Resp. Olivier CORITONUMR 1349 IGEPP

INRA-Agrocampus ouest-Univ Rennes 1INRA Centre de Rennes INRA Centre de Rennes INRA Centre de Rennes INRA Centre de Rennes

olivier.coriton@rennes.inra.frolivier.coriton@rennes.inra.frolivier.coriton@rennes.inra.frolivier.coriton@rennes.inra.fr

Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire

Végétale ( )

Nantes, le 28 Mars 2013

Offre actuelle, Contour

Cytogénétique Moléculaire ?

Cytogénétique Moléculaire ?

L’outil principal est l’Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur préparation chromosomique permet une

« Analyse fine de la structure des chromosomes »

«Biologie moléculaire» et «Cytogénétique traditionnelle»

née de la rencontre

FISH

Les outils de cytogénétique moléculaire permettent de développer des projets scientifiques d’études des génomes pour :

• Caractérisation cytogénétique du matériel végétal impliquant des hybrides interspécifiques ou des espèces polyploïdes : identification des

chromosomes parentaux ou introgression,

• Evolution structurale des génomes chez des espèces polyploïdes,

• Caractérisation des translocations chromosomiques par liaison entre la cartographie génétique et physique,

• Cartographie physique fine sur chromosomes en méiose (stade pachytène)et sur fibres d’ADN permettant la caractérisation fine de l’ordre du kb autour de locus d’intérêt ou la détection d’un remaniement chromosomique

2 à 5 Mb

1 kb

FISH

Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes

1- Préparation des lames

-> Pour Mitose : Pointe de racine

-> Pour Méiose : Anthère (Etamine)

Sélection des lames

Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes mitoses Multi-espèces

4X2X

2X

4X

6X8X

2X

2X

2X

Niveau de Polyploïdie :

Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes en méiose

Leptotène Zygotène Pachytène Diplotène Diacinèse Métaphase I Anaphase I Anaphase I

Métaphase II Anaphase II Télophase II Tétrade

• Stade métaphase I• Stade pachytène (les chromosomes sontappariés sur toutes leurs longueurs) Résolution x15

Prestations proposées par la plate-forme

• Hybridation génomique in situ (GISH) qui permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes

• Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées (FISH)

6Sv5Sv5U1U

Prestations proposées par la plate-forme

• Localisation physique de clones BAC sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH)

• Le BAC-Fiber-FISH qui permet l'analyse d'arrangements de séquences sur fibre d'ADN peignées

Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploïde

Le blé tendre, Allohexaploide

A-genome

B-genome

D-genome

?

2n=6X=42

0,5 MYA

10000 YA

Ae. speltoides

T. urartu

chromosomes

« cible »

A-probe-biotine

B-genome

D-probe-digoxgénine

?

Mix sondes ADN Génomique

A-genome

B-genome

D-genome

?

Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploide

Anti-dig-Fluorescéine

Avidin- Texas red

Détection

Hybridation

Filtre DAPI Filtre Fluorescein Filtre Texas Red

Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploïde

Translocation4A/7B

Translocation4A/7B

Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploide

4A/7B

4A/7B

Chr 1A ou 5A?

Chr 1A ou 5A?

Exemple 2 : Techniques FISH + GISH sur Blé dur,

tétraploide (AABB)

Exemple 3 : Technique GISH-like -> Le COLZA, Allotétraploide

B. rapa

AA, 2n=20B. oleracea

CC, 2n=18

B. napus

AACC, 2n=38

2000 YA

B. rapa

AA, 2n=20

B. napus

AACC, 2n=38

Sonde spécifique du génome C

B. oleracea

CC, 2n=18

GISH - like

Exemple 3 : Technique GISH-like -> Le COLZA, Allotétraploide

Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale

• Equipement / PersonnelEquipement / PersonnelEquipement / PersonnelEquipement / Personnel• Conditions d’accèsConditions d’accèsConditions d’accèsConditions d’accès• Cout des prestationsCout des prestationsCout des prestationsCout des prestations• LisibilitéLisibilitéLisibilitéLisibilité• FormationsFormationsFormationsFormations

• Démarche QualitéDémarche QualitéDémarche QualitéDémarche Qualité

Plate-Forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale

INRA- UMR 1349 Institut de Génétique, Environnement et Protection des Plantes

(IGEPP)- LE RHEU

1- Équipements

• Laboratoire de Cytogénétique Moléculaire

• Microscopie

* Système d'imagerie

• Caméra refroidie (Photometrics Cool SNAP HQ)

• Logiciel d'acquisition METAVUE (UNIVERSAL IMAGING)

* Epifluorescence Axioplan 2 Zeiss

2- Personnel

La plate-forme étant ouverte à 50% de sa capacité vers les équipes derecherche :

Site web : Un appel d’offre accompagné d’une plaquette de présentation

3- Accès

Pour la prise en charge des prestations en fonction des demandes,nous avons deux niveaux d’engagement :

• soit nous répondons à une prestation complète

• soit nous accueillons du personnel des unités demandeuses

• Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétée (FISH)= 33 Euros/lame

• Hybridation génomique in situ (GISH) qui permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes = 38 Euros/lame

• Le BAC-Fiber-FISH qui permet l'analyse d'arrangements de séquences sur fibre d'ADN peignées (BAC Fiber-FISH) = 33 Euros/lame

• Localisation physique de clones BAC sur les chromosomes (BAC-FISH)sur chromosomes en mitose et en méiose (stade pachytène)

= 33 Euros/lame

4- Cout des prestations

-> 200 Euros pour 6 lames

Depuis 2009« LABELLISATION DES OUTILS COLLECTIFS »

L'INRA a prévu de reconnaître 4 types d'outils collectifs en fonction de leurenvergure :

1- Plateformes Stratégiques INRA2- Plateformes INRA

3- Plateaux Techniques INRA4- Ateliers INRA

Le collège de direction a rendu son arbitrage identifiant notre outil comme Plateau Technique (PT) auprès de la CNOC :

Outil N°37 « Plate-Forme de cytogénétique moléculaire «

5- Lisibilité

La plate-forme a également une mission de formation et d'information auprès des chercheurs, techniciens et stagiaires pour un transfert de technologie.

* Sur Bananier - Afin de caractériser des translocations, le BAC-FISH a étémis au point sur la plate-forme de cytogénétique de Montpellier (Resp. A. D’Hont).

-> L’accueil de M. Rodier nous a permis d’échanger et d'optimiser les techniques de marquage des clones BAC et de détection

* Sur Caféier diploïde (C. canephora), nous avons pu mettre au point et former V. Viader (CIRAD-IRD-Montpellier) à la technique de BAC-FISH

6- Formations

Exemples :

7- Qualité

La PF s’est adossée à la démarche qualité mise en place par l’unité sous l’animation de deux groupes de travail « AQR » et « Métrologie » en lien avec un animateur qualité suivant le référentiel INRA (ISO 9001).

Les principales actions « qualité » mises en œuvre sur la PF ont été :

(1) Mise en place des cahiers de laboratoires,•(2) Rédaction de 30 Modes Opératoires,

(3) Document unique OPPI (Outil de Pilotage de la Prévention à l’INRA),

(4) Métrologie : Contrôle des températures (Frigo, Congélateur, Etuve) (OCEASOFT)Contrôle des balancesContrôle annuel des micropipettes METTLER TOLEDO

FISH chez les plantes?

Exemples de projets développés au sein de l’unité

Equipe 1 - Biodiversité et Polyploïdie

Décrire et structurer la diversité génétique, l’exploitervia la recombinaison homologue et homéologue

(Resp. A-M Chèvre)

Plate forme de cytogénétiqueMoléculaire

50%

(AABBDD,2n=6X=42) (AACC, 2n=4X=38)

Espèces diploïdes

Espèces allopolyploïdes

Stratégies :

Synthétiques

[1] Quels sont les mécanismes de spéciation et de régulation des recombinaisons homologues et homéologues :

Phase 1 : Suivi des modifications structurales qui interviennent dans les génomes lors de la stabilisation d’espèces allopolyploïdes

ANR Biodiversité

4X, 6X4X, 6X

1+1#2

10000 ans 2000 ans

?

Quelles sont les différences entre un colza synthétique et un colza naturel ?

Coll Moulon, IJPB-Versailles, URGV-Evry, Univ Rennes1, Brno-Czech Republic

2- Modifications fonctionnelles dès l’hybridation. Le chocgénomique se traduit par des modifications au niveau desséquences ribosomiques liées à une régulationépigénétique.

B. Rapa (Navet)

AA, 2n=2X=20

B. Oleracea (choux)CC, 2n=2X=18

AACC, 2n=4X=38

B. Napus (colza)

S0

1- Modifications structurales : Le GISH-like a montré d’des irrégularités méiotiques avec des appariements entreles génomes A et C permettant la formation detranslocations dès la 1ere méiose -> Caractérisation desréarrangements a pu être validée par BAC-FISH.

Nicolas et al, 2008, 2009Leflon et al, 2010Szadkowski et al 2010, 2011Ksiazczyk et al, 2011Suay et al, 2013

C1

A1

C1

C1

C1

A1

C1

C1

x

ANR Biodiversité

Quelles sont les différences entre un blé synthétique et un blé naturel ?

Mestiri et al 2010, 2013 Chagué et al, 2010 Chelaifa et al, 2013

×

AABB

2n = 4X= 28

DD (Aegilops tauschii)

2n = 2X= 14

AABBDD

2n = 6X= 42

1- Stabilité méiotique : le GISH n’a pas montré d’importantes irrégularités, défaut partiel d’appariement homologue conduisant

à la formation d’aneuploides,

2- Modifications structurales : aucun réarrangement ou élimination de séquence d’ADN n’a été observé chez les blés synthétiques au cours des trois premières générations,

3- Expression des gènes (transcrits) : additivité majoritairepas d’effet générationpas d’effet du génome Dpeu de différences avec blé tendre

Blé tendre

Coll URGV-Evry

Blé dur

x

ANR Biodiversité

(AABBDD, 2n=42)

Mécanismes impliqués dans la stabilisation d’une espèce

polyploïde

(AACC, 2n=38)

* Résistance aux nématodes à partir de Aegilops variabilis

(Coriton et al, 2009)

* Recombinaison entre chromosomes homéologues de Blé :Caractérisation de lignées isohoméoalléliques pour les gluténines de hautpoids moléculaire (Dumur. J et al, 2009b, 2009b)

Optimisation d’introduction de gènes d’intérêt

Les connaissances acquises permettent

Evaluation de flux de gènes

Effet de la position des (trans)gènes sur le flux

1B 6B 5DAdded

chromosome

[2] les transferts de gènes entre espèces

1A /1D

FISH chez les plantes?

Projets développés en collaborationavec des équipes extérieures

La plate-forme est ouverte à 50% de sa capacité :

Collaboration à différents projets de recherche extérieurs

INRA- EvryMUSEUM- ParisINRA- Versailles

INRA, CNRSUniv- Rennes INRA- Colmar

INRA- Angers

INRA- Bordeaux

INRA- Clermont-Fd

INRACIRADIRD Montpellier

INRA- Toulouse

INRA- Lusignan

A. Mason, M. Nelson University of Queensland Brisbane – AUSTRALIA

G. King, C. Ryder– Univ Warwick - UK

A. Kovarik, Academy of Sciences, Brno – CZECH REPUBLIC

R. Freuda-Agyeman, H. Rahman - University of AlbertaCANADA

PFMCV

PROJETS : Structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes ?

1- UR de Génétique et d'amélioration des plantes fourragères - LUSIGNAN

Projet : Analyse de la dynamique de la diversité génétique au sein de peuplement

de Ray-grass introgressé par la Fétuque

2- UMR Diversité et génome des plantes cultivées – MONTPELLIER

Projet : Suivi de populations d’Aegilops au contact de blés cultivés et étude des

phénomènes d’introgression

3- UR 419 sur les Espèces fruitières et la Vigne, « Analyse des génomes de Fragaria » -BORDEAUX

Projet : Utilisation de la cartographie physique pour définir l’origine du génome des espèces polyploïdes au sein du genre Fragaria en particulier chez le fraisier cultivé F. x ananassa (Espèce octoploïde)

4 - UMR GenHort – INH ANGERSProjet : Hybridation somatique interspécifique chez

pélargonium - caractérisation cytogénétique et moléculaire

5- UMR 1095 Amélioration et Santé des Plantes – CLERMONT-FERRAND

Projets : Elements transposables et Histoire évolutive de Triticum sp-

6- UR Génomique Végétale (URGV) - EVRY

Projets : Etude de l’activation des Éléments transposables chez le blé tendre

Projet 1: Evaluation de l’implication des rétrotransposons dans la variation de la taille des génomes chez des espèces de lupins écologiquement divergentes

7- UMR CNRS 6553 Ecobio « Evolution des Genomes et Speciation - RENNES

Projet 2 : Origine de la polyploïdie dans le complexe Hordeum murinum en Afrique du Nord : Diversité et évolution

PROJETS : Dynamique des génomes chez des espèces polyploïdes- Eléments Transposables

PROJETS : Cartographie physique fine de locus sur chromosomes

8- UMR SVQV- Génétique et d'Amélioration de la Vigne - COLMAR

Projet : Localisation des contigs de séquences de l’assemblage du génome

10- UMR990 INRA/INP-ENSAT Génomique et Biotechnologies des Fruits - TOULOUSE

Projet : Assignation de BAC par FISH en appui pour le séquençage du chromosome 7 de la Tomate

Projet : Etude des conséquences de la polyploïdie sur le fonctionnement et la croissance cellulaire au cours du développement du fruit

9- UMR619 Biologie du Fruit - BORDEAUX

Exemple de projet de Cartographie Physique

UMR990 INRA/INP-ENSAT Génomique et Biotechnologies des Fruits - TOULOUSE

Chromosome 7 project

Genomic and Biotechnology of Fruit

UMR990 INRA/INP-Toulouse FranceFarid Regad, Mondher Bouzayen (Project leader)

chr

Genome Structure

• Diploid specie

• 12 chromosomes pairs

• Genome size 950MB

• Repeat sequence 30%

• Sequencing of gene-rich euchromatic region - 220MB

• Estimated number of BACs to be sequenced: 277

FISH mapping status

FISH :Plate-Forme RennesS. Stack (Colorado, USA) Z. Cheng (Pékin, Chine)

050 BACs clones will be or not on

the chromosome 7

4 situations

0

(1)

BAC LE_ HBa 0104E22 + 309B15

(2)

BAC LE_ HBa 0006H17 + 309B15 BAC LE_ HBa 0224G23 + 309B15

(3)

BAC LE_ HBa 0027G01 + 309B15

(4)

BAC LE_ HBa 0173A21+ 309B15 BAC LE_ HBa 0116J06

FISH mapping status

• BACs are in the process on the chromosome

0

High-resolution FISH strategies on pachytene chromosomes

K7

92110K7 subtelomeric site on the long arm of

chromosome 7.pBeloBAC

11LE_HBa0309B15

?pBeloBAC

11LE_HBa0195N01

63,5110pBeloBAC

11LE_HBa0046G04

56118pBeloBAC

11LE_HBa0102J11

104129pBeloBAC

11LE_HBa0309F18

??pBeloBAC

11LE_HBa0018L21

85,5?

pBeloBAC

11

LE_HBa0048M11

??pIndigoBA

C-5SL_EcoRI0127B09

position cM

insert size (kb) DetailsplasmidBAC name

Infos:

15 BACs

Renferme la séquence centromérique TGR4 LE_HBa0057J04

LE_HBa0024K03

LE_HBa0006H17

LE_HBa0030C22

LE_HBa0028P04

LE_HBa0224G23

LE_HBa0140O20

pBeloBAC

11

34 52

121 ?pBeloBAC

11

pBeloBAC

11

pBeloBAC

11

pBeloBAC

11

pBeloBAC

11

147 54

114 22,5

137 72

? ?

?

Mitose

-> La résolution des chromosomes en mitose n’est pas suffisante (impossible de visualiser le pool de BAC)

Méiose

Steve stack (US)

Hans deHong (NL)

K7

K7

BAC 309B15

Steve stack (US)

Hans deHong (NL)

K7MéioseK7

BAC 309B15

MERCI DE VOTRE ATTENTION

Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire

Végétale ( )

http://www.biogenouest.org/contenu/plates-formes/bio-imagerie/cytogenetique