Nouveaux outils de cytog énétique moléculaire (MLPA et CGH) utilis és en constitutionnel

COUTTON Charles

EC GénétiqueJeudi 12 Janvier 2012

Remaniements génomiques

• Regroupent les duplications, les délétions, les insertions, les inversions et les translocations.

• Impliquent des régions d’une centaine de paires de bases jusqu’à plusieurs millions

• A l’origine de: – polymorphismes bénins – maladies génétiques regroupées sous le nom

de maladies ou désordres génomiques

Mécanismes• Trois principaux mécanismes:

– NAHR (Non Allelic Homologous Recombination) ou recombinaison homologue non allélique

– NHEJ (Non Homologous End Joining) ou raccordement d’extrémités non homologues

– FoSTeS (Fork Stalling and Template Switching)

• Surviennent aussi bien dans les cellules germinales (méiose) que dans les cellules somatiques (mitose / mosaïque)

=> maladies génétiques / cancers

NAHR• Dérive d’un mécanisme de réparation d’une CDB de l’ADN• Recherche d’une matrice contenant une séquence homologue =>

erreurs possibles si une mauvaise matrice de réparation est utilisée => NAHR

• Du à des séquences répétées appelées LCR (Low copy repeat) (5 % de notre génome , forte homologie (>90%)

• A proximité de structures génomiques capables de générer des CDB

NAHR

Pathogène ou bénin ?Bénin +++

Risque pour la descendance

NHEJ• Mécanisme biochimique

de réparation de l’ADN

• Perte d'information : les extrémités de la cassure double brin sont souvent digérées avant d'être recollées

• Impliqués dans les • recombinaisons

«physiologiques» V(D)J•• En pathologie: cancers

+++, DMD…

FoSTeS• Lié à la réplication (pas

de CDB)

• Entraine la formation de réarrangements non récurrents complexes

• En pathologie: Pelizaeus-Merzbacher, Potocki-Lupski (PTLS)

• Nécessite « que » des micro-homologies de séquences

Copy Number Variation

• Si le réarrangement génomique entraine une variation du nombre de copies (gain / perte) d’un segment d’ADN de 1 kb et plus, on parle de CNV (Copy Number Variation)

• Soit polymorphes, soit pathogènes:⇒ Intérêt médical⇒ Intérêt d’étude et de détection

CNV et polymorphismes

Cohorte d’individus « apparemment » sains

CNVs et polymorphismes

� Répertoriés dans des bases de données (DGV)

� 57 000 CNVs décrits

� Représenterait 13 à 20% du génome

� Situés dans des régions pauvres en gènes ou liés àl’environnement (R olfactifs)

� Si F > 1% : CNP (copy number polymorphism)

CNVs et pathologiesPhénotype anormal: RM + dysmorphie

Répertoriées dans des bases de données(DECIPHER)

Méthodes de detection

1970

1990

2000

.

.

.

Premier caryotype

« banding »

« banding » haute-résolution

FISH

MLPA, QMPSF

CGH-array

.

.

.

.

.

.

1956

CGH

.

.

.

FISH

MLPACaryotype

CGH-array

Approche globale Approche ciblée

Choix des techniques

Choix des techniques

ATGCACTGATGAATGCATGCAATATGCACTGATGAATGCATGCAAT

Gène moyen: 2.104 pb

Sous-bande: 2.105 pb

Bande chromosomique: 3.106 pb

Exon: 50 à 1000 pb

Caryotype

FISH

Séquençage

CGH-array

MLPA

Paire de bases

Réso

luti

on

Caryotype / FISH

Carotype

Résolution entre 3 et 5 Mb

Inconvénients: long ; faible résolution; cout

Avantages: mécanismes remaniements

FISH

Résolution: 150KbInconvénients: petite duplication, cout,culture, banque de clonesAvantages: mécanismes remaniements

FISH

CGH-array

• Technique d’hybridation comparative génomique sur microréseau(puce à ADN).

• Technique de quantification relative: mise en évidence de pertes ou de gains de matériel chromosomique (par rapport àune référence).

• Digestion de l'ADN génomique par les enzymes AluI et RsaI– Obtention de produits de digestion dont la

taille varie entre 100 et 500 pb• Marquage fluorescent de l'ADN digéré

– Alexa Fluor 5 et Alexa Fluor 3• Purification sur colonne de l'ADN digéré et

marqué• Vérification du marquage au Nanodrop

– Rejet des échantillons si marquage insuffisant

CGH-array

CGH-array

Dans chaque spot:� Fragment spécifique d’ADN simple brin de petite taille (60 pb)� Dépôt multiple du même oligonucléotide

• Hybridation sur lame CGH– 4x180K– Caisson ozone free– Durée 24 h à 65°C

ADN Patient

ADN Témoin

CGH-array

• LavagesCGH-array

• Scan des lames et extraction des données– Mesure des intensités de fluorescence – Logiciels d'extraction des données et

d'analyse

CGH-array

• Interprétation

Quantité d’ADN identique chez le patient et le témoin

- fluorescence jaune

- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0

Patient Témoin Patient TémoinPatient Témoin

=

CGH-array

Log2(R/V)

• Interprétation

Quantité d’ADN identique chez le patient et le témoin

- fluorescence jaune

- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0

Patient Témoin Patient TémoinPatient Témoin

=

Quantité d’ADN moindre chez le patient par rapport au témoin

- délétion

- fluorescence verte

- ratio de fluorescence log2(1/2) = -1

CGH-array

Log2(R/V)

• Interprétation

Quantité d’ADN identique chez le patient et le témoin

- fluorescence jaune

- ratio de fluorescence log2(2/2) = 0

Patient Témoin Patient TémoinPatient Témoin

=

Quantité d’ADN moindre chez le patient par rapport au témoin

- délétion

- fluorescence verte

- ratio de fluorescence log2(1/2) = -1

Quantité d’ADN supérieure chez le patient par rapport au témoin

- duplication

- fluorescence rouge

- ratio de fluorescence log2(3/2) = 0,58

CGH-array

Log2(R/V)

Expérience en quatuor:

CGH-array

Patient A en Al5 et B en Al3 (témoin)

CGH-array

Délétion ?

Duplication ?

• Patient A en Al5 et B en Al3 (témoin) : courbe rouge

• Courbe rouge : log2(1/2) = -1• 1 copie patient / 2 copies témoins

• Patient A en Al3 et D en Al5 : courbe verte

• Courbe verte : log2(2/1) = 1• 2 copies témoins / 1 copie patient

=> Image en miroir⇒ Délétion chez A confirmée

• Pas de miroir pour la duplication⇒ CNV n'appartiennent pas à A

CGH-array

• Avantages du quatuor et dye swap– Moindre coût : 4 patients par lame– Confirmation de l’anomalie qui apparaît en miroir– Bonne attribution des CNV– Lecture plus facile quand la courbe est bruitée– Attention : ne pas associer patients avec clinique strictement

identique

Expérience en quatuor:

CGH-array

CGH-array

Délétion 4q21.22q22.3 ~ 15.2 Mb

Détection d’anomalies au niveau de régions pauvres en bandes

CGH-array

Délétion

DuplicationInv dupdel (8p)

Détection facilité des anomalies complexes

Détection de petits remaniements

Duplication de 30 Kb

CGH-array

Duplication 1qcenq24.2 de 35 Mb en mosaïque à 23 %

Détection de faibles mosaïques

CGH-array

CGH-array

• Différents type de puces CGH-array (en f° des cibles)

– BAC/PAC: robuste, sensible, contrôle aisé, faible résolution (80-200 Kb), limite de la banque

– Oligonucléotides: résolution: < 30kb moy.• Longs: CNV seulement; excellente spécificité• Courts: détection des CNV + SNPS (LOH)

– cDNA: étude du niveau d’expression

• Puces ciblées– Hyperdense sur un région d’intérêt (< 1 kb)– Limitées à des régions précises (résolution std)

• Choix de la plate-forme dépend aussi du cout et des outils d’analyse bio-informatique.

FISH

MLPACaryotype

CGH-array

Approche globale Approche ciblée

Choix des techniques

DenaturationHybridation

MLPA

Ligation

MLPA

Ligation

MLPA

1

2

3

45

1

2

3

45

Amplification

MLPA

Triple X

Témoin

Patient

Séparation électrophorétique

Une différence relative de la hauteur ou surface d’un pic indique une variation du nombre de copie de la séquence cible.

MLPA

Normalisation

• Permets une quantification relative des signaux de chaque sonde:

• par rapport aux sondes contrôles (c)

• par rapport à un témoin négatif (sain)

⇒ obtenir un ratio

⇒ apprécier le nombre de copie de la région cible

Témoin

Exemple

0.5

1.5

0

1 11

c c

MLPA

MLPA et 22q11

Témoin

Patient

ComparaisonDélétion

22q11

Région

22q11

MLPA / CGH-array

Analyse des

signaux

Quantification

MLPA CGH-array

Hybridation

sondes / cibles

• Avantages

• Pas de culture (ADN)• Analyse pangénomique• Haute résolution• Haut débit• Automatisable• Tous types de tissus

• Pas de culture (ADN)• Multiplexage• Spécificité 100%• Sensibilité 100%• Coût• Rapide (48h)• Tous types de tissus

CGH-arrayMLPA

MLPA / CGH-array

CGH-array et RM

• Patients avec RM + dysmorphie:

– Le caryotype seul: 3 à 5% de diagnostic– Caryotype + FISH: 8 à 10% de diagnostic– CGH-array: 9 à 13% d’anomalies supplémentaires

par rapport au caryotype => 12 à 18% de diagnostic

CGH-array en première intention en post-natal ?

MLPA et 22q11

La MLPA détecte 100% des anomalies impliquées

LA FISH ne détecte « que » 95% des anomalies

Stachon et al. 2007. AJMG

• Limites

• Ne détecte pas lesremaniements équilibrés• Anomalie de la ploïdie• Prix• Mécanisme de l’anomalie• Éthique• Interprétation complexe

• Ne détecte pas lesremaniements équilibrés• Anomalie de la ploïdie• Analyse ciblée• Mécanisme de l’anomalie• Faux positifs• Pas automatisable

CGH-arrayMLPA

MLPA / CGH-array

Perte d’un gène suppresseur de tumeur (TP53)Impliqué dans le syndrome de Li-Fraumeni => attitude ?

Ethique

Interprétation

• Que faire quand on trouve des délétions ou des duplications ?

– Est-ce un CNV (Copy Number Variation) bénin ?

– Est-ce un CNV responsable de la maladie ?

– Bases de données

– Vérification de la variation chez le cas index

– Analyse des parents

Interprétation

• Anomalies héritées = polymorphismes ??

- L’expressivité variable : une même maladie s’exprime de manière différente chez plusieurs personnes porteuses de la même anomalie génomique.

- La pénétrance incomplète : elle consiste en l’absence d’expression de la maladie chez une personne porteuse d’une même anomalie génétique.

- La récessivité ou hétérozygote composite : un gène inclus dans la région délétée peut avoir son deuxième allèle porteur d’une mutation révélant ainsi une maladie récessive autosomique.

- L’empreinte parentale : elle consiste en l’expression différentielle de régions génomiques selon qu’elles sont héritées du père ou de la mère du patient.

- La régulation épigénétique : la méthylation ou l’acétylation différentielles de certaines régions génomiques entraînent une modification du niveau d’expression des gènes.

Interprétation

Van Ommen GJ

Nat Genet 37:333-4, 2005

Array CGH

NormalCNV

Polymorphisme(CNP)

ConnuInconnu

Héritéde novo

Anomalie causale

Analyser les parents

Anomaliecausale

Critères de Lee

Guidelines :Vermeesch et al, Shaffer et al

Interprétation

Interprétation

Anomalie de novo dans une région dépourvue de gènes et non répertoriée dans les bases de données

=> interprétation ?

Interprétation

Interprétation

Interprétation

• L’association de plusieurs CNVs apparemment bénins et/ou l’association avec d’autres facteurs comme des facteurs environnementaux peut favoriser l’apparition d’une maladie.

• Depuis quelques années, certains CNVs ont été clairement identifiés comme facteurs de prédisposition ou de susceptibilité à des maladies complexes multifactorielles (cancers, neuro-dégénératives etc…).

Signes d'appel écho ne justifiant pas à eux seuls l'IMG

CNV inconnus

Hérités ?CNV dans les gènes de

prédisposition aux cancers

Technique longue et coûteuse

Interprétation

• CNVs et prénatal

Séquençage haut-débit

• Séquenceurs nouvelles génération

– Séquençage d’un grand nombre de fragments d’ADN au hasard (« shotgun »)

– Séquences générées alignées sur séquence de référence

– Application en cancéro / constitutionnel• Efficacité validée mais recherche fondamentale• Niveau de résolution meilleure que puces