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Modèles in vitro et in vivo de leucémies aiguës humaines avec les gènes de fusion de MLL
Mémoire
Renata Cunha Teixeira
Maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Renata Cunha Teixeira, 2014
iii
Résumé
Les fusions de MLL peuvent générer trois types de leucémies aiguës (LLA-B, LMA
et LLA-T). Les cellules souches/progénitrices de sang de cordon humain purifiées
par une méthode de sélection négative ont été infectées par un rétrovirus
contrôle exprimant la EGFP ou un rétrovirus exprimant un gène de fusion de MLL
et la EGFP, avant d’être injectées dans le fémur de souris immunodéficientes.
Après 20 semaines, les souris ont été sacrifiées et les organes hématopoïétiques
ont été analysés par FACS. MLL-ENL a généré exclusivement des LLA-B, MLL-
ELL des LLA-B et LMA, et MLL-AF9 des LLA-B et mixte. Il semble que certains
partenaires peuvent jouer un rôle important dans le phénotype et que le
microenvironnement murin peut favoriser le phénotype LLA-B. Cette étude peut
aider à comprendre le rôle instructif des MLL-ENL, MLL-ELL et MLL-AF9 sur le
phénotype leucémique et leur capacité à initier la transformation des cellules
normales en cellules leucémiques.
v
Abstract
MLL fusion genes may generate three different types of acute leukemia (B-ALL,
AML and T-ALL). Purified human cord blood cells by negative selection technique
(Lin-CB) and having CD34+ >70% were transduced by control retrovirus
expressing the EGFP or other retrovirus expressing an MLL fusion gene and the
EGFP, and then injected into the immune-deficient NSG mouse femur to test the
leukemogenic potential. After 20 weeks, the mice were sacrificed and organs
were analysed by FACS. MLL-ENL exclusively produced B-ALL, MLL-ELL B-ALL
and AML, and MLL-AF9 B-ALL and mixed. It seems that some MLL partner genes
may play an important role in phenotype, and the murine microenvironment of
our in vivo model may promote the B-ALL phenotype. This study may help
understand the instructive role of MLL-ENL, MLL-ELL and MLL-AF9 fusion genes
in leukemic phenotype and their ability to induce the transformation of normal
hematopoietic stem/progenitor cells into leukemic cells.
vii
Table des matières
Résumé ................................................................................................ iii
Abstract ............................................................................................... v
Table des matières ................................................................................ vii
Liste des tableaux .................................................................................. xi
Liste des figures .................................................................................. xiii
Liste des abréviations ............................................................................ xv
Remerciements................................................................................... xvii
Chapitre I – Introduction ......................................................................... 1
1. Système hématopoïétique humain ........................................................ 1
1.1 Définition de l’hématopoïèse ............................................................ 1
1.2 Autorenouvellement et différentiation ............................................... 1
1.2.1 Développement de lymphocytes B .............................................. 3
1.3 Régulation .................................................................................... 5
1.4 Facteurs de transcription dans l’hématopoïèse ................................... 7
2. Leucémies aiguës ..............................................................................10
2.1 Définition et leucémogénèse ...........................................................10
2.2 Classification des leucémies aiguës ..................................................10
2.2.1 Leucémies myéloïdes aiguës .................................................... 10
2.2.2 Leucémies lymphoïdes aiguës .................................................. 13
2.3 Leucémies aiguës humaines impliquant les gènes de fusion de MLL ......14
3. Gène MLL (Mixed-Lineage Leukemia) ...................................................16
3.1 Caractérisation .............................................................................16
3.2 Rôle de MLL dans le développement embryonnaire et l’expression des gènes HOX ........................................................................................18
3.3 Réarrangements chromosomiques impliquant MLL .............................19
3.3.1 Translocations chromosomiques ............................................... 20
3.3.2 Duplication partielle en tandem de MLL (MLL-PTD) ...................... 21
3.3.3 Amplification de MLL ............................................................... 22
3.4 Partenaires de fusion de MLL ..........................................................22
3.4.1 Mécanismes moléculaires de leucémogénèse des fusions MLL ....... 25
viii
3.4.2 Mécanisme moléculaire de leucémogénèse de MLL-PTD ............... 29
4. Hypothèse et objectifs ...................................................................... 31
4.1 La problématique ......................................................................... 31
4.2 Hypothèse et objectifs .................................................................. 31
Chapitre II – Matériel et Méthodes .......................................................... 33
1. Purification de cellules souches/progénitrices de sang de cordon ombilical humain par sélection négative (CB-Lin) ................................................... 33
2. Technique de clonage ....................................................................... 34
2.1 Production d’ADN ......................................................................... 35
3. Production de rétrovirus avec des 293T ............................................... 36
3.1 Titration de virus ......................................................................... 37
4. Infection de cellules CB-Lin par rétrovirus ............................................ 38
5. Culture cellulaire des cellules CB-Lin infectées par rétrovirus .................. 39
6. Modèle in vivo de xénotransplantation ................................................. 39
6.1 Souris immunodéficientes ............................................................. 39
6.2 Irradiation des souris immunodéficientes ......................................... 40
6.3 Injection intra-fémorale ................................................................ 40
6.4 Analyse des souris ....................................................................... 40
7. Cytométrie en flux ............................................................................ 41
7.1 Analyse préliminaire ..................................................................... 41
7.2 Analyse supplémentaire ................................................................ 41
Chapitre III – Résultats......................................................................... 43
1. Analyse de l’expression de la protéine EGFP ......................................... 43
2. Prolifération cellulaire in vitro ............................................................. 44
3. Caractérisation des leucémies aiguës humaines avec les gènes de fusion de MLL dans le modèle in vivo .................................................................... 45
3.1 Observations des signes cliniques et morphologie des organes ........... 45
3.2 Analyse de cellules par cytométrie en flux ....................................... 46
3.2.1 Analyse de souris injectées par des cellules transduites avec les rétrovirus contrôle, MLL-ENL et MLL-ENL ER ....................................... 47
3.2.2 Analyse de souris injectées par des cellules transduites avec les rétrovirus contrôle, MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP ....................... 49
ix
Chapitre IV – Discussion et Conclusion .....................................................61
1. Discussion ........................................................................................61
1.1 Les constructions rétrovirales MLL-ENL et MLL-ENL ER .......................61
1.2 Les constructions rétrovirales MLL-ENL LoxP, MLL-AF9 et MLL-ELL .......62
2. Perspectives .....................................................................................65
3. Conclusion .......................................................................................66
Bibliographie ........................................................................................69
xi
Liste des tableaux
Tableau 1 : Classification « WHO » pour les néoplasies myéloïdes et leucémies aiguës .................................................................................................12 Tableau 2 : Classification « WHO » pour les leucémies lymphoïdes aiguës .....13 Tableau 3 : Classification des partenaires de fusion de MLL .........................25 Tableau 4 : Résumé de résultats in vivo ...................................................48
xiii
Liste des figures
Figure 1 : Différentiation de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices en cellules matures ................................................................................ 3 Figure 2 : Modèle de développement de lymphocytes B humaines ................. 4 Figure 3 : Résumé de la différentiation terminale des lymphocytes B et ses marqueurs de surface cellulaire ................................................................ 5 Figure 4 : Hématopoïèse et cytokines impliquées dans la différentiation cellulaire ............................................................................................... 7 Figure 5 : Facteurs de transcription importants dans l’hématopoïèse ............. 9 Figure 6 : Proportions de différentes anomalies chromosomiques impliquant le gène MLL dans les leucémies aiguës ........................................................15 Figure 7 : Localisation du gène MLL dans le chromosome 11 .......................16 Figure 8 : Domaines et interactions de la protéine MLL ...............................18 Figure 9 : Représentations schématiques du type sauvage et des protéines aberrantes de MLL ................................................................................21 Figure 10 : Classification de patients selon leurs groupes d’âge et type de maladie ...............................................................................................23 Figure 11 : Partenaires de fusion nucléaire sont potentiellement impliqués dans l’élongation transcriptionnelle .................................................................28 Figure 12 : Pourcentage de cellules EGFP positives infectées avec des rétrovirus ............................................................................................44 Figure 13 : Prolifération cellulaire in vitro .................................................45 Figure 14 : Poids des rates des souris contrôle, non-malade et malade .........46 Figure 15 : Poids des thymus des souris contrôle, non-malade et malade ......46 Figure 16 : Analyse des cellules des souris MLL-ENL et MLL-EN ER ...............48 Figure 17 : Analyse préliminaire des cellules de la moelle osseuse des souris leucémiques LLA-B ................................................................................50 Figure 18 : Bloc de différentiation au stage pro-B des cellules des souris leucémiques LLA-B ................................................................................51 Figure 19 : Différentiation terminale des cellules des souris leucémiques LLA-B ..........................................................................................................52 Figure 20 : Analyse initiale des cellules de la rate des souris leucémiques LLA-B ..........................................................................................................53 Figure 21 : Infiltration leucémique lymphoïde B dans le foie ........................54 Figure 22 : Infiltration leucémique lymphoïde B dans le thymus ...................55 Figure 23 : Phénotype leucémique myéloïde de la moelle osseuse ................56 Figure 24 : Caractérisation de la population leucémique myéloïde de la moelle osseuse et phénotype leucémique LMA de la rate ......................................57 Figure 25 : Phénotype leucémique mixte ..................................................58 Figure 26 : Caractérisation du phénotype leucémique mixte ........................59
xv
Liste des abréviations
AF9 : ALL1-fused gene from chromosome 9 AGM : Aorte-gonade-mésonéphros BCR : Breakpoint cluster region CBP : CREB-binding protein (protéine de liaison CREB) CLPs : Progéniteurs communs de cellules lymphoïdes CMPs : Progéniteurs communs de cellules myéloïdes ELL : Eleven nineteen lysin rich leukemia gene ENL : Eleven nineteen leukemia gene hCD45 : CD45 humain HOX : Homeobox genes HSC : Cellule souche hématopoïétique HSCs : Cellules souches hématopoïétiques HTRX : Gène trithorax humain CB-Lin : Cellules souches/progénitrices de sang de cordon humain purifiées par sélection négative KI : Knock-in KO : Knock-out LLA : Leucémies lymphoïdes aiguës LLA-B : Leucémie lymphoblastique de phénotype cellulaire B LLA-T : Leucémie lymphoblastique de phénotype cellulaire T LMA : Leucémie myéloïde aiguë LSC : Cellule souche leucémique LT-HSCs : Cellules souches hématopoïétiques à long terme MLL : Mixed-lineage leukemia MLLT1 : Mixed-lineage leukemia translocated to chromosome 1 MLLT3 : Mixed-lineage leukemia translocated to chromosome 3 MPPs : Progéniteurs primitifs multipotents NSG : Souris immunodéficiente NOD/ShiLtSz-scid/IL2Rγ-/- PHD : Plant homology domain SET : Su(var)3-9 enhancer-of-zeste, et trithorax SMD : Syndrome myélodysplasique SNL : Speckled nuclear localization SR-E : Autorenouvellement d’expansion SR-M : Autorenouvellement de maintenance ST-HSCs : Cellules souches hématopoïétiques à courte terme RT-PCR : Reverse transcriptase-polymerase chain reaction t-LMA : Leucémie myéloïde aigue secondaire
xvii
Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de recherche, le Dr. Frédéric
Barabé, de m’avoir accueillie dans son laboratoire me concédant une expérience
formatrice et enrichissante. Merci infiniment pour ses encouragements, ses
précieux conseils, ses implications dans les projets, sa grande disponibilité, son
enthousiasme, sa patience inépuisable et bien plus encore. Vous avez ma grande
admiration et toute ma reconnaissance.
Je suis reconnaissante envers tous les membres de notre équipe pour m’avoir
aidée et conseillée. Un merci spécial à notre assistante de recherche, Anne
Bergeron, qui m'a tout apprise, pour les injections intra-fémorales chez la souris,
son énorme disponibilité, ses encouragements et sa compétence. Un immense
merci à Mathieu Bélanger et à Jessica Simard qui m'ont accordée tout au long
de ma maîtrise une aide inestimable principalement avec les souris. Je remercie
chaleureusement Malika Laouedj pour son aide généreuse, son soutien et son
amitié. Un gros merci à Sara Berthiaume pour ses encouragements, son bonheur
et sa joie.
J’aimerais remercier à tous mes nombreux collègues de divers laboratoires et à
mes amis de loin, pour votre aide, votre support, vos encouragements et votre
amitié qui m'ont amenée accomplir ce projet. Je vous en serai toujours très
reconnaissante.
Finalement, je tiens à remercier mes parents, mon frère, ma sœur, mon mari et
ma petite fille pour leur soutien et leur amour inconditionnel.
1
Chapitre I – Introduction
1. Système hématopoïétique humain
Le système hématopoïétique humain préside à la formation des éléments figurés
du sang : les granulocytes/monocytes, les plaquettes, les érythrocytes et les
lymphocytes B et T. Pendant toute la vie, ce système produit et maintient
constamment des quantités adéquates de cellules sanguines par la
différentiation, la prolifération et l’autorenouvellement des cellules souches
hématopoïétiques et progénitrices afin de transporter de l’oxygène aux tissus et
de répondre à des stress hématopoïétiques comme les saignements, les
infections et l’exposition aux agents cytotoxiques
1.1 Définition de l’hématopoïèse
Chez les mammifères, l’hématopoïèse est une progression développementale qui
découle d’une petite population de cellules souches hématopoïétiques à long-
terme possédant un potentiel d’autorenouvellement illimité. Ces cellules
donnent naissance à une vaste population de cellules ayant des potentiels plus
limités et donnant naissance à leur tour à des cellules sanguines matures
trouvées dans le sang périphérique (Morrison, S. J. et al. 1995). Le
développement hématopoïétique est contrôlé par un réseau complexe de
facteurs de transcription hautement régulé. L’ordre des sites de l’hématopoïèse
durant l’embryogénèse est le sac vitellin, la région AGM (Aorte-Gonade-
Mésonéphros), le foie fœtal et la moelle osseuse. Le système hématopoïétique
humain repose sur l’autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques
(HSCs), l’engagement de ces cellules dans des lignées spécifiques, et la
différentiation/maturation des précurseurs en cellules sanguines fonctionnelles
pour maintenir l’homéostasie sanguine.
1.2 Autorenouvellement et différentiation
Dans l’hématopoïèse, la cellule souche hématopoïètique (HSC) est dotée d’un
potentiel d’autorenouvellement (la capacité de produire des cellules filles
2
possédant des potentiels prolifératif et de développement identiques) et d’une
capacité d’engagement en différentiation (orientation progressive vers une
lignée spécialisée). L’autorenouvellement des HSCs peut être symétrique ou
asymétrique. L’autorenouvellement symétrique génère par division deux cellules
HSCs identiques, nommé l’autorenouvellement d’expansion (SR-E), afin
d’augmenter le nombre des HSCs dans certaines conditions comme par exemple,
après une greffe de cellules souches hématopoïétiques, pendant l’ontogenèse
dans le foie fœtal et tout de suite après la naissance. L’autorenouvellement
asymétrique, désigné l’autorenouvellement de maintenance (SR-M), produit une
cellule HSC et une cellule progénitrice, qui possède une capacité réduite
d’autorenouvellement et est engagé dans la différentiation pour assurer et
maintenir la production de cellules sanguines matures en tout temps (Dick et al.
2003b) (Cellot & Sauvageau 2006) (Warner et al. 2004). Les HSCs sont
localisées dans la moelle osseuse, le site de l’hématopoïèse pendant la vie
adulte. Les HSCs à long terme (LT-HSCs) génèrent des HSCs à court terme (ST-
HSCs), qui donnent naissance à des progéniteurs primitifs multipotents (MPPs),
qui se divisent à leur tour en progéniteurs communs de cellules myéloïdes
(CMPs) ou en progéniteurs communs de cellules lymphoïdes (CLPs). Ces
progéniteurs vont se différentier en progéniteurs multi-lignées, qui vont être
soumis à plusieurs étapes de maturation aboutissent en cellules terminales du
sang périphérique : les granulocytes/monocytes, les plaquettes et les
érythrocytes pour les progéniteurs CMPs, et les lymphocytes B et T pour
progéniteurs les CLPs (Murre, C. 2007) (Passegue, E. et al. 2003) (figure 1). Les
cellules sanguines matures possèdent des caractéristiques et fonctions
biologiques distinctes. Les globules rouges ont un rôle dans le transport de
l’oxygène, les granulocytes dans l’infection et l’inflammation, les monocytes
dans la phagocytose, les plaquettes dans l’hémostase, et les lymphocytes dans
l’immunité spécifique (Fey, M. F. 2007).
3
Figure 1 : Différentiation de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices
en cellules matures. Tirée de Passegué, E. et al. 2003
1.2.1 Développement de lymphocytes B
Les lymphocytes B ont leur origine à partir des progéniteurs CLPs, et tous les
stades des lymphocytes B précoces humaines sont trouvés dans la moelle
osseuse du fœtus, du jeune et de l’adulte âgé, démontrant que le développement
des lymphocytes B a lieu tout au long de la vie (Nunez et al. 1996). Le
développement des lymphocytes B se fait par différentes étapes dont chacune
est caractérisée par les stades de l’évolution des lymphocytes B. Les marqueurs
de surface cellulaire et les réarrangements des gènes des différentes classes de
récepteurs des lymphocytes B (BCR) caractérisent les différents stades de
développement des lymphocytes B : lymphocytes B précoces, lymphocytes pro-
B et grands lymphocytes pré-BI, grands lymphocytes pré-BII et petits
lymphocytes pré-BII. Ce mémoire se concentre sur l’expression de leurs
antigènes de surface cellulaire. Les lymphocytes B précoces expriment les
CD34+CD19−CD10+, les lymphocytes pro-B et les grands lymphocytes pré-BI
les CD34+CD19+CD10+, les grands lymphocytes pré-BII et les petits
4
lymphocytes pré-BII les CD34-CD19+CD10+ (Blom, B. & Spits, H. 2006) (figure
2).
Figure 2 : Modèle de développement de lymphocytes B humaines. Tirée de Blom,
B. & Spits, H. 2006
Le modèle montré dans la figure 3 représente un résumé de la différentiation
terminale des lymphocytes B exprimant des marqueurs de surface cellulaire, qui
5
ont été choisis pour identifier les différents stades du développement des
lymphocytes B dans le cadre de ce mémoire.
Figure 3 : Résumé de la différentiation terminale des lymphocytes B et ses marqueurs de surface cellulaire
1.3 Régulation
L’hématopoïèse est hautement régulée par des mécanismes cellulaires
intrinsèques et extrinsèques qui contrôlent l’équilibre entre la phase quiescence
du cycle cellulaire (G0) et la prolifération des cellules souches hématopoïétiques
afin de maintenir adéquatement l’homéostasie sanguine chez l’adulte (Pietras,
E. M. et al. 2011). Plusieurs facteurs intrinsèques du cycle cellulaire sont
impliqués dans ce mécanisme et peuvent être minimisés par action compétitive
de cyclines qui induisent la progression du cycle cellulaire, et par des inhibiteurs
de cyclines qui empêchent l’entrée du cycle cellulaire. Les mécanismes cellulaires
extrinsèques agissent en partie via les voies de signalisation TGF-β, Wnts, Notch
ligands, et Hedgehog, qui sont également essentiels pour le développement
embryonnaire et l’hématopoïèse fœtale. Plusieurs facteurs environnementaux
mature B cell
Hematopoietic stem cell
Common lymphoid progenitor
pro-B cell
pre-B cell
PERIPHERY
CD34
CD10
CD19
CD20
sIgM/sIgD
6
incluant cytokines, facteurs de croissance et autres facteurs produits par des
cellules constituant la niche cellulaire, jouent un rôle dans la régulation de la
phase quiescence des cellules souches hématopoïétiques.
Les progéniteurs, quant à eux, doivent être capables de proliférer rapidement
en réponse à des facteurs extrinsèques signalant des dommages ou infections.
La régulation extrinsèque de l’hématopoïèse implique des facteurs de croissance
et un microenvironnement médullaire (matrice extracellulaire et cellules
stromales : fibroblastes, cellules endothéliales, adipocytes et ostéoblastes), qui
semblent déterminer le destin de la HSC. Il a été démontré expérimentalement
que les ostéoblastes et autres components de la niche cellulaire influencent le
statut du cycle cellulaire des HSCs (Wilson et al. 2007). Les facteurs de
croissance peuvent agir au niveau des progéniteurs primitifs, comme
l’interleukine 3 (IL3), l’interleukine 6 (IL6), le « stem cell factor » (SCF), le « Flt-
3 ligand » (FL) et la thrombopoïétine (TPO), ou sur des précurseurs myéloïdes
comme l’érythropoïétine (EPO), le « myeloid-colony stimulating factor » (M-CSF)
et le « granulocyte-colony stimulating factor » (G-CSF), ayant un rôle plutôt
spécifique à une lignée cellulaire (Lim, M et al. 2007) (figure 4). Les cytokines
et la niche cellulaire semblent jouer un rôle dans la prolifération et différentiation
fournissant un environnement permissif et sélectif.
7
Figure 4 : Hématopoïèse et cytokines impliquées dans la différentiation
cellulaire. Tirée de Lim, M et al. 2007. Abréviations : SCF = stem cell factor; FL = Flt-3
ligand; IL = interleukin; EPO = erythropoietin; TPO = thrombopoietin; GM-CSG = granulocyte-
macrophage-colony-stimulating factor; G-CSG = granulocyte-CSF; M-CSF = macrophage-CSF
lineages: CFU = colony forming unit; GEMM = granulocyte erythrocyte macrophage and monocyte;
Ba = basophil; Eo = eosinophil; Meg = megakaryocyte; E = erythrocyte; NK = natural killer
1.4 Facteurs de transcription dans l’hématopoïèse
Plusieurs facteurs de transcription favorisent l’engagement des HSCs en lignée
spécifique et leur confèrent un phénotype spécifique. L’activité de certains
facteurs de transcription est plutôt associée à la différentiation d’une lignée,
comme GATA1 (différenciation terminale des érythrocytes et des
8
mégacaryocytes) et SPI1/PU.1 (essentiel pour le développement des
granulocytes, des lymphocytes B et T et des macrophages), alors que l’activité
d’autres facteurs est plutôt requise pour la formation ou les fonctions des HSCs,
comme par exemple MLL (Mixed-Lineage Leukemia), RUNX1 (Runt-Related
Transcription Factor 1), ETV6 (ETS Variant 6), TAL1 (T-cell acute lymphocytic
leukemia protein 1) et LMO2 (LIM Domain Only 2). Nonobstant la distinction
dans le niveau d’action de ces facteurs, ces protéines régulatrices peuvent aussi
agir dans d’autres stades de l’hématopoïèse (Orkin, S. H. & Zon, L. I. 2008)
(figure 5).
Les gènes MLL, RUNX1, ETV6, TAL1 et LMO2 sont fréquemment impliqués dans
des translocations chromosomiques associées à des néoplasies hématologiques,
notamment dans des leucémies aiguës.
Les gènes « homeobox » (HOX) sont des facteurs de transcription qui participent
au développement de plusieurs tissus incluant le système hématopoïétique. Ils
sont exprimés dans les HSCs et progéniteurs de la moelle osseuse et jouent un
rôle dans l’induction de la différentiation terminale (Abramovich, C. &Humphries,
R. K. 2005) (Sauvageau, G. et al. 1994) (Lawrence, H.J. et al. 1995) (Pineault,
N. et al. 2002). Les souris homozygotes HoxA9 -/- sont viables mais présentent
certains défauts du système hématopoïétique, incluant une réduction du nombre
de précurseurs myéloïdes et de progéniteurs de cellules B, et une diminution de
la réponse au facteur G-CSF (« granulocyte colony-stimulating factor ») (Izon,
D. J. et al. 1998) (Lawrence, H.J. et al. 1997).
Plusieurs gènes ont été identifiés et caractérises au niveau moléculaire à partir
des cellules leucémiques des patients, et leur rôles dans la régulation de
l’hématopoïèse et dans la leucémogénèse ont été mis en évidence par des
modèles murins. Différents gènes impliqués dans l’autorenouvellement ou la
différentiation des cellules souches hématopoïétiques sont dérégulés dans les
leucémies, comme les gènes HOX, la voie WNT/βCATENINE et l’axe
PTEN/AKT/FOXO affectant les propriétés d’autorenouvellement, ou les gènes
SPI1/PU.1 et CEBPA associés à la différentiation myéloïde (Faber, J. et al. 2009)
(Wang, Y. et al. 2010).
9
Lorsque les processus d’autorenouvellement et différentiation deviennent
dérégulés ou découplés, les leucémies peuvent survenir.
Figure 5 : Facteurs de transcription importants dans l’hématopoïèse. Tirée de
Orkin, S. H. & Zon, L. I. 2008. La figure montre le stade de blocage de l’hématopoïèse en
absence du facteur de transcription pointé. Abréviations : LT-HSC, long-term hematopoietic stem
cell; ST-HSC, short term hematopoietic stem cell; CMP, common myeloid progenitor; CLP,
common lymphoid progenitor; MEP, megakaryocyte/erythroid progenitor; GMP,
granulocyte/macrophage progenitor; RBC, red blood cells
10
2. Leucémies aiguës
2.1 Définition et leucémogénèse
La leucémie est un cancer de cellules du système hématopoïétique humain causé
par une accumulation d’altérations génétiques et/ou épigénétiques, qui
modifient le programme de développement normal de la cellule souche
hématopoïétique ou d’un progéniteur et les transforment en cellules souches
leucémiques (LSC) capables de propager la maladie clonale (Vogelstein, B &
Kinzler, K.W. 2004). Les LSCs, identifiées dans des leucémies myéloïdes aiguës
(LMA) humaines, sont phénotypiquement liées aux HSCs normales car toutes les
deux expriment plusieurs protéines de surfaces cellulaires similaires. Les cellules
souches leucémiques ont une capacité illimitée d’autorenouvellement et sont
responsables de la maintenance de la leucémie. Le programme leucémogénique
est caractérisé par un arrêt de la différentiation cellulaire, l’augmentation accru
de la prolifération cellulaire, l’autorenouvellement, la diminution de l’apoptose
et la maintenance de télomères (Warner, J.K. et al. 2004). Les blastes, qui
prolifèrent de manière anormale et excessive, sont bloqués à un stade de
différentiation cellulaire et finissent par envahir complètement la moelle osseuse
puis le sang périphérique. Les blastes peuvent envahir plusieurs organes comme
la rate (splénomégalie), le foie (hépatomégalie), le thymus, les testicules, les
ganglions (adénopathies), et le système nerveux. Une compréhension claire du
processus leucémogénique requiert une caractérisation des événements
moléculaires et cellulaires, qui sous-tendent les lésions génétiques et la
croissance tumorale.
2.2 Classification des leucémies aiguës
2.2.1 Leucémies myéloïdes aiguës
Les leucémies aiguës humaines sont classifiées par l’organisation mondiale de la
santé (WHO) selon leur information génétique, morphologie, cytochimie,
immunophénotype et caractéristiques cliniques. Dans cette classification, le
terme myéloïde inclus toutes les cellules qui appartiennent à la lignée
granulocytaire (neutrophile, éosinophile, basophile),
11
monocytaire/macrophagique, érythrocytaire, mégacaryocytaire, et
mastocytaire. Les caractéristiques morphologiques, cytochimies et/ou
immunphénotypes sont utilisées pour définir la lignée des cellules néoplasiques
et évaluer leur maturation. Dans les cas de leucémies aiguës, la cytométrie de
flux est la méthode de choix dans la détermination de la lignée leucémique aussi
bien que dans la détection du profil antigénique aberrant dans le suivi de la
maladie. Différentes méthodes de diagnostic clinique sont utilisées à la
recherche d’anomalies génétiques récurrentes : cytogénétique, « reverse
transcriptase-polymerase chain reaction » (RT-PCR) et « fluorescence in situ
hybridization » (FISH). L’analyse cytogénétique des cellules blastiques doit être
réalisée afin de déterminer le diagnostic et pronostic de la leucémie. La RT-PCR
et/ou FISH sont les méthodes de diagnostic clinique de choix dans la détection
d’anomalies cytogénétiques non-détectables par caryotype conventionnel, et
dans le suivi thérapeutique à la recherche de maladie résiduelle.
Les LMA présentant un réarrangement du gène MLL sont classifiées dans le
groupe des LMA avec des anormalités génétiques récurrentes. Un exemple
caractéristique correspond à ce groupe est la LMA par gènes de fusion de MLL
avec la translocation t(9;11)(p22;q23) ; MLL-AF9 (ALL1-fused gene from
chromosome 9) ou MLL-MLLT3 (Mixed-lineage leukemia translocated to
chromosome 3) (en rouge dans le tableau 1) (Vardiman, J.W. et al. 2009). Ce
mémoire se concentre spécifiquement sur le groupe de leucémies MLL.
12
Tableau 1 : Classification « WHO » pour les néoplasies myéloïdes et leucémies aiguës Acute myeloid leukemia and related neoplasms
Acute myeloid leukemia with recurrent genetic abnormalities
AML with t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1
AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11
APL with t(15;17)(q22;q12); PML-RARA
AML with t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL
AML with t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214
AML with inv(3)(q21;q26.2) or t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1
AML (megakaryoblastic) with t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1
Provisional entity; AML with mutated NPM1
Provisional entity; AML with mutated CEBPA
Acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes
Therapy-related myeloid neoplasms
Acute myeloid leukemia, not otherwise specified
AML with minimal differentiation
AML without maturation
AML with maturation
Acute myelomonocytic leukemia
Acute monoblastic/monocytic leukemia
Acute erythroid leukemia
Pure erythroid leukemia
Erythroleukemia, erythroid/myeloid
Acute megakaryoblastic leukemia
Acute basophilic leukemia
Acute panmyelosis with myelofibrosis
Myeloid sarcoma
Myeloid proliferations related to Down syndrome
Transient abnormal myelopoiesis
Myeloid leukemia associated with Down syndrome
13
Blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm
Tiré et adaptée de Vardiman, J. W. et al. 2009
2.2.2 Leucémies lymphoïdes aiguës
Les leucémies lymphoïdes aiguës (LLA) sont classifiées par la WHO en deux
groupes : les leucémies lymphoblastiques de cellules B (LLA-B) et les leucémies
lymphoblastiques de cellules T (LLA-T). Dans le cadre de cette étude, il est
important de souligner la translocation t(v;11q23) entre le gène MLL (11q23) et
un gène partenaire variable (v) engendrant une fusion MLL. Cette translocation
est trouvée dans les groupes des leucémies aiguës à phénotype mixte/ambiguë
et des leucémies lymphoblastiques de cellules B (en rouge dans le tableau 2).
Tableau 2 : Classification « WHO » pour les leucémies lymphoïdes aiguës Acute leukemias of ambiguous lineage
Acute undifferentiated leukemia
Mixed phenotype acute leukemia with t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1
Mixed phenotype acute leukemia with t(v;11q23); MLL rearranged
Mixed phenotype acute leukemia, B-myeloid, NOS
Mixed phenotype acute leukemia, T-myeloid, NOS
Provisional entity; natural killer (NK) cell lymphoblastic
leukemia/lymphoma
B lymphoblastic leukemia/lymphoma
B lymphoblastic leukemia/lymphoma, NOS
B lymphoblastic leukemia/lymphoma with recurrent genetic abnormalities
B lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(9;22)(q34;q11.2); BCR-
ABL 1
B lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(v;11q23); MLL rearranged
B lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(12;21)(p13;q22) TEL-AML
(ETV6-RUNX1)
B lymphoblastic leukemia/lymphoma with hyperdiploidy
B lymphoblastic leukemia/lymphoma with hypodiploidy
B lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(5;14)(q31;q32) IL3-IGH
B lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(1;19)(q23;p13.3); TCF3-
14
PBX1
Tiré et adaptée de Vardiman, J. W. et al. 2009
2.3 Leucémies aiguës humaines impliquant les gènes de fusion de MLL
Aux États-Unis, environ 15 000 nouveaux cas de leucémies aiguës sont
détectées par an, dont 25% sont de leucémies lymphoblastiques aiguës, et 75%
sont de leucémies myéloïdes aiguës.
Les leucémies lymphoblastiques aiguës sont les maladies malignes les plus
fréquentes chez les enfants et adolescents (Meyer, L. H. et al. 2011). Les
réarrangements du gène MLL dans la région chromosomique 11q23 sont trouvés
dans une diversité des néoplasies hématologiques, comme les LMA, LLA-B et
LLA-T. Les translocations de MLL sont à l’origine d’environ 80% des leucémies
chez les bébés de 0 à 12 mois. Ces translocations sont également très fréquentes
dans les leucémies secondaires survenant après traitement avec des inhibiteurs
de la topoisomérase (Kaneko, Y. et al. 1988) (Borkhardt, A. et al. 2002) (Pui, C.
H. et al. 1989) (Super, H. J. et al. 1993) et la radiothérapie. Globalement, les
réarrangements du gène MLL sont détectés dans environ 5 à 10% des LMA et 8
à 10% des LLA. Les bébés de 0-12 mois ayant le diagnostic de la leucémie
lymphoïde aiguë avec translocation du gène MLL ont un pronostic défavorable
avec une survie inférieure à 50% (Chen, C. S. et al. 1993) (Rubnitz, J. E. et al.
1994) (Pui, C.H. et al. 2002) (Pui, C. H. et al. 2007). Les cinq partenaires les
plus fréquents impliqués dans 80% de toutes les leucémies aiguës MLL sont :
(t(4;11)(q21;q23), MLL–AF4 ou MLL-MLLT2 (~35%); t(9;11)(p22;q23), MLL–
AF9 ou MLL-MLLT3 (~25%); t(11;19)(q23;p13.3), MLL–ENL ou MLL-MLLT1
(~5%); t(10;11)(p12;q23), MLL–AF10 ou MLL-MLLT10 (~%5); et
t(6;11)(q27;q23), MLL–AF6 ou MLL-MLLT4 (~5%) (Daser, A. & Rabbitts, T. H.
2005) (figure 6A). Les plus communes de ces translocations sont MLL-AF4, MLL-
ENL et MLL-AF9 chez l’enfant avec la LLA (Meyer, C. et al. 2013). Il semble que
MLL-AF4 possède un effet tumorigène puissant capable d’initier la LLA chez
l’enfant. Dans les leucémies secondaires, le phénotype le plus fréquent est la
LMA. Les gènes partenaires de MLL plus fréquents impliqués dans de tels cas
15
sont : ELL (~30%), AF4 (~5%), AF9 (~10%) et AF10 (~5%) (Daser, A. &
Rabbitts, T. H. 2005) (figure 6B).
Figure 6 : Proportions de différentes anomalies chromosomiques impliquant le
gène MLL dans les leucémies aiguës. Tirée de Daser, A. & Rabbitts, T. H. 2005. Dans les leucémies associées au gène MLL, les gènes partenaires sont trouvés dans différentes
fréquences et représentés dans (A) leucémies aiguës spontanées et (B) leucémies aiguës liées à
la thérapie
Une caractéristique commune aux leucémies lymphoïdes et myéloïdes ayant un
réarrangement du gène MLL est le haut niveau de l’expression de gènes HOX
principalement les 5’-HOXA (HOXA5-11) (Armstrong, S. A. et al. 2002)
16
(Fernando, A. A. et al. 2003) (Rozovskaia, T. et al. 2001) (Drabkin, H. A. et al.
2002).
3. Gène MLL (Mixed-Lineage Leukemia)
3.1 Caractérisation
Le gène MLL, antérieurement appelé HTRX (human trithorax) et ALL-1, est
l’homologue humain du gène trithorax de la Drosophila melanogaster. Il est situé
dans la bande chromosomique 11q23 (figure 7).
Figure 7 : Localisation du gène MLL dans le chromosome 11
Le gène MLL possède 36 exons, codant pour une protéine nucléaire de 430 KDa
(Daser, A. & Rabbitts, T. H. 2004) (Krivtsov, A.V. & Armstrong, S. A. 2007)
(figure 8). La protéine MLL possède différents domaines d’interaction formant
un complexe multi-protéique, qui joue un rôle dans la régulation de la
transcription. Les domaines de MLL s’associent à un potentiel de liaison à l’ADN
et de répression transcriptionnelle au niveau N-terminal et à une activation
transcriptionnelle au niveau C-terminal. Au niveau N-terminal, MLL possède le
domaine AT hook, qui lie la protéine aux séquences de l’ADN riche en AT, suivi
par les sites SNL1 et 2 (speckled nuclear localization), puis par le domaine TRD
(transcriptionnal repression domain), constitué de deux sous-domaines : RD1 et
RD2 (Zeleznik-Le, N. J. et al. 1994). RD2 contient des homologies avec le
domaine DNMT1 (DNA methyl-transferase), incluant des motifs en doigts de zinc
17
CxxC, et recrute des protéines polycomb répresseurs HPC2 et BMI1 et le
corépresseur CTBP. RD2 recrute les répresseurs transcriptionnels, histones
déacétylases HDAC1 et HDAC2, qui peuvent aussi interagir avec RD1. Tout de
suite après les sous-domaines RD1 et RD2, il y a le domaine PHD (Plant
Homology Domain), qui possède des motifs en doigts de zinc et est impliqué
dans des interactions protéine-protéine, comme l’interaction MLL-Cyp33. Cyp33
est une cyclophiline nucléaire capable de potentialiser la liaison de HDAC1 au
domaine de répression (Xia, Z. B. et al 2003). Le domaine TAD (transcriptional
activation domain) qui se lie directement au coactivateur CBP (CREB-binding
protein) est une acétyltransférase, qui possiblement acétyle les histones H3 et
H4 et se lie aux promoteurs de gènes HOX. Proche de la région C-terminale, il y
a le domaine SET (Su(var)3-9 enhancer-of-Zeste, et trithorax), une histone
méthyltransférase, qui méthyle la lysine 4 sur l’histone H3 (H3-K4). La
méthylation H3-K4 est une marque épigénétique associée à l’activation
transcriptionnelle. Il semble que la méthylation H3-K4 joue un rôle direct dans
l’activation des gènes HOX par le domaine SET du gène MLL (Milne, T. A. et al.
2002) (Nakamura, T. et al. 2002) (figure 9). Les gènes trithorax, ainsi que la
famille des gènes Polycomb, jouent un rôle important dans la régulation de
l’expression épigénétique par modification de la structure de la chromatine.
Cette modification de la chromatine est souvent le résultat d’activité des histones
acétyltransférase et méthyltransférase sur des différents résidus et histones,
ayant des impacts d’activation ou de répression.
18
Figure 8 : Domaines et interactions de la protéine MLL. Tirée de Krivtsov, A.V.
& Armstrong, S. A. 2007
Dans les leucémies, la caractéristique la plus remarquable de MLL est la diversité
de gènes partenaires avec lesquels MLL se fusionne (Ayton, P. M. & Cleary, M.
L. 2001) (Collins, E. C. & Rabbitts, T. H. 2002). MLL est le principal gène impliqué
dans les translocations chromosomiques réciproques associées aux leucémies
aiguës de novo et aux leucémies reliées à la thérapie de tous les âges affectant
les cellules lymphoïdes et myéloïdes (Look, A. T. 1997) (Huret, J. L. et al. 2001)
(Rowley, J. D. 1993).
3.2 Rôle de MLL dans le développement embryonnaire et l’expression des gènes HOX
Des modèles animaux ont bien illustrés le rôle crucial de MLL dans le contrôle de
l’expression de gènes HOX et dans les développements du squelette et du
système hématopoïétique des mammifères. Les souris MLL knock-out (KO) ont
montré que l’expression de gènes HOX dans un stade spécifique du
développement est initiée normalement mais qu’elle n’est pas maintenue en
absence de MLL, démontrant le rôle de MLL dans l’expression appropriée de ces
gènes (Yu, B. D. et al. 1995). L’inactivation du gène MLL par la méthode de
recombinaison homologue chez la souris KO a aussi démontré que le gène MLL
est un régulateur de l’hématopoïèse et un important régulateur du
développement embryonnaire, suivi des anomalies d’expression des gènes HOX
étant plus signifiant pour les gènes HOXA7, HOXA9, HOXA10, HOXC4, HOXC8 et
HOXC9 dans les embryons et foies fœtaux (Yu, B. D. et al. 1995) (Yagi, H. et al.
1998) (Hess, J. L. et al. 1997). Il a été démontré par analyse du multi-complexe
19
MLL que le gène MLL se lie directement aux promoteurs de HOXA9 et HOXC8
(Milne, T. A. et al. 2002) (Nakamura, T. et al. 2002). Il semble que les protéines
de fusion de MLL générées par des translocations chromosomiques dans les
leucémies sont elles-mêmes des facteurs transcriptionnels de régulation, qui
peuvent être déterminants dans l’expression de gènes HOX dans les
réarrangements de MLL (Ayton, P. M. & Cleary, M. L. 2001) (Collins, E. C. &
Rabbitts, T. H. 2002). Les souris hétérozygotes MLL+/- ont montré des
anomalies positionnelles squelettiques bidirectionnelles (niveau postérieur et
antérieur), caractéristiques d’une mutation des gènes trithorax. Les souris
hétérozygotes MLL+/- présentent une anémie, un retard de croissance marqué
et des précurseurs hématopoïétiques défectueux (Yu, B. D. et al. 1995) (Yagi,
H. et al. 1998). Les souris KO de MLL ne sont pas viables, et une évaluation
détaillée de l’hématopoïèse du sac vitellin et du foie fœtal a montré des
déficiences dans la prolifération et/ou dans la survie des progéniteurs
hématopoïétiques chez ces souris (Hess, J. L. et al. 1997). Les embryons MLL
KO sont déficients de l’activité des HSCs dans la région aorte-gonade
mésonéphros du développement embryonnaire. MLL joue un rôle aussi bien dans
l’hématopoïèse embryonnaire, principalement au niveau de la spécification ou
l’expansion des HSCs, que dans l’hématopoïèse définitive chez les souris adultes,
où une diminution de cellules myéloïdes et lymphoïdes a été associée à
l’inhibition de MLL (Ernst, P. et al. 2004).
3.3 Réarrangements chromosomiques impliquant MLL
Les réarrangements chromosomiques impliquant le gène humain MLL sont
associés au développement de leucémies aiguës (Pui et al. 2002) (Pui et al.
2003). Généralement, les réarrangements de MLL sont initiés par des situations
de dommages à l’ADN, qui induisent la réparation par la recombinaison non-
homologue (NHEJ) (Reichel, M. et al. 1998) (Richardson, C. & Jasin, M. 2000).
Plusieurs évidences pointent vers un accident dans la réparation de l’ADN par
NHEJ, comme la raison la plus probable de l’origine des translocations 11q23.
Les leucémies aiguës par anomalies de MLL sont liées en général à un pronostic
défavorable. Les réarrangements de MLL sont repartis en translocations
20
chromosomiques et duplication partielle en tandem de MLL (MLL-PTD). Ces deux
types d’altérations génétiques génèrent des protéines oncogéniques MLL
conservant les motifs « AT-hooks » et des doigts de zinc CxxC dans l’extrémité
amino-terminale, qui sont cruciaux pour la capacité de transformation des
fusions MLL (Slany, R. k. et al. 1998).
3.3.1 Translocations chromosomiques
La translocation chromosomique représente le mécanisme le plus fréquent
affectant MLL dans différents types de leucémies. La région « breakpoint
cluster region » (BCR) de 8.3 kilobases (Kb), située entre les exons 8 et 13, est
la cible pour la majorité des réarrangements de MLL. Cette région contient des
sites de clivage de la topoisomérase II et des régions d’attachements à la matrice
nucléaire pouvant contribuer au mécanisme de la translocation. Dans la
translocation 11q23, le gène MLL maintient les 8 à 13 premiers exons,
dépendamment du point de cassure, et fusionne à un nombre variable d’exons
du gène partenaire de fusion. Malgré l’hétérogénéité de gènes partenaires de
fusion, toutes les translocations 11q23 suppriment l’importante région 3’ de MLL
et fusionnent l’extrémité 5’ restante aux gènes partenaires, amenant à une
délétion des domaines PHD, TA et SET de la protéine MLL. En outre, la région N-
terminale fusionnée de MLL possède les domaines de liaison de l’ADN, « AT-
hooks » et MT, et les régions critiques SNL1, SNL2 (Li, Z-Y et al. 2005) (figure
9). Un point de cassure plus proximal ou distal n’est pas compatible avec un
potentiel de transformation. Il a été démontré que la perte du domaine PHD est
essentielle pour la leucémogénèse de la protéine de fusion MLL. De plus,
l’inclusion de ce domaine au niveau des protéines de fusion MLL-AF9 et MLL-ENL
abolit leur capacité d’immortaliser les progéniteurs hématopoïétiques (Muntean,
A. G. et al. 2008) (Chen, J. et al. 2008).
21
Figure 9 : Représentations schématiques du type sauvage et des protéines
aberrantes de MLL. Tirée de Li, Z-Y et al. 2005
3.3.2 Duplication partielle en tandem de MLL (MLL-PTD)
Les MLL-PTDs consistent d’une répétition d’exons de MLL dans l’orientation 5’
vers la 3’ amenant à une séquence potentiellement traduisible (Caligiuri, M. A.
et al. 1994) (Schichman, S. A. et al. 1994). Cette duplication est retrouvée
globalement dans 3 à 10% des LMA adultes (Schnittger, S. et al. 2000) (Steudel,
C. et al. 2003), mais elle s’associe fréquemment aux LMA avec trisomie du
chromosome 11 (jusqu’à 90% de MLL-PTDs dans ces LMA) (Caligiuri, M. A. et
al. 1994) (Schichman, S. A. et al. 1994). Le réarrangement MLL-PTD a été
associé à un pronostic défavorable évalué par la survie globale et la survie sans
rechute, proportionnellement à d’autres anomalies récurrentes dans les LMA à
caryotype normal, comme les aberrations des gènes CEBPA et NPM1 avec
l’absence de la mutation FLT3-ITD (Schlenk, R. F. et al. 2008).
22
Il y a trois sous-types de duplication partielle en tandem qui ont été découverts :
le sous-type I (duplication Ex9/Ex3), le sous-type II (duplication Ex10/Ex3) et
le sous-type III (duplication Ex11/Ex3). Les fréquences de ces sous-types dans
LMA sont 58%, 14% et 28% respectivement (Steudel, C. et al. 2003). Deux
observations révèlent les mécanismes potentiels par lesquels MLL-PTD peut
dérégler l’hématopoïèse normale : (1) domaines de liaison de l’ADN « AT-
hooks » et CxxC répétitifs montrent une transactivation potentielle in vitro
(Martin, M.E. et al. 2003) et (2) études indiquent que l’autre allèle MLL sauvage
est inactivé par la méthylation dans le cas de MLL-PTD (Whitman, S. P. et al.
2008). Les MLL-PTDs semblent servir de médiateurs dans la dimérisation de la
région N-terminale de MLL, un processus qui démontre être suffisant pour
induire la transformation leucémogénique in vitro (Martin et al. 2003).
3.3.3 Amplification de MLL
L’amplification du gène MLL a été identifiée dans des LMA et SMD associés à un
mauvais pronostic et caryotype complexe (Andersen, M. K. et al. 2001)
(Zatkova, A. et al. 2004). Ces patients présentent plusieurs copies intra-
chromosomiques non-réarrangées du gène MLL, probablement pour faciliter sa
surexpression. L’analyse de son expression a identifié MLL comme une cible
importante de l’amplification 11q23 et soutient un rôle étiologique dans le gain
de fonction dans des leucémies myéloïdes.
3.4 Partenaires de fusion de MLL
Les fusions géniques MLL sont caractérisées par une multitude des gènes
partenaires de fusion de MLL, dont 79 ont été identifiés et caractérisés au niveau
moléculaire (Meyer, C. et al. 2013) (Marschalek, R. 2011) (Meyer, C. et al.
2009). La notion de « réseaux de gènes de fusion » pour la formation de gènes
de fusion avec une diversité de gènes partenaires a été proposée par Bohlander,
S. K. en 2000. La même fusion de MLL peut être impliquée dans les différents
types de leucémies aiguës (LMA, LLA-B et LLA-T) et cela est le cas pour le
partenaire ENL. Chaque fusion de MLL peut être associée à un ou plusieurs
phénotypes, et l’identité du gène partenaire semble jouer un rôle instructif dans
la détermination de la lignée leucémique (myéloïde versus lymphoïde). Les
23
partenaires plus fréquents impliqués dans les LMA et LLA chez les nourrissons,
les enfants et les adultes en différentes proportions sont : AF4, AF9, ENL, ELL,
AF10 et AF6 (Meyer, C. et al. 2013) (figure 10).
Figure 10 : Classification de patients selon leurs groupes d’âge et type de
maladie. (En haut) Fréquence des plus fréquentes partenaires de fusion de MLL dans la cohorte
de patients étudiés présentant la leucémie aiguë par réarrangements du gène MLL (n= 1590).
Cette cohorte de patients a été divisée en patients avec ALL (à gauche) et AML (à droite). Noms
des gènes sont écrits en noir, et les pourcentages sont indiqués avec des numéros blancs. Il été
impossible de classifier trente-trois patients dans les types de maladie ALL ou AML respectivement.
(Au centre) Fréquences des partenaires de fusion de MLL pour les groupes de patients :
nourrissons, enfants et adultes. (En bas) Sousdivision de tous les trois groupes d’âge des patients
en ALL et AML. Numéros négatifs confèrent à nouveaux le nombre de patients n’étant pas classés
ni dans le sousgroupe ALL ni dans le sousgroupe AML. Tirée de Meyer, C. et al. 2013
24
Les partenaires de fusion sont classés en cinq groupes : les protéines nucléaires,
les protéines cytoplasmiques, les septines, les histones acétyltransférase et le
groupe de réarrangements MLL-PTD (Krivtsov, A.V. & Armstrong, S. A. 2007)
(tableau 3). Les partenaires de fusion les plus récurrents dans les leucémies par
réarrangements de MLL sont des gènes codant pour des protéines nucléaires :
MLLT2/AF4, MLLT3/AF9, MLLT1/ENL, MLLT10/AF10 et ELL (Meyer, C. et al.
2006). Le groupe de protéines cytoplasmiques, GAS7, EEN, AF1p ou Eps15, AF6
et AFX, peut avoir les domaines de dimérisation par « coiled coil » (hélices
hydrophobes) qui induisent une dimérisation/oligomérisation de MLL et sont
importants pour leur potentiel de transformation (So, C. W. et al. 2003) (So, C.
W. & Cleary, M. L. 2003). Le petit groupe codant pour les septines, SEPT2,
SEPT5, SEPT6, SEPT9 et SEPT11, semble participer en plusieurs processus
comme dans le contrôle du cycle cellulaire, le trafic vésiculaire et le
cloisonnement de la membrane plasmatique. Le groupe des histones
acétyltransférase, p300 et CBP, forme des complexes avec le type sauvage de
MLL via le domaine TA, qui est aussi supprimé dans les fusions de MLL. Le groupe
des réarrangements MLL-PTD représente 4 à 7% de toutes les LMA avec
caryotype normal et est le résultat de la duplication en tandem des certains
exons (Caligiuri, M. A. et al. 1996) (Schichman, S.A. et al. 1994).
25
Tableau 3 : Classification des partenaires de fusion de MLL
Tiré de Slany, R.K. 2009
3.4.1 Mécanismes moléculaires de leucémogénèse des fusions MLL
Une multitude de différents gènes partenaires de fusion de MLL peuvent causer
la même maladie par deux modes différents. Premièrement, toutes les protéines
de fusion MLL partagent la même structure de MLL dans la région N-terminale
en suite du domaine CxxC excluant le domaine PHD. Secondairement, les
protéines de fusion de MLL sont classées en partenaires de fusion nucléaire et
26
cytoplasmique, selon que 6 protéines de fusion (AF4, AF9, ENL, AF10, ELL et
AF6) sont les plus fréquentes impliquées et contribuent pour plus de 85% de
tous les cas de leucémies impliquant MLL (Burmeister, T. et al. 2009) (Meyer,
C. et al. 2009). Différentes études suggèrent que l’acquisition de nouvelles
propriétés par la fusion de MLL avec les gènes partenaires amène la production
d’une protéine oncogénique active. Plusieurs modèles animaux knock-in (KI) ont
démontré que MLL a besoin d’un partenaire de fusion pour devenir
leucémogénique, alors que seulement la suppression de la région C-terminale
ne cause pas de leucémies chez la souris (Dobson, C. L. et al. 1999) (Dobson,
C. L. et al. 2000).
3.4.1.1 Partenaires de fusion nucléaire : élongation transcriptionnelle
Des études récentes ont montré que les protéines oncogéniques MLL agissent
comme facteur de transcription étant capable indistinctement d’activer plusieurs
différents promoteurs (Schreiner, S. A. et al. 1999). Le gène ENL est un
partenaire de fusion nucléaire et sa fonction cellulaire est impliquée dans
l’élongation de la transcription. Il a été démontré que ENL et AF9 sont capables
d’interagir avec d’autres partenaires de fusion comme AF4, AF5 (homologue
d’AF4), et possiblement AF10. Le gène ENL peut aussi se lier à l’histone H3
pouvant être impliqué dans le remodelage de la chromatine (Zeisig, D. T. et al.
2005). Le mécanisme commun de l’élongation de la transcription pour la plupart
des réarrangements de MLL est le recrutement du facteur pTEFb (« positive
transcription elongation factor b »). La purification du complexe ENL « associated
protein complex » (EAP) a permis de découvrir que ENL interagit avec le facteur
pTEFb et l’histone méthyltransférase DOT1L (Bitoun, E. et al. 2007) (Mueller, D.
et al. 2007) (Zhang, Y. et al. 2012). Le facteur pTEFb est un dimère composé
de la cycline dépendante de kinase 9 (CDK9) et de la cycline T qui phosphorylent
le domaine carboxy-terminal (CTD) de la RNA polymerase II permettant une
efficiente élongation transcriptionnelle (Peterlin, B. M. & Price, D. H. 2006).
L’histone méthyltransférase DOTL1 méthyle la lysine 79 sur l’histone H3
(H3K79). La méthylation H3K79 est associée à l’élongation de la transcription
suggérant que les gènes de fusion de MLL accroissent le taux de l’élongation par
DOT1L en surexprimant des gènes avec des potentiels leucémogéniques (Bernt,
27
K. M. et al. 2011). Des études récentes ont montré que la plupart des protéines
de fusion MLL ont une activité de méthylation H3K79 augmentée. De plus, les
acides aminés du gène ENL interagissant directement avec l’histone
méthyltransférase DOT1L sont essentiels pour la transformation par MLL-ENL
des progéniteurs de la moelle osseuse (Monroe, S.C. et al. 2011). Une
augmentation significative de la méthylation H3K79 a été trouvée dans
l’activation de gènes Hoxa9 par MLL-ENL (Milne, T. A. et al. 2005). Le gène ELL
codant pour le facteur d’élongation de la RNA polymérase II a été premièrement
caractérisé comme un partenaire de fusion de MLL (Thirman, M. J. et al. 1994).
ELL est un des trois membres de la famille de gènes ELL humains aussi capable
d’augmenter l’activité de l’élongation de la RNA polymérase II in vitro (Miller, T.
et al. 2000) (Shilatifard, A. et al. 1997). Le partenaire ELL interagit avec des
protéines homologues d’AF4, et il semble interagir indirectement avec le
complexe d’élongation EAP (Simone, F. et al. 2001) (Simone, F. et al. 2003)
(Zeisig, D. T. et al. 2005) (figure 11). Le partenaire AF9 encode pour une
protéine nucléaire riche en serine et proline associée à l’élongation de la
transcription dépendante du facteur pTEFb. (Zhang, Y. et al. 2012). Il a été
démontré que les plus communs gènes partenaires de fusion de MLL, dont AF9
et ENL, existent dans le complexe SEC (« Super Elongation Complex »)
contenant aussi la méthyltransférase DOT1L (Bernt, K. M. & Armstrong, S. A.
2011). Une étude récente a démontré que la fusion MLL-AF9 est dépendante de
l’aberration de la méthylation H3K79 par DOT1L (Bernt, K. M. et al. 2011).
28
Figure 11 : Partenaires de fusion nucléaire sont potentiellement impliqués dans
l’élongation transcriptionnelle. Tirée de Zeisig, D. T. et al. 2005
3.4.1.2 Partenaires de fusion nucléaire CBP et p300 : acétylation d’histone
Les fusions MLL avec les histones acétyltransférases « CREB binding protein »
CBP et l’homologue p300 ont été trouvées dans quelques cas de leucémie
secondaire liée à la thérapie, ce qui a incité l’investigation d’un possible mode
d’activation de MLL (Bennett, C. A. et al. 2009) (Sobulo, O. M. et al. 1997).
Ultérieurement, des analyses de fonction structurelle ont démontré que les
bromodomaines et les domaines acétyltransférases de l’histone CBP sont
nécessaires et suffisants pour la fonction oncogénique de ces protéines de fusion
MLL (Rowley, J. D. et al. 1997). Bien que les conséquences de l’expression de la
fusion MLL-CBP/p300 n’aient pas encore été investiguées, l’hypothèse la plus
probable est que le recrutement constant de l’activité HAT conduira à une hyper-
acétylation de la chromatine et une augmentation du taux de la transcription.
29
3.4.1.3 MLL-EEN : arginine méthyltransférase spécifique
Bien que le partenaire de fusion EEN ait été cloné à partir d’un seul cas de
leucémie MLL, la fusion MLL-EEN a été étudiée en détail. Étonnamment, des
études biochimiques ont démontré l’interaction du partenaire EEN avec l’arginine
méthyltransférase PRMT1 par l’adaptateur protéique SAM68 (Cheung, N. et al.
2007). PRMT1 est une arginine méthyltransférase spécifique agissant dans le
noyau et cytoplasme. Lorsque que PRMT1 se retrouve proche de plusieurs
substrats cytoplasmiques, elle est aussi capable d’ajouter des groupements
méthyls au résidu d’arginine 3 sur l’histone H4. Cette modification de la
chromatine est associée à une augmentation d’acétylation des histones (Pal, S.
& Sif, S. 2007).
3.4.1.4 Partenaires de fusion cytoplasmique : dimérisation
Quelques partenaires de fusion sont cytoplasmiques et leur capacité de
transformation semble être plus faible que celle des protéines nucléaires. La
présence de motifs « self-association » dans quelques partenaires de fusion MLL
a conduit plusieurs chercheurs à suggérer la dimérisation ou oligomérisation
comme étant le mécanisme responsable de la transformation de cette catégorie
de fusion. Les fusions de MLL avec les protéines cytoplasmiques GAS7, AF1p et
AF6 activent leurs propriétés transcriptionnelles et oncogéniques par le
mécanisme de dimérisation de MLL (So, C. W. et al. 2003). Le domaine de
dimérisation « coiled-coil » du partenaire de fusion EEN est maintenu et est
essentiel pour la leucémogénèse de la fusion MLL-EEN. En outre, MLL-EEN
pourrait agir comme un facteur de transcription potentiel transformant le
promoteur de HOXA7 en gène cible potentiel de MLL (Liu, H. et al. 2004). Il est
aussi important de considérer que toutes les fusions MLL sont amenées au noyau
dû à la présence des domaines SNL1 et SNL2 dans la région N-terminale de MLL
(Caslini, C. et al. 2000).
3.4.2 Mécanisme moléculaire de leucémogénèse de MLL-PTD
Un autre mécanisme possible de réarrangement MLL est l’activation des gènes
HOX par la duplication partielle en tandem de MLL. Un modèle de souris « knock-
in » MLL-PTD a rapporté la surexpression de certains gènes Hoxa (Hoxa7, Hoxa9,
30
Hoxa10), (Dorrance, A. M. et al. 2006). Ce mécanisme et la fonction biologique
demeurent controversés. Une étude sur le profil d’expression génique de
patients pédiatriques avec LMA a démontré un profil d’expression génique des
leucémies MLL-PTD différent de celui des leucémies de fusion MLL, suggérant
des mécanismes de leucémogénèse sous-jacents différents (Ross, M. E. et al.
2004).
31
4. Hypothèse et objectifs
4.1 La problématique
Les leucémies aiguës avec les gènes de fusion de MLL sont d’intérêt particulier
dû à leurs caractéristiques cliniques et biologiques communes. Il est d’intérêt
commun de clarifier (1) si le phénotype leucémique est déterminé par le gène
partenaire de fusion de MLL et/ou le microenvironnement, (2) les voies
moléculaires impliquées dans la transformation leucémogénique, (3) si la
leucémogénèse est initiée par un seul évènement ou plusieurs évènements et
(4) le type de cellule (HSC et/ou progénitrices) affectée. L’étude in vivo de la
transformation d’une cellule souche hématopoïétique humaine en une cellule
souche leucémique est un outil essentiel permettant d’étudier les mécanismes
cellulaires et moléculaires impliqués dans la leucémogénèse humaine.
4.2 Hypothèse et objectifs
L’hypothèse proposée dans ce mémoire est d’étudier si les fusions géniques MLL-
ENL, MLL-AF9 et MLL-ELL ont la même capacité d’initier la leucémogénèse
humaine.
Un premier objectif est de tester la capacité des fusions MLL-ENL, MLL-AF9 et
MLL-ELL de générer des leucémies dans un modèle in vivo. Un deuxième objectif
est de démontrer le rôle possible instructif des partenaires de fusion ENL, AF9
et ELL et/ou du microenvironnement de la souris immunodéficiente dans la
détermination du phénotype leucémique myéloïde ou lymphoïde.
33
Chapitre II – Matériel et Méthodes
1. Purification de cellules souches/progénitrices de sang de cordon ombilical humain par sélection négative (CB-Lin)
Les poches de sang de cordon ombilical humain sont obtenues après
consentement des femmes accouchant au Centre Hospitalier Universitaire de
Québec et de l’Hôtel-Dieu de Lévis. Les dons sont combinés dans une bouteille
stérile sous la hotte biologique, dilués avec du « Phosphate-Buffered Saline »
(PBS) à 2% de sérum de veau fœtal (FCS) et agités doucement par rotation
manuelle. Ensuite, 3 volumes de sang sont doucement déposés sur 1 volume de
Ficoll et centrifugés pour 30 minutes à 1500 rotation par minutes (RPM) à la
température ambiante. Les couches cellulaires sont récoltées, déposées dans du
PBS à 2% FCS et centrifugées pour 10 minutes à 1200 RPM. Le surnageant est
enlevé, la couche cellulaire est resuspendue dans du chlorure d’ammonium froid,
incubée pour 15 minutes, passée dans un tamis cellulaire, puis centrifugée pour
10 minutes à 1200 RPM afin d’éliminer les globules rouges. Le culot cellulaire est
resuspendu dans du PBS à 2% FCS, et un cocktail d’anticorps composé de CD2,
CD3, CD7, CD14, CD16a, CD19, CD24, CD56, CD66b, CD235a et CD41, l’anti-
CD41 et un colloïde magnétique sont ajoutés. Le mélange est incubé pour 40
minutes à la température ambiante avec douce agitation, et après les cellules
sont passées sur une colonne magnétique pour faire la sélection négative : les
cellules marquées avec le cocktail d’anticorps et l’anti-CD41 restent dans la
colonne, et les cellules non-marquées par anticorps passent à travers la colonne.
Cette étape a le but d’éliminer les cellules terminalement différentiées pour
garder les cellules plus primitives (CD34+). À la fin, une fraction des cellules qui
passent à travers la colonne sont marquées avec les anticorps CD34/CD38
humains et analysées par la cytométrie en flux. Le pourcentage de cellules CD34
positives est écrit sur le microtube cryovial et dans l’inventaire de cellules de
sang de cordon ombilical humain, puis les cellules sont congelées avec du FCS à
20% de diméthylsulfoxyde (DMSO).
34
Le cocktail d’anticorps (EasySep®) utilisé contient des anticorps contre les
respectifs antigènes de surfaces cellulaires :
CD2 : cellules T et « Natural killer »
CD3 et CD7 : cellules T
CD14 : monocytes
CD16a : cellules « natural killer » et macrophages
CD19 : cellules B
CD24 : cellules B et granulocytes
CD56 : cellules « natural killer »
CD66b : granulocytes
CD235a : érythrocytes
CD41 : plaquettes et mégacaryocytes
2. Technique de clonage
Dans notre modèle in vivo, la technique de clonage est fondamentale car elle
permet d’étudier différents gènes de fusion de MLL impliqués dans les leucémies
aiguës humaines. Trois fusions géniques sont choisies pour cette étude : MLL-
ENL, MLL-AF9 et MLL-ELL. Dans le but d’avoir un modèle inductible de leucémie
aiguë humaine, deux autres constructions rétrovirales sont créées à partir d’un
plasmide possédant l’oncogène MLL-ENL : MLL-ENL ER et MLL-ENL LoxP. Le
récepteur des estrogènes (ER) est introduit en 3` de la fusion génique MLL-ENL
pouvant activer ou désactiver l’oncogène MLL-ENL à l’aide du tamoxifene. Deux
sites LoxP composés de séquences d’ADN de 13 paires de bases et contenant
des sites de reconnaissance de l’enzyme Cre recombinase sont insérés entre la
fusion génique MLL-ENL. En présence de cette enzyme l’oncogène MLL-ENL peut
être excisé. Dans la technique de clonage, le plasmide de base utilisé est un
plasmide rétroviral appelé « Murine Stem Cell Virus » (MSCV) contenant deux
séquences « Long Terminal Repeat » (LTR) en 5’ et 3’, le promoteur PGK humain,
la protéine EGFP, le gène de la résistance pour l’antibiotique ampicilline, et une
séquence « Multi-Cloning Site (MCS). La technique de clonage consiste en
plusieurs étapes dans le but d’introduire l’insert d’intérêt dans un vecteur où le
gène de fusion de MLL et/ou de la protéine EGFP peut être exprimé.
35
Brièvement, deux plasmides (p), celui où se trouve l’insert et celui choisi comme
vecteur sont digérés avec des enzymes de restriction. Les produits digérés sont
migrés sur un gel d’électrophorèse d’agarose à 1% coloré au bromure d’éthidium
(10mg/ml) (Invitrogen®). Les fragments sont visualisés dans un
transilluminateur UV et découpés. Les ADN sont extraits avec le kit QIAquick Gel
Extraction (Qiagen®) selon le protocole du fabricant, et mesurés au
spectrophotomètre NanoDrop®. Ensuite une réaction de ligation a lieu. Le
plasmide créé par la réaction de ligation est introduit dans des bactéries
compétentes DH5α par la méthode de choc thermique, qui sont ensuite étalées
sous la flamme dans une plaque d’agar contenant du milieu LB (Luria Broth) et
de l’ampicilline (Sigma-Aldrich®) à une concentration finale de 100µg/ml et
incubées dans un incubateur à 37ºC pour toute la nuit. Quelques colonies de la
plaque d’agar sont sélectionnées et inoculées avec du milieu de culture LB et de
l’ampicilline (50mg/ml) à 37ºC sous-agitation pour 8 heures. Des mini-
préparations sont effectuées avec le kit GenElute Plasmid Miniprep (Sigma-
Aldrich®) selon le protocole du fabricant. Les DNA sont digérés avec des
enzymes de restriction afin de vérifier si l’insert est introduit dans le plasmide,
et si l’orientation de l’incorporation dans le vecteur est correcte, permettant
l’expression de la fusion génique et/ou de la protéine EGFP. Quelques colonies
portant l’insert dans la bonne orientation sont envoyées au séquençage.
2.1 Production d’ADN
Les plasmides générés sont produits en grande quantité pour permettre la
production de particule virale en vue de l’infection de cellules
souchesprogénitrices humaines. Un petit volume de chaque ADN, MLL-ENL, MLL-
ENL ER, MLL-AF9, MLL-ENL LoxP et MLL-ELL, est introduit dans des bactéries de
compétence DH5α par la méthode de choc thermique et celles sont étalées sous
la flamme dans une plaque ayant d’agar du milieu LB et de l’ampicilline. Le
lendemain matin après l’incubation à 37ºC, des colonies sont sélectionnées et
inoculées dans du milieu de culture LB et de l’ampicilline. Un millilitre (ml) de
cette culture est transféré dans 500 ml de milieu de culture LB et de l’ampicilline
36
(50mg/ml) à 37ºC sous-agitation pour toute la nuit. L’ADN est extrait avec le kit
« QIAGEN® Plasmid Maxi » selon le protocole du fabricant.
3. Production de rétrovirus avec des 293T
La technique est réalisée en 5 jours. Le jour pré-transfection, dans le but d’avoir
une expansion cellulaire, des cellules adhérentes (293T) sont ensemencées dans
des flasques T75 adhérents avec du milieu « Iscove’s Modified Dulbecco's
Medium (HyClone®) » (IMDM) à 10% de FCS et incubées à 37ºC pour toute la
nuit dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone (CO2). Le jour 1, ces
cellules sont récoltées, comptées et ensemencées dans 50 pétris (100 mm) de
culture cellulaire et retournées dans l’incubateur pour toute la nuit. Le jour 2, le
milieu est changé puis les cellules sont transfectées. La quantité d’ADN des 3
plasmides (VSV-G, PSY-ENV et MSCV avec gène d’intérêt) et de l’eau distillée
(milli-Q) pH 7.0 sont calculées. Le plasmide VSV-G « Vesicular Stomatitis Virus
Glycoprotein » possède le gène env codant pour la protéine d’enveloppe
responsable pour la formation de virion par les cellules 293T. Le plasmide PSY-
ENV possède les gènes gag et pol codant pour les protéines « coreproteins » :
le gène gag code pour la protéine de nucléocapside du rétrovirus responsable
pour l’encapsidation, et le gène pol code pour la transcriptase reverse
responsable pour la transcription de l’ARN viral en l’ADN. Le mélange des ADN
de trois plasmides et de l’eau (ADN-eau) est filtré sur une membrane 0.2 µm et
séparé dans des tubes stériles sur la hotte cellulaire. Du chlorure de calcium
(CaCl2) est ajouté goutte à goutte dans chaque tube du mélange ADN-eau, et le
volume total de chaque tube (ADN-eau-CaCl2) est transféré doucement dans une
série de tubes, qui contiennent du tampon « HEPES buffered saline » (HBS) 2X
pH 7.09. Ce complexe de solution (ADN-eau-CaCl2-HBS2X) repose 20 minutes
puis la moitié du volume de chaque tube est transférée goutte à goutte sur les
cellules 293T. L’ADN chargé négativement (groupements phosphates) est
incapable tout seul d’entrer dans la cellule dû à la charge positive de sa
membrane. Le CaCl2 est ajouté au mélange ADN-eau afin de neutraliser la
charge négative de l’ADN par liaison du calcium avec les groupements
phosphates de l’ADN. Ensuite, le tampon HBS est ajouté au mélange ADN-eau-
37
CaCl2 et précipite ce complexe, qui est englobé dans les cellules 293T par
endocytose. Le jour 3, le milieu de culture cellulaire de chaque pétri est changé
avec du milieu IMDM à 10% de FCS frais, et les pétris sont retournés dans
l’incubateur. Le jour 4, la première récolte de virus se fait. Le surnageant des
pétris est prélevés et filtrés stérilement. Du milieu IMDM à 10% de FCS frais,
pour la deuxième récolte, est remis dans chaque pétris, qui sont retournés dans
l’incubateur. Le volume total du surnageant filtré est divisé dans des tubes à
ultracentrifugation stériles et centrifugés pendant 2 heures à 22 000 RPM à 4ºC.
Après centrifugation, le surnageant de chaque tube est aspiré, le culot est
resuspendu dans 500 µl de milieu pour virus (X-Vivo 10, BSA 10%, L-Glutamine
200 mM), et les tubes cryovials sont congelés à -80ºC. Le jour 5, la deuxième
récolte est faite suivant le même protocole.
3.1 Titration de virus
La titration de virus est réalisée afin de connaitre le nombre de particules virales
obtenues et de calculer le volume nécessaire de virus à utiliser pour infecter les
cellules souches hématopoïétiques humaines.
Le protocole s’étend sur 4 jours et l’analyse est faite par cytométrie en flux
(FACS). Le jour 1, dans une plaque adhérente à 24 puits, 30 000 cellules Hela
sont ensemencées dans chaque puit avec du milieu IMDM à 10% de FCS et
incubées dans l’incubateur à 37ºC. Un total de 15 puits sont préparés par virus :
6 puits pour chaque récolte virale, 2 puits pour le comptage de cellules Hela et
1 puits pour le contrôle négatif. Le jour 2, les deux puits sont utilisés pour le
comptage, et les dilutions virales sont préparées pour chaque récolte virale de
la manière suivante : 1/40, 1/160, 1/400, 1/1000, 1/4000, 1/8000. Le
milieu/polybrene est préparé avec du IMDM à 10% de FCS et polybrene (Sigma-
Aldrich®) à 4mg/ml. Le jour 3, le surnageant de chaque puits est enlevé et du
milieu IMDM à 10% de FCS frais est ajouté. Le jour 4, les cellules Hela infectées
par rétrovirus sont récoltées avec de la trypsine-EDTA (Gibco®) et resuspendues
dans du PBS afin d’être analysées par FACS. À la machine, à chaque
concentration le pourcentage exprimant la protéine EGFP est déterminé. Les
38
données brutes sont analysées par le logiciel « FlowJo® » et entrées dans une
formule du programme « excel » pour le calcul du titre utilisée par le laboratoire.
4. Infection de cellules CB-Lin par rétrovirus
Le protocole d’infection de cellules CB-Lin par rétrovirus est composé d’un jour
de pré-stimulation et deux jours d’infections virales pour un total de 4
infections : deux infections par jour (matin et après-midi). Le jour de pré-
stimulation, les cellules CB-Lin sont décongelées, comptées et divisées dans une
plaque de culture cellulaire non-adhérente stérile à 6 puits à la concentration
maximale de 4 millions de cellules par puit avec du milieu et d’un cocktail de
cytokines. Le milieu utilisé appelé « Gene Transfer media » (GT) est préparé
avec du X-Vivo 10 (BioWhittaker®), du BSA (Roche®) à 1% et de la L-Glutamine
(Gibco®) à 2mM, et le cocktail est composé des plusieurs cytokines
recombinantes humaines (Invitrogen®) : SCF (100 ng/ml), FLT3L (100 ng/ml),
G-CSF (10 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml) et TPO (15 ng/ml). La plaque avec des
cellules CB-Lin, milieu et cytokines est mise en culture dans un incubateur à
37ºC pour toute la nuit. Une plaque de culture cellulaire adhérente stérile à 12
puits est préparée avec de la retronectine (Takara®) à une concentration finale
de 1 mg/ml. La retronectine est étalée au fond de chaque puit, et du PBS est
ajouté par-dessus. Cette plaque est laissée sur la hotte cellulaire à la
température ambiante pour toute la nuit. La retronectine est utilisée pour
augmenter l’efficacité de la transduction rétrovirale par ces 3 domaines de liaison
capables au même temps de lier la cellule et le rétrovirus les approximant et
facilitant l’infection. Le jour 1 en matinée, les cellules CB-Lin pré-stimulées sont
récoltées de la plaque et comptées. Le PBS de la plaque de retronectine est
aspiré, et environ 1 million de cellules CB-Lin pré-stimulées sont mis dans
chaque puit, qui contient de la retronectine. Le rétrovirus avec un titre entre 1
à 7.5 x 107, 13.3 µl/ml du cocktail de cytokines et du milieu GT pour compléter
1 ml sont ajoutés dans chaque puit (première infection). La plaque est remise
dans l’incubateur pour un minimum 9 heures. Dans l’après-midi, le surnageant
de chaque puit est séparément récolté et centrifugé. Le culot est resuspendu
dans du milieu GT et retourné dans son puit de la plaque. Du rétrovirus, des
39
cytokines et du milieu GT sont ajoutés suivant la même concentration et volume
de la première infection. Le jour 2, deux autres infections rétrovirales identiques
sont effectuées suivant le même protocole. Le lendemain de la quatrième
infection, les cellules sont lavées deux fois avec du PBS pour se débarrasser de
cellules mortes et des débris. Ensuite, les cellules sont comptées et un petit
volume de chaque type des cellules infectées est réservé pour vérifier le
pourcentage de l’expression de la protéine EGFP (« gene transfer ») par FACS.
Le volume correspondant à 250 000 cellules est réservé dans des microtubes
stériles pour l’injection intra-fémorale chez la souris. Les cellules excédantes
sont mises en culture avec du milieu IMDM à 15%FCS et des cytokines Il-3/SCF.
5. Culture cellulaire des cellules CB-Lin infectées par rétrovirus
Les cellules CB-Lin infectées par les rétrovirus contrôle (EGFP seule), MLL-ENL,
MLL-ENL ER, MLL-AF9, MLL-ELL et MLL-ENL LoxP sont gardées en culture
cellulaire avec du milieu IMDM à 15% de FCS et des cytokines IL-3 (10 ng /ml)
et SCF (100 ng/ml) dans le but d’étudier la prolifération cellulaire et de suivre
l’expression de la protéine EGFP par la cytométrie en flux. Une fois par semaine,
les cellules sont récoltées des flasques, centrifugées et comptées. Des volumes
correspondant à 2 millions de cellules sont remis dans des flasques non-
adhérents stériles, et du milieu IMDM à 15% de FCS et des cytokines IL-3 (10
ng /ml) et SCF (100 ng/ml) sont ajoutés pour avoir un volume final de 5 ml. Les
flasques sont remis dans l’incubateur à 5% de CO2 à 37ºC. Une petite quantité
de chaque cellules (~20 000) est analysée par FACS pour déterminer le
pourcentage de cellules EGFP positives.
6. Modèle in vivo de xénotransplantation
6.1 Souris immunodéficientes
Les souris immunodéficientes NOD/ShiLtSz-scid/IL2Rγ-/- (NSG) sont utilisées
dans le cadre de cette étude (Shultz, L. D. et al. 2005). Ces souris ont une
déficience complète de la chaîne gamma du récepteur interleukine 2 (IL2Rγ-/-).
40
La chaîne gamma du récepteur interleukine 2 (IL2Rγ) est requise pour la voie
de signalisation des cytokines IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 et IL-21 (Sugamura,
K. et al. 1996). Les souris IL2Rγ-/- présentent des défauts sévères de l’activité
de cellules « Natural Killer » (NK) et du développement des lymphocytes B et T,
ce qui améliore la prise de greffe de cellules humaines. Ces souris sont gardées
dans l’animalerie du centre de recherche avec des soins spéciaux comme de
l’eau autoclavée, de la nourriture irradiée, et sont manipulées au minimum sous
la hotte cellulaire.
6.2 Irradiation des souris immunodéficientes
La vielle des injections, les souris NSG sont irradiées à 200 cGy et maintenues
pendant un mois avec du Baytril à 25.5 mg/kg dilué dans leur eau, à l’exception,
des souris MLL-ENL ER qui sont traitées et maintenues avec du tamoxifene à
1mg/ml dans leur eau jusqu’à l’analyse.
6.3 Injection intra-fémorale
Brièvement, les souris NSG irradiées sont sédationées par l’inhalation
d’isofluorane. La région du genou droit est rasée et désinfectée. À l’aide d’une
aiguille, le fémur est perforé, et les cellules à tester sont directement injectées
dans le fémur de la souris. Les souris sont analysées si elles développent des
symptômes/signes de maladie ou à 20 semaines post-injection. La méthode
d’injection intra-fémorale permet aux cellules souches hématopoïétiques
humaines d’être livrées directement dans leur niche adéquate promouvant un
robuste greffon et prévenant la résistance de l’hôte par quelques facteurs
présents dans la circulation dans le cas d’une transplantation intraveineuse, ce
qui pourrait limiter la prise de greffe de cellules HSCs humaines (McKenzie, J. L.
et al. 2005).
6.4 Analyse des souris
Pour fins d’analyse, la moelle osseuse (fémurs, tibias, et pelvis), le foie, la rate
et le thymus et le sang sont récoltés. La rate et le thymus sont pesés. Des
suspensions de cellules sont faites pour analyser les organes désirés par
41
cytométrie en flux. Chaque souris est initialement analysée pour connaitre la
prise de greffe, le pourcentage de cellules EGFP et le phénotype des cellules
EGFP positives.
7. Cytométrie en flux
L'intérêt de cette méthode est de distinguer et de séparer différentes populations
cellulaires d'une même suspension cellulaire. Plusieurs paramètres peuvent être
étudiés dont la taille, la granulation et la fluorescence de chaque cellule. Dans le
cadre de ce mémoire, les marquages sont compris de 4 fluorochromes (FITC,
PE, PC5 et APC), et les acquisitions sont faites par l’appareil FACS Calibur
(Becton Dickinson®). Toutes les données brutes sont analysées par le logiciel
FlowJo®.
7.1 Analyse préliminaire
Les cellules présentes dans chacune des suspensions cellulaires provenant des
moelles osseuses et des rates sont réparties dans une série de tubes. Dans ces
tubes, les cellules sont marquées avec les anticorps suivants conjugués avec des
fluorochromes : le CD19 (PE), le CD33 (PC5) le CD45 humain (APC). Toute
couleur verte (FITC) visualisée dans l’analyse provient de l’expression de la
protéine EGFP par des cellules transduites.
7.2 Analyse supplémentaire
Cette analyse consiste à déterminer le phénotype leucémique, c’est-à-dire
lymphoïde, myéloïde ou mixte, et de vérifier si les cellules souches
hématopoïétiques et/ou progénitrices sont bloquées dans leur maturation.
Les souris présentant un pourcentage signifiant de cellules humaines EGFP
positives, ont leurs moelles osseuses, rates, et sang marqués avec plusieurs
anticorps différents conjugués avec des fluorochromes. Les six différents
marquages d’anticorps utilisés dans l’analyse supplémentaire sont détaillés en
bas :
GlyA (PE)/hCD45 (PC5)
42
CD38 (PE)/CD34 (PC5)/hCD45 (APC)
CD14 (PE)/CD11b (PC5)/CD33 (APC)
HLA DR (PE)/CD117 (PC5)/CD33 (APC)
CD19 (PE)/CD20 (PC5)/CD10 (APC)
IgD (PE)/IgM (PC5)/hCD45 (APC)
43
Chapitre III – Résultats
Les cellules CB-Lin infectées par des rétrovirus contrôle exprimant la EGFP ou
un gène de fusion de MLL et la EGFP ont été injectées dans le fémur de souris
immunodéficientes irradiées. Ces souris ont été sacrifiées après 20 semaines de
l’injection ou lors du développement de la leucémie, et certains de ses organes
ont été analysés avec différents marqueurs de surface cellulaire par cytométrie
en flux.
1. Analyse de l’expression de la protéine EGFP
Le lendemain de la quatrième infection de cellules CB-Lin par rétrovirus, soit le
jour d’injection chez la souris immunodéficiente NSG, environ 10 000 cellules
ont été réservées pour l’analyse de l’expression de la protéine EGFP par
cytométrie en flux. Le pourcentage d’EGFP variait selon l’oncogène. Les cellules
infectées avec le rétrovirus contrôle ont atteint un pourcentage d’EGFP de 20%.
Les infections avec les rétrovirus MLL-ENL et MLL-AF9 ont présenté un
pourcentage d’EGFP de 4% et 3.8% respectivement. Les cellules infectées avec
les rétrovirus MLL-ELL et MLL-ENL LoxP ont eu un pourcentage d’EGFP de 11%
et 1.6% respectivement (figure12).
44
Figure 12 : Pourcentage de cellules EGFP positives infectées avec des rétrovirus.
2. Prolifération cellulaire in vitro
Au moins 100 000 cellules de chaque infection rétrovirale ont été mises en
culture cellulaire avec du milieu IMDM, du FCS et des cytokines IL3 et SCF. Il
faut souligner que dans le cadre de cette étude, les cellules n’ont pas été triées
sur leur positivité pour la protéine EGFP. Une fois par semaine toutes les cultures
ont été analysées par FACS pour la EGFP. Environ 13 semaines après le début
de la culture cellulaire, les cellules MLL-ENL, MLL-ENL ER et MLL-ELL
présentaient presque 0% de EGFP. Par contre, après 18 semaines, les cellules
MLL-ENL LoxP et MLL-AF9 présentaient les pourcentages de EGFP de 98% et
97,7% respectivement. Seulement, les cellules infectées avec les rétrovirus MLL-
ENL LoxP et MLL-AF9 démontraient une croissance importante par rapport le
contrôle (figure 13). Ce profil de croissance cellulaire a bien été démontré par
l’équipe du Dr Barabé dans le passé (Barabé, F. et al., 2007).
45
0 50 100 150 200 2500
5
10
15
20
25
Jours
ContrôleMLL-ENLMLL-ENL ERMLL-ENL LoxPMLL-ELLMLL-AF9
Figure 13 : Prolifération cellulaire in vitro.
3. Caractérisation des leucémies aiguës humaines avec les gènes de fusion de MLL dans le modèle in vivo
Certains critères ont été utilisés pour caractériser les différents types de
leucémies aiguës humaines développées par les souris : signes cliniques et
morphologie des tissus, et immunophénotypage par l’analyse de cytométrie en
flux.
3.1 Observations des signes cliniques et morphologie des organes
Deux sur 43 souris, MLL-ELL et MLL-AF9, présentaient des signes cliniques après
une période de latence d’environ 15 semaines. Les signes cliniques ont été
caractérisés premièrement par une anémie sévère avec l’apparition des oreilles
blanches accompagnés par une respiration lente et difficile. Les autres 41 souris
ne présentaient pas des signes cliniques et ont été sacrifiées après 20 semaines.
La morphologie des organes internes de toutes les souris a été très hétérogène.
Les tailles des rates et des foies des souris avec phénotype leucémique ont
macroscopiquement été plus grosses en comparaison avec les souris normales.
Les poids des rates ont été environ 4.5 fois plus élevés (splénomégalie) (figure
46
14) et des thymus n’ont pas présenté de différence significative comparée aux
souris contrôles (figure 15). La moelle osseuse des souris leucémiques présentait
une couleur très pâle, et les souris normales une nuance différente de rouge.
Contrôle
(n=
7)
Non-mal
ade
(n=
24) M
alad
e
(n=
12)
Ra
te (
mg
)
Figure 14 : Poids des rates des souris contrôle, non-malade et malade.
Figure 15 : Poids des thymus des souris contrôle, non-malade et malade.
3.2 Analyse de cellules par cytométrie en flux
Vingt semaines après la transplantation ou lors du développement de la maladie,
les souris ont été sacrifiées, et la moelle osseuse (fémurs, tibias, et pelvis), la
rate, le thymus, le sang périphérique et le foie ont été extraits afin d’être
analysés par cytométrie en flux. Dans le cadre de ce mémoire, 43 souris ont été
47
analysées. Une analyse préliminaire a été effectuée sur des cellules provenant
de la moelle osseuse et de la rate des souris contrôles et leucémiques afin de
quantifier le greffon humain (hCD45) et de connaitre la lignée cellulaire
impliquée dans le phénotype leucémique : lymphoïde B (CD19) ou myéloïde
(CD33). Une deuxième analyse plus détaillée a été réalisée sur des cellules
humaines EGFP positives (hCD45+EGFP+) provenant de la moelle osseuse, de
la rate et du sang périphérique des souris contrôles et leucémiques. Dans un
premier temps, cette analyse consistait à déterminer le phénotype leucémique,
c’est-à-dire lymphoïde B, myéloïde ou mixte (lymphoïde B et myéloïde). Dans
un deuxième temps, cette analyse consistait à démontrer la maturation et la
différentiation terminale des cellules hématopoïétiques humaines. Les
phénotypes que nous avons obtenus ont été diversifiés dépendamment de
l’oncogène transformant les cellules CB-Lin.
3.2.1 Analyse de souris injectées par des cellules transduites avec les rétrovirus contrôle, MLL-ENL et MLL-ENL ER
Aucune cellule humaine EGFP positive (hCD45+EGFP+) n’a été détectée lors de
l’analyse des souris MLL-ENL et MLL-ENL ER démontrant que ces souris n’ont
pas développé des leucémies (quadrant supérieur droit) (figure 16).
48
Figure 16 : Analyse des cellules des souris MLL-ENL et MLL-EN ER.
Les quadrants supérieurs droits présentent les cellules humaines transduites par les rétrovirus
contrôle, MLL-EN et MLL-ENL ER exprimant la EGFP. Les graphiques montrent une souris
représentative dans l’ensemble de chaque groupe.
hCD45
Contrôle MLL-ENL MLL-ENL ER
EGFP
Moe
lle o
sseu
se
Tableau 4 : Résumé de résultats in vivo
49
3.2.2 Analyse de souris injectées par des cellules transduites avec les rétrovirus contrôle, MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP
Les souris MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP ont généré des phénotypes
leucémiques différents : LLA-B, LMA et mixte. Les trois groupes de souris ont
développé le phénotype LLA-B. Les souris MLL-ELL et MLL-AF9 ont développé de
plus le phénotype LLA-B, les phénotypes LMA et mixte respectivement. Les
souris MLL-ENL Lx ont développé exclusivement le phénotype LLA-B (tableau 4).
3.2.2.1. Phénotype leucémique LLA-B
Les cellules humaines EGFP positives de la moelle osseuse des souris contrôles,
MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP ont premièrement été analysées avec les
marqueurs de surface cellulaire lymphoïde B (CD19) et myéloïde (CD33) (figure
17-A). Cette analyse a démontré que les souris MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL
LoxP présentaient une population de cellules lymphoïdes B importante (CD19+)
et se différenciaient des souris contrôles, qui présentaient trois populations de
cellules différentes. Ces trois populations caractérisaient par une population de
cellules de souris (hCD45-CD19-CD33-), et deux populations de cellules souches
hématopoïétiques/progénitrices humaines EGFP positives : lymphoïde B
(CD19+) et myéloïde (CD33+) (figure 17-B). Par la suite, une analyse plus
détaillée avec les marqueurs de surface cellulaire lymphoïdes B (CD19, CD20,
CD10) a été prise en compte dans le but de vérifier la maturation des cellules
EGFP positives de la moelle osseuse des souris MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL
LoxP. Cette analyse a démontré que ces cellules étaient positives pour les
marqueurs lymphoïdes B CD19 et CD10 (figure 18-A), mais négatives pour le
marqueur lymphoïde B plus mature CD20 (figure 18-B) comparativement aux
cellules B des souris contrôles, qui démontraient une maturation B normale
(CD19+CD20+) (figure 18-B). Ce profil de marquage a démontré un arrêt de la
différentiation cellulaire au stage pro-B dans la moelle osseuse. Lors de l’analyse
plus détaillée, les cellules EGFP positives du sang périphérique des souris
contrôles, MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP ont été analysées avec les
marqueurs lymphoïdes B CD19 et CD20 et les immunoglobulines de surface IgD
et IgM afin d’investiguer la différentiation terminale. Cette analyse a démontré
50
que les cellules des souris MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP étaient bloquées
dans leur maturation, étant CD19+CD20- (≥ 90%), alors que des souris
contrôles étaient double positives CD19+ et CD20+ (figure 19-A). Les cellules
humaines EGFP positives du sang périphérique des souris MLL-ELL, MLL-AF9 et
MLL-ENL LoxP étaient négatives pour les immunoglobulines IgD et IgM, et des
souris contrôles étaient positives (56%) (figure 19-B) (figure 19-C). Ce profil de
marquage a démontré un arrêt de la différentiation terminale (figure 3).
Figure 17 : Analyse préliminaire des cellules de la moelle osseuse des souris
leucémiques LLA-B.
(A) Les quadrants supérieurs droits montrent les cellules humaines transduites exprimant la EGFP
dans la moelle osseuse. (B) Cellules humaines transduites par MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP
exprimant la EGFP et le marqueur lymphoïde B CD19 dans la moelle osseuse. Pour les cellules
transduites par MLL-ELL, MLL-AF9, seulement le phénotype leucémique LLA-B est inclus dans cette
analyse. Les graphiques montrent une souris représentative dans l’ensemble de chaque groupe.
MLL-ELL MLL-AF9 MLL-ENL LoxP A Contrôle
CD
19
hCD45
EGFP
CD33
B
51
Figure 18 : Bloc de différentiation au stage pro-B des cellules des souris
leucémiques LLA-B.
(A) Cellules transduites par MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP exprimant la EGFP et les
marqueurs lymphoïdes B CD19 et CD10 dans la moelle osseuse. (B) Cellules transduites par MLL-
ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP exprimant la EGFP et le marqueur lymphoïde B CD19 dans la moelle
osseuse. Les graphiques montrent une souris représentative dans l’ensemble de chaque groupe.
MLL-ENL LoxP Contrôle MLL-AF9 MLL-ELL A
CD10
CD
19
C
D1
9
CD20
B
52
Figure 19 : Différentiation terminale des cellules des souris leucémiques LLA-B.
(A) Cellules transduites par MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP du sang périphérique exprimant
la EGFP et le marqueur lymphoïde B CD19. (B) Les quadrants supérieurs droits montrent les
cellules humaines transduites exprimant la EGFP dans le sang périphérique. (C) Cellules humaines
transduites par MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP positives pour la EGFP et négatives pour les
immunoglobulines IgD et IgM dans le sang périphérique. Les graphiques montrent une souris
représentative dans l’ensemble de chaque groupe.
CD20
CD
19
EG
FP
hCD45
IgD
IgM
B
C
Contrôle MLL-ELL MLL-AF9 MLL-ENL LoxP A
53
3.2.2.1.1Analysedesrates
Les cellules de la rate des souris contrôles, MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP
ont été analysées avec les marqueurs hCD45, CD19 et CD33. Cette analyse a
démontré une seule population de cellules leucémiques lymphoïdes B chez les
souris MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP, comparativement aux souris
contrôles qui présentaient deux populations de cellules différentes : une
lymphoïde B et une mixte (lymphoïde B et myéloïde) (figure 20-A) (figure 20-
B).
Figure 20 : Analyse initiale des cellules de la rate des souris leucémiques LLA-B.
(A) Les quadrants supérieurs droits montrent les cellules humaines transduites exprimant la EGFP
dans la rate. (B) Cellules humaines transduites par MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP exprimant
la EGFP et le marqueur lymphoïde B CD19 dans la rate. Les graphiques montrent une souris
représentative dans l’ensemble de chaque groupe.
3.2.2.1.2Analysedufoieetduthymusàlarecherched’infiltrationleucémique
Les cellules du foie et du thymus des souris contrôles, MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-
ENL LoxP ont été analysées avec les marqueurs CD19, CD33 et hCD45 pour
MLL-AF9
hCD45
CD
19
MLL-ENL LoxP Contrôle
Rat
e
EGFP
CD33
MLL-ELL
B
A
54
démontrer, premièrement s’il y avait un infiltrat de cellules humaines, et par la
suite si cet infiltrat s’agissait de cellules leucémiques lymphoïdes B ou myéloïdes.
Aucune cellule humaine EGFP positive n’a pas été détectée dans le foie (figure
21-A) et le thymus (figure 22-A) des souris contrôles. Les souris MLL-ELL, MLL-
AF9 et MLL-ENL LoxP présentaient une population de cellules leucémiques
lymphoïdes B dans le foie (figure 21-B) et dans le thymus (figure 22-B).
Figure 21 : Infiltration leucémique lymphoïde B dans le foie.
(A) Les quadrants supérieurs droits montrent les cellules humaines transduites exprimant la EGFP.
(B) Cellules humaines transduites par MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP exprimant la EGFP et le
marqueur lymphoïde B CD19. Les graphiques montrent une souris représentative dans l’ensemble
de chaque groupe.
hCD45
Contrôle MLL-ENL LoxP MLL-ELL
Foie
EGFP
MLL-ELL
CD33
MLL-AF9
MLL-AF9
MLL-ENL LoxP
CD
19
A
B
55
Figure 22 : Infiltration leucémique lymphoïde B dans le thymus.
(A) Les quadrants supérieurs droits montrent les cellules humaines transduites exprimant la EGFP.
(B) Cellules humaines transduites par MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL LoxP exprimant la EGFP et le
marqueur lymphoïde B CD19. Les graphiques montrent une souris représentative dans l’ensemble
de chaque groupe.
3.2.2.2 Phénotype leucémique LMA
Dans un premier temps, les cellules de la moelle osseuse des souris contrôles et
MLL-ELL ont été analysées avec les marqueurs CD19, CD33 et hCD45. Cette
analyse a démontré que les cellules humaines EGFP positives (figure 23-A) de la
souris MLL-ELL présentaient exclusivement le phénotype leucémique myéloïde
CD33+ (figure 23-B). Dans un deuxième temps, afin de caractériser la
population de cellules leucémiques myéloïdes CD33+ dans cette souris MLL-ELL
(figure 23-B), d’autres marqueurs myéloïdes (CD33, CD117, CD11b et CD14) et
le marqueur de surface cellulaire HLA DR ont été testés. Seule la population de
cellules EGFP positives de la moelle osseuse de la souris MLL-ELL (figure 24-A)
a été prise en compte pour cette analyse. Ces cellules étaient
CD33+CD117+HLA DR+ (figure 24-B) et CD33+CD11b+ (figure 24-C).
Contrôle
EGFP
hCD45
MLL-ELL
Thym
us
MLL-ELL MLL-AF9 MLL-ENL LoxP
CD
19
CD33
MLL-AF9 MLL-ENL LoxP A
B
56
Figure 23 : Phénotype leucémique myéloïde de la moelle osseuse.
(A) Les quadrants supérieurs droits montrent les cellules humaines transduites exprimant la EGFP.
(B) Cellules humaines transduites par MLL-ELL exprimant la EGFP et le marqueur myéloïde CD33
(quadrant inférieur droit) dans la moelle osseuse. Les graphiques montrent une souris
représentative dans l’ensemble de chaque groupe.
3.2.2.2.1Analysedesratesdeleucémiemyéloïde
L’analyse préliminaire (CD19, CD33 et hCD45) des rates des souris contrôles et
MLL-ELL a démontré une population de cellules leucémiques myéloïdes CD33+
prédominante chez la souris MLL-ELL comparée aux souris contrôles qui
présentaient deux populations de cellules : une lymphoïde B (CD19+) et une
mixte (CD19+ et CD33+) (figure 24-D) (figure 24-E).
Contrôle MLL-ELL Contrôle MLL-ELL A B
CD
19
CD33
EGFP
hCD45
Moe
lle o
sseu
se
57
Figure 24 : Caractérisation de la population leucémique myéloïde de la moelle
osseuse et phénotype leucémique LMA de la rate.
(A) Cellules transduites par les rétrovirus contrôle et MLL-ELL exprimant la EGFP. (B) Cellules
transduites par MLL-ELL exprimant la EGFP, les marqueurs myéloïdes CD117 et CD33 et le
Contrôle MLL-ELL A
Sid
e S
catt
er (
SS
C)
CD33
MLL-ELL
EGFP
Contrôle
CD
11
7
MLL-ELL
CD33
MLL-ELL
CD33
Contrôle Contrôle
CD11b
CD
14
Contrôle
CD33
EGFP
MLL-ELL
Rat
e
hCD45
MLL-ELL
Moe
lle o
sseu
se
Contrôle
HLA
DR
MLL-ELL
CD
11
b
Contrôle
CD
19
D E
B
C
58
marqueur HLA DR. (C) Cellules transduites par MLL-ELL exprimant la EGFP et les marqueurs
myéloïdes CD11b et CD33. (D) Les quadrants supérieurs droits montrent les cellules humaines
transduites par les rétrovirus contrôle et MLL-ELL exprimant la EGFP dans la rate. (E) Cellules
humaines transduites par MLL-ELL exprimant la EGFP et le marqueur myéloïde CD33 (quadrant
inférieur droit) dans la rate. Les graphiques montrent une souris représentative dans l’ensemble
de chaque groupe.
3.2.2.3 Phénotype leucémique mixte
L’analyse des cellules humaines EGFP de la moelle osseuse des souris contrôles
et MLL-AF9 (figure 25-A) a démontré le phénotype mixte (lymphoïde B et
myéloïde) chez la souris MLL-AF9 (figure 25-B). Afin de savoir s’il s’agissait de
cellules ayant un phénotype mixte normal ou leucémique, ces cellules ont été
analysées avec plus des marqueurs permettant cette préciser leur nature
(marqueurs lymphoïdes B CD19, CD10 et CD20, et myéloïdes CD33 et CD11b).
L’analyse des cellules EGFP positives de la moelle osseuse des souris MLL-AF9
(figure 26-A) avec les marqueurs myéloïdes a démontré une population
anormale CD33+ et CD11b+ (figure 26-B), et par les marqueurs lymphoïdes B
une population lymphoïde B CD19+ et CD20+ (figure 26-C).
Figure 25 : Phénotype leucémique mixte.
(A) Les quadrants supérieurs droits montrent les cellules humaines transduites par les rétrovirus
contrôle et MLL-AF9 exprimant la EGFP. (B) Cellules humaines transduites par MLL-AF9 exprimant
la EGFP, le marqueur lymphoïde B CD19 et le marqueur myéloïde CD33 dans la moelle osseuse.
Les graphiques montrent une souris représentative dans l’ensemble de chaque groupe.
Contrôle
EGFP
hCD45
CD
19
Moe
lle o
sseu
se
MLL-AF9
CD33
MLL-AF9 Contrôle A B
59
Figure 26 : Caractérisation du phénotype leucémique mixte.
(A) Cellules transduites par les rétrovirus contrôle et MLL-AF9 exprimant la EGFP. (B) Cellules
transduites par MLL-AF9 exprimant la EGFP et les marqueurs myéloïdes CD11b et CD33. (C)
Cellules transduites par MLL-AF9 exprimant la EGFP et les marqueurs lymphoïdes B CD19 et CD20.
Les graphiques montrent une souris représentative dans l’ensemble de chaque groupe.
CD
11
b
Contrôle MLL-AF9
CD33 EGFP
MLL-AF9
CD
19
CD10
Moe
lle o
sseu
se
CD20
Contrôle
CD
19
Contrôle Contrôle MLL-AF9 MLL-AF9
B
C
A
Sid
e S
catt
er (
SS
C)
61
Chapitre IV – Discussion et Conclusion
1. Discussion
Les translocations chromosomiques impliquant le gène MLL sont associées à des
leucémies adultes et pédiatriques de divers phénotypes. Le gène MLL est
caractérisé par le grand nombre et la variabilité des gènes partenaires auxquels
il s’associe générant ainsi des fusions géniques codant pour des protéines
chimériques impliquées dans la leucémogénèse humaine. Ce mémoire a testé la
capacité des gènes de fusion de MLL d’induire la leucémogénèse humaine, et
conséquemment, le rôle possible instructif du partenaire de fusion MLL dans le
phénotype leucémique. Les résultats démontrent que les fusions géniques MLL-
ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL ont généré des phénotypes leucémiques distincts.
1.1 Les constructions rétrovirales MLL-ENL et MLL-ENL ER
Les résultats in vivo montrent que les souris MLL-ENL et MLL-ENL ER n’ont pas
développé des leucémies. De plus, aucune cellule humaine EGFP positive n’est
détectée lors de l’analyse de ces souris. Les cellules transduites avec les
rétrovirus MLL-ENL et MLL-ENL ER ne présentent pas un avantage de croissance
in vitro comparable aux cellules contrôles. Le jour d’injection chez la souris, les
pourcentages d’EGFP des cellules infectées avec les rétrovirus MLL-ENL et MLL-
ENL ER étaient respectivement 4% et 2.8% et ont diminué au cours de
l’expérience. L’oncogène MLL-ENL a été remarquablement démontré par l’équipe
du Dr Barabé en générant la leucémie LLA-B dans exactement le même modèle
in vivo de xénotransplantation que celui utilisé dans cette étude (Barabé, F. et
al., 2007). Dans nos souris MLL-ENL LoxP, le même oncogène reproduit les
données publiées par Barabé, F. et al., 2007, soit la leucémie LLA-B. Pourtant,
le fait de ne pas avoir des souris MLL-ENL et MLL-ENL ER leucémiques, nous
montre que des problèmes spécifiques reliés à cette expérience sont
responsables pour le phénotype normal trouvé pour ces souris. Un des
problèmes est associé au taux faible de « gene transfer » (pourcentage d’EGFP
des cellules infectées par rétrovirus) pouvant être responsable pour des effets
62
leucémogéniques insuffisants pour générer de la leucémie (Moriya, K. et al.
2012). Un autre problème est relié au type de cellules transduites par les
rétrovirus MLL-ENL et MLL-ENL ER (cellules souches hématopoïétiques humaines
versus progéniteurs humains) donnant un greffon à moyen/long terme.
Dans notre modèle conditionnel de leucémie MLL-ENL ER, l’activité
transcriptionnelle de l’oncogène MLL-ENL est dépendante du tamoxifene. Nos
souris injectées avec des cellules transduites avec le rétrovirus MLL-ENL ER
recevraient du tamoxifene dans leur eau afin de générer de la leucémie. Étant
donné que ENL est un gène partenaire de fusion nucléaire, son produit de
transcription est dépendant de sa localisation nucléaire. Le tamoxifene agit en
brisant la liaison entre MLL-ENL et les récepteurs d’estrogènes (ER) dans le
réticulum endoplasmique permettant que l’oncogène MLL-ENL soit retrouvé dans
le noyau générant de la leucémie. Les résultats démontrent que l’oncogène MLL-
ENL génère la leucémie LLA-B dans notre construction MLL-ENL LoxP et dans
l’étude in vivo publiée par Barabé, F. et al., 2007. Le laboratoire du Dr Barabé a
déjà testé la construction MLL-ENL ER dans le même modèle in vivo dans le
passé, et aucun phénotype leucémique n’a été généré et aucune cellule EGFP
n’a été détectée. Pourtant, l’absence de leucémies dans cette construction est
associée à des problèmes reliés spécifiquement au système ER/tamoxifene,
comme à une différence de la biologie du tamoxifene entre les deux espèces
(souris versus humain) empêchant que l’oncogène MLL-ENL soit retrouvé dans
le noyau et, par conséquence ne générant pas de la leucémie.
1.2 Les constructions rétrovirales MLL-ENL LoxP, MLL-AF9 et MLL-ELL
Les fusions géniques MLL-ELL, MLL-AF9 et MLL-ENL génèrent des phénotypes
leucémiques distincts : LLA-B, LMA et mixte. Lors de l’analyse, un pourcentage
élevé de cellules humaines EGFP positives est détecté dans la moelle osseuse
des souris. Par ailleurs, les cellules transduites avec les rétrovirus MLL-ENL LoxP
et MLL-AF9 présentent un avantage prolifératif in vitro en comparaison avec les
cellules contrôles. Le jour d’injection chez la souris, les pourcentages d’EGFP des
cellules infectées avec les rétrovirus MLL-ENL LoxP et MLL-AF9 étaient
63
respectivement 1.6% et 3.8% et ont augmentés au cours de l’expérience
atteignant 98%.
La construction rétrovirale MLL-ENL LoxP, tout comme la construction MLL-ENL
ER, a pour objectif de moduler l’expression de l’oncogène MLL-ENL une fois que
la leucémie est développée. Étant donné que la construction MLL-ENL ER n’a pas
fonctionné tant in vitro que in vivo, il a donc fallu se rabattre sur la construction
MLL-ENL LoxP pour tester nos hypothèses. Dans notre modèle in vivo, les souris
MLL-ENL LoxP développent exclusivement le phénotype leucémique LLA-B. Nos
résultats démontrent la capacité de l’oncogène MLL-ENL d’initier la
transformation leucémogénique et reproduisent l’étude in vivo publiée par notre
groupe démontrant que MLL-ENL développe exclusivement des leucémies LLA-B
dans le modèle de xénotransplantation (Barabé, F. et al., 2007).
Dans notre modèle in vivo de leucémogénèse humaine, les résultats démontrent
que la fusion MLL-AF9 a été capable d’initier la transformation leucémogénique
générant des phénotypes leucémiques LLA-B et des phénotypes leucémiques
mixtes en proportion similaire. Les souris MLL-AF9 n’ont pas développé la
leucémie LMA qui est normalement trouvée dans des modèles in vivo chez la
souris mais en faible proportion (Barabé, F. et al., 2007). Cependant, nos
phénotypes leucémiques LLA-B et mixte sont compatibles avec l’étude in vivo
publiée par notre groupe démontrant que MLL-AF9 développe des leucémies
LLA-B, LMA et mixte dans le modèle de xénotransplantation (Barabé, F. et al.,
2007). L’absence de la leucémie LMA dans nos résultats peut être dû au
microenvironnement de la souris immunodéficiente subléthalement irradiée qui
est très favorable à la reconstitution de cellules lymphoïdes B humaines et de
souris (Guenechea, G. et al., 2001) (Fulop, G. M. & Phillips, R. A. 1986). Il est
aussi possible que des caractéristiques intrinsèques des cellules CB-Lin ont dans
le début de l’expérience décidé l’engagement de la lignée cellulaire leucémique
vers la lignée lymphoïde ; cette notion est consistante avec les données cliniques
dont la leucémie LLA est cinq fois plus fréquente que LMA dans l’enfance
(Hjalgrim, L. L. et al. 2003).
64
Nos résultats démontrent aussi que la fusion génique MLL-ELL a été capable
d’initier la transformation leucémogénique générant des phénotypes
leucémiques LMA et des LLA-B. Malgré, notre phénotype leucémique LMA est en
faible proportion, il est compatible avec les données chez les patients, dont la
fusion MLL-ELL génère presque 100% de LMA (Meyer, C. et al., 2009).
(Marschalek, R., 2011) (Meyer, C. et al., 2013).
Cette étude démontrée que les fusions MLL-ENL, MLL-AF9 et MLL-ELL sont
capables d’induire la leucémogénèse humaine tant que le rôle possible instructif
du partenaire de fusion de MLL dans le phénotype leucémique : ENL, AF9 et ELL
impliqués dans le phénotype LLA-B, ELL dans le phénotype LMA et AF9 dans le
phénotype mixte. Nos résultats suggèrent également que le
microenvironnement de la souris immunodéficiente joue un rôle dans la
détermination du phénotype leucémique. La niche de la moelle osseuse est
composée par des différentes cellules non-hématopoïétiques, comme les
adipocytes, ostéocytes, chondrocytes, fibroblastes et macrophages (Chen, Ye et
al. 2012). Des évidences démontrent que le développement de la leucémie est
hautement dépendent des interactions cellulaires et des protéines de
signalisation du microenvironnement (Konopleva, M.Y. and Jordan, C.T. 2011)
(Colmone, A. et al. 2008) (Zhang, J. and Li, L. 2008) (Psaila, B. and Lyden, D.
2009). Il existe une tendance de notre modèle in vivo de favoriser la leucémie
LLA-B. Des études sur l’hématopoïèse humaine normale chez la souris
immunodéficiente irradiée ont démontré une propension du modèle de
xénotransplantation de favoriser la lymphopoïèse B humaine : six semaines
après la transplantation une proportion majeure de cellules lymphoïdes B
humaines par rapport les cellules myéloïdes humaines a été trouvée dans la
moelle osseuse des souris transplantées, distinguant de la moelle osseuse adulte
normale (Rossi, M. I. et al. 2001) (Manz, M.G. 2007). Des études in vitro et in
vivo sur la leucémogénèse humaine avec des cellules de sang de cordon humain
exprimant l’oncogène MLL-ENL ont démontré que des cellules ayant la capacité
d’initier la transformation leucémogénique lymphoïde B et/ou myéloïde étaient
présentes immédiatement après la transduction, mais ont généré exclusivement
la leucémie LLA-B lorsque elles étaient directement transplantées chez la souris
65
immunodéficiente (Barabé, F. et al. 2007). Le débalancement lymphoïde
B/myéloïde est possiblement en part dû à l’absence de réactivité croisée de
quelques cytokines myéloïdes de la souris, telles comme l’interleukine 3 (IL-3),
le « granulocyte-macrophage colony-stimulating factor » (GM-CSF) et le « stem
cell factor » (SCF) avec les cellules sanguines humaines (Manz, M.G. 2007). Des
études suggèrent la co-transplantation de cellules souches mésenchymateuses
humaines (hMSC) et cellules souches hématopoïétiques humaines (hHSC) dans
la constitution du microenvironnement non-hématopoïètique de la souris
immunodéficiente (Muguruma, Y. et al. 2006). La co-transplantation de hMSC et
cellules CB-Lin a démontré une augmentation du greffon de cellules souches
hématopoïétiques humaines dans un modèle de xénotransplantation, et un
changement de la prédominance de cellules lymphoïdes B vers myéloïdes (Noort,
W. A. et al. 2002) (in 't Anker, P. S. et al. 2003) (Angelopoulou, M. et al. 2003).
Bien que cette approche n’a pas démontré augmenter la prise de greffe de
cellules leucémiques LMA, elle peut favoriser l’étude de la leucémogénèse
myéloïde par le modèle de transduction rétrovirale avec transplantation (Lee, S.
T. et al. 2008).
2. Perspectives
Le laboratoire du Dr Barabé a quelques objectifs futurs impliquant la construction
MLL-ENL LoxP. Un des buts à l’avenir est d’exciser in vitro MLL-ENL des cellules
leucémiques LLA-B provenant de la moelle osseuse des souris primaires avec un
vecteur possédant l’enzyme Cre recombinase et un autre marqueur tel que
mCherry. Nous avons exhaustivement essayé sans succès d’exciser MLL-ENL de
ces cellules avec un vecteur adénovirus RDG modifié expressant la Cre
recombinase et le marqueur mCherry du fabricant « Vector Biolabs® ». Ce
vecteur adénovirus possède le motif d’aminoacides Arg-Gly-Asp (RDG) qui lie
aux récepteurs des intégrines αv des cellules favorisant son entrée par
endocytose dans les cellules leucémiques. La difficulté est de livrer l’adénovirus
dans les cellules leucémiques qui ne présentent pas le récepteur
CAR (« coxsackie–adenovirus receptor ») et expriment seulement 5%
d’integrines αvβ3 and αvβ5 (Yotnda, P. et al. 2004). Malgré de nombreux essais
66
et différentes stratégies/protocoles pour infecter ces cellules, les cellules MLL-
ENL LLA-B ne sont pas infectables par ces adénovirus. Il faudrait donc exciser
MLL-ENL par une autre stratégie, tel que par un rétrovirus ou une protéine TAT-
Cre. Le désavantage de la protéine TAT-Cre est que l’on ne peut pas connaitre
l’efficacité de la procédure. L’équipe du Dr Barabé connait bien la méthode
d’infection des cellules leucémiques par rétrovirus générant un taux de
transduction efficace. Dans un premier temps, il faut cloner la Cre recombinase
et le marqueur mCherry dans un vecteur rétrovirus de base. Postérieurement,
infecter les cellules LLA-B de la moelle osseuse des souris primaires avec ce
rétrovirus. Ensuite, trier ces cellules pour l’expression de la protéine mCherry
puis les injecter dans des souris secondaires afin d’étudier leur potentiel
leucémogénique. Nous voudrons démontrer si les cellules sans MLL-ENL sont
capables d’initier la transformation leucémogénique ou s’il faut vraiment la
présence de MLL-ENL pour le développement de la leucémie. Un autre but à
l’avenir est de réaliser plusieurs transplantations avec des cellules CB-Lin
transduites par le rétrovirus MLL-ENL LoxP, et ensuite exciser MLL-ENL in vitro
avec le rétrovirus Cre recombinase/mCehrry afin de démontrer ou non
l’importance des évènements secondaires dans le processus leucémogénique.
3. Conclusion
La compréhension détaillée de la leucémogénèse humaine requiert le
développement de modèles in vivo adéquats pour connaitre précisément le
processus leucémogénique. Nous avons testé le potentiel leucémogénique des
fusions MLL-ENL, MLL-AF9 et MLL-ELL dans l’induction de la leucémogénèse
humaine, et par conséquence le rôle possible instructif du partenaire de fusion
de MLL dans la détermination du phénotype leucémique. Les résultats suggèrent
que la transduction efficace des cellules donnant un greffon à moyen/long terme
est nécessaire pour générer des leucémies avec les gènes de fusion de MLL.
Cette étude démontre la capacité des fusions MLL-ENL, MLL-AF9 et MLL-ELL
d’induire la leucémogénèse humaine, étant donné que ces oncogènes ont
développés des leucémies, et le possible rôle instructif du partenaire de fusion
de MLL dans le phénotype leucémique : LLA-B (ENL, AF9 et ELL), LMA (ELL) et
67
mixte (AF9). Les résultats suggèrent également l’implication du
microenvironnement de la souris immunodéficiente dans le phénotype
leucémique LLA-B : l’évidence d’une proportion majeur de souris leucémiques
LLA-B sur une souris leucémique LMA. Les transplantations secondaires avec des
cellules provenant du notre modèle MLL-ENL LoxP/Cre recombinase pourront
aider à élucider si l’oncogène MLL-ENL requiert ou non des évènements
additionnels pour générer de la leucémie. La continuation de cette étude pourra
aider à meilleur comprendre le processus leucémogénique humain impliquant
ces fusions de MLL.
69
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![HumanLiverCellsExpressingAlbuminandMesenchymal ......bone marrow- (BM-) derived cells [20–22]. Activation of the pancreatic lineage in mice in vivo has been reported to occur in](https://img.pdfslide.fr/doc/110x75/60e09ab44a39df492a73ab90/humanlivercellsexpressingalbuminandmesenchymal-bone-marrow-bm-derived.jpg)
