’une fagon arythmique ; h de brkves pCriodes de faible activitC contractile s’intercalent de longues pCriodes d’arrkt. Aprb 56 h., le fragment ne pulse plus. A la 65e h., on ajoute une goutte de S . E. et ii la 6 6 e h., une goutte de solution hypertonique, sans que les pulsations reprennen t .

Culture no 459. - C a m embryonnaire de poulet de 8 jours d’incubation. Fragment cultivi pendant 6 h. Le fragment pulse en entier ; contractions Cnergique, rCgulikres et rythmiques. On ajoute une goutte de S . E. Aprb 8 min., le fragment pulse, en entier, mais plus Cnergiquement et plus frequemment qu’auparavant. Aprks 15 min., on ajoute une goutte de solution hypertonique et l’on observe qu’aprb 20 min., le fragment pulse encore plus Cnergiquement et avec une plus grande frCquence. La reprise des contractions apres la pCriode rifractaire a eu lieu dans ce cas 4 min. aprks que la culture

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avait etk remise dans le thermostat de Pfeiffer a 380. A p r b 12 min., le fragment pulse avec une plus grande vigueur et plus frequemment. A p r b 24 h., le fragment pulse faiblement et d’une faGon arythmique. Aprbs 36 h., i l est arrCte. Aprb 48 h., le fragment est toujours arr&te et ne peut se remettre a battre par addition, soit de solution hypertonique, soit de S. E.

Dans la fig. 2 sont rapportes en partie les exemples cites plus haut, en tant qu’ils servent a demontrer l’influence ulterieure activante

A B FIG. 2. - FrCquence des pulsations de fragments de c a m embryonnaire de

poulet en solution tquilibrte physiologiquement (A), et en solution hypertonique (B) .

Ligne 1. FrCquence des pulsations dans les conditions normales. - n 2 n Y 8 rnin. apres S. E. n 3 P H 20 1) un autre S. E. pour A. n 3 n 1) 20 )I solution hyperton. p. B.

d’une solution hypertonique sur les contractions d’un fragment cardiaque deja active par une addition precidente de S. E.

La colonne A de la figure 2 se rapporte a la culture 456 ; la colonne B a la culture 459.

Sur quelques fragments qui s’itaient arr&tis a p r b une breve pe‘riode d’activite, l’addition de la solution a provoqui, dans 3 cas sur 7, la reprise de l’activite contractile.

Dans l’interpritation partielle des rbultats obtenus dans ce cycle de recherches sur l’action des solutions hypertoniques, on observe que par l’addition de solutions hypertoniques, on obtient une augmentation de l’activiti contractile plus Forte que celle qui se montre par

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I’addition ultkrieure de S. E. ; et en se rapportant a ce qui a dkja CtC observe, c’est-a-dire que les yariations rapides des concentrations salines de perfusion constituent un excitant de l’activite contractive, peut-Ctre peut-on dire que le stimulus exerce par la solution hypertonique est plus fort que celui produit par S. E., par le simple motif que la difference de la concentration saline entre le plasma de poulet e t la solution hypertoniqne est plus forte que celle entre le plasma de poulet et S . E. En effet, il n’y a pas a supposer que le fragment pulse mieux en solution hypertonique parce qu’il se trouve dans de meil-

. leures conditions nutritives pour son bon fonctionnement, mais il est vraisemblable que la plus forte stimulation risulte de la plus grande difference entre les constituants des liquides de nutrition. Et que l’activitk contractile plus grande n’est pas due a de meilleures conditions de nutrition, est dCmontrC par le fait que les cultures nourries par des solutions hypertoniques s’arrCtent plus vite que celles qui sont nourries avec S . E. Si les conditions de nutrition en solution hypertonique etaient plus favorables, certainement le fragment devrait pulser plus longtemps dans la solution hypertonique que dans S. E. ; au lieu que le fait que les pulsations sont plus breves et plus fortes en solution hypertonique seulement pour une piriode de temps assez courte (1-2 h.) doit-Ctre attribuk uniquement a un stimulus temporaire, comme il a deja Cte dit.

Nous avons observe qu’apres la seconde heure, en general les pulsations des fragments isoles diminuent de force et de frkquence dans les solutions hypertoniques et continuent pendant 36 h. e t aussi plus longtemps a se contracter, il est vrai plus faiblement ; ce fait montre que K, Ca, Na, en concentration notablement plus tilevie que dans les conditions normales, ne compromettent pas serieusement ‘l’activitk contractile, dans les cas bien entendu, comme nous l’avons vu plus haut, ou Ca et K, malgrk leur augmentation, conservent toujours le m&me rapport proportionnel.

Ces r&ultats ne confirment pas ce qu’a avancC LEWIS, suivant lequel, le c a m embryonnaire dans L-d, plus concenfrk, ralentissait immidiatement la frequence de ses pulsations e t diminuerait leur force contractile.

LEWIS a emply6 L--d 1.6 e t 2 fois plus concentre que la normale (NaCl 12 “loo ; CaCL, 0.32 O!oo ; KCl 0.56 Oleo ; NaHCO, 0.16 “loo) e t (NaCI 16 “loo ; CaCI, 0.48 “loo ; KCl 0.84 O/oo ; NaHCO, 0.20 Oleo). Dans nos experiences, nous avons employe des proportions assez

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diffkrentes dans les composants du liquide de nutrition. I1 reste h voir si la diffirence de rCponse au liquide de nutrition plus concentre qui s’observe entre nos experiences et celle de LEWIS, doit &tre attribuCe a cette diffkrence entre la concentration proportionnelle des sels, ou bien a la presence dans le liquide de Lewis du NaHCO,, qui est absent dans la solution hypertonique de nutrition que nous avons employee.

c) L’activitk contractile en solution isotonique +KCI. - Dans la preckdente note, nous avons dCja CtudiC l’action du K en solution hypotonique (H,O) sur 1’activitC contractile et nous avons observe que KCI 1 oleo dCtermine un arrCt irnmidiat des contractions dans un fragment cardiaque. Les contractions rkapparaissent apres lavage de la culture avec NaCl 8.5 “loo.

OLIVO, dans ses recherches, se rapportant A la diffirentiation des myofibrilles, dans 1’Cbauche cardiaque de l’embryon de poulet cultivC in vitro, indkpendamment de l’activite fonctionnelle, a obtenu des rbultats en partie pareils aux n6tres. En effet, OLIVO, dans toutes les Cbauches cultivkes avec K, a pu constater que les phino- mknes d’accroissement ne sont pas arrCtCs ; le seul inconvenient Ctait une vacuolisation trouble qui s’observait dans le protoplasma tant des cellules CmigrCes que dans les cellules du coagulum. Les Cbauches cardiaques dont il a CtC question, cultivies pendant quelques jours en prbence de KCI, se remettent a pulser si on les lave a la solution physiologique.

Nous avons cependant observC des vacuolisations et avons noti egalement des altkrations morphologiques plus marqukes que de sim- ples vacuolisations. Mais comme il pouvait subsister le doute que ces altkrations dkpendraient non de la trop forte concentration de K, mais de l’hypotonie de la solution, nous avons cru opportun de repi- ter les essais avec KC1 1 “loo, dissous dans NaCl 9.5 “loo et eau.

En relation avec les recherches sur ce cycle, nous avons observe que les solutions isotoniques contenant KCI en grand excb (1 “loo) provoquent une augmentation initiale rapide de 1’activitC contractile, qui diminue a p r b 10-15 minutes; les contractions plus faibles se constatent au microscope aussi a p r b 40 a 60 minutes (contractions dissocikes), ensuite le fragment s’arrete.

Si immediatement apres I’arrCt des pulsations, on lave le fragment avec NaCl 8.5 “loo, il se remet a battre ; nous avons notC la reprise de

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I’activite contractile dans un cas sur trois apres addition de KCI 1 oleo en solution isotonique, 35 minutes apres I’arrtt par un lavage au NaCl 8.5 oleo.

Plus il s’icoule de temps apres I’arrCt, plus difficile est la reprise de I’activite contractile, soit par addition de CaCI,, soit par lavage au NaCl 8.5 o/oo, et apres 7 h . d’arrCt, l’addition de ces solutions reste certainement sans effet. La fig. 3 en montre un exemple.

FIG. 3. - Action d’un exch de KCI sur la friquence des pulsations de fragments isolks de caeur embryonnaire de Foulet. Ligne 1. Friquence des contractions dans les conditions notmales.

1) 2 11 )) 8 min. aprb NaCl+ KCI. ’) 3 1; n 25 )I I1

)I 5 1) 11 aprh addition de CaClz )) 6 . n n aprPs lavage au NaCI.

)) 4 n >I 65 n n

)I 7 temps en minutes.

Culture no 471. - Embryon de 5 jours d’incubation. Fragment cultivk depuis 13 h. Le fragment ne pulse que dans une partie. Les contractions sont fortes et assez rythmiques. On ajoute une goutte de solution isotonique NaCl 8.5 oio0 + KCI et 6 min. a p r b l’addition de cette solution, on observe que l’aire contractile a diminue ; mais alors que la force de la contraction est restee presque invariable, la friquence a augment6 et le rythme est devenu variable, des periodes de pulsations frequentes alternant avec de brefs arrCts. A p r b 35 minutes, le fragment pulse encore, mais l’aire pulsante est encore plus riduite, la force et la frequence sont notablement dimi- nukes, les piriodes d’activitk sont raccourcies, les piriodes d’arrCt allongees. Aprb 65 minutes, le fragment ne pulse plus. Apres 8 h.,

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on ajoute une goutte de CaC1, 1 O/oo en solution isotonique, mais sans rbultat. Aprb 9 h., on lave abondamment avec la solution isotonique de NaCl 8.5 O I W , sans observer la moindre contraction.

Les modifications structurales rencontries apres l’action du K seront dicrites plus loin. A present, prenant en consideration les rbultats obtenus avec K sur l’activite contractile, nous observons qu’a la dose de 1 0iW, le KCI peut &tre certainement considiri comme un inhibiteur de l’activite cardiaque.

En comparant ces rkultats avec ceux qu’a obtenus ZWAARDE- MAKER sur le cceur de Petromyzon addte , nous voyons de suite que la sensibilite‘ au K est plus forte chez le ceu r embryonnaire du poulet, ou tout au moins sur les fragments de cceur embryonnaire de poulet cultive in uitro. Le K en effet a sur eux une action dkprimante a la concentration 1 0lW, tandis qu’au contraire, sur le cceur de Pefro- myzon adulte, le K 1 Oleo est encore activant.

Ces risultats sont d’accord avec ceux de LEWIS, qui a observe, comme nous l’avons dit prkcedemment, que le cceur embryonnaire de poulet plonge‘ dans L.-d+KCI, en quantiti supirieure a la normale, diminue le nombre des pulsations, et revient au nombre normal de pulsation, si on le replace dans L-d.

Au contraire, le fait de rkcuperer l’activitk propre contractile peu de temps apres I’arrCt par KCI, tend i indiquer que la perte de fonctionnement du c a w est proprement due a l’action specifique du K qui altere la structure citoplasmatique, d’abord lkgkrement, puis a la longue, d’une fagon irreparable. Rappelons en effet nos experiences avec le radium, demontrant qu’un cceur arrCtC par K et lave immediatement a p r b par NaCl 8.5 elm, se remet a battre, et que sous I’action du radium, l’activiti contractile se developpe plus vivement qu’auparavant, tandis qu’au contraire, apres une action prolongie du K, on n’observe aucune reprise de la fonction pas l’irradiation au radium.

d) L’activite‘ contractile en solution isotonique+CaCI,. - Nous avons experiment6 I’action du Ca. en concentration superieure, wmme pour K, et aussi en concentration moindre, mais toujours superieure a celle du Ca dans les liquides nutritifs normaux.

Etudiant d’abord I’action de l’augmentation de concentration de Ca (NaCl 8.5 “loo + CaCl, 1.25 oleo), nous avons observe qu’aprb une trb breve periode intiale ou l’activite contractile augmente, on

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a une diminution ultkrieure et un arrtt de l’activitk fonctionnelle au bout d’environ 10 minutes. Si immediatement aprks I’arrCt, on ajoute une solution de K, ou si on lave avec NaCl 8.5 on peut avoir une breve reprise de l’activitk cardiaque, mais qui cesse en quelques minutes, et ne reparait ni par une addition ultkrieure de K, ni pas des lavages ultkrieurs au moyen de NaCl 8.5 Oleo.

Le mkme phinomkne s’observe si on emploie une.solution contenant Ca en concentration moindre (NaCl 8.5 “loo + CaCl, 1 Oleo) ; mais avec cette solution, l’activitk contractile augmente plus fortement et se prolonge pendant 15 & 20 minutes, et quand survient 1’arrCt des contractions, on a une plus forte reprise par l’addition de K, et la reprise est plus durable par un lavage ultkrieur au moyen de NaCl 8.5 oleo.

En employant une solution contenant Ca en quantitk encore plus faible (NaC1 8.5 Oleo + CaCl, 0.85 O / o o ) , on obtient un tableau presque semblable, mais avec une plus forte augmentation de l’activitk contractile qui se prolonge encore davantage (environ 25 min.) ; et a p r b I’arrCt, le fragment montre une plus grande sensibilitk vis-a-vis de l’addition de K.

Nous donnons dans la fig. 4 un exemple des expkriences exkcuties avec NaCl 8.5 “loo + CaCl, 1 Oleo.

Culture no 492. - Fragment de cax r embryonnaire de poulet de 5 jours d’incubation, en culture de 14 h. Le fragment ne pulse que dans une aire limitee. Les contractions sont assez fortes a pkriodes d ’activitk (contractions assez frkquentes et rythmiques) alternant avec des pkriodes de repos. On ajoute une goutte de solution NaCl 8.5 Oleo + CaCl,. Aprb 4 min. les contractions de l’aire pulsante sont plus fortes, rythmiques et les pkriodes d’activite‘ a pulsations plus frkquentes, alternent avec des pkriodes de repos plus courtes. Dans d’autres parties du fragment, s’ktablissent peu & peu de faibles et rapides contractions dissocikes. A p r b 12 minutes, le fragment prQente des contractions plus faibles et moins nombreuses, limitkes & l’aire pulsante et alternant avec des arrkts plus longs. Aprb 19 min., arrkt complet. On ajoute une goutte de solution NaCl 8.50/, + KCI 1 0lw. Apres 3 min., on note l’apparition de quelques contractions faibles et Tares. Apres 7 min., il y a de nouveau arr&t complet. On lave abondamment le fragment avec NaCl 8.5 oleo,. Aprb 2 minutes, apparition de pulsations fortes et lentes, rythmiques, sans interrup-

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tions, dans la zone qui battait au debut. Apres 4 minutes, contractions microscopiques et dissociies dans d’autres zones. Le fragment bat pendant 25 minutes, puis s’arrete.

FIG. 4. - Action d’un exces de CaCls sur la frkquence des pulsation de fragments de coeur embryonnaire de poulet. Ligne I. Frkquence des contractions A la 14‘

1) 2 1’ )) 4 min. 1) 3 >) >I 12 )J 4 1) 19 )) 5 )I )I 3 )) 6 )I 11 7 .

h. apres NaCl + CaC12.

)) NaClf KCI.

)J

)I 11

)) 7 )I )I 20 min. a p r h lavage au NaCI. )I 8. Temps en minutes.

Les alterations de structure rencontrees apres action de Ca seront decrites plus loin. Si nous considerons les risultats obtenus concernant l’activiti contractile, nous observons que l’action du Ca est presque semblable a celle du K. I1 faut observer seulement, qu’en augmentant proportionnellement la quantit i de Ca e t ,celle de K, en conservant toujours le meme rapport entre les deux substances, comme dans S. E., nous voyons que Ca manifeste une action inhi- bitrice plus forte a des doses relativement infirieures a celles du K. Et, avant tout, cela peut faire demander si cette occurrence doit Ctre mise en relation avec le fait que dans la solution initiale CquilibrCe il y aurait alteration du rapport entre Ca et K. En effet, il est difficile d’expliquer autrement cette inhibition plus grande due au Ca par rapport au K, qui laisse en chaque cas inaltkree l’isotonie de la solu-

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tion ; et cela aussi parce qu’aprks que le fragment a cesse de battre par action de K, nous voyons que par l’addition d’une quantiti adequate de calcium (immediatement aprks l’arr&t), le fragment se remet ii battre pendant un certain temps, alors qu’au contraire, si le caeur s’est arr&tC sous l’influence du Ca, l’addition d’une quantitk adequate de K ne fait reprendre les pulsations que pendant peu d’instants. Ce fait tend 21 dimontrer que le sejour dans le Ca a provoque dans le complexe cellulaire des altiration plus graves que celles du K, ou au moins plus fortement incompatibles avec le fonctionnement.

Nos resultats ne concordent pas avec ce que LEWIS a observe sur le caeur embryonnaire du poulet, battant en entier. En ajoutant CaCl, 0.75 oleo a la solution de LOCKE, il a observe une diminution de la force et de la friquence des pulsation, seulement a p r b 4 h., et il a constati que les pulsations redevenaient normales si le c a m Ctait place dans L.-d.

LEWIS a employe une solution lbggkement plus diluke de CaCI, que celle dont nous avons use‘, mais nous ne croyons pas que cette seule difference, assez faible en vCritC, suffise a expliquer la discordance des faits qui elle est sirieuse. Nous croyonsplutdt que la duree plus grande de l’activite contractile, observk dans les experiences de LEWIS, par I’addition de fortes quantitb de Ca, doit s’expliquer par le fait que LEWIS ajoutait du CaCl, ii des solutions contenant dija K, tandis que nous avons ajoute CaCI, B des solutions de NaCl pur, absolument privies de K.

I1 est interessant de comparer nos rbultats sur I’action du Ca avec ceux d’OLIvo. OLIVO, ajoutant CaCl, a la solution de Ringer avec laquelle il nourrissait des cultures de fragments de caeur embryonnaire de poulet, a constate que les ceurs d’embryons de 2 h 3 jours d’incubation ne se comportaient pas de la mCme fagon que ceux de 4 a 12 jours. Chez les derniers, l’addition de Ca provoque d’une fagon absolument constante la dissociation complbte de l’activitk contractile, tandis qu’on n’observe pas ces petites contractions dissociees sur les embryons de 2 h 3 jours, ni sur les embryons n’ayant pas atteint le stade de 11 a 12 somites (a myofibrilles non encore developpies). OLIVO, ayant constate que mCme sur des caeurs embryonnaires adultes cultiv6s pendant longtemps in vifro et chez lesquels les myofibrilles ont disparu, on n’arrive pas A determiner par Ca, des contractions dissociees, suppose que ces contractions microscopiques dissocikes sont dues h l’activiti des fjbrilles. OLIVO a rencontrk quelque chose de semblable sous l’in-

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fluence de K, ce qui surtout I’a conduit 5 adrnettre le dualisme fonctionnel de l’activiti cardiaque.

Nous exarninons plus loin l’influence que peuvent avoir le sarcoplasrne e t les rnyofibrilles sur la contraction.

En ce qui regarde I’action initiale stimulante ou deprirnante du Ca sur l’activite synergique du caeur (suivant les doses, la durke de l’action et les cornbinaisons entre Na et K), les resultats d’OLIvo sont tres sernblables aux n6tres.

e) L’activite‘ contractile en solution hypotonique. - Nous dirons peu de chose sur l’influence exercke sur l’activitk contractile par la diminution de la proportion centisimale des sels dans les liquides de nutrition, car nos recherches confirrnent en grande partie les resultats connus sur l’action des solutions hypotoniques sur le c e u r ernbryonnaire pulsant in toto.

En dirninuant la concentration de Na, K et de Ca, dans tous les cas, laissant de c6tC la pkriode initiale refractaire due au changernent de temperature inherent a la manipulation, on constate une augrnen- tation initiale plus ou moins marquee et plus ou moins durable dans la force e t la frequence des pulsations, a laquelle fait suite une periode de depression. Les fragments qu i battent en solution hypotonique arretent leur activite bien avant ceux qui battent en S. E., mais ils reprennent leur activite, cornrne normalernent, si peu de temps apres l’arret,on ajoute au liquide hypotonique de perfusion le sel ou les sels rnanquants, de rnaniere a rCtablir la concentration de la solution e t a la rendre egale a celle qui a ete Cquilibree.

Nous avons, cornrne LEWIS, note une difference nette du cornpor- tement des pulsations en cornparaison de l’action des solutions privees de Ca ou de K. Pour LEWIS, dans L.-d-Ca, les pulsations dirninuent immkdiatement et s’arrCtent au bout de peu de minutes, et dans L.-d-K, les pulsations montrent une augmentation immediate e t des plus nettes de leur frequence e t de leur force et le c a m continue & battre pendant plusieurs heures. Par contre, nous avons observe que sans Ca, les fragments cardiaques continuent a battre pendant 30 a 60 minutes ; et souvent on observe aussi par addition de S. E., prive de CaCI,, une legere augmentation initiale, e t la meme chose s’observe ayec S . E.-K.

Dans un essai (culture 504), ou l’on avait dirninui la concentration de NaCl e t augrnente proportionnellernent la quantit i de KCI e t

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de CaC1, (NaC1 4.50/,,, KCl 0 , 1 6 0 / ~ , CaCI, 0,2 “loo), nous avons observe une augmentation de l’activitk pendant environ 3 h., mais ensuite l’activitk contractile diminua et l’arrkt dkfinitif se produisit au bout de 7. h. et 30 min. Le cceur se remit ii battre apres lavage abondant au NaCl 8.5 oio0 et addition ulterieure de S. E. La fig. 5 correspond a cette observation de la culture 504.

FIG. 5 . - Action d’une solution hypotonique sur la friquence des pulsations de fragments de coeur embryonnaire de poulet. Ligne I. Frequence des pulsations apres 16 h.

)) 2 )) n 10 min. a p r b solution hypotonique. 1) j )) 11 5 h. n n )) 4 )I )I 8 h. n n )) 5 I1 n S. E. I) 6. Temps en minutes.

f) Action de Z’urunium sur l’activite’contractile. - Dans la note prC- cedente, de‘crivant les rhultats obtenus avec I’acCtate d’uranile, nous avons entre autres observe que I’acCtate d’uranile 1 Oleo, en solution isotonique NaCl 8.5 Oleo, ravive I’activitC contractile des battements de fragments de cceur embryonnaire de poulet cultivb in vitro. Cette action vivifiante de l’uranium commence a se manifester 5 h 10 minutes a p r b I’application et l’optimum d’action de la solution d’uranile 1 oleo se montre 15 a 25 minutes a p r b le debut de I’application.

Nous developperons plus tard les recherches sur I’action de I’uranium. Voici les risultats obtenus jusqu’a prbent :

l o En premier lieu, nous avons e‘tudiC l’action de solutions concentrees d’acetate d’uranile et nous avons employ6 une solution

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d’acetate d’urane 2 Oleo dans NaCl 7.5 Oleo. Apres addition de cette solution, le fragment qui bat cesse immediatement ses contractions et ne les reprend plus si on le maintient dans le liquide contenant une aussi forte proportion d’uranium. Au moment o i ~ , apres l’addition, le fragment cesse de battre sous I’action de I’uranium, l’observateur qui suit le phenomene au microscope, a I’impression que le coagulum se retracte sur lui-mCme et qu’il devient moins transparent, comme si I’arrCt se produisait en position de contracture exagCrCe.

Un abondant lavage au CaQ, 8.5 O/,,,,, pratique peu de temps a p r b I’arrCt, fait reparaitre I’activite contractile ; et I’addition ulterieure de S . E., ou mCme de solution hypertonique dans laquelle on a:aug- mentC lkgbrement et proportionnellement a la fois K et Ca, produit une augmentation de I’activite contractile.

La fig. 6 donne un exemple de ce type d’experience.

FIG. 6. -- Action des solutinns d’acitate d’uranile 20/110 sur la friquence des pulsations de fragments de cwur embryonnaire de poulet. L i p e 1. Friquence des contrxt ions 1 la 2.Y h.

I1 2. )I ), 6 inin. ;iprPs uraniuni. ” 3 )I 11 apres S. E. )I 4. Temps en ininutcs.

Culture no 523. - Fragment de cceur en culture depuis 23 h. , pulsant en entier avec force et frequence. L’addition d’une goutte de solution de NaC17.5 Oio0 + acetate d’uranium 2 Oio0 produit I’arrCt des pulsations. Le lavage au NaCl 8.5 oleo et I’addition d’une goutte de S. E. fait reparaitre les pulsations.

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20 Dans d’autres ipreuves oh la concentration de I’urane etait inferieure a 2 “loo (1.75 Oleo a 1 .SO 0ioo) on obtient un rapide reveil initial de I’activite contractile, qui est rapidement suivi d’une diminution, puis de I’arrCt. Cependant, I’activite contractile dure plus longtemps aprks addition d’acetate d’urane 1 S O que par I’acetate 1.75 oio0.

30 Avec les solutions d’uranium 1.20 oleo, la periode d’activite augrnentee est assez longue (12 a 15 minutes) e t encore plus longue la conservation de I’activite fonctionnelle (2 a 2.5 h. et davantage).

en solution NaCl 6.5 o/oo, on obtient une augmentation de l’activite contractile moindre qu’avec I’acetate d’uranium 1 Oleo en solution NaCl 8.5 Oleo.

50 De plus, les solutions d’acitate d’uranium, 0.500/00 dans NaCl 4.5 Oleo renforcent beaucoup moins I’activiti contractile de fragments en pulsation que ne le font les solutions d’acetate d’uranium 1 oleo dans NaCl 8.5 oleo. Mais I’action de I’acetate d’uranium 0.50 Oleo est bien plus forte, quand NaCl atteint 8.5 Oleo.

De ce qui precede on peu conclure que l’acitate d’uranium a une action beaucoup plus favorable sur l’activite contractile, quand on I’ajoute en solution avec NaCl 8.5 oleo. g) Considerations generales sur l’activite contractile. - Les modi-

fications de l’activite contractile que nous avons rencontrees dans les fragments de c e u r embryonnaire de poulet cultives in vitro e t pulsant, quand on faisait varier les constituants du liquide de nutrition, se prCtent a plusieurs considerations, particulikrement si on les compare avec les modifications observkes par les autres auteurs dans diverses conditions experimentales.

10 En premier lieu, du complexe des rttsultats obtenus, il ressort de toute evidence qu’un changement brusque de la concentration saline, soit en moins, soit en plus, du liquide de nutrition (S. E.), provoque une augmentation rapide de I’activiti contractile. L’activite contractile des fragments est stimulee par les variations des constituants du liquide de perfusion, comme on I’a presque toujours trouve pourle c e u r adulte et intact, aussi bien si la nouvelle solution est une solution appropriee, tonique ou activante, que si cette solution est inadaptee a la fonction e t mCme se montre a la longue deprimante.

La difference d’action entre les liquides deprimants et activants ne se montre pas immkdiatement sur I’activite cardiaque, mais

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seulement apres un certain temps, parce que d’abord en general, si l’on excepte les cas ou le nouveau liquide ne peut en aucune faGon permettre le fonctionnement, on a une augmentation de I’activite contractile, e t l’action excitante ou deprimante de la nouvelle solution ne se montre qu’apres la periode initiale d’excitation. On comprend a priori que pour les divers types de groupement des sels et pour les differentes concentrations, on a de tres fortes differences qui se manifestent, tant dans l’energie des contractions, que sur leur frequence et sur leur rythme et sur la dure‘e de I’action. En cffet, alors que nous avons vu pour certains liquides, une periode initiale d’excitation tres breve, suivie immediatement par la depression et l’arret des contractions, pour d’autres liquides (solutions hypertoniques), nous avons vu persister a la longue une plriode d’activite‘ plus forte ; dans d’autres encore (S. E.), la periode d’activite augmentee est caracterisee par une augmentation plus modere‘e, mais l’activite fonctionnelle persiste encore plus longtemps.

Au debut de ces recherches, nous nous itions propose de tracer des graphiques e t des tableaux indiquant I’action differente com- paree des differents liquides nutritifs sur l’activite fonctionnelle du cceur, en relation avec la constitution et la concentration des solutions ; mais au cours de ces recherches, nous avons abandonnC la premiere idee, ayant constate I’impossibilite, d’arriver A des resultats concrets. En effet, trop nombreuses sont les causes qui peuvent concourir a provoquer une difference dans le comportement fonctionnel d’un Fragment de caeur, en comparaison avec un autre fragment. En effet, peuvent avoir de l’influence : le temps de l’incubation de I’embryon, avant tout ; la difference individuelle entre embryon et embryon ; le temps de culture ; la difference entre Frag- ment et Fragment dans le mCme embryon, en tant que les differents fragments reprkentent differentes portions du cceur : de plus, I’action de la temperature pendant les manipulations, qui, nous l’avons vu, determine dans le plus grand nombre des cas, un arrCt temporaire de I’activitC Fonctionnelle ; e t encore, la dimension des fragments, le trauma correspondant a la section, etc.

Toutes ces causes concowrent A Faire qu’avec les differents Frag- ments trait& par la mCme solution, e t maintenus autant que possible, dans les mCmes conditions experimentales, on obtient des resultats parfois assez differents, ce qui tend a limiter la tAche de I’observateur a Cmettre des jugements generaux, basis sur la moyenne des obser-

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vations faites sur le mCme type. Nos conclusions sont donc basees toutes sur des moyennes et les differents exemples donnis pour les differents types d’experiences executees sont toujours choisis parmi ceux qui se rapprochent le plus de la moyenne des risultats obtenus dans les recherches d’un type donne.

20 Nous avons insiste plusieurs fois, au cours de l’exposition des resultats obtenus, sur le fait que les changements de temperature eprouves par le fragment qui pulse (quand le fragment est enleve au thermostat ou quand il est transporte dans la chambre de Pfeiffer pour I’observation au microscope, ou pour l’addition de divers liquides de perfusion), produisent souvent un arrCt temporaire de I’activite contractile du fragment. Cet arr& est toujours plus marque, quand on change le liquide de perfusion. En effet, par cette operation, i l arrive de detacher le couvre-objet du porte-objet (cela arrive facilement, parce que la vaseline qui tient le couvre-objet est presque fluide a la temperature du thermostat) et apres I’addition du liquide, i l est necessaire de le replacer, ce qui demande un certain temps pour la manaeuvre, temps suffisant pour refroidir partiellement le fragment cardiaque, lequel fragment en realite, subit le plus fort refroidissement au moment de I’addition du liquide nutritif que nous tenons toujours a la temperature ambiante.

Nous n’avons pas tenu compte de la duree de cette periode d’arret ou pCriode refractaire de LEWIS, ni des phenomenes caracteristiques qui s’observent au moment de la reapparition des contractions par I’addition des differentes solutions, parce que cette etude speciale fera I’objet d’une note prochaine.

Dans cette note, dans l’exposition des rbul ta ts obtenus apres I’addition des diverses solutions, nous sommes partis du moment ou les contractions etaient entierement retablies, apres la periode refractaire eventuelle.

30 On trouve dans la litterature, I’observation de LOEB, d’apres lequel un cceur, arrCt6 par un long sejour dans CaCl,, se remet a battre, si on le remet dans une solution ou CaC1, se trouve en solution plus concentree ou moins concentree. Nous n’avons jamais observe ce phenomene sur des fragments de caeurs cultives in vitro : le fragment arrCte par CaCI, ne se remit a pulser qu’apres lavage au NaCl ou addition d’une quantite adequate de KCI.

LOEB en vient en derniere analyse a admettre que le changement rapide de la concentration saline peut agir encore comme stimulus

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suffisant pour riactiver la fonction contractile d’un fragment arrCte par I’action de CaCI,. Pour le fragment de cceur de poulet, on arrive au contraire a neutraliser avec K I’action deletere que produit le Ca quand il est seul en exces, e t qu’on l’ajoute sans son antagoniste K ; en ajoutant K a un fragment soumis a I’action de Ca, on obtient des contractions microscopiques restreintes et faibles (contractions dissociees) ; il faut laver avec NaCl 8.5 Oleo le fragment, pour obtenir un fonctionnement meilleur ; on enleve de cette faGon I’exces de Ca qui endommage la structure cytoplasmatique, ce qui fait obstacle a la fonction. On comprend que cela peut arriver dans chaque cas oh un sejour trop prolonge dans CaCI, n’a pas encore provoque des alteration irremediables, rendant impossible un fonctionnement ulterieur. 40 En comparant les resultats obtenus par addition de solutions

a contenu normal de NaCl (8.5 Oleo), mais avec Ca ou K en exces, en comparant ces resultats avec ceux que donne I’addition de solutions hypotoniques (NaCI 6.5”/00), mais avec K et Ca en exces, nous avons vu que les premieres provoquent en general une augmentation initiale de l’activitk contractile plus forte que pour les secondes. Les solutions hypertoniques (entre certaines limites, bien entendu) determinent une stimulation initiale plus forte que les solution hypotoniques ; le stimulus est plus manifeste et plus durable quand la quantite‘ de K et de Ca est augmentee proportionnellement. Dans ces cas, ou la quantite de K et de Ca augmente proportionnellement, I’activite contractile du fragment persiste pendant un temps assez long, beaucoup plus long que pour les cas ou I’augmentation d’un des deux facteurs ne correspond pas a une augmentation adequate de I’autre. E t ce fait confirme clairement la conception de ZWAARDE- MAKER sur I’antagonisme entre Ca et K pour l’activite contractile du ceu r , grice auquel les contractions cardiaques atteignent leur optimum quand le rapport entre K et Ca reste constant.

50 En recherchant I’action du Ca ajout i aux solutions isotoniques, nous avons observe que les fragments du c e u r continuent a pulser, pendant un temps beaucoup plus court que dans les observations de LEWIS. Nous n’avons pas cru que cette action plus fortement deprimante sur I’activite contractile fut imputable au fait que nous avons employe‘ des doses Ikgkrement plus ClevCes ; mais nous avons attribue I’epuisement plus rapide de la fonction contractile dans nos cas, au fait que nous avons ajoutk CaCI, en Solution isotonique entierement

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privie de K , tandis que LEWIS ajoutait CaCI, a la solution de Locke qui contient K.

Outre qu’il explique pourquoi dans nos recherches nous avons eu une diminution du fonctionnement par Ca, ce fait contribue a etayer la conception mentionnee plus haut de ZWAARDEMAKER, d’apres laquelle l’optimum de la fonction se montre quand K et Ca se trouvent dans des rapports quantitatifs constants.

60 I1 semble plus difficile d’expliquer les differences entre nos resultats obtenus avec des solution hypotoniques privees de K ou de Ca,et celles que LEWIS a obtenues avec des solutions de Locke privees, soit de K, soit de Ca. Dans un cas comme dans I’autre, pour S. E. dilue‘e, p r i d e de Ca ou K, on a d’abord une 1Cgkre augmentation de I’activite contractile, puis une diminution e t enfin un arrCt. Pour LEWIS, au contraire, une solution de Locke p r i d e de Calcium diminue I’activiti contractile du cceur e t provoque I’arrCt en peu de minutes, tandis qu’en enlevant le K, on a une augmentation de I’activitC contractile ; et le cceur continue a pulser pendant plusieurs heures.

Nous n’avons pas note ce comportement opposi ; nous avons observe des differences notables ; mais aussi en enlevant CaCl,, il y a une le‘gkre augmentation fonctionnelle initiale, suivie d’une diminution et ce n’est qu’apres un certain temps (30-60 min.), que se produit l’arrCt des contractions.

70 Les recherches sur l’urane ont demontrC qu’avec des concentrations d’acetate d’uranile inferieures a 2 O/oo , si l’ace‘tate d’urane est dissous dans NaCl 8.5 oleo, on obtient une augmentation initiale de I’activiti contractile, plus forte e t plus durable proportionnellement a la diminution graduelle du pourcentage de l’uranium. Les mCmes concentrations d’uranile dissous dans H,O en solution isotonique exercent une action dkprimante. L’action de l’acetate d’uranium en solution hypotonique est beaucoup plus faible que celle que manifestent les solutions hypotoniques aux mCmes concentrations (en doses comprises entre 0.50 e t 1.75 “loo d’acetate d’urane).

80 En nous referant aux resultats obtenus en dernier lieu dont nous avons par16 dans les comptes rendus partiels, nous confirmons ce que OLIVO a dit ; ainsi nous pouvons nettement distinguer sous I’action du Ca specialement e t aussi du K, deux types de contraction dans l’activite contractile du c e u r embryonnaire : contractions synergiques e t con tractions dissociees. Les contractions synergiques

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sont abolies par les fortes concentrations de Ca e t de K, alors qu’au contraire apparaissent de faibles contractions dissociees.

Les contractions dissociees sont appreciables dans les fragments de culture ou les fibrilles sont developpees e t OLIVO pensait, cornme il a ete dit , que les contractions dissociees pouvaient &re considerees cornme d’origine fibrillaire. .

Dans le chapitre concernant les modifications de structure dues a I’action du Ca e t du K, nous pourrons juger de I’exactitude des suppositions d’OLIvo sur le dualisme fonctionnel cardiaque, selon l’hypothese de BOTTAZZI.

5. Modifications de la structure de fragments de coeur embryonnaire cultivks in vitro,

par variation du liquide nourricier

Apres avoir expose les modifications fonctionnelles des fragments isoles du cam- de I’ernbryon de poulet sous I’action des diverses solutions salines, nous allons dkcrire brievement les modifications de structure qui apparaissent dans les mCmes cultures.

Mais avant d’exposer les resultats des recherches, nous desirons noter qu’il est autrernent difficile de pouvoir etablir un rapport d’interdependance entre les modifications de la fonction et celles de la structure. L’augmentation ou la diminution de la capacite de contraction des fragments cardiaques, trks souvent, ne trouve, saufdans descasext rhes , pas de fondement dans les modifications de structure telles que les moyens actuels d’investigation histologiques nous revelent. D’autre part, cela devient evident quand on pense qu’aucune des nombreuses interpretations du phenornene de la contraction, basee sur les donnkes histologiques, ne peu.t etre acceptee cornme demontree avec certitude.

D’autre part, on sait, principalement par les excellents travaux de OLIVO, que dans le cceur embryonnaire de poulet, la differenciation fonctionnelle ne se developpe pas parallelement avec la differenciation de structure, en tant que la differentiation fonctionnelle precede l’apparition des myofibrilles. D’autre part, OLIVO a l u i - m h e pu etablir que mCme en emPCchant le developpement des phenomenes de contractilite, les rnyofibrilles ne se forment pas moins. En effet, cet auteur, en cultivant en presence d’un excks de KCI, des ebauches cardiaques d’embryons de poulet, au stade de 3 a 8 somites, stade

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danslequel I’activiti contractile ne commence pas encore h se montrer, note qu’on pouvait constater dans ces cultures, I’etablissement des phenomenes de differenciation fonctionnelle en ce sens que le fragment cardiaque manifeste I’activite usuelle migratrice et de multiplication. Or, dans ces conditions, I’auteur a pu observer I’apparition des myofibrilles. Dans ce cas donc les myofibrilles se differencient sans qu’il y ait encore la moindre activite contractile. Mais si ces cultures, maintenues dans un exces de KCI, sont ensuites lavees dans une solution physiologique, l’activite s’etablit immediatement.

Un phenomene unique rencontre par OLIVO dans ces fragments cardiaques etait une vacuolisation notable du cytoplasme, tant des cellules migratrices que de celles du fragment cardiaque. Cela demon- tre que si un sel donne peut emptcher I’etablissement des phenomenes de contractilite, il n’emptche pas les elements cellulaires de se differencier du point de vue rnorphologique et de donner lieu a ces formations sfructurelles que nous croyons Ctre en rapport intime avec I’activite contractile.

Si nous passons ri la description des modifications de structure que les diverses solutions salines employees par nous, provoquent dans les lambeaux cardiaques, nous devons rappeler que les cultures qui Ctaient ensuite soumises a I’action des solutions salines, ont ete preparees sans addition de suc embryonnaire. Seulement les cultures de contr8le etaient priparees soit en plasma et Ringer, soit dans des mllanges de plasma de sang de poulet et de suc embryonnaire de poulet.

I1 est bon de se rapp’eler cela car i l est resulte des recherches d’OLIvo que, tandis que dam les cultures preparees dans un mklange a parties egales de plasma et de suc cmbryonnaire, la differenciation des myofibrilles est tres rapide, au contraire, dans les cultures preparkes dans un melange a parties egales de plasma et de liquide de Ringer, les phenomenes de differenciation se produisent beaucoup plus lentement.

Dans Ies cultures sournises a I’action de S. E., les phenomenes d’accroissement se montrent de la m&me intensitkque dansles cultures preparees dans un melange a parties egales de plasma et de suc embryonnaire. Les elements qui emigrent dans le coagulum, arrivent a former une zone exterieure d’invasion. 11s sont representes par des dements assez volumineux, pourvus de prolongements plus ou moins longs et tenus. La forme de ces cellules ne differe pas de celle des

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elements emigres dcs fragments du cceur embryonnaire de sept jours d’incubation, cultives sur plasma et suc embryonnaire. On ne constate aucune modification du cytoplasme et encore rnoins du noyau dans ces cellules.

Mais si les cultures etaient soumises a I’action de solutions hypertoniques, contenant une plus grande quantittt de CaCI, et KCI, il y avait une modification nctte de la forme des cellules.

Ces dernieres, en effet, pour des raisons evidentes, tendent a prendre une forrne plus ou rnoins rigulierement globulaire, ovoi‘dale ou polygonale, per- dant entre elks et leurs voisines les rapports de contiguite. Si la solution hypertonique n’ktait pas ajoutee 24 a 32 h. apres l’isolement du lambeau cardiaque, mais au momcnt m h e de I’etablissemcnt de la culture, alors les phenomenes de migration et dc multiplication cellulaires etaient beaucoup plus faibles, compares aux mCmes phinomencs prdsentes par les cultures preparees dans un melange de plasma e t de suc embryonnaire, ou de plasma ct S. E. Au contraire,en suivant a t tentivement certaines cultures, nous avons pu observer que dans quelques fragments cardiaques, on verifiait seulement des phenomenes de migration peu accentues, non des phhomenes de multiplication cellulaire. Si ensuite ces cultures apres 18 a 72 h., Ctaient lavees au Ringer, puis soumises a des transplantations successives, l’activite multipli- catrice reprenait immkdiatement comme auparavant.

Nous n’avons pu rttaliser des observations suffisantes pour Ctablir I’action des solutions hypertoniques sur les mitoses, mais il semble que tres probablement la cinese doit Ctre empCchCe ou au rnoins contrariee par un fort exces de CaCl, et KCI.

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Un semblable exces de sel n’arrcte cepcndant pas, toute activite vitale de la culture (bien entendu aux doses employees = KCI 0.50 O,’oo, CaCI, 0.65 O,loo dans NaCl 13y0), pour autant qu’apres 48-72 h., on la libkre de I’exces du sel par lavage au moyen de la solution isotonique : et transplantie, elle reprcrid, cornme d’ordinaire, son rythme d’accroissement.

Le cytoplasrne des cellulcs ernigrees des fragments cultives, en solution hypertonique, se rnonlre opaque et dans Ics priparations fixecs ct colorees, le chondriornc, par la diminution de I’expansion du cytoplasme, est constitue par des organitcs itroitement accolis Ics uns aux autres et occupant tout le cytoplasme lui-rni5me. Dans de telles cellules, on peut observer la formation dc vacuoles. Par contre, un exces de KCI ajoute a la solution isotoniquc determine dcs rnodi- fications notables du cytoplasrne.

L’excks de KCI, cornme nous l’avons dcjh note dam de prectdentes recherches, et cornme OLIVO l’a lui-rntrne observe, n’ernpiche pas Ic dheloppcment des phenomenes de migration et de multiplication d a m la culture. De ce point de vue, la culture soumise l’action d’un excks de KCI ne se distingue pas de ccllc qu’on a trait& dans un nie- lange de plasma ct de suc embryonnaire ou de plasma et S. E. En ce qui regarde la forrne des elements qui envahissent Ic coagiiluni, on peut mettre en evidence des modifications apprkciables.

Par contre, la modification constantc a lieu aux dipens du cytoplasme. En effet, en ajoztant l’exces du KCI depuis le moment de I’irnplantation de la culture, on met toujours en Cvidencc, une notable vacuolisation du cytoplasrne, soit en observant la culture a l’etat vivant, soit en observant des priparations fixees e t colorecs. L’kten- due, le siege et le nombre de ces vacuoles est variable. Parfois le cytoplasrne est occupk par deux ou trois grandes vacuoles, situles soit vers la peripherie de la cellule, soit vers le centre. Dans ce dernier cas, le noyau est modifik dans sa forme; ainsi lorsqu’une grosse vacuole s’est etablie dans le voisinage irnrnediat du noyau lui-rntrne, ce dernier s’incurve plus ou rnoins en prenant la forme d’un haricot. D’autres fois, au contraire, le cytoplasme est parseme dc nornbreuses e t petites vacuoles, qui donnent au cytoplasme un aspect spurneux. Dans ces conditions, i l devient difficilc de faire des observations sur Ic chondriome, mais dans les cultures oh les vacuoles n’etaient pas tres nornbreuses, on voit que le chondriome est form6 uniquement de fins granules.

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Comme cette vacuolisation manifeste, qui s’itend aux cellules du fragment transportk, est le seul fait constant qui se montre dans les cultures constitukes en presence d’un exces de KCI, elle doit selon toute vraisemblance reprksenter la base histologique de la suppression de l’activite contractile des fragments isolks.

Cela devient evident quand on songe a la capacitk contractile du sarcoplasme. On sait en effet, comme I’a de- montre BOTTAZZI, que la contraction, tant dans les muscles lisses que dans les muscles stries, est de nature a la fois myofibrillaire et sarcoplasmatique et que la contraction d’une fibre est la resultante de I’activite de ses deux composants. Ce dualisme entre sarcoplasme et myofibrille est beaucoup plus evident dans le tissu embryonnaire que dans celui de I’adulte. Ensuite OLIVO, ayant pu surprendre le debut de I’activite contractile dans le caeur embryonnaire du poulet, avant I’apparition des premiers myofibrilles, a pleinemen t confirme ce fai t .

Or donc. comrne i l n’y a plus aucun doute sur la participation active du sarcoplasrne a la fonction de contraction et qu’il resulte des recherches de OLIVO que, m h e en presence de rnyofibrilles, i l se peut que tout phenornene contractile fasse defaut dans les fragments cardiaques soumis a certaines conditions speciales, on peut adrnettre la supposition que les modifications sarcoplasmatiques dkterminkes par un exces de KCI sont responsables de la suppression de l’activite contractile. Mais comrne la vacuolisation peut disparaitre une fois que la culture a ete debarrassee de l’exces de KCI, alors

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aussi l’activite contractile se differencie, une fois modifike la concentration saline du liquide nourricier.

En pratiquant des subcultures de cultures preparees avec un exces de KCl, I’activiti de multiplication des subcultures se montre toujours fort vive. A cet Cgard nous avons voulu observer si en cultivant, par la methode de la transplantation successive, du cceur embryonnaire de poulet de 7-8 jours dans plasma + suc embryon-

naire + excks de KCI, ceux-ci se differencient un moment anterieur ou posterieur a celui des fragments de c e u r appartenant au mCme embryon cultives sur plasma et suc embryonnaire.

Eh bien, ces observations ont donne comme resultat, en ce qui regarde la differenciation fonctionnelle, que tant pour les fragments cultives dans un exces de KCI et puis liberes de cet exces, pour verifier la differenciation des phenomenes contractiles, que pour les fragments prepares en plasma et suc embryonnaire, on ne peut constater aucune difference. Dans tous les fragments depuis les premiers passages (10-29, i l y a disparition complete de toute activite contractile.

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304 GIULIO BUCCIARDI ET VINCENZO BISCECLIE

De pair avec la differenciation fonctionnelle marche la differenciation morphologique de cellules du fragment cardiaque, avec disparition des myofibrilles. I1 en resulte qu’un exces de KCI, en ce qu’il arrCte toute activite contractile, n’avance ni ne retarde la differenciation morphologique e t aussi fonctionnelle comparke aux cultures preparees en plasma et suc embryonnaire.

Le CaCI, ajoutk aux fragments de cceur determine, comme nous I’avons dit plus haut, des modifications fonctionnelles manifestes, mais auxquelles ne correspond pas une modification structurale adequate. En ce qui regarde la croissance de telles cultures, nous n’avons pu observer de differences notoires avec les cultures prcpa- rites dans plasma -+ S. E. ou plasma et suc embryonnaire. D’autre part, ces cultures transplantees ensuite dam plasma et suc embryonnaire, montrent toutes dans leurs passages successifs, un intense pouvoir de multiplication.

Si l’on observe des cultures soumises a I’action de CaCI,, tant a I’etat vivant qu’en preparations fixees et colories, on n’observe pas dc differences avec les cultures de con- tr6le en ce qui regarde la forme e t la dimension des ClCments cellu’aires. Seu- lement le cytoplasme des myoblastes emigres presente rarement des vacuoles; mais i l est tres opaque dans les cellules

Dans de telles cultures,

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I I plus etenduesen superficie. J

F I G , 10. -- Myo1~la~tc.s higl-2s d’un fl-qgiicnt ‘e chondriome est cons- lie Lyp:.ir c.iiiliiyoiiii;iire t ~ c potilrt viuiiiis ii l ’ x - titue de chondriocontes tion d’uii ex(& de C:icl2. L:i fornir. rt la dinic‘n- plus ou mains longs et sion des ic.lltilt...,coniiiic‘ atissi I C ‘ L I ~ s t rui turc . cyto-

plasniiitiqtiz c‘t nuclC:iire, ne sont i i i od i f ih en flexueux e t de rares gra- rien. nules mi tochondr iaux . Dans les cellules du fragment cardiaque apparaissent de nombreuses myofibrilles. Par la methode des transplantations succes-

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sives, la differenciation structurale de ces cellules se produit dans un temps a peu prks egal a cclui des fragments developpis dans plasma et suc embryonnaire. II en resulte que les modifications fonctionnelles dues a I’action de CaCI, sur les fragments de c e u r embryonnaire, ont pour base des modifications de structure qui ne sont pas rendues visibles par les moyens actuels d’investigation histologique.

De mtme, si l’on soumet les cultures a I’action des liquides hypo- toniqucs d a m lesquels on diminue la concentration de Na, de K et dc Ca, I’activite de multiplication des fragments de caeur n’en est pas modifide. L’accroissement de tdles cultures suit son cours habitue1 dans les fragments successifs. En ce qui regarde le volume e t la forme des elements qui emigrent dans le coagulum, on observe qu’ils sont en general, plus etendus en superficie que les mtmes elements qui emigrent dans les cultures preparees en plasma e t suc embryonnaire. Les myoblastes Cmigres des fragments de caeur embryonnaire de 7-9 jours e t soumis a I’action de solutions hypotoniques ne presentent presque jamais de prolongements plus ou moins t h u s et longs, mais par contre montrcnt des saillies courtes et obtuses. Dans les culturcs ou la couche de plasma etait reduite a un voile tres mince, les cellules italees en surface et disposees en une seule couche, nrrivaient a former une membrane cellulaire, qui tout en presentant quelquc solution de continuiti, ressemblait a une membrane d’elements epitheliaux, Le chondriome de ces cellules, etait nettement visible par la forte expansion d u cytoplasme et etait constitue dc chondriocontes et de granules mitochondraux.

Dans la precedente no’te, nous avons dit quc les solutions d’acetate d’uranile I”/,,,, ne reussissent pas, a moins que I’action n’ait ete prolongee pendant longtemps, a provoquer des modifications morphologiques nettes dans les fragments de caeur embryonnaires de poulet. Au contraire, d a m les presentes recherches, en employant une solution d’acetate d’uranile a 2 o/,,,,, nous avons toujours pu constater de profondes modifications morphologiques qui expli- quaient clairement les modifications fonctionnelles subies par le fragment cardiaque.

Avant tout, si I’addition d’acetate d’uranile est pratiquee au moment ou la culture est priparee, les phenomenes de migration cellulaire manquent pour ainsi dire entierement. Mais si I’addition est faite 32 a 48 h. apres le moment de l’isolement du fragment, on note

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alors, outre de profondes modifications de structure, I’arrtt des processus de multiplication. Dans ces conditions, la culture, si elle a subi I’influence de I’action de l’uranile pendant plusieurs heures, n’est plus capable d’etre transplantee avec succes. Ensuite, l’observation des elements emigres du coagulum de tels fragments, montre une vacuolisation marquee du cytoplasme.

Ces vacuoles sont en general tres grandes e t le plus souvent chaque cellule n’en contient que 2-3. Mais 51 c8te de cette vacuolisation, le cytoplasme rnontre des gouttelcttes de graisse nornbreuses et plus ou rnoins grosses. Enfin, le noyau est assez bien conservk dans certaines cellules, mais dans d’autres, presente des signes rnanifestes de degenirescence. On a des alterations pareilles dans les cellules du fragment cardiaque.

Ccs modifications qui s’observent dans les cultures soumises longtemps aux solutions d’acetate d’uranile 2 o ,oo , se montrent rnoins rnarquies d a m

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les cellules sournises a des solutions moins concentrees d’acitate d’uranile. Avec des solutions B 1.50 oleo d’acetate d’uranile, i l n’y a pas formation de gouttelettes de graisse, et la vacuolisation est beaucoup moins accentuee. Avec les solutions a I .200’,, d’acetate d’uranile, la vacuolisation aussi ne s’observe plus, et la culture presente une rnarche d’accroissement presque egale a celle des cultures de contrble et peut Ctre transplantee avec succes.

Ainsi l’urane en solution voisine de I O i o 0 agit comme activateur de la fonction contractile dans les fragments de cceur et n’y provoque pas de modifications structurales profondes ; mais en solution a 2 oleo, il arrete toute activite contractile dans le fragment cardiaque isole e t provoque de graves e t irreparables modifications de structure dans les cellules ernigrees du caillot et dans les fragments de cam-.

Entre les deux extremes on rencontre des forrnes de passage.

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Conclusions

1 ) L’addition de solutions physiologiquement equilibries B des fragments isoles du cceur embryonnaire de poulet en cultures in uilro determine une augmentation de I’activite contractile superieure a celle que I’on obtient par addition de plasma de sang de poulet.

2) L’augmentation de l’activite contractile pendant 2 heures ou davantage est manifestement plus forte si elle est obtenue pas addition de liquide nutritif contenant une quantite Iegerement superieure de CaCI, et de KCI. La concentration de ces deux sels doit en tous cas augmenter proportionnellement. A une periode d’activite fonctionnelle augmentee, fait suite une depression plus rapide, et le fragment cesse de pulser avant les fragments de contr6le cultivks sur plasma e t sur solution equilibree physiologiquement.

3) Les solutions isotoniques + KCI 1 oio0 provoquent une augmentation immediate et temporaire de I’activite contractile, qui diminue au bout de 30 a 60 minutes. Les contractions s’arrCtent plus t8t que dans les cultures de contrble, cultivees dans le plasma et dans S. E. 4) Les solutions isotoniques de CaCI, (0.85 o;oo, 1 o;loo, 1.25 oio0)

provoquent une augmentation immediate et passagere de I’activi tC contractile, qui diminue ensuite rapidement. Les contractions s’arrCtent bien avant que dans les cultures de contr8le conservees dans le plasma et dans S. E.

5) Les solutions hypotoniques provoquent une augmentation primitive de I’activite contractile : I’augmentation est plus forte si, avec la diminution de concentration de NaCI, on fait coincider une augmentation moderee de la concentration du KCI et du CaCI,; mais I’augmentation de ces deux sels doit i t r e proportionnelle.

6) L’acetate d’uranile aux cencentrations infirieut‘es a 20jO0 a une action primitive activante, si I’acetate d’uranile est dissoute dans NaCl 8.5 O;oo. L’augmentation de l’activite contractile est plus manifeste et plus durable pour les faibles concentrations d’acetate d’uranile ; les mCmes concentrations d’acetate d’uranile dissoutes dans H,O, ou dans des solutions hypotoniques de NaCl se montrent au debut deprimantes plut6t qu’excitantes.

7) Des fragments de c e u r embryonnaire de poulet cultives dans des melanges de plasma et de solution equilibree, ne presentent pas

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de difference, soit pour ce qui regarde I’intensite dc I’accroisscment, soit pour la forme et la structure des myoblastcs kmigrks compares aux cultures faites dam le melange de plasma et de suc embryonnaire.

8) La culture des fragments de c u m dans le plasma e t les solutions hypertoniques, contenant une plus grande quantite de CaC1, c t de KCI, se montre plus difficile e t malaisee. Les elements qui emigrent dans la culture sont reduits en volume et tendent a prendre une forme irrigulieremen t arrondie ou polygonale.

9) Un excis de KCl dans la culture n’emptche pas le dkveloppe- ment des mCmes phenomenes d’emigration et de multiplication, mais determine une forte e t Cvidente vacuolisation d u cytoplasmc. Mais, d’autre part, cette modification peut entierement retrograder e t la culture libCree de I’exces de K , peut Ctre transplantee avec succes. L’exces de K n’accelere ni ne retarde la diffkrenciation fonctionnelle e t morphologique des fragments isolis.

10) L’addition d’un exces de CaCI, a la culture n’est pas capable de modifier la rapidite de I’accroissement et ne produit pas de modifications nette dans la forme et la structure des myoblastes.

11) De mtme, les solutions hypotoniques, a I’exception d’une notable expansion du cytoplasme des cellules, ne determine pas d’autres modifications nettement appreciables.

12) L’addition de solution d’acitate d’uranile ‘2 O i o o , au moment de I’implantation de la culture, ne permet presque jamais le developpement des phenomenes de migration cellulaire. Mais si une telle addition est pratiquee a une culture deja en voie d’accroissement, alors on constate dans les myoblastes emigres de profondes modifications cytoplasmatiques(formation de vacuoles et apparition de gouttelettes de graisse) et nuclkaires, qui amenent rapidement la mort de la culture.

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Modifications De L'Activité Contractile et de la Structure De Fragments Isolés Du Cceur Embryonnaire De Poulet Par Les Variations Quantitatives De La Composition Du Liquide Nutritif