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15 es JNI, Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie Virologie et Hygiène hospitalière URMITE CNRS-IRD UMR 6236 1

NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

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Page 1: NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

NOUVELLES TECHNIQUES POUR QUELLES AVANCEacuteES EN

MICROBIOLOGIE MEacuteDICALE

Dr Freacutedeacuterique GOURIET Feacutedeacuteration de Bacteacuteriologie Virologie et Hygiegravene hospitaliegravere

URMITE CNRS-IRD UMR 6236

1

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

Molecular detection and identification

MetagenomicsSequencing

PCR

Syndrome and disease--based sampling kits

Point of care (POC) laboratory

assays lt 2 hours

Real-time PCR

Immunochromatographicor agglutination

assay

Real-time genome

sequencing

New or atypicalbacterium

Direct examinationand culture

Automated bloodculture monitoring

Diversifiedculture conditions

Phenotypic identification and antibiotic susceptibility testing

Automated biochemicalphenotype and antibiogram

MALDI-TOF MS

Manual biochemotypeand antibiogram

Phenotypic microarrayStrain

collection

Local national and or international

alert

SMS message Laboratory

website

Transport

Unidentifiedor unusualbacterium

Corelaboratory

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

3

Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification de souche bacteacuterienne

identification directe sur flacon drsquoheacutemocultures

Identification directe sur les urines

Biotypage des bacteacuteries detection drsquoune eacutepideacutemie Surveillance drsquoune eacutepideacutemie Identification de clones

Deacutetection rapide de la reacutesistance aux antibiotiques par MALDI-TOF Carbapeacuteneacutemases chez les bacteacuteries agrave gram neacutegatif

Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique

5

Micro-organisme inconnu Deacutepocirct sur une cible

Analyse MALDI-TOF

Interpreacutetation des donneacutees Banque de donneacutees

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Interpreacutetation des reacutesultats

6

bull Comparaison par souches

bull 3 niveaux drsquoidentification ndash Log supeacuterieur ou eacutegal agrave 2

identification drsquoespegravece ndash Log entre 17 et 20 identification

de genre ndash Log lt agrave 17 absence

drsquoidentification

Increacutementation de la Base de donneacutees Bruker Biotyper

Biologie moleacuteculaire

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Performances des diffeacuterents Spectromegravetre disponible pour la microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique

Pheacutenotypique en spectromeacutetrie de masse

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse

bull Problegravemes du choix du systegraveme drsquoidentification

ndash Gram ndash Tests drsquoorientation (catalase oxydasehellip)

bull Diversiteacute pheacutenotypique ndash Base de donneacutees nombre importants

de souches par espegravece ndash Chevauchement des pheacutenotypes

bull Choix multiples

bull Souches deacuteficientes ndash Variant ndash Inoculum insuffisant

bull Choix preacutealable inutile

bull Colonie ou eacutechantillon heacutemocultureurines

bull Une seule base de donneacutee pouvant ecirctre constitueacutee par une seule souche par espegravecemodulable

bull Profils proteacuteiques provenant en grande partie par des proteacuteines ribosomales

bull Reacutesultat rapide

bull Coucirct concurrentiel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

6

4

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2005 2006 2007 2008

Ndeg o

f pat

ient

year

18 souches Issues de13 patients

Deacutetection drsquoune eacutepideacutemie

Emerging Infectious Diseases bull wwwcdcgoveid bull Vol 16 No 8 August 2010

Arbre phylogeacuteneacutetique position des Corynebacterium spp comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN ndashsous uniteacute beta de polymerase gene rpoB (B)

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
Page 2: NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

Molecular detection and identification

MetagenomicsSequencing

PCR

Syndrome and disease--based sampling kits

Point of care (POC) laboratory

assays lt 2 hours

Real-time PCR

Immunochromatographicor agglutination

assay

Real-time genome

sequencing

New or atypicalbacterium

Direct examinationand culture

Automated bloodculture monitoring

Diversifiedculture conditions

Phenotypic identification and antibiotic susceptibility testing

Automated biochemicalphenotype and antibiogram

MALDI-TOF MS

Manual biochemotypeand antibiogram

Phenotypic microarrayStrain

collection

Local national and or international

alert

SMS message Laboratory

website

Transport

Unidentifiedor unusualbacterium

Corelaboratory

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

3

Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification de souche bacteacuterienne

identification directe sur flacon drsquoheacutemocultures

Identification directe sur les urines

Biotypage des bacteacuteries detection drsquoune eacutepideacutemie Surveillance drsquoune eacutepideacutemie Identification de clones

Deacutetection rapide de la reacutesistance aux antibiotiques par MALDI-TOF Carbapeacuteneacutemases chez les bacteacuteries agrave gram neacutegatif

Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique

5

Micro-organisme inconnu Deacutepocirct sur une cible

Analyse MALDI-TOF

Interpreacutetation des donneacutees Banque de donneacutees

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Interpreacutetation des reacutesultats

6

bull Comparaison par souches

bull 3 niveaux drsquoidentification ndash Log supeacuterieur ou eacutegal agrave 2

identification drsquoespegravece ndash Log entre 17 et 20 identification

de genre ndash Log lt agrave 17 absence

drsquoidentification

Increacutementation de la Base de donneacutees Bruker Biotyper

Biologie moleacuteculaire

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Performances des diffeacuterents Spectromegravetre disponible pour la microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique

Pheacutenotypique en spectromeacutetrie de masse

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse

bull Problegravemes du choix du systegraveme drsquoidentification

ndash Gram ndash Tests drsquoorientation (catalase oxydasehellip)

bull Diversiteacute pheacutenotypique ndash Base de donneacutees nombre importants

de souches par espegravece ndash Chevauchement des pheacutenotypes

bull Choix multiples

bull Souches deacuteficientes ndash Variant ndash Inoculum insuffisant

bull Choix preacutealable inutile

bull Colonie ou eacutechantillon heacutemocultureurines

bull Une seule base de donneacutee pouvant ecirctre constitueacutee par une seule souche par espegravecemodulable

bull Profils proteacuteiques provenant en grande partie par des proteacuteines ribosomales

bull Reacutesultat rapide

bull Coucirct concurrentiel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

6

4

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2005 2006 2007 2008

Ndeg o

f pat

ient

year

18 souches Issues de13 patients

Deacutetection drsquoune eacutepideacutemie

Emerging Infectious Diseases bull wwwcdcgoveid bull Vol 16 No 8 August 2010

Arbre phylogeacuteneacutetique position des Corynebacterium spp comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN ndashsous uniteacute beta de polymerase gene rpoB (B)

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
Page 3: NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

3

Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification de souche bacteacuterienne

identification directe sur flacon drsquoheacutemocultures

Identification directe sur les urines

Biotypage des bacteacuteries detection drsquoune eacutepideacutemie Surveillance drsquoune eacutepideacutemie Identification de clones

Deacutetection rapide de la reacutesistance aux antibiotiques par MALDI-TOF Carbapeacuteneacutemases chez les bacteacuteries agrave gram neacutegatif

Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique

5

Micro-organisme inconnu Deacutepocirct sur une cible

Analyse MALDI-TOF

Interpreacutetation des donneacutees Banque de donneacutees

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Interpreacutetation des reacutesultats

6

bull Comparaison par souches

bull 3 niveaux drsquoidentification ndash Log supeacuterieur ou eacutegal agrave 2

identification drsquoespegravece ndash Log entre 17 et 20 identification

de genre ndash Log lt agrave 17 absence

drsquoidentification

Increacutementation de la Base de donneacutees Bruker Biotyper

Biologie moleacuteculaire

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Performances des diffeacuterents Spectromegravetre disponible pour la microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique

Pheacutenotypique en spectromeacutetrie de masse

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse

bull Problegravemes du choix du systegraveme drsquoidentification

ndash Gram ndash Tests drsquoorientation (catalase oxydasehellip)

bull Diversiteacute pheacutenotypique ndash Base de donneacutees nombre importants

de souches par espegravece ndash Chevauchement des pheacutenotypes

bull Choix multiples

bull Souches deacuteficientes ndash Variant ndash Inoculum insuffisant

bull Choix preacutealable inutile

bull Colonie ou eacutechantillon heacutemocultureurines

bull Une seule base de donneacutee pouvant ecirctre constitueacutee par une seule souche par espegravecemodulable

bull Profils proteacuteiques provenant en grande partie par des proteacuteines ribosomales

bull Reacutesultat rapide

bull Coucirct concurrentiel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

6

4

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2005 2006 2007 2008

Ndeg o

f pat

ient

year

18 souches Issues de13 patients

Deacutetection drsquoune eacutepideacutemie

Emerging Infectious Diseases bull wwwcdcgoveid bull Vol 16 No 8 August 2010

Arbre phylogeacuteneacutetique position des Corynebacterium spp comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN ndashsous uniteacute beta de polymerase gene rpoB (B)

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
Page 4: NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification de souche bacteacuterienne

identification directe sur flacon drsquoheacutemocultures

Identification directe sur les urines

Biotypage des bacteacuteries detection drsquoune eacutepideacutemie Surveillance drsquoune eacutepideacutemie Identification de clones

Deacutetection rapide de la reacutesistance aux antibiotiques par MALDI-TOF Carbapeacuteneacutemases chez les bacteacuteries agrave gram neacutegatif

Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique

5

Micro-organisme inconnu Deacutepocirct sur une cible

Analyse MALDI-TOF

Interpreacutetation des donneacutees Banque de donneacutees

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Interpreacutetation des reacutesultats

6

bull Comparaison par souches

bull 3 niveaux drsquoidentification ndash Log supeacuterieur ou eacutegal agrave 2

identification drsquoespegravece ndash Log entre 17 et 20 identification

de genre ndash Log lt agrave 17 absence

drsquoidentification

Increacutementation de la Base de donneacutees Bruker Biotyper

Biologie moleacuteculaire

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Performances des diffeacuterents Spectromegravetre disponible pour la microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique

Pheacutenotypique en spectromeacutetrie de masse

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse

bull Problegravemes du choix du systegraveme drsquoidentification

ndash Gram ndash Tests drsquoorientation (catalase oxydasehellip)

bull Diversiteacute pheacutenotypique ndash Base de donneacutees nombre importants

de souches par espegravece ndash Chevauchement des pheacutenotypes

bull Choix multiples

bull Souches deacuteficientes ndash Variant ndash Inoculum insuffisant

bull Choix preacutealable inutile

bull Colonie ou eacutechantillon heacutemocultureurines

bull Une seule base de donneacutee pouvant ecirctre constitueacutee par une seule souche par espegravecemodulable

bull Profils proteacuteiques provenant en grande partie par des proteacuteines ribosomales

bull Reacutesultat rapide

bull Coucirct concurrentiel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

6

4

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2005 2006 2007 2008

Ndeg o

f pat

ient

year

18 souches Issues de13 patients

Deacutetection drsquoune eacutepideacutemie

Emerging Infectious Diseases bull wwwcdcgoveid bull Vol 16 No 8 August 2010

Arbre phylogeacuteneacutetique position des Corynebacterium spp comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN ndashsous uniteacute beta de polymerase gene rpoB (B)

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
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15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique

5

Micro-organisme inconnu Deacutepocirct sur une cible

Analyse MALDI-TOF

Interpreacutetation des donneacutees Banque de donneacutees

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Interpreacutetation des reacutesultats

6

bull Comparaison par souches

bull 3 niveaux drsquoidentification ndash Log supeacuterieur ou eacutegal agrave 2

identification drsquoespegravece ndash Log entre 17 et 20 identification

de genre ndash Log lt agrave 17 absence

drsquoidentification

Increacutementation de la Base de donneacutees Bruker Biotyper

Biologie moleacuteculaire

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Performances des diffeacuterents Spectromegravetre disponible pour la microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique

Pheacutenotypique en spectromeacutetrie de masse

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse

bull Problegravemes du choix du systegraveme drsquoidentification

ndash Gram ndash Tests drsquoorientation (catalase oxydasehellip)

bull Diversiteacute pheacutenotypique ndash Base de donneacutees nombre importants

de souches par espegravece ndash Chevauchement des pheacutenotypes

bull Choix multiples

bull Souches deacuteficientes ndash Variant ndash Inoculum insuffisant

bull Choix preacutealable inutile

bull Colonie ou eacutechantillon heacutemocultureurines

bull Une seule base de donneacutee pouvant ecirctre constitueacutee par une seule souche par espegravecemodulable

bull Profils proteacuteiques provenant en grande partie par des proteacuteines ribosomales

bull Reacutesultat rapide

bull Coucirct concurrentiel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

6

4

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2005 2006 2007 2008

Ndeg o

f pat

ient

year

18 souches Issues de13 patients

Deacutetection drsquoune eacutepideacutemie

Emerging Infectious Diseases bull wwwcdcgoveid bull Vol 16 No 8 August 2010

Arbre phylogeacuteneacutetique position des Corynebacterium spp comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN ndashsous uniteacute beta de polymerase gene rpoB (B)

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
Page 6: NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Interpreacutetation des reacutesultats

6

bull Comparaison par souches

bull 3 niveaux drsquoidentification ndash Log supeacuterieur ou eacutegal agrave 2

identification drsquoespegravece ndash Log entre 17 et 20 identification

de genre ndash Log lt agrave 17 absence

drsquoidentification

Increacutementation de la Base de donneacutees Bruker Biotyper

Biologie moleacuteculaire

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Performances des diffeacuterents Spectromegravetre disponible pour la microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique

Pheacutenotypique en spectromeacutetrie de masse

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse

bull Problegravemes du choix du systegraveme drsquoidentification

ndash Gram ndash Tests drsquoorientation (catalase oxydasehellip)

bull Diversiteacute pheacutenotypique ndash Base de donneacutees nombre importants

de souches par espegravece ndash Chevauchement des pheacutenotypes

bull Choix multiples

bull Souches deacuteficientes ndash Variant ndash Inoculum insuffisant

bull Choix preacutealable inutile

bull Colonie ou eacutechantillon heacutemocultureurines

bull Une seule base de donneacutee pouvant ecirctre constitueacutee par une seule souche par espegravecemodulable

bull Profils proteacuteiques provenant en grande partie par des proteacuteines ribosomales

bull Reacutesultat rapide

bull Coucirct concurrentiel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

6

4

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2005 2006 2007 2008

Ndeg o

f pat

ient

year

18 souches Issues de13 patients

Deacutetection drsquoune eacutepideacutemie

Emerging Infectious Diseases bull wwwcdcgoveid bull Vol 16 No 8 August 2010

Arbre phylogeacuteneacutetique position des Corynebacterium spp comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN ndashsous uniteacute beta de polymerase gene rpoB (B)

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
Page 7: NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Performances des diffeacuterents Spectromegravetre disponible pour la microbiologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique

Pheacutenotypique en spectromeacutetrie de masse

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse

bull Problegravemes du choix du systegraveme drsquoidentification

ndash Gram ndash Tests drsquoorientation (catalase oxydasehellip)

bull Diversiteacute pheacutenotypique ndash Base de donneacutees nombre importants

de souches par espegravece ndash Chevauchement des pheacutenotypes

bull Choix multiples

bull Souches deacuteficientes ndash Variant ndash Inoculum insuffisant

bull Choix preacutealable inutile

bull Colonie ou eacutechantillon heacutemocultureurines

bull Une seule base de donneacutee pouvant ecirctre constitueacutee par une seule souche par espegravecemodulable

bull Profils proteacuteiques provenant en grande partie par des proteacuteines ribosomales

bull Reacutesultat rapide

bull Coucirct concurrentiel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

6

4

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2005 2006 2007 2008

Ndeg o

f pat

ient

year

18 souches Issues de13 patients

Deacutetection drsquoune eacutepideacutemie

Emerging Infectious Diseases bull wwwcdcgoveid bull Vol 16 No 8 August 2010

Arbre phylogeacuteneacutetique position des Corynebacterium spp comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN ndashsous uniteacute beta de polymerase gene rpoB (B)

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
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15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique

Pheacutenotypique en spectromeacutetrie de masse

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse

bull Problegravemes du choix du systegraveme drsquoidentification

ndash Gram ndash Tests drsquoorientation (catalase oxydasehellip)

bull Diversiteacute pheacutenotypique ndash Base de donneacutees nombre importants

de souches par espegravece ndash Chevauchement des pheacutenotypes

bull Choix multiples

bull Souches deacuteficientes ndash Variant ndash Inoculum insuffisant

bull Choix preacutealable inutile

bull Colonie ou eacutechantillon heacutemocultureurines

bull Une seule base de donneacutee pouvant ecirctre constitueacutee par une seule souche par espegravecemodulable

bull Profils proteacuteiques provenant en grande partie par des proteacuteines ribosomales

bull Reacutesultat rapide

bull Coucirct concurrentiel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

6

4

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2005 2006 2007 2008

Ndeg o

f pat

ient

year

18 souches Issues de13 patients

Deacutetection drsquoune eacutepideacutemie

Emerging Infectious Diseases bull wwwcdcgoveid bull Vol 16 No 8 August 2010

Arbre phylogeacuteneacutetique position des Corynebacterium spp comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN ndashsous uniteacute beta de polymerase gene rpoB (B)

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
Page 9: NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse

bull Problegravemes du choix du systegraveme drsquoidentification

ndash Gram ndash Tests drsquoorientation (catalase oxydasehellip)

bull Diversiteacute pheacutenotypique ndash Base de donneacutees nombre importants

de souches par espegravece ndash Chevauchement des pheacutenotypes

bull Choix multiples

bull Souches deacuteficientes ndash Variant ndash Inoculum insuffisant

bull Choix preacutealable inutile

bull Colonie ou eacutechantillon heacutemocultureurines

bull Une seule base de donneacutee pouvant ecirctre constitueacutee par une seule souche par espegravecemodulable

bull Profils proteacuteiques provenant en grande partie par des proteacuteines ribosomales

bull Reacutesultat rapide

bull Coucirct concurrentiel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

6

4

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2005 2006 2007 2008

Ndeg o

f pat

ient

year

18 souches Issues de13 patients

Deacutetection drsquoune eacutepideacutemie

Emerging Infectious Diseases bull wwwcdcgoveid bull Vol 16 No 8 August 2010

Arbre phylogeacuteneacutetique position des Corynebacterium spp comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN ndashsous uniteacute beta de polymerase gene rpoB (B)

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
Page 10: NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse

bull Problegravemes du choix du systegraveme drsquoidentification

ndash Gram ndash Tests drsquoorientation (catalase oxydasehellip)

bull Diversiteacute pheacutenotypique ndash Base de donneacutees nombre importants

de souches par espegravece ndash Chevauchement des pheacutenotypes

bull Choix multiples

bull Souches deacuteficientes ndash Variant ndash Inoculum insuffisant

bull Choix preacutealable inutile

bull Colonie ou eacutechantillon heacutemocultureurines

bull Une seule base de donneacutee pouvant ecirctre constitueacutee par une seule souche par espegravecemodulable

bull Profils proteacuteiques provenant en grande partie par des proteacuteines ribosomales

bull Reacutesultat rapide

bull Coucirct concurrentiel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

6

4

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2005 2006 2007 2008

Ndeg o

f pat

ient

year

18 souches Issues de13 patients

Deacutetection drsquoune eacutepideacutemie

Emerging Infectious Diseases bull wwwcdcgoveid bull Vol 16 No 8 August 2010

Arbre phylogeacuteneacutetique position des Corynebacterium spp comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN ndashsous uniteacute beta de polymerase gene rpoB (B)

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
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15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

2

6

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9

0

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3

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9

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2005 2006 2007 2008

Ndeg o

f pat

ient

year

18 souches Issues de13 patients

Deacutetection drsquoune eacutepideacutemie

Emerging Infectious Diseases bull wwwcdcgoveid bull Vol 16 No 8 August 2010

Arbre phylogeacuteneacutetique position des Corynebacterium spp comparaisons MALDI-TOF (A) et sequences partielle ARN ndashsous uniteacute beta de polymerase gene rpoB (B)

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

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Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
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Surveillance drsquoune eacutepideacutemie

01002003004005006007008009001000

MSP Dendrogram

Distance Level

C1

C2

C3

C4

C5

bull 622 isolats

bull 5 clusters

bull Cluster associations

ndash Origine Geographical bull Algeacuterie ST80 (C1)

bull Marseille (C2-C5)

ndash Origine Clinique bull Patients non-mucovicidosique (C5)

bull Patients mucovicidosique ndash C1 and C2 children

ndash C3 and C4 adults

Staphylococcus aureus et mucovicidose

Clusters identification de pheacutenotypes

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
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Epideacutemie et origine geacuteographique

Klebsiella pneumoniae

01002003004005006007008009001000K pneumoniae SKP3K pneumoniae SKP4K pneumoniae SKP2K pneumoniae SKP8K pneumoniae OKP5K pneumoniae OKP9K pneumoniae SKP14K pneumoniae SKP7K pneumoniae SKP9K pneumoniae SKP15K pneumoniae SKP29K pneumoniae OKP15K pneumoniae KP61K pneumoniae KP74K pneumoniae SKP28K pneumoniae SKP27K pneumoniae KP63K pneumoniae OKP8K pneumoniae KP73K pneumoniae KP78K pneumoniae OKP10K pneumoniae KP62K pneumoniae SKP22K pneumoniae OKP13K pneumoniae SKP23K pneumoniae SKP26K pneumoniae KP80K pneumoniae KP70K pneumoniae KP76K pneumoniae KP77K pneumoniae SKP30K pneumoniae OKP7K pneumoniae OKP3K pneumoniae OKP6K pneumoniae SKP1K pneumoniae KP64K pneumoniae KP98K pneumoniae SKP25K pneumoniae KP79K pneumoniae SKP6K pneumoniae KP101K pneumoniae KP83K pneumoniae SKP17K pneumoniae SKP21K pneumoniae KP95K pneumoniae KP69K pneumoniae KP81K pneumoniae OKP11K pneumoniae KP96K pneumoniae OKP1K pneumoniae KP82K pneumoniae SKP16K pneumoniae KP102K pneumoniae KP65K pneumoniae KP85K pneumoniae KP86K pneumoniae KP90K pneumoniae OKP4K pneumoniae KP67K pneumoniae KP87K pneumoniae KP88K pneumoniae OKP14K pneumoniae KP68K pneumoniae KP92K pneumoniae OKP12K pneumoniae KP93K pneumoniae 129K pneumoniae OKP2K pneumoniae 131K pneumoniae CSUR P130K pneumoniae KP89K pneumoniae SKP20K pneumoniae 128K pneumoniae 130K pneumoniae 64K pneumoniae 108K pneumoniae 63K pneumoniae 67K pneumoniae 121K pneumoniae 88K pneumoniae 1K pneumoniae 116K pneumoniae 27K pneumoniae 52K pneumoniae 65K pneumoniae 34K pneumoniae 36K pneumoniae 109K pneumoniae 169K pneumoniae 79K pneumoniae 117K pneumoniae 7K pneumoniae 113K pneumoniae 40K pneumoniae 115K pneumoniae 19K pneumoniae 82K pneumoniae 123K pneumoniae 5K pneumoniae 2K pneumoniae 38K pneumoniae 74K pneumoniae 62K pneumoniae 3K pneumoniae 32K pneumoniae 6K pneumoniae 77K pneumoniae 94K pneumoniae 110K pneumoniae 78K pneumoniae 20K pneumoniae 125K pneumoniae 119K pneumoniae 76K pneumoniae 98K pneumoniae 66K pneumoniae 17K pneumoniae 90K pneumoniae 23K pneumoniae 31K pneumoniae 10K pneumoniae 144K pneumoniae 16K pneumoniae 60K pneumoniae 96K pneumoniae 75K pneumoniae 86K pneumoniae 97K pneumoniae 112K pneumoniae 118K pneumoniae 80K pneumoniae 104K pneumoniae 35K pneumoniae 85K pneumoniae 99K pneumoniae 106K pneumoniae 120K pneumoniae 91K pneumoniae 22K pneumoniae 49K pneumoniae 58K pneumoniae 41K pneumoniae 137K pneumoniae 68K pneumoniae 149K pneumoniae 105K pneumoniae 47K pneumoniae 53K pneumoniae 147K pneumoniae 18K pneumoniae 81K pneumoniae 59K pneumoniae 61K pneumoniae 93K pneumoniae 11K pneumoniae 37K pneumoniae 92K pneumoniae 148K pneumoniae 146K pneumoniae 102K pneumoniae 114K pneumoniae 12K pneumoniae 156K pneumoniae 111K pneumoniae 30K pneumoniae 126K pneumoniae 84K pneumoniae 138K pneumoniae 54K pneumoniae 150K pneumoniae 46K pneumoniae 28K pneumoniae 158K pneumoniae 159K pneumoniae 167K pneumoniae 164K pneumoniae 165K pneumoniae 168K pneumoniae 166K pneumoniae 160K pneumoniae 161K pneumoniae 163K pneumoniae 103K pneumoniae 87K pneumoniae 83K pneumoniae 21K pneumoniae 73K pneumoniae 157K pneumoniae 133K pneumoniae 14K pneumoniae 89K pneumoniae 95K pneumoniae 69K pneumoniae 136K pneumoniae 134K pneumoniae 152K pneumoniae 48K pneumoniae 155K pneumoniae 55K pneumoniae 33K pneumoniae 135K pneumoniae 142K pneumoniae 42K pneumoniae 154K pneumoniae 13K pneumoniae 9K pneumoniae 153K pneumoniae 100K pneumoniae 8K pneumoniae 101K pneumoniae 145K pneumoniae 15K pneumoniae 4K pneumoniae 162K pneumoniae 39K pneumoniae 107K pneumoniae 25K pneumoniae 45K pneumoniae 72K pneumoniae 127K pneumoniae 29K pneumoniae NCTC13443K pneumoniae 122K pneumoniae 124K pneumoniae 57K pneumoniae 132K pneumoniae 140K pneumoniae 26K pneumoniae 56K pneumoniae 141K pneumoniae 43K pneumoniae 139K pneumoniae 143K pneumoniae 151K pneumoniae 70K pneumoniae 51K pneumoniae 71K pneumoniae 24K pneumoniae 44

MSP Dendrogram

Distance Level

Marseille - France

Algeria

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
Page 14: NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

Klebsiella pneumoniae Sensible Imipeacutenegraveme ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F8 MS Raw

00

05

10

15

205x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0G7 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M10 MS Raw

0

2

4

6

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M20 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

240 260 280 300 320 340 360 380mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

04

06

08

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

4

64x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

3

4

5

64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
Page 15: NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Imipeacutenegraveme IMP pic speacutecifique agrave 300 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

15

4x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J15 MS Raw

00

02

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5x10

Inte

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essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0A11 MS Raw

0

2

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essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0N19 MS Raw

0

1

2

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64x10

Inte

ns [

au

]

250 260 270 280 290 300 310 320 330mz

IMP 1 B T0

IMP 1 B T2

IMP 1 B T1

Matrice +Nacl

Disparition de lrsquoIMP agrave T1

imipenemmetabolite

carbapenemase

NH

O OH

S

NH NH

H

C11H17N3O2S N

O OH

S

NH NH

HHOH

OC12H17N3O4S

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
Page 16: NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN ... … · NOUVELLES TECHNIQUES : POUR QUELLES AVANCÉES EN MICROBIOLOGIE MÉDICALE Dr Frédérique GOURIET Fédération de Bactériologie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Klebsiella pneumoniae NDM-1 Positive ndash Test Meacuteropeacutenegraveme MER pic speacutecifique agrave 384 mz

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0F7 MS Raw

00

05

10

155x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0M15 MS Raw

00

02

04

06

08

105x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J11 MS Raw

00

05

10

15

5x10

Inte

ns [

au

]

essai-ATB-bact-27-09-2011-ultraflex 0J21 MS Raw

00

05

10

15

20

5x10

Inte

ns [

au

]

360 370 380 390 400 410 420mz

Matrice+NACL

MER 1 B to

MER 1 B t2

MER 1 B t1 Disparition de MER agrave T1

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

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Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

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Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
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15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Strain type No of isolates

(Location of isolates [ Noof isolates])

MALDI-TOF analysis

Range of the ratio of the area of

imipenemmetabolite based on the time of

incubation

No of isolates detected as carbapenemase

producers based on the time of incubation

2h 4h 2h 4h

Carbapenem-resistant strains (70) (imipenem MIC gt8 mgL) lt001-177 lt001-026 67 70

K pneumoniae KPC 1 lt001 lt001 1 1

K pneumoniae NDM-1 2

P aeruginosa VIM 2

P aeruginosa IMP 2

lt001

lt001

lt001

lt001

ND

ND

2

2

2

2

2

2

Abaumannii blaOXA23-like 57 (Marseille [17] Algeria [40]) lt001-177 lt001-039 54 57

Abaumannii blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001 002-004 3 3

Abaumannii blaOXA23-like + blaOXA24-like 3 (Algeria) lt001-048 lt001-026 3 3

Carbapenem-susceptible strains (79) (imipenem MIC le2 mgL) lt001-1286 lt001 -1484 0 0

K pneumoniae ESBL 31 (Algeria)

K pneumoniae non ESBL 4 (Algeria)

Escherichia coli ATCC 25922 (1)

ND

ND

164

064-1484

124-582

117

0

0

0

0

0

0

A baumannii 43 (Marseille [1] Algeria [42]) 061-1286 076 -326 0 0

Table 1 Characterization of the 149 bacterial strains analyzed and data summary of imipenem hydrolysis assay utilizing MALDI-TOF MS

Sensitivity = 100 Specificity = 100 (t=4h)

Deacutetection des carbapeacuteneacutemases par MALDI-TOF

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

18

bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

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Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
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bull Les tests microbiologiques ameacuteliorent la prise en charge des malades si les reacutesultats sont disponibles dans le temps du soin

Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge

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Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

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Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

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23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

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25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
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15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014 19

Organisation du laboratoire central en microbiologie

eacutechantillons

Preacutelegravevements drsquoenvironnement

- reacuteservoirs - vecteurs

PRE-ANALYTIQUE ANALYTIQUE POST-ANALYTIQUE

gt Reacuteception 2424 365 joursan

gt Enregistrement

gt Dispatching

Seacuterologies Automates

inoculation automatique

Inoculation Manuelle bull cellules bull animaux

Identi

ficati

on M

ALDI

-TOF

bull Identification par seacutequenccedilage bullGeacutenomique au deacutebit

Antibiogramme automatiseacute

bull Validation

bull Expertise et conseil theacuterapeutique bull Contact avec cliniciens

Limites des laboratoires cœur reacutesultats retardeacutes dans les tests de routine

Regroupement geacuteographique des laboratoires sur un seul site

Creacuteation de laboratoires secondaire drsquourgence

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
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15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Objectif laboratoire drsquourgence

bull Prise en charge meacutedicale rapide des maladies infectieuses en fournissant les reacutesultats des analyses microbiologiques pendant que les malades sont encore en service drsquourgence =gt Reacutesultats lt 4 heures

bull Afin de reacutepondre agrave 4 questions cruciales

bull 1 ndash Hospitalisation neacutecessaire

bull 2 ndash isolement requis

bull 3 ndashtraitement anti-infectieux neacutecessaire

bull 4 ndashanalyses compleacutementaires neacutecessaires

20

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
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15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord

21

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

Ordi

Ordi+ imp

Ordi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm Ordi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

210 cm

60 cmEZ1

Qiagen

OrdiOrdi

Ordi+ imp

OrdiOrdi

SmartCycler

SmartCycler

PSMHolten

LaminAir

Congeacutelobas

-20degC

Congeacutelobas

-20degC

Frigobas

+4degC

20 cm

Evier

101 cm

92 cm

113 cm

60 cm

50 cm

257 cm60 cm

BainSec

StuartVortex

Bioblock

CentriJouan

C3i

GenXpert

Monarch

60 cm

65 cm OrdiOrdi

66 cm

240 cm

60 cm

153 cm

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard sous paillasseL113 x h85 x p50

Placard muralL120 x h70 x p30

2 eacutetagegraveres muralesL270 x p36

2 eacutetagegraveres muralesL160 x p36

MicroZeiss

Axiolab

POC Timone172 m2

143 cm

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
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Critegraveres de seacutelection des analyses au POC

22

bull Reacutesultats en moins de 4 heures transmission SMS

bull bonne valeur preacutedictive

bull deacutepistage par syndrome

bull Reacutesultats modifient la prise en charge

Immunochromatographie PCR en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

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Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

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Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

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Diagnostic kits

Diagnostic kits

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Core Laboratory Other

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POC

Consultation

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Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

remerciements

bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

35

Merci pour votre attention

  • Nouvelles techniques pour quelles avanceacutees en microbiologie meacutedicale
  • Diapositive numeacutero 2
  • Diapositive numeacutero 3
  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
  • Diapositive numeacutero 13
  • Diapositive numeacutero 14
  • Diapositive numeacutero 15
  • Diapositive numeacutero 16
  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
  • Diapositive numeacutero 25
  • Diapositive numeacutero 26
  • Diapositive numeacutero 27
  • Diapositive numeacutero 28
  • Diapositive numeacutero 29
  • Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale
  • Approche syndromique kit peacutericardique
  • Application meacutetageacutenomique
  • Approche syndromique ex Kit endocardite
  • Application geacutenome en temps reacuteel
  • remerciements
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15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

23

Pneumonia bull Flu ICT bull VRS ICT bull Mycoplasma pneumoniae PCR bull Whooping-cough (B pertussis) PCR bull Coxiella burnetii PCR bull Staphylococcus aureus (ICU only) PCR bull Pneumocystis jiroveci PCR bull Legionella urinary antigen bull Pneumococcal urinary antigen

Gastro-enteritis diarrhoea bull Rotavirus ndash adenovirus ICT bull Norovirus ICT bull Clostridium difficile - Helicobacter pylori ICT

Tropical fever bull Malaria PCR bull Malaria ICT bull Dengue ICT

Meningitis bull Cytology bull Enterovirus PCR bull Herpes virus PCR bull Varicella zoster virus PCR bull Meningococcus PCR bull Pneumococcus PCR bull Cryptococcus

Gynecology bull HIV ICT bull Group B streptococcus PCR bull Atopobium vaginae PCR

Pharyngitis bull Group A streptococcus ICT bull Infectious mononucleosis MNI test

Others bull Blood exposure accident = HIV bull Tetanus toxin ICT bull Procalcitonin

Exploration par syndrome

PNEU

GASTRO

Tropical fever

MENIN

GYNECO

ANG

Other

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

Strip 2 CONTROcircLE NEGATIF - rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

Une barrette par patient ex meacuteningite

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

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Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

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Approche syndromique kit peacutericardique

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Application meacutetageacutenomique

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PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

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33

Geacutenome en temps reacuteel

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Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

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  • Interpreacutetation des reacutesultats
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Real-time PCR assays syndrome-specific strips

24

LCR code

5 microL

in all wells

Strip 1

HSV VZV PlyN LytA TISS ctrA crgA 7SL-RNA mix

Strip 3

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CONTROcircLE POSITIF- Rien agrave rajouter ndash precirct agrave lrsquoemploi

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

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Une barrette par patient ex meacuteningite

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25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

Extraction EZ1 Virus card

pure DNA

cup1 cup2 cup3

5 microL

Code

mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

7SL-RNA 7SL-RNA

Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

Nothing to add ndash Ready to use controls

1 patient par barrette ex pneumonie

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26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

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Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

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Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

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Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

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Diagnostic kits

Diagnostic kits

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Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

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POC

Consultation

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Diagnostic kits

Diagnostic kits

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Clinics hospitals laboratories In France and abroad

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Place des nouveaux outils moleacuteculaires

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Approche syndromique kit peacutericardique

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Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

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Geacutenome en temps reacuteel

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Application geacutenome en temps reacuteel

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J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

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  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
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25

Real-time PCR assays syndrome-specific multiplexed strips

190 microl sample + 10microL TISS

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mix X TISS 7SL-RNA X TISS X

patient Negative control Positive control

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Coxiella burnetii M pneumoniae Bordetella pertussis

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1 patient par barrette ex pneumonie

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POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

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Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

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Activiteacute exponentielle

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POC

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Clinics hospitals laboratories In France and abroad

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Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

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Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

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  • Nouvelles applications de la spectromeacutetrie de masse au laboratoire de Microbiologie
  • Apport de la Spectromeacutetrie de masse pour le diagnostic microbiologique
  • Interpreacutetation des reacutesultats
  • Performances des diffeacuterentsSpectromegravetre disponible pour la microbiologie
  • Problegravemes drsquoidentification Discordance MALDI_Tof et identification classique
  • Diapositive numeacutero 9
  • Identification pheacutenotypique classique spectromeacutetrie de masse
  • Diapositive numeacutero 11
  • Diapositive numeacutero 12
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  • Diapositive numeacutero 17
  • Diagnostic rapide en microbiologie meacutedicale un veacuteritable challenge
  • Organisation du laboratoire central en microbiologie
  • Objectif laboratoire drsquourgence
  • Point of care agrave lrsquohocircpital de la Timone et hocircpital Nord
  • Critegraveres de seacutelection des analyses au POC
  • Diapositive numeacutero 23
  • Real-time PCR assays syndrome-specific strips
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  • Approche syndromique ex Kit endocardite
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15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

26

POC PCR en temps reacuteel

Xpertreg Flu Detection of Flu virus de type A and B and H1N1 2009 Preparation 2 min Result 77 min

Xpertreg EV Molecular detection of enterovirus meningitis Preparation 5 min Result 150 min

Xpertreg C difficile Detection of toxigenic et epidemic strains of Clostridium difficile Preparation 2 min Result 47 min

Xpertreg GBS Intrapartum detection of Streptococcus group B Preparation 1 min Result 52 min

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

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Activiteacute exponentielle

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

29

Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

Assistance Publique des Hocircpitaux de Marseille

POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Diagnostic kits

Remote POC

Perspectives POC deacutelocaliseacute Afrique

Clinics hospitals laboratories In France and abroad

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

Place des nouveaux outils moleacuteculaires

30

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Approche syndromique kit peacutericardique

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application meacutetageacutenomique

32

Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

PLoS One 2014 Apr 19(4)e93367 2014 Viral communities associated with human pericardial fluids in idiopathic pericarditis Fancello L Monteil S Popgeorgiev N Rivet R Gouriet F Fournier PE Raoult D Desnues C

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Approche syndromique ex Kit endocardite

33

Geacutenome en temps reacuteel

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

Application geacutenome en temps reacuteel

bull Geacutenome en temps reacuteel de Sepidermidis

J Clin Microbiol 2013 May51(5)1617-21 Deciphering genomic virulence traits of a Staphylococcus epidermidis strain causing native-valve endocarditis Fournier PE Gouriet F Gimenez G Robert C Raoult D

Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

15es JNI Bordeaux du 11 au 13 juin 2014

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bull Pr Michel Drancourt bull Dr jean-Paul Casalta bull Dr Pierre Yves Levy bull Pr jean Marc Rolain

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Activiteacute exponentielle

2008 2009 2010 Test Diagnostics Test Diagnostics Test Diagnostics influenza virus 1390 102 7 12455 1489 12 2551 25 1 RSV 1537 378 25 3300 297 9 2171 451 21 S pneumoniae 67 12 18 967 63 7 L pneumophila 168 1 1 405 4 1 954 9 1 M pneumoniae 668 25 4 1184 47 4 C burnetii 244 0 0 B pertussis 561 20 4 761 10 1 Procalcitonin 1169 206 18 1090 169 16 774 104 13 S pyogenes 1817 339 19 2912 567 19 2210 420 19 EBV 82 9 11 143 13 9 146 16 11 EV 296 84 28 482 92 19 416 58 14 HSV-12 3 0 0 114 3 3 251 3 1 S pneumoniae 267 10 4 479 10 2 410 14 3 N meningitidis 272 6 2 480 3 1 403 6 1 M pneumoniae 38 1 3 144 0 0 Rotavirusadeno 537 105 20 1075 313 29 1221 295 24 C difficile 352 7 2 518 10 2 535 17 3 H pylori 33 4 12 49 4 8 60 1 2 S agalactiae 149 21 14 352 64 18 417 66 16 HIV 199 2 1 401 4 1 269 5 2 Plasmodium spp 277 50 18 367 90 25 382 83 22 Dengue virus 45 4 9 66 6 9 15 2 13 C tetani 16 8 50 21 18 86 Total 8593 1328 15 26038 3204 12 16506 1713 10

Cohen-Bacrie S et al PloS One 2011

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Activiteacute exponentielle

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Core Other

Remote mobile POC

Consultation

Emergency room POC

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Diagnostic kits

Diagnostic kits

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Core Laboratory Other

Remote POC in patientrsquos premices

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POC

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Consultation

Emergency room POC

IHU Hospitalization

Diagnostic kits

Diagnostic kits

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Remote POC

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Approche syndromique du diagnostic en microbiologie meacutedicale

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POC

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Detection Torque teno virus et papillomavirus dans le liquide peacutericardique pour la 1ere fois chez lrsquohomme

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Staphylococcus epidermidis souche isoleacutee de 3 heacutemocultures sur 3 chez responsable drsquoune endocardite aortique chez un homme de 26 ans geacutenome de 25-Mb sequence unique avec 32 genes de virulence CSUR P278

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