Embed Size (px)
Citation preview
الجمھوریة الجزائریة الدیمقراطیة الشعبیة
République Algérienne Démocratique Et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Faculté des sciences de la nature et de la vie
Département de biologie
Laboratoire de Microbiologie Appliquée
Thèse de Doctorat troisième cycle LMD
Spécialité : Microbiologie fondamentale et appliquée
Option : Contrôle microbiologique et hygiène alimentaire
Thème
Soutenue publiquement le 03/12/2015
Par : Mme Zergui Amina
Devant les membres du jury : Président Pr. KIHAL M. Université d’Oran 1 Rapporteur Dr. SAIDI N. Université d’Oran 1 Examinateurs Pr. BELLAHCENE M. Centre Universitaire - Aïn Témouchent Pr. GUESSAS B. Université d’Oran 1 Pr. HEDDADJI M. Université d’Oran 1
Année universitaire 2014-2015
Optimisation des conditions de biosynthèse de substances
antimicrobiennes isolées de souches de bactéries lactiques du lait crû de chamelle
Remerciements
Ce travail s’est déroulé au laboratoire de microbiologie appliquée de
l’université d’Oran 1 (Algérie), et aux laboratoires de recherche du département de
Biotechnologie de l’université de Pondichéry (Inde).
J’exprime toute ma reconnaissance au Professeur Arul Venkatesan pour
l'accueil et les conditions de travail privilégiées qui m’ont été offertes au sein des
laboratoires de recherche de l’Université de Pondichéry.
Je remercie mon directeur de thèse Dr. Saidi Noureddine, maitre de
conférences A à l’université d’Oran 1, d’avoir accepté de diriger ce travail. Je lui
exprime toute ma gratitude pour sa patience, son encadrement, ses conseils ainsi que
pour avoir patiemment corrigé ce document.
Je remercie monsieur Kihal Mebrouk, Professeur et directeur du laboratoire de
microbiologie appliqué, de vouloir présider le jury.
Je suis très honorée que messieurs Pr. Guessas. B, Pr. Heddadji. M et Pr.
Belahcene. M, soient les jurys de cette thèse.
Je tiens à remercier mes collègues Veena Vijaykumar, Balraj Meleppat et
Repally Ayan, Venkatesh Perumal, Dallel Arabet, Nora Laref et Mohamed Merzoug
pour les discussions fructueuses, l’immense coopération et leur support émotionnel.
Mes profonds remerciements vont au Professeur Sakthivel. N de l’université
de Pondicherry (Inde), Professeur Drider. D de l’université de Lille 1 (France) et au
Professeur Diep. B.D de l’université d’Oslo (Norvège) pour avoir partagé leurs
expériences et connaissances scientifiques, ainsi que leurs aides précieuses lors des
manipulations.
Mes remerciements vont aussi à ma famille et mes amis qui, avec cette
question récurrente, « quand est-ce que tu la soutiens cette thèse ? », bien
qu’angoissante en période fréquente de doutes, m’ont permis de ne jamais dévier de
mon objectif final.
Et enfin à toute personne ayant contribué de près ou de loin à la réalisation de
ce travail de recherche.
Dédicaces
Je dédie cette thèse aux gens que j'aime plus que tout au monde :
À mes parents, pour être vous-mêmes, pour les valeurs que vous m'avez
transmises et pour le support sans fin que vous ne cessez de me donner.
À mon confident, mon ami et mon conjoint.
À mes sœurs, pour leur courage et leur détermination exemplaire.
J'aimerais finir cette dédicace par une citation qui exprime clairement selon
moi l'origine de toute démarche scientifique. Sans elle, la curiosité et le goût du
savoir ne peuvent pas exister.
« L'imagination est plus importante que le savoir »
- Albert Einstein -
Sommaire
1. Introduction 2. Analyse bibliographique
2.1. Caractéristiques du lait de chamelle 2.1.1. Caractéristiques physiques, chimiques et organoleptique 2.1.2. Une source de bactéries lactiques
2.2. Bactéries lactiques 2.2.1. Classification des bactéries lactiques
2.2.1. Voies métaboliques 2.3. Composés antimicrobiens 2.3.1. Acides organiques 2.3.2. Peroxyde d’hydrogène 2.3.3. Composés phénoliques 2.3.4. Acides gras 2.3.5. Dioxyde de carbone 2.3.6. Diacétyle (2,3-butanedione) 2.3.7. Antibiotiques 2.3.8. Bactériocines
2.3.8.1. Classification 2.3.8.2. Génétique des bactériocines 2.3.8.3. Biosynthèse des bactériocines
2.4. Lactobacillus plantarum comme modèle 2.4.1. Classification 2.4.2. Diversité génétique 2.4.3. Production de bactériocines 2.4.4. Rôle dans l’industrie agroalimentaire 2.5. Effets préventifs et curatifs des probiotiques
3. Matériel et méthodes 3.1. Collecte du lait de chamelle 3.2. Isolement, purification et identification des bactéries lactiques
3.2.1. Caractérisation phénotypique 3.2.1.1. Gram et morphologie 3.2.1.2. Production de catalase 3.2.1.3 Tests d’identification biochimique
3.2.2. Caractérisation moléculaire 3.2.2.1. Extraction et Purification de l’ADN génomique 3.2.2.2. Electrophorèse sur gel d’agarose 3.2.2.3. PCR des génomes collectés 3.2.2.4. Séquençage du produit PCR des souches 3.2.2.5. Soumission de la séquence à GenBank
3.3. Propriétés probiotiques de la souche sélectionnée 3.3.1. Activité gélatinase 3.3.2. Activité hémolytique 3.3.3. Tolérance à la bile 3.3.4. Capacité à réduire le cholestérol 3.3.5. Résistance à l’acidité 3.3.6. Production d’exopolysaccharides (EPS)
3.3.7. Spectre d’activité antibactérienne 3.4. Purification des bactériocines
3.4.1. Préparation de l’extrait bactériocinogénique 3.4.2. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
1
4 4 5 7 7 8
10 10 11 12 13 13 14 14 15 15 17 20 21 21 23 23 24 25
28 30 30 30 30 30 32 32 33 33 34 34 35 35 35 35 36 36 36 36 38 38 39
3.4.3. Détermination du poids moléculaire par MALDI-TOF/MS 3.4.4. Détermination du N-terminal
3.5. Action de différents facteurs sur la production de la bactériocine 3.5.1. Effet de la température, 3.5.2. Effet du pH 3.5.3. Effet des enzymes
3.6. Optimisation des conditions de biosynthèse des bactériocines 3.6.1. Effet de la température 3.6.3. Effet du pH 3.6.3. Effet de la salinité 3.8.4. Effet du surfactant Tween 80
4. Résultats et discussions 4.1. Caractéristiques physico chimiques du lait collecté 4.2. Identification des souches
4.2.1. Obtention des isolats purs 4.2.2. Identification phénotypique
- Genre Lactococcus - Genre Lactobacillus
4.2.3. Identification moléculaire 4.3. Caractéristiques de la souche sélectionnée
4.3.1. Caractérisation phénotypique 4.3.2. Tests d’identification biochimique 4.3.3. Antibiogramme
4.4. Propriétés probiotiques de la souche sélectionnée 4.4.1. Activité gélatinase et hémolytique 4.4.2. Tolérance à la bile 4.4.3. Capacité à réduire le cholestérol 4.4.4. Résistance à l’acidité 4.4.5. Production d’exopolysaccharides (EPS) 4.4.6. Spectre d’activités antibactériennes
4.5. Purification des bactériocines 4.6. Poids moléculaire des bactériocines
4.6.1. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide 4.6.2. Détermination du poids moléculaire par MALDI-TOF/MS
4.7. Séquençage du N-terminal 4.8. Action de différents facteurs sur la production de la bactériocine
4.8.1. Effet de la température 4.8.2. Effet du pH 4.8.3. Effet des enzymes
4.9. Optimisation des conditions de biosynthèse des bactériocines 4.9.1. Effet de la température 4.9.2. Effet du pH 4.9.3. Effet du NaCl 4.9.4. Effet du surfactant Tween
5. Conclusion 6. Références bibliographiques 7. Annexes
41 41 41 41 41 42 42 43 43 43 44
45 49 50 51 57 58 59 67 67 68 68 70 70 70 71 72 73 73 75 77 77 78 80 80 80 81 81 81 81 84 87 90
92 94
Liste des figures
Figure 1: Schéma de différenciation des bactéries lactiques. Figure 2: Électrophorèse sur gel de DU10. Figure 3: Arbre phylogénétique de Lactobacillus plantarum DU10. Figure 4: Dépôt de la séquence DU10 sur NCBI. Figure 5: Arbre phylogénétique de Lactobacillus curvatus H17. Figure 6: Arbre phylogénétique de Lactobacillus brevis M2. Figure 7: Arbre phylogénétique d’Enterococcus faecium Z86. Figure 8: Arbre phylogénétique d’Enterococcus faecium Z87. Figure 9: Colonies de DU10 sur boite de Pétri. Figure 10: Aspect microscopique de DU10. Figure 11: Action des sels biliaires sur la croissance de DU10. Figure 12: Apparition de colonies blanches productrices d’EPS. Figure 13: Sephadex G-25 chromatogramme. Figue 14: Chromatogramme de la plantaricine MZ. Figure 15: Electrophorèse sur gel Tricine-SDS PAGE de la plantaricine MZ. Figue 16: MALDI-TOF/MS de la plantaricine M. Figure 17: MALDI-TOF/MS de la plantaricine Z. Figure 18 (a): Effet de la température sur la croissance bactérienne, la production de bactériocines avec variation du pH. Figure 18 (b): Effet de la température sur la croissance bactérienne, la production de bactériocines avec variation du pH. Figure 19 (a): Effet du pH sur la croissance bactérienne, la production de bactériocines avec variation du pH. Figure 19 (b): Effet du pH sur la croissance bactérienne, la production de bactériocines avec variation du pH. Figure 20 (a): Effet de la salinité sur la croissance bactérienne, la production de bactériocines avec variation du pH. Figure 20 (b): Effet de la salinité sur la croissance bactérienne, la production de bactériocines avec variation du pH. Figure 21: Effet de Tween 80 sur la croissance bactérienne, la production de bactériocines avec variation du pH.
Liste des tableaux Tableau1: Bactéries pathogènes. Tableau 2: Analyses physicochimiques et minérales du lait de chamelle. Tableau 3: Analyses physico-chimiques et minérales du lait de vache. Tableau 4: Profils fermentaires des cocci. Tableau 5: Profils fermentaires des cocci. Tableau 6: Profils fermentaires des lactobacilles. Tableau 7: Profils fermentaires des lactobacilles. Tableau 8: Activité antimicrobienne des souches sélectionnées. Tableau 9: Antibiogramme de la souche DU10. Tableau 10: Effet du suc gastrique artificiel sur la croissance de DU10. Tableau 11: Activité antimicrobienne de DU10. Tableau 12: Effet de différents traitements sur l'activité de la plantaricine MZ.
1. Introduction
1. Introduction
Le mot « probiotique » a été pour la première fois utilisé comme un antonyme
au mot « antibiotique ». Il dérive du Grec et signifie « pour la vie » (Hamilton-Miler
et al., 2003 ; Vasiljevic et Shah, 2008). Le concept des probiotiques a été proposé par
Metchinikoff, un lauréat du prix Nobel en 1908. Il a été étonné par la très
longue durée de vie des paysans Bulgares et a ensuite étudié leur mode de vie ainsi
que leurs habitudes alimentaires. Ces paysans utilisaient de très grandes quantités de
produits laitiers fermentés. Metchnikoff a postulé que les pathogènes présents dans
l’intestin humain produisaient des molécules toxiques qui affaiblissent
progressivement le corps. Les bactéries lactiques présentes dans le lait aigre défendent
avec succès le corps des enteropathogènes présents (Valsiljevic et Shah, 2008).
La principale description des probiotiques citée par Fuller (1992), les a
définies en tant que « complément alimentaire microbien vivant qui
affecte avantageusement l'animal hôte en améliorant son équilibre microbien
intestinal ». Par contre, cette définition a été beaucoup plus applicable sur les animaux
que les êtes humains. Une autre définition est généralement utilisée « les probiotiques
sont des cultures uniques ou mixtes de microorganismes vivants qui pourraient avoir
une incidence bénéfique sur l'hôte en améliorant les caractéristiques de la microflore
indigène » (Holzapfel et al., 1998).
L’Organisation mondiale de la Santé (OMS) et l'Organisation des Nations
Unies pour l'Alimentation et l'Agriculture (FAO) ont donné une définition officielle
des probiotiques qui sont des « micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés
en quantité suffisante, exercent des effets positifs sur la santé, au-delà des effets
nutritionnels traditionnels » (ONNUA/OMS, 2002).
Certaines bactéries ont démontré des propriétés probiotiques, comprenant
principalement des bactéries lactiques productrices d’acide lactique
(Lactobacilli, Streptococci, Enterococci, Lactococci, Bifidobacteria), Bacillus, la
levure Saccharomyces, et Aspergillus comme champignon (Shah, 2004). Ces groupes
probiotiques trouvent une large application de nos jours à cause des produits
synthétisés grâce à leur intervention ainsi que les propriétés antimicrobiennes et
antioxydantes dont elles disposent (Shah, 2004).
1
Les cultures probiotiques sont exploitées commercialement comme un outil de
développement de nouveaux produits fonctionnels. Il a été estimé la présence de 70
probiotiques dans les produits consommables dans le marché mondial (Shah, 2004).
La consommation de probiotiques au sein des produits laitiers dans
l’Amérique du nord, l’Europe et le Japon a augmenté de 12% depuis 2005. Les
produits probiotiques sont devenus populaire au Japon, plus de 53 types de produits
contenant des probiotiques ont inondé le marché international (Vasiljevic et Shah,
2008).
Les bactéries lactiques produisent un nombre important de substances
antimicrobiennes y compris les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène,
bactériocines et bactériocines-like. Les bactériocines sont des substances peptidique
ou protéique, ayant une activité inhibitrice contre les souches bactériennes sensibles.
Ces biomolécules confèrent un système de défense important à l’encontre d’autres
microorganismes. Les bactériocines diffèrent des antibiotiques habituels car ils sont
synthétisés ribosomiquement alors que les antibiotiques sont généralement des
métabolites secondaires. Aussi, les antibiotiques inhibent les microorganismes par
différents mécanismes comme l’inhibition de la synthèse du peptidoglycane,
l’inhibition de la synthèse protéique ou en bloquant les promoteurs, etc., mais les
bactériocines agissent généralement sur la membrane cellulaire en créant des pores et
provoquant par la suite la fuite des ions K+, Na+ et les autres constituants cellulaires
(Shah, 2004).
Ce travail de recherche a été réalisé dans le but de mieux cerner l’aptitude des
souches lactiques à produire les bactériocines et de booster cette capacité pour
l’utiliser à des fins socio-économiques
Cette étude comprend essentiellement plusieurs volets :
Un premier volet microbiologique qui concerne la sélection de la
meilleure souche bactériocinogène parmi les souches isolées à partir du lait crû de
chamelle sud Algérien, et sa caractérisation biochimique ;
L’identification moléculaire par la technique du séquençage de l’ARN
16S
Le troisième volet englobe l’étude des effets probiotiques de la souche
sélectionnée Lactobacillus plantarum DU10.
Le quatrième volet comprend l’isolement, la purification et la
caractérisation biochimique et moléculaire des bactériocines produites
2
par la souche étudiée, afin de déterminer le poids moléculaire exacte
de ses deux biomolécules.
Et en dernier lieu, l’optimisation des conditions de biosynthèse des
bactériocines isolées de Lactobacillus plantarum DU10 en fonction de
plusieurs paramètres (température, pH, NaCl et le surfactant Tween
80).
Ce travail de thèse nous a permis de participer à plusieurs congrès
internationaux:
- 7th Asian Conference on Lactic Acid Bacteria (7ACLAB) 6-8
September, 2013. India Habitat Centre, New Delhi, India.
- Conference of Sustainability of Camel Population and Production
(CSCPP) 17-20 February, 2013. Al-Ahsa, Saudi Arabia.
- International Congress on Microbial Biotechnology for Development
(MICROBIOD2) 02-04 October, 2012. Marrakech, Morocco.
Ainsi que la publication de deux articles dans des revues internationales :
- Characterization and potential probiotic attributes of Lactobacillus
plantarum DU10 isolated from Algerian raw camel milk.
DOI: 10.3923/biotech.2014.282-288.
- Purification and molecular characterization of two-antimicrobial
peptides produced by Lactobacillus plantarum DU10. DOI: 10.3923/ijbc.2015.46.58
3
2. Analyse bibliographique
2. Analyse bibliographique 2. Analyse bibliographique
2.1. Caractéristiques du lait de chamelle Le lait de chamelle est le lait le plus bénéfique pour l’être humain et regorge de vertus
curatives inattendues qui pourraient bien surprendre.
2.1.1. Caractéristiques physiques, chimiques et organoleptiques
Le lait de chamelle est de couleur blanche, en raison notamment de la
structure et de la composition de sa matière grasse, relativement pauvre en β-carotène
(Sawaya et al., 1984). Il est légèrement sucré, avec un goût acide, parfois même salé
(Abdel-Rahim, 1987) et/ou amère (Ramet, 2003). Cette variabilité dans le goût est
liée au type de fourrage ingéré ainsi qu’à la disponibilité en eau (Yagil et Etzion,
1980; Wangoh et al., 1998).
Le pH du lait camelin se situe autour de 6,6 et l'acidité est de l'ordre de 15°
Dornic. Sa densité oscille entre 0,99 et 1,034 avec une viscosité moyenne de 2,2
centipoises et un point de congélation variant de -0,53 à -0,61°C (Hassan et al., 1987).
Les fluctuations qui existent dans les valeurs des constantes physico-
chimiques rapportées par différents auteurs sont liées aux teneurs variables des
différents composants de ce lait (Mehaia et al., 1995 ; Wangoh et al., 1998), elles
mêmes dépendantes des facteurs mentionnés plus haut : alimentation, rang et stade de
lactation.
Les teneurs en protéines et en matière grasse varient respectivement de 2,5 à
4% et de 1,1 à 4,6% (avec une fréquence élevée à des taux supérieurs à 3%), alors que
la teneur en lactose fluctue entre 2,5 et 5,6%. Les concentrations élevées observées
pour ce dernier nutriment expliqueraient la saveur parfois sucrée du lait de chamelle
rapportée par plusieurs auteurs (Gnan et Shereha, 1986 ; Bayoumi, 1990).
La teneur en eau du lait camelin, qui varie selon son apport dans
l’alimentation, atteint son maximum pendant la période de sécheresse. En effet, il a
été montré que la restriction en eau alimentaire des chamelles se traduit par une
dilution du lait : un régime riche en eau donne un lait ayant un taux de 86% alors que
dans un régime déficient, celui-ci s’élève à 91% (Yagil et Etzion, 1980 ; Faye et
Mulato, 1991).
Au niveau quantitatif, si la composition en macroéléments (Na, K, Ca, Mg…)
est relativement similaire à celle du lait bovin, le lait camelin se caractérise néanmoins
par des taux plus élevés en oligo-éléments (Yagil et Etzion, 1980 ; Sawaya et al.,
4
2. Analyse bibliographique 1984 ; Elamin et Wilcox, 1992; Bengoumi et al., 1994 ; Mehaia et al., 1995 ; Gorban
et Izzeldin, 1997).
Le lait de chamelle se singularise par sa richesse relative en vitamines B3
(niacine) et en vitamine C. Même si des variations importantes (de 25 à 60 mg/l) de la
teneur de cette dernière dans les laits camelin sont rapportés (Farah, 1993), il n’en
demeure pas moins que des teneurs autour de 36 mg/l sont signalées (Farah et al.,
1992) ; soit en moyenne 3 fois plus élevées que celles présentes dans le lait bovin, qui
ne dépassent pas 22 mg/l (Mathieu, 1998). Cette caractéristique est particulièrement
intéressante, car elle permet au lait de cette espèce, par son apport important en cette
vitamine, de répondre aux besoins nutritionnels, aussi bien du jeune chamelon que des
populations locales, qui vivent dans un environnement où l’apport en ce type de
vitamine est particulièrement limité (Siboukeur, 2007).
Farah (1993) signale que le lait camelin contient des teneurs plus faibles en
vitamines A et E et en certaines vitamines du groupe B (vitamine B2, B5 et B9).
2.1.2. Une source de bactéries lactiques
Le lait referme inévitablement une microflore dont la nature et l’importance
sont conditionnées par l’état sanitaire de l’animal, les conditions de traite, la
température, la durée de conservation etc...
Sous des conditions rigoureuses de collecte, sa charge ne dépasse cependant
pas 5.103 germes /ml (Larpent et al., 1997). Si la microflore du lait bovin a fait l'objet
de nombreuses études, cela est loin d'être le cas du lait camelin où quelques travaux
seulement lui sont consacrés. L'une des raisons principales de cette carence est la
relative absence des moyens matériels et humains (laboratoires, chercheurs…) tout
près des lieux de collecte ce qui éviterait à recourir à la congélation ou à l'utilisation
d'agents antimicrobiens, comme c'est généralement le cas des études physico-
chimiques.
L’étude réalisée par Barbour et al (1984) met en évidence l’inhibition des
bactéries pathogènes par le lait camelin. Al-Mohizea et al (1994), en s’appuyant sur la
numération de quatre groupes de micro-organismes (la flore aérobie totale, les
psychrotrophes, les coliformes et bactéries sporulantes) déduisent que la qualité
hygiénique du lait camelin est satisfaisante. Yagil et al (1994) soutiennent que la
pasteurisation du lait de chamelle n’est pas indispensable si tous les dromadaires du
5
2. Analyse bibliographique troupeau sont en bonne santé. L’activité antimicrobienne du lait de chamelle, due à la
présence des protéines protectrices citées précédemment (Lysozyme, lactopéroxydase,
lactoferrine…), serait responsable de cet état (Barbour et al., 1984). Dans ce contexte,
d’autres auteurs ont montré l’effet inhibiteur du lysozyme extrait et purifié à partir du
lait camelin, sur Escherichia coli et Micrococcus lysodeikticus en le comparant à celui
de l’ovalbumine (Durhaiman, 1988).
Dans le même ordre d’idée, l’efficacité de l’activité des protéines
protectrices du lait de chamelle contre Lactococcus lactis subsp. cremoris,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium et rotavirus, a été
également signalée (El-Sayed et al., 1992).
Par ailleurs, on reconnaît depuis longtemps aux bactéries lactiques, la
propriété de produire des substances antagonistes tels que les acides organiques (acide
lactique et acide citrique), le peroxyde d'hydrogène et des protéines antimicrobiennes
(Klaenhammer et al., 1994).
Il est important de signaler que les acides aminés libres et les autres composés
azotés non protéiques (NPN) dont le taux est plus élevé que dans le lait bovin, sont
facilement dégradés par les microorganismes, particulièrement la flore bifidogène
connue pour ses exigences en matière de facteurs de croissance. En effet, des travaux
portant sur quatre espèces (Bifidobacteriu breve ; B. bifidum ; B. longum et B.
angulatum), rapportent que le lait camelin est un excellent milieu de culture, naturel,
pour les bifidobactéries. En outre, le stockage de ce lait à 4°C n'affecte pas leur
viabilité et leur activité protéolytique est plus forte que dans le lait bovin. A cet effet,
ces mêmes auteurs préconisent, l'utilisation de la poudre de lait camelin comme
milieu de préculture de cette flore à haut potentiel nutritionnel et thérapeutique (Abu-
Tarboush et al., 1997).
L’activité antimicrobienne du lait camelin due à la synergie des effets
précédemment cités, confère au lait camelin une bonne aptitude à la conservation,
mais se répercute négativement sur ses aptitudes à la transformation en produits
dérivés (Farah et al., 1990 ; Ramet, 1994 ; Kamoun, 1995 ; Abou-Tarbousch et al.,
1998).
6
2. Analyse bibliographique 2.2. Bactéries lactiques
Les bactéries lactiques acidifiantes sont un groupe de bactéries à Gram-positif
qui sont dépourvues de cytochromes et préfèrent les conditions anaérobiques,
fastidieuses, productrices d’acide lactique et tolèrent l’acidité, strictement
fermentatives. Elles sont non mobiles et ne produisent pas de spores. Ce groupe
comporte les formes rondes (Lactobacilli et Carnobacteria) et les cocci
(Streptococci). Différentes espèces de bactéries lactiques acidifiantes (comme les
genres Steptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Enterococcus,
Vagococcus, Lactobacillus, Carnobacterium) se sont adapté afin de croitre dans
différentes conditions environnementales. On les rencontre dans le tractus gastro-
intestinal de différents animaux, produits laitiers, le sol et sur la surface de certaines
plantes (Ring et Gatesoupe, 1998). Bien que les bactéries lactiques acidifiantes ne
soient pas dominantes comparant à la flore intestinal normal, plusieurs essais ont été
entrepris pour induire leur dominance artificielle (Verschuere et al., 2000). Basé sur
leur métabolisme carbohydraté, les bactéries lactiques acidifiantes sont divisées en
deux groupes distincts. Le groupe homofermentaire qui utilise le chemin de Embden-
Meyerhof-Parnas (Glycolytique) pour transformer la source de carbone
principalement en acide lactique. Le groupe hétérofermentaire quant à lui produit des
quantités équimolaires de lactate, CO2, l'éthanol ou l'acétate à partir du glucose
exploitant la voie phosphocétolase. Le groupe homofermentaire comprend
Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus. L’hétérofermentaire
regroupe quant à lui Leuconostoc, Weisella (Vasiljevik et Shah, 2008).
2.2.1. Classification des bactéries lactiques
D’une façon générale, on désigne deux phyla chez les bactéries à Gram
positif, phyla G+C élevé et la subdivision G+C bas, qui reflet le pourcentage
moléculaire G+C de l’ADN. Le point séparant les deux groupes est souvent situé à
50%, mais c’est plutôt l’intervalle aux alentours de 53-55%, depuis que quelques
espèces (ex, Lb. fermentum et Lb. pontis) deviennent clairement appartenir à la
subdivision G+C-bas. Le G+C-élevé où la subdivision Actinomycètes contient les
genres Bifidobacterium, Arthrobacter, Micrococcus, Propionibacterium,
Microbacterium, Corynebacterium, Actinomyces, et Streptomyces. Le G+C-bas où la
subdivision Clostridium inclue toutes les bactéries lactiques, avec les aérobies et
7
2. Analyse bibliographique les anaérobies facultatifs comme Bacillus, Staphylococcus et Listeria et les
anaérobies comme Clostridium, Peptococcus, et Ruminococcus (Klein et al., 1998 ;
Axelsson, 2004 ; Garrido-Fernández et al., 2010). Les bactéries lactiques ont été
considérées comme un « super groupe », qui phylogénétiquement lie entre les
genres strictement anaérobiques (ex, Clostridium) et les genres strictement
aérobies ou aérobies facultatifs (ex, staphylocoques et bacilles). Mais ce n’est
pas entièrement vrai. Les genres Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus,
Lactococcus, Leuconostoc sensu stricto, Tetragenococcus, Vagococcus, et
Weissella, forment une unité phylogénétique cohérente. En plus, certains
groupements sont évidents. Ainsi, Carnobacterium, Enterococcus, et Vagococcus
forment un groupe serré et sont reliées entre eux plus que par rapport aux autres
bactéries lactiques. Les genres Aerococcus et Tetragenococcus peuvent être
inclus dans ce groupe serré comme des membres périphériques (Axelsson, 2004).
De plus, ce groupe de genres apparait phylogénétiquement comme des
aérobies et anaérobies facultatifs de la subdivision G+C bas que des autres
bactéries lactiques. Les genres Lactococcus et Staphylococcus sont aussi plus
reliés entre eux que par apport aux autres, quoique cette tendance ne soit pas
forte avec le groupe Enterococcus. Les bactéries lactiques « Leuconostoc-like »,
i.e., Weissella et Leuconostoc sensu stricto, sont clairement reliées, et Oenococcus
aussi appartient à cette branche, quoique la distance évolutionnaire de ce genre soit
large. Depuis que le groupe Oenococcus apparait comme une bactérie lactique
«Leuconostoc-like » à la fois phylogénétiquement et physiologiquement, aucun
n’a pu imaginer qu’une adaptation à un seul habitat (vin), requiert des
changements extensifs du génome, résultant à une divergence rapide des espèces
reliées (Axelsson, 2004).
2.2.2. Voies métaboliques
Les bactéries lactiques étant incapables d'obtenir leur énergie par la
respiration, elles recourent à la fermentation des glucides en acide lactique.
Pour être métabolisés, les sucres du milieu extérieur doivent d'abord franchir
la membrane cellulaire. Il existe deux systèmes de transport actif des sucres:
un système qui couple le transport et la phosphorylation du glucide
(phosphorylation en cascade) nommé le « système phosphotransferase
8
2. Analyse bibliographique phosphoénolpyruvate dépendant » PTS. L'entrée d'un sucre est couplée à celle d'un
proton. Le sucre est ensuite phosphorylé dans la cellule par des kinases (Drider,2009) ;
un système qui fait pénétrer les glucides sous forme libre dit système
« perméase énergie dépendant ». C'est un système de translocation de groupe qui
phosphoryle le substrat tout en lui faisant traverser la membrane (Drider,2009).
Suivant les espèces, les sucres sont ensuite catabolisés suivant une des trois
voies différentes : la voie homofermentaire, la voie hétérofermentaire et la voie bifide.
La voie homofermentaire
Elle utilise la glycolyse dans sa totalité, du glucose au pyruvate puis
lactate. En condition optimale de croissance, cette voie produit deux molécules de
lactate et deux molécules d'ATP par molécule de glucose consommée. Pour être
qualifiée d'homolactique, cette voie doit convertir au moins 90 % du glucose
consommé en lactate. Mais dans des conditions de croissance non optimales (milieu
appauvri, sur certains sucres, avec des souches mutées…), les bactéries lactiques
homofermentaires peuvent présenter un métabolisme mixte, caractérisé par la
production d'acide lactique, d'acide acétique, d'éthanol et d'acide formique et/ou de
CO2 .La voie homofermentaire est généralement associée aux bactéries des genres
Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus, Lactobacillus (Drider,2009)
La voie hétérofermentaire
Elle produit outre l'acide lactique, des quantités significatives de CO2 et
d'éthanol ou d'acétate. La dégradation d'une molécule de glucose conduit à la
formation d'une molécule de lactate, une molécule d'éthanol (CH3CH2OH), d'un CO2
et d'un ATP. Une enzyme spécifique de cette voie (la D-xylulose-5-phosphate
phosphocétolase) catalyse la dissociation du xylulose-5-phosphate en acétyl-P et
glycéraldéhyde-3-phosphate. L'acétyl-P est converti ensuite soit en éthanol soit en
acétate selon les besoins en ATP ou NAD+. Le glycéraldéhyde-3-phosphate rejoint la
glycolyse pour être converti en lactate. En général, les sucres à 5 atomes de carbones
(ou pentoses) ne peuvent être métabolisés que par cette voie. Certaines bactéries
Leuconostoc et Lactobacillus empruntent cette voie hétérofermentaire (Drider,2009)
9
2. Analyse bibliographique
La voie fermentaire bifide :
Encore appelée la voie de la fructose-6-P phosphocétolase FPC). Elle est
empruntée par les bactéries du genre Bifidobacterium. Pour une molécule d'hexose
consommée, cette voie produit 1,5 molécule d'acétate et 2,5 molécules d'ATP
Les hexoses autres que le glucose (mannose, galactose, fructose) rejoignent en
général les voies précédentes après différentes étapes d'isomérisations et de
phosphorylation en glucose-6-P et fructose-6-P. Le lactose entre dans la cellule par le
système PTS, puis est phosphorylé en lactose-6-phosphate et hydrolysé à l'intérieur de
la cellule en glucose et galactose-6-phosphate. Il rejoint finalement la glycolyse au
niveau des trioses-phosphate. Les pentoses consommés (ribose, arabinose, xylose)
sont convertis en xylulose-5-phosphate par des réactions de phosphorylation et
d'isomérisation ou d'épimérisation (Drider,2009)
2.3. Composés antimicrobiens 2.3.1. Acides organiques
Après la fermentation des hexoses, l'acide lactique est produit par
homofermentation. Dans le cas d’une hétérofermentation; des quantités
équimolaire d'acide lactique, acide acétique / éthanol et de CO2 seront produites
(Ouwehand et Vesterlund, 2004).
Il a été depuis longtemps remarqué que les acides faibles ont un
pouvoir antimicrobien plus élevé à pH faible qu'à pH neutre (Bearson et al., 1997).
L'acide acétique est le plus fort inhibiteur et dispose d'un large éventail d'activité
inhibitrice, inhibition des levures, des moisissures et des bactéries, tandis que
l'acide propionique exerce un fort effet antimicrobien, en particulier contre les
levures et les moisissures. Cette forte activité antimicrobienne des acides acétique et
propionique peut être expliquée en partie par leur pKa plus grand par rapport
à celui de l'acide lactique (4,87, 4,75, et 3,08, respectivement). Par exemple, à
pH 4, seulement 11% d'acide lactique est non dissocié, alors que 85% d'acide
acétique et 92% d'acide propionique sont non dissociés (Bearson et al., 1997).
Lorsqu’un mélange d'acides est présent, il est probable que l'acide lactique
contribue principalement à la réduction du pH, tandis que l'acide propionique
et acétique, qui deviennent non dissociés, sont les agents antimicrobiens réels. En
effet, il a été observés les mélanges d'acide lactique et acétique ont la capacité
10
2. Analyse bibliographique de réduire le taux de croissance de Salmonella enterica ser. var. Typhimurium
plus que l'acide seul, suggérant une activité synergique. Cependant, en plus de la
réduction du pH, il à été observé que l'acide lactique également perméabilise les
membranes, ainsi, renforce l'activité d'autres substances antimicrobiennes (Bearson
et al., 1997). On suppose souvent que la molécule non dissociée est la forme
toxique d'un acide faible, bien que les acides dissociés possèdent également un
pouvoir d’inhibition de la croissance microbienne. La forme non dissocié (neutre)
de l'acide organique diffuse à travers la membrane cellulaire, car ils sont
liposolubles (Bearson et al., 1997). Toutefois, Après avoir pénétré dans la
cellule, l'acide se dissocie car le pH cytoplasmique est généralement autour de
neutre. Beaucoup de chercheurs ont suggéré que la libération de protons dans le
cytoplasme conduit à l'acidification et la dissipation du gradient de pH sur la
membrane ce qui est à l'origine de l’inhibition de la croissance (Salmond et al.,
1984 ; Blom et Mortvedt, 1991). Toutefois, d'autres chercheurs suggèrent que cette
hypothèse devrait être revue. Il a été suggéré que ce n’est pas la translocation
des protons, mais l'accumulation des anions est la principale cause de
l'inhibition de la croissance observée (Eklund, 1980). Il est proposé que l'anion
réduise le taux de synthèse des macromolécules et affecte le transport sur la
membrane cellulaire. En particulier, les bactéries lactiques, ainsi que d'autres
bactéries, contrer les effets de l’accumulation d'anions en réduisant leur pH
cytoplasmique (Ouwehand et Vesterlund, 2004).
Dans la plupart des applications pratiques, les acides organiques seront
présents dans un milieu contenant des matières organiques. Gélinas et Goulet (1983)
ont observé que la matière organique réduit l’activité bactéricide d'un acide oléique
sulfatés. Cherrington et al (1991) ont trouvé que l’extrait de levure réduit l'activité de
l'acide lactique et d'acide acétique (Ouwehand et Vesterlund, 2004).
2.3.2. Peroxyde d’hydrogène
En présence d'oxygène, les bactéries lactiques sont capables de générer
du peroxyde d'hydrogène (H2O2) à travers l'action de flavoprotéines contenant
les oxydases, NADH oxydases, et la superoxyde dismutase (Ouwehand et
Vesterlund, 2004).
11
2. Analyse bibliographique
En absence d'une source de l'hème, les bactéries lactiques ne
synthétiseront pas la catalase pour l'élimination du peroxyde d'hydrogène
(Ouwehand et Vesterlund, 2004).
D'autres systèmes qui éliminent le peroxyde l'hydrogène sont moins
actifs que ceux qui le produisent. Cela permet l'accumulation de peroxyde
d'hydrogène. Toutefois, Fontaine et ses collaborateurs en 1996, affirment que le
peroxyde d'hydrogène ne s'accumule pas à des quantités importantes in vivo,
car il est décomposé par les peroxydases, flavoprotéines et pseudocatalase.
L'effet bactéricide du peroxyde d'hydrogène a été attribué à ses effets oxydants
sur les cellules bactériennes; les groupes hydrosulfuriques des protéines cellulaires
et les lipides de la membrane peuvent être oxydés. En outre, certaine quantité
d’hydrogène peroxyde d'oxygène, crée une récupération des réactions, créant
ainsi un environnement anaérobie qui est défavorable pour certains organismes. Il a
été suggéré que la production du peroxyde d'hydrogène est particulièrement
importante pour la colonisation du tractus urogénital par les lactobacilles. Cette
colonisation par les lactobacilles permet la diminution de l'acquisition du virus de
l'immunodéficience humaine (VIH), la gonorrhée et les infections urinaires
(Ouwehand et Vesterlund, 2004).
Le principal effet antimicrobien du peroxyde d’hydrogène est la contribution
au blocage de la glycolyse. Il est proposé qu'il inhibe le transport du glucose,
l'activité hexokinase, et l'activité du glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase en
raison de l'oxydation des groupes hydrosulfuriques dans ces enzymes
métaboliques. L'enzyme-ci, glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, semble
être la cible principale. L'activité vers les bactéries à Gram positif, y compris les
bactéries d'acide lactique, est généralement bactériostatique, alors que de
nombreuses bactéries gram-négatives sont rapidement tuées (Ouwehand et
Vesterlund, 2004).
2.3.3. Composés phénoliques
Un seul document a rapporté la participation d’un composé phénolique dans
l’activité antifongique des bactéries lactiques (Mandal et al., 2007). Ce composé
phénolique, qui reste à être identifié, est produit par Pc. acidilactici LAB 5 et a
montré des degrés divers de l’activité antifongique contre un certain nombre de
12
2. Analyse bibliographique contaminants d’aliments et contre des champignons phytopathogènes (Mandal et al.,
2007).
2.3.4. Acides gras
Certaines bactéries lactiques sont capables de produite des acides gras
antimicrobiens qui améliorent la qualité sensorielle des produits fermentés (Earnshaw,
1992). L’acide caproique isolé de Lb. sanfrancisco CB1 a été la principale substance
antifongique puissante produite par cette souche (Corsetti et al., 1998). Ce composé
pourrait agir en synergie avec d’autres acides tels que l’acide propionique, butyrique
et valérique. Récemment, Sjögren et al (2003) ont décrit des acides gras hydroxylés
(C3) présentant de larges activités antifongiques. Les acides gras hydroxylés
présentent un spectre d’inhibition très large et sont efficaces contre les moisissures,
les levures et les bactéries (Gould, 1991 ; Dalié et al., 2010). La concentration
minimale inhibitrice (CMI) des acides gras hydroxylés est comprise entre 10 et 100
µg/ml (Sjögren et al., 2003). La cinétique de leur production suit la croissance des
souches productrices, ce qui suggère que ces composés ne résultent pas de la lyse
cellulaire (Sjögren et al., 2003). Toutefois, leur mécanisme d’action reste à élucider.
2.3.5. Dioxyde de carbone
Le dioxyde de carbone (CO2) est principalement formé pendant la
fermentation d'acide lactique hétérofermentaires des hexoses, mais aussi de
nombreuses autres voies métaboliques produisent du dioxyde de carbone au cours de
la fermentation. Le dioxyde de carbone a un double effet antimicrobien (Ouwehand
et Vesterlund, 2004). Sa formation crée un milieu anaérobie et le dioxyde de
carbone, lui même, a une activité antimicrobienne. Le mécanisme de cette activité est
inconnu, mais il a été suggéré que les décarboxylations enzymatiques sont inhibées
et que l'accumulation de dioxyde de carbone dans la bicouche lipidique
provoque un dysfonctionnement de la perméabilité membranaire. Lors de faible
concentration du dioxyde de carbone, la croissance de certains organismes peut être
stimulée, tandis que des concentrations plus élevées peuvent empêcher la croissance.
En raison de son activité antimicrobienne, le dioxyde de carbone est maintenant
couramment utilisé comme principal composant des emballages sous atmosphère
modifiée. Les bactéries Gram-négatives sont plus sensibles au dioxyde de
carbone que les bactéries gram-positives (Ouwehand et Vesterlund, 2004).
13
2. Analyse bibliographique
2.3.6. Diacétyle (2,3-butanedione)
Le diacétyle (2,3-butanediole) a été identifié par van Niel et ses
collaborateurs (1929) comme l'arôme et le composant de goût du beurre. En
1927, Lemoigne a décrit son activité antimicrobienne contre Bacillus sp. Il est
produit par les espèces et les souches de genres Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus, Streptococcus et, ainsi que d'autres organismes.
Lorsque les hexoses sont métabolisés, la formation de diacétyle sera
réprimée. Toutefois, le diacétyle peut être surproduit si le citrate est métabolisé.
Le citrate est converti par l'intermédiaire du pyruvate en diacétyle. Jay (1982) a
observé que le diacétyle est de plus en plus efficace à pH, 7. Il a également été
observé que l'activité antimicrobienne a été contrariée par la présence de
glucose, l'acétate, et le Tween 80. Il a été trouvé que le diacétyle est plus
actifs contre les bactéries à gram-négatif, les levures et les moisissures que contre les
bactéries gram-positives; les bactéries lactiques ont été moins sensibles
(Ouwehand et Vesterlund, 2004).
2. 3.7. Antibiotiques
La reutérine et la reutéricycline sont les antibiotiques les plus connus chez les
bactéries lactiques. Il s’agit de molécules antimicrobiennes de petite taille produites
par certaines souches de Lactobacillus reuteri (Talarico et Dobrogosz, 1989 ;
Axelsson et al., 1989 ; Holtzel et al., 200). La reutérine est une mixture de différentes
formes de β-hydroxypropionaldehyde alors que la reutéricycline est un nouvel
antibiotique dérivé de l’acide tétramique (Nes et Jonhsborg, 2004). La reurérine agit
sur les enzymes sulfhydryles, notamment la ribonucléotide réductase, ce qui interfère
avec la synthèse de l’ADN (Dobrogosz et al., 1989 ; Rash et al., 2007). La
reutéricycline est une molécule hautement hydrophobe qui agit en déstabilisant la
membrane cytoplasmique des cellules cibles (Gänzle et Vogel, 2003).
Ces substances ont une activité antimicrobienne contre de nombreux
organismes d’altération des aliments y compris les bactéries à Gram positif et à Gram
négatif, les levures, les champignons et les protozoaires (Alexsson et al., 1989 ;
Dobrogosz et al., 1989; Rasch et al., 2007 ; Tiwari et al., 2009). Les bactéries
lactiques sont également sensibles à la reutérine et la reutéricycline mais plus
14
2. Analyse bibliographique résistantes par rapport aux autres microorganismes (Dobrogosz et al., 1989 ; Chung et
al., 1989). La reutérine est adaptée à la bioconservation des aliments et son utilisation
a été bien démontrée dans des produits carnés et laitiers (El-Ziney et Debevere, 1998 ;
Arques et al., 2004 ; Tobajas et al., 2007).
2.3.8. Bactériocines
Différentes définitions des bactériocines ont été données au cours du temps.
Cependant, la définition qui reste la plus largement acceptée est celle de
Klaenhammer (1988) « ce sont des protéines, ou complexes de protéines, avec une
activité bactéricide contre des espèces proches de la souche productrice ».
Les bactériocines représentent une large classe de substances antagonistes qui
varient considérablement du point de vue de leur poids moléculaire, de leurs
propriétés biochimiques, de leur spectre d'action et de leur mode d'action
(Klaenhammer, 1988). Toutes les bactériocines produites par des bactéries lactiques
décrites jusqu'à présent ont une activité dirigée contre les bactéries Gram+. Aucune
bactériocine produite par des bactéries lactiques avec une activité contre des bactéries
Gram- n'a été décrite, la membrane externe des bactéries Gram- ne permettant pas aux
bactériocines d'atteindre la membrane interne, siège de leur activité (Klaenhammer,
1993).
2.3.8.1. Classification
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont réparties en quatre
classes, comme proposé par Klaenhammer (1993). Ces quatre classes sont :
Classe I
Les lantibiotiques : peptides de taille inférieure à 5 kDa, stables à la chaleur et
qui contiennent des acides aminés inhabituels soufrés formés post-
traductionnellement, c'est-à-dire la lanthionine, la β-méthyl lanthionine, la
déhydrobutyrine et la déhydroalanine. Ils peuvent être divisés en deux types: la
classe Ia qui comprend des peptides cationiques hydrophobes allongés contenant
jusqu'à 34 acides aminés et la classe Ib qui comprend les peptides globulaires chargés
négativement ou sans charge nette et contenant jusqu'à 19 acides aminés (McAuliffe
et al., 2001 ; Twomey et al., 2002). Certains lantibiotiques sont par ailleurs constitués
de deux peptides agissant ensemble pour avoir une activité comme la lacticine 3147.
15
2. Analyse bibliographique
Classe II
Peptides de taille inférieure à 10 kDa, stables à la chaleur, ne contenant pas
d'acides aminés modifiés. Leur point isolélectrique varie entre 8 et 10. Cette classe est
divisée en trois sous-classes.
Les bactériocines de la sous-classe IIa contiennent entre 27 et 48 acides
aminés et ont toutes une partie N-terminale hydrophobe contenant la séquence
consensus YGNGV ainsi qu'un pont disulfure et une partie C-terminale moins
conservée, hydrophobe ou amphiphile qui détermine la spécificité d'action (Fimland
et al., 2000 ; Richard et al., 2006). Elles ont toutes une activité
contre Listeria monocytogenes. Certaines bactériocines de cette sous-classe
contiennent également un deuxième pont disulfure dans leur domaine C-terminale qui
semble être important dans la stabilisation de la structure tertiaire. Il semble par
ailleurs qu'il leur conférerait une meilleure activité antimicrobienne, une meilleure
résistance à l'exposition à des hautes températures et un spectre d'action plus large
(Eijsink et al., 1998 ; Fimland et al., 2000 ; Drider et al., 2006 ; Richard et al., 2006).
La sous-classe IIb comprend les bactériocines ayant besoin de deux peptides
pour avoir une activité. Deux types de bactériocines de classe IIb peuvent être
distingués : le type E (Enhancing) où la fonction d'un des deux peptides est
d'augmenter l'activité de l'autre et le type S (Synergy) où les deux peptides sont
complémentaires.
La sous-classe IIc contient les bactériocines ne pouvant pas être classées dans
les autres sous-classes.
Classe III
Ce sont des protéines de taille supérieure à 30 kDa et sensibles à la chaleur. La
structure et le mode d'action de ces bactériocines diffèrent complètement des autres
bactériocines produites par les bactéries lactiques. Cette classe ne contient que quatre
bactériocines : l'helvéticine J produite par Lactobacillus helveticus A, l'enterolysine A
produite par Enterococcus faecium, la zoocine A produite par Spreptococcus
zooepidemicus et la millericin B produite par Streptococcus milleri (Nilsen et al.,
2003 ; Papagianni, 2003 ; Nigutova et al., 2007).
16
2. Analyse bibliographique
Classe IV
Peptides requérant une partie carbohydratée ou lipidique pour avoir une
activité. Aucune bactériocine de cette classe n'a été décrite.
2.3.8.2. Génétique des batériocines
Différentes protéines sont impliquées dans la production des bactériocines et
sa régulation. Les bactériocines sont produites sous forme d'un pré-peptide non-
biologiquement actif qui subira des modifications post-traductionnelles pour aboutir
au peptide actif. Cette production est souvent régulée par un système de Quorum
Sensing, un mécanisme permettant à certains gènes d'être exprimés en fonction de la
densité de la population bactérienne.
Les lantibiotiques
Les gènes de biosynthèse des lantibiotiques ont été désignés par le symbole
commun Lan, avec un nom plus spécifique pour chaque lantibiotique (nis pour la
nisine, par exemple). Le gène de structure, LanA, code pour un prépeptide contenant
une séquence N-Terminale de 23 à 30 acides aminés qui sera clivée lors du transport à
l'extérieur de la cellule. Ce prépeptide subira différentes modifications post-
traductionnelles afin d'acquérir les quatre acides aminés inhabituels (Xie et al., 2004).
La première étape de ces modifications consiste en la déshydratation de la
sérine et de la thréonine pour former la déhydroalanine et la déhydrobutyrine. La
deuxième étape consiste en la formation d'un lien thioéther entre ces résidus
déshydratés et les cystéines environnantes, donnant aux lantibiotiques une structure
cyclique. Les enzymes impliquées sont une déshydratase et une cyclase codée soit
par les gènes LanB et LanC ou le gène LanM. Après ces modifications, le prépeptide
sera clivé lors de l'excrétion hors de la cellule par la protéase LanP ou le domaine
protéasique de l'ABC transporteur LanT. Cette dernière modification permettra
d'obtenir le peptide biologiquement actif (McAuliffe et al., 2001 ; Kleerebezem,
2004 ; Xie et al., 2004 ; Patton et al., 2005).
La production des lantibiotiques est sous le contrôle d'un mécanisme de
régulation à deux composantes basé sur le Quorum Sensing. Une histidine kinase
LanK réagira à un stimulus extérieur et induira la phosphorylation d'un régulateur de
réponse LanR. Ce régulateur de réponse phosphorylé va permettre l'activation de
17
2. Analyse bibliographique l'expression de l'opéron. Le stimulus extérieur est la bactériocine elle-même qui est
présente dans la culture à basse concentration en début de croissance. Elle s'accumule
et quand un certain seuil est atteint, elle interagit avec le système de régulation pour
activer la transcription du gène de structure mais également de ceux d'immunité et de
transport, on parlera donc d'autorégulation (McAuliffe et al., 2001 ; Twomey et al.,
2002 ; Kleerebezem, 2004 ; Patton et al., 2005). Les quatre gènes LanI, LanF, LanE et
LanG codent pour des protéines impliquées dans l'immunité de la souche vis-à-vis de
la bactériocine qu'elle produit. Bien que le mécanisme d'action ne soit pas
complètement compris, il semblerait que LanI est une lipoprotéine qui s'attache à la
surface externe de la membrane et interagit avec le lantibiotique afin de l'empêcher
d'y former des pores. LanF, LanE et LanG forment un ABC transporteur. Il
permettrait d'exporter à l'extérieur de la membrane cytoplasmique les lantibiotiques
qui n'auraient pas interagi avec la lipoprotéine LanI et qui s'y trouveraient,
l'empêchant ainsi de former des pores (McAuliffe et al., 2001 ; Twomey et al., 2002 ;
Stein et al., 2003 ; Lubelski et al., 2008).
Les bactériocines de classe II
Les bactériocines de classe IIa sont également produites sous la forme d'un
pré-peptide non biologiquement actif dont la séquence N-terminal très conservée,
appelée séquence signal et contenant une vingtaine d'acides aminés, sera clivée du
côté C-terminal d'un motif GG par le domaine protéasique de l'ABC transporteur lors
de l'excrétion pour donner le peptide biologiquement actif (Ennahar et al., 2000).
Avec la formation d'un ou deux ponts disulfures cruciaux pour l'activité, ce sera la
seule transformation post-traductionnelle (Drider et al., 2006). Certaines bactériocines
de classe IIa sont excrétées par le « sec-dependent pathways » revu par Keyser et al
(2003) et basé sur la translocation du peptide par un pore aqueux composé de
plusieurs protéines (van Wely et al., 2001 ; Ruch et al., 2007). Les peptides signaux
de ces bactériocines ne contiennent donc pas de doublet glycine mais bien la séquence
signal typique des protéines secrétées par ce système qui sera clivé par une peptidase
durant la translocation (van Wely et al., 2001 ; De Kwaadsteniet et al., 2006 ;
Sanchez et al., 2007).
La régulation de la production des bactériocines de classe IIa est sous le
contrôle d'un système de Quorum Sensing à trois composantes qui sont un peptide
18
2. Analyse bibliographique d'induction, une histidine kinase et un régulateur de réponse. Les gènes codant pour
ces trois protéines sont co-transcrits (Eijsink et al., 2002). Le peptide d'induction est
produit à basse concentration comme un prépeptide de bas poids moléculaire, sans ou
avec une très faible activité inhibitrice, stable à la chaleur, cationique et hydrophobe
et dont la partie N-Terminal est clivée au niveau d'un doublet glycine lors de
l'excrétion par l'ABC transporteur également impliqué dans l'excrétion de la
bactériocine (Ennahar et al., 2000 ; Eijsink et al., 2002). A une certaine concentration
externe du peptide d'induction, l'histidine kinase transmembranaire est activée, ce qui
induit la phosphorylation du régulateur de réponse et l'activation de l'expression des
gènes de structure, d'immunité et de transport mais également du système de
régulation à trois composantes. Le système est donc auto-induit (Eijsink et al., 2002 ;
Drider et al., 2006). Cependant, il a été récemment suggéré que le gène codant pour le
régulateur de réponse de la sakacin P (sppR), une bactériocine de classe IIa, pouvait
produire deux protéines : une protéine complète et cette même protéine dont
l'extrémité N-terminal est tronquée. Cette deuxième protéine tronquée peut alors
réprimer l'expression des gènes codant pour la sakacin P, probablement en interférant
avec l'action de la molécule complète (Straume et al., 2007).
Les gènes codant pour la production des bactériocines de classe IIa sont, la
plupart du temps, organisés en trois opérons, le premier contenant les gènes de
structure et d'immunité, le deuxième les gènes nécessaires à la sécrétion de la
bactériocine (l'ABC transporteur et une protéine accessoire) et le troisième les gènes
du système de régulation à trois composantes. Le gène d'immunité code pour une
protéine intracellulaire qui, en interagissant avec le complexe membranaire formé par
la bactériocine et la « mannose perméase » (voir ci-dessous), l'empêche de former des
pores dans la membrane de la cellule productrice (Diep et al., 2007).
Peu d'informations sont disponibles concernant la régulation de la production
des bactériocines de classe IIb. Néanmoins, il a été montré qu'un système de
régulation à trois composantes identique à celui retrouvé pour les bactériocines de
classe IIa est impliqué dans la production de l'ABP-118 par Lactobacillus salivarius
subsp. salivarius UCC118 et des plantaricin E/F et J/K par Lactobacillus plantarum
C11 (Flynn et al., 2002 ; Oppegard et al., 2007).
19
2. Analyse bibliographique 2.3.8.3. Biosynthèse des bactériocines
Les bactériocines sont généralement produites à la fin de la phase
exponentielle et au début de la phase stationnaire de croissance Elles peuvent ensuite
être dégradées par les protéases produites par la bactérie lactique productrice
(Savijoki et al., 2006) ou être adsorbées à sa surface, ce qui mène à la baisse de la
concentration de bactériocines dans la culture. Les facteurs influençant la production
de bactériocines sont principalement la souche productrice, la température, le pH, la
composition du milieu et la technologie de fermentation employée (Savijoki et al.,
2006).
Comme l'ont montré Moretro et al (2000) pour la production de sakacine P
par L. sakei, une même bactériocine peut être produite par des souches ou espèces
différentes dont la capacité de production peut être variable. Lors d'une optimisation
de production, si différentes souches sont disponibles, le choix de la souche pourra
être déterminant.
Les conditions de culture influencent fortement la production de bactériocines.
En effet, l'optimalisation de la croissance ne résulte pas nécessairement en
l'optimalisation de la production de bactériocines (Parente et al., 1999). Il a même été
suggéré que des conditions de croissance défavorables permettent de stimuler leur
production (Verluyten et al., 2004). Les températures et pH optimaux de production
sont souvent inférieurs à ceux optimaux pour la croissance. C'est par exemple le cas
pour la production de bactériocine par L. curvatus LTH1174 (Messens et al.,
2003), Leuconostoc mesenteroides L124 et L. curvatus L442 (Mataragas et al., 2003),
de sakacin P par L. sakei CCUG42687 (Moretro et al., 2000), d'amylovorin L471
par L. amylovorus DCE471 (De Vuyst et al., 1996) et de pediocin PA-1
par Pediococcus damnosus (Nel et al., 2001).
La composition du milieu, tout particulièrement les sources et concentrations
de carbone et azote, affectent fortement la production de bactériocines. Les bactéries
lactiques productrices requièrent de nombreux nutriments pour leur croissance et des
milieux riches contenant de l'extrait de viande, de levure et des hydrolysats de
protéines sont nécessaires. Il a déjà été montré que l'augmentation des concentrations
en extrait de levure, extrait de viande ou peptone peut permettre une augmentation de
la production de bactériocines (Aasen et al., 2000 ; Nel et al., 2001 ; Mataragas et al.,
2004 ; Todorov et al., 2004 ; Verluyten et al., 2004).
20
2. Analyse bibliographique
D'autre part, quelques études ont montré que la source de carbone utilisée et sa
concentration est un facteur important dans l'optimisation de la production de
bactériocines (Leal-Sanchez et al., 2002 ; Leroy et al., 2006 ; Chen et al., 2007 ;
Anastasiadou et al., 2008). L'ajout de ces nutriments lors d'une culture fed-batch
permet souvent d'augmenter la production comparativement à une culture en batch
(Callewaert et al., 2000 ; Lv et al., 2005 ; Pèrez Guerra et al., 2005).
L'utilisation de la technique des cellules immobilisées peut permettre
d'augmenter la durée et la stabilité de la production de bactériocines. Les cellules
peuvent être immobilisées dans des biofilms ou des billes d'alginates de calcium.
Cette technique a déjà été utilisée avec succès pour la lacticine 3147 et la nisine
(Scannell et al., 2000 ; Pongtharangkul et al., 2006).
2.4. Lactobacillus plantarum comme modèle 2.4.1. Classification
Une définition pareille est comparable à un arrangement où toutes les
bactéries lactiques cocci étaient inclues dans le même genre. Cependant, entre les
cocci, des spécificités phénotypiques étaient très tôt reconnues, ce que met une
différentiation à différents genres possibles. Même si la situation était plus difficile
pour les bactéries lactiques de forme bâtonnets. Orla-Jensen (1919) à un certain
moment, a divisé ce groupe dans une voie pareille des cocci. Ainsi, les sous genres
de Lactobacillus étaient créés: Thermobacterium, Streptobacterium, et
Betabacterium. Remarquablement, cette division est toujours valable à un degré
considérable, quoique la désignation a été laissée et quelques modifications
dans la définition du sous groupe ont été crées. La base physiologique de la
division est (généralement) la présence ou l’absence de l’enzyme clé du
métabolisme homo et hétérofermentaire des sucres, fructose-1,6-diphosphate
aldolase et phosphocétolase, respectivement (Axelsson, 2004 ; Hammes et Hertel,
2006 ; Singh et al., 2009 ; Ukeyima, 2010). Le genre Lactobacillus a été proposé
par Beijerinck en 1901.
C’est le genre le plus large des bactéries lactiques. Il est ainsi assez
hétérogène, contient des espèces avec une large variété phénotypique/biochimique,
et propriétés physiologiques. L’hétérogénéité est reflétée par le type de
pourcentage moléculaire G+C de l’ADN des espèces inclues dans ce genre. La série
21
2. Analyse bibliographique est de 32-55%, deux fois l’espace accepté usuellement pour un genre unique.
L’hétérogénéité et le large nombre d’espèces sont dus à la définition du genre, qui
est essentiellement : des bactéries lactiques de forme bâtonnets (Schleifer et Ludwig,
1995 ; Axelsson, 2004 ; Hammes et Hertel, 2006).
Les voies classiques pour distinguer les différentes espèces des lactobacilles
sont les voies de fermentation des carbohydrates, configuration de l’acide lactique
produit, l’hydrolyse de l’arginine, les exigences de croissance, et la croissance
à certaines températures. Ces caractéristiques sont toujours utilisées, mais une
classification correcte requière aussi d’analyse du peptidoglycane, la mobilité
électrophorétique de la LDH, le pourcentage moléculaire (GC%) de l’ADN, et
l’étude de l’homologie ADN-ADN. Les sondes oligonucléotidiques spécifiques
d’espèces (dérivant de la séquence d’ARNr) pour un grand nombre d’espèces
sont maintenant disponibles. Deux techniques différentes de PCR et de
séquençage des fragments de la PCR (ex, les gènes d’ARNr) offrent de nouvelles
possibilités pour l’identification rapide et la classification des lactobacilles et
les bactéries lactiques en général (Axelsson, 2004 ; Hammes et Hertel, 2006 ; Singh
et al., 2009).
Les voies classiques pour distinguer les différentes espèces des lactobacilles
sont les voies de fermentation des carbohydrates, configuration de l’acide lactique
produit, l’hydrolyse de l’arginine, les exigences de croissance, et la croissance
à certaines températures. Ces caractéristiques sont toujours utilisées, mais une
classification correcte requière aussi d’analyse du peptidoglycane, la mobilité
électrophorétique de la LDH, le pourcentage moléculaire (GC%) de l’ADN, et
l’étude de l’homologie ADN-ADN. Les sondes oligonucléotidiques spécifiques
d’espèces (dérivant de la séquence d’ARNr) pour un grand nombre d’espèces
sont maintenant disponibles. Deux techniques différentes de PCR et de
séquençage des fragments de la PCR (ex, les gènes d’ARNr) offrent de nouvelles
possibilités pour l’identification rapide et la classification des lactobacilles et
les bactéries lactiques en général (Axelsson, 2004 ; Hammes et Hertel, 2006 ; Singh
et al., 2009).
22
2. Analyse bibliographique 2.4.2. Diversité génétique
Les études basées sur les ARN 16S ont permis de mettre en évidence
l’existence de différents groupes phylogénétiques au sein des lactobacilles qui ne se
recoupent pas systématiquement avec la classification basée sur les profils
fermentaires. Les lactobacilles sont divisés en groupes phylogénétiques portant le
nom de l’espèce type, considérée comme la plus représentative du groupe
considéré : Lb. acidophilus, Lb. salivarius, Lb. reuteri, Lb. buchneri, Lb. plantarum.
Le genre Pediococcus ne peut pas être différentié du genre Lactobacillus par ce
type de classification, et est donc compris dans le groupe Lactobacillus (Collins et
al., 1991 ; Schleifer et Ludwig, 1995 ; Penaud, 2006 ; Singh et al., 2009 ; Giraffa et
al., 2010).
Le premier génome de lactobacille publié a été celui de Lb. plantarum en
2003 (Kleerebezem et al., 2003). Le génome de Lb. sakei, un autre lactobacille
hétérofermentaire facultatif, phylogénétiquement éloigné de Lb. plantarum, a été
séquencé (Chaillou et al., 2005). Deux génomes de lactobacille du groupe
acidophilus, Lb. acidophilus et Lb. johnsonii sont séquencés (Altermann et al.,
2005 ; Pridmore et al., 2004). Parmi les lactobacilles, la taille du génome varie entre
3,31 Mb pour Lb. plantarum à 1,86 Mb pour Lb. bulgaricus. Cependant, la majorité
des génomes séquencés ou en cours de séquençage ont une taille d’environ 2 Mb
(Singh et al., 2009).
2.4.3. Production de bactériocines
Les bactéries peuvent produire un large éventail de substances
antimicrobiennes. La plupart des études ont porté sur les antimicrobiens
produits par les bactéries lactiques et associés des bactéries telles que les
bactéries propioniques et les bifidobactéries. Galvez et al (2010) pense que
l’utilisation de cette propriété dans la préservation des aliments contre les agents
pathogènes représente une piste intéressante dans l’hygiène et la sécurité des
aliments.
Les bactériocines sont des composés de synthèse ribosomale produites par les
bactéries dans le but d’inhiber la croissance des autres bactéries. Ces composés sont
trouvés chez la plupart des espèces bactériennes étudiés jusqu’à aujourd’hui. Mais
peu d’entre eux sont largement étudiés. En général, elles ont un spectre d’action
23
2. Analyse bibliographique restreint, inhibant seulement les bactéries voisines de la souche productrice. Les
bactéries à gram + n’inhibent pas les bactéries à Gram négatif et vice versa
(Ouwehand et Vesterlund, 2004).
Habituellement, elles sont de faible poids moléculaire (mais des
bactériocines à haut poids moléculaire sont également produites). C’est leur nature
protéique et leur spectre d’inhibition étroit qui les distingue des antibiotiques (De
Vuyst et Leroy, 2007). Au cours des deux dernières décennies, la sécurité
alimentaire est devenue un problème majeur, et de grands efforts ont été fournis
pour identifier des bactériocines qui inhibent la croissance des germes pathogènes
et nuisibles.
Pour l’utilisation dans l’aliment la bactériocine doit être :
stable à la chaleur,
stable à l’acidité,
résistante aux protéases qui se trouvent dans l’aliment,
active pendant une période prolongée,
active au pH de l’alimentation (4,5 à 7,0),
possède un effet bactéricide que bactériostatique,
large éventail d’hôtes, en inhibant plusieurs agents pathogènes et
nuisibles (Fox et al., 2000).
2.4.4. Rôle dans l’industrie agroalimentaire
Les lactobacilles sont très utilisés dans l’industrie, en laiterie, fromagerie,
dans la fabrication de choucroute et interviennent dans les saumures et
charcuteries. Dans les yaourts Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus forme
des peptides utilisés par Streptococcus thermophilus qui forme de l’acide formique
qui est capable de le stimuler (synergie). L’arôme du yaourt est dû à l’acétalaldéhyde
formé à partir de thréonine par aldolase de Lb. delbrueckii subsp bulgaricus. Divers
lactobacilles (Lb. casei, Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. buchneri…) interviennent
pendant l’affinage des fromages Lb. helveticus, Lb. lactis et Lb. delbrueckii
subsp bulgaricus agissent avec S. thermophilus dans les fromages à pate cuite. Dans
le kéfyr Lactobacillus kefir, Lb. kefiranofaciens et d’autres lactobacilles
mésophiles interviennent à coté de Candida kefyr, d’autres levures, de Leuconostoc
et de bactéries acétiques. Le rôle des lactobacilles est également important dans les
24
2. Analyse bibliographique végétaux fermentés. Dans les ensilages, il ya d’abord intervention des coliformes
qui utilisent l’oxygène, puis de Leuconostoc et d’entérocoques, enfin de
pédiocoques et de lactobacilles (Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. brevis, Lb. curvatus,
Lb. buchneri, Lb. acidophilus, Lb. graminis…). Dans la choucroute, on observe une
succession de flore voisine avec Lb. brevis puis Lb. plantarum, Lb. curvatus,
Lb. Sake. Dans les cornichons, on trouve Lb. plantarum, Lb. brevis au côté de
Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecalis, Pediococcus cerevisiae. Dans
certains pains, les lactobacilles homo ou hétérofermentaires (Lb. delbrueckii, Lb.
acidophilus, Lb. plantarum, Lb. brevis et surtout Lb. sanfrancisco) interviennent
au côté des levures. Dans le vin, les lactobacilles participent à la fermentation
malolactique (Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. hilgardii, Lb.
fructivorans, Lb. mali…) et à la dégradation de l’acide tartrique : Lb. plantarum,
Lb. brevis (Guiraud et Rosec, 2004 ; Giraffa et al., 2010).
2.5. Effets préventifs et curatifs des probiotiques Les bactéries probiotiques ont été étudiées pour la première fois par Elie
Metchnikoff, lauréat du prix Nobel de médecine en 1908. Il avait proposé une théorie
attestant que les microbes protéolytiques dans le colon produit des substances
toxiques responsables du processus de vieillissement, et propose que la consommation
des produits laitiers fermentés protège le colon à l’aide des bactéries lactiques
acidifiantes, en diminuant le pH intestinal, en réprimant les bactéries protéolytiques et
par la suite conduisant au ralentissement du processus de vieillissement.
Metchnikoff et ses collègues ont ingérés un produit laitier fermenté avec des
espèces bactériennes Bulgares du genre Bacillus et ont reporté des bienfaits pour leur
santé. Pour qualifier une bactérie comme probiotique, certains critères doivent être
respectés : une souche bactérienne doit être identifié par des outils moléculaires, ne
présentant aucun danger lors de son ingestion, adhère à la muqueuse membranaire,
capable de coloniser l’épithélium intestinal, stable après un stockage, doit survivre
dans des concentrations élevés en acides et sels biliaires (Verna et Lucak, 2010).
Certains chercheurs ont étudié et utilisé les probiotiques dans des conditions
médicales variées. Bowe et Logan, (2011) ont discuté la possibilité des probiotiques à
guérir l’acné bien qu’il n’y a pas de protocole approprié menée jusqu’à présent.
Rerksuppaphol et Rerksuppaphol, (2010) ont testé Lactobacillus acidophilus et
25
2. Analyse bibliographique Bifidobacterium bifidum contre la diarrhée aigue chez les nourrissons et les enfants
âgés de 2 mois à 7 ans. Les probiotiques avaient réduits la durée de diarrhée (34.1 et
34.8 h contre 58 h avec placebo) et le nombre de selles (7.3 et 8 contre 15.9 avec
placebo). Ces probiotiques sont aussi utiles dans la prévention du dysfonctionnement
de la barrière intestinale dans la pancréatite aigue (Lutgendorff et al., 2009). Le pré
traitement probiotique réduit la pancréatite aigue en induisant une augmentation du
passage d’E. coli (57.4 probiotiques contre 223 avec placebo), le flux Cr-EDTA (16.7
contre 32.1 cm/s 10-6), l’apoptose, la peroxidation lipidique (0.42 contre 1.62 pmol
MDA/mg de protéine). Ouwehand et al (2009) ont reporté l’efficacité de leurs
souches bactériennes L. acidophilus NCFM dans l’élévation des rhinites allergiques.
La souche probiotique Lactobacillus fermentum VR1-033PCC diminue
considérablement la dermatite atopique dans 56 enfants âgés de 6 à 18 mois et avait
réduit les cas de 54 % comparant à 30 % du groupe placebo. Les bactéries
probiotiques ont été aussi étudiés pour leur bienfaits sur l’encéphalomyélite auto-
immune (Lavasani et al., 2010), la constipation de l’enfant (Bekkali et al., 2007),
l’hypertension et ont prouvé leur efficacité.
L’observation originale du rôle positif joué par quelques bactéries
sélectionnées est attribuée à Eli Metchnikoff, d’origine russe, lauréat du Prix
Nobel qui travaillait à l’Institut Pasteur au début du siècle dernier et qui a suggéré
que "la dépendance des microbes intestinaux vis-à-vis des aliments rend possible
l’adoption de mesures pour modifier la flore dans nos corps et remplacer les
microbes dangereux par des microbes utiles" (Metchnikoff, 1907). Les probiotiques
sont définis comme des micro-organismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en
quantité adéquate, confèrent un bénéfice pour la santé de l’hôte (FAO/WHO, 2002),
au-delà de l’effet nutritionnel. Au sein d’une même espèce, les propriétés
probiotiques de souches différentes peuvent être très variables (Isolauri et al., 2004 ;
Penaud, 2006).
L’effet probiotique de certains lactobacilles a été et est encore
largement étudié. Les lactobacilles font partie de la flore digestive et
participent aux effets bénéfiques de la microflore sur l’hôte, que ce soit au
niveau métabolique, trophique ou immunitaire (Maragkoudakis et al., 2010 ;
Brinques et al., 2010; Dicks et Botes, 2010).
26
2. Analyse bibliographique
Les probiotiques doivent être capables d’exercer leurs effets bénéfiques
sur l’hôte par leur croissance et/ou leur activité dans le corps humain. Toutefois,
c’est la spécificité de l’action, et non la source du microorganisme, qui est
importante. En effet, il est très difficile de confirmer la source d’un
microorganisme. Les nourrissons naissent sans aucune de ces bactéries dans
l’intestin, et l’origine de la microflore intestinale n’a pas été entièrement
élucidée. C’est leur aptitude à rester viables sur le site cible et à être efficaces qui
devrait être vérifiée pour chaque souche potentiellement probiotique (FAO/OMS,
2001).
27
3. Matériel et méthodes
3. Matériel et méthodes 3.1. Collecte du lait de chamelle
Les échantillons de lait crû proviennent de troupeaux de chamelles de la
région d’Ouargla, durant les mois d’avril, de juin et de novembre. Cette région est
caractérisée par une implantation non négligeable de l’élevage de dromadaires de
différentes races.
La récolte de lait de vache est faite simultanément dans les mêmes régions et
chez les mêmes éleveurs pour pouvoir faire une étude comparative par la suite.
L’accompagnement des éleveurs dans un véhicule 4x4 à la recherche de leurs
troupeaux nous a non seulement rendu la tâche plus aisée, mais aussi, nous a fait
gagné énormément de temps. L’identification des dromadaires est facilitée par la
« Sima », qui est une marque spécifique de feu sur l’encolure et les cuisses de
l’animal, que les différentes tribus apposent après chaque opération d’achat ou de
servage.
Le lait est trait à partir de chamelles saines. Il est recueilli proprement selon
les conditions d’hygiène recommandées. Les échantillons de lait sont conservés à
+4°C dans des glacières contenants des blocs de glaces et transportées aussitôt par
avion au laboratoire où ils sont analysés.
Sur les lieux et à l’arrivée, une mesure de pH est réalisée. La plus grande
quantité de lait a été utilisée pour les analyses ultérieures. Le reste, est réparti en
petites fractions et congelé ainsi jusqu'à son utilisation.
Les analyses physico-chimiques et minérales sont réalisées et couvertes par le
laboratoire d’hygiène, et le laboratoire privé Nadjah de la wilaya de Chleff, tandis que
le taux en éléments minéraux en Inde.
Ces tests comprennent:
La composition chimique: matière grasse, matière protéique et la
teneur en caséines.
Les éléments minéraux
Et la teneur en vitamine C.
- La détermination du pH se fait avec un simple pH mètre, et celle de la densité
à l'aide d’un lactodensimètre.
- La détermination de l’acidité titrable est réalisée selon la méthode deLuquet
(1985).
28
3. Matériel et méthodes - La détermination de la matière sèche totale par dessiccation à l'étuve réglée à 103 ±
2°C, après une évaporation de l'eau au moyen d'un bain marie bouillant;
- La matière grasse est déterminée selon la méthode de Gerber (norme AFNOR :
NFV04-210 de décembre 1974).
- L'azote est dosé par la méthode de Kjeldahl (norme FIL-IDF 1962/20) qui repose
sur la minéralisation complète des molécules organiques à chaud et en présence de
l'acide sulfurique concentré et la distillation de l'ammoniaque obtenu, après
alcanisation. La teneur en protéines est obtenue par conversion du taux d'azote total
par un facteur de correction égal à 6.38 (Mathieu, 1998).
- Les protéines lactosériques sont préalablement récupérées dans le surnageant
d'un lait écrémé et additionné du mélange (acétate de sodium 1M et acide acétique
10%, v/v), centrifugé à 4 000 x g / 20 min. Le taux de caséines est obtenu par
déduction des protéines lactosériques des protéines totales.
- La teneur en éléments minéraux est déterminée par un ICP-OES.
- La vitamine C est quantifiée par la méthode colorimétrique en utilisant le 2.6 di-
chlorindophénol (2.6-DIPh) (Farah et al, 1994).
29
3. Matériel et méthodes 3.2. Isolement, purification et identification des bactéries lactiques
L’isolement des souches réalisé au laboratoire de microbiologie appliquée à
partir du lait de chamelle se fait après des séries de dilutions décimales allant jusqu’à
10-6. Cette cascade réduit considérablement le nombre de bactéries présentes dans les
quatre échantillons collectés. Une goutte (voire 0.1 ml) de chaque dilution 10-4 à 10-6
est ensemencée en surface en stries sur milieu MRS, et la boite de Pétri est ensuite
incubée à 30°C pendant 48 h.
Les souches suspectes vont subir des séries de purification sur milieu MRS à
pH 5,4 (Guiraud et Rosec, 2004), et à chaque fois, une observation de l’aspect
macroscopique, de la coloration de Gram et la présence de la catalase est faite.
Les souches considérées comme pures et qui possèdent les caractéristiques du
genre Lactobacillus ou Lactococcus (petites colonies blanchâtres, à Gram positif et à
catalase négatif) sont conservées à courte et à longue durée.
3.2.1. Caractérisation phénotypique Cette étape permet une pré-identification des isolats sélectionnés.
3.2.1.1. Gram et morphologie
Les observations macroscopiques quant à elles permettent de déterminer la
morphologie des cellules bactériennes (la taille, la forme, la disposition des cellules et
le Gram). Les bactéries lactiques sont à Gram positif.
Les observations microscopiques consistent à décrire l’aspect, la couleur, la
taille et le contour des colonies obtenues sur milieu solide sur boite, après une
incubation à 30 °C pendant 24 – 48 h.
3.2.1.2. Production de catalase
Le test consiste à prélever une colonie isolée et à l’émulsionner dans une
goutte d’eau oxygénée. La présence de l’activité de la catalase se traduit par le
dégagement de bulles d’oxygène qui forment une mousse persistante. Les bactéries
lactiques sont catalase négative.
3.2.1.3. Tests d’identification biochimique
Les bactéries Gram positives, catalase et oxydase négatives ont fait l‘objet
d‘une analyse biochimique par le système API bioMérieux en utilisant la galerie API
30
3. Matériel et méthodes 50CH avec API 50 CHL medium (bioMerieux, Marcy l‘étoile, France).
L‘ensemencement et la lecture de la galerie ont été réalisés selon les instructions du
fabricant. Ils se font de la façon suivante:
- cultiver la souche pure sur milieu MRS gélosé 24h à 30°C,
- ouvrir une ampoule de Suspension medium (2 ml), prélever toutes les
colonies de la culture, à l‘aide d‘un écouvillon, et réaliser une suspension dense dans
l‘ampoule,
- ouvrir une ampoule de Suspension medium (5ml) et réaliser une opacité
égale à 2 McFarland en transférant un certain nombre de gouttes de la première
suspension, noter ce nombre de gouttes (n),
- ouvrir une ampoule de API 50 CHL Medium et inoculer avec deux fois le
nombre de gouttes trouvées (2n), homogénéiser,
- répartir API 50 CHL ainsi inoculé dans les tubules, et recouvrir avec de
l‘huile de paraffine stérile,
- incuber à 30°C en aérobiose pendant 48h.
- tous les tests sont lus à 24h et 48h (on recherche dans chaque tubule
l‘acidification produite qui se traduit
par le virage au jaune du pourpre bromocrésol contenu dans le milieu. Pour le
test esculine, on observe un virage du pourpre au noir),
- enregistrer les résultats obtenus,
- le profil biochimique ainsi obtenu peut être lu grâce à un logiciel
d‘identification APILAB (bioMérieux, Marcy l‘étoile, France).
par le virage au jaune du pourpre bromocrésol contenu dans le milieu. Pour le
test esculine, on observe un virage du pourpre au noir),
- enregistrer les résultats obtenus,
- le profil biochimique ainsi obtenu peut être lu grâce à un logiciel
d‘identification APILAB (bioMérieux, Marcy l‘étoile, France).
31
3. Matériel et méthodes 3.2.2. Caractérisation moléculaire
Les produits de biologie moléculaire proviennent de Sigma (États-Unis).
L’identification moléculaire des souches de bactéries lactiques est réalisée en
plusieurs étapes cruciales.
3.2.2.1. Extraction et Purification de l’ADN génomique
La technique employée pour l‘extraction de l’ADN génomique est celle de
Satish et al (2010). Les bactéries lactiques sont ensemencées dans un milieu MRS
liquide (37°C, 12 h) d’incubation. 1.5 ml de la culture est centrifugé (8000 tr/min, 6
min). Les culots sont repris dans 330 µl de solution de lyse GTE (tris: 25 mM; EDTA:
10 mM; glucose: 50 mM; eau distillée: 100 ml; pH : 8).
Les préparations sont laissées à température ambiante pendant 30 min.
Quelques milligrammes de lysozyme sont ajoutés et incubée (37° C, 1 h). Ensuite, 10
µl de SDS à 20% sont ajoutés, puis incubées à 37 °C toute la nuit.
L’ARNase (10 mg/ml) est dissous dans 10 mM Tris-Cl (pH 7.5) et mis dans
un bain marie pendant 15 min, puis réfrigéré et stocké à -20°C.
Pour éliminer l’ARN, de l’ARNase (0.1 mg/ml préparée à l’avance) est ajouté
à la préparation et incubé (37°C, 3 h), ensuite 17 µl d’EDTA (0.5 M) et incubé (50°C,
10 min).
La protéinase K (10 µl) est ajoutée puis incubée (37°C, 3 h).
Après incubation, 200 µl de phénol : chloroforme sont ajoutés doucement,
puis la solution est centrifugée (16000 tr/min, 15min). Ce solvant est préparé en
utilisant le ratio 24 :1 et stocké dans une bouteille teintée à 4°C avec 0.1M de Tris-Cl
en phase aqueuse.
Après centrifugation, la phase aqueuse est collectée et mixée à un volume
équivalant d’isopropanol. Le contenu est agité doucement, jusqu’à l’observation d’un
fin filament d’ADN, puis centrifugé (16000 tr/min, 15 min). Le culot d’ADN est rincé
en ajoutant 1 ml d’éthanol à 95 % puis centrifugé encore une fois (16000 tr/min, 15
min.
Les culots sont mis à l’air libre pour sécher, puis dissouts dans 40 µl de
solvant 1X TE (1M Tris-HCl (pH 8.0): 1 ml ; EDTA 0.5M: 0.2 ml; Eau distillée: 100
ml). Solution EDTA 0.5M (EDTA: 14.61 g; eau distillée: 100 ml; pH: 8.0)
32
3. Matériel et méthodes
Les culots d’ADN collectés sont mis en évidence grâce à l’électrophorèse sur
gel d’agarose.
3.2.2.2. Electrophorèse sur gel d’agarose
Les culots d’ADN purs isolés sont séparés sur un gel d’agarose (0.8 %).
Ensuite, une solution 1X de solvant TAE est préparée et ce en ajoutant 1 ml du
solvant 50X TAE (Tris-base: 242 g; Acide acétique glacial: 57.1 ml; 0.5M EDTA (pH
8.0):100 ml; Eau distillée qsp 1000 ml) à 49 ml d’eau distillée.
0.4 g d’agarose sont ajoutées. Le mélange est bien mixé tout en chauffant
jusqu’à la dissolution complète de l’agarose.
3 µl de bromure d’éthidium de la solution mère (0.5 µg/ml) sont additionnés
tout en mélangeant légèrement.
La solution tiède d’agarose est coulée dans le moule contenant le peigne, puis
laissée refroidir pour 30 - 45min à température ambiante. Le gel est monté par la
suite dans les cuves d’électrophorèse. Le solvant d’électrophorèse est ajouté afin de
couvrir le gel à une profondeur de 1 mm.
Les échantillons d’ADN sont mélangés au colorant révélateur du gel (bleu de
bromophénol : 0.25 g ; xylène cyanol : 0.25 g ; glycérol : 30ml ; eau distillée qsp
100ml), puis introduits dans les puits submergés à l’aide d’une micropipette. Le
voltage utilisé est de 50 V.
Après 1 à 2 h, le gel est pris seul pour l’examiner sous une illumination
ultraviolette. Les bandes claires sont révélées en rouge orangé. Le poids moléculaire
est mesuré en comparant les bandes au marqueur d’ADN utilisé.
Après 1 à 2 h, le gel est pris seul pour l’examiner sous une illumination
ultraviolette. Les bandes claires sont révélées en rouge orangé. Le poids moléculaire
est mesuré en comparant les bandes au marqueur d’ADN utilisé. Un marqueur d’ADN
de 50 bp (Promega) est utilisé.
3.2.2.3. PCR des génomes collectés
Les réactifs de PCR ainsi que les marqueurs de poids moléculaires nous ont
été offerts par Bangalore Genei (Inde).
Afin d’amplifier l’ADNr 16S des échantillons, nous avons utilisé la technique
de PCR (Polymerase Chain Reaction). Les amorces utilisées pour l’amplification de
33
3. Matériel et méthodes l’ADNr 16S sont l’amorce sens (forward): AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG et
l’amorce anti-sens (reverse): ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT.
Un mélange réactionnel (mélange de PCR) composé de 5 μl d’ADN purifié, 1
μl de chaque amorce, 5 μl Taq ADN polymérase, 2.5 µl dNTP , 3 µl solvant et 7.5 µl
eau distillée est préparé.
Le mélange réactionnel est sujet au programme suivant pendant 30 cycles:
• Dénaturation initiale: 95° C, 4 min
• Dénaturation: 95° C, 30 s
• Hybridation: 55° C, 30 s
• Elongation: 72° C, 30 s
• Finalisation: 72° C, 10 min
Les produits de PCR sont analysés par une électrophorèse sur gel d’agarose à
0.8 %. La purification est faite par un Kit de Purification de PCR (Bangalore Genie).
Les gels d’agarose et de polyacrylamide sont photographiés en utilisant un
système spécial à cet effet, appelé Gel Doc, muni d’un illuminateur à ultra violet et
d’une caméra digitale intégrée de type CCD, le tout relié à un ordinateur.
3.2.2.4. Séquençage du produit PCR des souches
Une fois que les produits de PCR apparaissent sur le gel d’agarose avec une
quantité satisfaisante, le séquençage moléculaire est tout de suite envisagé. La
méthode utilisée pour le séquençage est celle de Frederick Sanger.
Pour cela, les laboratoires Suisse Microsynth AG se sont chargés du
séquençage des souches bactériennes. La concentration minimale requise à cet effet
est de 10 pmol/µl dans 12 µl d’ADN.
Les résultats sont fournis par email 24 h après la réception des eppendorfs
contenants les produits de PCR ainsi que les amorces universelles.
3.2.2.5. Soumission de la séquence à GenBank
Après la réception des données, les séquences sont analysées par des
méthodes bioinformatiques, puis soumises à la banque GenBank (NCBI), qui est
gérée par le National Institute of Health aux Etats-Unis, afin de recevoir les numéros
d’accession uniques pour chaque souche bactérienne. Les étapes à suivre pour
34
3. Matériel et méthodes soumettre une séquence donnée sont misent à la disposition des chercheurs sur le site
officiel de NCBI.
3.3. Propriétés probiotiques de la souche sélectionnée Les critères qui permettent de déterminer si la souche sélectionnée possède
des propriétés probiotiques se présentent sous forme de différents tests.
Tous les milieux de culture et les enzymes nous ont été procurés et fournis par
HiMedia (Inde).
3.3.1. Activité gélatinase
Des boites de pétri contenant du BHI solide additionné de peptone (10 g/l) et
de gélatine (30 g/l) sont utilisées pour déterminer la production de gélatinase.
Après incubation à 37 °C, les cultures sont placées à 4°C pendant 5 h avant
d’examiner les liquides dus à l’hydrolyse de gélatine, qui indiquent la présence de
l’activité gélatinase (Harrigan et MacCance, 1990)
3.3.2. Activité hémolytique
Cette analyse est déterminée en utilisant les érythrocytes du sang humain (50
g/100 ml) mélangés au BHI solide (Linaje et al., 2004). Après inoculation et
incubation des boites de Pétri, l’observation des halos clairs autour des colonies
indique que l’activité hémolytique de la souche est positive.
La nature de ces zones claires est interprétée comme β-hémolytique ou α-
hémolytique (Maragkoudakis et al., 2006).
3.3.3. Tolérance à la bile
La tolérance à la bile est déterminée comme décrit par Jonh et Alicia (2001).
Les souches sont cultivées pendant 16 h dans un bouillon de MRS à 37°C. Les
cellules centrifugées sont bien lavées avec un solvant phosphate 0.1 M, puis re-
suspendues dans le volume initial et par la suite mixées à l’aide d’un agitateur.
Seulement 0.5 % de la suspension est inoculée dans du MRS liquide ou
MRSO supplémenté de Oxbile (Oxgall) pour obtenir une concentration finale de 0.05
%, 0.1 %, 0.15 % et 0.3 %, puis incubées directement à 37 °C. L’absorbance est lue à
560 nm chaque heure durant 24h (John et Alicia, 2001).
35
3. Matériel et méthodes
3.3.4. Capacité à réduire le cholestérol
Le MRSO supplémenté de 0.3 % d’Oxbile comme étant des sels biliaires. Le
cholestérol soluble dans l’eau est additionné jusqu’à une concentration de 100 µg/ml,
puis inoculé avec la souche testée, et incubé à 37 °C pendant 20 h.
Les cellules sont centrifugées et la concentration en cholestérol restant est
déterminée par la méthode décrite par Rudeland Morris (1973).
3.3.5. Résistance à l’acidité
Le suc gastrique artificiel composé de 0.2 % NaCl, 3.2 g/l Pepsin, pH 2.0) est
préparé et stérilisé en utilisant des filtres Millex de 0.22µm de diamètre. Pour le
contrôle, 30 ml est ajusté à un pH final de 6.0 avec 1 N NaOH, puis 2 ml (contenant
approximativement 8 log cfu/ml de cellules vivantes) est additionné. Les deux milieux
de cultures sont incubés sur un agitateur à 100 tr/min à 37 °C.
Les échantillons sont collectés chaque heure durant 24 h afin de déterminer le
taux de viabilité des cellules sur le milieu MRS solide comme décrit précédemment
par John et Alicia (2001).
3.3.6. Production d’exopolysaccharides (EPS)
Les cultures fraiches d’une nuitée, sont ensemencées sur des boites de pétri
contenant du rouge de ruthénium additionné de lait (poudre de lait 10 % w/v, sucrose
1 % w/v, rouge de ruthénium 0.08 g/l et de l’agar-agar 1.5 % w/v) puis incubées à 37
°C pendant 24 h.
Les cellules visqueuses apparaissent en couleur rouge parce que la membrane
cellulaire se colore sous l’action du colorant, les cellules non visqueuses quant à elles
sont blanchâtres, comme indiqué par Mora et al (2002).
3.3.7. Spectre d’activité antibactérienne
Une culture jeune de DU10 dans un milieu MRS est centrifugée durant 10 min
à 15 tr/min. Les surnageants de culture cellulaire sont filtrés en utilisant un filtre
millipore Millex GV (Millipore, États-Unis) d’un diamètre de 0.22 µm dans le but
d’éliminer les cellules résiduelles.
36
3. Matériel et méthodes
L’activité antimicrobienne des surnageants de culture est déterminée par la
méthode de diffusion sur gel contre les souches à Gram positif et à Gram négatif.
Les souches bactériennes (Tableau 1) utilisées dans ce travail proviennent de
l’École Nationale Supérieure Vétérinaire d'Alger (Listeria) et de l’Université de
Tlemcen (le reste des souches pathogènes).
Tableau1: Bactéries pathogènes
Bactérie Référence
Listeria monocytogenes
Listeria innocua
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Klebsiella pneumonia
Salmonella enterica
Salmonella typhi
Vibrio fischeri
Vibrio parahaemolyticus
ATCC 15313
ATCC 33090
ATCC 6538
ATCC 27853
ATCC 8739
ATCC 700603
ATCC 14028
ATCC 700720
ATCC 700601
ATCC 17802
Les souches pathogènes indicatrices (Tableau 1) sont ensemencées
séparément dans une gélose molle MRS, puis des puits sont creusés et 80 µl du
surnageant DU10 sont déposés dans le puits, en variant les dilutions et en fixant le pH
à 6.5. (Kumar et Arul, 2009).
Les halos d’inhibition confirment la présence d’une activité antimicrobienne
(Saidi et al., 2011).
37
3. Matériel et méthodes 3.4. Purification des bactériocines 3.4.1. Préparation de l’extrait bactériocinogénique
Un litre (1 L) de milieu de culture MRS liquide est innoculé avec 0.1 % de
Lactobacillus plantarum DU10, puis incubé à 37 °C durant 16 h sur un agitateur. Les
cellules sont ensuite séparées en centrifugeant le milieu de culture à 8000 tr/min à 4°C
pendant 15 min.
Le surnageant de culture subit par la suite une ultrafiltration en utilisant un
filtre de type Amicon (Merck Millipore, Allemagne) afin de purifier et de concentrer
les protéines.
Le diamètre de la membrane est de 10 kDa , vu que la bectériocine est
suspectée d’être au dessous de ce poids moléculaire (Zergui et al., 2015).
Le sulfate d’ammonium est ajoutée doucement au filtrat résultant -de la
précédante étape jusqu’à 90% de saturation (61.3 g/100 ml), et est laissé sous
agitation toute la nuit à 4°C. Les protéines précipitées sont ensuite collectées après
une centrifugation à 10,000 tr/min pendant 20 min à 4°C, et re-suspendues dans une
quantité minimale de 10 mM de solvant d’acétate d’ammonium (pH 6.0).
La suspension est ensuite mise dans des poches pour dialyse (1 kDa) toute la
nuit à 4°C contre un solvant sous agitation (Spectrumlabs, États Unis).
L’échantillon dialisé est injecté dans un système de filtration sur colonne
séphadex G-25 (Sigma, États Unis) connecté à un système de purification Akta Prime
Plus (GE Healthcare, Uppsala, Swisse). La colonne du gel est équilibrée avec un
solvant d’acétate d’ammonium (10 mM) à pH 6.0.
Par la suite, 1 ml de l’échantillon dialysé est élué avec le meme solvant mais
contenant cette fois ci 0.01 M de chloride de sodium à un débit de 0.5 ml/min et des
fractions de 1ml seulement.
Pour chaque fraction, l’activité bactériocinogénique est testée, et le profil
protéique est réalisé par une Tricine SDS-PAGE.
Les fractions actives démontrant une activité bactériocinogénique et leur
présence sur le profil protéique sous forme de bandes, sont concentrées puis
lyophilisées (Savant, États Unis).
L’échantillon concentré est purifié en utilisant une HPLC (Shimadzu, Japan) à
phase inverse (RP-HPLC). Les matrices de chromatographie sur gel ont été obtenues
de GE Healthcare (Suisse). Les solvants HPLC ont été parvenus de la part de Merck
38
3. Matériel et méthodes (Allemagne). La colonne HPLC à phase inverse a été achetée de Phenominex (États-
Unis). Les sacs de dialyse de la part de Spectrumlab (États-Unis), et la verrerie de la
marque Tarsons (Inde).
25 µl de la bactériocine concentrée (fractions collectées de la colonne de
purification montrant une inhibition des pathogènes testés) sont injectés dans une
colonne analytique de type C18 à phase inverse (Lune 5 µm, 4.6x250 mm,
Phenomenec, CA, États Unis).
L’élution est effectuée à un flux de 1 ml/min en utilisant un gradiant linéaire
de 90 % de solvant A [0.1 % (w/v) trifluoro-acide acétique (TFA) dans 5 % (v/v)
d’acétonitrile dans de l’eau] et 10 % de solvant B (0.1 % TFA dans 100%
d’acétonitrile), jusqu’à 42 % et 58 % de solvants A et B respectivement, et ce pendant
46 min.
Les fractions peptidiques sont détectées par spectrophotométrie en mesurant
l’absorbance à 220 nm et collectées manuellement. Elles sont ensuite concentrées en
utilisant un lyophilisateur, puis dissoutes dans un solvant d’acétate d’ammonium (10
mM, pH 6.0) et utilisées pour tester l’activité bactériocinogénique et déterminer le
poids moléculaire (Zergui et al., 2015).
3.4.2. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
Le poids moléculaire des bactériocines est estimé en séparant les fractions
obtenues après l’analyse par HPLC en utilisant la méthode de Tricine SDS-PAGE
(10%) (Schägger et Jagow, 1987).
Un marqueur de taille allant de 3.0 à 97.4 kDa (Bangalore Genei, Bangalore,
Inde) est utilisé, et le gel est coloré au nitrate d’argent (Morrisey, 1981).
Le gel de 1 mm d'épaisseur est coulé entre les deux plaques en verre. Le gel de
concentration (Acrylamide: 48,0 g ; bis-acrylamide : 1,5 g ; eau distillée qsp 100 ml)
utilisé à cet effet est de 5%, et le gel de séparation (acrylamide: 46,5 g; bis-
acrylamide: 1,5 g; eau distillée qsp 100 ml) de 10%. Le gel de séparation est versé
entre les plaques de verre propres scellées. De l'eau distillée est posée sur la partie
supérieure du gel de résolution doucement pour éliminer les bulles d'air et permettre
de donner une surface plane au-dessus. Après polymérisation complète du gel de
résolution, l'eau sur la partie supérieure est enlevée et le gel d'empilement (solution
mère de séparation à 10% contenant : gel de séparation: 1,22 ml; solvant du gel: 2,0
39
3. Matériel et méthodes ml (qui contient du : Tris (0,5M): 5,0 ml; SDS (20%): 4,0 ml; 2-mercaptoethanol: 4,0
ml; glycérol (50%): 1,0 ml; bleu de bromophénol : 0,004 g; eau distillée: 6,0 ml; pH:
6,8); glycérol (50 %): 2,0 ml ; eau distillée: 0.78 ml; persulfate d’ammonium (10
%):75,0 µl; TEMED : 7,5 µl) est versé sur le gel de résolution jusqu'à atteindre la
partie supérieure. Un peigne approprié est inséré dans la cassette et la polymérisation
est ainsi autorisée à prendre place. La cassette de gel est ensuite retirée de l'appareil et
placée sur la plate-forme d'électrophorèse avec soin de sorte qu'aucune bulle d'air
n’est formée au fond du gel dans le réservoir inférieur. Ensuite, le peigne est enlevé et
le réservoir supérieur est également rempli avec du tampon. Ensuite, les échantillons
sont mis prudemment dans les puits, en utilisant la solution de concentration (Gel de
concentration : 0,25 ml ; solvant du gel : 0,75 ml ; eau distillée : 2,0 ml ; persulfate
d’ammonium : 20,0 µl ; TEMED : 2,0 µl), et tournent à 50 V.
Le solvant de l’anode (+) 10X contient du Tris : 200 mM; pH : 8,9; SDS: 8,25. Tandis
que le solvant de la cathode (-) 10X contient du Tris : 200 mM; pH : 8,9; Tricine: 1
%; SDS: 8,25)
Une fois que l'électrophorèse est terminée, le gel est soigneusement retiré des plaques
et coloré en utilisant la technique de coloration aux nitrates d'argent.
Coloration aux nitrates d’argent
La Coloration aux nitrates d’argent réalisée revient à Morrissey (1981). Le gel de
polyacrylamide est fixé (éthanol: 50 %; acide acétique: 12 %; formaldéhyde: 0,1 M;
eau distillée: 100 ml) toute la nuit et rincé avec de l’eau distillée deux fois
successives. Le gel est après immergé dans une solution d’éthanol à 50 % durant 20
minutes et 100 ml d’une solution de 0.01% de sodium thiosulphate est transférée dans
le même bac. Ensuite, il est rincé deux fois et traité avec les nitrates d’argent à 0.2%
(Ag NO3: 0,2 g; formaldéhyde: 160 µl; eau distillée: 100 ml) et laissé à l’obscurité
pendant 20 min. Après l’avoir rincé, 100 ml de la solution de développement (Na2 S2
O3: 0,01 g; Na2 CO3: 3,0 g; formaldehyde: 40 µl; eau distillée: 100 ml) est ajoutée,
puis rincé encore une fois jusqu’à ce que les bandes apparaissent à l’œil nues. Cette
réaction est stoppée avec de l’eau distillée afin d’éviter le noircissement du gel.
Afin de tester l’activité antimicrobienne de deux bandes apparentes, le gel
coupé n’est exposé ni à l’ébullition ni à l’ajout de 2-mercaptoéthanole. Le SDS est
enlevé par rinçage 4 fois durant 10 minutes chacune avec de l’eau distillée, puis le gel
40
3. Matériel et méthodes est placé dans une boite de pétri contenant 2 % d’agar et le tout couvert de 0.7 %
d’agar refroidit inoculé par la souche indicatrice à 37°C pendant 24 h.
3.4.3. Détermination du poids moléculaire par MALDI-TOF/MS
Le poids moléculaire exact des peptides antimicrobiens est déterminé par
MALDI-TOF/MS.
Le poids moléculaire des peptides est déterminée grâce aux analyses
protéomiques faites à l’unité de biophysique moléculaire à l’Institut Indien des
Sciences de Bangalore (Inde).
3.4.4. Détermination du N-terminal
Le séquençage du N-terminal des bactériocines produites par DU10 est réalisé
au département de chimie à l’institut Indien des sciences de Bangalore (Inde).
Les échantillons purs de HPLC sont collectés et mis sur des membranes
PVDF en utilisant le solvant Towbin (0.025 M de Tris, 0.052 M de glycine, 20 % de
méthanol) comme solvant de transfert.
Le transfert se fait pour au moins 2 h à 100 mA en utilisant un appareil
d'électro-transfert semi-sec Biorad Trans-Blot SD-Dry.
3.5. Action de différents facteurs sur la production de la bactériocine 3.5.1. Effet de la température,
En faisant chauffer les peptides antimicrobiens partiellement purifiés, l’effet
de la température sur l’activité antimicrobienne est testé (1 mg protéine/ml) à 60
°C/30 min, 80 °C/30 min, 100 °C/30 min, 121 °C/15 min, puis les échantillons sont
refroidis et l’activité résiduelle est testée en utilisant la souche Listeria
monocytogenes ATCC 15313 comme indicatrice. (Al-Otaibi, 2012). Les expériences
menées sont toutes faites trois fois de suite.
3.5.2. Effet du pH
A partir du gel de filtration chromatographique, la fraction active est obtenue
et ajusté à 1 mg protéine/ml (pH 6.5) en tant que peptide antimicrobien partiellement
purifié, par la suite un test d’activité antimicrobienne est effectué. Les peptides
antimicrobiens partiellement purifiés présents dans les solvants sans enzymes, et les
solvants seuls sont utilisés comme contrôle.
41
3. Matériel et méthodes
Le pH des échantillons est ajusté (1 mg protéine/ml) à des valeurs allants de
2.0 à 10.0 avec du 3 M NaOH ou 3 M HCl pour vérifier la présence d’une activité
antimicrobienne.
Après une incubation à 37 °C pendant 72 h, le pH des échantillons est réajusté
à 6.5 avec du 3 M NaOH ou 3 M HCl, et testés ensuite pour vérifier encore l’activité
antimicrobienne.
3.5.3. Effet des enzymes
Les aliquotes des échantillons sont incubés en présence de différentes
enzymes à 37 °C pendant 2 h à savoir :
• Pepsine : 800 U/ml avec 0.05 M de solvant d’acide citrique à pH 2.0
(Sigma, États-Unis)
• Trypsine : 250 U/ml avec 0.05 M de solvant phosphate de sodium à
pH 7.0 (Sigma, États-Unis)
• Protéinase K : 38 U/ml à pH 7.5 en présence de 0.05 M de solvant de
phosphate de sodium (Amresco, États-Unis)
• α-chymotrypsine : 100 U/ml avec 0.05 M de solvant de phosphate de
sodium à pH 7.5 (Sigma, États-Unis).
Après incubation, les échantillons sont ajustés à un pH 6.5 avec 3 M de NaOH
stérile ou bien 3M de HCl, et testés pour l’existence d’une activité antimicrobienne
contre la souche Listeria monocytogenes ATCC 15313 comme souche indicatrice
3.6. Optimisation des conditions de biosynthèse des bactériocines De nombreux chercheurs ont étudié la production des bactériocines par les
bactéries lactiques. Il est connu désormais, que la production de bactériocines par les
bactéries lactiques peut être influencée par la température d’incubation, le pH, la
composition du milieu de culture et d’autres facteurs environnementaux (Eijsink et
al., 2002 ; Strompfovà et Laukovà, 2007).
La souche sélectionnée productrice de bactériocines a été maintenue dans le
milieu MRS à -4°C et son activité bactériocinogène est estimée en utilisant la
méthode de diffusion en puits et exprimée en unité arbitraire (UA/ml).
La souche est préparée en inoculant une seule colonie dans 10 ml de MRS
liquide, puis incubée à 37°C pendant 16 h sous agitation.
42
3. Matériel et méthodes
La fermentation en batch est réalisée dans une fiole Erlenmeyer de 250 ml
contenant 100 ml de milieu fermentaire (pH 6.5) inoculé par 5% (v/v) d’une culture
bactérienne âgée de 16 h à 37°C sous agitations pendant 16 h.
3.6.1. Effet de la température
Cette optimisation est déterminée en inoculant les premières phases
logarithmiques des cultures et les incuber à différentes températures 25°C, 30°C,
35°C, 40°C et 45°C. Les cellules sont centrifugées chaque 2 h durant 24 h (8000
tr/min pendant 10 min à 4°C).
Les cellules viables totales sont comptées en utilisant la méthode de
numération sur boite sur milieu MRS. Le pH du surnageant de culture est ajusté à 6.5
avec 1 N de NaOH et filtré (diamètre des pores 0.22 µg) pour estimer l’activité
bactériocinogène (UA/ml) en utilisant la méthode de diffusion en puits.
3.6.2. Effet du pH
Pour évaluer l’effet du pH sur la croissance et la production des bactériocines
produites par la souche, celle-ci est cultivée sur un milieu MRS à différents pH allant
de 5.5 à 7.0.
Le pH du milieu MRS liquide est ajusté à la valeur voulu, en additionnant 1N
de HCl ou avec 1N de NaOH, par la suite le milieu de culture est inoculé par la
souche sélectionnée et incubé à 37 °C.
Les cellules viables totales sont comptées, et l’activité bactériocinogène est
mesurée comme précédemment décrit.
3.6.3. Effet de la salinité
Des expérimentations sont faites pour déterminer la concentration optimale de
NaCl dans le milieu de culture nécessaire pour booster la croissance bactérienne et la
production de bactériocines.
La souche est donc cultivée sur milieu MRS contenant différentes
concentrations de NaCl allant de 0 % à 3.0 %, et incubé à 37 °C. Les cellules viables
totales sont comptées, et l’activité bactériocinogène déterminée en respectant les
intervalles de temps. Les surnageants de culture sont collectés après 16 h et
neutralisés avec 1 N de NaOH.
43
3. Matériel et méthodes
3.8.4. Effet du surfactant Tween 80
Pour évaluer l’effet de Tween 80 sur la croissance et la production de
bactériocines, la souche est cultivée dans un milieu MRS liquide contenant différentes
concentrations de Tween 80 de 0.2 à 1 %.
Après une période d’incubation de 16 h, les cellules sont centrifugées (8000
tr/min pendant 10 min à 4 °C).
Les cellules viables sont comptées en utilisant la méthode de comptage sur
boite sur milieu MRS. Le pH du surnageant de culture est ajusté à 6.5 avec 1N NaOH
et filtré (diamètre 0.22µm) pour estimer l’activité bactériocinogène (UA/ml) avec la
méthode de diffusion sur gel.
A la fin, les valeurs optimales sont testées simultanément pour déterminer le
taux de production de bactériocines de la souche Lactobacillus plantarum DU10.
- Ce qu’il faut savoir sur le Tween 80 (Additif alimentaire E433) :
Les polysorbates sont des produits synthétiques fabriqués à partir de sorbitol (E420)
dans un processus en trois étapes. De l'eau est d'abord retirée du sorbitol pour former
un sorbitane, qui est ensuite partiellement estérifié avec un acide gras naturel tel que
l'acide laurique Enfin, de l'oxyde d'éthylène est ajouté en présence d'un catalyseur
pour donner du polysorbate. Les polysorbates E433 contiennent des acides gras
presque toujours issus d'huiles végétales, mais l'utilisation de graisses animales, n'est
pas exclue et demeure à la discrétion du producteur.
E433 est listé comme agent de texture (émulsifiant et stabilisant) au Codex
alimentarius ; il peut être ajouté à de nombreux aliments selon des doses maximales
comprises entre 10 mg/kg (sel) et 5.000 mg/kg (assaisonnements et condiments,
sauces claires, etc.), voire 25.000 mg/kg dans les compléments alimentaires.
L'association européenne de fabricants d'émulsifiants (EFEMA) liste également le
polysorbate 80 dans les produits pharmaceutiques, les cosmétiques, les aliments pour
animaux, et des emballages alimentaires en plastique.
44
4. Résultats et discussion
4. Résultats et discussion
L’ensemble de tous les résultats obtenus dans le cadre de la préparation de
cette thèse sont consignés sous la forme de plusieurs points qui sont: les
caractéristiques physico chimiques du lait collecté, l’identification phénotypique des
souches, l’identication moléculaire par comparaison de l’ADNr 16S, la recherche des
caractéristiques de la souche sélectionnée DU10, l’évaluation des propriétés
probiotiques de la souche sélectionnée, la purification de la bactériocine, la
connaissance du poids moléculaire des bactériocines, le séquençage du N-terminal de
la plantaricine MZ, l’étude des effets de différents facteurs sur la production de la
bactériocine, et l’ optimisation des conditions de biosynthèse des bactériocines. Il est
important de signaler que plusieurs données ont été perdues à cause d’un incident
survenu à l’Université des Sciences et de Technologie Houari Boumediene, l’essentiel
des résultats est présenté dans cette partie.
4.1. Caractéristiques physico chimiques du lait collecté Les analyses physicochimiques et minérales réalisées sur le lait de chamelles
et de vaches de la région d’Ouargla sont regroupés dans les tableaux 2 et 3.
La qualité des échantillons de lait cru est influencée par les méthodes
d’échantillonnage, de transport, et par l’état de santé de l’animal.
Des contaminations importantes du lait cru signifieraient une modification de
l’équilibre de la microflore, et entraîneraient des problèmes au cours des opérations
d’isolement des bactéries lactiques. D’où l’intérêt de prélever les souches
bactériennes le plus rapidement possible, après la traite, et d’apprécier la qualité
hygiénique et microbiologique des échantillons de lait cru, avant l’isolement des
bactéries lactiques. Pour cela, une prise du pH est effectuée.
Le lait de chamelle collecté localement se caractérise par un pH d’une valeur
moyenne de 6.53. Le lait de vache quant à lui est moins acide avec des valeurs qui
oscillent entre 6.67 à 6.72, soit une moyenne de 6.66.
Le lait camelin serait légèrement donc plus acide que le lait bovin.
Les valeurs relevées du lait camelin concordent à celles rapportées par certains
auteurs dans d’autres pays tels qu’Abu-Tarboush et al (1998), en Arabie Saoudite (pH
6.48). D’autres auteurs avancent des valeurs plus élevées, tels que Mehaia (1993 a) en
Arabie Saoudite (pH 6.61), et Kamoun (1995) en Tunisie (pH 6.51).
45
4. Résultats et discussion
Le pH ainsi que le goût du lait peuvent dépendre de la nature des fourrages et
de la disponibilité de l’eau (Gorban et Izzeldin, 1997).
Tableau 2: Analyses physicochimiques et minérales du lait de chamelle
Prélèvements Avril Juin Novembre Constantes
Physiques
pH à 20°C 6.440 ± 0.026 6.820 ± 0.019 6.330 ± 0.024 AT 15.440 ± 0.161 15.680 ± 0.083 16.260 ± 0.194 D à 20°C 1.034 ± 0.002 1.009 ± 0.017 1.032 ± 0.003
Composition
Chimique
(g/l)
MST 138.80 ± 0.75 102.18 ± 0.20 110.54 ± 0.49 MG 46.498 ± 0.141 28.789 ± 0.055 42.898 ± 0.238 MP 27.98 ± 0.13 25.22 ± 0.16 26.54 ± 0.17 Caséines 23.14 ± 0.12 21.70 ± 0.06 22.55 ± 0.35
Composants
Minéraux
(g/l)
Ca 1.122 ± 0.025 1.161 ± 0.013 1.201 ± 0.011 P 0.908 ± 0.013 0.844 ± 0.019 0.882 ± 0.021 Na 0.43 ± 0.01 0.351 ± 0.009 0.412 ± 0.004 K 1.77 ± 0.02 1.611 ± 0.013 1.751 ± 0.014 Cl 2.250 ± 0.004 2.160 ± ±0.056 2.252 ± 0.008 Fe 2.201 ± 0.012 3.101 ± 0.034 3.398 ± 0.006
Vitamine C (mg/l) 43.940 ± 0.134 41.290 ± 0.015 42.643 ± 0.151
Tableau 3: Analyses physico-chimiques et minérales du lait de vache
Prélèvements Avril Juin Novembre Constantes
Physiques
pH à 20°C 6.680 ± 0.014 6.720 ± 0.017 6.670 ± 0.014 AT 15.950 ± 0.070 16.021 ± 0.011 16.550 ± 0.070 D à 20°C 1.034 ± 0.004 1.035 ± 0.001 1.032 ± 0.003
Composition
Chimique
(g/l)
MST 126.213 ± 0.282 107.120± 0.871 117.850± 0.212 MG 33.605± 0.282 31.330 ± 0.351 32.409 ± 0.141 MP 30.600 ± 0.141 27.705 ± 0.141 29.204 ± 0.264 Caséines 25.553 ± 0.353 22.960 ± 0.070 24.151 ± 0.212
Composants
Minéraux
(g/l)
Ca 1.340 ± 0.014 1.280 ± 0.007 1.310 ± 0.014 P 0.965 ± 0.007 0.950 ± 0.011 1.025 ± 0.007 Na 0.57 ± 0.007 0.520 ± 0.007 0.560 ± 0.003 K 1.750 ± 0.014 1.420 ± 0.007 1.410 ± 0.021 Cl 1.215 ± 0.02 1.210 ± 0.005 1.190 ± 0.007 Fe 0.480 ± 0.005 0.350 ± 0.003 0.501± 0.006
Vitamine C (mg/l) 20.290 ± 0.014 20.230 ± 0.005 20.260 ± 0.007 AT: acidité titrable; D: densité; MAT: matière sèche totale; MG: matière grasse; MP: matière
protéique.
46
4. Résultats et discussion
La teneur relativement élevée en vitamine C du lait de dromadaire, serait
même à l’origine du pH bas (Saley, 1993). De même qu’elle lui confère un goût
particulièrement sucré pouvant être masqué par une saveur amère ou acide selon la
nature des plantes broutées. D’autre part, Yagil (1985) estime que le pH bas du lait
camelin peut être attribué à la forte concentration en acide gras volatils.
Les échantillons de lait camelin analysés, présentent une acidité titrable d’une
moyenne de 15,79 °D. Cette valeur se situe dans la fourchette des travaux rapportés
sur le lait camelin. Certains avancent une acidité de l’ordre de 14 °D, légèrement plus
faible par rapport à celle du lait bovin qui est de l’ordre de 15 °D (Mehaia, 1993),
alors que de nombreux auteurs rapportent des valeurs supérieures ou égales à 15°D,
tels que Elamin et Wilcox (1992) en Arabie Saoudite.
Le lait camelin se caractérise par un effet tampon plus élevé par rapport au lait
bovin (Abu-Tarboush, 1996), ceci permet d'expliquer l'absence de relation directe
entre le pH et l'acidité titrable.
D’autre part, la valeur de la densité des échantillons de lait camelin est égale
à 1,025. Elle est comparable aux valeurs rapportées par Farah (1993), qui cite une
fourchette entre 1.025 et 1.032 avec une moyenne de 1.029, Daget et Lhost (1995)
1.026, et Kamoun (1995) 1.028. La densité dépend directement de la teneur en
matière sèche, liée fortement à la fréquence d’abreuvement.
Concernant la teneur en matière sèche totale, la valeur moyenne des
échantillons analysés est égale à 116,90 g/l. Celle-ci semble un peu faible par rapport
à celles du lait de vache dont la valeur moyenne est de 117.16 g/l.
La densité se situe dans la fourchette des travaux menés à travers le monde, à
savoir 116 g/l (Mehaia et al., 1995) pour la race Hamra, ou la race Somali avec une
valeur de 121.5 g/l selon Abulehia (1994).
L’une des principales caractéristiques du lait camelin est en effet, sa teneur en
matière sèche réduite par rapport à celle des laits d’autres espèces (Ramet, 1994). En
été, la teneur en eau du lait augmente et donc sa matière sèche diminue davantage
sous l’effet du stress hydrique. En outre, il a été montré que le passage d’un régime
hydraté à un régime pauvre en eau entraîne une chute de la teneur en matière sèche
totale de 8.8 à 14.3 % et qu'en cas de privation ou d’abreuvement insuffisant, la teneur
en eau du lait camelin augmente et passe de 87 à 91 % (Yagil et Etzion, 1980a).
47
4. Résultats et discussion
La teneur moyenne en matière grasse du lait analysé se situe autour de 39.39
g/l. Elle est plus forte que celles du lait de vache (32.44 g/l). Elle se situe entre des
valeurs extrêmes, relevées pour la race Somali avec 56 g/l selon Karue (1994), et pour
la race Wadah avec une valeur de 24.6 g/l selon Mehaia (1995).
Il est établi qu’en dehors de la race, le rang de la traite influe sur le taux de
matière grasse. En effet, la traite du matin donne un lait relativement pauvre en
matière grasse par rapport à celui des autres traites, bien que quantitativement plus
important (Kamoun, 1994).
Les résultats consignés indiquent une teneur moyenne en protéines totales
égale à 26,58 g/l. Celle-ci est inférieure de celles du lait de vache (29.16 g/l).
Le taux relevé lors de la présente étude se situe dans la fourchette des travaux
cités par Mohamed et al (1989) et Gnan et al (1994) à savoir 46 g/l et 21.5 g/l
respectivement. Il est comparable aux valeurs rapportées par Mehaia et al (1995) pour
les races Majaheem et Hamra (29.1 g/l et 25.2 g/l).
La teneur moyenne en caséines des échantillons de lait analysés est égale à
22,46 g/l. Elle se rapproche un peu de celle des caséines de lait de vache d’une valeur
égale à 24.22 g/l.
La teneur en caséines camelines enregistrée lors de ces investigations semble
se rapprocher de celle rapportée par Kihal et al (1999), en Algérie avec 24.53 g/l.
Cette teneur est également similaire à celle enregistrée par Kamoun (1995), soit entre
19 et 23 g/l.
Les sels minéraux présents dans le lait de chamelle sont aussi diversifiés que
ceux rencontrés dans le lait de vache. On y dénombre en effet des macro et des oligo-
éléments qui se trouvent sous forme de sels (phosphates, chlorures et citrates) ou de
métaux divers (sodium, potassium, magnésium, calcium, fer, cuivre, zinc...etc.).
Au niveau quantitatif, si la composition en macroéléments (Na, K, Ca, Mg…)
est relativement similaire à celle du lait de vache, le lait camelin se caractérise
néanmoins par des taux plus élevés en oligo-éléments. Ces résultats concordent avec
ceux de Yagil et Etzion (1980a), Elamin et Wilcox (1992) et Mehaia et al (1995)
48
4. Résultats et discussion
Le lait de chamelle se singularise par sa richesse relative en vitamine C.
Même si des variations importantes (de 25 à 60 mg/l) de la teneur de cette dernière
dans les laits camelin sont rapportés (Farah, 1993), il n’en demeure pas moins que les
teneurs signalées (autour de 36 mg/l selon Farah et al., 1992) sont en moyenne 3 fois
plus élevées que celles présentes dans le lait de vache, qui ne dépassent pas 22 mg/l
(Mathieu ; 1998).
Ces résultats sont en parfait accord avec ceux trouvés. En effet, la valeur
moyenne en vitamine C du lait de chamelle collecté est de 42.62 mg/l, et celle du lait
de vache n’est que de 20.26 mg/l (Farah, 1993).
Cette caractéristique est particulièrement intéressante, car elle permet au lait
de cette espèce, par son apport important en cette vitamine, de répondre aux besoins
nutritionnels, aussi bien du jeune chamelon que des populations locales, qui vivent
dans un environnement où l’apport en ce type de vitamine est particulièrement limité
(Farah, 1993). Au point de vue apport alimentaire, le lait de chamelle devrait par
conséquent, être classé parmi les produits ayant une grande valeur nutritive et pourrait
de ce fait répondre en grande partie aux besoins nutritionnels de la population du sud
du pays.
4.2. Identification des souches L’objectif principal de cette deuxième partie est l’identification phénotypique
des souches cultivables isolées à partir des différents échantillons du lait cru de
chamelle. La caractérisation complète pour certaines souches est faite sur la base des
diverses réponses enregistrées aux différents tests tant microbiologiques que
biochimiques.
En premier lieu, il est indispensable d’obtenir des isolats purs et en deuxième
lieu l’application de divers examens nous permettront une pré identification qui sera
par la suite affinée pour aboutir à l’espèce, et à la sous espèce dans certains cas.
L’identification de l’espèce repose sur la comparaison de divers caractères
phénotypiques de la souche à étudier vis à vis de ceux d’une souche de référence.
La classification phénotypique utilise un faible nombre de caractères
considérés comme importants tels que la morphologie, la mise en évidence d’un
caractère biochimique, l’habitat. Mais elle ne reflète qu’un nombre réduit
d’information, les caractères considérés comme importants sont subjectifs et
49
4. Résultats et discussion dépendent des conditions environnementales. Il faut garder à l’esprit que ces
caractères peuvent être absents notamment chez les souches mutantes.
Pour notre étude, l’identification des souches s’est basée selon la clé
dichotomique (Carr et al., 2002) (Figure 1).
4.2.1. Obtention des isolats purs L'isolement des bactéries lactiques se fait à partir de boîtes de Pétri contenant
un nombre de colonies compris entre 50 et 100.
Les caractéristiques morphologiques et phénotypiques des colonies des
souches développées sur M17 et MRS sont notées. Cette caractérisation des souches
est basée sur le manuel de Bergey de systématique bactériologique (Sneath et al.,
1986).
Dans le but d'écarter tout ce qui ne peut pas être une bactérie lactique, la
coloration de Gram a été effectuée pour s'assurer qu'il n'y avait eu aucune
contamination avec les microorganismes à Gram négatif.
Bactéries lactiques: Gram+, cat-
- Production
- Arginine + Cocci Bâtonnets
Tétrades + -
Pediococcus - 45°C +
10°C + -
Lactococcus Enterococcus Streptococcus
NaCl 6.5%
+ -
- 15°C +
Thermobacterium Spreptobacterium
Leuconostoc Betabacterium
Bâtonnets Cocci
Figure 1: Schéma de différenciation des bactéries lactiques 10°C: croissance à 10°C; 15°C: croissance à 15°C, 45°C: croissance à 45°C; 6.5% NaCl: croissance en présence de 6.5% NaCl; arginine: hydrolyse de l’arginine; +: réaction positive; -: réaction négative.
50
4. Résultats et discussion
Après purification des isolats et obtention de souches pures. Les isolats,
cultivés (30°C, 24 h) dans des tubes à essais contenant le milieu de culture approprié
(M17 agar ou MRS solide), subissent le test de production de la catalase.
La caractérisation macroscopique, permet de décrire l'aspect les colonies
obtenues sur milieu solide et de retrouver les critères relatifs aux colonies des
bactéries lactiques (taille, pigmentation, contour, aspect, viscosité). Pour les souches
isolées, les colonies sont petites d'environ 1mm de diamètre, de couleur blanchâtre ou
laiteuse, avec une surface lisse et un pourtour circulaire régulier).
L’observation microscopique révèle la présence de plusieurs formes et
associations cellulaires. Certaines ont la forme de cocci, tandis que pour d’autres c’est
la forme bâtonnet. Les cellules sont soit isolées, en paires (diplocoques), ou en
chaînettes.
4.2.2. Identification phénotypique Les méthodes phénotypiques appliquées sont basées sur des caractères
morphologiques, biochimiques, enzymatiques et physiologiques, y compris les
températures de croissance. L’étude de leur comportement dans différentes conditions
de culture, leur production de divers métabolismes et enzymes spécifiques et diverses
autres aptitudes particulières (Curk et al., 1994).
L'identification classique et la caractérisation par les paramètres
physiologiques et biochimiques sont basées sur les méthodes de Hastings et
Holtzapfel (1987). Pour le genre Lactobacillus, l’emploi des méthodes décrites par
Schillinger et Lücke (1987), Sanz et al., (1988), Hugas et al., (1993), et Samelis et al.,
(1994) sont appliquées.
Pour les bactéries lactiques, les critères de biotypages les plus utilisés pour
une taxonomie phénotypique peuvent être résumés comme suit:
la croissance à différentes températures (15°C, 37°C et 45°C); l'aptitude à croître en présence de 4% et 6,5% de Na Cl, l'aptitude à croître à pH 9.6, la production de gaz, l'hydrolyse de l'arginine, l'utilisation du citrate, la production de dextrane à partir du saccharose, la production d'acétoïne à partir du glucose;
51
4. Résultats et discussion
la croissance en présence de bleu de méthylène (Test de Sherman); la fermentation des carbohydrates.
Tous les résultats obtenus grâce à ces différents tests vont nous diriger en
premier lieu vers le genre et en deuxième lieu l’espèce.
Pour notre travail, nous n’avons retenu que les bactéries qui arborent les
caractéristiques propres aux bactéries lactiques c’est-à-dire cellules à Gram positif,
catalase négative et bâtonnets asporulants.
Cette première approche nous a permis d’isoler 55 souches de bactéries
lactiques. Ce premier screening comprend les genres lactiques Lactococcus,
Lactobacillus et Enterococcus). Les 55 isolats retenus ont été rattachés à 3 genres
distincts et distribués par ordre de dominance comme suit: Lactobacillus (28
isolats, 50.90 %), Lactococcus (15 isolats, 27.27 %), et Enterococcus (12 isolats,
21.81 %).
Les bactéries du genre Enterococcus ont la même morphologie que les
lactocoques et elles peuvent être différenciées de ces derniers par leur capacité de se
développer à 10°C et à 45°C et en milieu liquide contenant 6,5% NaCl, de croître à
pH 9,6, et de réduire le milieu lait contenant 0,1% de bleu de méthylène (Schleifer et
al., 1985; Mundt, 1986; Schillinger et Lücke, 1987; Schleifer et Kilpper-Balz, 1987;
Hartman et al., 1992; Devriese et Pot, 1995; Hardie et Whiley, 1995).
L’emploi des galeries API CH (bioMérieux, Marcy l‘étoile, France) nous a
permis d’identifier les souches de bactéries lactiques en cours de croissance.
Les résultats obtenus sont enregistrés, le profil biochimique ainsi obtenu peut
être lu grâce à un logiciel d‘identification APILAB (bioMérieux, Marcy l‘étoile,
France).
Les tableaux 4, 5, 6 et 7 regroupent l’ensemble des résultats de la fermentation
des carbohydrates.
Légende des tableaux : MDX : Méthyl β D-Xylopyranoside
GNT : Potassium Gluconate MDM : Méthyl α D-Mannopyranoside
2KG : Potassium 2-céto gluconate MDG: Méthyl β D-Glucopyranoside
5KG : Potassium 5-céto gluconate NAG: N-Acétyl Glucosamine
52
4. Résultats et discussion Tableau 4: Profils fermentaires des cocci
Hydrates de C DU13
Z92 H6 H14 DU11 DU17 DU18 M11 M8 M4 H16 DU194
Z93 H8 M6 Témoin - - - - - - - - - - - - - - - Glycérol
-
-
- -
- - - -
-
-
+
+
+
+
+ D-Arabinose - - - - - - - - - - - - - - -
L-Arabinose + + + + + + + + + + + + + + + D-Ribose + + + + + + + + + + + + + + + D-Xylose - - - - - - - - - - + + + + + L-Xylose - - - - - - - - - - - - - - - D-Adonitol - - - - - - - - - - - - - - - MDX - - - - - - - - - - - - - - - D-Galactose + + + + + + - + + + + + + + + D-Glucose + + + + + + - + + + + + + + + D-Fructose + + + + + + + + + + + + + + + D-Mannose + + - - + + + + + + + + + + + L-Sorbose - - - - - - - - - - - - - - - L-Rhanmose - - + - - - - - - - + + + + + Dulcitol - - - - - - - - - - - - - - - Inositol - - - - - - - - - - - - - - - D-Mannitol + + + - - - - + + - + + + + + D-Sorbitol - - + - - - - - - - + + + + + MDM - - - - - - - - - - + + + + + MDG - - - - - - - - - - - - - - - NAG + + + + + + + + + + + + + + + Amydaline + + - + + + + + + + - - - - - Arbutine + + - + + + + + + + + + + + + Esculine + + + + + + + + + + + + + + + Salicine + + + + + + + + + + + + + + + D-Celiobiose + + + + + + + + + + + + + + + D-Maltose + + + + + + + + + + + + + + + D-Lactose + + + + + + + + + + + + + + + D Meliobiose - - - + - - - - - - + + + + + D Saccharose + + + + + + + + + + + + + + + D-Trehalose + + + + + + + + + + + + + + + Inuline - - - - - - - - - - - - - - - D-Mélézitose - - - - - - - - - - - - - - - D-Raffinose - - - - - - - - - - + + + + + Amidon + + - - - - - + + - - - - - - Glycogène - - - - - - - - - - - - - - - Xylitol - - - - - - - - - - - - - - - Gentiobiose + + + - + + + + + + + + + + + D-Turanose - - - - - - - - - - - - - - - D-Lyxose - - - - - - - - - - - - - - - D-Tagatose - - - - - - - - - - + + + + + D-Fucose - - - - - - - - - - - - - - - L-Fucose - - - - - - - - - - + + + + + D-Arabitol - - - - - - - - - - - - - - - L-Arabitol - - - - - - - - - - - - - - - GNT - - - - - - - - - - + + + + + 2KG - - - - - - - - - - - - - - - 5KG - - - - - - - - - - - - - - - Identification biochimique
Lactococcus lactis
53
4. Résultats et discussion
Tableau 5: Profils fermentaires des cocci
Hydrates de C Z86 Z87 Z94 H7 H13 H15 H18 H23 M3 M7 M9 M13
Témoin - - - - - - - - - - - - Glycérol - - - - - - - - - - - - Erythritol - - - - - - - - - - - - D-Arabinose - - - - - - - - - - - - L-Arabinose + + + + + + + + + + + + D-Ribose + + + + + + + + + + + + D-Xylose + - - - - - - - + + - - L-Xylose + - - - - - - - + + - - D-Adonitol - - - - - - - - - - - - MDX - - - - - - - - - - - - D-Galactose + + + + + + + + + + + + D-Glucose + + + + + + + + + + + + D-Fructose + + + + + + + + + + + + D-Mannose + + + + + + + + + + + + L-Sorbose - - - - - - - - - - - - L-Rhanmose - - - - - - - - - - - - Dulcitol - - - - - - - - - - - - Inositol - - - - - - - - - - - - D-Mannitol - - - - - - - - - - - - D-Sorbitol - - - - - - - - - - - - MDM - - - - - - - - - - - - MDG - - - - - - - - - - - - NAG + + + + + + + + + + + + Amydaline + + + + + + + + + + + + Arbutine + + + + + + + + + + + + Esculine + + + + + + + + + + + + Salicine + + + + + + + + + + + + D-Celiobiose + + + + + + + + + + + + D-Maltose + + + + + + + + + + + + D-Lactose + + + + + + + + + + + + D Meliobiose + - - - - - - - + + - - D Saccharose + + + + + + + + + + + + D-Trehalose + + + + + + + + + + + + Inuline - - - - - - - - - - - - D-Mélézitose - - - - - - - - - - - - D-Raffinose - - - - - - - - - - - - Amidon - - - - - - - - - - - - Glycogène - - - - - - - - - - - - Xylitol - - - - - - - - - - - - Gentiobiose + + + + + + + + + + + + D-Turanose - - - - - - - - - - - - D-Lyxose - - - - - - - - - - - - D-Tagatose - - - - - - - - - - - - D-Fucose - - - - - - - - - - - - L-Fucose - - - - - - - - - - - - D-Arabitol - - - - - - - - - - - - L-Arabitol - - - - - - - - - - - - GNT - - - - - - - - - - - - 2KG - - - - - - - - - - - - 5KG - - - - - - - - - - - - Identification biochimique
Enterococcus faecium
54
4. Résultats et discussion
Tableau 6: Profils fermentaires des lactobacilles
Hydrates de C DU10 DU15 Z89 H12 H20 M5 M14 M10 DU12 Z91 H10 M2 M12 H21 Témoin - - - - - - - - - - - - - - Glycérol - - - - - - - - + + + + + + Erythritol - - - - - - - - - - - - - - D-Arabinose + - - - - - - - - - - - - - L-Arabinose + + + + + + + + + + + + + + D-Ribose + + + + + + + + + + + + + + D-Xylose - - - - - - - + + + + + + + L-Xylose - - - - - - - - - - - - - - D-Adonitol - - - - - - - - - - - - - - MDX - - - - - - - - - - - - - - D-Galactose - + + + + + + + + + + + + + D-Glucose + + + + + + + + + + + + + + D-Fructose + + + + + + + + + + + + + + D-Mannose - + + + + + + + + + + + + + L-Sorbose - - - - - - - - - - - - - - L-Rhanmose + - - - - - - - - - - - - - Dulcitol - - - - - - - - - - - - - - Inositol - - - - - - - - - - - - - - D-Mannitol + + + + + + + + - - - - - - D-Sorbitol + + + + + + + + - - - - - - MDM + + + + + + - - - - - - - MDG + - - - - - - - - - - - - - NAG + + + + + + + + + + + + + + Amydaline + + + + + + + + + + + + + + Arbutine + + + + + + + + + + + + + + Esculine - + + + + + + - + + + + + + Salicine + + + + + + + + + + + + + + D-Celiobiose + + + + + + + + + + + + + + D-Maltose + + + + + + + + + + + + + + D-Lactose + + + + + + + + + + + + + + D Meliobiose + - - - - - - + + + + + + + D Saccharose + + + + + + + + + + + + + + D-Trehalose + - - - - - - + + + + + + + Inuline - - - - - - - - - - - - - - D-Mélézitose + + + + + + + + + + + + + + D-Raffinose - - - - - - - + - - - - - - Amidon - + + + + + + - - - - - - - Glycogène - + + + + + + - - - - - - - Xylitol - - - - - - - - - - - - - - Gentiobiose + + + + + + + + + + + + + + D-Turanose - - - - - - - + - - - - - - D-Lyxose - - - - - - - - - - - - - - D-Tagatose - - - - - - - + + + + + + + D-Fucose - - - - - - - - - - - - - - L-Fucose - - - - - - - - + + + + + + D-Arabitol - - - - - - - - - - - - - - L-Arabitol - - - - - - - - - - - - - - GNT - + + + + + + - + + + + + + 2KG - - - - - - - - - - - - - - 5KG - - - - - - - - - - - - - - Identification biochimique
Lactobacillus plantarum Lactobacillus brevis
55
4. Résultats et discussion
Tableau 7: Profils fermentaires des lactobacilles
Hydrates de C M1 H19 M3 M4 H11 DU1 Z90 Z88 H5 H9 H17 M7 M9 M13
Témoin - - - - - - - - - - - - - - Glycérol - - - - - - - - - - - - - - Erythritol - - - - - - - - - - - - - - D-Arabinose - - - - - - - - - - - - - - L-Arabinose - - + + - - - - - - - + + + D-Ribose + + + + + + + + + + + + + + D-Xylose - - + - - - - - - - - + - - L-Xylose - - + - - - - - - - - + - - D-Adonitol - - - - - - - - - - - - - - MDX - - - - - - - - - - - - - - D-Galactose - - + + - - - + + + + + + + D-Glucose + + + + + + + + + + + + + + D-Fructose + + + + + + + + + + + + + + D-Mannose + + + + + + + + + + + + + + L-Sorbose - - - - - - - - - - - - - - L-Rhanmose - - - - - - - - - - - - - - Dulcitol - - - - - - - - - - - - - - Inositol - - - - - - - - - - - - - - D-Mannitol - - - - - - - - - - - - - - D-Sorbitol - - - - - - - - - - - - - - MDM - - - - - - - - - - - - - - MDG - - - - - - - + + + + - - - NAG + + + + + + + + + + + + + + Amydaline - - + + - - - - - - - + + + Arbutine - - + + - - - - - - - + + + Esculine + + + + + + + + + + + + + + Salicine - - + + - - - + + + + + + + D-Celiobiose - - + + - - - + + + + + + + D-Maltose + + + + + + + + + + + + + + D-Lactose - - + + - - - + + + + + + + D Meliobiose - - + - - - - - - - - + - - D Saccharose - - + + - - - - - - - + + + D-Trehalose + + + + + + + + + + + + + + Inuline - - - - - - - - - - - - - - D-Mélézitose - - - - - - - - - - - - - - D-Raffinose - - - - - - - - - - - - - - Amidon - - - - - - - - - - - - - - Glycogène - - - - - - - - - - - - - - Xylitol - - - - - - - - - - - - - - Gentiobiose - - + + - - - - - - - + + + D-Turanose - - - - - - - - - - - - - - D-Lyxose - - - - - - - - - - - - - - D-Tagatose - - - - - - - - - - - - - - D-Fucose - - - - - - - - - - - - - - L-Fucose - - - - - - - - - - - - - - D-Arabitol - - - - - - - - - - - - - - L-Arabitol - - - - - - - - - - - - - - GNT + + - - + + + - - - - - - - 2KG - - - - - - - - - - - - - - 5KG - - - - - - - - - - - - - - Identification biochimique
Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus curvatus
56
4. Résultats et discussion - Genre Lactococcus
Toutes les bactéries qui se présentent sous la forme cocci et possédant les
caractéristiques suivantes: aucune croissance à pH 9.6, à 45°C et en présence de 6.5 %
de NaCl ont été classés dans le genre Lactococcus.
La croissance en présence de 6.5% de NaCl, à 45°C et à pH 9.6 est un signe
caractéristique du genre Enterococcus.
Le genre Lactococcus comprend plusieurs espèces et sous espèces. Trois tests
sont employés pour l’identification complète des lactocoques; la production d'ADH
et/ou d'acétoïne, croissance ou absence de croissance en présence de 4% de NaCl.
La réponse à ces tests nous permet de les subdiviser en espèces, sous-espèces
et biovar.
Les résultats obtenus nous ont permis de relever trois génotypes.
ADH+ et acétoïne+: 10 isolats de Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis.
ADH+ et acétoïne-: 4 isolats de Lc. lactis subsp. lactis (croissance positive à 4%
NaCl).
ADH- et acétoïne+: 1 isolat de Lc. lactis subsp. cremoris (utilisant très peu de
carbohydrates) (DU18).
Il est important de signaler qu’un seul isolat est identifié en tant que
Lactococcus lactis subsp.cremoris. Cette sous-espèce devient rare dans les pays
industrialisés. Le milieu Reddy solide permet de faire la différence entre Lc. lactis
subsp. lactis et Lc. lactis subsp. cremoris, cette différenciation est basée sur la couleur
des colonies obtenues sur ce milieu. Lc. lactis subsp. lactis donnent des colonies
blanches alors que pour Lc. lactis subsp. cremoris nous obtenons des colonies jaunes
(Huggins, 1984; Vedamuthu et al., 1992).
Une étude comparative entres des souches de lactocoques sauvages et des
souches industrielles pour les besoins en acides aminés a montré que la sous-espèce
cremoris industrielle a besoin de neuf à dix acides aminés, tandis que les souches
sauvages la sous-espèce lactis aussi bien que cremoris, ont eu besoin seulement d'un à
de trois acides aminés (Ayad et al., 1999).
57
4. Résultats et discussion Genre Lactobacillus.
28 isolats de lactobacilles sont isolés. Normalement, ils sont différenciés par
leur type de fermentation des carbohydrates mais le profil de la fermentation de ces
isolats a été comparé avec celles de souches de référence dans la clé d'identification
de Bergey (Kandler et Weiss, 1986) et des différences considérables ont été notées.
- bâtonnets homofermentaires mésophiles (15 souches),
- bâtonnets homofermentaires thermophiles (7 souches)
- bâtonnets hétérofermentaires mésophiles (8 souche).
Les résultats obtenus lors de la fermentation des carbohydrates nous ont
permis de les répartir en 4 espèces.
Groupe mésophiles et homofermentaires
Les isolats de ce groupe fermentent les hexoses en produisant exclusivement
du lactate et ne produisent pas du gaz à partir du glucose. Ils peuvent fermenter les
pentoses. Les streptobactéries ou bâtonnets du groupe 4 sont des espèces de
lactobacilles qui sont homofermentaires et peuvent être groupées et identifiées comme
suit. Elles se développent à la température de 15°C et pas 45°C (Schillinger et Lücke,
1987; Singleton et Sainsbury, 1987). Il y a quelques exceptions, Lactobacillus
fermentum est capable de pousser à 45°C (Sharpe, 1962).
Sur la capacité de fermenter le mannitol, les streptobactéries sont divisées en
deux groupes principaux (Schillinger et Lücke, 1987). Le groupe mannitol positif
renferme les espèces: Lb. carnis, Lb. piscicola, Lb. coryniformis, Lb. plantarum, Lb.
casei subsp. casei, Lb. casei subsp. rhamnosus, Lb. maltaromicus, Lb. casei subsp.
pseudoplantarum, et Lb. agilis.
Le groupe mannitol négatif comprend: Lb. bavaricus, Lb. sake, Lb. curvatus,
Lb. casei subsp. tolerans, Lb. yamanashiensis, Lb. amylophilus, Lb. farciminis et Lb.
sharpeae. Ceux qui fermentent le mannitol peuvent être encore séparés par la
production de l'ammoniaque (Schillinger et Lücke, 1987; Singleton et Sainsbury,
1987)
Groupe thermophiles et homofermentaires
Les isolats de ce groupe fermentent les hexoses en produisant exclusivement
du lactate, mais ne fermentent pas les pentoses. Lb. delbrueckii (7 souches).
58
4. Résultats et discussion
Groupe hétérofermentaires
Les isolats de ce groupe fermentent les hexoses en lactate, en acétate et/ou en
éthanol et CO2. Les sept espèces isolées sont rattachées à Lactobacillus brevis
4.2.3. Identification moléculaire Une électrophorèse sur gel d’agarose est réalisée dans le but de déterminer la
concentration des produits de PCR et d’ADN génomique de DU10 (avant de les
envoyer pour un séquençage).
Les bandes 2 et 3 représentent les produits de PCR de souches Indiennes de
Lb. plantarum préparés par mes collègues aux laboratoires de Pondichéry afin de les
comparer avec les concentrations de nos échantillons.
La figure 2 montre en effet que les concentrations sont satisfaisantes grâce à
l’apparition d’une large bande « 5 » non diffusée sur le gel d’agarose.
Le poids moléculaire élevé de l’ADN génomique possède une migration assez
lente comparant au produit de PCR.
L’isolat DU10 est identifié comme étant : Lactobacillus plantarum DU10
phylogénétiquement par le séquençage de l’ARN 16S, vu qu’il représente 99% de
similarité avec les souches apparentées.
Dans toutes études phylogénétiques ou d’identification bactérienne, le choix
de la sémantide pour la construction de l’arbre phylogénétique est indispensable. De
toute manière, le gène de l’ADNr 16S reste la sémantide la plus largement utilisé car,
elle est représentée dans les banques de données.
Durant notre étude, l’analyse phylogénétique préliminaire a été effectuée par
l’utilisation du logiciel MEGA. Les relations phylogénétiques des souches ont été
comparées par la construction d’arbres phylogénétiques du gène amplifié de l’ADNr
16S. Deux bases de données ont été utilisées, il s’agit de la base de données RDP
(Ribosomal Database Project II) ou de la base de données de Genbank.
59
4. Résultats et discussion
Figure 2: Électrophorèse sur gel de DU10
1: Marqueur de taille, 2 et 3: Produit de PCR de souches Lb. plantarum d’origine Indienne, 4: ADN génomique, 5: Produit de PCR de la souche Lb. plantarum DU10.
Figure. 3: Arbre phylogénétique de Lactobacillus plantarum DU10.
P
G
60
4. Résultats et discussion
L’isolat DU10 est identifié comme étant Lactobacillus plantarum DU10
phylogénétiquement par le séquençage de l’ARN 16S, vu qu’il représente 99% de
similarité avec les souches apparentées.
La séquence originale reçue des laboratoires Microsynth est la suivante : GCTATANTGCAGTCGACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGC ATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTG AGTGAAGAAG GGTTTCGGCT CGTAAAACTC TGTTGTTAAAGAAGAACATA TCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGC GAGCGCAGGC GGTTTTTTAA GTCTGATGTG AAAGCCTTCG GCTCAACCGAAGAAGTGCAT CGGAAACTGG GAAACTTGAG TGCAGAAGAG GACAGTGGAA CTCCATGTGTAGCGGTGAAA TGCGTAGATA TATGGAAGAA CACCAGTGGC GAAGGCGGCT GTCTGGTCTGTAACTGACGC TGAGGCTCGA AAGTATGGGT AGCAAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCCATACCGTAAA CGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCA CAAGCGGTGG AGCATGTGGT TTAATTCGAA GCTACGCGAA GAACCTTACCAGGTCTTGAC ATACTATGCA AATCTAAGAG ATTAGACGTT CCCTTCGGGGA
La séquence est par la suite déposée dans la banque de données internationale
GenBank, et un numéro d’accession unique lui est attribué: KF724943.
L’alignement des séquences des gènes de différentes souches étudiées est
effectué par l’utilisation du logiciel Clustal W (Thompson et al., 1994) et corrigé
manuellement par l’utilisation du logiciel Chromas Pro si nécessaire . Le programme
de Gblocks (Castresana, 2000) a été utilisé pour éliminer les positions trop
divergentes ou qui contiennent beaucoup de caractères manquants. Les relations
phylogénétiques des séquences alignées ont été déduites en utilisant l'algorithme
PHYML de maximum de vraisemblance (Guindon et Gascuel, 2003) sous le modèle
de l’évolution et de substitution nucléotidique GTR. Ainsi, pour déterminer la fiabilité
de l’arbre construite, les valeurs de réplication de bootstrap ont été répétées 500 fois.
61
4. Résultats et discussion
Figure 4: Dépôt de la séquence DU10 sur NCBI
62
4. Résultats et discussion
En utilisant le programme BLAST (Basic Local Alignment Search Tool),
toutes les espèces bactériennes sont identifiées après avoir reçu les séquences
nucléotidiques brutes des Laboratoires Suisse Microsynth, en voici quelques unes :
Lactobacillus curvatus H17
ATGCTGATTATAGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCACTCTCGTTAGATTGAAGAAGCTTGCTTCTGATTGATAACATTTGAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTAAAGTGGGGGATAACATTTCGGAAACAGATGCTAATACGGCATAAAACCTAACACCGCATGGTGCAAGGTTGCCCGATGGTTTCGGCTATCACTTTAGGATGGACCCGCGGTGCATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGACCGTGATGCATAGCCGACCTGAGAGTGTAATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTGTCGGATCGTAAAACTCTGCAGTTGGAGAAGAACGTATTTGATAGTAACTGATCAGGTAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAAGCGGTATCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGCAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGATGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGACAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACGCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGATGAAACTCAAAGGAATTGACCCGTGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGACGAACCTTACCAGGTCT
Figure 5: Arbre phylogénétique de Lactobacillus curvatus H17
63
4. Résultats et discussion
Lactobacillus brevis M2
GCACGAGCTTCCGTTGAATGACGTGCTTGCACTGATTTCAACAATGAAGCGAGTGGCGAAACACGTGGGAAATCTGCCCAGAAGCAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAACAAAATCCGCATGGATTTTGTTTGAAAGGTGGCTTCGGCTATCACTTCTGGATGATCCCGCGGCGTATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCCCACCTTGACGATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGATGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACACCTTTGAGAGTAACTGTTCAAGGGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTACCAGGCAAGCGTTGTCCAGCTTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTAGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGACCCTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAATCTTAGAGATAAGACGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTT
Figure 6: Arbre phylogénétique de Lactobacillus brevis M2
64
4. Résultats et discussion
Enterococcus faecium Z86
GCAGTCGACGCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGATATAACAATCGARACCGCANTGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGT
Figure 7: Arbre phylogénétique d’Enterococcus faecium Z86
65
4. Résultats et discussion
Enterococcus faecium Z87
ATGCAGTCGACGCTTCTTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGG
Figure 8: Arbre phylogénétique d’Enterococcus faecium Z87
66
4. Résultats et discussion
4.3. Caractéristiques de la souche sélectionnée Parmi la cinquantaine de bactéries lactiques identifiées du lait de chamelle de
la région d’Ouargla, seule la souche Lactobacillus plantarum DU10 est retenue pour
la présente étude.
En premier lieu, nous avons axé notre travail sur 4 souches ; Lactococcus
lactis M8, Lactobacillus plantarum DU10, Enteroccus faecium Z86 et Enterococcus
faecium H23.
L’étude a porté principalement sur leur activité antimicrobienne contre la
souche Listeria monocytogenes ATCC 15313, les résultats obtenus sont reportés sur le
tableau 8.
Tableau 8 : Activité antimicrobiennes des souches sélectionnées
Souche testée Diamètre d’inhibition
Lactococcus lactis M8 10 mm
Lactobacillus plantarum DU10 18 mm
Enteroccus faecium Z86 15 mm
Enterococcus faecium H23 12 mm
A la lecture des résultats obtenus et sur l’importance de l’inhibition causée par
Lactobacillus plantarum DU10, pour mieux cerner notre travail nous avons retenu
une seule souche qui est la DU10.
4.3.1. Caractérisation phénotypique Ces tests conduisent à l’identification au stade genre seulement de la bactérie
DU10.
Les colonies apparaissent de petites tailles et brillantes à contour régulier sur
la boite de pétri (Figure 9). Le test de catalase est négatif et le Gram positif. Sous
microscope, les colonies apparaissent sous forme de bâtonnets liés ou dispersés
(Figure 10).
67
4. Résultats et discussion
4.3.2. Tests d’identification biochimique Les résultats de fermentation des sucres présents sur la galerie API 50 CHL
révèlent que la bactérie en question appartient au genre Lactobacillus, et proche de
l’espèce Lb. plantarum.
4.3.3. Antibiogramme Cette bactérie est sensible à la plupart des antibiotiques à part la polymyxine,
kanamycine, sulfphafurazole, céfpodoxime et la vancomycine (Tableau 9).
Plusieurs publications rapportent la résistance naturelle de Lactobacillus
plantarum à certains antibiotiques, comme la pénicilline G, l’ampicilline, la
vancomycine, le chloramphenicol et la ciprofloxacine.
Ces résultats sont en concordance avec le nôtres, sauf pour la vancomycine
(Halami et al., 2000; Coppola et al., 2005). Cet antibiotique fait partie des
glycopeptides et agit en inhibant la synthèse du peptidoglycane qui est un constituant
structural important pour la membrane bactérienne. Par conséquent, les bactéries
lactiques sont particulièrement vulnérables au traitement par vancomycine (Reynolds,
1989).
68
4. Résultats et discussion
Figure 9: Colonies de DU10 sur boite de Pétri
Figure 10: Aspect microscopique de DU10
Tableau 9: Antibiogramme de la souche DU10
Antibiotique (Concentration (µg/disque)
Résultat Antibiotique Concentration (µg/disque)
Résultat
Chloramphenicol Amoxicilline Vancomycine Gentamycine Oxytétracycline Erythromycine Amikacine Pénicilline Céfpodoxime Néomycine
30 10 30 10 30 10 30 10 10 30
S S R S S S S S R S
Méticilline Novobiocine Kanamycine Rifampicine Tétracycline Ampicilline Polymyxine Sulfphafurazole Ciprofloxine
30 30 30 30 5 10 300 300 5
S S R S S S R R S
S= Sensible, R=Résistante
69
4. Résultats et discussion
4.4. Propriétés probiotiques de la souche sélectionnée Lactobacillus plantarum fait partie des quelques lactobacilles impliqués à la
fois dans la production d'aliments fermentés et résidant habituellement dans le tractus
intestinal. Sa parfaite innocuité l'autorise dans les applications alimentaires.
En 2001, l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) et l'Organisation des
Nations unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) ont donné une définition
officielle des probiotiques qui sont des « micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont
ingérés en quantité suffisante, exercent des effets positifs sur la santé, au-delà des
effets nutritionnels traditionnels ».
Pour pouvoir acquérir le statut de bactérie probiotique, la souche DU10 doit
posséder certaines caractéristiques, parmi lesquelles l’aptitude à atteindre puis à
survivre dans l'intestin. La réponse aux différents tests effectués va nous aider à
démontrer que la souche Lactobacillus plantarum DU10 peut être considérée comme
bactérie probiotique.
4.4.1. Activité gélatinase et hémolytique Lb. plantarum DU10 n'a montré aucune activité hémolytique ni gélatinase
contrairement à la souche Staphylococcus aureus ATCC 6538 utilisée comme témoin.
Ni de zones claires autour des colonies (β-hémolyse), ni de halos verdâtres (α-
hémolyse) ne sont observés. Ce critère est considéré comme important pour
l'utilisation de cette souche dans l'industrie laitière comme starter (Marroki et
Bousmaha-Marroki, 2014).
4.4.2. Tolérance à la bile La croissance de Lb. plantarum DU10 était normale dans différentes
concentrations de sels biliaires. La souche est donc tolérante à la bile (Figure 11).
Pour être une souche probiotique, une bactérie doit résister à des conditions
difficiles dans les régions de l'estomac et de l'intestin; et doit être capable de coloniser
l'épithélium intestinal. En outre, la réduction de cholestérol est une propriété
particulière de bactéries probiotiques, et qui est indirectement lié à l’activité hydrolase
de la bactérie (Soccol et al., 2010).
70
4. Résultats et discussion
4.4.3. Capacité à réduire le cholestérol L’absorbance à 550nm était de 0.241±0.02 pour le bouillon MRSCHO
(inoculé de 100 µg/ml de cholestérol). Celle de l’échantillon test était de 0.246±0.03.
Le cholestérol résiduel dans le bouillon inoculé MRSCHO (bouillon MRS contenant
0,3% de sels biliaires et 100 µg ml de cholestérol) est de 13,79 µg/ml. Le cholestérol
réduit par la souche DU10 est donc de 86.21 %.
Figure 11: Action des sels biliaires sur la croissance de DU10.
Tableau 10: Effet du suc gastrique artificiel sur la croissance de DU10.
Temps d’incubation (h) pH 2.0 (log ufc/ml) pH 6.0 (log ufc/ml)
0
24
6.99 ± 0.03
6.02 ± 0.01
8.12 ± 0.12
7.67 ± 0.06
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Den
sité
opt
ique
à 5
60 n
m
Temps (h)MRS MRSO (0,05%) MRSO (0,1%)MRSO (0,15%) MRSO (0,3%)
71
4. Résultats et discussion
Figure 12: Apparition de colonies blanches productrices d’EPS.
Cette forte capacité peut être exploitée afin de réduire le taux de cholestérol
sérique en incluant de telles bactéries probiotiques dans les régimes alimentaires dans
le but de réduire les risques de maladies cardiovasculaires.
Les Lactobacilles possèdent cette propriété et réduisent le cholestérol à des
valeurs variables. Dans une étude menée par James et Stanley (1999), l’assimilation
du cholestérol variait entre 0 % pour la souche ATCC 4356 et 50 % seulement pour la
souche ATCC 43121.
4.4.4. Résistance à l’acidité Cette bactérie a pu survivre au suc gastrique artificiel jusqu'à 24 h
d'incubation, mais le nombre de bactéries est plus faible en comparaison au contrôle
(pH 6,0).
Au début, quand Lb. plantarum DU10 est inoculée, le nombre de bactéries
était de 6,99±0,03 log ufc/ml à pH 2,0 et 8,12±0,12 log ufc/ml à pH 6,0 puis réduit à
6,02±0,01 log ufc/ml et 7,67±0,06 log ufc/ml après 24 h.
Ceci démontre que la souche DU10 peut être administrée par voie orale
comme supplément alimentaire.
Dans certaines études menées par Jin et al (1998), une souche de Lactobacilles
a pu survivre à pH 2.0 pendant 2 h d’incubation.
72
4. Résultats et discussion 4.4.5. Production d’exopolysaccharides (EPS)
Les colonies sont apparues de couleur blanche, et non colorées (Figure 11).
Le rouge de ruthénium colore la paroi cellulaire bactérienne des souches non
sécrétrices, ce qui donne des colonies rougeâtres. La production de EPS empêche
cette coloration, et les colonies apparaissent blanchâtres sur les mêmes boites de Pétri
(Stingele et al., 1996).
Les exopolysaccharides jouent un rôle crucial dans l'industrie spécialisée dans
la production de produits fermentés, en particulier pour la production de yaourts, des
yaourts liquides, des fromages, des desserts et des crèmes fermentées à base de lait
(de Vuyst et al., 1999).
4.4.6. Spectre d’activités antibactériennes
Les surnageants exempts de cellules DU10 donnent des halos d’inhibition
autour des souches pathogènes indicatrices. Le diamètre d’inhibition le plus large
obtenu est de 25 mm contre Listeria monocytogenes et L. innocua.
Les résultats obtenus indiquent la capacité de Lactobacillus plantarum DU10
à inhiber les bactéries à Gram positif et à Gram négatif.
Adeniyi (2006) avait utilisé le surnageant de culture de souches Lactobacillus
pour prouver leurs efficacités contre les germes impliqués dans les infections
urinaires.
Similairement, la plantaricine 423 (Van Reenen,1998), et la plantaricine LP84
(Suma,1998) montrent une activité inhibitrice contre les souches pathogènes comme
S. aureus et B. subtilis.
La plantaricine 35d produite par la souche Lb. plantarum avait une forte
action bactériocinogène contre S. aureus et L. monocytogenes (Messi et al., 2001).
Lash (2005) avait décrit une bactériocine produite par Lb. plantarum ATCC
8014 qui inhibait S. aureus, E. coli, L. innocua et P. aeruginosa.
Valenzuela (2008) avait décrit un peptide antimicrobien qui inhibe des
bactéries pathogènes comme B. cereus, E. coli et S. enterica.
Gong et Xie avaient reporté une Plantaricine MG produite par Lb. plantarum
KLDSI 0391 qui inhibait plusieurs pathogènes à savoir L. monocytogenes, S. aureus,
S. thyphimurium et E. coli.
73
4. Résultats et discussion
Xie (2011) quant à lui avait décrit une bactériocine active contre les souches
de Lactobacillus, Listeria, Streptococcus et Pediococcus. La plantaricine LD1
produite par la souche Lactobacillus plantarum LD1 inhibait non seulement les
souches apparentées mais aussi les autres souches à Gram positif et à Gram négatif
comme S. aureus, P. aeruginosa, S. typhi comme décrit par Gupta (2014).
La plantaricine Y produite par Lb. plantarum 510 reporté par Chen (2014),
avait montré une forte activité antimicrobienne contre L. monocytogenes BCRC
14845.
Le surnageant exempte de cellules de Lb. plantarum DU10 donnait des zones
claires autour des souches pathogènes indicatrices. Le plus grand diamètre
d’inhibition est de 25 mm et a été obtenu contre les souches Listeria monocytogenes
et Listeria innocua.
Le tableau 5 indique que la souche DU10 est capable d'inhiber la croissance
des bactéries Gram-positives et Gram-négatives.
Tableau 11: Activité antimicrobienne de DU10
Souches pathogènes testées Sensibilité
Listeria monocytogenes ATCC 15313
Listeria innocua ATCC 33090
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Escherichia coli ATCC 8739
Klebsiella pneumonia ATCC 700603
Salmonella enterica ATCC 14028
Salmonella typhi ATCC 700720
Vibrio fischeri ATCC 700601
Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802
+++
+++
+++
+++
++
+
++
++
+
+
≥ 5 mm = + ++ = 5>x>10 +++ = 10 mm ≤
74
4. Résultats et discussion
Ces résultats prouvent la capacité de Lb. plantarum DU10 à inhiber la
croissance des souches non apparentées.
4.5. Purification des bactériocines Pour purifier la plantaricine MZ, le surnageant de culture exempt de cellule est
soumis à une ultrafiltration à travers une membrane de 10 kDa, puis précipité avec du
sulfate d'ammonium. Le précipitât subit une dialyse et soumis à une colonne de
Sephadex G-25 chromatographie sur gel. La fraction active résultante a été lyophilisée
et dissoute dans un volume minimal de solvant A avant de procéder à une analyse par
HPLC.
Figure 13: Sephadex G-25 chromatogramme
75
4. Résultats et discussion
Figue 14: Chromatogramme de plantaricine M et Z
L'échantillon de bactériocine a été purifié en utilisant la colonne de Sephadex
G-25 chromatographie sur gel, puis élué à un débit de 0,5 ml/min.
Seules les fractions actives allant de 31 à 51 sont prises en considération (voir
flèche à deux sens dans la Figure 13) vu qu’elles présentent une activité
antimicrobienne contre Listeria monocytogenes ATCC 15313.
Lors de l'injection de l'échantillon résultant de Sephadex G-25 dans l'HPLC en
phase inverse, deux pics distincts sont observés, correspondants à un temps de
rétention de 16,90 min et 23,38 min respectivement (Figure 10).
Ces pics sont actifs contre Listeria monocytogenes ATCC 15313 et
Staphylococcus aureus ATCC 6538, et ont été utilisés pour la détermination du poids
moléculaire.
Les échantillons lyophilisés partiellement purifiés sont remis en suspension
dans une quantité minimale de solvant A. Un échantillon de 25 µl est élué en utilisant
un gradient linéaire de 90 % de solvant A [0,1 % (p/v) d'acide trifluoroacétique (TFA)
dans 5 % (v/v) d'acétonitrile dans l'eau] et de 10 % de solvant B (TFA 0,1 % dans de
l'acétonitrile à 100 %) à 42 % et 5 8% de solvants A et B, respectivement, dans les 46
76
4. Résultats et discussion min. Deux pics distincts de plantaricine M et plantaricine Z purifiés sont obtenus à
16,90 min et 23,38 min respectivement.
4.6. Poids moléculaire des bactériocines La détermination du poids moléculaire des bactériocines s’est faite par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et par la méthode de
MALDI-TOF/MS.
4.6.1. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide Le poids moléculaire est estimé en séparant les fractions obtenues après
l’analyse par HPLC en utilisant la méthode de Tricine SDS-PAGE (10%) (Schägger
et Jagow, 1987).
Deux bandes foncées et distinctes sont observés sur le gel, ce qui
correspondait à plantaricine M et plantaricine Z avec un poids moléculaire d'environ
6 kDa et 7 kDa respectivement (Figure 15).
Figure 15: Electrophorèse sur gel Tricine-SDS PAGE de la plantaricine MZ.
A : marqueur de taille B : Apparition de deux bandes C : Halo d’inhibition contre
Listeria monocytogenes ATCC 15313.
77
4. Résultats et discussion 4.6.2. Détermination du poids moléculaire par MALDI-TOF/MS
Les deux biomolécules M et Z sont purifiés jusqu'à homogénéité, et MALDI-
TOF/MS l’avait confirmé, ce qui a facilité la détermination du pois moléculaire
exacte des deux peptides. L'analyse MALDI-TOF, faite à l’unité de biophysique
moléculaire (Institut Indien des Sciences de Bangalore) le 14 novembre 2013 sous la
supervision du Pr. Sunita Prakash, a montré un pic distinct d'environ 6400 m/z, ce qui
indique que le poids moléculaire de la protéine est de 6,3122 kDa (Figure 15).
Le poids moléculaire des peptides est déterminé grâce aux analyses
protéomiques faites à l’unité de biophysique moléculaire à l’Institut Indien des
Sciences de Bangalore (Inde).
L'analyse MALDI-TOF a montré d’un autre coté un pic distinct d'environ
7250 m/z, ce qui indique que le poids moléculaire de la protéine est de 7,1922 kDa
(Figure 16).
D’après la littérature, aucune bactériocine ayant ces deux poids moléculaires
et caractéristiques n’a été décrite auparavant. De ce fait, ces deux biomolécules
peuvent être considérés comme une découverte scientifique.
Des études supplémentaires doivent être faites avant de confirmer leur
nouveauté ou bien leur appartenance à une classe donnée.
78
4. Résultats et discussion
Figue 16: MALDI-TOF/MS de la plantaricine M.
Figue 17: MALDI-TOF/MS de la plantaricine Z
79
4. Résultats et discussion 4.7. Séquençage du N-terminal
Le microséquençage Nt par dégradation d'Edman donne de très bons résultats
et permet d'identifier dans la majoritè des cas la protéine d'intérêt en comparant la
séquence Nt obtenue avec les banques de données. Cependant, l'analyse est plus
problèmatique lorsque la protéine est bloquée en Nt en raison par exemple
d'acétylation, de formylation ou de la présence d'un acide pyroglutamique. Le
microséquençage par dégradation d'Edman est alors impossible. Selon le groupement
chimique bloquant, il est néanmoins possible de déterminer la séquence Nt de la
protéine en réalisant au préalable un déblocage.
Il nous a été reporté de l’institut Indien des sciences de Bangalore (Inde) que
les séquences N-terminal des deux peptides antimicrobiens Plantaricine M et Z étaient
bloqués à l’extrémité et que des expérimentations ultérieures doivent être faites afin
d’y remédier. Des études approfondies seront faites à l’université Norvégienne OSLO
des sciences de la nature pour débloquer les extrémités et les analyser prochainement.
4.8. Action de différents facteurs sur la production de la bactériocine
4.8.1. Effet de la température La plantaricine MZ s'est avéré être résistante à la chaleur de 121 °C pendant
15 min (Tableau 7). A des températures de 60 °C, 70 °C et 80 °C pendant 30 min,
l'activité a été conservée et stable à 100% (Tableau 12). Cela peut constituer un
avantage en vu de son utilisation potentielle en tant qu'additif alimentaire dans des
processus tels que la pasteurisation et le séchage.
Tableau 12: Effet de différents traitements sur l'activité de la plantaricine MZ
Activité de la bactériocine résiduelle %
Température Surfactant pH
60°C, 30min
80°C, 30min
100°C, 30min
121°C, 15min
100
100
100
100
Catalase
Protéinase K
α-Chymotrypsine
Trypsine
Pepsine
Lipase
100
0
0
0
0
100
2.0
6.0
8.0
10.0
100
100
100
100
80
4. Résultats et discussion
4.8.2. Effet du pH Même à des valeurs de pH extrêmes allant de 2 à 10, le pourcentage de l’activité
résiduelle est conservé et stable à 100 %. Ceci est un atout pour une utilisation
industrielle.
4.8.3. Effet des enzymes La plantaricine MZ était sensible à la pepsine, la trypsine, l’α-chymotrypsine
et la protéinase K mais insensible à la catalase (Tableau 7), ce qui confirme que
l'inhibition était due à une molécule protéique (bactériocine). Son activité n'a pas été
réduite par la lipase (Tableau 11).
Dans des études antérieures, la plupart des plantaricines traitées avec de la
trypsine sont inactivés (Gong et al, 2010; González et al, 1994; Jiménez-Díaz et al,
1993; Van Reenen et al, 1998). Le traitement de la plantaricine Y avec de la trypsine
a fourni un résultat similaire en utilisant W. paramesenteroides BRCR 14006 comme
souche indicatrice, mais l'activité inhibitrice a été observée lorsque L. monocytogenes
CRCB 14845 a été utilisé comme souche indicatrice.
Lorsque les deux fractions (plantaricine M et plantaricine Z) sont testées
séparément, aucune activité n’a été détectée, ceci peut être expliqué par le fait que les
deux biomolécules ont une action synergique.
4.9. Optimisation des conditions de biosynthèse des bactériocines Plusieurs recherches avaient démontrées que les facteurs physiologiques
comme la température, pH, salinité et les composants du milieu de culture jouent un
rôle important dans la production de bactériocines par les souches bactériennes
(Anthony et al., 2009 ; Preetha et al., 2007 ; Kabuki et al., 2007).
4.9.1. Effet de la température Les cinétiques de croissance et de production de bactériocines de la souche
DU10 sont testées à différentes températures dans le milieu MRS (Figure 18).
Pour toutes les températures testées, la production de bactériocines ne
commençait que 2 h après l’incubation, la production maximale détectée est de 16.900
UA/ml dans la phase semi-stationnaire à une température de 35°C.
81
4. Résultats et discussion
La production de bactériocines avait ensuite diminué à une valeur de 14.400
UA/ml dans l’intervalle 12 – 14 h d’incubation.
0 5 10 15 20 255
6
7
8
9
10
11
12
13
Croissance bactérienne (LogUFC/ml) Production de bactériocines (UA/ml) Variation du pH
Temps (h)Temp 25°C
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
0 5 10 15 20 255
6
7
8
9
10
11
12
13
Croissance bactérienne (LogUFC/ml) Production de bactériocines (UA/ml) Variation du pH
Temps (h)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
Temp 30°C
0 5 10 15 20 255
6
7
8
9
10
11
12
13
Croissance bactérienne (LogUFC/ml) Production de bactériocines (UA/ml) Variation du pH
Temps (h)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
4,4
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
Temp 35°C
Figure 18 (a): Effet de la température sur la croissance bactérienne, la
production de bactériocines avec variation du pH.
82
4. Résultats et discussion
0 5 10 15 20 255
6
7
8
9
10
11
12
Croissance bactérienne (LogUFC/ml) Production de bactériocines (UA/ml) Variation du pH
Temps (h)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
4,4
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
Temp 40°C
0 5 10 15 20 255
6
7
8
9
10
11
12
13
Croissance bactérienne (LogUFC/ml) Production de bactériocines (UA/ml) Variation du pH
Temps (h)
0
2000
4000
6000
8000
10000
5,5
5,6
5,7
5,8
5,9
6,0
6,1
6,2
6,3
6,4
Temp 45 °C
Figures 18 (b): Effet de la température sur la croissance bactérienne, la
production de bactériocines avec variation du pH.
83
4. Résultats et discussion
Par la suite, la production de bactériocines s’est réduite jusqu’à la fin de la
période d’incubation. Ceci peut être du à différents mécanismes tel que l’agrégation
de protéines, la dégradation protéolytique par des enzymes ou à l’adsorption aux
cellules productrices (Kabuki et al., 2007).
Initialement, le nombre de cellules viables (croissance cellulaire) a augmenté
après 6 h d’incubation pour toutes les températures testées
Le pH du milieu de culture quant à lui avait été réduit de 6.6 à 4.5, indiquant
une production d’acide lactique.
Similairement, la production de bactériocines par S. thermophilus SBT1277
avait augmenté en l’exposant à une température allant de 25°C à 35°C (Kabuki et al.,
2007). La souche DU10 produisait la plus grande valeur à une température de 35°C.
D’un autre coté, la production de bactériocines par la souche S. thermophilus
81 incubée à 30 °C était plus beaucoup plus importante que celle incubée à 42 °C
(Ivanova et al., 1998).
Kim et al (2006) avait reporté que la production par Micrococcus spp. GO5
était plus grande quand la température a été augmentée de 25 ° C à 37 °C.
Les courbes suivantes indiquent la variabilité des trois facteurs (croissance
bactérienne, production de bactériocines et valeur de pH) en fonction des différentes
températures testées.
4.9.2. Effet du pH La production de bactériocines et le taux de cellules viables sont dépendants
au pH du milieu durant la période de fermentation. L’utilisation d’une valeur de pH
contrôlé lors de la fermentation peut induire une augmentation considérable de la
croissance cellulaire ainsi que la production de biomolécules (Herranz et al., 2001).
Dans ce but, l’effet du pH sur la croissance de DU10 et la production de ses
bactériocines a été testé sur milieu MRS (Figure 19).
La valeur maximale de production est de 16900 UA/ml, et le taux de cellules
viables est de 12622 log ufc/ml. Ce résultat a été observé quand la souche DU10 est
incubée à un pH de 6.5, mais l’activité avait diminué à un pH 5.5.
Ces résultats indiquent que le pH de culture avait un effet important sur la
production de bactériocines et la croissance cellulaire.
84
4. Résultats et discussion
0 5 10 15 20 25
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,0
11,5
12,0
12,5
Croissance bactérienne (LogUFC/ml) Production de bactériocines (UA/ml) Variation du pH
Temps
0
2000
4000
6000
8000
10000
pH=5,5
4,7
4,8
4,9
5,0
5,1
5,2
5,3
5,4
5,5
0 5 10 15 20 25
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,0
11,5
12,0
12,5
13,0
Croissance bactérienne (LogUFC/ml) Production de bactériocines (UA/ml) Variation du pH
Temps
2000
4000
6000
8000
10000
12000
pH=6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
Figure 19 (a): Effet du pH sur la croissance bactérienne, la production de
bactériocines avec variation du pH.
85
4. Résultats et discussion
0 5 10 15 20 258,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,0
11,5
12,0
12,5
Croissance bactérienne (LogUFC/ml) Production de bactériocines (UA/ml) Variation du pH
Temps
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
pH=6,5
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
0 5 10 15 20 25
9,0
9,5
10,0
10,5
11,0
11,5
12,0
12,5
Croissance bactérienne (LogUFC/ml) Production de bactériocines (UA/ml) Variation du pH
Temps
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
pH=7
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
Figure 19 (b): Effet du pH sur la croissance bactérienne, la production de
bactériocines avec variation du pH.
86
4. Résultats et discussion
Similairement, le pH optimal pour la production de bactériocines est de 6.5,
avec une valeur maximale de 640 UA/ml obtenue après 5-6 h d’incubation (Kabuki et
al., 2007). Aktypis et al (1998) avaient reporté que la thermophiline T produite par S.
thermophilus ACA-DC était d’une valeur plus importante à pH 6.2 que le pH 6.8.
La production de bacteriocines par E. faecium P13 avait augmenté quatre fois
de plus à un pH de 6.0 (Herranz et al., 2001). En plus, la valeur de 6.5 est le pH
optimale de production pour la souche S. warneri (Prema et al., 2006), L. pentosus
ST71BZ (Todorov and Dicks, 2007) et B. coagulans (Emad, 2008).
Ces résultats démontrent clairement la dépendance de la production de
bactériocines et la croissance cellulaire au pH du milieu de culture pendant la période
de fermentation.
Les courbes suivantes indiquent la variabilité des trois facteurs en fonction des
différentes valeurs de pH:
4.9.3. Effet du NaCl La production de bactériocines et le taux de cellules viables étaient influencés
par la teneur en NaCl dans le milieu de culture MRS (Figure 20).
La valeur optimale de salinité (NaCl) induisant la plus forte production de
bactériocines et cellules viables est de 3% avec un taux maximal de production d’une
valeur de 19600 UA/ml.
Par contre, les autres valeurs induisaient une diminution de la production de
bactériocines.
Généralement, le NaCl affecte la croissance cellulaire et la production de
bactériocines de différentes espèces bactériennes (Delgado et al., 2005). Cet effet
négatif que a le NaCl sur la production de biomolécules peut être attribué à son
interférence avec le récepteur d’induction (Nilsen et al., 1998).
Delgado et al (2005) avaient reportés que l’addition de NaCl augmentait la
production de plantaricin S de la souche Lb. plantarum LPCO10 et Lb. pentosus B96.
Ce résultat concorde avec les valeurs enregistrées pour une concentration de 3 %.
Les courbes suivantes indiquent la variabilité des trois facteurs en fonction des
différentes concentrations en NaCl additionnées au milieu de culture MRS :
87
4. Résultats et discussion
0 5 10 15 20 258
9
10
11
12
13
Croissance bactérienne LogUFC/ml Production de bactériocines UA/ml Variation du pH
Temps (h)
8000
10000
12000
14000
16000
18000
0%NaCl
4,4
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
0 5 10 15 20 258
9
10
11
12
13
Croissance bactérienne LogUFC/ml Production de bactériocines UA/ml Variation du pH
Temps (h)
8000
10000
12000
14000
16000
18000
4,4
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
0,5% NaCl
0 5 10 15 20 25
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,0
11,5
12,0
12,5
Croissance bactérienne LogUFC/ml Production de bactériocines UA/ml Variation du pH
Temps (h)
8000
10000
12000
14000
16000
18000
1%NaCl
4,4
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
Figure 20 (a): Effet de la salinité sur la croissance bactérienne, la production de
bactériocines avec variation du pH.
88
4. Résultats et discussion
0 5 10 15 20 258
9
10
11
12
13
Croissance bactérienne (LogUFC/ml) Production de bactériocines (UA/ml) Variation du pH
Temps (h)
8000
10000
12000
14000
16000
18000
2%NaCl
4,4
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
0 5 10 15 20 258
9
10
11
12
13
Croissance bactérienne LogUFC/ml Production de bactériocines UA/ml Variation du pH
Temps (h)
10000
12000
14000
16000
18000
20000
4,4
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
3%NaCl
Figure 20 (b): Effet de la salinité sur la croissance bactérienne, la production de
bactériocines avec variation du pH.
89
4. Résultats et discussion
4.9.4. Effet du surfactant Tween 80 Monooléate de polyoxyéthylène sorbitane, encore appelé Tween 80 est un
surfactant non ionique et émulsifiant utilisé dans l’industrie alimentaire et cosmétique.
La production de bactériocines et le taux de cellules viables étaient influencés
par la teneur en surfactant Tween 80 dans le milieu de culture MRS.
Ce surfactant 80 avait une importance vitale sur les paramètres testés, et une
très forte production de bactériocines d’une valeur supérieure à 22000 UA/ml est
enregistrée après son addition (concentrations de 0.4 et 0.6 %) (Figure 21).
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,011,2
11,3
11,4
11,5
11,6
11,7
11,8
11,9
12,0
12,1
Croissance bactérienne LogUFC/ml Production de bactériocines UA/ml Variation du pH
Tween (%)
0
5000
10000
15000
20000
25000
4,80
4,85
4,90
4,95
5,00
5,05
Figure 21: Effet de Tween 80 sur la croissance bactérienne, la production de
bactériocines avec variation du pH.
Par contre, le nombre de cellules viables était plus important pour une
concentration en Tween 80 de 0.4%. La concentration optimale de croissance
bactérienne et de production et de 0.4 %.
Jung et al (1992) avaient reporté que l’addition de Tween 80 avait boosté
l’activité antimicrobienne de la nisine contre Listeria monocytogenes présente dans le
lait quelque soit la teneur en matière grasse. Ils suggéraient que la nisine a pu être
90
4. Résultats et discussion adsorbé sur les globules graisseux du lait, qui la rendent indisponible pour la
destruction de cellules microbiennes. Tween a l’habilité à disperser les protéines des
globules gras, laissant ainsi la nisine faire son travail aisément.
De ce fait, les conditions optimales de croissance bactérienne et de production
de bactériocines de la souche Lactobacillus plantarum DU10 sont :
- Température : 35°C
- pH : 6.5
- NaCl : 3%
- Surfactant Tween 80 : 0.4 %
Les résultats indiquent que la production de plantaricine MZ peut être
augmentée considérablement en utilisant un milieu de culture MRS contenant
seulement du NaCl et Tween 80, avec un coût moins cher pour l’industrie.
La production de bactériocines et le taux de cellules viables dépendent
généralement sur des facteurs environnementaux, ainsi que le milieu de culture. Par
conséquent, l’optimisation de la composition du milieu de culture est aussi un facteur
important pour booster la production de bactériocines (Kayalvizhi et Gunasekaran,
2008; Anthony et al., 2009).
Plantaricine MZ est sensible aux différentes variations du milieu ou elle est
produite allant de la temprérature, pH, concentration en NaCl et enfin en Tween80.
Cette étude démontre clairement que les facteurs environnementaux ont un
effet direct sur la production de biomolécules.
Néanmoins, il serait intéressant d’appliquer la méthode de surface de réponses
dans le but d'explorer les relations entre les variables dépendantes et
indépendantes impliquées dans la prochaine expérience.
Cette technique a pour avantage d'être facile à estimer, même lorsque
l'information disponible sur les processus en cours est minime.
91
5. Conclusion
5. Conclusion
Dans la présente étude, les bactéries lactiques ont été isolées à partir du lait
crû de chamelle sud Algérien. Sur un total de 55 souches de bactéries lactiques
criblées sur la base de leur forte activité antibactérienne, une seule a été sélectionnée
pour la caractériser morphologiquement, biochimiquement, en testant les profils
fermentaires des glucides ainsi que sa classification phylogénétique basée sur
l'approche de l'ADNr 16S. L’identification par une homologie de séquence de l'ADNr
16S de l’isolat a révélé que la souche sélectionnée est : Lactobacillus plantarum,
qu’on a surnommé par la suite DU10. Une fois la séquence déposée dans la banque de
données GenBank, un numéro d’accession unique lui a été attribué : KF724943.
Cette souche a montré une forte activité antibactérienne contre différents
pathogènes à Gram positif et Gram négatif, dont le halo d’inhibition ne dépassait pas
les 24 mm de diamètre.
L’effet probiotique de la souche DU10 a été confirmé grâce à plusieurs
facteurs, à savoir ; sa tolérance aux sels biliaires, au suc gastrique artificiel, ainsi que
sa forte réduction de cholestérol.
Les bactériocines à effet antibactérien ont été caractérisées et purifiées jusqu'à
homogénéité. La purification de la bactériocine a été confirmée par HPLC après
l’observation de deux pics distincts. La masse moléculaire de Plantaricine M et
Plantaricine Z a été déterminée par MALDI-TOF/MS. Les poids moléculaires sont
de 6. 31 kDa et 7,19 kDa respectivement. Ces deux bactériocines démontrent un large
spectre d’activité antibactérienne contre les bactéries à Gram positif et à Gram négatif
lorsqu’elles agissent simultanément. L’activité est nulle si chacune est testée
séparément.
D’après la littérature, aucune bactériocine ayant le poids moléculaire
précédemment cité n’a été trouvé, ce qui veut probablement dire que ce sont de
nouvelles bactériocines jamais isolées et purifiées auparavant.
Les extrémités N-terminal étant bloquées, des études ultérieures doivent être
faites afin de confirmer la nouveauté de ces biomolécules.
En dernier lieu, l’optimisation de biosynthèse de ces substances
antimicrobiennes a été réalisée en testant différents facteurs (température, pH, NaCl et
Tween 80).
92
Les valeurs optimales détectées sont : Température 35°C, pH 6.5, 3% de NaCl
et 0.6 % de Tween 80. La production maximale détectée est de 25600 UA/ml après 5
h d’incubation en combinant ces conditions favorables.
Ces résultats indiquent que la production de plantaricine MZ peut être boostée
en utilisant un milieu de culture MRS contenant seulement du NaCl et Tween 80, et
en fixant le pH à 6.5, ce qui peut revenir moins cher pour l’industrie.
A la lumière de ces résultats, nous pouvons avancer que la souche étudiée
présente de grandes potentialités quant à son utilisation en industrie agroalimentaire.
Notre travail ouvre plusieurs perspectives d’étude :
- Débloquer les extrémités N-terminal des deux peptides Plantaricine M et
Z.
- Etude histologique après avoir testé l’effet cytotoxique de la bactérie
probiotique ingérée par des animaux.
- Exploration de l’activité anticancéreuse de la bactériocine purifiée contre
le cancer du foie et du colon.
- Utilisation de la bactériocine comme agent bio-préservateur dans des
aliments industriels et vérifier sa non toxicité.
- Explorer le rôle de la bactériocine dans le métabolisme animal pour son
effet immuno-modulateur, et le devenir de la biomolécule digérée In Vitro
et In Vivo.
- Déterminer la dose exacte nécessaire pour un effet bénéfique maximal.
93
6. Références bibliographiques
6. Références bibliographiques
Aasen, I.M., Møretrø, T., Katla, T., Axelsson, L., Storrø, I., 2000. Influence of complex nutrients, temperature and pH on bacteriocin production by Lactobacillus sakei CCUG 42687. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 159–166. doi:10.1007/s002530050003
Abada, E.A.E., 2008. Isolation and characterization of a antimicrobial compound from Bacillus coagulans. Animal Cells Syst. (Seoul). 12, 41–46. doi:10.1080/19768354.2008.9647152
Abu-Taraboush, H.M., Al-Dagal, M.M., Al-Royli, M.A., 1998. Growth, Viability, and Proteolytic Activity of Bifidobacteria in Whole Camel Milk. J. Dairy Sci. 81, 354–361. doi:10.3168/jds.S0022-0302(98)75584-5
Abu-Tarboush, H.M., 1996. Comparison of Associative Growth and Proteolytic Activity of Yogurt Starters in Whole Milk from Camels and Cows. J. Dairy Sci. 79, 366–371. doi:10.3168/jds.S0022-0302(96)76373-7
Abu-Tarboush, H.M., Ahmed, S.A.B., Al Kahtani, H. a., 1997. Some nutritional and functional properties of Karkade (Hibiscus sabdariffa) seed products. Cereal Chem. 74, 352–355. doi:10.1094/CCHEM.1997.74.3.352
AFRC, R.F., 1989. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66, 365–378. doi:10.1111/j.1365-2672.1989.tb05105.x
Aktypis, A., Kalantzopoulos, G., Huis in’t Veld, J.H.J., ten Brink, B., 1998. Purification and characterization of thermophilin T, a novel bacteriocin produced by Streptococcus thermophilus ACA-DC 0040. J. Appl. Microbiol. 84, 568–576. doi:10.1046/j.1365-2672.1998.00383.x
Al‐Mohizea, I.S., Mashhadi, A.S., Fawwal, A., Al‐Shalhat, A., 1994. Microbiological and shelf life assessment of chilled eviscerated whole chicken broilers in Saudi Arabia. Br. Poult. Sci. 35, 519–526. doi:10.1080/00071669408417717
Altermann, E., Russell, W.M., Azcarate-Peril, M.A., Barrangou, R., Buck, B.L., McAuliffe, O., Souther, N., Dobson, A., Duong, T., Callanan, M., Lick, S., Hamrick, A., Cano, R., Klaenhammer, T.R., 2005. Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3906–3912. doi:10.1073/pnas.0409188102
Anthony, T., Rajesh, T., Kayalvizhi, N., Gunasekaran, P., 2009. Influence of medium components and fermentation conditions on the production of bacteriocin(s) by Bacillus licheniformis AnBa9. Bioresour. Technol. 100, 872–877. doi:10.1016/j.biortech.2008.07.027
Arqués, J.L., Fernández, J., Gaya, P., Nuñez, M., Rodríguez, E., Medina, M., 2004. Antimicrobial activity of reuterin in combination with nisin against food-borne pathogens. Int. J. Food Microbiol. 95, 225–229. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2004.03.009
Axelsson, L., 2011. Lactic Acid Bacteria, in: Lactic Acid Bacteria. Informa {UK} Limited, pp. 1–16. doi:10.1201/b11503-2
Axelsson, L.T., Chungf, T.C., Dobrogosz, W.J., Lindgrent, S.E., 1989. Production of a Broad Spectrum Antimicrobial Substance by Lactobacillus reuteri. Microb. Ecol. Health Dis. 2, 131–136. doi:10.3109/08910608909140210
Ayad, E.H.E., Verheul, A., De Jong, C., Wouters, J.T.M., Smit, G., 1999. Flavour forming abilities and amino acid requirements of Lactococcus lactis strains isolated from artisanal and non-dairy origin. Int. Dairy J. 9, 725–735. doi:10.1016/S0958-6946(99)00140-5
Bearson, S., Bearson, B., Foster, J.W., 1997. Acid stress responses in enterobacteria . FEMS Microbiol. Lett. 147, 173–180. doi:10.1016/S0378-1097(96)00503-4
Bekkali, N.-L.-H., Bongers, M.E., Van den Berg, M.M., Liem, O., Benninga, M. a, 2007. The role of a probiotics mixture in the treatment of childhood constipation: a pilot study. Nutr. J. 6, 17. doi:10.1186/1475-2891-6-17
Bellon-Fontaine, M.N., Rault, J., Van Oss, C.J., 1996. Microbial adhesion to solvents: A novel method to determine the electron-donor/electron-acceptor or Lewis acid-base properties of microbial cells. Colloids Surfaces B Biointerfaces 7, 47–53. doi:10.1016/0927-7765(96)01272-6
Blom, H., Mortvedt, C., 1991. Anti-microbial substances produced by food-associated micro-organisms. Biochem. Soc. Trans. 19, 694–698. doi:10.1042/bst0190694
Bowe, W.P., Logan, A.C., 2011. Acne vulgaris, probiotics and the gut-brain-skin axis - back to the future? Gut Pathog. 3, 1. doi:10.1186/1757-4749-3-1
Brinques, G.B., do Carmo Peralba, M., Ayub, M.A.Z., 2010. Optimization of probiotic and lactic acid production by Lactobacillus plantarum in submerged bioreactor systems. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 37, 205–212. doi:10.1007/s10295-009-0665-1
Callewaert, R., Vuyst, L. De, 2000. Bacteriocin Production with Lactobacillus amylovorus DCE 471 Is Improved and Stabilized by Fed-Batch Fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 66, 606–613. doi:10.1128/AEM.66.2.606-613.2000
Carr, E.G., Dunlap, G., Horner, R.H., Koegel, R.L., Turnbull, A.P., Sailor, W., Anderson, J.L., Albin, R.W., Koegel, L.K., Fox, L., 2002. Positive Behavior Support: Evolution of an Applied Science. J. Posit. Behav. Interv. 4, 4 – 17, 20. doi:10.1177/109830070200400102
Chaillou, S., Champomier-Vergès, M.-C., Cornet, M., Crutz-Le Coq, A.-M., Dudez, A.-M., Martin, V., Beaufils, S., Darbon-Rongère, E., Bossy, R., Loux, V., Zagorec, M., 2005. The complete genome sequence of the meat-borne lactic acid bacterium Lactobacillus
sakei 23K. Nat. Biotechnol. 23, 1527–1533. doi:10.1038/nbt1160
Chen, Y.S., Srionnual, S., Onda, T., Yanagida, F., 2007. Effects of prebiotic oligosaccharides and trehalose on growth and production of bacteriocins by lactic acid bacteria. Lett. Appl. Microbiol. 45, 190–193. doi:10.1111/j.1472-765X.2007.02167.x
Chen, Y.S., Wang, Y.C., Chow, Y.S., Yanagida, F., Liao, C.C., Chiu, C.M., 2014. Purification and characterization of plantaricin Y, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum 510. Arch. Microbiol. 196, 193–99. doi:10.1007/s00203-014-0958-2
Cherrington, C.A., Hinton, M., Mead, G.C., Chopra, I., 1991. Organic Acids: Chemistry, Antibacterial Activity and Practical Applications, in: Advances in Microbial Physiology Volume 32. Elsevier {BV}, pp. 87–108. doi:10.1016/S0065-2911(08)60006-5
Chung, C.T., Niemela, S.L., Miller, R.H., 1989. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 2172–2175. doi:10.1073/pnas.86.7.2172
Collins, J.E., Legan, P.K., Kenny, T.P., MacGarvie, J., Holton, J.L., Garrod, D.R., 1991. Cloning and sequence analysis of desmosomal glycoproteins 2 and 3 (desmocollins): cadherin-like desmosomal adhesion molecules with heterogeneous cytoplasmic domains. J. Cell Biol. 113, 381–91. doi:10.1083/jcb.113.2.381
Coppola, R., Succi, M., Tremonte, P., Reale, A., Salzano, G., Sorrentino, E., 2005. Antibiotic susceptibility of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from Parmigiano Reggiano cheese. Lait 85, 193–204. doi:10.1051/lait:2005007
Corsetti, A., Gobbetti, M., Balestrieri, F., Paoletti, F., Russi, L., Rossi, J., 2008. Sourdough Lactic Acid Bacteria Effects on Bread Firmness and Stalin. J. Food Sci. 63, 347–351. doi:10.1111/j.1365-2621.1998.tb15739.x
Curk, M.C., Hubert, J.C., Bringel, F., 1996. Lactobacillus paraplantarum sp. now., a new species related to Lactobacillus plantarum. Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 595–8. doi:10.1099/00207713-46-2-595
Dalié, D.K.D., Deschamps, A.M., Richard-Forget, F., 2010. Lactic acid bacteria – Potential for control of mould growth and mycotoxins: A review. Food Control 21, 370–380. doi:10.1016/j.foodcont.2009.07.011
de Keyzer, J., van der Does, C., Driessen, A.J.M., 2003. The bacterial translocase: a dynamic protein channel complex. Cell. Mol. Life Sci. 60, 2034–2052. doi:10.1007/s00018-003-3006-y
De Vuyst, L., Degeest, B., 1999. Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 23, 153–177. doi:10.1111/j.1574-6976.1999.tb00395.x
De Vuyst, L., Leroy, F., 2007. Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria: Production, Purification, and Food Applications. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 13, 194–199.
doi:10.1159/000104752
Delgado, A., Brito, D., Peres, C., Noé-Arroyo, F., Garrido-Fernández, A., 2005. Bacteriocin production by Lactobacillus pentosus B96 can be expressed as a function of temperature and NaCl concentration. Food Microbiol. 22, 521–528. doi:10.1016/j.fm.2004.11.015
Devriese, L.A., Pot, B., 1995. The genus Enterococcus, in: The Genera of Lactic Acid Bacteria. Springer Science \mathplus Business Media, pp. 327–367. doi:10.1007/978-1-4615-5817-0_10
Dicks, L., Botes, M., 2010. Probiotic lactic acid bacteria in the gastro-intestinal tract: health benefits, safety and mode of action. Benef. Microbes 1, 11–29. doi:10.3920/BM2009.0012
Diep, D.B., Skaugen, M., Salehian, Z., Holo, H., Nes, I.F., 2007. Common mechanisms of target cell recognition and immunity for class II bacteriocins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 2384–9. doi:10.1073/pnas.0608775104
Drider, D., Fimland, G., Hechard, Y., McMullen, L.M., Prevost, H., 2006. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70, 564–582. doi:10.1128/MMBR.00016-05
Duhaiman, a S., 1988. Purification of camel milk lysozyme and its lytic effect on Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus. Comp. Biochem. Physiol. B. 91, 793–6. doi:10.1016/0305-0491(88)90210-6
Earnshaw, R.G., 1992. The Antimicrobial Action of Lactic Acid Bacteria: Natural Food Preservation Systems, in: The Lactic Acid Bacteria Volume 1. Springer Science \mathplus Business Media, pp. 211–232. doi:10.1007/978-1-4615-3522-5_9
Eijsink, V.G.H., Axelsson, L., Diep, D.B., Håvarstein, L.S., Holo, H., Nes, I.F., 2002. Production of class II bacteriocins by lactic acid bacteria; an example of biological warfare and communication. Antonie van Leeuwenhoek, Int. J. Gen. Mol. Microbiol. 81, 639–654. doi:10.1023/A:1020582211262
Eklund, T., 1980. Inhibition of Growth and Uptake Processes in Bacteria by Some Chemical Food Preservatives. J. Appl. Bacteriol. 48, 423–432. doi:10.1111/j.1365-2672.1980.tb01031.x
el Agamy, E.I., Ruppanner, R., Ismail, a, Champagne, C.P., Assaf, R., 1992. Antibacterial and antiviral activity of camel milk protective proteins. J. Dairy Res. 59, 169–175. doi:10.1017/S0022029900030417
Elamin, F.M., Wilcox, C.J., 1992. Milk composition of Majaheim camels. J Dairy Sci 75, 3155–3157. doi:10.3168/jds.S0022-0302(92)78079-5
Ennahar, S., Sashihara, T., Sonomoto, K., Ishizaki, A., 2000. Class IIa bacteriocins: Biosynthesis, structure and activity. FEMS Microbiol. Rev. 24, 85–106. doi:10.1016/S0168-6445(99)00031-5
Farah, S.B., Ramos, C.F., de Mello, M.P., Sartorato, E.L., Horelli-Kuitunen, N., Lopes, V.L.G.S., Cavalcanti, D.P., Hackel, C., 1994. Two cases of Y; autosome translocations: A 45, X male and a clinically trisomy 18 patient. Am. J. Med. Genet. 49, 388–392. doi:10.1002/ajmg.1320490407
Farah, Z., Streiff, T., Bachmann, M.R., 1990. Preparation and consumer acceptability tests of fermented camel milk in Kenya. J. Dairy Res. 57, 281–283. doi:10.1017/S002202990002690X
Fimland, G., Johnsen, L., Axelsson, L., Brurberg, M.B., Nes, I.F., Eijsink, V.G.H., Nissen-Meyer, J., 2000. A C-terminal disulfide bridge in pediocin-like bacteriocins renders bacteriocin activity less temperature dependent and is a major determinant of the antimicrobial spectrum. J. Bacteriol. 182, 2643–2648. doi:10.1128/JB.182.9.2643-2648.2000
Flynn, K.J., 2002. Toxin production in migrating dinoflagellates: a modelling study of PSP producing Alexandrium. Harmful Algae 1, 147–155. doi:10.1016/S1568-9883(02)00028-8
Fox, J.G., Chien, C.C., Dewhirst, F.E., Paster, B.J., Shen, Z., Melito, P.L., Woodward, D.L., Rodgers, F.G., 2000. Helicobacter canadensis sp. nov. isolated from humans with diarrhea as an example of an emerging pathogen. J. Clin. Microbiol. 38, 2546–2549. doi:10.1016/S0016-5085(00)83612-4
Gálvez, A., Abriouel, H., Benomar, N., Lucas, R., 2010. Microbial antagonists to food-borne pathogens and biocontrol. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 142–148. doi:10.1016/j.copbio.2010.01.005
Gänzle, M.G., Vogel, R.F., 2003. Studies on the mode of action of reutericyclin. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1305–1307. doi:10.1128/AEM.69.2.1305-1307.2003
Garrido-Fernández, J., Maldonado-Barragán, A., Caballero-Guerrero, B., Hornero-Méndez, D., Ruiz-Barba, J.L., 2010. Carotenoid production in Lactobacillus plantarum. Int. J. Food Microbiol. 140, 34–9. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2010.02.015
Garriga, M., Hugas, M., Aymerich, T., Monfort, J.M., 1993. Bacteriocinogenic activity of lactobacilli from fermented sausages. J. Appl. Bacteriol. 75, 142–8. doi:10.1016/0168-1605(93)90215-3
Gélinas, P., Goulet, J., 1983. Neutralization of the activity of eight disinfectants by organic matter. J. Appl. Bacteriol. 54, 243–247. doi:10.1111/j.1365-2672.1983.tb02613.x
Giraffa, G., Chanishvili, N., Widyastuti, Y., 2010. Importance of lactobacilli in food and feed biotechnology. Res. Microbiol. 161, 480–487. doi:10.1016/j.resmic.2010.03.001
Gong, H.S., Meng, X.C., Wang, H., 2010. Plantaricin MG active against Gram-negative bacteria produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 isolated from “Jiaoke”, a traditional fermented cream from China. Food Control 21, 89–96.
doi:10.1016/j.foodcont.2009.04.005
Gorban, A.M.S., Izzeldin, O.M., 1997. Mineral content of camel milk and colostrum. J. Dairy Res. 64, 471–474. doi:10.1017/S0022029997002264
Gupta, A., Tiwari, S.K., 2014. Plantaricin LD1: A bacteriocin produced by food isolate of Lactobacillus plantarum LD1. Appl. Biochem. Biotechnol. 172, 3354–3362. doi:10.1007/s12.
Halami, P.M., Chandrashekar, a, Nand, K., 2000. Lactobacillus farciminis MD, a newer strain with potential for bacteriocin and antibiotic assay. Lett. Appl. Microbiol. 30, 197–202. doi:10.1046/j.1472-765x.2000.00691.x
Hamilton-Miller, J.M.T., Gibson, G.R., Bruck, W., 2003. Some insights into the derivation and early uses of the word “probiotic”. Br. J. Nutr. 90, 845. doi:10.1079/BJN2003954
Hammes, W.P., Hertel, C., 2006. The Genera Lactobacillus and Carnobacterium, in: The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria,. Springer Science \mathplus Business Media, pp. 320–403. doi:10.1007/0-387-30744-3
Hardie, J.M., Whiley, R.A., 1995. The genus Streptococcus, in: The Genera of Lactic Acid Bacteria. Springer Science \mathplus Business Media, pp. 55–124. doi:10.1007/978-1-4615-5817-0_4
Hastings, J.W., Holzapfel, W.H., 1987. Conventional taxonomy of lactobacilli surviving radurization of meat. J Appl Bacteriol 62, 209–216. doi:10.1016/0168-1605(87)90057-2
Herranz, C., Martínez, J.M., Rodríguez, J.M., Hernández, P.E., Cintas, L.M., 2001. Optimization of enterocin P production by batch fermentation of Enterococcus faecium P13 at constant pH. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, 378–383. doi:10.1007/s002530100656
Höltzel, A., Gänzle, M.G., Nicholson, G.J., Hammes, W.P., Jung, G., 2000. The first low molecular weight antibiotic from lactic acid bacteria: Reutericyclin, a new tetramic acid. Angew. Chemie - Int. Ed. 39, 2766–2768. doi:10.1002/1521-3773(20000804)39:15<2766::AID-ANIE2766>3.0.CO;2-G
Holzapfel, W.H., Haberer, P., Snel, J., Schillinger, U., Huis In’T Veld, J.H.J., 1998. Overview of gut flora and probiotics. Int. J. Food Microbiol. 41, 85–101. doi:10.1016/S0168-1605(98)00044-0
Huggins, A.R., Sandine, W.E., 1984. Differentiation of Fast and Slow Milk-Coagulating Isolates in Strains of Lactic Streptococci. J. Dairy Sci. 67, 1674–1679. doi:10.3168/jds.S0022-0302(84)81491-5
Isolauri, E., Salminen, S., Ouwehand, A.C., 2004. Probiotics. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 18, 299–313. doi:10.1016/j.bpg.2003.10.006
Ivanova, I., Miteva, V., Stefanova, T., Pantev, a., Budakov, I., Danova, S., Moncheva, P.,
Nikolova, I., Dousset, X., Boyaval, P., 1998. Characterization of a bacteriocin produced by Streptococcus thermophilus 81. Int. J. Food Microbiol. 42, 147–158. doi:10.1016/S0168-1605(98)00067-1
Jay, J.M., 1982. Effect of diacetyl on foodborne microorganisms. J. Food Sci. 47, 1829–1831. doi:10.1111/j.1365-2621.1982.tb12892.x
Jung, D.S., Bodyfelt, F.W., Daeschel, M.A., 1992. Influence of fat and emulsifiers on the efficacy of nisin in inhibiting Listeria monocytogenes in fluid milk. J. Dairy Sci. 75, 387–93. doi:10.3168/jds.S0022-0302(92)77773-X
Kabuki, T., Uenishi, H., Watanabe, M., Seto, Y., Nakajima, H., 2007. Characterization of a bacteriocin, Thermophilin 1277, produced by Streptococcus thermophilus SBT1277. J. Appl. Microbiol. 102, 971–980. doi:10.1111/j.1365-2672.2006.03159.x
Kayalvizhi, N., Gunasekaran, P., 2008. Production and characterization of a low-molecular-weight bacteriocin from Bacillus licheniformis MKU3. Lett. Appl. Microbiol. 47, 600–607. doi:10.1111/j.1472-765X.2008.02473.x
Kim, Y.H., Lee, Y., Kim, S., Yeom, J., Yeom, S., Kim, B.S., Oh, S., Park, S., Jeon, C.O., Park, W., 2006. The role of periplasmic antioxidant enzymes (superoxide dismutase and thiol peroxidase) of the Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7 in the formation of biofilms. Proteomics 6, 6181–6193. doi:10.1002/pmic.200600320
Klaenhamer, T.R., 1993. Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Bacteriocins Lact. Acid Bact. 70, xvii–xviii. doi:10.1016/B978-0-12-355510-6.50007-5
Klaenhammer, T.R., 1993. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 12, 39–85. doi:10.1016/0168-6445(93)90057-G
Klaenhammer, T.R., Fitzgerald, G.F., 1994. Bacteriophage and bacteriophage resistance, in: Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. Springer Science \mathplus Business Media, pp. 106–168. doi:10.1007/978-94-011-1340-3_3
Kleerebezem, M., 2004. Quorum sensing control of lantibiotic production; nisin and subtilin autoregulate their own biosynthesis. Peptides 25, 1405–1414. doi:10.1016/j.peptides.2003.10.021
Kleerebezem, M., Boekhorst, J., van Kranenburg, R., Molenaar, D., Kuipers, O.P., Leer, R., Tarchini, R., Peters, S. a, Sandbrink, H.M., Fiers, M.W.E.J., Stiekema, W., Lankhorst, R.M.K., Bron, P. a, Hoffer, S.M., Groot, M.N.N., Kerkhoven, R., de Vries, M., Ursing, B., de Vos, W.M., Siezen, R.J., 2003. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 1990–1995. doi:10.1073/pnas.0337704100
Lash, B.W., Mysliwiec, T.H., Gourama, H., 2005. Detection and partial characterization of a broad-range bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum (ATCC 8014). Food Microbiol. 22, 199–204. doi:10.1016/j.fm.2004.03.006
Lavasani, S., Dzhambazov, B., Nouri, M., Fåk, F., Buske, S., Molin, G., Thorlacius, H., Alenfall, J., Jeppsson, B., Weström, B., 2010. A novel probiotic mixture exerts a therapeutic effect on experimental autoimmune encephalomyelitis mediated by IL-10 producing regulatory T cells. PLoS One 5, e9009. doi:10.1371/journal.pone.0009009
Leal-Sánchez, M. V, Jiménez-Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Garrido-Fernández, A., Ruiz-Barba, J.L., 2002. Optimization of bacteriocin production by batch fermentation of Lactobacillus plantarum LPCO10. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4465–4471. doi:10.1128/AEM.68.9.4465-4471.2002
Leroy, S., Marret, F., Giralt, S., Bulatov, S., 2006. Natural and anthropogenic rapid changes in the Kara-Bogaz Gol over the last two centuries reconstructed from palynological analyses and a comparison to instrumental records. Quat. Int. 150, 52–70. doi:10.1016/j.quaint.2006.01.007
Linaje, R., Coloma, M.D., Perez-Martinez, G., Zuniga, M., 2004. Characterization of faecal enterococci from rabbits for the selection of probiotic strains. J. Appl. Microbiol. 96, 761–771. doi:Doi 10.1111/J.1365-2672.2004.02191.X
Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G.N., Kuipers, O.P., 2008. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell. Mol. Life Sci. 65, 455–476. doi:10.1007/s00018-007-7171-2
Lutgendorff, F., Nijmeijer, R.M., Sandström, P.A., Trulsson, L.M., Magnusson, K.-E., Timmerman, H.M., van Minnen, L.P., Rijkers, G.T., Gooszen, H.G., Akkermans, L.M.A., Söderholm, J.D., 2009. Probiotics prevent intestinal barrier dysfunction in acute pancreatitis in rats via induction of ileal mucosal glutathione biosynthesis. PLoS One 4, e4512. doi:10.1371/journal.pone.0004512
Lv, W., Zhang, X., Cong, W., 2005. Modelling the production of nisin by Lactococcus lactis in fed-batch culture. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 322–326. doi:10.1007/s00253-005-1892-7
Mandal, S.M., Migliolo, L., Franco, O.L., Ghosh, A.K., 2011. Identification of an antifungal peptide from Trapa natans fruits with inhibitory effects on Candida tropicalis biofilm formation. Peptides 32, 1741–1747. doi:10.1016/j.peptides.2011.06.020
Maragkoudakis, P.A., Chingwaru, W., Gradisnik, L., Tsakalidou, E., Cencic, A., 2010. Lactic acid bacteria efficiently protect human and animal intestinal epithelial and immune cells from enteric virus infection. Int. J. Food Microbiol. 141, S91–S97. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2009.12.024
Maragkoudakis, P.A., Zoumpopoulou, G., Miaris, C., Kalantzopoulos, G., Pot, B., Tsakalidou, E., 2006. Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from dairy products. Int. Dairy J. 16, 189–199. doi:10.1016/j.idairyj.2005.02.009
Marroki, A., Bousmaha-Marroki, L., 2014. Lactobacilli isolated from Algerian goat’s milk as adjunct culture in dairy products. Brazilian Arch. Biol. Technol. 57, 410–420.
doi:10.1590/S1516-89132014005000003
Mataragas, M., Drosinos, E.H., Tsakalidou, E., Metaxopoulos, J., 2004a. Influence of nutrients on growth and bacteriocin production by Leuconostoc mesenteroides L124 and Lactobacillus curvatus L442. Antonie van Leeuwenhoek, Int. J. Gen. Mol. Microbiol. 85, 191–198. doi:10.1023/B:ANTO.0000020291.01957.a2
Mataragas, M., Drosinos, E.H., Tsakalidou, E., Metaxopoulos, J., 2004b. Influence of nutrients on growth and bacteriocin production by Leuconostoc mesenteroides L124 and Lactobacillus curvatus L442. Antonie van Leeuwenhoek, Int. J. Gen. Mol. Microbiol. 85, 191–198. doi:10.1023/B:ANTO.0000020291.01957.a2
McAuliffe, O., 2001. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action. FEMS Microbiol. Rev. 25, 285–308. doi:10.1016/S0168-6445(00)00065-6
Mehaia, M.A., 1993. Fresh Soft White Cheese (Domiati-Type) from Camel Milk: Composition, Yield, and Sensory Evaluation. J. Dairy Sci. 76, 2845–2855. doi:http://dx.doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(93)77623-7
Messens, W., Verluyten, J., Leroy, F., De Vuyst, L., 2003. Modelling growth and bacteriocin production by Lactobacillus curvatus LTH 1174 in response to temperature and pH values used for European sausage fermentation processes. Int. J. Food Microbiol. 81, 41–52. doi:10.1016/S0168-1605(02)00168-X
Messi, P., Bondi, M., Sabia, C., Battini, R., Manicardi, G., 2001. Detection and preliminary characterization of a bacteriocin (plantaricin 35d) produced by a Lactobacillus plantarum strain. Int. J. Food Microbiol. 64, 193–198. doi:10.1016/S0168-1605(00)00419-0
Mora, M.L., Cartes, P., Demanet, R., Cornforth, I.S., 2002. Effects of lime and gypsum on pasture growth and composition on an acid Andisol in Chile, South America. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 33, 2069–2081. doi:10.1081/CSS-120005749
Morrissey, J.H., 1981. Silver stain for proteins in polyacrylamide gels: A modified procedure with enhanced uniform sensitivity. Anal. Biochem. 117, 307–310. doi:10.1016/0003-2697(81)90783-1
Nel, H. a., Bauer, R., Vandamme, E.J., Dicks, L.M.T., 2001. Growth optimization of Pediococcus damnosus NCFB 1832 and the influence of pH and nutrients on the production of pediocin PD-1. J. Appl. Microbiol. 91, 1131–1138. doi:10.1046/j.1365-2672.2001.01486.x
Nigutova, K., Morovsky, M., Pristas, P., Teather, R.M., Holo, H., Javorsky, P., 2007. Production of enterolysin A by rumen Enterococcus faecalis strain and occurrence of enlA homologues among ruminal Gram-positive cocci. J. Appl. Microbiol. 102, 563–569. doi:10.1111/j.1365-2672.2006.03068.x
Nilsen, T., Nes, I.F., Holo, H., 2003. Enterolysin A, a cell wall-degrading bacteriocin from
Enterococcus faecalis LMG 2333. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2975–2984. doi:10.1128/AEM.69.5.2975-2984.2003
Oppegård, C., Fimland, G., Thorbaek, L., Nissen-Meyer, J., 2007. Analysis of the two-peptide bacteriocins lactococcin G and enterocin 1071 by site-directed mutagenesis. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2931–8. doi:10.1128/AEM.02718-06
Ouwehand, A., Vesterlund, S., 2004. Antimicrobial Components from Lactic Acid Bacteria, in: Lactic Acid Bacteria. Informa {UK} Limited. doi:10.1201/9780824752033.ch11
Papagianni, M., 2003. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: Biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol. Adv. 21, 465–499. doi:10.1016/S0734-9750(03)00077-6
Parente, E., Ricciardi, a., 1999. Production, recovery and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 628–638. doi:10.1007/s002530051570
Patton, G.C., van der Donk, W.A., 2005. New developments in lantibiotic biosynthesis and mode of action. Curr. Opin. Microbiol. 8, 543–551. doi:10.1016/j.mib.2005.08.008
Penaud, S., Fernandez, a, Boudebbouze, S., Ehrlich, S.D., Maguin, E., van de Guchte, M., 2006. Induction of heavy-metal-transporting CPX-type ATPases during acid adaptation in Lactobacillus bulgaricus. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7445–54. doi:10.1128/AEM.01109-06
Pérez Guerra, N., Bernárdez, P.F., Agrasar, A.T., López Macías, C., Castro, L.P., 2005. Fed-batch pediocin production by Pediococcus acidilactici NRRL B-5627 on whey. Biotechnol. Appl. Biochem. 42, 17–23. doi:10.1042/BA20040146
Pongtharangkul, T., Demirci, A., 2006. Evaluation of culture medium for nisin production in a repeated-batch biofilm reactor. Biotechnol. Prog. 22, 217–224. doi:10.1021/bp050295q
Preetha, R., Jayaprakash, N.S., Philip, R., Bright Singh, I.S., 2007. Optimization of medium for the production of a novel aquaculture probiotic,Micrococcus MCCB 104 using central composite design. Biotechnol. Bioprocess Eng. 12, 548–555. doi:10.1007/BF02931353
Prema, P., Bharathy, S., Palavesam, a., Sivasubramanian, M., Immanuel, G., 2006. Detection, purification and efficacy of warnerin produced by Staphylococcus warneri. World J. Microbiol. Biotechnol. 22, 865–872. doi:10.1007/s11274-005-9116-y
Pridmore, R.D., Berger, B., Desiere, F., Vilanova, D., Barretto, C., Pittet, A.-C., Zwahlen, M.-C., Rouvet, M., Altermann, E., Barrangou, R., Mollet, B., Mercenier, A., Klaenhammer, T., Arigoni, F., Schell, M. a, 2004. The genome sequence of the probiotic intestinal bacterium Lactobacillus johnsonii NCC 533. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 2512–2517. doi:10.1073/pnas.0307327101
Reenen, C.A. van, Dicks, L.M.T., Chikindas, M.L., 1998. Isolation, purification and partial
characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum. J. Appl. Microbiol. 84, 1131–1137. doi:10.1046/j.1365-2672.1998.00451.x
Rerksuppaphol, S., Rerksuppaphol, L., 2010. Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum stored at ambient temperature are effective in the treatment of acute diarrhoea. Ann. Trop. Paediatr. 30, 299–304. doi:10.1179/146532810X12858955921159
Reynolds, P.E., 1989. Structure, biochemistry and mechanism of action of glycopeptide antibiotics. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 8, 943–950. doi:10.1007/BF01967563
Richard, C., Cañon, R., Naghmouchi, K., Bertrand, D., Prévost, H., Drider, D., 2006. Evidence on correlation between number of disulfide bridge and toxicity of class IIa bacteriocins. Food Microbiol. 23, 175–83. doi:10.1016/j.fm.2005.02.001
Ringø, E., Gatesoupe, F.J., 1998. Lactic acid bacteria in fish: A review. Aquaculture 160, 177–203. doi:10.1016/S0044-8486(97)00299-8
Rusch, S.L., Kendall, D. a., 2007. Interactions that drive Sec-dependent bacterial protein transport. Biochemistry 46, 9665–9673. doi:10.1021/bi7010064
Salmond, C. V, Kroll, R.G., Booth, I.R., 1984. The effect of food preservatives on pH homeostasis in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 130, 2845–2850. doi:10.1099/00221287-130-11-2845
Samelis, J., Maurogenakis, F., Metaxopoulos, J., 1994. Characterisation of lactic acid bacteria isolated from naturally fermented Greek dry salami. Int. J. Food Microbiol. 23, 179–196. doi:10.1016/0168-1605(94)90051-5
Sánchez, J., Diep, D.B., Herranz, C., Nes, I.F., Cintas, L.M., Hernández, P.E., 2007. Amino acid and nucleotide sequence, adjacent genes, and heterologous expression of hiracin JM79, a sec-dependent bacteriocin produced by Enterococcus hirae DCH5, isolated from Mallard ducks (Anas platyrhynchos). FEMS Microbiol. Lett. 270, 227–36. doi:10.1111/j.1574-6968.2007.00673.x
Satish Kumar, R., Arul, V., 2009. Purification and characterization of phocaecin PI80: An anti-listerial bacteriocin produced by Streptococcus phocae PI80 isolated from the gut of Peneaus indicus (Indian white shrimp). J. Microbiol. Biotechnol. 19, 1393–1400. doi:10.4014/jmb.0901.0003
Savijoki, K., Ingmer, H., Varmanen, P., 2006. Proteolytic systems of lactic acid bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 71, 394–406. doi:10.1007/s00253-006-0427-1
Sawaya, W.N., Khalil, J.K., Al-Shalhat, a., Al-Mohammad, H., 1984. Chemical Composition and Nutritional Quality of Camel Milk. J. Food Sci. 49, 744–747. doi:10.1111/j.1365-2621.1984.tb13200.x
Scannell, A.G.M., Hill, C., Ross, R.P., Marx, S., Hartmeier, W., Arendt, E.K., 2000. Development of bioactive food packaging materials using immobilised bacteriocins Lacticin 3147 and Nisaplin. Int. J. Food Microbiol. 60, 241–249. doi:10.1016/S0168-
1605(00)00314-7
Schägger, H., von Jagow, G., 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368–379. doi:10.1016/0003-2697(87)90587-2
Schillinger, U., Lücke, F.-K., 1987. Identification of lactobacilli from meat and meat products. Food Microbiol. 4, 199–208. doi:10.1016/0740-0020(87)90002-5
Schleifer, K.H., Kilpper-Bälz, R., 1987. Molecular and Chemotaxonomic Approaches to the Classification of Streptococci, Enterococci and Lactococci: A Review. Syst. Appl. Microbiol. 10, 1–19. doi:10.1016/S0723-2020(87)80002-4
Schleifer, K.H., Ludwig, W., 1995. Phylogeny of the Genus Lactobacillus and Related Genera. Syst. Appl. Microbiol. 18, 461–467. doi:10.1016/S0723-2020(11)80404-2
Singh, B., Sharma, D.K., Kumar, R., Gupta, A., 2009. Controlled release of the fungicide thiram from starch-alginate-clay based formulation. Appl. Clay Sci. 45, 76–82. doi:10.1016/j.clay.2009.03.001
Sjögren, J., Magnusson, J., Broberg, A., Schnürer, J., Kenne, L., 2003. Antifungal 3-Hydroxy Fatty Acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14 Antifungal 3-Hydroxy Fatty Acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14. Appl. Environ. Microbiol. 69, 7554–7557. doi:10.1128/AEM.69.12.7554
SPOLVERINI, L., 1930. Recherches sur la physico-chimie colloidale du lait et leurs conséquences dans la pratique alimentaire des enfants. Lait 10, 21–32. doi:10.1051/lait:1930912
Stein, L.D., Bao, Z., Blasiar, D., Blumenthal, T., Brent, M.R., Chen, N., Chinwalla, A., Clarke, L., Clee, C., Coghlan, A., Coulson, A., D’Eustachio, P., Fitch, D.H.A., Fulton, L.A., Fulton, R.E., Griffiths-Jones, S., Harris, T.W., Hillier, L.W., Kamath, R., Kuwabara, P.E., Mardis, E.R., Marra, M.A., Miner, T.L., Minx, P., Mullikin, J.C., Plumb, R.W., Rogers, J., Schein, J.E., Sohrmann, M., Spieth, J., Stajich, J.E., Wei, C., Willey, D., Wilson, R.K., Durbin, R., Waterston, R.H., 2003. The genome sequence of Caenorhabditis briggsae: a platform for comparative genomics. PLoS Biol. 1, E45. doi:10.1371/journal.pbio.0000045
Straume, D., Kjos, M., Nes, I.F., Diep, D.B., 2007. Quorum-sensing based bacteriocin production is down-regulated by N-terminally truncated species of gene activators. Mol. Genet. Genomics 278, 283–293. doi:10.1007/s00438-007-0251-z
Suma, K., Misra, M.C., Varadaraj, M.C., 1998. Plantaricin LP84, a broad spectrum heat-stable bacteriocin of Lactobacillus plantarum NCIM 2084 produced in a simple glucose broth medium. Int. J. Food Microbiol. 40, 17–25. doi:10.1016/S0168-1605(98)00010-5
Talarico, T.L.T., Dobrogosz, W.J., 1989. Chemical characterization of an antimicrobial substance produced by Lactobacillus reuteri. Antimicrob. Agents Chemother. 33, 674–
679. doi:10.1128/AAC.33.5.674
Tiwari, B.K., Valdramidis, V.P., O’ Donnell, C.P., Muthukumarappan, K., Bourke, P., Cullen, P.J., 2009. Application of Natural Antimicrobials for Food Preservation. J. Agric. Food Chem. 57, 5987–6000. doi:10.1021/jf900668n
Tobajas, M., Mohedano, a. F., Casas, J. a., Rodríguez, J.J., 2007. A kinetic study of reuterin production by Lactobacillus reuteri PRO 137 in resting cells. Biochem. Eng. J. 35, 218–225. doi:10.1016/j.bej.2007.01.017
Todorov, S., Dicks, L., 2007. Bacteriocin production by Lactobacillus pentosus ST712BZ isolated from boza. Brazilian J. Microbiol. 38, 166–172. doi:10.1590/S1517-83822007000100034
Todorov, S.D., Dicks, L.M.T., 2004. Influence of growth conditions on the production of a bacteriocin by Lactococcus lactis subsp. lactis ST34BR, a strain isolated from barley beer. J. Basic Microbiol. 44, 305–316. doi:10.1002/jobm.200410413
Twomey, D., Ross, R.P., Ryan, M., Meaney, B., Hill, C., 2002. Lantibiotics produced by lactic acid bacteria: structure, function and applications., in: Antonie van Leeuwenhoek. Springer Science \mathplus Business Media, pp. 165–185. doi:10.1007/978-94-017-2029-8_11
Uraz, G., Akkuzu, S., Özcan, S., Pardoul, M.E., 2012. Isolation of Lactic Acid Bacteria from kefir. J. Biotechnol. 161, Suppl, 39. doi:10.1016/j.jbiotec.2012.07.120
Valenzuela, A.S., Ruiz, G.D., Omar, N. Ben, Abriouel, H., López, R.L., Cañamero, M.M., Ortega, E., Gálvez, A., 2008. Inhibition of food poisoning and pathogenic bacteria by Lactobacillus plantarum strain 2.9 isolated from ben saalga, both in a culture medium and in food. Food Control 19, 842–848. doi:10.1016/j.foodcont.2007.08.009
van Wely, K.H., Swaving, J., Freudl, R., Driessen, a J., 2001. Translocation of proteins across the cell envelope of Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 25, 437–454. doi:10.1111/j.1574-6976.2001.tb00586.x
Vasiljevic, T., Shah, N.P., 2008. Probiotics—From Metchnikoff to bioactives. Int. Dairy J. 18, 714–728. doi:10.1016/j.idairyj.2008.03.004
Verluyten, J., Messens, W., De Vuyst, L., 2004. Sodium Chloride Reduces Production of Curvacin A, a Bacteriocin Produced by Lactobacillus curvatus Strain LTH 1174, Originating from Fermented Sausage. Appl. Environ. Microbiol. 70, 2271–2278. doi:10.1128/AEM.70.4.2271-2278.2004
Verna, E.C., Lucak, S., 2010. Use of probiotics in gastrointestinal disorders: what to recommend? Therap. Adv. Gastroenterol. 3, 307–319. doi:10.1177/1756283X10373814
Verschuere, L., Rombaut, G., Sorgeloos, P., Verstraete, W., 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 655–671. doi:10.1128/MMBR.64.4.655-671.2000.Updated
Xie, L., van der Donk, W. a, 2004. Post-translational modifications during lantibiotic biosynthesis. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 498–507. doi:10.1016/j.cbpa.2004.08.005
Xie, Y., An, H., Hao, Y., Qin, Q., Huang, Y., Luo, Y., Zhang, L., 2011. Characterization of an anti-Listeria bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LB-B1 isolated from koumiss, a traditionally fermented dairy product from China. Food Control 22, 1027–1031. doi:10.1016/j.foodcont.2010.12.007
Yagil, R., Etzion, Z., 2009. Effect of drought condition on the quality of camel milk. J. Dairy Res. 47, 159. doi:10.1017/S0022029900021026
Zergui, A., Noureddine, S., Venkatesan, A., Perumal, V., Hichem, B., Asma, Z., Yamina, M., Miloud, H., Mebrouk, K., 2014. Characterization and Potential Probiotic Attributes of Lactobacillus plantarum DU10 Isolated from Algerian Raw Camel Milk. Biotechnology(Faisalabad) 13, 282–288. doi:10.3923/biotech.2014.282.288
Zhao, D., Bai, Y., Niu, Y., 2015. Composition and characteristics of Chinese Bactrian camel milk. Small Rumin. Res. 127, 58–67. doi:10.1016/j.smallrumres.2015.04.008
7. Annexes
Journal of Food Science and Engineering 3 (2013) 55-63
Physico-chemical and Microbiological Analysis of Algerian Raw Camel’s Milk and Identification of Predominating Thermophilic Lactic Acid Bacteria
Merzouk Yamina, Chahrour Wassila, Zarour Kenza, Zergui Amina, Saidi Noureddine, Henni Jamal Eddine and
Kihal Mebrouk
Laboratory of Applied Microbiology, Department of Biology, Faculty of Science, Oran University, Oran 31100, Algeria
Received: November 26, 2012 / Published: February 20, 2013. Abstract: The dromedary camel (Camelus dromedarius) is a significant socioeconomic importance in several arid and semi-arid regions of North Africa and Middle East, and its milk constitutes an important component of human diets in these regions. The camel milk plays a vital role in the food of the Algerian nomads in the Sahara. During February and September, 20 samples of the raw camel’s milk were taken starting from different livestock of camels from three different Sahariennes regions (Bechar, El-Bayadh and Naama). These 20 collected samples were analyzed by physico-chemical and microbiological methods. The results of physicochemical analyze obtained from two hot and cold seasons are respectively the following: T °C (35.83 and 33.95), pH (6.36 and 6.49), density (1.031 and 1.032), dornic acidity (18.6 and 18.3 °D), dry matter (93.4 and 144.8 g/L), fat contents (30 and 52.1 g/L), total protein (26.3 and 33.1 g/L) and ashes (7.46 and 8.66 g/L). The protein profile obtained by electrophoretic analysis (SDS-PAGE) showed that camel milk contains several types of proteins and some have a molecular weight identical to major proteins of the cow’s milk. The final results showed that camel milk has generally a comparable composition to that of bovine milk. The microbiological analysis, of these samples, detected a significant number of the total microflora, Staphylococcus aureus and total coliforms. The absence of Clostridium and fecal coliforms was observed. Several species of lactic acid bacteria were detected such as Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Weissella cibaria and Enteroccocus feacalis. Key words: Raw camel’s milk, physicochemical analysis, microflora, electrophoretic analysis, proteins of milk.
1. Introduction
According to Food and Agriculture Organization of
the United Nations (FAO) statistics, there are about 19
million camels in the world, of which 15 million are
found in Africa and 4 million in Asia. Of this estimated
population, 17 million are considered to be a single
hump camels (Camelus dromedarius) and 2 million
with two-humped (Camelus bactrianus).
Approximately 15 million dromedaries, representing
two-thirds of the world camel population, are living in
the arid areas of Africa, particularly in Northeast Africa
(Somalia, Sudan, Ethiopia, and Kenya) [1-3]. In
Corresponding author: Kihal Mebrouk, professor, research
fields: food and applied microbiology. E-mail: [email protected].
Algeria, according to the statistics of FAO [4], the
population of camels is of 295,000 head. The
production of the camel milk per day and annual in
Algeria is respectively 3 kg and 1,460 kg [3]. Camel is
a unique animal having the ability to survive with low
cost of feeding under difficult climatic conditions
compared to other animals. It is a good source of meat
in areas where the climate adversely affects efficiency
of other animal’s production [5].
The camel (Camelus dromedarius) is of significant
socio-economic importance in many arid and semi-arid
parts of the world and its milk constitutes an important
component of human diets in these regions. The milk is
the main source of nutrition for the neonates, and
provides all the essential nutrients for growth and
D DAVID PUBLISHING
Physico-chemical and Microbiological Analysis of Algerian Raw Camel’s Milk and Identification of Predominating Thermophilic Lactic Acid Bacteria
56
development [6]. Camel milk has been consumed for
centuries by nomadic peoples for its nutritional value
and medicinal properties. Currently, pasteurized camel
milk is produced and sold only in a few countries
including Saudi Arabia, United Arab Emirates,
Kazakhstan, Mauritania and Algeria [7, 8].
The nomad’s populations have long believed that
raw camel’s milk is safe and even has therapeutic
virtues. Such empirical observation was scientifically
substantiated by demonstrating the stronger
antimicrobial activity of camel milk as compared to
that of other animal species and its ability to inhibit
Gram-positive and Gram-negative pathogens of
concern to food safety. Nonetheless, camel milk is
produced in a traditional way, and is usually collected,
handled and transported in poor sanitary conditions.
Moreover, camel herds rarely benefit from veterinary
care and, hence, mastitis diseases are common among
lactating females. Therefore, the milk produced is
likely to cause food-borne diseases and the natural
antimicrobial factors can only provide a limited
protection against specific pathogens and for a short
period. Such risk is higher when the milk is consumed
in its raw state as is commonly practiced by the local
producers [9]. The objective of this work is to evaluate the
chemical composition of the Algeria raw camel’s milk
and determine the dominant milk microflora.
2. Materials and Methods
2.1 Sampling
To obtain variability, 20 samples of camel milk were
collected in three different areas from the South
Algeria: Bechar (Abadla), EL Bayadh (Elkheitar) and
Naama (Table 1).
Four samples were collected on September 23, 2011
from Abadla (the race Ouled Sidi Cheikh, dark peeling),
six samples were collected on September 26, 2011 from
El Bayadh (race Rguibi, clear peeling) and 10 samples
were collected from Naama on February 9, 2012. The
different samples were taking in sterile bottles which
Table 1 Samples provenance of raw camel’s milk.
Regions Race Number of samples
Date
Bechar (Abadla)Ouled sidi Cheikh
4 September 23, 2011
Al-Bayadh (Elkheitar)
Rguibi 6 September 26, 2011
Naama (Bouktab)
Rguibi 10 February 9, 2012
were subjected to temperature and pH analysis. All
samples were transported to the Laboratory of Applied
Microbiology (Faculty of Science, University of Oran,
Es-senia) in an isothermal container for the physical,
chemical and microbiological analysis.
The food camels of these three areas are based
primarily on the plants of the Sahara such as Acacia
raddiana Savi (Talha), Artemisia herba alba Asso
(Chih), Euphorbia guyoniana Boiss. Rent. (Moulbina),
Trananurn nudatum Del (Damrane), Retama retam
Webb (Rtam) [10].
2.2 Physicochemical Analysis of the Camel Milk
The physicochemical analysis consisted in
measuring: the temperature (with an electronic
thermometer), the pH (with pH meter, Hanna
instruments) and the density (with a
thermo-lactodensimeter regulated at a temperature of
20 °C). The Dornic acidity was measured by titration
using a graduated pipette, a mixture of 10 mL of milk
and 2 to 3 drops of phenolphthalein indicator 1% (w/v),
following by the titration by NaOH solution (N/9). The
dry matter was measured, after desiccation by
evaporation of 5 g milk deposited in a dried capsule in
103 °C during 4 h. Total ashes were measured, after
incineration of 5 g milk deposited in a dry and tarred
capsule, with the Moufle furnace in 500 °C during 3 h.
The fat contents rate (by the method to Gerber) was
measured by the introduction, into a butyrometer, 10
mL of concentrated sulphuric acid, 11 mL of milk and
1 mL of amyl alcohol. The butyrometer was stopped
then turned over 3 to 4 times for mixing the three
products well; the direct reading of the fat content rates
is made on the graduated branch of the butyrometer
turned over after centrifugation during 3 to 5 min to
Physico-chemical and Microbiological Analysis of Algerian Raw Camel’s Milk and Identification of Predominating Thermophilic Lactic Acid Bacteria
57
1,000 rpm [11, 12]. The protein was measured by the
method of Bradford [13, 14].
2.3 Total Proteins Profile of Raw Camel Milk
(SDS-PAGE)
2.3.1 Preparation of the Samples
The creaming of the samples was done by
centrifugation with 4,000 rpm during 15 min at 4 °C.
The acidification of raw camel milk was made by the
addition of HCl 0.1 N to obtain pH 4.4 (iso-electric pH
of caseins) and for the goat and cow’s milk until
obtaining pH 4.6 (iso-electric pH of caseins). After
centrifugation, the precipitate obtained represents
caseins and the supernatant the lactoserum [15].
2.3.2 The Electrophoresis (SDS-PAGE)
Electrophoresis on polyacrylamide gel SDS-PAGE
was performed on freezing of concentration to 5% and
freezing of separation to 12.5% by using the technique
described by Laemmli [16]. A mixture of marker of
size was prepared with serum albumin (68 kDa), casein
(24 kDa), α-lactalbumin (14 kDa), ovalbumin (45 kDa),
lactoferrin (72 kDa) and β-lactoglobulin (18 kDa) [17].
2.4 Microbiological Analysis of the Camel Milk
The total aerobic mesophilic flora (TAMF)
considered as a good indicator of contamination were
counted on plate count agar (PCA) and were incubated
for 24 h at 30 °C. The coliforms were grown on the
desoxycolate citrate lactose agar (DCL) and were
incubated 24 h, at 37 °C for total coliforms and 44 °C
for fecal coliforms. Staphylococci were determined on
Chapman medium (Mannitol Salt Agar) and were
incubated for 48 h at 37 °C. The sulphite-reducing
clostridia were counted on the culture medium beef
liver agar distributed into tubes to promote anaerobic
conditions, with heat treatment for 10 min at 80 °C to
activate the germination of spores and destroy
vegetative cells; the tubes were incubated for 48 h at
37 °C. Only black colonies were counted. Fungal flora
was counted on malt extract agar (M.E) [18, 19].
2.5 Isolation and Identification of Thermophilic Lactic
Acid Bacteria
Thermophilic lactic acid bacteria were isolated on
MRS agar (pH 6.8) [20] and were incubated at 45 °C
for 48 h. The colonies were randomly picked from
plates with 30-300 colonies and several representative
strains displaying general characteristics of lactic acid.
Bacteria (LAB) were chosen from each plate for
further studies. The pure cultures were characterized
using Gram stain, cell morphology and catalase
reaction. The strains of LAB were stored without
appreciable loss of properties in skimmed milk with
30% (v/v) glycerol at -20 °C. Working cultures were
also kept on MRS agar slant at 4 °C and streaked every
4 weeks [21]. Colonies and cell morphology
characteristics on MRS agar were examined. Only
strains Gram-positive, catalase and
cytochrome-oxidase negative have been taken to
complete identification and the following tests were
applied: growth at 15 °C, 37 °C and 45 °C (MRS broth)
for 5 days; growth at pH 6.5 and pH 9.6; gas production
from glucose (Durham tubes); hydrolysis of arginine
(M16BPC medium) [22]. The production of acetoin
from glucose was determined by using the
Voges-Proskauer test [23]. The fermentation of
carbohydrates (arabinose, ribose, xylose, galactose,
fructose, mannitol, sorbitol, cellobiose, maltose,
lactose, melibiose, succrose, trehalose, raffinose,
esculin) was determined also in mini preparation with
ELISA microtiter plate [24-26].
2.5.1 Technological Characterization of Lactic Acid
Bacteria
Citrate utilization, in the presence of glucose, was
studied on KMK medium [27] allows to distinguish
between citrate-fermenting colonies (blue colour) and
non citrate fermenting colonies (white colour).
Production of dextran was recorded on MSE medium
[28] strains producing dextran are characterized by the
formation of large and viscous colonies. Proteolytic
activity was tested using Plat Count Agar PCA with 1%
Physico-chemical and Microbiological Analysis of Algerian Raw Camel’s Milk and Identification of Predominating Thermophilic Lactic Acid Bacteria
58
(w/v) of skim milk [26, 29], the presence of clear zones
around the colonies was recorder as positive activity.
3. Results and Discussion
The pH of fresh camel milk is 6.36 in September and
6.49 in February (Table 2), which is almost similar to
that obtained by Omer et al. and Bornaz et al. [30, 31].
The Dornic acidity ranges from 6.5 to 6.7 in September
and February, respectively, was lower than observed
by Omer et al. [30] and higher to that obtained by
Bornaz et al. and Meiloud et al. [31, 32]. This variation
of pH and acidity for the same source of milk could be
due to differences in hygiene of the actual milking and
the total microbial count of the milk [2]. The average
pH, acidity and density presented in Table 2 of camel
milk samples collected from different areas seasonal
(September and February) is significantly similar to
that observed by several authors [33, 34].
The fat content of Algerian dromedary camel milk is
between 30 g/L and 52.1 g/L in September and
February, respectively [34-36]. Dry matter is very
important quantity in February (144.88 g/L) and it is
lower in September (93.4 g/L) [30, 36]. The average fat
content, total dry matter and ash (Table 2) in Algerian
camel milk collected in September is greater than that
collected in February, which is probably due to
seasonal variation, lactation periods, the state of
dehydration animals and feeds [37, 38].
Native-PAGE electrophoretic patterns of camel, cow
and goat’s milk caseins (Fig. 1) showed that each type
of casein has a unique electrophoretic pattern. Camel,
cow and goat’s milk caseins showed the appearance of
three fractions differ in their migration positions. One
of these fractions was the major casein fraction and
other two were minor fractions, as indicated by small
arrows. Different casein fractions were identified on
the gel as described previous by El-Agamy et al. [39].
Electrophoresis analysis of Algerian camel milk
reveals several bands that are identical to those of
cow’s milk and goat’s milk (Fig. 1) presence of
α-lactalbumin 14 kDa, [34]. Lactoferrin 72 kDa is
present in some samples of camel milk (C1 and C2)
and in cow’s and goat milk. Our results show the
presence of SBA and Ovalbumin in all samples. The
casein fraction is present in all samples of camel milk,
goat milk and cow milk but the β-lactoglobulin 18 kDa
is present only in cow and goats milk [1].
The hygienic quality of camel milk samples
collected from different regions indicates the presence
of total aerobic mesophilic germs with an average rate
(Table 3) 2.2 105 cfu/mL in September and 3 104
cfu/mL in February. The presence of total coliforms
has an average 4.2 10 and 2.4 102 cfu/mL, the presence
of coliforms indicates a strong fecal contamination of
animal or human origin [9]. Presence of
Staphylococcus aureus in several samples has an
average 13 cfu/mL in the month of September and 3.4
10 cfu/mL in the month of February. The presence of
toxigenic pathogen could cause poisoning to the
consumer and mastitis disease in the camels herd [40].
The absence of pathogenic germs, coliforms and spores
of sulphite-reducing Clostridium which indicates the
absence of old fecal contamination.
Species identification of LAB: out of 30 strains
obtained from Algerian raw camel’s milk were
Gram-positive, catalase negative and non-spore-forming.
Table 2 Physico-chemical analysis of samples collected from camel milk in different seasons and comparison with the parameters of other countries.
Countries pH Dornic acidity (°D)
Density Dry matter (g/L)Fatty matter(g/L)
Ash (g/L) Protein (g/L)
T (°C)
Average ± SEa
(September) 6.369 ± 0.049 18.6 ± 0.069 1.031 ± 0.001 93.4 ± 5.42 30 ± 3.36 7.46 ± 0.28 26.3 ± 2.23 35.83 ± 0.58
Average ± SEa (Februray)
6.493 ± 0.052 18.3 ± 0.082 1.032 ± 0.001 144.88 ± 17.058 52.1 ± 4.121 8.667 ± 0.557 33.1 ± 2.13 33.95 ± 0.770
astrandard errors.
Physico-chemical and Microbiological Analysis of Algerian Raw Camel’s Milk and Identification of Predominating Thermophilic Lactic Acid Bacteria
59
Fig. 1 Electrophoretic patterns of SDS-PAGE of
dromedary’s milk. Kit = molecular weight (MW) standards
containing: a. Lactoferin (MW 72,000 Da); b. Bovine serum
albumin (MW 68,000 Da); c. Ovalbumin (MW 45,000 Da); d.
casein (MW 24,000 Da); e. β-lactoglobulin (α-Lg, MW
18,000 Da) and f. α-lactalbumin (α-La, MW 14,000 Da). C1
and C2, camel milk; B1, cow milk and G1, goats milk.
Table 3 Enumeration of microbial groups of hygienic significance in Algerian camel’s milk collected (February/September).
Microorganisms Max (February) (cfu/mL)
Max (September)(cfu/mL)
TAMF 30 ± 3 104 40 ± 2.2 105
Staphylococcus aureus 35 ± 3.4 10 290 ± 13
Total coliforms 20 ± 2.4 102 140 ± 4.2 10
Fecal coliforms 00 00
Clostridium 00 00
Fungal flora 00 37 ± 3.3 104
The morphological, physiological and biochemical
analysis revealed a diversity of LAB that were
subdivided into four groups: Lc. lactis subsp. lactis
(36.66%), Lactococcus lactis subsp. lactis biovar.
diacetylactis (30%), Weissella cibaria sp. Nov (13.13%)
and Enterococcus feacalis (20%) (Table 4).
The identification of strains was performed following
the recommendations of Carr et al., Bjorkroth et al.,
Khedid et al. and Dicks et al. [41-44].
Group 1: 11 homofermentative isolates, ADH
positive, acetoin negative, they do not grow at 6.5%
NaCl but grow at 4%;
Group 2: nine homofermentative isolates, ADH
positive, acetoin positive, grow at 4% of NaCl;
Group 3: four heterofermentative isolates, ADH
positive, grow at 15 °C, 37 °C, 45 °C and 4% of NaCl;
Group 4: six homofermentative isolates, ADH
positive, grow at 45 °C, 15 °C, pH 9.6, ADH positive,
does not ferment arabinose.
LAB predominated the total microflora; Lactococci
dominates the totality of this flora. In our research, the
absence of lactobacillus can be explained by their low
concentration in raw camel milk, similar results were
observed by Saidi et al. [45]. However, these strains
grow at 45 °C. The classic literature indicates that the
Lc. lactis subsp. lactis and Lactococcus lactis subsp.
lactis biovar. diacetylactis species did not grow at this
temperature. In 2009, Drici et al. [23] identified one
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis
strains which grow at 50 °C from Algerian raw camel’s
milk, they use the molecular identification test. This
thermo tolerance probably reflects an adaptation to the
high temperatures of the Algerian desert.
There are three groups of isolates according to their
proteolytic activities (Table 5): the first group contains
10 strains (1, 2, 11, 13, 19, 20, 22-25) that have a high
proteolytic activity area which is more 20 mm in
diameter. The second group contains 11 strains (3-6, 8,
10, 12, 16-18 and 21) which have a medium proteolytic
activity whose diameter is between 10 and 15, while
the third group contains four strains (7, 9, 14 and 15)
that have a low proteolytic activity area whose
diameter is less than 10 mm.
Camel milk composition was found to be less stable
than other species such as bovine milk. However,
variations observed in camel milk composition could
be attributed to several factors such as analytical
measurement procedures, geographical locations,
feeding conditions and samples being taken from
different breeds, in addition to other factors including
stage of lactation, age and calving number [46].
Geographical origin and seasonal variations were
found to be also the most effective factors in camel
milk composition. Konuspayeva et al. [47] studied the
effect of geographical origin on camel milk
Kit C1 C2 B1 G1
Physico-chemical and Microbiological Analysis of Algerian Raw Camel’s Milk and Identification of Predominating Thermophilic Lactic Acid Bacteria
60
Table 4 Morphological, physiological, biochemical and technological characteristics of thermophilic LAB isolated from Algerian raw camel’s milk.
Group Cocci
1 2 3 4
No. of isolates 11 9 4 6
Gram stain reaction G+ G+ G+ G+
Spores formation - - - -
Catalase activity - - - -
CO2 from glucose - - + -
NH3 from arginine + + + +
Growth at temperature (°C)
15 37 45
+ + +
+ + +
+ + +
- + +
Growth at pH 6.59.6
+ -
+ -
+ -
+ +
Growth in a medium with NaCl (%)
4 6.5
+ -
+ -
+ -
+ +
Production of dextrane from sucrose Acetoine from glucose Citrate utilization
- - -
- + +
- - +
- + +
Sugar fermentation Arabinose Ribose Xylose Galactose Fructose Mannitol Sorbitol Cellobiose Maltose Lactose Melibiose Saccharose Trehalose Raffinose Esculine
+ + + + + + - + + + - + + + +
- + + + + + - + + + + + - - +
+ + + + + + + + + + + + + + +
- - - + + + + + + + - + + - +
Species Lc. lactis subsp. lactisLc. lactis subsp. Lactisbiovar. diacetylactis
Weissella cibaria sp. nov.
Enterococcus feacalis
(+) = positive reaction, (-) = negative reaction.
composition and showed that the milk composition
from camels living in East Africa have higher fat
content than the milk from camels living in Africa and
Western Asia. Variation in camel milk composition
was also observed for camels from the same species
(dromedary) but domesticated in different parts of the
world [48].
An inverse relationship was found between total
solids in camel milk and water intake by camels. In the
first study, all components except lactose reached their
maxima in mid-winter and were lowest in summer. For
example, total solids were 13.9% in December and
January, and 10.2% in August due to availability of
drinking water [36]. In another study, the fat content of
camel milk was reported to decrease from 4.3% to
1.1% due to the increase in water content of milk
produced by thirsty camels [49]. The increase observed
in water content could be attributed to the decrease in
total solids produced by the thirsty camels.
As far as we know, this is the first report that
describes the distribution of LAB population in raw
camel milk from Algeria. LAB distribution showed a
high diversity of species that are dominant and
frequently described in various dairy products. The
Physico-chemical and Microbiological Analysis of Algerian Raw Camel’s Milk and Identification of Predominating Thermophilic Lactic Acid Bacteria
61
Table 5 Proteolytic activity of isolated lactic acid bacteria.
Isolates PCA + Lait 1% Diameter of proteolysis zone (mm)
1 + 20
2 + 20
3 + 10
4 + 10
5 + 10
6 + 15
7 + 9
8 + 10
9 + 8
10 + 15
11 + 16
12 + 13
13 + 18
14 + 5
15 + 7
16 + 15
17 + 12
18 + 11
19 + 17
20 + 20
21 + 10
22 + 16
23 + 18
24 + 20
25 + 18
abundance of some species such as Lactococcus lactis
subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar
diacetylactis and Weissella cibaria suggests their
possible use as starter culture in the manufacture of
camel fermented milk products. Indeed, a process for
the production of a camel milk cheese is under
investigation in several laboratories. Khedid et al. [43]
described several species of LAB isolated from raw
dromedary milk in Morocco but all predominant
species are thermophilic.
4. Conclusions
The most relevant finding in this investigation is that
thermophilic species are highly represented in Algerian
camel milk compared with cow milk and goat milk. All
isolates can grow at 45 °C. These findings are very
important since the one humped camel from Algeria
grow in regions where the ambient temperatures are
around 30 °C. Furthermore, during the lactating season
which may be extended between May and July, the
temperature can reach 40 °C. This is seemingly a very
interesting approach for the curdling of camel milk,
which can be handled under thermophilic conditions.
However, more studies are needed to complete the
isolation and the characterization of new LAB strains
that could be present in Algerian camel milk and to
compare the results with reports from other countries.
References
[1] E.I. El-Agamy, I. Elsayed, N. Mohsen, M. Sherif, A. Shamsiab, A. Sameh, Are camel milk proteins convenient to the nutrition of cow milk allergic children?, Small Ruminant Res. 82 (2009) 1-6.
[2] O.A.H. Al-Haj, A. Al-Kanhal, Compositional, technological and nutritional aspects of dromedary camel milk, Inter. Dairy J. 20 (2010) 811-821.
[3] Z. Farah, Camel Milk, in Encyclopedia of Dairy Sciences, (2nd ed.) Editor-in-Chief., 2011, pp. 512-517.
[4] Agro-statistics Database, Rome: Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2008.
[5] O.M.A. Abdelhadi, S.A. Babiker, B. Picard, C. Juriec, R. Jailler, J.F. Hocquette, et al., Effect of season on contractile and metabolic properties of desert camel muscle (Camelus dromedarius), Meat Sci. 90 (2012) 139-144.
[6] H. El-Hatmi, J.M. Girardet, J.L. Gaillard, M. Habib Yahyaoui, H. Attia, Characterisation of whey proteins of camel (Camelus dromedarius) milk and colostrums, Small Ruminant Research 70 (2007) 267-271.
[7] V. Dell’Orto, D. Cattaneo, E. Beretta, A. Baldi, G. Savoini, Effects of trace element supplementation on milk yield and composition in camels, Inter. Dairy J. 10 (2001) 873-879.
[8] P.C. Lorenzena, R. Wernery, B. Johnson, S. Joseb, U. Wernery, Evaluation of indigenous enzyme activities in raw and pasteurized camel milk, Small Rumt Res. 97 (2011) 79-82.
[9] N. Benkerroum, A. Boughdadi, N. Bennani, K. Hidane, Microbiological quality assessment of Moroccan camel’s milk and identification of predominating lactic acid bacteria, World J. of Microbiol. Biotech. 19 (2003) 645-648.
[10] K. Maiza, P. Brac, R.A. Hammiche, Pharmacopée traditionnelle saharienne: Sahara septentrional. Médicaments et Aliments: l’approche Ethnopharmacologique, Actes du 2e Colloque Européen d’Ethnophmacologie et de la 1l e Conférence
Physico-chemical and Microbiological Analysis of Algerian Raw Camel’s Milk and Identification of Predominating Thermophilic Lactic Acid Bacteria
62
internationale d’Ethnomédecine, Heidelberg, 1993, pp. 169-171.
[11] M.O. Koussou, P. Guiraud, L.Y. Mopaté, Evaluation de la qualité physico-chimique et hygiénique du lait de brousse et des produits laitiers locaux commercialisés dans les bars laitiers de N’Djamena au Tchad, Revue Elev. Méd. Vét. Pays Trop 60 (2007) (1-4) 45-49.
[12] S.B. Javaid, J.A.I. Gadah, M. Khaskeli, M.B. Bhutto, S. Kumbher, A.H. Panhwar, Physical and chemical quality of market milk sold at tandojam, Pakistan, Pakistan Vet. J. 2 9 (1) (2009) 27-31.
[13] M.M. Bradford, A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72 (1976) 248.
[14] N. Nasri, S. Triki, Les protéines de réserve du pin pignon (Pinus pinea L.), C.R. Biologies. 330 (2007) 402-409.
[15] N. Youcef, D. Saidi, F. Mezemaze, K.E. El-Mecherfi, H. Kaddouri, H. Negaoui, et al., Cross reactivity between dromedary whey proteins and IgG anti bovine α-lactalbumin and anti bovine β-lactoglobulin, Amer. J. Appl. Sci. 6 (8) (2009) 1448-1452.
[16] U.K. Laemelli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.
[17] J.N. Buffoni, I. Bonizzi, A. Pauciullo, L. Ramunno, M. Feligini, Characterization of the major whey proteins from milk of Mediterranean water buffalo (Bubalus bubalis), Food Chem. 127 (2011) 1515-1520.
[18] H. Aggad, F. Mahouz, Y. Ammar, M. Kihal, Evaluation de la qualité hygiénique du lait dans l’ouest algérien, Revue Méd. Vét. 160, 12 (2009) 590-595
[19] H. Labioui, L. Elmoualdi, A. Benzakour, M.E.L. Yachioui, E. Berny, M. Ouhssine, Etude physicochimique et microbiologique de laits crus, Bull. Soc. Pharm. Bordeaux. 148 (2009) 7-16.
[20] J.C. De Man, M. Rogosa, M.E. Sharpe, A medium for the cultivation of lactobacilli, J. Appl. Bacteriol. 23 (1960) 130-135.
[21] A. Badis, D. Guetarni, B. Moussa-Boudjema, J.E. Henni, M. Kihal, Identification and technological properties of lactic acid bacteria isolated from raw goat’s milk of four Algerian races, Food Microbiol. 21 (2004) 579-588.
[22] B. Guessas, M. Kihal, Characterization of lactic acid bacteria isolated from Algerian arid zone raw goats milk, Afr. J. Biotechnol. 3 (2004) 339-342.
[23] H. Drici, C. Gilbert, M. Kihal, D. Atlan, Atypical citrate-fermenting Lactococcus lactis strains isolated from dromedary’s milk, J. Appl. Microbiol. 108 (2009) 647-657.
[24] A.Z. Boumehira, A. Mami, A.R. Hamedi, J.E. Henni, M. Kihal, Identification and characterization of functional and technological Lactobacillus plantarum strains isolated
from raw goat and camel milk collected in Algeria, J. Pure Appl. Microbiol. 5 (2) (2011) 553-566.
[25] A. Mami, J.E. Henni, M. Kihal, Screening of autochthonous lactobacillus species from Algerian raw gaot's milk for the production of bacteriocin-like compounds against Staphylococcus aureus, Afr. J. Microbiol. Res. 6 (12) (2012) 2888-2898.
[26] B. Guessas, F. Adjoudj, M. Hadadji, M. Kihal, Isolation and identification of lactic acid bacteria from Dhan, a traditional butter and their major technological traits, World Appl Sci. J. 17 (4) (2012) 480-488.
[27] G.M. Kempler, L.L. McKay, Improved medium for detection of citrate-fermenting Streptococcus lactis subsp. diacetylactis, J. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1980) 956-927.
[28] J.V. Mayeux, W.W.E. Sandine, P.R. Elliker, A selective medium for detecting Leuconostoc organisms in mixed strain starter cultures, J. Dairy Sci. 45 (1962) 655-656.
[29] M. Moulay, H. Aggad, Z. Benmechernene, B. Guessas, D.E. Henni, M. Kihal, Proteolytic activity of cultivable lactic acid bacteria isolated from Algerian raw goat’s milk, World J. of Dairy Food Sci. 1 (1) (2006) 12-18.
[30] R.H. Omer, A.H. Eltinay, Changes in chemical composition of camel’s raw milk during storage, Pak. J. Nutr. 8 (5) (2009) 607-610.
[31] S. Bornaz, A. Sahli, A. Attalah, H. Attia , Physicochemical characteristics and renneting properties of camels milk: A comparison with goats, ewes and cows milks, Inter. J. Dairy Technol. 62 (4) (2009) 505-513.
[32] G.M. Meiloud, I.N. Ould bouraya, A. Samb, A. Houmeida, Composition of mauritanian camel milk: Results of first study, Inter. J. Agri. Biol. 13 (1) (2011) 145-147.
[33] M. Kamoun, Le lait de dromadaire: Production, aspects qualitatifs et aptitude à la transformation, Options méditerranéennes, série B., 1996, pp. 81-103.
[34] O. Alloui-lombarkia, E.H. Ghennam, A. Bacha, M. Abededdaim, Caractéristiques physico-chimiques et biochimiques du lait de chamelle et séparation de ses protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, Renc. Rech. Rum. 14 (2007) 108.
[35] H. El-Hatmi, T. Khorchani, H. Attia, Characterization and composition of camel’s (Camelus dromedarius) colostrums and milk, Microbiol. Hyg. Aliment. 18 (2006) 13-17.
[36] A.M. Kamal, O.A. Salama, K.M. El-Saied, Changes in amino acid profile of camel milk protein during the early lactation, Inter. Dairy J. 2 (2007) 226-234.
[37] M.S.Y. Haddadin, S. Gammoh, R.K. Robinson, Seasonal variations in the chemical composition of camel milk in Jordan, J. Dairy Res. 75 (2008) 8-12.
[38] E.S. Shuiep, I.E.M. El Zubeir, O.A.O. El Owni, H.H. Musa, Influence of season and management on
Physico-chemical and Microbiological Analysis of Algerian Raw Camel’s Milk and Identification of Predominating Thermophilic Lactic Acid Bacteria
63
composition of raw camel (Camelus dromedarius) milk in khartoum state, sudan, Tropic and Subtrop Agroecosystems 8 (2008) 101-106.
[39] E.I. El-Agamy, Z.I. Abou-Shloue, Y.I. Abdel-Kader, A comparative study of milk proteins from different species, II. Electrophoretic patterns, molecular characterization, amino acid composition and immunological relationships, in: Third Alexandria Conference on Food Science and Technology, Alexandria, Egypt, Mar., 1997, pp. 1-3
[40] E.S. Shuiep, T. Kanbar, N. Eissa, J. Alber, C. Lämmler, M. Zschöck, et al., Phenotypic and genotypic characterization of Staphylococcus aureus isolated from raw camel milk samples, Res. Veter. Sci. 86 (2009) 211-215.
[41] F.J. Carr, D. Chill, N. Maida, The lactic acid bacteria: A literature survey, Critical Rev. Microbiol. 28 (4) (2002) 281-370.
[42] J.K. Bjorkroth, U. Schillinger, R. Geisen, N. Weiss, B. Hoste, W.H. Holzapfel, et al., Taxonomic study of Weissella confuse and description of Weissella cibaria sp. nov. detected in food and clinical samples, Inter. J. Syst. Evol. Microbiol. 52 (2002) 141-148.
[43] K. Khedid, M. Faid, A. Mokhtari, A. Soulaymani, A.
Zinedine, Characterization of lactic acid bacteria isolated from the one humped camel milk produced in Morocco, Microbiol Res.164 (2009) 81-91.
[44] L.M.T. Dicks, A. Endo, Taxonomic status of lactic acid bacteria in wine and key characteristics to differentiate species, S. Afr. J. Enol. Vitic. 30 (1) (2009) 72-90.
[45] D. Saidi, M. Kihal, A. Hamama, A. Chekroune, J.E. Henni, O. Kheroua, Characterization of Algerian raw camels’ milk: Identification of dominant lactic acid bacteria and proteins analysis, J. Alg. Reg. Arides. 4 (2005) 1-9.
[46] M. Khaskheli, M.A. Arain, S. Chaudhry, A.H. Soomro, T.A. Qureshi, Physico-chemical quality of camel milk, J. Agri. Soc. Sci. 2 (2005) 164-166.
[47] G. Konuspayeva, B. Faye, G. Loiseau, The composition of camel milk: A meta-analysis of the literature data, J. Food Comp. Anal. 22 (2009) 95-101.
[48] M.A. Mehaia, M.A. Hablas, K.M. Abdel-Rahman, S.A. El-Mougy, Milk composition of Majaheim, Wadah and Hamra camels in Saudi Arabia, Food Chem. 52 (1995) 115-122.
[49] R. Yagil, Z. Etzion, Effect of drought condition on the quality of camel milk, J. Dairy Res. 47 (1980) 159-166.
G P
International Journal of Biological Chemistry 9 (2): 46-58, 2015ISSN 1819-155X / DOI: 10.3923/ijbc.2015.46.58© 2015 Academic Journals Inc.
Purification and Molecular Characterization of Two-AntimicrobialPeptides Produced by Lactobacillus plantarum DU10
1Zergui Amina, 1Saidi Noureddine, 2Arul Venkatesan, 3Bessaiah Hicham,4Benmalek Yamina, 5Bouayad Leila and 1Kihal Mebrouk1Department of Biology, Faculty of Life and Natural Sciences, Laboratory of Applied Microbiology, UniversityOran 1 Ahmed Ben Bella, BP 16, Es-Senia, 31100, Oran, Algeria2Department of Biotechnology, School of Life Sciences, Pondicherry University, Puducherry, 605014, India3UR454, INRA, Clermont-Ferrand Research Centre (Theix site), Saint-Genès Champanelle, F-63122,France4Microbiology Group, Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Faculty of Biological Sciences, USTHB,BP 32, El Alia, Bab Ezzouar, Algiers, Algeria5Animal Health and Production Laboratory, High National Veterinary School, BP 161, El-Harrach, Algiers,Algeria
Corresponding Author: Zergui Amina, Department of Biology, Faculty of Life and Natural Sciences, Laboratory of AppliedMicrobiology, University Oran 1 Ahmed Ben Bella, BP 16, Es-Senia, 31100, Oran, Algeria
ABSTRACTThe aim of this study was the partial characterization of plantaricin MZ, a two-component
antimicrobial peptides produced by the putative probiotic bacteria Lactobacillus plantarum DU10,which was isolated from Algerian raw camel milk. This biomolecule was secreted in thesupernatant of a L. plantarum DU10 culture and showed diverse spectrum of antimicrobialactivities against several pathogenic bacteria. The activity as determined by the proteolytic actionof trypsin, pepsin and proteinase K, plantaricin MZ was maintained even after a treatment at121°C for 15°C and a pH range from 2-10. This putative probiotic strain was found to produceantimicrobial substances proteinaceous in nature. Molecular mass determination wasestimated with tricine-sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, then confirmed by mass-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry. Theproducing strain and its antimicrobial peptides may find an application as a bio-preservativeagent.
Key words: Lactobacillus plantarum, probiotic, bacteriocin, purification, antimicrobial peptide
INTRODUCTIONAlgerian camel milk represents an important probiotic source, in which Lactobacillus
plantarum was the major species of Lactic Acid Bacteria (LAB) isolated from this product(Zineddine et al., 2011; Marroki and Bousmaha-Marroki, 2014). This strain is able to produceantimicrobial peptides with a specific action such as bacteriocins or bacteriocin-like inhibitorysubstances (Xie et al., 2011).
These bio-molecules can inhibit even in low concentrations bacterial growth especially theclosely related ones. Despite of their diversity and origins, they are all ribosomally synthesized
46
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
antimicrobial peptides. Bacteriocins produced by gram-positive bacteria can be classified into twomain groups. Group 1 includes antibiotics which are post-traditionally modified bacteriocins, group2 includes the unmodified bacteriocins and which can be divided into many subgroups due to theircharacteristics. For example, class IIa bacteriocins are called Listeria-active or pediocin-like. ClassIIb are two-peptide bacteriocins, class IIc are circular and class IId are linear and non-pediocinbacteriocins. From these subgroups, class IIb bacteriocins depends on the action of bothantimicrobial peptides.
Most of LAB bacteriocins are found as single peptides but some of them only were found astwo-peptide systems. In the same operon, each system is encoded by adjacent Open ReadingFrames (ORFs) situated in the same operon which are transcribed and synthesized in the sametime. They are completely active usually because of the synergistic action of the two peptides, whileeach peptide alone has less or no activity. In all previous studies, the optimal combination ratio ofthe two peptides is about 1:1 (Chen et al., 2014).
This type of systems is found in lantibiotics which have not been categorized into a defined classand in modified two peptides bacteriocins belonging to class IIb.
The first two-peptide bacteriocin was described for the first time from Lactococcus lactis subsp.lactis LMG 2081 named as Lactococcin G. Its activity, structure and mode of action have beenexamined extensively (Nissen-Meyer et al., 1992).
Bacteriocins, especially those produced by probiotic bacteria are of particular interest becauseof their potential as biopreservative (Wang et al., 2008).
Nisin is a good model of safe biopreservative according to Food and Drug Administration andhas hence beneficiated of many research works mainly probiotic ones.
Lactobacillus plantarum strains have gained particular interest these last two decades, mostof their plantaricins were not only characterized but amino acid also sequenced.
Both class I and class II plantaricins have been previously identified from differentL. plantarum strains (Atrih et al., 2001; Enan et al., 2002; Galvez et al., 2007; Gong et al., 2010;Hata et al., 2010; Hernandez et al., 2005; Holo et al., 2001; Tiwari and Srivastava, 2008;Zhang et al., 2013) and were found to show high antimicrobial activities against L. monocytogenes(Gong et al., 2010; Holo et al., 2001; Tiwari and Srivastava, 2008).
The probiotic potential of L. plantarum DU10 has already been established in our labs(Amina et al., 2014). Therefore, the present study was designed to partially characterize thetwo-antimicrobial peptides plantaricin MZ by molecular techniques after their purification tohomogeneity.
MATERIALS AND METHODSSampling: Lactic acid bacteria were isolated from raw camel milk in Southern Algerian farms,from Ouargla (Afran village, 786 km far from the capital Algiers). Ten milk samples were collectedin sterilized bottles and brought to applied microbiology laboratory at Oran 1 University (Algeria),then to the Department of Biotechnology at Pondicherry University (India) for further analysis.
Identification of the selected strain: The identification was determined by classical methods(Sharaf and Al Harbi, 2011), then finally by 16S rDNA sequencing using universal primers 16S1(5‘AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3‘) and 16S2 (5‘ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT 3‘) thensent to Microsynth Laboratories, Switzerland.
47
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
The obtained sequence was BLAST-analyzed using NCBI website and the results submitted toGenBank (Marroki et al., 2011; Kumar et al., 2010; Talpur et al., 2012; Amina et al., 2014).
Antimicrobial spectrum: The antimicrobial activity of Cell Free Supernatant (CFS) wasdetermined by agar well diffusion method against several pathogenic bacteria. The MRS agarcontaining the indicator strain was poured on petri dishes and then 4 mm wells were punched intoagar and filled with 80 µL of filter sterilized CFS of Lactobacillus plantarum using differentdilutions and adjusted to pH 6.5.
Clear zones around each well confirmed the antimicrobial activity of the selected probioticbacterium (Anas et al., 2012; Kumar and Arul, 2009).
Sensitivity to antibiotics: Twenty five milliliters of MRS agar was inoculated with 12 h oldculture and mixed carefully, then poured on petri dish. After solidification, all antibiotic discspresent in our lab were deposed on the medium and incubated at 37°C for 24 h. Clear zones ofinhibition indicated the sensitivity of the probiotic strain towards selected antibiotics.
Results were compared to ACFMS (Antibiogram Committee of the French Microbiology Society)to confirm the obtained results. The dilution method was used to determine the MinimumInhibitory Concentration (MIC) (Danielsen and Wind, 2003; Sahm and Washington, 1991;Vlkova et al., 2006).
Crude bacteriocin preparation and partial purification: The MRS Broth culture inoculatedwith 0.1% of DU10 inoculums grown for 16 h at 37°C. The cells were separated by centrifuging at8,500 g at 4°C for 15 min, then the cell free supernatant neutralized to pH 6.5±0.1 with 1 N NaOH(Enan, 2006).
The antimicrobial activities against pathogenic bacterial strains were elucidated by agar welldiffusion assay. Then the CFS was subjected to ultrafiltration using Amicon Ultra CentrifugalFilters, which enable the high concentration of proteins (Merck Millipore, Germany), as thedesirable putative bacteriocins were suspected below this molecular weight.
Ammonium sulfate was gradually added to the procured filtrate to attain up to 90% saturationand kept for overnight at 4°C. Then the precipitated proteins collected by centrifugation at10,000 g for 20 min at 4°C and dissolved in a minimal quantity of a 10 mM ammonium acetatebuffer (pH 6.0) and dialyzed 16 h against the same buffer at 4°C with a 1 kDa pore size dialysismembrane (spectrum labs, USA).
Purification of the antimicrobial peptide: The dialyzed crude bacteriocin was partially purifiedby Akta Prime plus protein purification system (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) whichwas connected with a size exclusion column (c) 10/20) and Sephadex G-25 (Sigma) as a matrix.Two milliliter of dialyzed sample was injected into the column which was equilibrated with 10 mMammonium acetate buffer (pH 6.0) and containing 0.01 M sodium chloride at a flow rate of0.5 mL minG1. The eluent was collected as 1 mL size of fractions. Each fraction carried out forantibacterial activity and protein profiling by Tricine SDS-PAGE. The active fraction waslyophilized and the concentrated fraction further purified by reverse phase liquid chromatographyRP-HPLC (Shimadzu, Japan).
48
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
Then, 25 µL of the concentrated bacteriocin which was collected from Akta prime plus columnpurification and able to inhibit pathogens was injected into an analytical C18 reverse-phase column(Luna 5 µm, 250×4.6 mm; Phenomenex, CA, USA). The elution was performed at a flow rate of1 mL minG1 using a linear gradient from 90% solvent A [0.1% (w/v) TriFluoro-Acetic Acid (TFA) in5% (v/v) acetonitrile in water] and 10% solvent B [0.1% TFA in 100% acetonitrile] to 42 and 58%of solvents A and B, respectively within 46 min. The peptide fractions were detectedspectrophotometrically by measuring the absorbance at 220 nm and collected manually. Thefractions were then lyophilized and dissolved in an ammonium acetate buffer (10 mM, pH 6.0) andkept for further analysis.
Effect of enzymes, pH and temperature on antibacterial activity: From the gel filtrationchromatography an active fraction was obtained and adjusted to 1 mg protein mLG1 (pH 6.5) aspartially purified antimicrobial peptides and followed by an antimicrobial activity test. Aliquots ofthese samples were co-incubated with several enzymes at 37°C for 2 h, pepsin (800 U mLG1,0.05 M citric acid buffer, pH 2.0, Sigma, USA), trypsin (250 U mLG1, 0.05 M sodium phosphatebuffer, pH 7.0, Sigma), proteinase K (38 U mLG1, pH 7.5, 0.05 M sodium phosphate buffer, Amresco,USA), α-chymotrypsin (100 U mLG1, 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 7.5, Sigma) and catalase(2000 U mLG1, 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 7.0, Sigma). After incubation, all samples wereadjusted to pH 6.5 with sterile 3 M NaOH or 3 M HCl and tested for antibacterial activity by usingListeria monocytogenes ATCC 15313 as an indicator strain. Partially purified antimicrobials inbuffers without enzyme and buffers alone were used as controls.
The pH of samples was adjusted (1 mg protein mLG1) to values varying from 2.0-10.0 withsterile 3 M NaOH or 3 M HCl to check its effect on the antimicrobial activity. After incubation at37°C during 72 h, the samples were re-adjusted to pH 6.5 with sterile 3 M NaOH or 3 M HCl andtested again for antibacterial activities.
By heating the partially purified antimicrobials, the effect of temperature on antibacterialactivity was tested (1 mg protein mLG1) at 60°C/30 min, 80°C/30 min, 100°C/30 min 121°C/15 min,respectively, then the samples were cooled and residual antibacterial activities were tested by usingListeria monocytogenes ATCC 15313, as an indicator strain. In experiments of 121°C, heating andcooling time were about 15 min, respectively. All experiments were conducted in triplicate(Al-Otaibi, 2012).
Molecular mass determination: The molecular mass of the antimicrobial peptide wasconfirmed by Mass-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry(MALDI-TOF/MS) using the Proteomic facility of the Molecular Biophysics Unit at the IndianInstitute of Sciences, Bangalore, India (Kaur et al., 2013).
Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis: The separated fractionsobtained after an HPLC analysis, were used to determine the molecular size by Tricine SDS-PAGE(10%) which was run under reducing and non reducing conditions (Schagger and Jagow, 1987). Theprobe buffer wasn’t neither boiled nor added of 2-mercaptoethanol. The SDS was removed bywashing the gel 4 times for 10 min in distilled water and then the gel was placed in a petri dishcontaining a 2% agar medium overlaid with a precooled 0.7% agar medium inoculated with the
49
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
Lactobacillus plantarum strain M67 16S ribosomal RNA gane partial sequence gene for 16S ribosomal RNA partial sequence strain qz1195Lactobacillus plantarum strain 3m 116S ribosomal RNA gene partial sequenceLactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum strain TW 242 16S ribosomal RNA gene partial sequenceLactobacillus plantarum gene for 16S ribosomal RNA partial sequence strain qz 138da
Lactobacillus plantarum partial 16S RNA gene isolate isolate 8 strain MG 26 16S ribosomal RNA gene partial sequenceLactobacillus plantarum strain YM 2116S ribosomal RNA gene partial sequenceLactobacillus plantarum strain M42 16S ribosomal RNA gene partial sequenceLactobacillus plantarum strain M41 16S ribosomal RNA gene partial sequenceLactobacillus plantarum ZJ316 complete genomeLactobacillus plantarum strain DU 10 16S ribosomal RNA gene partial sequence Lactobacillus plantarum
Lactobacillus sp. SXVIII 102011 16S ribosomal RNA gene partial sequenceLactobacillus plantrum gene for16 S ribosomal RNA sequence strain qz139
Lactobacillus plantrum plantraum subsp P8 complete genomeLactobacillus plantrum strain M60 16 S ribosomal RNA gene partial sequence
Lactobacillus plantrum strain p516S ribosomal RNA gene partial sequenceLactobacillus plantrum strain M7416S ribosomal RNA gene partial sequenceLactobacillus sp. ZJHD7 14 16S ribosomal RNA gene partial sequenceLactobacillus plantarum 16 complete genomeLactobacillus plantrum sups plantarum gene 16 S RNA partial sequence strain TO 1002Lactobacillus plantrum strain M68 16 S ribosomal RNA gene partial sequence
Frmioutes
Frmioutes
indicator organism at 37°C for 24 h. A low molecular mass protein marker with sizes ranging from3.0-97.4 kDa (Bangalore Genei, Bangalore, India) was used. The gel was stained using the silverstaining method (Morrissey, 1981).
RESULTS AND DISCUSSIONIdentification of Lb. plantarum from raw camel milk: Among 50 lactic acid bacteria isolatedfrom Algerian raw camel milk, only one was selected in this study for its remarkablecharacteristics. The Isolate was identified as Lactobacillus plantarum DU10 by morphological,biochemical and phylogenetic 16S rDNA sequence method as described previously by Amina et al.(2014). The obtained sequence was identified and deposited in Genbank under the AccessionNumber KF724943. The phylogenic tree is shown in Fig. 1.
Inhibitory spectrum of DU10: CSF of L. plantarum DU10 gave clear zones around the indicatorpathogenic strains. The largest diameter of inhibition which is 25 mm, was obtained with the CFSof this probiotic strain (Yateem et al., 2008) on L. monocytogenes and L. innocua. Table 1 indicatesthat L. plantarum is able to inhibit the growth of both gram-positive and gram-negative bacteria.
Table 1: Antimicrobial activity of DU10 towards pathogenic bacteriaPathogenic strains SensitivityListeria monocytogenes ATCC 15313 +++Listeria innocua ATCC 33090 +++Staphylococcus aureus ATCC 6538 +++Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 +++Escherichia coli ATCC 8739 ++Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 +Salmonella enterica ATCC 14028 ++Salmonella typhi ATCC 700720 ++Vibrio fischeri ATCC 700601 +Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 ++: >5 mm, 5< ++: <10 mm and +++: <10 mm
Fig. 1: Blast tree view of L. plantarum DU10 using blast pairwise alignments
50
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
Adeniyi et al. (2006) have used the CFS of Lactobacillus strains to prove their growth inhibitionof all organisms implicated in urinary tract infection.
Lactobacillus plantarum (Yateem et al., 2008) has been isolated from un-pasteurized camelmilk which was allowed to ferment spontaneously for one week, was able to inhibit the growthof the Gram-negative tested bacteria such as Salmonella spp. and E. coli strains. Dialyzedsample (semi-crude preparation) of L. plantarum DU10 has shown a broad spectrum antibacterialactivity towards several gram-positive and gram-negative pathogens. Similarly, plantaricin 423 reported by Van Reenen et al. (1998) and plantaricin LP84 reported by Suma et al. (1998)showed inhibitory activity towards several pathogens such as S. aureus and B. subtilis.
Plantaricin 35d produced by a L. plantarum strain showed a broad spectrum of antimicrobialactivity including S. aureus and L. monocytogenes according to Messi et al. (2001). Lash et al. (2005)described a bacteriocin produced by L. plantarum (ATCC 8014), which inhibited S. aureus, E. coli,L. innocua and P. aeruginosa. Plantaricin 35d produced by a L. plantarum strain showed alarge broad spectrum of antimicrobial activity including S. aureus and L. monocytogenes(Messi et al., 2001). Valenzuela et al. (2008) described an antimicrobial peptide that inhibitedpathogenic bacteria like B. cereus, E. coli and S. enterica. Gong and Xie have reportedplantaricin MG produced by L. plantarum KLDSI 0391 that inhibited many pathogens suchas L. monocytogenes, S. aureus, S. thyphimurium and E. coli (Gong et al., 2010; Xie et al.,2011).
Xie et al. (2011) described an active bacteriocin against strains of Lactobacillus, Listeria,Sreptococcus and Pediococcus. Plantaricin LD1 produced by food isolate of Lactobacillus plantarumLD1 inhibited not only related strains but also other gram-positive and gram-negative bacteriasuch as S. aureus, P. aeruginosa, S. typhi as described by Gupta and Tiwari (2014). Plantaricin Yproduced by L. plantarum 510 reported by Chen et al. (2014) showed strong inhibitory activityagainst L. monocytogenes BCRC 14845.
Sensitivity to antibiotics: The probiotic bacterium was sensitive to most selected antibioticsexcept for polymyxin, kanamycin, sulfafurazole, cefpodoxim and vancomycin. Various reportsshowed that Lactobacillus plantarum DU10 was naturally resistant to some antibiotics, suchas penicillin G, ampicillin, vancomycin, chloramphenicol or ciprofloxacin. These results are notin concordance with ours, except for vancomycin (Coppola et al., 2005; Halami et al., 2000)(Table 2).
This antibiotic belongs to glycopeptide antibiotics and inhibits the peptidoglycan synthesiswhich is important structural component of cell wall bacterial. Consequently, lactic acid bacteriaare particularly vulnerable to vancomycin treatment (Reynolds, 1989).
Purification of microbial peptides: To purify plantaricin MZ, the CFS was ultrafiltered througha 10 kDa membrane, precipitated with ammonium sulfate, dialyzed and subjected to SephadexG-25 gel chromatography (Fig. 2). The resulting active fraction was lyophilized and dissolved in aminimum volume of solvent A for an HPLC analysis.
Upon injection of the Sephadex G-25-purified sample into the reverse-phase HPLC, two distinctpeaks were observed, corresponding to a retention time of 16.90 and 23.38 min, respectively
51
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
Fig. 2: Sephadex G-25 chromatogram for the whole bacteriocin sample. The bacteriocin sample waspurified by Sephadex G-25 gel chromatography and eluted at a flow rate of 0.5 mL minG1
Table 2: Antibiotic sensitivity of Lactobacillus plantarum DU10Pathogenic strains Sensitivity Disc concentration (µg/disc)Chloramphenicol S 30Amoxycillin S 10Vancomycin R 30Gentamycin S 10Oxytetracycline S 30Erythromycin S 10Amikacin S 30Penicillin S 10Cefpodoxim R 10Neomycin S 30Methicillin S 30Novobiocin S 30Kanamycin R 30Rifampicin S 30Tetracycline S 5Ampicillin S 10Polymyxin R 300Sulfafurazole R 300Ciprofloxacin S 5S: Sensitive and R: Resistant
(Fig. 3). These peaks were also shown to be active against Listeria monocytogenes ATCC 15313 andStaphylococcus aureus ATCC 6538 and used for the molecular mass determination.
52
-200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400
Time (min)
400
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
-100 6 11
16
21
26
31
36
41
46
51
56
61
66
71
76
81
86
91
96
Frac
tion
size
1.5
mL
Paus
e
0.07
/18/
2013
. 10:
06:5
1 PM
indi
a st
anda
mA
u
UV Cond pH Pressure Temperature Concentration Positive
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
Fig. 3: High Performance Liquid Chromatography chromatogram of plantaricin M and Z. Thelyophilized partially purified samples were resuspended in a minimal quantity of solventA. A 25 µL sample was eluted using a linear gradient from 90% solvent A [0.1% (w/v)trifluoroacetic acid (TFA) in 5% (v/v) acetonitrile in water] and 10% solvent B (0.1% TFAin 100% acetonitrile) to 42 and 58% of solvents A and B, respectively within 46 min. Twodistinct peaks of purified plantaricin M and Z were obtained at 16.90 and 23.38 min,respectively
Table 3: Antimicrobial spectrum expressed as residual bacteriocin activity of mixed fractions (1:1 molar ratio)Residual bacteriocin activity (%)-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Temperature and time Surfactant pH60°C, 30 min (100) Catalse (100) 2.0 (100)80°C, 30 min (100) Proteinase-K (0) 6.0 (100)100°C, 30 min (100) A-Chymotrypsin (0) 8.0 (100)121°C, 15 min (100) Trypsin (0) 10.0 (100)
Pepsin (0)Lipase (100)
Negative results were found when both fractions were tested separately, this means that the two-peptide bacteriocins acts synergistically
Effect of enzyme and heat treatment on antimicrobial activity: Plantaricin MZ was foundto be heat resistant to 121°C for 15 min. At temperatures of 60, 70 and 80°C for 30 min, 100%activity was retained and stable. This may constitute an advantage in view of its potential use asa food additive in processes like pasteurization and drying (Bhattacharya and Das, 2010). It wassensitive to pepsin, trypsin, chymotrypsin and proteinase-K but insensitive to catalase confirmingthat inhibition was due to proteinaceous molecule (bacteriocin). Its activity was not reduced bylipase indicating that there was no structural modification by lipid moiety (Table 3). In previousstudies, most plantaricins treated with trypsin were inactivated (Gong et al., 2010; Gonzalez et al.,1994; Jimenez-Diaz et al., 1993; Tiwari and Srivastava, 2008; Van Reenen et al., 1998; Zhang et al.,2013). Treatment of plantaricin Y with trypsin provided a similar result usingW. paramesenteroides BRCR 14006 as the indicator strain but inhibitory activity was observed
53
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Time (min) 1 Det. A Ch1/220 nm 2 Det. A Ch2/254 nm
4000000
3000000
2000000
1000000
0
uV
1 Det. A Ch1 2 Det. A Ch2
42.6
6 44
.37
44.9
5
36.4
9
32.9
7
29.9
3
23.4
6 23
.38
16.9
0
21.5
3 21
.06
18.9
4
16.9
0
11.5
2 12
.81
10.1
5 9.
25
8.90
0.30
0.
11
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
when L. monocytogenes BCRC 14845 was used as the indicator strain. In order to determinewhether trypsin-treated plantaricin MZ has inhibitory activity against other tested bacteria,activity against all the indicator strains listed in Table 1 was tested. To clarify this, more detailedanalyses are necessary in future studies.
Negative results were found when both fractions were tested separately, this means that thetwo-peptide bacteriocins acts synergistically.
Molecular mass determination: Plantaricin M and Z were purified to homogeneity andMALDI-TOF/MS confirmed the purity of samples and determined the exact molecular mass ofpeptides to be 6.7956 and 7.1922 kDa, respectively as shown in Fig. 4 and 5.
These bacteriocins could temporary been classified as a class II bacteriocin based on theirmolecular mass [9]. Previous reports on molecular weight of bacteriocins isolated fromL. plantarum strains did not exactly corresponded to Plantaricin M and Z.
Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis: A clear zone in nativePAGE was observed (Fig. 6) which was corresponding to purified antimicrobial peptides PlantaricinM and Z with a molecular weight around 6 and 7 kDa, respectively.
Fig. 4: Mass-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrum of plantaricin M.The single active peak fraction of HPLC was subjected to mass spectrometry. Themass-assisted laser desorption ionization time of flight analysis showed a distinct peakaround 670 m zG1, indicating that the molecular mass of the bacteriocin protein was6.7956 kDa
54
600 800 1000 1200 1400 1500 1800 2000
m/z
×105
1.5
1.0
0.5
0.0
208.668 1078.633 979.562 905.752
1490
.842
1419.822 1576.861
679.561
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
Fig. 5: Mass-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrum of plantaricin Z. Thesingle active peak fraction of HPLC was subjected to mass spectrometry. The Mass-assistedlaser desorption ionization time of flight analysis showed a distinct peak around 7250 m zG1,indicating that the molecular mass of the bacteriocin protein was 7.1922 kDa
Fig. 6: Tricine SDS-Page of DU10 antimicrobial peptides, Lane 1: Molecular weight markers,Lane 2: Position of peptide bands and Lane 3: Gel overlaid with the pathogenic strain
These results have validated further the molecular mass of the antimicrobial peptides as 6.7956and 7.1922 kDa. Data obtained indicate that plantaricin M and Z have a different molecular massand characteristics to other known bacteriocins from L. plantarum.
55
97.4 kDa
66.0 kDa
43.0 kDa 29.0 kDa 20.1 kDa
14.3 kDa
6.5 kDa
3.0 kDa
2000 4000 6000 8000 10000 12000
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
Inte
ns (a
.u)
×104
m/z
7192.3
8837.27748.56742.93595.5
2123.3
1566.1
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
CONCLUSIONIn vitro screening of Lactobacilli from raw camel milk constitutes a valuable strategy for the
large-level preliminary selection of putatively safe LAB expected for use as probiotic cultures.This study shows that filter sterilized CFS from L. plantarum DU10 exhibited antimicrobial
activity against both gram-positive and gram-negative bacteria. The purified two-componentantimicrobial peptides plantaricin MZ were reported for the first time in this research work.
Some additional studies should be done to know the power of adhesion, mode of action and thestability of the isolate to manufacturing processes.
ACKNOWLEDGMENTSWe gratefully acknowledge the support provided under C.V Raman International Fellowship
for African Researchers, from the Federation of Indian Chambers of Commerce and Industry(FICCI) and from the Department of Science and Technology (DST), without which the presentstudy could not have been completed. Special thanks to Mrs. and Mr. Belyagoubi from Abou BekrBelkaid University of Tlemcen for their generosity and kindness.
REFERENCESAdeniyi, B.A., F.A. Ayeni and S.T. Ogunbanwo, 2006. Antagonistic activities of lactic acid bacteria
isolated from Nigerian fermented dairy food against organisms implicated in urinary tractinfection. Biotechnology, 5: 183-188.
Al-Otaibi, M.M., 2012. Isolation of lactic acid bacteria from some traditional Saudi food.Am. J. Food Technol., 7: 690-699.
Amina, Z., S. Noureddine, A. Venkatesan, V. Perumal and B. Hichem et al., 2014. Characterizationand potential probiotic attributes of Lactobacillus plantarum DU10 isolated from Algerian rawcamel milk. Biotechnology, 13: 282-288.
Anas, M., B.A. Zinedine, H.A. Rizk, H.J. Eddine and K. Mebrouk, 2012. Screening of autochthonousLactobacillus species from Algerian raw goats' milk for the production of bacteriocin-likecompounds against Staphylococcus aureus. Afr. J. Biochem., 11: 4595-4607.
Atrih, A., N. Rekhif, A.J.G. Moir, A. Lebrihi and G. Lefebvre, 2001. Mode of action, purification andamino acid sequence of plantaricin C19, an anti-Listeria bacteriocin produced byLactobacillus plantarum C19. Int. J. Food Microbiol., 68: 93-104.
Bhattacharya, S. and A. Das, 2010. Study of physical and cultural parameters on the bacteriocinsproduced by lactic acid bacteria isolated from traditional Indian fermented foods.Am. J. Food Technol., 5: 111-120.
Chen, Y.S., Y.C. Wang, Y.S. Chow, F. Yanagida, C.C. Liao and C.M. Chiu, 2014. Purification andcharacterization of plantaricin Y, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum 510.Arch. Microbiol., 196: 193-199.
Coppola, R., M. Succi, P. Tremonte, A. Reale, G. Salzano and E. Sorrentino, 2005. Antibioticsusceptibility of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from Parmigiano Reggiano cheese.Lait, 85: 193-204.
Danielsen, M. and A. Wind, 2003. Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents.Int. J. Food Microbiol., 82: 1-11.
Enan, G., 2006. Behaviour of Listeria monocytogenes LMG 10470 in poultry meat and its controlby the bacteriocin plantaricin UG 1. Int. J. Poult. Sci., 5: 355-359.
56
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
Enan, G., S. Alalyan, H.A. Abdel-Salam and J. Debevere, 2002. Inhibition of listeria monocytogenesLMG10470 by plantaricin UG1 in vitro and in beef meat. Nahrung, 46: 411-414.
Galvez, A., H. Abriouel, R.L. Lopez and N.B. Omar, 2007. Bacteriocin-based strategies for foodbiopreservation. Int. J. Food Microbiol., 120: 51-70.
Gong, H.S., X.C. Meng and H. Wang, 2010. Plantaricin MG active against Gram-negative bacteriaproduced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 isolated from Jiaoke, a traditionalfermented cream from China. Food Control, 21: 89-96.
Gonzalez, B., P. Arca, B. Mayo and J.E. Suarez, 1994. Detection, purification and partialcharacterization of plantaricin C, a bacteriocin produced by a Lactobacillus plantarum strainof dairy origin. Applied Environ. Microbiol., 60: 2158-2163.
Gupta, A. and S.K. Tiwari, 2014. Plantaricin LD1: A bacteriocin produced by food isolate ofLactobacillus plantarum LD1. Applied Biochem. Biotechnol., 172: 3354-3362.
Halami, P.M., A. Chandrashekar and K. Nand, 2000. Lactobacillus farciminis MD, a newer strainwith potential for bacteriocin and antibiotic assay. Lett. Applied Microbiol., 30: 197-202.
Hata, T., R. Tanaka and S. Ohmomo, 2010. Isolation and characterization of plantaricin ASM1: Anew bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum A-1. Int. J. Food Microbiol., 137: 94-99.
Hernandez, D., E. Cardell and V. Zarate, 2005. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolatedfrom Tenerife cheese: Initial characterization of plantaricin TF711, a bacteriocin-like substanceproduced by Lactobacillus plantarum TF711. J. Applied Microbiol., 99: 77-84.
Holo, H., Z. Jeknic, M. Daeschel, S. Stevanovic and I.F. Nes, 2001. Plantaricin W fromLactobacillus plantarum belongs to a new family of two-peptide lantibiotics. Microbiology,147: 643-651.
Jimenez-Diaz, R., R.M. Rios-Sanchez, M. Desmazeaud, J.L. Ruiz-Barba and J.C. Piard, 1993.Plantaricins S and T, two new bacteriocins produced by Lactobacillus plantarum LPCO10isolated from a green olive fermentation. Applied Environ. Microbiol., 59: 1416-1424.
Kaur, B., P. Balgir, B. Mittu, A. Chauhan and B. Kumar, 2013. Purification and physicochemicalcharacterization of anti-Gardnerella vaginalis bacteriocin HV6b produced by Lactobacillusfermentum isolate from human vaginal ecosystem. Am. J. Biochem. Mol. Biol., 3: 91-100.
Kumar, R.S. and V. Arul, 2009. Purification and characterization of phocaecin PI80: Ananti-listerial bacteriocin produced by Streptococcus phocae PI80 Isolated from the gut ofPeneaus indicus (Indian white shrimp). J. Microbiol. Biotechnol., 19: 1393-1400.
Kumar, R.S., D.R. Varman, P. Kanmani, N. Yuvaraj, K.A. Paari, V. Pattukumar and V. Arul, 2010.Isolation, characterization and identification of a potential probiont from South Indianfermented foods (Kallappam, Koozh and Mor Kuzhambu) and its use as biopreservative.Prob. Antimicrob. Prot., 2: 145-151.
Lash, B.W., T.H. Mysliwiec and H. Gourama, 2005. Detection and partial characterization of abroad-range bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum (ATCC 8014). Food Microbiol.,22: 199-204.
Marroki, A. and L. Bousmaha-Marroki, 2014. Lactobacilli isolated from Algerian goat's milk asadjunct culture in dairy products. Braz. Arch. Biol. Technol., 57: 410-420.
Marroki, A., M. Zuniga, M. Kihal and G. Perez-Martinez, 2011. Characterization of Lactobacillusfrom Algerian goat's milk based on phenotypic, 16S rDNA sequencing and their technologicalproperties. Braz. J. Microbiol., 42: 158-171.
Messi, P., M. Bondi, C. Sabia, R. Battini and G. Manicardi, 2001. Detection and preliminarycharacterization of a bacteriocin (plantaricin 35d) produced by a Lactobacillus plantarumstrain. Int. J. Food Microbiol., 64: 193-198.
57
Int. J. Biol. Chem., 9 (2): 46-58, 2015
Morrissey, J.H., 1981. Silver stain for proteins in polyacrylamide gels: A modified procedure withenhanced uniform sensitivity. Anal. Biochem., 117: 307-310.
Nissen-Meyer, J., L.S. Holo, Havarstein, K. Sletten and I.F. Nes, 1992. A novel Lactococcalbacteriocin whose activity depends on the complementary action of two peptides. J. Bacteriol.,174: 5686-5692.
Reynolds, P.E., 1989. Structure, biochemistry and mechanism of action of glycopeptide antibiotics.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 8: 943-950.
Sahm, D.F. and J.A. Washington, 1991. Antibacterial Susceptibility Tests: Dilution Methods.In: Manual of Clinical Microbiology, Balows, A. (Ed.). 5th Edn., American Society forMicrobiology, Washington, DC., USA., ISBN-13: 9781555810290, pp: 1105-1116.
Schagger, H. and G. von Jagow, 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem.,166: 368-379.
Sharaf, E.F. and R.M. Al Harbi, 2011. Isolation, Identification and antimicrobial activity of somelocal isolates of lactic acid bacteria. Res. J. Microbiol., 6: 826-838.
Suma, K., M.C. Misra and M.C. Varadaraj, 1998. Plantaricin LP84, a broad spectrum heat-stablebacteriocin of Lactobacillus plantarum NCIM 2084 produced in a simple glucose broth medium.Int. J. Food Microbiol., 40: 17-25.
Talpur, A.D., A.J. Memon, M.I. Khan, M. Ikhwanuddin, M.M.D. Daniel and A.B. Abol-Munafi,2012. Isolation and screening of lactic acid bacteria from the gut of blue swimming crab,P. pelagicus, an in vitro inhibition assay and small scale in vivo model for validation of isolatesas probiotics. J. Fish. Aquat. Sci., 7: 1-28.
Tiwari, S.K. and S. Srivastava, 2008. Purification and characterization of plantaricin LR14: A novelbacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LR/14. Applied Microbiol. Biotechnol.,79: 759-767.
Valenzuela, A.S., G.D. Ruiz, N. Ben Omar, H. Abriouel and R.L. Lopez et al., 2008. Inhibition offood poisoning and pathogenic bacteria by Lactobacillus plantarum strain 2.9 isolated from bensaalga, both in a culture medium and in food. Food Control, 19: 842-848.
Van Reenen, C.A., L.M. Dicks and M.L. Chikindas, 1998. Isolation, purification and partialcharacterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum.J. Applied Microbiol., 84: 1131-1137.
Vlkova, E., I. Trojanova and V. Rada, 2006. Distribution of Bifidobacteria in the gastrointestinaltract of calves. Folia Microbiologica, 51: 325-328.
Wang, Y., Z. Ahmed, W. Feng, C. Li and S. Song, 2008. Physicochemical properties ofexopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 isolated from Tibet kefir.Int. J. Biol. Macromol., 43: 283-288.
Xie, Y., H. An, Y. Hao, Q. Qin, Y. Huang, Y. Luo and L. Zhang, 2011. Characterization of ananti-Listeria bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LB-B1 isolated from koumiss,a traditionally fermented dairy product from China. Food Control, 22: 1027-1031.
Yateem, A., M.T. Balba, T. Al-Surrayai, B. Al-Mutairi and R. Al-Daher, 2008. Isolation of lactic acidbacteria with probiotic potential from camel milk. Int. J. Dairy Sci., 3: 194-199.
Zhang, H., L. Liu, Y. Hao, S. Zhong, H. Liu, T. Han and Y. Xie, 2013. Isolation and partialcharacterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum BM-1 isolated from atraditionally fermented Chinese meat product. Microbiol. Immunol., 57: 746-755.
Zineddine, B.A., M. Anas, H.A. Rizk, H.J. Eddine and K. Mebrouk, 2011. Identification andcharacterization of functional and technological Lactobacillus plantarum strains isolated fromraw goat and camel milk collected in Algeria. J. Pure Applied Microbiol., 5: 553-566.
58
ملخص
ساللة بكتيرية واحدة فقط اختيرت لهذا الدراسة و التي ’ بكتيريا حمض اللبن المنتجة للبكتيريوسينات 55من بين ذات خصائص KF724943 تحت الرقم التسلسلي Lactobacillus plantarum DU10 أطلقنا عليها اسم
ذات الوزن الجزيئي Zو Plantaricine M بروبيوتيك. عملية تنقية البكتيريوسين كشفت وجود بيبتيدين إثنين. يمكن زيادة التونديلو ك 7.19و التونديلو ك 6.31على التوالي MALDI-TOFالدقيق و المحدد بطريقة
Tween 80يحتوي على ملح الطعام و MRSبكثرة وذلك باستعمال وسط غذائي Plantaricine MZإنتاج
Tweenمن %0.4و ملح الطعام % pH 6.5 ,3م, °35بحيث أن الشروط المثالية تتمثل في درجة حرارة
, و الذي من الناحية الصناعية أقل تكلفة. 80
Lactobacillus plantarumبكتيريا حمض اللبن, بروبيوتيك, بيبتيد, الكلمات المفتاحية:
Résumé
Parmi 55 bactéries lactiques bactériocinogènes, une seule souche est sélectionnée
pour cette étude dénommée Lactobacillus plantarum DU10 sous le numéro
d’accession KF724943 présentant des caractères probiotiques. La purification de la
bactériocine produite a révélé la présence de deux peptides antimicrobiens
Plantaricine M et Z dont le poids moléculaire exact déterminé par MALDI-TOF est de
6. 31 kDa et 7,19 kDa respectivement. La production de plantaricine MZ peut être
augmentée considérablement en utilisant un milieu de culture MRS contenant
seulement du NaCl et Tween 80 dont les conditions optimales sont une température
de 35°C ; pH 6.5, 3% NaCl et 0.4% de Tween 80, ce qui présente un coût moins cher
pour l’industrie.
Mots clés : Bactéries lactiques, probiotique, peptide, Lactobacillus plantarum
Abstract
Among 55 lactic acid bacteria producing bacteriocins, only one strain is selected for
this study referred to as Lactobacillus plantarum DU10 under the accession number
KF724943 presenting probiotic traits. The purification of the produced bacteriocin
revealed the presence of two-antimicrobial peptides Plantaricin M and Z, the exact
molecular weight determined by MALDI-TOF is 6. 31 kDa and 7,19 kDa
respectively. Plantaricin MZ’s production may be increased considerably by using an
MRS medium containing only NaCl and Tween 80 which optimum conditions are a
temperature of 35°C, pH 6.5, 3% NaCl and 0.4 % Tween 80, with a cheap cost to the
industry.
Keywords: Lactic acid bacteria, probiotic, peptide, Lactobacillus plantarum
