Obtention de la Obtention de la séquence séquence

nucléotidique nucléotidique codante pour la GFPcodante pour la GFP

I- Reverse transcription de l’ARN en ADNc par RT-I- Reverse transcription de l’ARN en ADNc par RT-PCRPCR

II- Amplification de l’ADNc codant pour la protéine II- Amplification de l’ADNc codant pour la protéine fluorescente par PCRfluorescente par PCR

III- Vérification de l’amplification de l’ADNc par III- Vérification de l’amplification de l’ADNc par électrophorèse électrophorèse

IV- Purification de l’ADNc pour l’étape suivanteIV- Purification de l’ADNc pour l’étape suivante

I- Reverse transcription de l’ARN en ADNc I- Reverse transcription de l’ARN en ADNc par RT-PCRpar RT-PCR

On utilise la RT-PCR pour obtenir l’ADNc totale de l’organisme On utilise la RT-PCR pour obtenir l’ADNc totale de l’organisme fluorescent.fluorescent.

RT-PCR :RT-PCR : reverse transcription de l’ARNm en ADNc, c’est-à-dire que reverse transcription de l’ARNm en ADNc, c’est-à-dire que la RT-la RT- PCR retranscrit l’uracile de l’ARN en thymine de façon à PCR retranscrit l’uracile de l’ARN en thymine de façon à donner un brin d’ADNc.donner un brin d’ADNc.

Comment passe-t-on de l’ARN à l’ADNc ?Comment passe-t-on de l’ARN à l’ADNc ?

Schéma : Schéma :

s

II. Amplification de l’ADNc codant pour la II. Amplification de l’ADNc codant pour la protéine fluorescente par PCRprotéine fluorescente par PCR

Schéma: un cycle de PCR:Schéma: un cycle de PCR:

X 26 cycles

(spécifiques)

III- Vérification de l’amplification de l’ADNc par III- Vérification de l’amplification de l’ADNc par électrophorèseélectrophorèse

L’électrophorèse permet la migration de l’ADNc du négatif vers le positif L’électrophorèse permet la migration de l’ADNc du négatif vers le positif (car celui-ci est négatif). Plus la taille est petite, plus la molécule migre (car celui-ci est négatif). Plus la taille est petite, plus la molécule migre

vers le pôle positif.vers le pôle positif.

En paires de bases

2 000

1 500

1 000

500

Echelle C3 T1 C4 C1 C2

*C1 *C1 H2O (sans Taq polymérase) H2O (sans Taq polymérase) *C2 *C2 contamination (sans ADN) contamination (sans ADN) *C3 *C3 sur un organisme non fluorescent (avec de l’ADNc de sur un organisme non fluorescent (avec de l’ADNc de saumon)saumon) *C4 *C4 sur un échantillon positif (connu) sur un échantillon positif (connu) *T1 *T1 sur l’ADNc de méduse sur l’ADNc de méduse

On mesure la distance entre le puits et les résidus fluorescents :On mesure la distance entre le puits et les résidus fluorescents :

échelleéchellecontrôle contrôle saumon saumon

PCR PCR méduseméduse

contrôle PCR contrôle PCR positifpositif

4cm4cm

6,5 cm6,5 cm      

5,5 cm5,5 cm      

5,5 cm5,5 cm      

4,5 cm4,5 cm

5 cm5 cm

6 cm6 cm

L’échelle est :

CmCm Paires de basesPaires de bases

44 20002000

4,54,5 15001500

55 10001000

66 500500

D’après cette échelle on peut tracer la courbe représentative suivante:D’après cette échelle on peut tracer la courbe représentative suivante:

courbe de référence

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5

cm

pai

res

de

bas

esSérie1

#Grâce à cette courbe nous pouvons dire que pour:

_ C3, le résidu fluorescent dans le gel correspond aux oligonucléotides.

_ T1, le résidu fluorescent dans le gel correspond à 750 paires de bases d'ADNc.

_ C4, le résidu fluorescent dans le gel correspond à 750 paires de bases d'ADNc.

IV- Purification de l’ADNc pour l’étape IV- Purification de l’ADNc pour l’étape suivantesuivante

La purification sert à enlever l’excès de tampon, de dNTP, d’enzymes La purification sert à enlever l’excès de tampon, de dNTP, d’enzymes et d’amorces et donc à obtenir un ADNc pur. et d’amorces et donc à obtenir un ADNc pur.

Prélèvement au scalpel

500 pb

1000 pb

On obtient un ADNc pur qui servira pour l’étape suivante.

Ce diaporama vous a été présenté Ce diaporama vous a été présenté par les experts du NCIS:par les experts du NCIS:

_ Florent _ Florent _ Virgile_ Virgile _ Elodie_ Elodie _ Alice_ Alice _ Coline_ Coline