Revue des Maladies Respiratoires (2011) 28, 823—833

SÉRIE « TUBERCULOSES ET MYCOBACTÉRIOSES »coordonnée par Francois Xavier Blanc, Jean-Paul Janssens et Michel Underner

Nouveaux tests pour le diagnostic de la tuberculose

New tests for the diagnosis of tuberculosis

B. Nineta, P. Roux-Lombardb, J. Schrenzela,c,J.-P. Janssensd,∗

a Laboratoire de bactériologie, service de médecine de laboratoire, hôpital cantonaluniversitaire, 4, rue Gabrielle-Perret-Gentil, 1211 Genève 4, Suisseb Laboratoire d’immunologie et d’allergologie clinique, service d’immunologie etd’allergologie et service de médecine de laboratoire, hôpital cantonal universitaire,4, rue Gabrielle-Perret-Gentil, 1211 Genève 4, Suissec Service des maladies infectieuses, hôpital cantonal universitaire, 4, rueGabrielle-Perret-Gentil, 1211 Genève 4, Suissed Service de pneumologie, centre antituberculeux, hôpital cantonal universitaire,4, rue Gabrielle-Perret-Gentil, 1211 Genève 4, Suisse

Recu le 16 juillet 2010 ; accepté le 14 decembre 2010Disponible sur Internet le 25 mai 2011

MOTS CLÉSGamma interféron ;PCR ;Tuberculose ;Diagnostic ;InfectionTuberculeuse latente

Résumé Au cours des dernières années, les techniques de biologie moléculaire sont devenuesde plus en plus sensibles et rapides pour l’identification des tuberculoses des voies respiratoires,qu’elles soient positives ou non à l’examen microscopique direct. Les techniques d’amplificationgénique permettent aussi la détection rapide des résistances aux antituberculeux de premièreet deuxième ligne. La sensibilité de ces techniques pour des prélèvements d’origine non res-piratoire reste à déterminer. Le diagnostic de l’infection tuberculeuse latente a aussi gagnéen sensibilité, spécificité, et valeur prédictive positive, grâce aux tests au �-interféron, quitendent à remplacer — sauf pour les jeunes enfants — le test tuberculinique. Ces tests ont tou-tefois des limites qu’il est important de connaître, en particulier pour ce qui est de la distinctionentre tuberculose active et latente, et de l’exclusion du diagnostic de tuberculose.© 2011 SPLF. Publié par Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

KEYWORDSNuclear AmplificationAssays;

Summary Over the last decade, molecular biology techniques for identifying mycobacteria inpulmonary secretions have become more and more sensitive and rapid, even in smear negativesamples. Nuclear amplification techniques also allow the rapid detection of resistance to firstor second line anti-tuberculous drugs. The sensitivity of these techniques for non respiratory

∗ Auteur correspondant.Adresses e-mail : Beatrice.Ninet@hcuge.ch (B. Ninet), Pascale.Roux-Lombard@hcuge.ch (P. Roux-Lombard),

Jacques.Schrenzel@hcuge.ch (J. Schrenzel), Jean-Paul.Janssens@hcuge.ch (J.-P. Janssens).

0761-8425/$ — see front matter © 2011 SPLF. Publié par Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.doi:10.1016/j.rmr.2010.12.012

824 B. Ninet et al.

Tuberculosis;Gamma InterferonAssays;Diagnosis;Latent tuberculosisInfection

samples is yet to be determined. The diagnosis of latent tuberculous infection (LTBI) has alsoincreased in sensitivity, specificity and positive predictive value through the use of interferon-� release assays (IGRAs), which are tending to replace the tuberculin skin test, except forchildren aged under five. These tests, however, do have limitations which are important forthe clinician; especially their inability to distinguish active from latent tuberculosis and theirinability, in most circumstances, to exclude a diagnosis of active TB.© 2011 SPLF. Published by Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

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ntroduction

es techniques mises à disposition des cliniciens au cours desix dernières années sont en train de modifier radicalement’approche diagnostique tant de l’infection tuberculeuseatente (ITL) que de l’infection tuberculeuse active (TB).itons notamment les progrès faits dans l’identificationrécoce des souches de mycobactéries par amplificationénique (PCR), l’identification précoce des résistances auxuberculostatiques de première ligne par PCR, ou encore laontribution au diagnostic de l’ITL des tests au �-interféronIGRA).

La publication il y a six mois à peine de Boehme et al. [1],t la mise sur le marché d’une technologie permettant, enoins de deux heures, à partir d’expectorations, d’obtenirar PCR à la fois la confirmation de la présence de Mycobac-erium tuberculosis (MTB) et celle de la présence éventuelle’une mutation sur le gène rpoB signant la résistance à laifampicine, et donc une très probable tuberculose multi-ésistante (MDR), représentent un bond gigantesque poure diagnostic rapide des TB, et des MDR. Il restera bienntendu à montrer que ces technologies sont compatiblesnancièrement avec les moyens à disposition dans les paysn voie de développement. Les tests mesurant la productione �-interféron en réponse à des antigènes spécifiques deTB (IGRA) ont aussi considérablement changé la prise enharge des personnes suspectes d’ITL, apportant une spé-ificité accrue et une amélioration de la valeur prédictiveositive quant au développement ultérieur d’une infectionctive, réduisant les faux positifs et permettant donc unraitement de l’ITL mieux ciblé.

Ce travail a pour but de passer en revue les acqui-itions récentes et les perspectives dans le domaine de’approche diagnostique de la TB et de l’ITL dans des paysndustrialisés.

es avancées de la microscopie

e diagnostic de la TB repose en premier lieu sur l’examenicroscopique de l’échantillon à analyser. La microscopiela recherche de bacilles acido-alcoolo résistants (BAAR)

près coloration fluorescente (auramine) ou non (Ziehl-eelsen) n’est pas la technique la plus sensible mais elleeste très rapide, peu onéreuse et assez spécifique dans leségions de haute incidence. Depuis 2007, l’OMS recommandee réduire le nombre d’échantillons respiratoires à examiner

expectorations spontanées) de trois à deux pour le dépis-age des cas de TB pulmonaire, pour autant qu’un systèmee contrôle de qualité externe performant soit mis en placeans le laboratoire. En 2009, l’OMS a même proposé que

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es deux examens microscopiques soient effectués la mêmeournée.

Les développements techniques les plus récents l’ontté au niveau des microscopes fluorescents et des lampesight-emitting diode (LED) qui peuvent remplacer les lampesraditionnelles à vapeur de mercure ou les lampes halo-ènes. Les systèmes fluorescents augmentent la sensibilitée la détection de BAAR par rapport à la coloration de Ziehl-eelsen. Les lampes LED offrent par ailleurs l’avantage d’unaible coût par rapport aux autres systèmes fluorescents et’une durée de vie de plus de 50 000 heures.

En 2009, des chercheurs de l’université de Berkeley enalifornie, ont mis au point une lentille qui transforme

’appareil photo d’un téléphone mobile normal (avec uneésolution d’au moins 3,2 Megapixels) en un microscope por-able assez puissant pour être utilisé sur le terrain : leellScope. Un système de filtres bloque la lumière de fond etonvertit la source de lumière — une simple LED — en un fais-eau lumineux d’une longueur d’onde de 460 nm nécessaireour exciter le colorant vert fluorescent dans l’échantillon.nsuite, il est possible de prendre des photos des imagesuorescentes de MTB.

Les nouveaux microscopes (fluorescents et à LED) sontplus sensibles pour la détection de BAAR que lesmicroscopes traditionnels, et ce, à un moindre coût aulong cours.

étection des mycobactéries en culture

a culture reste l’étalon-or pour le diagnostic de TB.ependant, le faible taux de réplication des mycobacté-ies implique une incubation de plusieurs semaines. Laisualisation de colonies clairement reconnaissables peuttre remplacée par d’autres méthodes de détection tellesue : détection microscopique de colonies « immatures »,étection de produits bactériens liés à la réplication cel-ulaire, ou utilisation de bactériophages comme marqueurse la viabilité cellulaire. Ce sont les systèmes de culturesiquides automatisés introduits depuis une dizaine d’années,ui sont actuellement les plus performants. Ces culturesiquides réduisent considérablement le temps de détec-ion par rapport aux cultures sur milieu solide : trois à

uatre semaines avec les milieux solides traditionnels à’œuf contre dix à 14 jours pour les échantillons microsco-iquement positifs [2]. Différents systèmes automatiséeson radioactifs en milieu liquide ont remplacé le tradition-

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Nouveaux tests pour le diagnostic de la tuberculose

nel BACTEC 460TB (respirométrie radiométrique ; BectonDickinson, New Jersey, États-Unis). Parmi ceux-ci, on peutciter le BACT/Alert 3D automatisé (Biomérieux, Craponne,France) et la méthode Mycobacterial Growth Indicator Tube(MGIT : Becton Dickinson). Le MGIT est basé sur la présencedans le tube d’un sel de ruthénium qui émet une fluores-cence visible en lumière violette lorsque la pression partielleen oxygène diminue dans le tube, signant la croissance desmicro-organismes. Ces systèmes en milieu liquide ont unesensibilité d’environ 10 % supérieure aux milieux solides [3].La technique la plus performante pour la culture des myco-bactéries reste la combinaison des milieux liquides et solidescar certaines souches ne poussent qu’en milieu liquide etd’autres en milieu solide. Un autre atout des cultures enmilieu liquide est de permettre de tester plus rapidement lasensibilité aux antituberculeux de première ligne [4] et plusrécemment à certains antituberculeux de seconde ligne [5].

La détection de la résistance aux antituberculeuxbasée sur l’observation microscopique de la croissancedes mycobactéries du « complexe tuberculosis » sous formede « cordes » (Microscopic Observation Drug Susceptibility[MODS]) en milieu liquide dans lequel a été rajouté del’isoniazide ou de la rifampicine est une méthode sensibledéveloppée récemment pour des pays à faible ressourcefinancière [6,7]. Les avantages de cette méthode sont sarapidité et surtout son très faible coût.

La capacité des mycobactériophages d’infecter et de serépliquer dans MTB a aussi été exploitée ces cinq dernièresannées dans des tests diagnostiques. Le mycobactériophageB29 peut être utilisé pour infecter des bacilles de MTB dansune expectoration pendant un court temps d’incubation.Après la période d’infection, un virucide est ajouté tuantles phages non internalisés. Les cellules infectées sont pla-cées sur un tapis de mycobactéries à croissance rapide(M. smegmatis) qui après infection, produisent des plagesde lyse indiquant la présence indirecte de MTB. L’avantagede cette méthode — commercialisée par Biotec Laborato-ries (Orléans, France) sous le nom FAST Plaque TB assay —est sa rapidité (quelques jours d’analyse au lieu de quelquessemaines) et surtout sa facilité d’implémentation dans lespays à forte endémie de tuberculose [8].

• Les systèmes de culture en milieu liquide réduisentles délais et sont plus sensibles que les culturestraditionnelles.

• Les cultures en milieu liquide permettent de testerplus rapidement la sensibilité aux antituberculeux etde détecter une résistance aux antituberculeux.

Méthodes de biologie moléculaire

La mise en évidence de la tuberculose repose à présent engrande partie sur des méthodes de biologie moléculaire,soit directement à partir de l’échantillon clinique soit dèsla positivité de la culture. La détection de mutations dans

certains gènes conférant une résistance à des antitubercu-leux s’est aussi développée comme méthode d’identificationrapide soit par séquencage soit par hybridation des acidesnucléiques.

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825

étection directe de Mycobacterium tuberculosist détermination de la résistance à la rifampicinees tests de détection des acides nucléiques sont trèstilisés dans les laboratoires de routine à cause de la rapi-ité de détection de l’agent pathogène (quelques heuresontre deux à trois semaines pour obtenir une culture posi-ive). Des règles d’utilisation ont été publiées par leenters for Disease Control (CDC) dès 1996 et réactuali-ées en 2000 et 2008. Actuellement de nombreux testsommerciaux sont disponibles : ils utilisent différentes tech-iques d’amplification dont les deux formats les plusonnus sont la Polymerase Chain Reaction (PCR, Rochepplied Science, Meylan, France) et l’amplification iso-herme (Transcription-mediated amplification, Gen-Probe,an Diego, CA, États-Unis et Strand-Displacement Ampli-cation, Becton Dickinson). Ces tests ont une sensibilitéupérieure à 95 % pour les échantillons microscopiquementositifs contre seulement 60 à 70 % pour les échantillonségatifs à l’examen microscopique. La détection descides nucléiques augmente la spécificité diagnostique dea tuberculose ; toutefois, une sensibilité trop basse — enarticulier pour les échantillons négatifs à l’examen micro-copique — ne permet pas d’exclure une tuberculose en case test négatif [9].

Ces recommandations sont surtout valables pour leschantillons respiratoires ; la détection d’acides nucléiquesans les autres échantillons cliniques, en particulieres biopsies, peut être négative à cause de la pré-ence d’inhibiteurs d’amplification. Ceux-ci doivent donctre systématiquement recherchés quel que soit le type’échantillon et de méthode d’extraction des acidesucléiques. Enfin, les tests d’amplification des acidesucléiques commerciaux doivent être préférés aux testséveloppés dans le laboratoire à cause des résultats peueproductibles de ces derniers.

FIND Diagnostics (Genève, Suisse), organisation pour leéveloppement de nouveaux tests diagnostiques pour lesays en voie de développement, projette, pour les années020, la mise au point de la détection de fragments d’ADNe MTB excrétés dans les urines. L’urine est un échantillonlus homogène et plus facile à récolter qu’une expectora-ion, ces deux caractéristiques étant un atout important silles sont liées à une méthode d’amplification très simplet sensible [10].

En effet, les méthodes d’amplification actuellementmplémentées dans les laboratoires deviennent plus simplest plus rapides. Ainsi, Roche (Cobas Taqman, Roche Diag-ostics, Meylan, France) a développé une PCR en tempséel [11] qui diminue de moitié le temps d’amplification ete détection des germes avec une automatisation partielledeux heures au lieu de quatre).

Une méthode très prometteuse de PCR en temps réelXpert MTB/RIF, Cepheid, Sunnyvale, CA, États-Unis), per-et d’établir à la fois la présence de MTB et d’une mutationu gène rpoB indiquant une résistance à la rifampicinen moins de deux heures. Cette technique, outre sa rapi-ité, semble avoir une sensibilité nettement plus élevéeans les échantillons négatifs à l’examen microscopique

72 %) que les méthodes PCR traditionnelles commercialisées1,12,13]. Cette sensibilité diagnostique accrue provient,’une part, de l’extraction des acides nucléiques effectuée

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Tableau 1 Tuberculostatiques pour lesquels des gènes spécifiques de résistance ont été mis en évidence et peuvent êtredétectés par des techniques d’amplification nucléaire.

Médicaments Gène Sensibilité (%) Spécificité (%)

Antituberculeux primaires Rifampicinea rpoB 96 97Isoniazidea inhA + katG 89 99Éthambutol embB 50 n.d.Pyrazinamide pncA 80 n.d.

Antituberculeux secondaires Fluoroquinolonesa gyrA 82 97Kanamycinea rrs + eis 87 97Amikacinea rrs 88 99Capréomycinea Rrs + tlyA 45 86

n.d. : données non disponibles.a Système commercial par hybridation reverse.

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utomatiquement dans la cartouche et, d’autre part, d’uneeuxième amplification (nested-PCR).

Les mutations associées à la résistance à de nom-reux traitement anti-tuberculeux ont été décrites depuisne dizaine d’années (Tableau 1). En particulier, 95 % desouches résistantes à la rifampicine montrent des mutationsl’intérieur d’une région de 81pb du gène rpoB. Plusieurs

ests moléculaires ont été développés pour la détectione ces mutations, basés sur le recours à la PCR pourmplifier la séquence cible, puis d’une deuxième étape deéquencage ou d’hybridation pour détecter les mutations.insi, les méthodes Line-probe basées sur des techniques’hybridation reverse s’avèrent très fiables pour la détec-ion des souches multi-résistantes à partir de culturesositives en mettant en évidence des mutations dans lesènes inhA ou katG pour l’isoniazide et dans le gène rpoBour la rifampicine. Une des recommandations de l’OMS en008 est d’utiliser ces tests pour la détection rapide desouches multirésistantes dans les échantillons des patientsicroscopiquement positifs en utilisant le test GenoTypeTDR (Hain Life Sciences, Nehren, Allemagne).

D’autres tests moléculaires (GenoType MTBDRsl, Hainife Sciences) viennent d’être commercialisés pour détectera résistance aux fluoroquinolones, aux aminoglycosides etl’éthambutol. Un résumé des gènes connus impliqués dans

es mécanismes de résistance aux antituberculeux primairest secondaires est présenté dans le Tableau 1.

La biologie moléculaire à partir de cultures de mycobac-éries n’est pas seulement utilisée pour la détection desènes de résistances mais aussi pour identifier les diffé-entes espèces de mycobactéries.

dentification des espèces de mycobactéries àartir de cultures positivese système GenoType MTBC (Hain Life Sciences) permet’identifier les différentes espèces au sein du complexeTB. Ce test est basé sur la mise en évidence de dif-

érences dans le gène gyrB (gyrase B) par amplificatione l’ADN et hybridation du produit d’amplification avec

es sondes spécifiques. Ce test a été d’un apport énormeour les laboratoires de diagnostic car il a permis deasser d’une identification des espèces par tests biochi-iques sur plusieurs semaines, avec parfois des difficultés

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’interprétation, à une méthode très fiable et réalisable enne journée [14]. D’autres tests basés sur le même principeermettent d’identifier les mycobactéries atypiques. Leéquencage du gène de l’ARNr16S est aussi une méthode trèserformante pour l’identification des mycobactéries aty-iques. Cette technique a été largement validée et utiliséeans les laboratoires pouvant avoir accès à un séquenceurais elle n’est parfois pas assez discriminante. Par exemple. kansasii et M. gastri ont la même séquence du gène de

’ARNr 16S, le même problème étant retrouvé pour plusieursspèces de mycobactéries à croissance rapide. Dans ce cas,es systèmes d’hybridation sont une valeur ajoutée car ilsermettent l’identification précise des espèces.

• Les techniques de PCR, de PCR en temps réel etd’amplification isotherme sont rapides et sensibles,mais un résultat négatif ne permet pas d’exclure uneinfection.

• Des tests moléculaires ont été développés pourdéceler des résistances à la rifampicine (mutationsdu gène rpoB) et à l’isoniazide (mutations des gènesinhA ou katG).

• D’autres tests viennent d’être commercialisés pourdétecter la résistance aux fluoroquinolones, auxaminoglycosides et à l’éthambutol.

• Enfin, des tests moléculaires permettent d’identifierrapidement les différentes espèces au sein ducomplexe Mycobacterium tuberculosis.

arqueurs biologiques

’autres méthodes ne faisant pas appel à la biologie molé-ulaire, moins lourdes à mettre en place et moins coûteusesn instruments et personnel commencent à apparaître poure diagnostic de la TB. Ces techniques profitent à la fois desrogrès dans la connaissance de la biologie de MTB et de la

écouverte de nouvelles protéines cellulaires ou excrétées.

Deux marqueurs biologiques ont démontré leur utilitéour le diagnostic de la tuberculose, l’un pour la recherchee tuberculose directement chez le patient (le lipoa-

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Nouveaux tests pour le diagnostic de la tuberculose

rabinomannane), l’autre pour l’identification rapide desmycobactéries du complexe MTB dès la positivité de laculture (Antigène MPT-64).

Le lipoarabinomannane est un glycolipide de haut poidsmoléculaire, résistant à la température, présent dans laparoi cellulaire des mycobactéries. Cette molécule n’estpas spécifique pour le complexe MTB mais plusieurs groupesont montré la présence de concentrations mesurables delipoarabinomannane dans les expectorations [15] ou dansles urines des patients atteint de tuberculose [16]. Des don-nées préliminaires positives ainsi que l’avantage d’utiliserun simple test urinaire pour détecter une tuberculoseont rapidement conduit au développement d’un test Elisacommercial (Clearview TB, Inverness Medical Innovations,Waltham, MA, États-Unis). Des travaux récents ont mon-tré des performances variables de cette approche et unesensibilité plus faible que celle espérée [17,18]. Ce test sem-blerait avoir une meilleure performance chez les patientsVIH positifs avec une immunosuppression avancée [19].

Le seul test commercial de détection antigéniquepermettant de mettre en évidence spécifiquement les myco-bactéries du complexe MTB utilise l’antigène MPT-64. Ce testest basé sur un dosage immuno-chromatographique concupour la détection qualitative à partir d’un tube de cultureMGIT positif (BD MGIT TBc Identification Test, BD diagnos-tics, Sparks, États-Unis). La protéine MPT-64 est sécrétéedans le milieu de culture et permet une confirmation del’appartenance au complexe MTB avec une très bonne sen-sibilité et spécificité [20,21].

Quelques souches de M. bovis BCG ne produisent pas cetantigène MPT-64. L’exécution de ce test en 15 minutes, soncoût plus faible que les méthodes moléculaires et l’emploide techniciens peu spécialisés pour sa lecture en fontnéanmoins un outil très performant dans les laboratoiresdiagnostics actuels.

• Le dosage du lipoarabinomannane pour lediagnostic de tuberculose active chez le sujetimmunocompétent n’a pas pour l’instant lasensibilité espérée.

• Un test détectant l’antigène MPT-64 permetd’identifier les mycobactéries du complexeMycobacterium tuberculosis en culture.

Outils épidémiologiques

Les méthodes de typage sont utilisées pour étudier notam-ment les souches de bacilles tuberculeux chez un mêmepatient (réinfection ou réactivation), la transmission d’unesouche dans une communauté spécifique (prison, école, lieude travail, groupe ethnique. . .), pour suivre la dispersion dessouches au niveau de la population mondiale ou encore pourmettre en évidence une contamination croisée au labora-toire.

La technique de référence, bien que lourde à mettreen œuvre et lente (résultat disponible en une dizainede jours) est la méthode Restriction Fragment LengthPolymorphism (RFLP). Elle est basée sur une hybrida-

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ion avec une sonde spécifique à la séquence d’insertionS6110 qu’on retrouve en nombre de copies variables danse génome de MTB. Cette hybridation se fait après avoirigéré le génome par une enzyme de restriction et aprèsvoir séparé les fragments par électrophorèse [22]. Lesvantages de cette méthode sont la stabilité des pro-ls des souches étudiées au cours du temps et uneiscrimination suffisante, ce qui en fait un bon outil épi-émiologique.

Les méthodes de typage ont pris un essor importantvec l’utilisation de l’amplification génique à cause deeur rapidité et de leur facilité relative d’utilisation. Unees méthodes largement utilisées est le spoligotypingSpacer Oligonucleotide Typing) basée sur le polymor-hisme d’une séquence répétée de 36pb (Direct RepeatDR]), séparée par des séquences variables de 35 à1 pb. Ces séquences varient d’une souche à l’autre enombre et en distance : les souches de la lignée Beijingar exemple, réputées plus virulentes et plus fréquem-ent multi-résistantes, pouvant être identifiées par cetteéthode.Une autre méthode de typage basée sur le poly-

orphisme génique d’éléments répétés (Mycobacterialnterspersed Repetitive Units [MIRU]) est dérivée duéquencage complet de MTB H37Rv et de la misen évidence de séquences répétées dans des régionspécifiques du génome. Son pouvoir discriminant estuffisant pour réaliser une étude épidémiologique [23].ette méthode est actuellement la plus performantear elle permet de typer toutes les souches, y compriselles ayant un faible nombre de copies IS6110. Ellest en plus assez simple à implémenter pour lesaboratoires pratiquant les techniques de biologie molécu-aire.

Dernièrement, une autre méthode commerciale deypage pour différentes bactéries (rep-PCR Diversilab, Bac-erial Barcodes Inc, Biomérieux, Houston, TX, États-Unis) aussi été évaluée pour MTB (rep-PCR Diversilab Mycobac-erium Tuberculosis Typing kit). Cette technique amplifiees régions entre des séquences répétées non codantesu génome et les produits d’amplification sont analysésans une puce où migre un gel à travers des micro-apillaires. La méthode sépare et analyse les fragmentsmplifiés de différentes tailles et d’intensités de fluores-ence variable. Cette méthode a été utilisée avec succèsans notre laboratoire en parallèle avec un typage IS 6110-FLP pour mettre en évidence une épidémie à Genèvee 15 cas d’immigrés venant d’un même pays [24]. Cettetude était réalisée sur un nombre de souches assez faiblest une récente comparaison des techniques RFLP, MIRU etep-PCR a démontré la supériorité de la technique MIRUomme outil de typage PCR par rapport à la rep-PCR25].

• Différentes méthodes de typage permettent dediscriminer les souches de bacilles tuberculeux.

• Il existe plusieurs méthodes, mais la meilleure

actuellement est la Mycobacterial InterspersedRepetitive Units (MIRU).

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28

ests basés sur la production de �-interférontests IFN − �) en réponse à des antigènespécifiques de M. tuberculosis (IGRA)

rincipe des tests Interferon-� Release AssaysIGRAs)e nouveaux tests palliant en partie les limites du testutané tuberculinique (TCT) ont été développés ces der-ières années et ont rapidement pris de l’importance danse dépistage de la tuberculose. Ces tests sanguins réalisésn vitro, mesurent la production d’IFN − � après stimulationes lymphocytes par des antigènes spécifiques de MTB ; ilsont habituellement appelés « tests de production d’IFN-� »u « tests IFN-� ». Au cours d’une infection par des myco-actéries, l’IFN-� est d’abord produit par les cellules de’immunité innée, principalement les « natural killers », puisn grande quantité par les lymphocytes T Th1 exprimantes récepteurs spécifiques pour des antigènes de mycobac-éries. Ce sont ces lymphocytes T devenus « effecteurs »ui peuvent être réactivés in vitro par des antigènese mycobactéries et produire des quantités importantes’IFN-�·

Seuls les lymphocytes préalablement exposés aux mêmesntigènes vont être stimulés, ce qui assure la spécificitéour MTB. En effet, les antigènes utilisés ([Early Secretoryarget Protein 6 ESAT-6] et Culture Filtrate Protein 10 [CFP-0]) correspondent à des protéines codées dans une régionarticulière du génome des mycobactéries du « complexeuberculosis » (MTB, M. bovis, M. africanum, M. microti et. canetti). Cette région, appelée Region of Difference 1

RD1) n’est pas partagée par la plupart des mycobactériesnvironnementales à l’exception de M. szulgai, M. kansasiit M. marinum, et surtout, elle est absente des souchestténuées de M. bovis utilisées pour la production de BCG.

Deux tests commerciaux ont été développés à partir dee principe, avec des technologies un peu différentes. Le-SPOT. TB (Oxford Immunotec, UK) mesure le nombre deymphocytes T secrétant de l’IFN-� en réponse aux anti-ènes ESAT-6 et CFP-10 par une technique appelée ELISPOTlors que le QuantiFERON-TB Gold (QFT ; Cellestis Ltd, Aus-ralie) mesure par Elisa la quantité totale d’IFN-� produiten réponse à ces même antigènes auxquels est ajouté unntigène supplémentaire des mycobactéries du complexeuberculosis : le TB 7,7. Il existe plusieurs versions commer-iales du test QFT, mais la plus répandue actuellement eta plus performante est le « QuantiFERON-TB Gold in-tubessay ».

Certaines particularités méthodologiques ont des consé-uences sur les résultats des tests. Ainsi, pour le T-SPOT.TB,es cellules mononuclées (lymphocytes et monocytes) duang périphérique sont isolées, comptées et ajustées à uneoncentration prédéterminée avant d’être stimulées. Leest est donc moins influencé par le taux de lymphocytesirculants et donc a priori plus sensible en cas de lympho-énie.

Dans les deux tests, il y a un contrôle négatif (absence’antigènes) et un contrôle positif (la phytohémagglutinine

PHA), qui stimule la production d’IFN-� par tous les lym-hocytes). Dans la majorité des cas, lorsque le résultat’un test est « indéterminé », c’est parce que la réponsece contrôle positif est insuffisante, indiquant l’absence

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B. Ninet et al.

e lymphocytes stimulables ou leur incapacité à produiree l’IFN-�. Un tel résultat doit faire suspecter une cause’immunodéficience : il est connu que les âges extrêmes,t les traitements immunosuppresseurs, en particulier lesorticostéroïdes, sont associés à une augmentation de laréquence de ces résultats « indéterminés » [26]. Il faut’ailleurs noter que la concentration de PHA utilisé danse T-SPOT.TB est supérieure à celle du QFT, ce qui pour-ait expliquer le nombre un peu plus faible de résultatsindéterminés » rapporté avec le T-SPOT.TB. Pour les deuxests, le temps d’incubation recommandé en présence desntigènes est de 16 à 24 heures car en principe, dans ceélai, seuls les lymphocytes récemment sensibilisés sontapables de répondre en secrétant de l’IFN-�. Un temps’incubation plus long permet la stimulation des cellulesémoires qui peuvent être le témoin d’une infection très

ncienne [26,27].Deux revues extensives détaillant les principes de ces

ests, leurs avantages et inconvénients ont été publiéesn 2007 dans la Revue des Maladies Respiratoires [28,29].lles montrent clairement que les tests IFN-� sont au moinsussi sensibles que le TCT et nettement plus spécifiquesuisqu’ils sont indépendants de la vaccination par le BCG.lles soulignent aussi leurs limites, notamment chez lesujets immunodéprimés, ainsi que leur incapacité à fairea distinction entre ITL et TB.

Un certain nombre de nouvelles études ont été publiéesepuis et ont permis de confirmer certaines de ces donnéesais aussi de mettre en évidence nouveaux aspects des tests

FN-�.

nfection tuberculeuse latente (ITL)omparés au TCT, les données publiées concordent à démon-rer que les tests IFN-� sont nettement plus spécifiquest donc meilleurs prédicteurs d’une ITL que le TCT. Laublication récente d’une méta-analyse incluant 38 étudesubliées entre 2004 et 2008 permet d’estimer les spécifi-ités moyennes du QFT (96 %), du T-SPOT.TB (93 %) et duCT (66 %) si l’on s’adresse à des populations à faible risque’infection tuberculeuse [30,31]. Cela s’explique en grandeartie par l’absence d’influence du BCG ou de l’expositiondes mycobactéries non tuberculeuses sur les tests IFN-�.Le principe des tests IFN-� voudrait que le temps

’incubation préconisé permette de stimuler les lympho-ytes T effecteurs récemment sensibilisés, mais pas lesymphocytes T à mémoire et donc de ne dépister que lesujets récemment exposés [27]. Cela serait un atout par rap-ort au TCT qui déclenche une stimulation intradermiquerolongée pouvant activer des cellules mémoires toujoursrésentes malgré une élimination totale des mycobacté-ies. Toutefois, les résultats obtenus avec les tests IFN-�e sont pas tous convergents et difficiles à interpréter cares protocoles expérimentaux sont très différents. Certainsravaux montrent qu’il est nécessaire d’incuber les lym-hocytes cinq à 12 jours, donc nettement plus que la duréeréconisée, pour observer une production d’IFN-� aprèsn traitement efficace, tendant ainsi à confirmer le rôle

es cellules mémoires [32,33]. Au contraire, d’autres ontontré que des infections anciennes, remontant à plus deeux ans, voire même des infections latentes traitées, ethéoriquement peu susceptibles de se réactiver, suffisent

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Nouveaux tests pour le diagnostic de la tuberculose

à positiver les tests IFN-�, même avec incubation courte.Ainsi, Dheda et al. trouvent que le taux de positivité duT-SPOT.TB décroît avec la durée du traitement (83 % avantquatre mois et 17 % au-delà). Cependant, même une incuba-tion prolongée de cinq jours n’a pas permis de déclencherune production d’IFN-� par les lymphocytes des sujets trai-tés, ce qui tend à infirmer l’hypothèse de cellules mémoires.Par ailleurs, dans ce même travail, trois patients avaientencore un T-SPOT.TB positif 17 à 18 mois après la fin du trai-tement, suggérant que certains sujets conservent longtempsdes lymphocytes effecteurs circulants [34].

Pour l’instant, même si un résultat de test IFN-� positifest plutôt en faveur d’une infection récemment acquise, ilne permet pas d’exclure que cette infection remonte à plusde deux ans.

La sensibilité des tests IFN-� pour l’ITL est très difficile àévaluer puisque par définition, on ne dispose d’aucun outilpermettant une certitude diagnostique. Elle est donc esti-mée à partir de scores d’exposition ou en en prenant les casde TB comme marqueurs de substitution. Compte tenu decette limitation, elle semble en général égale, voire légè-rement supérieure à celle du TCT chez les patients adultesimmunocompétents, avec un léger avantage en faveur duT-SPOT.TB sur le QFT. La méta-analyse de Pai et al. permetd’estimer la sensibilité du QFT à 78 %, celle du T-SPOT.TB à90 % et celle du TCT à 77 % [30]. Certains auteurs émettenttoutefois des réserves sur ces résultats en montrant notam-ment que la sensibilité du QFT peut être inférieure à celledu TCT dans un contrôle d’entourage après exposition.

En revanche, la sensibilité des tests IFN-� semblenettement supérieure à celle du TCT chez les sujets immu-nosupprimés, quelle que soit la cause et l’intensité de cetteimmunosuppression. Ainsi, chez les sujets âgés de plus de50 ans, la sensibilité du QFT pour une ITL est supérieure àcelle du TCT [35].

En ce qui concerne les sujets infectés par le VIH, la plu-part des études confirment la supériorité des tests IFN-� parrapport au TCT, mais relèvent qu’ils sont toutefois moinssensibles que chez les sujets immunocompétents. Il existedes discordances importantes entre les résultats des deuxtests IFN-�, en particulier en raison de la plus grande dépen-dance du QFT au taux de lymphocytes T CD4+, puisque leT-SPOT.TB est ajusté pour la concentration de lymphocytes[36]. Dans une étude portant sur 590 patients séropositifspour le VIH, la sensibilité du QFT est décrite comme satis-faisante si le compte de lymphocytes CD4+ est supérieur à100 par millimètre cube [37].

Des résultats un peu différents ont été observés chez lespatients hémodialysés. Une étude de notre groupe compa-rant les performances des deux tests IFN-� a montré quedans cette population la concordance entre les deux testsIFN était modérée (� = 0,60), mais que le QFT était deux foisplus sensible pour détecter une ITL [38].

Valeur prédictive quant au développement d’uneinfection tuberculeuse active (TB)Le plus utile serait de pouvoir utiliser ces tests non seule-

ment pour détecter une ITL, mais surtout pour prévoirquels sont les sujets à risque de développer une TB etdonc susceptibles de bénéficier d’un traitement. Beaucoupde données existent pour les TCT, permettant d’évaluer

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829

e risque de développer une TB en fonction du diamètree l’induration, mais de telles informations restent encorerès limitées pour les tests IFN-�. Seules des études longi-udinales peuvent répondre à cette question et elles sontncore peu nombreuses. Elles posent d’ailleurs un pro-lème éthique puisqu’il est difficile de suivre des patientsvec un test IFN-� positif sans leur proposer un traite-ent.Une étude menée en Allemagne portant sur 600 sujets

mmunocompétents et en grande majorité adultes, enontact rapproché avec des patients souffrant de TB etuivis pendant deux ans, a montré que 40 % d’entre euxtaient positifs pour le TCT (induration > 5 mm) et seule-ent 11 %, soit 66, positifs pour le QFT. Parmi ces derniers,

1 ont refusé le traitement prophylactique par isoniazide quieur a été proposé et six d’entre eux (14,6 %) ont développéne TB active dans les deux ans. Parmi ces six patients,n avait un TCT négatif. Par ailleurs, seulement 2,3 % desujets avec un TCT positif et non traités ont développé uneB. Ces résultats montrent donc que le QFT est au moinsussi sensible et beaucoup plus spécifique que le TCT pourdentifier les sujets à risque de développer une TB aprèsn contact récent [39]. Pour ce qui est des enfants et desdolescents, une étude un peu similaire a été menée enurquie, mais en utilisant le T-SPOT.TB. Parmi 908 enfantstudiés, 550 (60,5 %) avaient un TCT positif et 381 (41,9 %)n T-SPOT.TB positif. La grande majorité de ces enfantsété traitée préventivement en suivant les recommanda-

ions en vigueur en Turquie. Parmi les non-traités, 3,6 %3/83) de ceux ayant un TCT positif et 7,4 % (4/54) de ceuxont le T-SPOT.TB était positif, ont développé une TB, mon-rant donc également une meilleure valeur prédictive du-SPOT.TB [40]. Enfin, dans une étude autrichienne portantur une population de 830 patients infectés par le VIH, leFT était positif dans 44 cas. Parmi ceux-ci, sept se sont

évélés être des TB et ont été traités. Les 37 autres ontté suivis régulièrement sans traitement et trois (8,1 %)nt développé une TB. En outre, un nombre assez impor-ant de patients (47/830, soit 5,6 %) avaient un résultatindéterminé » mais aucun d’entre d’eux n’a développé deB par la suite [41]. Dans cette étude, seuls les patients posi-ifs pour le QFT ont eu un TCT et seulement 73,8 % étaientositifs, confirmant la plus faible sensibilité du TCT dansette population.

Ces études longitudinales et prospectives, bienu’encore peu nombreuses, concordent donc pour montrerue les tests IFN-� semblent supérieurs au TCT pour prédire’évolution d’une ITL vers une TB et qu’en moyenne 10 %es sujets positifs développeront une maladie active danses deux ans.

nfection tuberculeuse active (tuberculosealadie)

es tests IFN-� sont les témoins d’une infection par MTB ete permettent donc pas de faire la distinction entre uneTL et une TB. Toutefois, puisqu’une TB est nécessairementrécédée par une ITL (en dehors de rares formes rapidement

volutives, notamment chez le nourrisson), un test IFN-�égatif devrait théoriquement exclure une TB. Différentestudes qui ont évalué les performances des tests lors de TBussi bien chez des adultes [42], que chez des enfants [43]

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t des sujets âgés [44] ont montré que les deux tests IFN-�T-SPOT.TB et QFT) ont une sensibilité de l’ordre de 80 %,oujours supérieure à celle des TCT.

Récemment, une méta-analyse a inclus 124 études éva-uant les performances des tests IFN-� et des TCT dans desas de TB confirmés par culture ou par PCR [45]. Elle per-et d’établir une sensibilité moyenne de 81 % pour le QFT

t de 88 % pour le T-SPOT.TB, alors que celle du TCT n’estue de 70 %. Si l’on restreint l’analyse aux pays développés,es sensibilités des tests augmentent et atteignent 84 % poure QFT et 89 % pour le T-SPOT.TB. À l’inverse, la spécificitéu QFT (99 %) est nettement supérieure à celle du T-SPOT.TB86 %).

Une autre méta-analyse récente portant sur le taux deraisemblance (likelihood ratio) conclut qu’aucun des deuxests IFN-� ne peut confirmer une TB, mais que le T-SPOT.TBerait assez performant pour écarter le diagnostic de TBvec une probabilité de 90 %, notamment chez les sujetsgés [46]. Cependant, surtout dans les pays développés où’incidence de TB est faible, aucun de ces tests n’a une sen-ibilité suffisante pour exclure une TB et plusieurs mises enarde ont été publiées à ce propos [47,48]. En effet, la mor-idité et la mortalité d’une TB sont telles que même unaible pourcentage de patients faussement négatifs n’estas acceptable.

ésultats quantitatifs des tests IFN

es résultats des tests IFN-� sont exprimés de facon qualita-ive (positifs ou négatifs) en fonction des valeurs obtenues etn utilisant les règles établies par les fournisseurs. Il a tou-efois été suggéré que les valeurs quantitatives pourraientonner des résultats permettant une évaluation plus fine.

Ainsi, lors d’un contrôle d’entourage se pose parfois lauestion de distinguer entre les sujets contaminés, porteurs’une ITL, et ceux ayant déjà une TB et nous nous sommesemandés si le nombre de spots comptés dans le T-SPOT.TBermettait de différencier ces deux situations. Notre étudemontré que le nombre de spots était plus élevé en cas

e TB que lors d’ITL et qu’un seuil de 49 spots permettaite distinguer entre TB active et latente avec une sensibi-ité de 83 % et une spécificité de 74 %. Il y avait cependanteaucoup de recouvrement entre les valeurs quantitativesbtenues dans ces situations et les sensibilités et spécifici-és sont insuffisantes pour pouvoir utiliser ce test et cettealeur seuil comme facteur discriminant [49].

Nous avons également essayé d’évaluer si la modificationu nombre de spots observée sur des tests pratiqués sys-ématiquement au début et à la fin du traitement pouvaitrédire l’évolution des patients. Une diminution du nombree spots a été observée pour la majorité des cas (30/36),ais parmi les six patients pour lesquels le nombre de spotsaugmentés, cinq ont eu une évolution favorable, sans

omplications. Un seul d’entre eux, âgé, a rechuté après2 mois et est décédé. Il n’est donc pas possible de conclureu’une augmentation du nombre de spots sous traitementst prédictive d’une évolution défavorable [50].

oints non résolusême si le très grand nombre de publications consacréesux tests IFN-� a apporté beaucoup d’informations, cer-

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B. Ninet et al.

ains points restent encore problématiques et nécessitente rester vigilants sur l’utilisation et l’interprétation de cesests.

Tout d’abord, comme souligné par Blanc et al., la plupartes études disponibles ont été réalisées dans des populationsélectionnées qui ne sont pas vraiment représentatives deelles soumises au risque de tuberculose [29]. De plus, desifférences selon les populations analysées ont été mises envidence par une méta-analyse récente [46]. Cette revueontre que chez les adultes immunocompétents, le QFT

st plus performant que le T-SPOT.TB pour confirmer uneTL dans les études d’origine japonaise alors que les testsont équivalents dans les autres populations. Inversement,e T-SPOT.TB est plus performant pour exclure une ITL chezes sujets non japonais alors que les deux tests sont équi-alents dans les études japonaises. Les auteurs soulignentes différences mais ne proposent aucune explication. Cetteevue confirme en outre la supériorité des tests IFN-� sures tests cutanés, quel que soit le diamètre d’indurationetenu.

D’autres limitations dues à la variabilité intra- et inter-ssais des tests IFN-� ont été mises en évidence récemment.insi, une étude finlandaise a montré que le coefficient deariation intra-essai est de 4,5 % avec le QFT et 17,5 % avece T-Spot.TB. Le coefficient de variation inter-essai est beau-oup plus élevé et atteint 37,7 % avec le QFT et 24,9 % avece T-SPOT.TB [51]. Il faut toutefois noter que la congéla-ion/décongélation des cellules peut influencer les résultatst que cette procédure n’est pas recommandée pour lesests IFN-�.

Une autre approche a consisté à tester les mêmes sujetsplusieurs reprises, à intervalles suffisamment rapprochés

our que la probabilité d’une infection par MTB entre leseux tests soit faible. Les résultats montrent qu’un nombreon négligeable de sujets change de statut entre les deuxests, c’est-à-dire deviennent positifs alors qu’ils étaientégatifs ou inversement (conversion et réversion). Ainsi,ux États-Unis, dans une zone de faible prévalence de TB,n trois semaines, sept sujets sur 117, soit 6 %, ont positivéu réversé leur test avec le QFT et 7 % avec le T-Spot.TB52]. Dans les zones de forte endémie, comme l’Inde ou’Afrique du Sud, ces pourcentages atteignent jusqu’à 26 %52,53]. Le « changement de statut » est d’autant plus fré-uent que les résultats du test sont proches du seuil deositivité (cut-off) et tous les auteurs insistent sur la néces-ité de définir une zone grise dans laquelle le résultat estouteux et doit être confirmé. Cette notion de zone grise até reprise dans les recommandations les plus récentes duDC.

Une autre limitation importante à connaître dans’interprétation des résultats d’un test IFN-� est le possibleffet « rappel » d’un TCT préalable. Sur 13 études analy-ées par Van Zyl-Smit fin 2009 [54], cinq montrent qu’unCT ne modifie pas le résultat du test IFN-� alors que septboutissent à la conclusion inverse. Parmi ces dernières,n observe quelques cas de positivation chez des sujetsntérieurement négatifs, mais surtout des augmentations de’intensité de la réponse chez les sujets positifs. Cet effetrappel » se manifeste trois jours après le TCT. Il semble

aximal après trois semaines et peut se prolonger plusieurs

emaines. Il ne dépend pas du résultat du TCT et peut seroduire après un TCT positif ou négatif. Une de ces études

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Nouveaux tests pour le diagnostic de la tuberculose

montre qu’un TCT préalable influence moins le T-SPOT.TBque le QFT, suggérant que l’antigène TB 7,7, présent uni-quement dans ce dernier test, pourrait être responsable del’effet « rappel » [55]. Toutefois, deux études ultérieuresne confirment pas cette observation et montrent que lesdeux tests IFN-� sont sensibles à un TCT préalable [52,56].Même si l’effet d’un TCT préalable reste encore contro-versé, ces observations pourraient remettre en cause leschéma d’évaluation en deux étapes (two-step procedure :TCT suivi d’un test IFN-� en cas de positivité) mis en placedans certains pays.

Perspectives

Les tests IFN-� actuels ne permettent donc pas de résoudretous les problèmes diagnostiques liés à la tuberculose.Toutefois, les investigations se poursuivent pour palierleurs inconvénients et certaines voies semblent promet-teuses. Ainsi, l’adjonction pendant la phase d’incubationde cytokines qui favorisent la survie des lymphocytes Ttelles que l’interleukine-7 ou l’interleukine-15, permettraitd’augmenter la production d’IFN-� et ainsi d’améliorer lasensibilité des tests IFN-� sans altérer leur spécificité [57]. Ilest aussi possible de mesurer d’autres cytokines que l’IFN-�après stimulation par les antigènes de MTB. Jusqu’à pré-sent, les chemiokines pro-inflammatoires IFN-� inducibleprotein (IP-10) et monocyte chemotactic protein (MCP-2)ont été évaluées parce qu’elles sont produites en réponse àl’IFN-�, mais en quantité beaucoup plus importantes quecelui-ci, et que leurs concentrations corrèlent bien aveccelle de l’IFN-� [58]. Les résultats ont toutefois été plu-tôt décevants : leur dosage en plus de celui de l’IFN-�dans le test QuantiFERON augmente un peu la sensibilitédu test, mais au détriment de sa spécificité et ne per-met pas de mieux distinguer entre ITL et TB [59,60]. Uneautre chemiokine, l’IFN-� inducible protein (IP-10) a donnédes résultats similaires à ceux du QFT classique en termesde sensibilité et de spécificité, mais semble en outre par-ticulièrement sensible chez les jeunes enfants [60—62].Son utilité reste à confirmer par de larges études cli-niques.

Enfin, un groupe d’antigènes de MTB n’est expriméque par les bactéries en phase de latence : utilisés dansle T-SPOT.TB, ils déclencheraient une production d’IFN-�significativement plus importante lorsque les lymphocytesproviennent de sujets avec une ITL comparés à ceux avecune TB, permettant ainsi de mieux discriminer ces deuxsituations. [63,64].

• Les tests IFN-� sont au moins aussi sensibles que leTCT, mais ils ne permettent pas de distinguer uneinfection tuberculeuse latente d’une tuberculoseactive, ni d’exclure une tuberculose.

• Les tests IGRA (« tests de production d’IFN-� »ou « tests IFN-� ») ont l’avantage d’une spécificitéaccrue par rapport au TCT.

• Des études complémentaires restent nécessairespour mieux préciser la place des tests IFN.

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onclusion

es moyens diagnostiques apparus au cours de la dernièreécennie (et en particulier la simplification des techniquese biologie moléculaire) permettent de raccourcir de faconpectaculaire la durée nécessaire pour la confirmation bac-ériologique d’un diagnostic de tuberculose et pour laétection d’une multirésistance. Toutefois, la confirmationactériologique des atteintes paucibacillaires, en particu-ier extrathoraciques reste encore un défi pour le clinicien,ême si de nouvelles approches sont prometteuses. De

ouvelles techniques (lipoarabinomannane ou détection deragments d’ADN urinaires, recours à de nouvelles cytokinesu à de nouveaux antigènes dans les tests immunologiques)ont prometteuses. Le diagnostic de l’ITL a quant à lui gagnén sensibilité, spécificité et valeur prédictive positive, per-ettant un choix plus adéquat des sujets traités pour ITL.

es tests IFN-� ne permettent toujours pas de discriminerntre ITL et TB, ni d’exclure une TB à moins d’être dans uneituation de faible probabilité chez un sujet immunocompé-ent.

POINTS ESSENTIELS

• Les tests d’amplification (PCR et amplificationisotherme) sont rapides mais parfois peu sensibles(échantillons avec microscopie négative, atteintesextrapulmonaires).

• Une technique permettant d’obtenir par PCR, enmoins de deux heures, à partir d’expectorations,à la fois la confirmation de l’infection parMycobacterium tuberculosis et la présenceéventuelle d’une mutation sur le gène rpoB (doncd’une résistance à la rifampicine) a récemment étémise sur le marché. Elle semble plus sensible que lesautres techniques PCR utilisées jusqu’à aujourd’hui.

• De nouveaux microscopes, plus performants, ont étécommercialisés.

• On peut considérablement réduire les délais descultures par de nouvelles techniques de culture enmilieu liquide.

éclaration d’intérêts

es auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts enelation avec cet article.

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