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Université d’ORAN
Faculté des Sciences
Département de Biotechnologie
Mémoire de MAGISTER
en Biotechnologie
Option : Intérêt des microorganismes en Agriculture et en Agro-alimentaire
Présenté par
Bounoua Mohammed Djellel
Intitulé
Essais d’utilisation des Pseudomonas spp. et Bacillus spp. dans le
biocontrôle de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici sur tomate
et Verticillium dahliae sur l’olivier.
Devant le Jury : Président : Pr. FORTAS Zohra Université d’ORAN Examinateurs : Pr. ZADI-KARAM Halima Université d’ORAN Pr. KARAM Nourredine Université d’ORAN Dr. BELABID Lakhdar C.U de MASCARA
Rapporteur : Dr. BELLAHCENE Miloud Université de MOSTAGANEM
Avant - propos
Avant tout, je remercie Dieu tout puissant qui m’a donné la force, la foi, et de m’avoir
permis d’arriver à ce stade.
Ce travail a été effectué au Laboratoire de Biologie des Micro-organismes et de
Biotechnologie (LBMB) de l’Université d’Oran Es-sénia.
J’exprime ma profonde reconnaissance à Pr. Fortas pour m’avoir accueilli dans son
laboratoire et d’avoir accepté de présider le jury de mon mémoire.
Que Mr Bellahcene veuille bien trouver ici l’expression de mes sincères
remerciements pour la bienveillance qu’il n’a cessé de témoigner à mon égard.
Je remercie chaleureusement Mme Karam, Mr. Karam ainsi que Belabid d’avoir
aimablement accepté de siéger dans le jury de ce mémoire.
Mes sincères remerciements vont également à l’ensemble du personnel du laboratoire pour l’atmosphère amicale et enthousiaste dont ils m’ont entouré et plus particulièrement à Mme Chahrazed, Dahbia, Mounia, Amel, Merouane, et Mme Dib-Bellahouel.
Dédicace
Je dédie ce modeste travail à :
Mon cher et regretté père à qui je dois tout,
Ma mère et ma sœur pour leur courage
et le soutien qu’elles m’ont apporté,
Sarah et sa famille,
Mes complices : Amine, Zaki, Yazid, Redouane et Mounir,
Mes amis : Walid, Chawki, Houcine, Jawed…
Et à ceux que je n’ai pas cités
Djellel
Sommaire
Introduction générale………………………………………………………………………...1
Chapitre I : Synthèse bibliographique
I.1. Généralités sur l’olivier……………………………………………………………………3 I.1.1. Historique, origine et aire d’expansion ………………………………………………….3 I.1.2. Caractères taxonomiques et morphologiques de l’olivier ……………………………….4 I.1.3. Industrie oléicole mondiale………………………………………………………………5 I.1.4. Industrie oléicole en Algérie …………………………………………………………….5 I.1.5. Maladies de la culture de l’olivier ………………………………………………………7 I.2. La verticilliose de l’olivier ………………………………………………………………...8 I.2.1. Symptômes de la verticilliose de l’olivier et importance des dégâts ……………………9 I.2.2. Cycle infectieux de l’agent pathogène …………………………………………………..9 I.2.3. Moyens de lutte contre la verticilliose………………………………………………….12 I.2.3.1. Moyens de lutte culturaux …………………………………………………………...12 I.2.3.2. Moyens de lutte physiques …………………………………………………………...12 I.2.3.2. Moyens de lutte chimiques …………………………………………………………..12 I.2.3.4. La résistance génétique……………………………………………………………….13 I.3. Généralités sur la culture de la tomate……………………………………………………13 I.3.1. Historique, origine et aire d’expansion ………………………………………………...13 I.3.2. Caractères taxonomiques et morphologiques de la tomate …………………………….14 I.3.3. Importance et production de la tomate dans le monde ………………………………...14 I.3.4. La culture de la tomate en Algérie ……………………………………………………..15 I.3.5. Maladies de la culture de tomate……………………………………………………….16 I.4. La fusariose vasculaire de la tomate……………………………………………………...17 I.4.1. Historique et taxonomie………………………………………………………………...17 I.4.2. Description du champignon…………………………………………………………….17 I.4.3. Biologie du champignon………………………………………………………………..18 I.4.4. Epidémiologie de la maladie…………………………………………………………...18 I.4.5. Moyens de lutte contre la fusariose…………………………………………………….20 I.4.5.1. Moyens de lutte culturaux……………………………………………………………20 I.4.5.2. Moyens de lutte physiques …………………………………………………………...20 I.4.5.3. Moyens de lutte chimiques…………………………………………………………...21 I.5. La lutte génétique………………………………………………………………………...21 I.6. La lutte biologique………………………………………………………………………..21 I.6.1. Utilisation de bactéries contre champignons…………………………………………...21 I.6.2. Phénomènes de l’antagonisme …………………………………………………………22 I.7. Les agents antagonistes…………………………………………………………………...23 I.7.1. Le genre Pseudomonas spp. …………………………………………………………...23 I.7.1.1. Les mécanismes biochimiques développés par les Pseudomonas fluorescents dans la lutte biologique ………………………………………………………………………24 I.7.1.1.1. Colonisation de la rhizosphère……………………………………………………...25 I.7.1.1.2. Production de substances inhibitrices de la croissance des pathogènes……………26 I.7.1.1.3. Mécanismes indirects………………………………………………………………27 I.7.2. Le genre Bacillus spp. …................................................................................................28 I.8. Modes d’action des bactéries sur les champignons pathogènes …………………………30 I.8.1. Modes directs …………………………………………………………………………..30 I.8.2. Modes indirects ………………………………………………………………………...31
Chapitre II : Matériel et méthodes
II.1. Origine des souches fongiques…………………………………………………………..32 II.2. Isolement des souches bactériennes……………………………………………………..32 II.2.1. Echantillonnage………………………………………………………………………..32 II.2.2. Milieux de culture utilisés……………………………………………………………..32 II.2.3. Traitement des échantillons……………………………………………………………33 II.2.4. Isolement et purification des souches bactériennes……………………………………33 II.2.5. Conservation des souches bactériennes………………………………………………..33 II.3. Caractéristiques de pré-identification des souches………………………………………33 II.3.1. Etude morphologique………………………………………………………………….33 II.3.1.1. Coloration des spores au vert de malachite………………………………………….34 II.3.2. Etude biochimique……………………………………………………………………..34 II.3.2.1. Recherche de la catalase……………………………………………………………..34 II.3.2.2. Recherche de l’oxydase……………………………………………………………...34 II.3.2.3. Utilisation du citrate de Simmons…………………………………………………...35 II.4. Potentialités antagonistes in vitro des isolats……………………………………………35 II.4.1. Méthode de confrontation directe en boîte de Petri……………………………………35 II.4.2. Méthode de mise en évidence de substances antagonistes volatiles…………………..36 II.4.3. Activité des filtrats de culture…………………………………………………………37 II.4.3.1. Préparation des filtrats de culture……………………………………………………37 II.4.3.2. Action du filtrat sur la croissance mycélienne du parasite…………………………..37 II.5. Etude du phénomène d’antagonisme in vivo…………………………………………….38 II.5.1. Production de la suspension sporale du champignon …………………………………38 II.5.2. Production de la suspension bactérienne………………………………………………38 II.5.2.1. Des isolats pré-identifiés Bacillus spp. ……………………………………………...38 II.5.2.2. Des isolats pré-identifiés Pseudomonas spp. ……………………………………….38 II.5.3. Méthode d’étude de l’aptitude des isolats bactériens à réduire la gravité de la fusariose et de la verticilliose de la tomate……………………………………………...39
II.5.3.1. Tests sur graines en boîtes de Petri………………………………………………….39 II.5.3.2. Tests en serre………………………………………………………………………...40
Chapitre III : Résultats et discussion
III.1. Etude des souches fongiques……………………………………………………………42 III.1.1. Etude macroscopique et microscopique du Verticillium dahliae……………………..42 III.1.2. Etude macroscopique et microscopique du Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici….43 III.2. Isolement et purification des souches bactériennes…………………………………….43 III.3. Pré-identification des bactéries…………………………………………………………43 III.4. Résultats des antagonismes in vitro des isolats…………………………………………46 III.4.1. Résultat de l’antagonisme par confrontation directe en boîte de Petri………………..46 III.4.2. Résultat de l’antagonisme par les substances antagonistes volatiles……………........50 III.4.3. Résultat de l’antagonisme par activité des filtrats de culture…………………………51 III.5. Résultats des essais in planta (in vivo) …………………………………………………53 III.5.1. Résultats de l’essai sur graines en boîte de Petri……...………………………………53 III.5.2. Résultats des essais en serre ………………………………………………………….56
Conclusion et perspectives…………………………………………………………………..61
Liste des figures
Page
Figure 1. Cycle infectieux de Verticillium dahliae (Hiemstra et Harris, 1998)……………...11 Figure 2. Cycle infectieux de Fusarium oxysporum (Agrios, 1970)………………………...19 Figure 3. Interactions entre les Pseudomonas fluorescents, les micro-organismes phytopathogènes et les cellules racinaires (Jacques et al., 1993)…………………………….25 Figure 4. Méthode de confrontation directe en boîte de Petri entre les souches bactériennes et l’agent phytopathogène………………………………………………………36 Figure 5. Méthode de confrontation indirecte sur milieu de culture par action des substances volatiles entre les souches bactériennes et l’agent phytopathogène………….37 Figure 6. Aspect macroscopique (a) et microscopique (présence de spores, de microsclérotes et des phialides en forme de V) (b, c) de Verticillium dahliae………….........42 Figure 7. Aspect macroscopique (a) et microscopique (Présence de macroconidies et de microconidies) (b, c) de Fusarium oxysporum………………………………………….43 Figure 8. Aspect macroscopique de Bacillus BT4 sur gélose nutritive……………………...44 Figure 9. Observation microscopique (100x) de BM1 après coloration de Gram…………...44 Figure 10. Aspect macroscopique de Pseudomonas PM1 sur milieu King B……………….44 Figure 11. Observation microscopique (100x) de PM1 après coloration de Gram……….….44 Figure 12. Observation microscopique (100x) de BA10 après coloration de Gram (présence d’endospores)…………………………………………………………….45 Figure 13. Utilisation du citrate de la souche Pseudomonas PT3 sur milieu citrate de Simmons comparé au témoin………………………………………………………45 Figure 14. Diagramme représentant les pourcentages moyens d’inhibition de la croissance de Fusarium oxysporum f.sp lycopersici en confrontation directe avec les antagonistes…………………………………………………………………………………...46 Figure 15. Fusarium oxysporum sur milieu de culture après 5 jours d’incubation (témoin)……………………………………………………………………………………….47 Figure 16. Confrontation directe en boite de Petri entre les souches bactériennes (BA10, BM1, BT6, PM1) et Fusarium oxysporum après 5 jours d’incubation……………………….47
Figure 17. Diagramme représentant les pourcentages moyens d’inhibition de la croissance de Verticillium dahliae en confrontation directe avec les antagonistes………………………48 Figure 18. Verticillium dahliae sur milieu de culture PDA après 10 jours d’incubation (témoin)……………………………………………………………………………………….49 Figure 19. Confrontation directe en boite de Petri entre les souches bactériennes (BA10, BT1, BT9, PM1) et Verticillium dahliae après 10 jours d’incubation……………………………...49 Figure 20. Confrontation indirecte (substances volatiles) : Bacillus BT4 contre Fusarium oxysporum avec le témoin…………………………………………………………50 Figure 21. Diagramme représentant les pourcentages moyens d’inhibition de la croissance de Fusarium oxysporum f.sp lycopersici en confrontation indirecte (substances volatiles) avec des antagonistes……………………………………………………………………………….50 Figure 22. Diagramme représentant les pourcentages moyens d’inhibition de la croissance de Fusarium oxysporum f.sp lycopersici en confrontation indirecte (filtrats de culture) avec des antagonistes…………………………………………………………………………………...52 Figure 23. Caractérisation de la souche Pseudomonas PM1 à l’aide d’une galerie API 20 NE……………………………………………………………………...52 Figure 24. Test in vivo en boîte de Petri sur des graines de tomate (St. Ruff) au jour 0…….54 Figure 25. Résultat de l’essai in vivo en boîte de Petri sur graines de tomate variété Heinz (a : Témoin, b : graine+PM1+ F.o.l, c : graine+ F.o.l)………......................................55 Figure 26. Résultat de l’essai in vivo en boîte de Petri sur graines de tomate variété Luxor F1 (a : Témoin, b : graine+PM1+ V.d, c : graine+ V.d)……………………………….55 Figure 27. Résultat de l’essai in vivo en boîte de Petri sur graines de tomate variété Marmande (a : Témoin, b : graine+BM1+ F.o.l, c : graine+ F.o.l)…......................................55 Figure 28. Résultat de l’essai in vivo en serre sur plants de tomate variété Marmande (a : Témoin, b : plante+F.o.l, c : plante+BM1+F.o.l)……………….......................................57 Figure 29. Résultat de l’essai in vivo en serre sur plants de tomate variété St. Ruff (a : Témoin, b : plante+V.d, c : plante+BM1+V.d)…………………………………………...58
Liste des tableaux
Page
Tableau 1. Données statistiques des superficies oléicoles et leurs productions en Algérie (1991-1992-1993) (Matallah et al., 1996 ; in Matallah-Boutiba, 1998)………………………6 Tableau 2. Maladies de l’olivier signalées en Algérie (Bellahcene, 2004)…………………..7 Tableau 3. Production en tonnes de tomate .Chiffres 2004-2005 (FAO) [5]………………..15
Tableau 4. Evolution de la production de la tomate en Algérie 1983-1987 (Abderrezak, 2001)…………………………………………………………………………...15 Tableau 5. Les principales maladies transmises par le sol…………………………………..24 Tableau 6. Origines des champignons phytopathogènes…………………………………….32 Tableau 7. Résultat de l’isolement des souches de Bacillus et Pseudomonas……………… 45
Tableau 8. Confrontation in vivo (en boite) entre Fusarium, Verticillium et 2 antagonistes bactériens BM1 et PM1 sur 4 variétés de tomate…………………………………………......53
Tableau 9. Résultats des essais in vivo (in planta) entre Fusarium, Verticillium et les 2 antagonistes bactériens BM1 et PM1 sur 2 variétés de tomate……………………………….56
Liste des abréviations
Abréviations des noms de microorganismes :
B. : Bacillus
F.o.l : Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici
P.: Pseudomonas
V.d : Verticillium dahliae
Principales autres abréviations :
°C: degré Celsius
Cirad : Centre de coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le
Développement.
cm: centimètre
FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations.
Fig(s). : Figure (s)
h : heure
ha : hectare
hl : hectolitre
min : minute
ml: millilitre
mm : millimètre
mt : million de tonne
PDA: Potato-Dextrose-Agar
pH: potentiel Hydrogène
q.s.p : quantité suffisante pour
Qx : quintaux
rpm : Round Per Minute
YPG: Yeast-Peptone-Glucose
Introduction
Les plantes subissent les attaques de nombreux bio-agresseurs. Parmi eux, les
champignons pathogènes causent des maladies sur tous les organes des plantes. Ils
appartiennent à de nombreux genres et espèces des différents phylums de champignons vrais
(Ascomycètes, Basidiomycètes, Deutéromycètes et Zygomycètes) et plus largement aussi au
phylum des oomycètes (micro-organismes fongiques plus phylogénétiquement des algues que
des champignons (Lepoivre et al., 2003). Pour diminuer les pertes de rendement occasionnées
sur les plantes d’intérêt agricole, des méthodes de lutte classiques, comme l’utilisation de la
résistance des plantes et l’application de fongicides, sont déployées. Leurs limites d’efficacité
sont maintenant connues. Elles sont dues en grande partie aux difficultés d’application des
fongicides par ailleurs potentiellement néfastes pour l’environnement et la santé, à l’évolution
des populations des agents pathogènes sous différentes pressions de sélection.
Les maladies fongiques d’origine tellurique ont concentré l’intérêt des chercheurs pour
la connaissance de la communauté microbienne associée. Plus que tout autre environnement,
le sol est le siège de compétitions microbiennes dues à la richesse biologique rencontrée.
L’ampleur de cette compétition s’intensifie au voisinage des racines ou zone rhizosphérique
de par l’apport de substrats carbonés par la plante. Le pathogène n’est donc jamais seul à
interagir avec la plante. Mais c’est d’abord l’observation de la capacité de certains sols à
réprimer l’expression de maladies qui a conduit à impliquer fréquemment les bactéries non-
pathogènes (Cook et Rovira, 1976). Ces souches bactériennes présentant pour la plupart des
propriétés antagonistes vis-à-vis des champignons pathogènes ont très vite acquis un statut de
vedette comme agent de lutte biologique. Les souches les plus étudiées relèvent des genres
Pseudomonas, Bacillus et Streptomyces spp. Depuis, l’inventaire s’élargit régulièrement à
d’autres genres bactériens.
L’olivier (Olea europaea L.) et la tomate (Solanum lycopersicum) sont deux espèces
cultivées sensibles à l’attaque d’agents phytopathogènes tels que respectivement, Verticillium
dahliae et Fusarium oxysporum f.sp. lycopercisi. Leur développement rapide et insidieux,
engendre chaque année la destruction de centaines d’arbres d’oliviers et des dizaines
d’hectares de culture de tomate. Ces agents telluriques occasionnent des dégâts avec des
conséquences très importantes sur le rendement et la qualité des récoltes. Bien que certaines
pratiques culturales soient recommandées, il n’existe aucune méthode permettant de lutter
efficacement contre ces maladies. Parmi les alternatives à la seule lutte chimique, le recours à
la protection biologique, constitue une des solutions alternatives qui permettra de lutter contre
les agents phytopathogènes tout en diminuant l’emploi de produits chimiques.
Parmi les antagonistes qui règnent dans les sols saturés en microflore équilibrée pour
le milieu et le biotope, on rencontre presque toujours une espèce du genre Pseudomonas ou
Bacillus.
Les molécules antifongiques disponibles à l’heure actuelle ne réunissent pas les
critères définissant l’antibiotique idéal : toxicité spécifique vis-à-vis du champignon
pathogène, large spectre d’activité, absence de problèmes liés à l’apparition de souches
résistantes et absence d’effets secondaires (Badji et al., 2005).
Les mesures de contrôle alternatif telle que l’utilisation d’antagonistes sont nécessaires
et ont besoin d’être explorés. Cette stratégie est basée sur l’utilisation de micro-organismes
(bactéries, levures ou champignons saprophytes) qui ont soit un potentiel inhibiteur de l’agent
causal, soit l’habilité d’accroître le mécanisme de défense de la plante (Piga et al., 1997 ;
Larkin et Fravel, 1998 ; Benhamou et Nicole, 1999 ; De Boer et al., 1999 ; Chérif et al.,
2002 ; Silva et al., 2004). Le contrôle des phytopathogènes de manière biologique est plus
avantageux pour l’environnement en comparaison avec le contrôle chimique (Nautiyal, 2001).
Si les traitements avec des pesticides (insecticides, acaricides, nématicides, fongicides,
bactéricides et herbicides) présentent de bons résultats à court terme, à long terme leur action
secondaire sur l’environnement devient inquiétante (Vanachter et al., 1983). Les fongicides
chimiques peuvent contaminer l’environnement de par leur haute toxicité, et se retrouver sur
les produits finis (fruits), et induire à la longue une résistance du pathogène (Moenne-Loccoz
et al., 1998). Le traitement chimique représente une solution de facilité, qui correspond aussi
au besoin d’absolu de l’homme désirant un résultat rapide et total. La lutte biologique au
contraire n’a qu’une efficacité relative et demande davantage de connaissances et
d’observations, mais à long terme, elle est plus intéressante sur tous les plans.
Nous avons fixé comme objectif dans ce travail, l’isolement et la pré-identification de
souches bactériennes déjà décrites comme antagonistes fongiques à partir de différents sols
rhizosphériques du nord-ouest algérien. En second lieu, nous avons étudié l’effet antagoniste
des ces souches bactériennes sur les 2 agents phytopathogènes : Fusarium oxysporum f.sp.
lycopersici et Verticillium dahliae, et ceci par des confrontations in vitro en boîtes de Petri et
à l’aide de différentes méthodes. Une deuxième série d’essais a été effectuée in planta (in
vivo) afin d’apprécier l’effet protecteur des souches vis-à-vis de plantes tests (tomate)
infectées avec les 2 agents phytopathogènes.
Ce travail a pour finalité de contribuer à l’étude des effets antagonistes de certains genres
bactériens, et de permettre leur utilisation comme agents de lutte biologique.
I. Synthèse bibliographique : 1. Généralités sur l’olivier :
1.1. Historique, origine et aire d’expansion :
L’olivier est un arbre de la famille des Oléacées cultivé dans les régions de climat
méditerranéen pour son fruit, l'olive, qui donne une huile recherchée. L'olivier est lié à
l'installation du climat méditerranéen, car la contrainte climatique est la donnée fondamentale
pour la culture de cet arbre. Ce type de climat est apparu progressivement depuis environ
10 000 ans avant notre ère, s'installant d'abord dans la Méditerranée orientale pour s'étendre
ensuite sur plusieurs millénaires à l'ouest et au nord du Bassin méditerranéen. Des études
biologiques réalisées par Camps en 1970 montrent que l'olivier sauvage existait au Sahara
vers 11 000 ans avant notre ère, et les dernières analyses de pollen de différents arbres à
feuillages caduques et dominants semblent montrer que ce changement climatique s'est
développé vers 8 000 ans au sud-est de l'Espagne pour remonter lentement vers le nord
(Amouretti et Comet, 2000).
Selon les archéologues, la domestication de l'olivier aurait eu lieu entre 5700 et 5200
ans avant l'époque actuelle (soit environ entre 3800 et 3200 avant J.-C.). Des études archéo-
biologiques (Terral, 1997) et l'étude génétique des populations d'oléastres et des variétés
d'olivier (Besnard et al., 2001) montrent que la domestication s'est produite indépendamment
dans plusieurs régions du Bassin méditerranéen, et s'est très probablement réalisée sur une
longue période. Après une récession due à la disparition de plusieurs états orientaux vers 1200
avant notre ère, l'expansion démographique de l'âge du fer en Méditerranée entraîna la
création de nombreuses colonies par les phéniciens en Afrique du Nord (Carthage) et au sud
de l'Espagne, ainsi que par les grecs en Asie mineure, dans les îles de la Mer Égée, en Sicile,
et dans le sud de l'Italie et de la France (Marseille), où ils importèrent leur culture de l'olivier
et développèrent son commerce. L'oléiculture (culture de l’olivier) est peut être la plus
ancienne richesse de l’Algérie. Elle fut introduite par les Carthaginois, bien avant l'ère
chrétienne ; les Romains la développèrent à tel point qu'il semble que c'est plutôt par ses
huiles que par ses céréales que l'Afrique romaine mérita son nom de " Grenier de Rome " [1].
Arbre millénaire, l’olivier est chargé de légendes depuis l'Antiquité, l'olivier que la
déesse Athéna fit sortir de terre, est le symbole de la ville grecque éponyme et représente la
force et la victoire, la sagesse et la fidélité, l'immortalité et l'espérance, la richesse et
l'abondance.
[1] : http://www.alger-roi.net/Alger/cahiers_centenaire/productions/textes/p1_chapitre1a.htm
L'olivier est aussi une des plantes les plus citées dans la Bible, où la colombe lâchée
par Noé après le Déluge (Genèse 8/11) revint en tenant un rameau d’olivier dans le bec après
avoir trouvé une terre émergée.
Dans le Coran, l'olivier est un arbre béni, symbole de l'homme universel, et l'huile
d'olive est source de lumière divine pour guider les hommes (moubârakatin zaytounatin dans
le verset 35 de la 24ème sourate intitulée "La Lumière" / An-Nour) [2].
1.2. Caractères taxonomiques et morphologiques de l’olivier :
Sa nomenclature vulgaire dérive de deux souches méditerranéennes : d’une part le
nom grec : Oleum d’origine égéenne passe directement au latin Olea et, d’autre part, le nom
hébreux Zait ou Sait est passé dans l’arabe Zaitun (Pagnol, 1975 ; in Bellahcene, 2004).
L'olivier fait parti de la famille des Oléacées qui comprend, entre autre, les lilas
(Syringia), les troènes (Ligustrum) et les frênes (Fraxinus), ainsi que nombre d'arbustes
comme les forsythias, les jasmins. La Classification de l’olivier est la suivante [3]:
Règne : Plantae Division : Magnoliophyta Classe : Magnoliopsida Ordre : Scrophulariales Famille : Oleaceae Genre : Olea espèce : europaea L.
Le genre Olea a longtemps été subdivisé en deux sous-espèces, Olea europaea var.
europaea pour l'olivier domestique (Europe et Turquie), et Olea europaea var. sylvestris
(Mill.) Lehr pour l'oléastre, ou olivier sauvage. Cette subdivision est devenue obsolète. Divers
travaux ayant montré l'absence de frontière entre les populations sauvages et les populations
cultivées, aussi bien sur le plan génotypique que phénotypique, pour l'olivier européen Olea
europaea subsp europaea, sous espèce principale du complexe Olea europaea (Breton, 2006).
Du point de vue climat, l’olivier est l’arbre méditerranéen par excellence, il exige un
climat doux, lumineux, et supporte tout à fait bien la sécheresse, il craint plutôt le trop d'eau et
donc les excès d'arrosage (apport de 30 à 40 litres d'eau, une à deux fois en juillet et août, et
seulement la première année après la plantation). Tous les sols lui conviennent, même les sols
calcaires ; cependant il donne de meilleurs résultats en terres profondes et fertiles que dans les
terrains rocheux et pauvres (Angiboust, 1986).
[2] : http://fr.wikipedia.org/wiki/Olivier_(arbre) [3] : http://data.gbif.org/species/13197107/
1.3. Industrie oléicole mondiale :
La culture de l'olivier occupe en 2005 dans le monde 7,5 millions d'hectares pour une
production d’environ 14,9 millions de tonnes d'olives avec un rendement de 20 quintaux/ha
selon le FAO (2005).
Sur la période 2000/2006, la production mondiale moyenne annuelle s'élève à 2 778
800 tonnes d'huile d'olive et à 1 638 300 tonnes d'olives de table. La production mondiale
d'huile d'olives est passée de 1 453 000 tonnes en 1990 à 2 820 000 tonnes en 2006, alors que
dans le même temps la production d'olives de table passait de
950 000 tonnes à 1 832 500 tonnes (COI, 2006).
La production mondiale d’huile d’olive ne représente cependant qu'environ 3% de la
production d’huile végétale comestible du monde, et est largement dépassée par celle de
l’huile de soja (32 % de la production mondiale avec 32 Mt/an), de l’huile de palme (28 %
avec 27,2 Mt/an), de l’huile de graine de colza (13,5 % avec 13,6 Mt/an), de tournesol (8,9 %
avec 9 Mt/an), d'arachide (4,8% avec 4,8 Mt/an), et de coton (4,2% avec 4,2 Mt/an) (CIRAD,
2004) . De même, dans le commerce international, les huiles d’olive ne représentent pas plus
de 2 % du volume des huiles végétales comestibles vendues (Harwood et Aparicio, 2000) .
L'oléiculture occupe toutefois une part très importante dans l'économie agricole de
certains pays méditerranéens et la tendance de la consommation mondiale est à la hausse. Les
quatre premiers pays producteurs (Espagne, Italie, Grèce et Turquie) représentent 80 % de la
production mondiale d'olives et les dix premiers, tous situés dans la zone méditerranéenne,
95 % (FAO, 2005).
1.4. Industrie oléicole en Algérie :
L’Algérie fait partie des pays du pourtour méditerranéen dont le climat est des plus
propices à la culture de l’olivier. Les données statistiques agricoles des superficies et
productions oléicoles pour les trois années 1991, 1992 et 1993 en Algérie sont représentées
dans le tableau (1) :
Tableau 1. Données statistiques des superficies oléicoles et leurs productions en Algérie (1991-1992-1993) (Matallah et al., 1996 ; in Matallah-Boutiba, 1998).
Olives pour
conserve
Olives pour
l’huile
Année Superficie
occupée
(ha)
Oliviers
cultivés
Qx % Qx %
Production
d’huile (hl)
1991
1992
1993
184 520 164 290 161 330
16 222 240 17 540 930 17 627 630
141 960 220 290 206 770
16.2 8.3 10
735 400 2 434 910 1 853 960
83.8 91.7 90
106 040 473 800 291 870
En l’an 2000, la culture de l’olivier en Algérie occupait une superficie d’environ
168 080 ha, soit 33 % des 500 000 ha de superficie arboricole nationale, et 2 % des terres
agricoles cultivables. En 2010, les prévisions de superficies oléicoles portent sur 309 500 ha.
La participation du secteur oléicole à la production finale agricole du pays était en moyenne
de 21 % en 1999-2000. La surface oléicole est répartie dans trois régions : le Centre, avec
54,3 % de la superficie totale ; l’Est, avec 28,3 % ; et l’Ouest, avec 17 %. La plupart des
oliveraies (80 %) sont situées dans des zones de montagne, sur des terrains accidentés et
marginaux, peu fertiles et caractérisés par une pluviométrie moyenne comprise entre 400 et
900 mm/an. Le reste des oliveraies (20 %) sont situées dans les plaines occidentales du pays
(Mascara - Sig - Relizane), où la pluviométrie moyenne annuelle est de 300-400 mm.
L’analyse des données statistiques de la superficie oléicole de la dernière décennie
(1990/99) montre que la surface plantée a enregistré une baisse continue entre 1990 et 1995
(tableau 1) en raison principalement de l’absence de soutien de l’Etat. La restructuration du
secteur agricole, en 1997, a permis d’augmenter de nouveau les surfaces oléicoles. Cette
tendance s’est confirmée avec la relance du Plan National de Développement Agricole en
2000 et grâce au financement du secteur par le Fonds National de Régularisation et
Développement Agricole (FNRDA).
En 2005/06, 134 520 ha étaient en production, 39 497 ha n’étaient pas encore entrés en
production et 15 449 ha devaient être plantés dans l’année. Les prévisions à l’horizon 2010
sont de 189 500 ha en production et de 120 000 ha qui ne seraient pas encore en production,
soit une superficie totale de plantations régulières (sans compter les arbres isolés) de 309 500
ha.
Le Ministère de l’Agriculture et du développement rural a mis en place un programme
spécial pour le développement de l’oléiculture en intensif dans les zones steppiques, pré-
sahariennes et sahariennes pour l’année 2006/07 en vue d’augmenter les productions et de
diminuer les importations d’huiles végétales (Kerbouaa, 2003).
L’oléiculture algérienne est caractérisée par une large gamme de variétés. Dans le
centre et dans l’est prédominent les variétés : Hamma (pour la confiserie), Chemlal, Azeradj,
Bouchouk, Rougette, Blanquette et Limli (pour l’extraction d’huile).
Dans la région nord-ouest, les variétés les plus diffusées sont : Sigoise, Verdial, Cornicabra
et Gordal.
1.5. Maladies de la culture de l’olivier :
En raison de déficiences sur le plan nutritionnel et de conditions de culture
inadéquates, l’olivier est sensible à de nombreuses maladies qui occasionnent des pertes de
rendement considérables (Katsoyannos, 1992). Faustino de Andres (1965) a recensé environ
250 espèces parasites diverses comprenant 90 champignons, 5 bactéries, 3 lichens, 4 mousses,
3 angiospermes, 11 nématodes, 110 insectes, 13 arachnides, y compris les dégâts provoqués
par 5 oiseaux et 4 mammifères. En zone méditerranéenne, on peut rencontrer une dizaine de
maladies fongiques et bactériennes graves (Civantos, 1999). En Algérie, 7 maladies de
l’olivier ont été signalées (Tableau 2) :
Tableau 2. Maladies de l’olivier signalées en Algérie (in Bellahcene, 2004).
Parasites Agents
Maladies Auteurs
Insectes
Dacus oleae Gmel. (B.olea) Pryas oleae Bern. Saissetia oleae Bern.
Mouche de l’olivier Teigne de l’olivier Cochenille noire
Gaouar, 1996
Champignons
Cycloconium oleaginum
(Spilocea oleagina) Cast Alternaria sp. Cladosporium sp. Capnodium sp. Verticillium dahliae
Œil de paon
Fumagine
Verticilliose
Guechi et Girre, 2002 Assawah et Ayat, 1985 Benchaabane, 1990 Bellahcene et al., 2000
Bactéries
Pseudomonas syringae
pv. Savastanoi Smith.
Tuberculose Assawah et Ayat, 1985
2. La verticilliose de l’olivier :
Les maladies vasculaires causent des dégâts importants sur de nombreuses cultures.
Les champignons des genres Fusarium et Verticillium en sont les principaux responsables.
Ruggieri (1946 in Bellahcene, 2004) attribue l’affection vasculaire de l’olivier à un agent de
trachéomycose, Verticillium dahliae Kleb., qui a été décrit pour la première fois sur le dahlia
en 1913.
La classification de ce champignon établie par Agrios (1988) puis Botton et al. (1990)
est la suivante :
Division : Amastigomycota Groupe : Deutéromycètes Classe : Hyphomycètes Ordre : Hyphales ou Moniliales Famille : Moniliaceae Genre : Verticillium espèce : dahliae (Kleb.)
Le genre Verticillium appartient au groupe des champignons imparfaits et possède
deux types d’organes reproducteurs :
- les microconidies, unicellulaires, ovales (4-6 µm x 2-3 µm) contenues dans une
gouttelette muqueuse, portées à l’extrémité des phialides ( la sphérule).
- Les microsclérotes, de formes et de tailles variables, reconnaissables par leur couleur
noire, due à un pigment : la mélanine. Ils se forment par augmentation de taille,
épaississement et mélanisation de la paroi des hyphes (Goudou-Sinha, 1988).
Le genre Verticillium est représenté par différentes espèces dont V. albo-atrum Reinke et
Berthold (1879) et V. dahliae sont les plus dangereux. Elles se distinguent l’une de l’autre par
leur forme de conservation :
- un mycélium brun avec une paroi épaisse (hyphe enkysté) pour V. albo-atrum.
- des microconidies pour V. dahliae.
Cependant la séparation de ces deux espèces a longtemps été controversée (Lahlou, 1974).
Les Verticillium sont polyphages, et attaquent des plantes, appartenant à des genres et
familles botaniques très différents dont beaucoup ont un intérêt agricole et économique :
plantes maraîchères, fourragères, fruitières, ornementales…
La verticilliose est une maladie due à un champignon Verticillium dahliae (tableau 2)
se transmettant par voie racinaire, entraîne un dessèchement des arbres par une interruption de
la circulation de la sève au niveau du collet.
Les verticillioses sont répandues à travers le monde entier mais semblent moins
fréquentes dans les zones intertropicales et dans les régions du sud et de l’est de l’Asie. Elles
sont particulièrement importantes dans les régions à climat tempéré ou méditerranéen
(Schnathrost, 1981 ; Lahlou, 1983).
En Algérie, la verticilliose fut signalée pour la première fois par Boullinger (1970) et
par Subramoniam (1974) sur les cultures de tomates. Ce n’est qu’en 1990 que la verticilliose
de l’olivier n’a été signalée en Algérie par Benchaabane et plus récemment par Matallah et al.
(1996), puis Bellahcene et al. (1997, 1998, 2000).
2.1. Symptômes de la verticilliose de l’olivier et importance des dégâts :
Les symptômes de la verticilliose sont variables selon les conditions du milieu, les
plantes-hôtes et l’agressivité des souches. Verticillium dahliae provoque chez son hôte des
symptômes externes au niveau du système aérien : jaunissement et nécrose des feuilles,
flétrissement des feuilles et de la plante entière, ainsi que des modifications de croissance
(rabougrissement ou gigantisme). Il entraîne également des symptômes internes :
brunissements des vaisseaux, dus à l’oxydation de phénols des cellules du parenchyme
(Mueller et Beckman, 1976). Si cette infection est rapide et ne laisse pas à l'arbre le temps
d'émettre des rejets, elle peut être mortelle (Julien, 2005).
Verticillium dahliae s’attaque a une gamme exceptionnellement étendue de cultures
annuelles, cotonnier (Gossypium spp.), melon (Cucumis melo), colza (Brassica napus),
fraisier (Fragaria ananassa), pastèque (Citrullus lanatus), Solanaceae et diverses plantes
ornementales (Hiemstra et Harris, 1998 ; in Bellahcene, 2004).
Il attaque aussi des cultures pérennes telles que l’olivier (Olea europaea), pistachier
(Pistacia vera), avocatier (Persea americana), Prunus spp. et diverses essences forestières,
ainsi que des adventices et même des céréales. De manière peut-être surprenante, les agrumes
et les fruits à pépins sont résistants (Tjamos, 1989).
2.2. Cycle infectieux de l’agent pathogène :
V. dahliae peut survivre dans le sol durant plusieurs années, jusqu’à 20 ans, sous
forme de microsclérotes (amas de cellules de 0.1 à 0.5mm) libres ou dans des tissus infectés
(Civantos, 1999 ; Julien, 2005).
Parasite facultatif, son cycle de développement se déroule en 2 phases, une phase
saprophytique qui comprend une période d’activité et une phase parasitaire qui se déroule
dans la plante-hôte (Hiemstra, 1998) (Fig. 1).
Stimulés par les exsudats racinaires de la plante-hôte les microsclérotes s’activent,
s’ensuit une germination par un développement mycélien et une production conidienne
(Schreiber et Green, 1963). Lors de la phase parasitaire, V. dahliae pénètre dans la plante-hôte
au niveau des racines par les blessures causées lors de la transplantation des arbres, par des
travaux de sol, ou encore par des ravageurs animaux terricoles (vers blanc, rongeurs…)
(Bolay, 1988 ; Ferrandino, 1995 ; in Bellahcene, 2004). Sa propagation vers les vaisseaux du
xylème est inter et intracellulaire.
La pénétration dans les vaisseaux du bois se fait par les ponctuations ou par des
ruptures préexistantes du système vasculaire (Beckman et Talboys, 1981). A partir de ce
stade, la propagation du parasite se fera surtout par des spores véhiculées par le flux de sève
ascendante. Elles sont arrêtées au niveau des plaques de perforation qu’elles ne peuvent
traverser. Elles émettent alors un fin filament qui traverse les parois cellulaires au niveau des
perforations et donnent naissance à de nouvelles spores dans le vaisseau adjacent. Ainsi peut
se poursuivre la contamination du système vasculaire. La colonisation entraîne un
flétrissement, puis une nécrose et enfin la chute des feuilles. Cela permet le retour du
champignon au sol et la reprise éventuelle d’un nouveau cycle infectieux.
Les feuilles infectées recontaminent le sol au pied de la plante, si elles sont
transportées par le vent, elles sont susceptibles de contaminer des champs voisins.
Les symptômes exprimés par une plante malade sont souvent dépendants de
substances synthétisées et excrétées par les champignons pathogènes (Julien, 2005). Les
produits du métabolisme fongique, actifs dans la pathogenèse appartiennent à trois grandes
catégories : les toxines, les enzymes et les facteurs de croissances :
- des toxines ont été mises en évidence. Elles seraient de structure protéique ou
oligosaccharidique (Keen et al., 1972), ces toxines seraient responsables du jaunissement
précédant le stade de flétrissement.
- des enzymes lytiques telles que des polygalacturonases, pectate- lyases, cellulases,
galactanases, xylanases, arabinases ont été caractérisées par Puhalla et Bell en 1981.
- des facteurs de croissance : AIA (Pegg et Selman, 1959), gibbérellines (Aube et
Sackston, 1965) ont également été identifiés.
Le développement de V. dahliae dans les vaisseaux, les obstructions et les toxines
produites perturbent la physiologie des parties aériennes, feuilles, fleurs et fruits, entraînant
jaunissements et desséchements plus ou moins graves (Daayf, 1993 ; Romane et Vigouroux,
1999).
Figure 1. Cycle infectieux de Verticillium dahliae (Hiemstra et Harris, 1998)
2.3. Moyens de lutte contre la verticilliose:
Le potentiel infectieux de la parcelle est lié aux microsclérotes présents dans la terre
exploitée par les racines (Julien, 2005). Il n’existe actuellement aucun traitement curatif
contre la verticilliose. La lutte ne peut être que préventive au travers de mesures
prophylactiques ou de pratiques culturales adaptées.
2.3.1. Moyens de lutte culturaux :
Des chercheurs roumains (Costache et al., 1979) ont observé que les plants sont plus
susceptibles à l'attaque du champignon dans les conditions suivantes:
- une température du sol inférieure ou égale à 25°C;
- une humidité relative de 40% plutôt que 80%;
- une courte photopériode;
- et une fertilisation azotée excessive.
Toutes mesures qui permettent d'éviter ces conditions vont aider à prévenir le
développement de la maladie: maintenir un sol chaud, assurer une période de lumière assez
longue, éviter la fertilisation excessive.
2.3.2. Moyens de lutte physiques :
En dehors des mesures préventives permettant d'éviter les conditions mentionnées
précédemment, la désinfection du sol, soit par solarisation ou traitement à la vapeur, semble la
seule méthode de contrôle éprouvée. La solarisation consiste à bien mouiller le sol et à le
recouvrir d'une toile plastique pendant les périodes les plus chaudes de l'été (Skoudriadakis et
Bourdos, 1989). La température sous la toile devient rapidement très élevée, ce qui détruit les
organismes responsables des maladies et les graines de dicotylédones adventices (dites
mauvaises herbes), ces dernières étant nombreuses à être des hôtes réguliers du champignon.
Ce dernier est éliminé après 6 à 8 semaines de traitement (Melero-Vara et al., 1995).
2.3.3. Moyens de lutte chimiques :
Des fongicides systémiques (thiabendazole, bénomyl, carbendazim et méthyl-thio-
phanate) utilisés pour traiter les plantes entières sont absorbés par le feuillage et les racines, et
transportés par le xylème (Erwin et Buchenauer, 1971). Un mélange de l'acide aminé
méthionine et de vitamine A semble être un fongicide efficace contre V. dahliae dans la
mesure où la luminosité est suffisante (Tzeng, 1989). Cependant, aucune lutte chimique
efficace n’a été mise au point (Tawil, 1979 ; Tawil et al., 1991 ; Tjamos, 1993).
2.3.4. La résistance génétique :
Le meilleur contrôle de la maladie se fait par l’utilisation de variétés résistantes
(Romane et Vigouroux, 1999 ; in Boukenadel, 2002).
Plusieurs chercheurs ont essayé de sélectionner des variétés résistantes, ou moins
sensibles comme les variétés Frantoio, Fragivento et Coratina d’origine italienne (Cirulli et
Montemurro, 1976) ainsi qu’Arbequina et Empeltre d’origine espagnole (Civantos, 1999).
3. Généralités sur la culture de la tomate :
3.1. Historique, origine et aire d’expansion :
La tomate est une plante annuelle de la famille des Solanacées, originaire d'Amérique
du Sud (Colombie, Équateur, Pérou, nord du Chili) (Laumonnier, 1979). Introduite en Europe
(Italie, Espagne) au 16ème siècle comme plante ornementale (Damidaux, 1989). L'introduction
en France fut lente puisqu’en 1600, Olivier de Serres, un des premiers agronomes français, la
classe parmi les plantes d'ornement. La plante étant de la même famille que la belladone
(plante toxique), ses fruits n'étaient pas considérés comme comestibles, mais utiles en
médecine. Elle n’est cultivée que depuis le 18ème siècle pour son fruit, consommé comme
légume (Laumonnier, 1979 ; in Abderrezak, 2001).
Le terme tomate désigne aussi ce fruit charnu, qui est l'un des aliments les plus
importants dans l'alimentation humaine et qui se consomme frais ou transformé. C'est
l'ingrédient de cuisine le plus consommé dans le monde après la pomme de terre. Elle est
cultivée sous presque toutes les latitudes, sur une superficie d'environ 3 millions d'hectares, ce
qui représente près du tiers des surfaces mondiales consacrées aux légumes. Longtemps
appelée "pomme d'amour" ou "pomme d'or", son nom de « tomate » n'a été accepté par
l'Académie française qu'en 1835. Il a été emprunté au nahuatl (langue de la famille uto-
aztèque) tomatl (Rick, 1979 ; Laterrot et Philouze, 1995). Le nom lycopersicum signifie
littéralement « pêche de loup », et fait référence au caractère toxique attribué initialement à ce
fruit.
3.2. Caractères taxonomiques et morphologiques de la tomate :
La tomate a aussi été appelée Lycopersicon esculentum. Cependant, des études
récentes en génomique classent la tomate dans le genre Solanum [4], le même que la pomme
de terre pour devenir Solanum lycopersicum, sa classification est la suivante [5] :
Règne : Plantae Division : Magnoliophyta Classe : Magnoliopsida Ordre : Solanales Famille : Solanaceae Genre : Solanum espèce : lycopersicum
La tomate est une plante herbacée annuelle à port rampant, aux tiges ramifiées. Il
existe trois ports : retombant, semi-retombant et horizontal. De nos jours, il est difficile de
déterminer la taille de la tomate puisqu'on utilise exclusivement des hybrides à croissance
indéterminée. Il est nécessaire de les palisser car la tige est très peu ligneuse et a une section
creuse. Pour palisser, on entoure un lien autour de la tige, lien que l'on accroche à un support
ou à une bobine reliée à la charpente de la serre (FAO, 1987 ; in Abderrezak, 2001).
Chez la tomate, le système racinaire est très puissant et ramifié sur les trente premiers
centimètres. On dit que ce système racinaire est pivotant.
La tomate est une plante de climat tempéré chaud. Sa température idéale de croissance
se situe entre 15 °C (la nuit) et 25 °C (le jour). Elle craint le gel et ne supporte pas les
températures inférieures à + 2 °C. C'est une plante héliophile, elle demande une hygrométrie
moyenne, parfois un apport de CO2 (sous serre). Sa période de végétation est assez longue : il
faut compter entre cinq et six mois entre le semis et la première récolte.
3.3. Importance et production de la tomate dans le monde :
La tomate est cultivée dans presque tous les pays du monde (tableau 3). C'est, par le
volume de production, le troisième "légume" au plan mondial, derrière la pomme de terre et la
patate douce.
[4] : http://fr.wikipedia.org/wiki/Tomate [5] : http://data.gbif.org/species/13192651/
Tableau 3. Production en tonnes de tomate .Chiffres 2004-2005 (FAO) [5].
Pays Production (t) 2004 % Production (t) 2005 %
Chine 30 143 929 24 31 644 040 26 Etats-Unis 12 867 180 10 11 043 300 9 Turquie 9 440 000 8 9 700 000 8 Egypte 7 640 818 6 7 600 000 6 Inde 7 600 000 6 7 600 000 6 Italie 7 682 504 6 7 187 016 6 Espagne 4 441 800 4 4 473 573 4 Iran 4 200 000 3 4 200 000 3 Brésil 3 515 567 3 3 303 530 3 Mexique 2 148 130 2 2 148 130 2 Russie 2 017 860 2 2 100 000 2 Grèce 1 932 000 2 1 713 580 1 Chili 1 200 000 1 1 230 000 1 Maroc 1 201 230 1 1 201 230 1
Ouzbékistan 1 245 470 1 1 200 000 1 Ukraine 1 145 700 1 1 200 000 1 Portugal 1 200 930 1 1 175 000 1 Irak 988 000 1 1 000 000 1 Syrie 920 000 1 920 000 1 Tunisie 1 118 000 1 920 000 1 Autres pays 21 780 606 18 20 752 357 17
Total 124 429 724 100 122 311 756 100
3.4. La culture de la tomate en Algérie :
La tomate se place au premier rang parmi les cultures maraîchères en Algérie selon
l’Institut technique des cultures maraîchères et industrielles (2000). Elle représente 51% de la
production totale en produits maraîchers. Sa superficie est de l’ordre de 1737 ha, soit 40% de
la superficie serre (4350 ha) (Nechadi et al., 2002). L’évolution de la production de la tomate
en Algérie entre les années 1983-1987 est donnée dans le tableau (4) suivant: (Abderrezak,
2001)
Tableau 4. Evolution de la production de la tomate en Algérie 1983-1987.
Années 1983-1984 1984-1985 1985-1986 1986-1987
Tonnage (tonnes) 129963 225 000 396 660 401 000
Avec près de 1 million de tonnes de tomates produites en 2001, l’Algérie subvient à
ses besoins. Cependant le volume de production en tomate fraîche demeure encore faible
comparativement aux pays voisins, notamment la Tunisie et le Maroc.
Le rendement actuel en Algérie est estimé, selon le Manager général de la Conserverie
(CAB), à 15 tonnes/hectare contre 45 à 75 tonnes en Tunisie et à 68 tonnes tonnes/hectare en
Italie [6]. En Chine, il est de 66 tonnes/hectare. Donc, le rendement de l’Algérie reste loin de
celui des pays concurrents bien qu’elle dispose d’atouts importants pour le développement de
cette filière.
La filière tomate dans notre pays est pénalisée par des conditions de culture difficiles
et des méthodes de production traditionnelles. Cette situation a engendré un déficit dans la
couverture des besoins nationaux durant ces dernières années. L’absence de régulation a
compliqué davantage la situation de cette filière. Les agriculteurs algériens continuent
toujours d’utiliser des méthodes traditionnelles et archaïques de production qui ne répondent
pas aux normes internationales. Les variétés les plus utilisées sont des variétés fixées peu
performantes et cultivées sans irrigation. Il faut noter la très faible utilisation de variétés
hybrides à haut rendement, essentiellement due au manque de vulgarisation des techniques
culturales de pointe et les producteurs restent attachés aux anciennes variétés. 80% de la
superficie en tomates industrielles sont occupées par la Saint Ruff (60%) et la Heinz (20%) en
raison de leur maturité étalée, la possibilité d’écoulement d’une partie sur le marché du frais.
3.5. Maladies de la culture de tomate :
Les principaux ennemis de la culture de tomates sont : (Nechadi et al., 2002)
- des ravageurs : pucerons, aleurodes, mineuses [7], noctuelle de la tomate, doryphore,
nématodes.
- des maladies cryptogamiques : fonte des semis, anthracnose, alternariose, cladosporiose,
pied noir de la tomate, mildiou de la tomate, pourriture grise, fusariose de la tomate,
septoriose.
- des maladies bactériennes : chancre bactérien (Benchaabane et al., 2008).
- des maladies virales : bronze de la tomate, mosaïque du tabac, maladie filiforme.
[6] : http://www.algerie-dz.com/article1327.html [7] : http://www.elwatan.com/Tipaza-Les-champs-de-tomates
4. La fusariose vasculaire de la tomate :
4.1. Historique et taxonomie :
Depuis la création du genre Fusarium par Link en 1809, et de sa délimitation actuelle
par Appel et Wollenweber en 1910, de nombreux travaux ont été consacrés à sa taxonomie
(Wollenweber et Reinking, 1935 ; Snyder et Hansen, 1940 ; Raillo, 1950 ; Gordon, 1952 ;
Messiaen et Cassini, 1968 ; Booth, 1971 ; Joffe, 1974 ; Nelson et al., 1983 ; in Belabid,
2003).
Le genre Fusarium tire son nom du latin fusus car ses spores sont en forme de fuseau.
Fusarium oxysporum (Schlecht.) emend. Snyder et Hansen, se distingue des autres espèces de
Fusarium par la production abondante de microconidies, rassemblées en fausse tête à partir de
monophialides courtes. Seule la reproduction asexuée est connue chez cette espèce, ce qui la
place dans le groupe des Deutéromycètes ainsi qu’à la sous-classe des Hyphomycètes et à la
famille des Tuberculariacées ; il fait partie de la section Elegans (Messiaen et Cassini, 1968 ;
Booth, 1971 ; Nelson et al., 1983 ; in Belabid, 2003). Le genre Fusarium est économiquement
très important car il regroupe beaucoup d'espèces phytopathogènes susceptibles d’attaquer un
grand nombre de plantes. Ainsi, plus de 120 formes spécialisées et races ont été décrites chez
F. oxysporum (Armstrong et Armstrong, 1981). De plus beaucoup d’espèces saprophytes sont
capables de se développer en tant que pathogènes secondaires sur des tissus végétaux
sénescents. Sa classification est la suivante [8]:
Règne : Fungi Division : Ascomycota Classe : Ascomycetes Sous-classe : Sordariomycetes Ordre : Hypocreales Famille : Nectriaceae Genre : Fusarium espèce : oxysporum
4.2. Description du champignon :
Le champignon induit la pourriture du système racinaire : le cylindre central et le
cortex des racines brunissent puis se désagrègent. Des jaunissements unilatéraux des folioles
et des feuilles apparaissent à la base de la plante. Le collet peut présenter un chancre recouvert
d'un mucus rose saumon (fructifications sporifères). Le système racinaire des plantes malades
présente une réduction des ramifications secondaires (Kraft et al., 1994).
[8] : http://data.gbif.org/species/14377524/
4.3. Biologie du champignon :
Les Fusarium sont des ascomycètes ubiquistes abondants dans les sols et souvent
phytopathogènes. Cependant, il peuvent survivre à l’état saprophytique dans les débris
végétaux, et au niveau de la rhizosphère des plantes non hôtes (Booth, 1971 ; Edel et al.,
1995). Le champignon se conserve dans le sol grâce à ses chlamydospores et au mycélium
capable de survivre sur les débris (Erskine et Bayaa, 1996).
4.4. Epidémiologie de la maladie :
La dissémination du champignon se fait au niveau du sol par les eaux de ruissellement,
le vent ou les éclaboussures ou les importations dans l'exploitation de terreaux ou de plants
contaminés. Le champignon semble plus agressif sur des cultures ayant connu un stress (excès
d'eau ou température trop froide). Le cycle infectieux de F.o.l débute par la germination des
chlamydospores en présence d’une racine de tomate, le filament mycélien pénètre dans la
racine et se développe dans le système vasculaire. Cette pénétration est facilitée par les
blessures ou par des ouvertures naturelles du système racinaire (Fig. 2).
La fusariose de la tomate, causées par les agents pathogènes Fusarium oxysporum f.sp
lycopersici et Fusarium oxysporum f.sp radicis- lycopersici est connue parmi les maladies les
plus dévastatrices de cette culture à travers le monde (Haas et Défago, 2005).
Elle provoque un flétrissement rapide (parfois en une journée) des jeunes plantules.
Sur les plantes plus âgées, les premiers symptômes visibles sont le flétrissement des feuilles
de base, puis des feuilles situées plus haut. Lorsque la plante possède plusieurs branches, le
flétrissement se manifeste d'abord sur une seule branche, souvent sur le côté qui correspond
aux racines atteintes. Un jaunissement peut parfois précéder le flétrissement. En coupe, la
base de la tige montre des vaisseaux bruns à noirâtres (conséquences de l’activité des
substances phénoliques) localisés sur un secteur du côté des racines atteintes ou bien répartis
sur toute la section (Kraft et al., 1994).
Figure 2. Cycle infectieux de Fusarium oxysporum (Agrios, 1970)
4.5. Moyens de lutte contre la fusariose:
Le Fusarium a une température de croissance optimale comprise entre 25 et 30°C,
cependant il peut résister à un spectre plus large allant de 5 à 37 °C. Les désherbages
chimiques sont réalisés avec des produits habituels à base de Métribuzine à 70 %, mais aussi
par une couverture fongique classique.
4.5.1. Moyens de luttes culturaux :
Les mesures préventives contre la flétrissure fusarienne consistent à éviter les
conditions qui favorisent la maladie soit: un sol léger et acide, un manque d'azote et de
calcium, des températures élevées - l'optimum pour le développement du F.o.l est 28°C- et un
manque de lumière en intensité et en temps. Barna et al. (1983) souligne l'importance de
maintenir une fertilisation azotée élevée surtout sous forme de nitrates (fumier) afin de
produire beaucoup de pousses jeunes. La méthode de prévention la plus courante est de
chauler afin de maintenir le pH entre 6.4 et 7.0 (Scott, 1923).
Des chercheurs de Taiwan (Sun et Huang, 1985) ont mis au point un amendement
organique et minéral qui à raison de 1% par poids de sol permet de contrôler efficacement
diverses espèces de Fusarium. Leur mélange- le mélange S-H - contient: 4,4% de bagasse
(résidus de canne à sucre); 8,4% de son de riz; 4,25% de coquilles d'huîtres; 8,25% d'urée;
1,04% de nitrate de potassium; 13,16% de superphosphate de calcium; 60,5% de cendres
minérales constituées de 31% de dioxyde de silice, 4,4% d'oxyde de calcium, 1,7% d'oxyde de
magnésium, 18% d'oxyde d'aluminium et 1% d'oxyde ferreux.
Une rotation de la récolte de 4 à 5 années diminue la densité de l’inoculum dans le sol,
mais ne freine pas complètement la maladie (Bayaa et Erskine, 1998 ; in Belabid, 2003).
4.5.2. Moyens de lutte physiques :
Anchisi et al. (1985) ont développé un traitement à l'eau chaude pour protéger les
plants dans un sol où l'on sait la maladie présente. La méthode consiste à traiter les racines
avec de l'eau à 48-49°C pendant 30 secondes avant de transplanter au moins de 48 heures
après. Cela stimule la croissance des racines.
La taille des racines amène aussi une protection contre la fusariose pour la même
raison. La stérilisation ou la solarisation ne sont pas des solutions à long terme.
4.5.3. Moyens de lutte chimiques :
Biehn et Dimond (1969), Maraite et Meyer (1971) ont montré l’efficacité du bénomyl,
du thiophanate et du méthyle thiophanate vis-à-vis du Fusarium. En Inde, le traitement de
semences par le carbendazim (Bavistin) et le carboxine (Vitavax) ont réduit le flétrissement
de la lentille à 56% et 39% respectivement (Rajib et Chaudhary, 1999 ; in Belabid, 2003).
Cependant, en grande culture de nombreux inconvénients sont rencontrés (Tramier et
Bettachini, 1974) :
- le déséquilibre de la microflore du sol par la destruction de certains bons antagonistes ;
- l’apparition de souches de Fusarium résistantes à ces fongicides ;
- et le coût élevé du traitement.
Ces difficultés dans le contrôle du Fusarium ont stimulé la recherche vers la lutte biologique
(Fravel et al., 2003).
5. La lutte génétique :
La sélection de variétés résistantes donne de bons résultats, cependant il faut entretenir
une diversité génétique de manière à ne pas faciliter les mutations adaptatives et les
expansions géographiques du champignon. Depuis quelques années, la recherche se concentre
surtout sur l’identification des gènes impliqués dans la résistance, ceux codant pour des
enzymes entrants dans la biosynthèse de composés toxiques pour le champignon, et ceux
codant pour des toxines protéiques qui inhibent directement sa croissance (Cornelissen et
Melchers 1993; Terras et al., 1998 ; Valpuesta, 2002).
6. La lutte biologique :
Cette méthode consiste à utiliser différents organismes vivants, appelés auxiliaires, ou
de leurs produits, pour prévenir ou réduire les dégâts causés par les bio-agresseurs. Il s’agit
d’utiliser la biodiversité et les ennemis naturels des espèces nuisibles (Fernandes, 2005).
6.1. Utilisation de bactéries contre champignons :
Plusieurs auteurs ont montré l’importance de l’activité antibiotique des bactéries dans
la limitation de la gravité des maladies d’origine tellurique (Howell et Stipanovic 1979 ;
1980 ; Papavizas et Lumsden 1980 ; Sneh et al., 1984 ; Weller et Cook 1986 ; Altindag et al.,
2006). La lutte biologique est mieux contrôlé via un antagoniste bactérien, qui va interagir
directement avec l’agent pathogène et/ou indirectement c’est à dire avec la plante-hôte
(Tomashow, 1996 ; Benhamou et al., 2002).
Plusieurs genres bactériens sont des agents de bio-contrôle anti-fongique (McLoughlin
et al., 1992 ; Duijff et al., 1993 ; Vicedo et al., 1993 ; Korsten et al., 1997 ; Ramamoorthy et
al., 2001 ; Esitken et al., 2002 ; Badji et al., 2005). Les bactéries les plus utilisées sont :
Pseudomonas fluorescens, P. putida, Erwinia herbicola, Bacillus subtilis et Enterobacter
cloacae.
6.2. Phénomènes de l’antagonisme :
En lutte biologique, certaines bactéries ou champignons auxiliaires peuvent être
utilisés pour empêcher le développement de maladies dues aux microorganismes, selon
plusieurs modes d’action (une même espèce, voir une même souche, d’agent de lutte
biologique peut posséder plusieurs de ces modes d’action) :
- l’hyperparasitisme : (ou mycoparasitisme chez les champignons) l’antagoniste
attaque le pathogène en perçant les hyphes et les envahissant.
- l’antibiose : formation de substances toxiques pour l’agent pathogène, exemple de
l’agrocine d’Agrobacterium radiobacter.
- l’occupation de la même niche écologique : la tendance est de rechercher comme
antagoniste soit une souche avirulente de la même espèce que le pathogène, soit une autre
espèce du même genre que le pathogène. On a pu démontrer à l’aide de mutants que des
souches très faiblement virulentes et occupant la même niche mettent en action les
mécanismes de défenses de la plante (production de phytoalexines), ce qui suffit à la sauver
de l’infection d’un pathogène virulent (Rucci, 1986 ; in Henni, 1998).
- la compétition pour les éléments nutritifs : en relation avec une occupation rapide
du milieu. Elle a été mise en évidence tant dans la rhizosphère que sur le phylloplan. Dans les
sols suppressifs où les agents pathogènes se développent mal, par opposition aux sols
réceptifs où ils se multiplient rapidement, la biomasse est particulièrement dense ; pour
déclencher la germination de chlamydospores de Fusarium il faut des concentrations de
nutriments beaucoup plus élevées que dans les sols réceptifs.
La compétition pour le fer est un des mécanismes attribués à Pseudomonas
fluorescens. Sur le phylloplan, les densités de levures atteignent 104 -105/cm2.
La compétition pour les exsudats, le miellat ou les graines de pollen est active et serait
en grande partie responsable de la diminution jusqu’à 50% des attaques des parasites
nécrotrophes.
- la modification du milieu : la modification du milieu, en particulier du pH, qui,
lorsqu’il est abaissé devient inhibiteur pour les bactéries. C’est une des actions bénéfiques de
l’engrais vert enfoui dans le sol ; mais le même phénomène se répète aussi sur le phylloplan.
L’augmentation du pH freine Botrytis cinerea sur fraisier.
- l’induction de résistance chez la plante hôte : l’agent de lutte biologique déclenche
chez la plante des mécanismes de défense (épaississement des parois végétales, production de
molécules de défenses…) qui s’opposent au développement de l’infection par l’agent
pathogène (Fernandes, 2005).
7. Les agents antagonistes :
7.1. Le genre Pseudomonas spp. :
Le groupe des Pseudomonas fluorescents est composé de bactéries qui, dans des
conditions de carence de fer, produisent des pigments jaune-vert fluorescents. Huit espèces
différentes appartiennent à ce groupe : Pseudomonas aeruginosa, espèce pathogène de
l’homme, P. syringae, P. viridiflava, et P. cichorii, espèces phytopathogènes et enfin P.
fluorescens, P. putida, P. aureofaciens et P. chlororaphis, qui rassemblent des organismes
saprophytes. La classification des Pseudomonas est la suivante [9]:
Règne : Bacteria Division : Proteobacteria Classe : Gammaproteobacteria Ordre : Pseudomonadales Famille : Pseudomonadaceae Genre : Pseudomonas
De nombreuses publications ont fait écho à des essais réalisés en serre ou au champ
qui montrent l’intérêt potentiel des Pseudomonas fluorescents non pathogènes en tant
qu’agents de lutte biologique contre les pathogènes responsables de maladies de plantes
(Whipps, 2001 ;Weller et al., 2002).
[9] : http://data.gbif.org/species/13238840/
Le tableau (5) ci-dessous reprend les principaux agents phytopathogènes contre
lesquels l’utilisation des Pseudomonas fluorescents a été proposée :
Tableau 5. Les principales maladies transmises par le sol.
Maladie Agent phytopathogène Cultures Références
Piétin échaudage Fonte des semis Verticilliose Pourriture des tubercules Pourriture des racines Pourriture du collet Fusarioses des racines et du collet Fusarioses vasculaires Galle du collet
Gaeumannomyces graminis
Pythium ultimum
Rhizoctonia solani
Verticillium dahliae
Erwinia carotovora
Thielaviopsis basicola
Sclerotium rolfsii
F.o. f.sp. lycopersici
Fusarium solani
Fusarium oxysporum spp.
F.o. f.sp. lentis F.o f.sp. albedinis
Agrobacterium tumefaciens
Céréales, gazon Cotonnier, concombre, blé, pois chiche, pois, soja… Pomme de terre, palmier, olivier, tomate… Pomme de terre Tabac Arachides Tomate Haricot, lentille Lin, concombre, radis… Lentille Palmier dattier Arbres fruitiers, vigne
Weller et Cook (1983) ; Sarniguet et Lucas (1991) Paulitz (1991) Howell et Stipanovic (1979) Bellahcene (2004); Matallah-Boutiba (1998); Boukenadel (2002) Xu et Gross (1986) Keel et al. (1989) Henni (1998); Haas et Défago (2005) Belabid et al. (2000) ; Setti et Bouznad (1998) Belabid (2003) Rahmania-Hamzaoui (2000) Canfield et Woore (1991)
Les Pseudomonas fluorescents sont largement testés grâce à leur croissance rapide et
leur capacité à coloniser la rhizosphère (Lemanceau, 1992 ; Fukui et al., 1994) .En plus de la
compétition pour les sources de carbone, l’antagonisme peut être attribué en grande partie à la
production de métabolites secondaires (antibiotiques, sidérophores, acide cyanhydrique…)
( O’Sullivan et O’Gara, 1992).
7.1.1. Les mécanismes biochimiques développés par les Pseudomonas fluorescents dans
la lutte biologique :
Différents mécanismes, agissant seuls ou en combinaison, ont été avancés pour
expliquer comment ces Pseudomonas fluorescents sont capables de réduire la gravité de ces
maladies (Fig. 3):
- la simple occupation des sites d’infection potentielle par colonisation de la rhizosphère,
empêchant ainsi la croissance des pathogènes ;
- la production de métabolites inhibiteurs de la croissance des pathogènes ;
- et la stimulation des mécanismes de résistance de l’hôte vis-à-vis des agents pathogènes.
Figure 3. Interactions entre les Pseudomonas fluorescents, les micro-organismes phytopathogènes et les cellules racinaires (Jacques et al., 1993).
7.1.1.1. Colonisation de la rhizosphère :
Cette colonisation est susceptible d’exercer une protection contre les maladies du sol
et apparaît liée à un processus d’antagonisme, ou comme un préalable à l’expression de
facteurs responsables de l’antagonisme (antibiose, stimulation de la résistance).
Ce phénomène de colonisation peut être décomposé en trois étapes :
- le chimiotactisme, associé aux exsudats racinaires ;
- l’adsorption des micro-organismes sur les racines ;
- et la colonisation proprement dite de la rhizosphère, qui implique une consommation des
exsudats racinaires.
Gamliel et Katan (1992), Lemanceau (1992), Dowling et O’Gara (1994), Di Battista-
Leoboeuf et al. (2003) ont observé que la solarisation des sols a pour effet d’améliorer la
croissance des plantes. Les analyses de sols montrent que cette solarisation s’accompagne
d’un accroissement de la proportion de Pseudomonas fluorescents dans la rhizosphère, à la
suite d’une augmentation du chimiotactisme exercé par les exsudats racinaires des graines vis-
à-vis des souches de P. fluorescens ou P. putida.
Micro-organisme phytopathogène
Le mécanisme de compétition pour le fer est activé et repose sur la production de
sidérophores, molécules chélatrices du fer, dont la biosynthèse chez les Pseudomonas
fluorescents est favorisée par une source d’azote (Delfosse et al., 1991). Paulitz (1991) a
démontré que P. putida N1R réduit le développement de la fonte des semis du pois et du soja
en consommant les exsudats volatils tels que l’éthanol ou l’acétaldéhyde produits par les
semences en germination, les rendant ainsi inaccessibles pour la croissance du pathogène
Pythium ultimum.
-La mobilité : De Weger et al. (1987), Scher et al. (1988) ont remarqué que la mobilité est
nécessaire à la colonisation de la rhizosphère, en observant des mutants de P. fluorescens
WCS374 dépourvus de flagelles, qui sont devenus incapables de coloniser les racines de
pommes de terre et de soja respectivement.
-L’adsorption : L’agglutination des souches de Pseudomonas par les agglutinines des racines
était associée à une meilleure colonisation de la rhizosphère (Van Peer et al., 1991a). Les pili
joueraient un rôle important dans la fixation de Pseudomonas fluorescens sur les racines de
maїs (Vesper, 1987).
7.1.1.2. Production de substances inhibitrices de la croissance des pathogènes :
Les Pseudomonas fluorescents produisent un grand nombre de métabolites
secondaires (Leisinger et Margraff, 1979) qui pourraient jouer un rôle dans l’effet antagoniste
de ces micro-organismes dans le sol. Ces agents inhibiteurs peuvent être scindés en 4
groupes : les antibiotiques, les sidérophores, les enzymes et l’acide cyanhydrique (HCN).
A ces métabolites secondaires, il convient d’ajouter une molécule dérivant du métabolisme
primaire, l’ammoniaque, qui, par l’alcalinisation du milieu qu’il provoque, peut avoir un effet
inhibiteur, principalement sur la croissance d’espèces fongiques phytopathogènes.
-Les antibiotiques : Plusieurs antibiotiques sont produits par les Pseudomonas fluorescents et
jouent un rôle important dans l’inhibition d’agents phytopathogènes, le 2,4-diacetyl-
phloroglucinol (DPG) produit par P. fluorescens CHA0 (Haas et al., 1991 ; Keel et al., 1992,
1996) a montré un effet suppressif sur plusieurs phytopathogènes (G. graminis et
Thielaviopsis basicola), d’autres antibiotiques sont produits par les Pseudomonas dont le
pyoluteorine (Maurhofer et al., 1994), Pyrrolnitrin (Rosales et al., 1995 ; Ligon et al., 2000),
l’oomycine A (James et Gutterson, 1986 ; Howie et Suslow, 1991).
-Les sidérophores : Quoiqu’un des éléments les plus abondants de la surface terrestre, le fer
se trouve le plus souvent dans des conditions de pH proches de la neutralité et dans un
environnement aérobie sous la forme de polymères d’hydroxydes ferriques fortement
insolubles (à pH 7, la concentration en Fe3+ soluble est évaluée à 10-17 M) (Jacques et al.,
1993). La plupart des micro-organismes ont donc développé un mécanisme hautement
spécifique de captation des ions ferriques basé sur la production de sidérophores dans des
conditions de carence en fer. Ce sont des substances de faible poids moléculaire, chélatrices
du Fe3+ et servant de transporteur de l’ion ferrique à l’intérieur de la cellule microbienne
(Neilands et Leong, 1986). Les Pseudomonas fluorescents produisent deux types de
sidérophores, l’un dit de faible affinité (pyochéline) décelé chez P. aeruginosa (Cox et al.,
1981) et l’autre, possédant une affinité élevée (pyoverdine ou pseudobactine). La production
en quantités importantes de ces molécules chélatrices dans le sol permet aux Pseudomonas
fluorescents de s’approprier tout le fer nécessaire à leur croissance et de le rendre inaccessible
aux autres microorganismes (Viswanathan et Samiyappan, 2004).
-Les enzymes : la production d’enzymes mycolitiques est également évoquée pour expliquer
l’action antagoniste des Pseudomonas fluorescents (Lam et al., 1992). Pour une souche de
Pseudomonas stutzeri (non fluorescent), Lim et al. (1991) ont montré que la chitinase et la
laminarinase produites par cette souche sont responsables de l’antagonisme in vitro observé
vis-à-vis de Fusarium solani.
-L’acide cyanhydrique : selon Voisard et al. (1989), la production d’acide cyanhydrique
(HCN) par la souche de P. fluorescens CHA5 est nécessaire à la protection de la plante vis-à-
vis de l’agent de la pourriture noire du tabac. Ce mécanisme est de moindre importance avec
la souche CHA77 (Haas et al., 1991). L’HCN produit dans la rhizosphère activerait des
réactions de défense de la plante, ce qui correspond à un mécanisme indirect de protection.
7.1.1.3. Mécanismes indirects :
Il existe des interactions entre les Pseudomonas et les cellules racinaires, qui
permettent d’augmenter la résistance de celles-ci à l’infection par des micro-organismes.
La réduction du manganèse par les Pseudomonas fluorescents pourrait jouer un rôle
(Sarniguet, 1990). Cette réduction augmenterait la quantité de manganèse disponible pour la
plante et, par ce biais, conduirait à une meilleure tolérance de cette dernière au parasite. Van
Peer et al. (1991b) ont démontré que la présence d’une souche de Pseudomonas sp. WCS
417r dans la rhizosphère d’œillet, induit l’accumulation par les cellules de la plante de
phytoalexines présentant une toxicité vis-à-vis de Fusarium oxysporum.
Enfin, la production par les Pseudomonas fluorescents de composés promoteurs de la
croissance des plantes tels que l’acide indole-3-acétique (Haas et al., 1991).
7.2. Le genre Bacillus spp. :
Les Bacillus forment un genre de bactéries à gram positif, appartenant à la famille des
bacillacées (Bacillaceae), l’ordre des Bacillales, la classe des bacilles (Bacilli), le phylum des
Firmicutes. De forme bacille, ils sont aérobies ou aéro-anaérobies facultatifs, et tirent leur
énergie par respiration ou fermentation. Ces bactéries sont capables de produire des
endospores leur permettant de résister à des conditions environnementales défavorables.
Les Bacillus sont hétérotrophes, saprophytes et ubiquitaires. Elles sont fréquemment
retrouvées dans le sol où certaines espèces ont un rôle dans le cycle du carbone et de l'azote.
On peut trouver des Bacillus dans des denrées alimentaires.
Le genre Bacillus est classé comme suit [10]:
Règne : Bacteria Embranchement : Firmicutes Classe : Bacilli Ordre : Bacillales Famille : Bacillaceae Genre : Bacillus
Il en existe un grand nombre d'espèces avec des propriétés physiologiques et des
habitats très variés. Certaines espèces sont trouvées dans l'eau douce, d'autres dans l'eau de
mer. Il existe des espèces thermophiles, acidophiles, psychrophiles, alcalinophiles.
-Bacillus anthracis responsable de la maladie du charbon, ou anthrax, murrain, woolsorter’s
disease, ou encore « sang de rate ».
-Bacillus cereus bactérie ubiquitaire présente dans le sol et nombreux autres environnements,
certaines souches sont pathogènes.
-Bacillus licheniformis
-Bacillus megaterium très fréquente dans le sol.
-Bacillus subtilis, ubiquitaire, bactérie du sol, utilisée en biotechnologie, est un exemple
d’adaptation. Elle forme des spores capables de survivre dans des conditions extrêmes,
révélant une adaptation très ancienne.
[10] : http://data.gbif.org/species/13238979/
-Bacillus thuringiensis pathogène des insectes, ses vertus entomotoxiques ont été à l'origine
d'un intérêt agricole, sylvicole et commercial dès les années 1930, mais beaucoup plus
marqué à la fin du 20ème siècle, notamment avec le développement du génie génétique et le
brevetage du vivant.
Les premières applications de Bacillus thuringiensis dans l'environnement datent de
1933. Il a été utilisé dès les années 1950 dans les forêts, les champs et les vignobles. Jusqu'au
milieu des années 1970, sa principale application était la lutte contre les lépidoptères
défoliateurs dans les forêts et certains papillons parasites des grandes cultures, de maïs
notamment. En 1976, la découverte des sérotypes israelensis (Bti) et tenebrionis a permis
l'ouverture de nouveaux marchés, grâce à une action larvicide sur les moustiques, les simulies
et les coléoptères.
Plusieurs espèces du genre Bacillus sont efficaces dans le bio contrôle de divers
champignons phytopathogènes (Williams et Asher, 1996 ; Landa et al., 1997 ; Commare et
al., 2002 ; Swain et Ray, 2006).
Les espèces de Bacillus productrices d’antibiotiques sont B. subtilis, B. polymyxa, B.
brevis, B. licheniformis, B. circulans, B. cereus. Les antibiotiques polypeptidiques produits
par Bacillus les plus utilisés dans les traitements médicaux sont la bacitracine, la gramycidine
S, les polymyxines, la tyrotricidine (Morikawa et al., 1992 ; Perez et al., 1993 ; Drablos et al.,
1999). Ils ont un large spectre d’action et sont utilisés comme agents anti-fongiques (Milner et
al., 1995).
La plupart de ces Bacillus ont été capables d’inhiber la croissance de Fusarium
oxysporum efficacement in vitro. D’autres pathogènes parmi le F. oxysporum dont F.o.
ciciris, F.o. phasioli et F.o. melonis sont inhibés par des isolats de Bacillus spp. de la
rhizosphère du pois chiche (Landa et al., 1997).
La souche Bacillus cereus UW85 a la capacité de réduire les maladies des plantes
causées par les Oomycètes (Handelsman et Stabb, 1996), grâce à la production des
antibiotiques Zwittermicine (Milner et al., 1996a) et Kanosamine (Milner et al., 1996b).
8. Modes d’action des bactéries sur les champignons pathogènes :
8.1. Modes directs :
La production de substances antibiotiques voire antifongiques par la bactérie est le
mode d’action le plus répandu et a priori le plus efficace contre les champignons pathogènes.
La molécule produite par la bactérie a un effet soit fongistatique, en ralentissant ou inhibant la
croissance du champignon, soit fongicide, en conduisant à la mort cellulaire fongique. Ces
activités ont souvent été mises en évidence in vitro dans des tests de confrontation
champignons – bactéries sur des milieux nutritifs permettant la production des composés
toxiques. Ces antibiotiques ou fongistatiques dérivent souvent du métabolisme secondaire
bactérien et appartiennent à différentes familles chimiques dont les polykétides (Sarniguet et
al., 2008). Chez les Pseudomonas sp., la pyrrolnitrine a une implication en protection des
plantes pour un spectre restreint aux oomycètes. Elle est exploitée par ailleurs comme
antifongique puissant dans les dermatoses humaines et des molécules homologues sont
utilisées comme fongicides agricoles. Parmi les antibiotiques, le 2,4 – diacétylephloroglucinol
produit par Pseudomonas sp. présente un spectre d’action assez large vis-à-vis de plusieurs
pathogènes fongiques telluriques, comme Fusarium oxysporum sur tomate, Rhizoctonia solani
sur pomme de terre, Pythium sp. sur concombre et betterave (Haas et Défago, 2005). D’autres
antibiotiques connus, comme le cyanure d’hydrogène, sont volatiles. Par ailleurs,
l’implication d’un système de sécrétion bactérien dans l’antagonisme vis-à-vis de Pythium
laisse augurer de la découverte de nouvelles molécules intervenant dans l’antagonisme
(Rezzonico et al., 2005). Mais la production de ces substances antibiotiques varie en fonction
des conditions nutritives et environnementales de la souche bactérienne. Les travaux actuels
sur les systèmes génétiques très complexes de régulations de la production de quelques uns de
ces antibiotiques ont pour but de comprendre la relation avec l’environnement, mais ils sont
cependant souvent restés centrés sur des questions de physiologie bactérienne. Les surfactants
forment une autre famille de composés toxiques. Ces lipopeptides cycliques, comme les
rhamnolipides, sont capables de faire éclater des zoospores d’oomycètes (Raaijmakers et al.,
2006).
Des enzymes comme les glucanases et chitinases produites par certaines bactéries sont
également impliquées car elles dégradent les parois des champignons. La compétition
nutritive, comme mécanisme général est aussi un mécanisme spécifique quand elle porte soit
sur une source de carbone particulière, soit sur un oligo-élément indispensable à la
physiologie du champignon. Un exemple existe autour de l’élément fer.
Les Pseudomonas, comme les champignons, sont capables de produire des
sidérophores, molécules servant à capter le fer.
Le sidérophore bactérien ou pyoverdine a une plus grande affinité pour le fer que
certains sidérophores fongiques et par conséquent sa production abondante prive le
champignon de fer. Ainsi, les chlamydospores de Fusarium oxysporum sur tomate, carencées
en fer ne germent plus et ne donnent plus la forme mycélienne infectieuse (Lemanceau et
Alabouvette, 1993).
8.2. Modes indirects :
Des bactéries actives en protection des plantes peuvent agir indirectement via la plante
en induisant des réactions de défense. La résistance de la plante obtenue n’est que partielle,
c’est à dire que la protection est modérée mais réelle. Cette résistance peut-être locale, au
niveau de la zone d’application de la bactérie sur la plante, ou systémique, c’est à dire
éloignée du point d’application sur la plante. Parmi les exemples concernant l’induction
systémique de la résistance, les voies de réponse aux bioagresseurs de la plante telles que,
l’acide salicylique, ou le jasmonate/éthylène (Sarniguet et al., 2008).
Un autre mode d’action indirect est la modification de l’environnement physico-
chimique du champignon par la bactérie. Certaines bactéries produisent abondamment des
acides organiques qui en abaissant le pH du milieu rendant disponibles des macro et oligo
éléments qui empêchent la croissance de mycélium sensible aux pH bas ou renforcent la
croissance racinaire permettant d’échapper à la maladie. Ces différents mécanismes directs et
indirects peuvent être rencontrés chez une même souche bactérienne ou au contraire ne
constituer que le principal mode d’action efficace (Sarniguet et al., 2008).
II. Matériel et Méthodes : 1. Origine des souches fongiques :
Avant d’aborder les différents essais, il convient de faire un état d’origine des souches
phytopathogènes. Elles ont été isolées et identifiées par M. Bellahcene, au Laboratoire de
Microbiologie, Département de Biologie, Université de Mostaganem. L’origine des
champignons est indiquée dans le tableau (6) ci-dessous :
Tableau 6. Origine des champignons phytopathogènes.
Souches Année d’isolement Origine
Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici
2006
Tiges de tomate présentant des symptômes de fusariose (région de Mostaganem)
Verticillium dahliae
2004
Rameaux d’olivier présentant des symptômes de verticilliose (région de Maghnia- Tlemcen)
2. Isolement des souches bactériennes :
Parmi les différents représentants de la microflore du sol rhizosphérique, nous avons
recherché à isoler un certain nombre d’isolats en fonction des critères suivants :
- genres ayant déjà été décrits comme possédant des qualités antagonistes ;
- et genres les plus fréquemment rencontrés au cours de nos différents isolements.
2.1. Echantillonnage :
Les échantillons de sol ont été prélevés en 2007 dans les zones rhizosphèriques de
différentes plantes saines (olivier, tomate, fève) des régions de Mohammadia, Tlemcen et Ain
Temouchent selon la méthode de Pochon et Tardieux (1962). La couche superficielle du sol (5
cm) a été éliminée puis un échantillon de 100g est prélevé à proximité du système racinaire, et
mis dans des sacs en plastique propres. Il est directement analysé ou conservé à 4°C pendant
6 heures au maximum.
2.2. Milieux de culture utilisés :
Les milieux King B (KB) et gélose nutritive (GN) (Annexe 1) servent à la culture des
bactéries ciblées. Les Pseudomonas produisent des sidérophores fluorescents visibles sur
milieu King B (King et al., 1954).
2.3. Traitement des échantillons :
10 g de sol rhizosphérique sont transférés dans un erlenmeyer contenant 90 ml d’eau
distillée stérile, la suspension microbienne est ensuite récupérée après agitation à 120 rpm
pendant 30 min (Rangarajan et al., 2002), on procède ensuite aux dilutions décimales (10-1 à
10-5) dans de l’eau physiologique (Annexe 1). 0.1ml de chaque dilution est étalé sur une boîte
de Petri contenant du Milieu KB et une autre boîte contenant de la gélose nutritive.
Pour sélectionner les espèces de Bacillus, les échantillons sont chauffés à 60°C
pendant 60 min dans un bain marie (Chilcott et Wigley, 1993). L’incubation des boîtes se fait
à 28 °C pendant 48 heures.
2.4. Isolement et purification des souches bactériennes:
Les colonies présentant des caractéristiques macroscopiques correspondant aux genres
Bacillus (très grande colonie sèche et irrégulière) et Pseudomonas (colonie assez grande,
nacré avec un contour dentelé et une pigmentation jaune-vert) sont repiquées sur boîtes de
Petri de façon successive jusqu’à l’obtention de cultures pures. Ces dernières sont soumises à
la coloration de Gram (Bacillus : Gram +, Pseudomonas : Gram -) et à la recherche de la
catalase, ces tests préliminaires nous permettent de vérifier et d’orienter notre recherche vers
les genres Bacillus et Pseudomonas.
2.5. Conservation des souches bactériennes :
La conservation des souches à courte durée a été effectuée à 4°C sur gélose inclinée en
tubes à essai, à raison d’un repiquage toutes les 4 semaines.
3. Caractéristiques de pré-identification des souches :
3.1. Etude morphologique :
L’étude macroscopique nous a permis de relever le diamètre, la pigmentation et
l’aspect des colonies. Alors que l’étude microscopique par l’intermédiaire de la coloration de
Gram, nous a permis d’examiner la forme, le mode d’association et le résultat de la coloration
de Gram des bactéries.
3.1.1. Coloration des spores au vert de malachite :
Les bactéries du genre Bacillus forment une structure exceptionnellement résistante
appelée endospore, sa morphologie et sa localisation varient selon les espèces et sont souvent
précieuses dans l’identification. Les endospores ne sont pas bien colorées par la plupart des
colorants, cependant une fois colorées, elles résistent à la décoloration. Cette propriété est à la
base de la coloration des spores au vert de malachite.
Dans cette coloration le frottis est fixé à la chaleur, puis recouvert d’une solution
aqueuse de vert de malachite à 5%. On laisse agir à chaud (plaque chauffante) pendant 15
minutes à partir de l’émission de vapeurs (ne jamais laisser sécher ; rajouter du colorant si
nécessaire). La préparation est ensuite lavée sous filet d’eau, colorée à la safranine (solution
aqueuse 5%) pendant 5 min puis rincée, séchée et observée au microscope photonique. Les
spores apparaissent colorées en vert, le reste de la bactérie ou les bactéries n’ayant pas sporulé
sont colorées en rouge-rosé.
3.2. Etude biochimique :
3.2.1. Recherche de la catalase :
La catalase est une enzyme de haut poids moléculaire existante chez toutes les
bactéries aérobies, elle leur permet de vivre en présence d’oxygène. En plus de la chaîne
respiratoire des cytochromes, il existe en effet chez les aérobies une chaîne accessoire courte,
fixant l’hydrogène sur l’oxygène en aboutissant à de l’eau oxygénée (peroxyde d’hydrogène)
selon la réaction :
2 H2O2 � 2 H2O + O2
La recherche de cette enzyme est effectuée simplement par mise en contact d’une
colonie avec quelques gouttes d’ H2O2 à 10 V, un important dégagement gazeux traduit la
présence d’une catalase. Les Bacillus ainsi que les Pseudomonas sont catalase positives.
3.2.2. Recherche de l’oxydase :
Ce test est à la base de l’identification des bactéries Gram négatives. Il permet de
mettre en évidence une enzyme : la phénylène diamine oxydase des bactéries à partir de leur
culture en milieu gélosé. Cette enzyme est capable d’oxyder un réactif : le N-diméthyl
paraphénylène diamine. Pour cela, une colonie bactérienne est mise en contact avec du papier
filtre imbibé du réactif à l’aide d’une pipette Pasteur (instrument n’oxydant pas le réactif).
Une coloration rose exprime un résultat positif (la bactérie possède une oxydase). Pas
de coloration le résultat est négatif (bactérie ne possède pas d’oxydase).
3.2.3. Utilisation du citrate de Simmons :
L’utilisation du milieu citrate de Simmons (Annexe 1) a pour but de déterminer si un
organisme peut utiliser le citrate comme seule source de carbone (cas des Pseudomonas).
Cette technique consiste à ensemencer le milieu citrate de Simmons à partir d’une culture
bactérienne âgée de 48 heures prélevée du milieu KB. L’incubation se fait à 28 °C pendant 24
heures. Les bactéries citrate (+) donnent une culture abondante et se traduit par le virage de
l’indicateur du verre au bleu (Larpent, 1975).
4. Potentialités antagonistes in vitro des isolats :
4.1. Méthode de confrontation directe en boîte de Petri :
L’évaluation du phénomène d’antagonisme est réalisé vis-à-vis du Fusarium
oxysporum f.sp lycopersici (F.o.l) et Verticillium dahliae (V.d). Les champignons comme les
espèces bactériennes proviennent de pré cultures en boîtes de Petri. Un disque de champignon
(F.o.l ou V.d) de 8 mm de diamètre est prélevé puis déposé à l’aide d’un emporte pièce stérile
sur une boîte de Petri contenant soit de la gélose nutritive pour les tests en présence des
espèces de Bacillus ou sur milieu King B pour les espèces de Pseudomonas (Fig. 4). A 2.5cm
de la pastille du Fusarium, et à 2.0cm pour le Verticillium, une souche bactérienne est
ensemencée en trait. Chaque souche bactérienne est confrontée au F.o.l et au V.d, à raison de
3 répétitions.
Le témoin consiste en une boîte contenant une pastille du champignon de 8mm de
diamètre et où l’inoculum bactérien est remplacé par de l’eau distillée stérile (Dennis et
Webster, 1971 ; Wong et Baker, 1984 ; Weller et Cook, 1986 ; Inam-ul-Haq et al., 2003).
L’incubation des boîtes est faite à 28°C pendant 5 jours pour F.o.l et 10 pour V. dahliae.
La lecture des résultats consiste à mesurer la distance parcourue par le champignon en
direction de l’antagoniste bactérien. Ainsi le pourcentage d’inhibition (%) a été calculé
comme suit :
(%) inhibition = ( Rtémoin – Rtest) / Rtémoin x 100 (Wang et al., 2002)
Rtémoin : distance radiale max de la croissance du champignon.
Rtest : distance radiale sur une ligne en direction de l’antagoniste.
A partir de 20% on peut parler d’inhibition.
Figure 4. Méthode de confrontation directe en boîte de Petri entre les souches bactériennes et l’agent phytopathogène.
4.2. Méthode de mise en évidence de substances antagonistes volatiles :
Cette technique consiste à confronter indirectement la souche bactérienne avec le
champignon phytopathogène et évaluer l’action antagoniste grâce à l’action des substances
volatiles sécrétées par la bactérie testée. Dans cette technique, une boîte contenant la bactérie
est incubée pendant 24 heures à 28°C, puis dans des conditions stériles son couvercle est
remplacé par le fond d’une autre boîte contenant du milieu PDA (Annexe1), ensemencé par
une pastille de 8 mm de diamètre du champignon Fusarium oxysporum; les 2 fonds de boîtes
superposés sont scellés avec du parafilm afin d’éviter toute déperdition de substances volatiles
(Fig. 5).
Dans la boîte servant de témoin, l’inoculum bactérien est remplacé par de l’eau
distillée stérile (Fiddaman et Rossall, 1993 ; Montealegre et al., 2003 ; Chaurasia et al., 2005 ;
Trivedi et al., 2006). L’incubation est faite à 28°C pendant 5 jours. La lecture des résultats se
fait comme décrit précédemment.
Agent Phytopathogène (8mm)
Milieu de culture
2.5cm
Bactérie ensemencée en trait
Figure 5. Méthode de confrontation indirecte sur milieu de culture par action des substances volatiles entre les souches bactériennes et l’agent phytopathogène.
4.3. Activité des filtrats de culture :
4.3.1. Préparation des filtrats de culture :
Les bactéries ont été cultivées séparément dans des erlenmeyers de 250 ml contenant
chacun 50 ml de bouillon nutritif (BN) (Annexe 1). Les cultures sont agitées (75tr/min)
pendant une semaine à 28 °C ; Après centrifugation à 3000 rpm pendant 20 min, le surnageant
est récupéré et filtré sur membrane millipore stérile (0.22 µm de diamètre) à l’aide d’une
seringue stérile. Le filtrat obtenu est conservé à froid à 4°C dans des fioles fermées
hermétiquement.
4.3.2. Action du filtrat sur la croissance mycélienne du parasite :
L’incorporation du filtrat au milieu PDA est faite à une concentration de 25%
(témoin : le filtrat est remplacé par du bouillon nutritif stérile) ; des pastilles de 8mm de
diamètre sont prélevées à la périphérie d’une culture fongique jeune du Fusarium oxysporum,
âgée de 5 jours, et sont placées dans des boîtes de Petri contenant le milieu PDA. La
croissance mycélienne du parasite est évaluée par la mesure du diamètre moyen des colonies
après 5 jours d’incubation à 28°C (Sedra et Maslouhy, 1995). Un pourcentage moyen
d’inhibition de la croissance mycélienne du parasite a été calculé comme décrit
précédemment. Toutes les expériences effectuées ont été répétées 3 fois.
Milieu de culture
Parafilm
Bactérie ensemencée en strie
Agent Phytopathogène
5. Etude du phénomène d’antagonisme in vivo :
5.1. Production de la suspension sporale du champignon :
Les spores des deux champignons phytopathogènes sont obtenues en inondant une
culture de 14 jours sur milieu PDA (incubée à 28°C) avec 10 ml d’eau distillée stérile, les
conidies sont délogées en grattant la surface du milieu avec le bout d’une pipette Pasteur
stérile. Le liquide résultant est filtré à travers 4 couches de mousseline autoclavée (toile de
coton) pour éliminer les débris du mycélium et du milieu. Le filtrat obtenu contenant les
spores est lavé 2 fois avec de l’eau distillée stérile et la suspension sporale est centrifugée à
1000 g pendant 5 minutes. La concentration des conidies est estimée à l’aide une cellule de
Malassez (Annexe 2) et ajustée à la concentration voulue (5.105 spores/ml) en y rajoutant de
l’eau distillée stérile (Omar et al., 2006).
5.2. Production de la suspension bactérienne :
5.2.1. Des isolats pré-identifiés Bacillus spp. :
Des boîtes de Petri contenant le milieu nutritif gélosé sont ensemencées en stries et
incubées pendant 24 h à 30°C .Les boîtes sont ensuite inondées avec 10ml d’eau distillée
stérile puis grattées avec une pipette Pasteur stérile, la suspension récupérée est homogénéisée
par agitation à l’aide d’un vortex. Des flacons contenant 50 ml d’YPG (Annexe 1) sont
inoculés avec 100 µl de l’inoculum bactérien et incubés à 30 °C pendant 48 h (Omar et al.,
2006).
5.2.2. Des isolats pré-identifiés Pseudomonas spp. :
Ces souches bactériennes sont cultivées dans des boîtes de Petri contenant le milieu
King B, puis incubées à 27°C pendant 24 h. La suspension bactérienne a été réalisée en
grattant la surface du milieu dans du MgSO4 à 0.01 M, après homogénéisation à l’aide d’un
vortex, des flacons contenant 50 ml de King B sont inoculés avec 100 µl de l’inoculum
bactérien et incubés à 27°C pendant 48 h (Omar et al., 2006).
5.3. Méthode d’étude de l’aptitude des isolats bactériens à réduire la gravité de la
fusariose et de la verticilliose de la tomate :
Matériel végétal : Quatre variétés de tomates ont été utilisées : Luxor F1, Marmande, Heinz
1370 et Saint Ruff.
5.3.1. Tests sur graines en boîtes de Petri :
Quatre variétés de tomate (Luxor F1, Marmande, Heinz 1370 et Saint Ruff) ont été
utilisées pour ce test. Heinz et Saint Ruff ont été choisies pour leur grande utilisation à
l’échelle nationale (20 et 60% respectivement), Marmande pour sa disponibilité sur le marché,
et Luxor F1 qui est une hybride. Pour nos essais, nous avons pris comme base un lot de 100
graines par variété.
La désinfection des graines de tomate a été réalisée dans une solution d’hypochlorite
de sodium à 5 %, elles y sont immergées pendant 3 min afin d’éliminer toute trace de
contamination superficielle préexistante, puis rincées 6 fois dans de l’eau distillée stérile
durant 30 min (Simons et al., 1996). Les graines désinfectées sont transférées dans des boîtes
de Petri contenant du papier filtre (stérile, imbibé de 3 ml d’eau distillée stérile) à raison de 10
graines par boîte. 1ml d’inoculum bactérien est immédiatement ajouté sur les graines.
Après 24 h d’incubation à 25°C, l’inoculum fongique de F. oxysporum ou V. dahliae
(5x105 spores ml-1) est alors ajouté. Les témoins sont réalisés comme suit:
- des boîtes contenant des graines, où l’inoculum fongique est remplacé par de l’eau
distillée stérile et l’inoculum bactérien par 1 ml de milieu YPG ou King B stérile ;
- et des boîtes contenant des graines inoculées par le pathogène avec ajout d’1ml de
YPG ou King B stérile.
Les boîtes de Petri contenant les graines sont mises à incuber dans une étuve
(obscurité) à une température de 25 °C, pendant 4 jours. Au cinquième jour, elles sont
transférées à la lumière (16h photopériode) avec ajout de 2 ml d’eau distillée stérile par boîte,
afin de maintenir une humidité suffisante. Au septième jour, l’expérience est achevée
(Hultberg et al., 2000). Nous avons ensuite réalisé des observations visuelles des graines et
des plantules obtenues, puis nous avons procédé à la notation et à la mesure du poids frais des
plantules.
La sévérité des deux types de maladie a été mesurée en utilisant l’indice de maladie,
selon Rafin et Tirilly (1995), répartissant les plantules en 5 classes selon les
symptômes observés:
0 : plantule saine
1 : extrémité de la racine nécrosée
2 : secteur nécrotique au dessus du bout de la racine
3 : racine partiellement nécrotique avec diminution de la croissance des cotylédons
4 : nécrose sévère, racine <2 cm et pas de cotylédons.
5.3.2. Tests en serre :
Notre travail au niveau de la serre, se traduit par l’exécution d’inoculations sur les
plantules de tomate. Le substrat utilisé pour ces essais en serre est le terreau (Annexe 3). Ce
dernier a subi une série de 3 autoclavages pendant 20 min à 120°C, à 24 heures d’intervalle,
puis laissé à température ambiante durant une journée (Snissi et al., 2006). Les graines de
tomate utilisées correspondent aux deux variétés : Saint Ruff, Heinz 1370. Les graines
désinfectées, comme décrit précédemment, sont ensuite mises à prégermer durant 24 h dans
des boîtes de Petri contenant du papier filtre stérile (ou du coton hydrophile stérile) imbibé
d’eau distillée stérile, puis placées à l’obscurité. Les graines germées sont ensuite transférées
dans des pots en plastique (contenant du terreau) puis maintenues pendant 14 jours dans une
chambre de culture à une température de 25°C avec 60 à 80% d’humidité et une photopériode
contrôlée de 16h. Les plantules ayant des tailles identiques sont choisies pour la suite de
l’expérience (une plantule par pot).
Les plantules obtenues sont inoculées avec 1ml de la suspension bactérienne
(antagoniste), appliquée dans le terreau à la base de la tige (collet). 24h après l’inoculation,
une suspension sporale 5.105 spores ml-1 de F. oxysporum ou V. dahliae est ajoutée de la
même manière, les plantules sont suivies avec un arrosage quotidien.
Le dépérissement et la mort des plantules sont enregistrés (Omar et al., 2006). Il est à
noter que le plateau contenant les pots est tourné tous les 2 jours pour éviter les effets de
positionnement. Deux catégories de pots servent de témoins, la première contient les plantes
de tomates saines non infectées et la deuxième catégorie contient les plantes infectées avec le
champignon pathogène.
La dernière observation est réalisée visuellement après 21 jours d’inoculation des
champignons en utilisant la clé de sévérité de Bora et al. (2004), les notations sont faites à la
fin de la troisième semaine selon l’échelle ci-dessous :
0 : pas de symptômes.
1 : < 25% des feuilles avec des symptômes
2 : 26-50% des feuilles avec des symptômes
3 : 51-75% des feuilles avec des symptômes
4 : 76-100% des feuilles avec des symptômes.
Selon Villajuan-Abgona et al. (1996), le pourcentage de suppression est calculé comme suit:
% suppression = [(A-B)/ A x 100]
A : sévérité de la maladie (pathogène seul)
B : sévérité de la maladie (pathogène + antagoniste).
III. Résultats et discussion : 1. Etude des souches fongiques :
1.1. Etude macroscopique et microscopique du Verticillium dahliae :
La colonie de V. dahliae en culture sur milieu PDA a un aspect cotonneux, de couleur
plus ou moins blanchâtre passant après 5 à 6 jours de culture à une couleur noirâtre due à la
production en abondance de microsclérotes (Fig. 6a).
Les observations microscopiques ont montré la présence d’hyphes mycéliens
ramifiées. Des conidiophores portant des phialides verticillées par groupe de trois ou quatre,
les phialides à leur extrémité des conidies plus ou moins arrondies très nombreuses. On a
observé également la présence de microsclérotes (Figs. 6b, et 6c).
Figure 6. Aspect macroscopique (a) et microscopique (640x) (présence de spores, de microsclérotes et des phialides en forme de V) (b, c) de Verticillium dahliae.
1.2. Etude macroscopique et microscopique du Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici :
La colonie de F. oxysporum en culture sur milieu PDA a un aspect feutré, aérien d’une
couleur blanchâtre (Fig. 7a).
Les observations microscopiques ont montré la présence d’hyphes mycéliens
cloisonnés, ramifiés. Les conidiophores portent de courtes phialides, ces dernières portent à
leur extrémité des macroconidies et des microconidies qui sont abondants (Figs. 7b, et 7c).
Figure 7. Aspect macroscopique (a) et microscopique (640x) (Présence de macroconidies et de microconidies) (b, c) de Fusarium oxysporum.
2. Isolement et purification des souches bactériennes:
A partir des différents échantillons de sol, et plusieurs repiquages successifs, nous
avons pu isoler et purifier 36 souches qui correspondaient à nos exigences.
3. Pré-identification des bactéries:
L’étude macroscopique réalisée sur milieu solide gélose nutritive (GN) nous a permis
d’observer de grandes colonies sèches et irrégulières (Fig. 8). L’examen microscopique
montre de gros bacilles rectilignes à extrémités carrées ou arrondies positifs à la coloration de
Gram, avec une spore (Figs. 9, et 12).
a cb
a b c
Les colonies sur milieu King B sont plus petites, nacrées avec un contour dentelé et
une pigmentation jaune-vert de toutes les souches obtenues (Fig. 10), tandis que l’examen
microscopique a montré de fins bacilles droits négatifs à la coloration de Gram (Fig. 11). Ces
souches ont été transférées sur milieu citrate de Simmons et ont toutes provoqué un virage de
l’indicateur (Fig. 13), ainsi que la présence d’une oxydase. La totalité des souches est catalase
positive.
Sur les 36 souches (Tableau 7), 18 sont pré identifiées comme Pseudomonas codées P
X (X : M, A, T selon l’origine de l’échantillon), 17 correspondent au genre Bacillus codées B
X., ainsi qu’une souche inconnue nommée XT.
Tableau 7. Résultat de l’isolement des souches de Bacillus et Pseudomonas.
Lieu de prélèvement des
sols rhizosphériques
Les Bacillus Les Pseudomonas
Mohammadia Tlemcen Ain Temouchent
BM1, BM2, BM5, BM12, BM14, BM18
BT1, BT4, BT6, BT9, BT11
BA1, BA8, BA10, BA17, BA21, BA22
PM1, PM2, PM7, PM8, PM10
PT3, PT6, PT8, PT9, PT10, PT12, PT13
PA2, PA3, PA5, PA6, PA7, PA9
Total 17 18
On remarque une légère prédominance des Pseudomonas, ceci rejoint l’observation
faite par Di Battista-Leboeuf et al., (2003) que les Pseudomonas ont une densité plus élevée
dans la rhizosphère que dans le sol nu, plus précisément au niveau de la zone d’élongation des
racines et des poils absorbants.
Figure 10. Aspect macroscopique de Pseudomonas PM1 sur milieu King B.
Figure 8. Aspect macroscopique de Bacillus BT4 sur gélose nutritive.
Figure 9. Observation microscopique (1600x) de BM1 après coloration de Gram.
Figure 12. Observation microscopique (1600x) de BA10 après coloration de Gram
(présence d’endospores).
Figure 13. Utilisation du citrate de la souche Pseudomonas PT3 sur milieu citrate de
Simmons comparé au témoin.
Témoin
Figure 11. Observation microscopique (1600x) de PM1 après coloration de Gram.
4. Résultats des antagonismes in vitro des isolats :
4.1. Résultat de l’antagonisme par confrontation directe en boîte de Petri :
Sur les 36 souches bactériennes testées, 15 (41.67%) ont une action inhibitrice de la
croissance (≥20%) sur Fusarium oxysporum ou Verticillium dahliae par rapport aux témoins,
et dont 9 possèdent une double activité inhibitrice sur les deux agents phytopathogènes.
Sur les 15 souches bactériennes ayant une action sur au moins un des deux
phytopathogènes : 9 sont représentées par le genre Bacillus (60%) ; ces souches sont codées
de la manière suivante BA10, BA21, BA22, BM1, BM18, BT1, BT4, BT6, BT9 ; en
revanche 5 souches représentent le genre Pseudomonas (33.33%) : PA2, PM1, PM2, PT3,
PT6 ; et enfin 1 genre inconnu (7.67%) : XT.
Les 9 souches ayant une double action inhibitrice sur le Fusarium oxysporum et le
Verticillium dahliae sont : BA10, BA21, BM1, BT1, BT4, BT9, PM1, PT3, PT6.
Action sur Fusarium oxysporum :
Les pourcentages d’inhibition les plus élevés de la croissance mycélienne de F.
oxysporum obtenus avec les Bacillus : BA10 et BM1 sont respectivement 57 et 59% (Fig. 16).
Les Pseudomonas PM1, PM2, PT3 et PT6 présentent un pourcentage d’inhibition moyen
d’environ 35% sur le genre F. oxysporum (Fig. 14) comparé au témoin (Fig. 15). Ces souches
se sont révélées moins performantes que les isolats de Bacillus, malgré une forte pigmentation
(jaune-vert) sur milieu gélosé (Fig. 16).
Figure 14. Diagramme représentant les pourcentages moyens d’inhibition de la croissance de Fusarium oxysporum f.sp lycopersici en confrontation directe avec les antagonistes.
0
10
20
30
40
50
60
70
BA10 BA21 BA22 BM1 BT1 BT4 BT6 BT9 PM1 PM2 PT3 PT6
% d’inhibition
Souches bactériennes
Figure 15. Fusarium oxysporum sur milieu de culture après 5 jours d’incubation (témoin).
Figure 16. Confrontation directe en boîte de Petri entre les souches bactériennes (BA10, BM1, BT6, PM1) et Fusarium oxysporum après 5 jours d’incubation.
Action sur Verticillium dahliae :
L’action inhibitrice des souches bactériennes sur le V. dahliae a montré que 4 souches
se distinguent et présentent des résultats encourageants (Fig. 17), il s’agit des Bacillus BT4
avec 62%, BA10 avec 72%, BM1 et BT9 avec 75% d’inhibition de la croissance de
Verticillium (Fig. 19) comparé au témoin (Fig. 18); les autres souches de Bacillus présentent
un antagonisme allant de 30 à 45%, tandis que pour les Pseudomonas leur pourcentage
d’inhibition se situe entre 30 et 40% (Fig. 17).
Figure 17. Diagramme représentant les pourcentages moyens d’inhibition de la croissance de Verticillium dahliae en confrontation directe avec les antagonistes.
Les résultats obtenus montrent que pour les isolats les plus performants, la zone
d’inhibition est tellement grande qu’il n’y a pas eu de contact physique avec le pathogène
(Fig. 16,18) concluant que la bactérie produit des métabolites antifongiques (Montealegre et
al., 2003). La différence entre les pourcentages d’inhibition de nos souches suggère que le
mode d’action et/ou le type de métabolite produit par les isolats peut varier, mais aussi que les
bactéries sont taxonomiquement différentes (Williams et Asher, 1996).
% d’inhibition
Témoin
PM1 BM1 BA10 BT6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
BA10 BA21 BM1 BM18 BT1 BT4 BT9 PA2 PM1 PT3 PT6 XTSouches bactériennes
Les métabolites sécrétés par la bactérie peuvent agir sur le champignon
phytopathogène comme fongistatique, inhibiteur de la germination, fongicide ou en lysant le
mycélium (Gloud, 1990). Selon Vining (1990), la production de ces métabolites secondaires
s’effectue durant la phase stationnaire de la bactérie. Alippi et Monaco (1994) ont démontré
que plusieurs souches de Bacillus pouvaient produire des métabolites antifongiques tels que
subtiline, bacitracine, bacilline et bacillomycine qui appartiennent à la famille des iturines.
Figure 18. Verticillium dahliae sur milieu de culture PDA après 10 jours d’incubation (témoin).
Figure 19. Confrontation directe en boîte de Petri entre les souches bactériennes (BA10, BT1, BT9, PM1) et Verticillium dahliae après 10 jours d’incubation.
De plus, comme le milieu PDA (et GN) utilisé dans l’expérience de confrontation
directe est riche en nutriments, la compétition peut être exclue comme le mode d’action de ces
isolats (Landa et al., 1997).
4.2. Résultat de l’antagonisme par les substances antagonistes volatiles :
Sur les 15 souches sélectionnées, 4 (26.67%) ont montré un effet antagoniste contre le
Fusarium oxysporum, il s’agit de: BA10, BM1, BT4, PT6 (Fig. 20) en les comparant au
témoin. Le reste des souches a montré une inhibition négligeable et parfois nulle.
Figure 20. Confrontation indirecte (substances volatiles) : Bacillus BT4 contre Fusarium oxysporum avec le témoin.
Figure 21. Diagramme représentant les pourcentages moyens d’inhibition de la croissance de Fusarium oxysporum f.sp lycopersici en confrontation indirecte (substances volatiles) avec
des antagonistes.
0
5
10
15
20
25
30
35
BA10 BM1 BT4 PT6
% d’inhibition
Souches bactériennes
Témoin
BT9 PM1 BA10
BT1
Les pourcentages d’inhibition des souches bactériennes varient de 21 à 33% (Fig. 21),
ceci montre que l’action des composés volatils sur la croissance de Fusarium oxysporum est
moins importante que lors des confrontations directes. D’ailleurs, ces résultats rejoignent ceux
de Tripathi et Johri (2002), signalant les composés volatils antifongiques produits par des
Pseudomonas fluorescents comme ayant un pouvoir antifongique moins important que leurs
produits diffusibles.
Les composés volatils tels que l’ammoniac et le cyanure d’hydrogène (HCN) sont
produits par un grand nombre de rhizobactéries et jouent un grand rôle dans le biocontrôle
(Brimecombe et al., 2001). Alabouvette et al. (1993) ont démontré que l’efficacité d’un agent
de contrôle biologique n’était pas due à seul mécanisme mais à une combinaison de différents
modes d’action.
4.3. Résultat de l’antagonisme par activité des filtrats de culture :
L’incorporation du filtrat des souches antagonistes dans le milieu de culture provoque
certes une inhibition moins importante mais non négligeable variant de 20% pour la souche
PT3 à 25% pour la souche PM1. Parmi les 15 isolats testés 6 souches (40%), ont un effet
inhibiteur de la croissance mycélienne de Fusarium oxysporum, il s’agit de : BA10, BM1,
BT4, PM1, PT3, PT6. Les trois souches de Pseudomonas se sont avérées moyennement plus
performantes que les Bacillus par cette méthode (Fig. 22). Ces résultats d’antagonisme par
action des filtrats de culture sont en accord avec ceux de Howell et Stipanovic (1979), Scher
et Baker (1982), Digat (1983), Olivier et Guillaumes (1983), Lemanceau et al. (1988), Loper
(1988) et Park et al. (1988). Ceci conforte aussi l’hypothèse de Sedra et Maslouhy (1994),
selon laquelle ces antagonistes sécrètent des substances antibiotiques. Ces dernières agissent
sur le parasite par une lyse du mycélium; ceci est à l’origine du phénomène d’aplatissement
des colonies observé face aux antagonistes.
Les différences d’intensité du pouvoir inhibiteur de nos souches pourraient être liées à
la nature et la quantité des substances sécrétées. Mishagi et al. (1982), ont établi une
corrélation entre la quantité de pigments fluorescents et le pouvoir antagoniste des
Pseudomonas. Plusieurs types de pigments fluorescents sont mentionnés dans la
littérature telles que: la pyoverdine (Turfreijer, 1942 ; Bossier et al., 1988 ; Iswandi, 1986), la
fluorescine (King et al., 1948), la pseudobactine (Kloepper et al., 1980).
Figure 22. Diagramme représentant les pourcentages moyens d’inhibition de la croissance de Fusarium oxysporum f.sp lycopersici en confrontation indirecte (filtrats de culture) avec des
antagonistes.
Plusieurs travaux ont démontré que les souches bactériennes non antagonistes sur
boîte (in vitro) sont généralement inactives aussi in vivo (Broadbent et al., 1971). Il est donc
préférable de passer par des tests in vitro, et cela malgré les limites de ces derniers, pour le
contrôle in planta (Inam-ul-Haq et al., 2003). Sur la base de cette hypothèse et suite à nos
différents résultats, nous avons choisi de tester pour la suite de notre travail deux souches
bactériennes se caractérisant par un meilleur phénomène d’antagonisme in vitro. A ce sujet,
nous avons sélectionné une souche de Bacillus (BM1), et une souche de Pseudomonas (PM1).
Avant d’aborder le phénomène d’antagonisme in vivo, une étude de caractérisation de
la souche PM1 fut réalisée grâce à l’utilisation de galeries API 20 NE. Cette étude a permis
d’identifier cette souche comme étant Pseudomonas fluorescens (Fig. 23).
Figure 23. Caractérisation de la souche Pseudomonas PM1 à l’aide d’une galerie API 20 NE.
0
5
10
15
20
25
30
BA10 BM1 BT4 PM1 PT3 PT6
% d’inhibition
Souches bactériennes
5. Résultats des essais in vivo :
5.1. Résultats de l’essai sur graines en boîtes de Petri :
Les résultats des confrontations in vivo en boîtes de Petri sont regroupés dans le
tableau (8) ci-dessous :
Tableau 8. Confrontation in vivo (sur graines en boîte) entre Fusarium, Verticillium et 2 antagonistes bactériens BM1 et PM1 sur 4 variétés de tomate.
Luxor F1 Marmande Heinz 1370 St. Ruff P.F (g) I.M P.F I.M P.F I.M P.F I.M
Témoin 0.066 0 0.044 0 0.018 0 0.019 0 Var.+F.o.l 0.011 3.6 0.011 3.7 0.015 0 0.009 2.6 Var.+BM1+F.o.l 0.031 2.2 0.032 2.8 0.019 0 0.011 1.9 Var.+PM1+F.o.l 0.034 2.2 0.023 3.0 0.020 0 0.017 1.2 Var.+V.d 0.019 3.2 0.015 3.5 0.008 2.5 0.009 3.0 Var.+BM1+V.d 0.037 2.0 0.032 3.0 0.012 2.0 0.011 2.3 Var.+PM1+V.d 0.031 2.1 0.024 2.4 0.016 2.1 0.010 2.4
Var. : Variété de tomate, P.F : poids frais (g), I.M : indice de maladie,
-Poids frais (P.F) :
En comparant les poids frais des témoins on constate que la variété Luxor F1 (hybride)
se distingue avec une meilleure croissance (0.066g), suivi de Marmande (0.044g), St. Ruff
(0.019g) et Heinz 1370 (0.018g).
Graines traitées par Fusarium oxysporum:
Les graines de tomate de la variété Luxor F1, Marmande et St. Ruff inoculées par les
spores du Fusarium oxysporum ont montrés une nette diminution du poids frais (0.011g,
0.011g et 0.009g respectivement), à l’exception de la variété Heinz 1370 (0.015g). La
différence entre les témoins (plantules non inoculées) et les plantules infectées par le
champignon est assez importante, cette action peut s’expliquer par l’absence de compétition
facilitant la dissémination du pathogène et augmentant ainsi son potentiel d’infection
(Stanghellini et Rasmussen, 1994).
Cependant, la pré-inoculation des graines par les antagonistes a eu un effet bénéfique
sur la croissance des graines par rapport à celles inoculées seulement avec le champignon.
Ce résultat s’est traduit chez la variété Marmande pré-inoculée par le Bacillus BM1
avec un poids d’environ 0.032g (Fig. 27) et 0.034g pour la variété Luxor F1 pré-inoculée par
le Pseudomonas PM1.
Pour la variété Heinz (résistante) une légère augmentation du poids frais de la graine
inoculée par les bactéries fut observée (0.019g pour BM1 et 0.020g pour PM1) par rapport au
témoin (0.018g) (Fig. 25).
Graines traitées par Verticillium dahliae:
Toutes les graines de tomate inoculées par les spores de Verticillium dahliae ont
montrés une diminution du poids frais. La pré-inoculation des différentes graines par les
bactéries antagonistes a montré une augmentation du poids frais par rapport aux graines
inoculées seulement avec le champignon, 0.031g pour Luxor F1 avec la souche PM1 (Fig.
26), et 0.032g pour Marmande avec la souche BM1.
-Indice de maladie (I.M):
L’indice de maladie (0 pour les témoins) est de 3.6 pour la variété Luxor F1 inoculée
seulement avec le Fusarium oxysporum, tandis que pour les mêmes graines inoculées
préalablement par le Pseudomonas PM1 il est de 2.2.
Les résultats de l’indice de maladie obtenus concordent avec ceux des poids frais, et
nous permettent de suggérer que la différence de poids des plantules et donc de leur
croissance résulte de la diminution de la sévérité de la maladie qui s’est traduite en plus d’une
diminution de la croissance de la plantule par un brunissement de la racine.
Figure 24. Test in vivo en boîtes de Petri sur des graines de tomate (St. Ruff) au jour 0.
Figure 25. Résultat de l’essai in vivo en boîtes de Petri sur graines de tomate variété Heinz au 7ème jour (a : Témoin, b : graine+PM1+ F.o.l, c : graine+ F.o.l).
Figure 26. Résultat de l’essai in vivo en boîtes de Petri sur graines de tomate variété Luxor F1 au 7ème jour (a : Témoin, b : graine+PM1+ V.d, c : graine+ V.d).
Figure 27. Résultat de l’essai in vivo en boîtes de Petri sur graines de tomate variété Marmande au 7ème jour (a : Témoin, b : graine+BM1+ F.o.l, c : graine+ F.o.l).
a b c
Tous les traitements des graines de tomate avec les antagonistes sélectionnés tendent à
diminuer le pouvoir pathogène des champignons. Les souches de Bacillus BM1 et
Pseudomonas PM1 stimulent légèrement la croissance des graines de tomate variété Heinz
(résistante à la fusariose), et pourrait s’expliquer par la sécrétion de métabolites
phytohormonales (Killian et al., 2000). Selon Tang (1994), un certain nombre de Bacillus ont
la capacité de produire des phytohormones : zéatine, acide gibbérellique et acide abscisique.
Woritka et al. (2004) ont démontré aussi que B. subtilis est capable de promouvoir la
croissance de la plante ainsi que d’augmenter la viabilité des graines de tomate.
L’ajout d’une suspension bactérienne à des graines de tomate a réduit de façon
significative la colonisation fongique de ces dernières, on peut supposer que cette action
résulte de la compétition pour les nutriments. Ce résultat montre l’intérêt et l’importance de la
présence de ces rhizobactéries dans la lutte biologique.
Cette infection est hautement artificielle, et comparée à une infection naturelle
l’inoculum fongique est présent à une haute concentration. Cependant, il est impossible d’en
conclure la quantité de bactéries nécessaires pour la suppression d’une infection sous des
conditions naturelles.
5.2. Résultats des essais en serre :
Les résultats du degré de protection des souches antagonistes effectués en serre sont
représentés dans le tableau (9) :
Tableau 9. Résultats des essais in vivo (in planta) entre Fusarium, Verticillium et les 2 antagonistes bactériens BM1 et PM1 sur 2 variétés de tomate.
Marmande St. Ruff
C.S % A % S C.S % A % S
Témoin 0 0 - 0 0 - Var.+F.o.l 2.12 43.5 0 2.14 36 0 Var.+BM1+F.o.l 2.0 34.9 19.77 2.0 35 2.78 Var.+PM1+F.o.l 2.0 34.8 20 2.0 34.5 4.17 Var.+V.d 2.5 51.51 0 2.4 48.89 0 Var.+BM1+V.d 2.0 37 28.17 2.0 28.11 42.5 Var.+PM1+V.d 2.0 32 37.87 2.0 38 22.27
Var. : Variété de tomate, C.S : Clé de sévérité, % A: pourcentage moyen d’atteinte des feuilles/plante, % S : pourcentage moyen de suppression de la maladie chez la plante.
-Essai sur la variété Marmande :
Les résultats présentés dans le tableau (9) montrent que le pourcentage moyen
d’atteinte des feuilles par plantes de tomate inoculées seulement avec le parasite est de 43.5%
pour le Fusarium oxysporum, et de 51.51% avec le Verticillium dahliae, avec une clé de
sévérité de 2.12 et 2.5 respectivement. Les plantules ayant reçu un inoculum bactérien dans le
terreau en plus de la suspension sporale du Fusarium oxysporum ont montré une suppression
de la maladie d’environ 19.77% avec la souche BM1 (Fig. 28), et 20% en présence de la
souche PM1. Cependant, les pourcentages de suppression de la maladie causée par
Vertcillium sur les plantules de tomate avoisinent les 28.17% et 37.87% pour BM1 et PM1
respectivement.
Figure 28. Résultat de l’essai in vivo en serre sur plants de tomate variété Marmande (a : Témoin, b : plante+F.o.l, c : plante+BM1+F.o.l).
-Essai sur la variété St. Ruff :
Les résultats mentionnés dans le tableau (9) montrent que le pourcentage moyen
d’atteinte des feuilles par plantes de tomate inoculées seulement avec le Fusarium oxysporum
est de 36%, en revanche ce pourcentage a atteint 48.89% en présence de Verticillium dahliae,
avec une clé de sévérité de 2.14 et 2.4 respectivement. Les plantules ayant reçu un inoculum
bactérien dans le terreau en plus de la suspension sporale du Vertcillium ont montré une
suppression de la maladie de 42.5% avec la souche BM1 (Fig. 29), et 22.27% avec la souche
PM1. Cependant, le pourcentage de suppression de la maladie causée par Fusarium
oxysporum est de 2.78% et 4.17% en présence de BM1 et PM1 respectivement.
Figure 29. Résultat de l’essai in vivo en serre sur plants de tomate variété St. Ruff (a : Témoin, b : plante+V.d, c : plante+BM1+V.d).
D’après ces résultats, on remarque que les mêmes souches bactériennes BM1 et PM1,
actives sur le Fusarium oxysporum testées sur la variété Marmande, sont moins performantes
sur la variété St. Ruff.
a b c
a b c
Les résultats sont encourageant vis-à-vis du Verticillium dahliae, où la souche BM1
avec 42.5% de suppression de la maladie chez la variété St. Ruff et 28.17% chez la Marmande
est assez performante. Un des mécanismes par lequel les Bacillus exercent un effet
antifongique est le parasitisme par dégradation des membranes des phytopathogènes,. B.
licheniformis (Trachuk et al., 1996) et B. circulans (Watanabe et al., 1990) produisent
l’enzyme chitinase qui dégrade la chitine. Grâce à cette habilité à dégrader la chitine,
composant majeur dans la structure des membranes cellulaires des phytopathogènes (Someya
et al., 2004), ces enzymes chitinolytiques sont considérées importantes dans le contrôle
biologique des pathogènes du sol (Singh et al., 1999).
On peut supposer que la souche Pseudomonas PM1 avec environ 37.87% et 22.27%
de suppression de la maladie causée par Verticillium dahliae chez Marmande et St. Ruff
respectivement peut représenter un bon antagoniste. Vandenbergh et al. (1983) et
Ramamoorthy et al. (2002) ont établi que P. fluorescens stimulait les mécanismes de défense
des plantes en améliorant leur résistance à différents phytopathogènes.
Ces bactéries rhizosphèriques bénéfiques à la croissance de la plante, sont nommées
plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) (Kloepper et Schroth, 1978). La promotion
indirecte de la croissance de la plante se produit lorsque le PGPR atténue ou prévient les
effets néfastes des phytopathogènes par divers mécanismes telle que l’antibiose (Ashgar et al.,
2004). Elizabeth et Handelsman (1999) évoquent l’effet de Bacillus cereus sur les
rhizobactéries comme stimulant la croissance de certaines bactéries, qui augmentent la
croissance des racines, atténuent le pathogène ou induisent une résistance chez l’hôte.
Malgré les bons résultats obtenus par BM1 et PM1, une certaine différence existe entre
les résultats in vitro et in vivo. Ces résultats rejoignent ceux de Burr et al. (1978) qui ont
observé que l’effet antagoniste exprimé in vitro n’est pas toujours retranscrit dans le sol. La
diminution de l’effet antagoniste par rapport aux confrontations directes, pourrait s’expliquer
par la concentration des nutriments dans la rhizosphère qui diffère de celle du milieu de
culture, affectant ainsi la production de métabolites secondaires nécessitant un certain nombre
de carbone (Elad et Baker, 1985). On pourrait expliquer aussi la diminution de l’antagonisme
de Pseudomonas PM1 par le fait que les sidérophores ne sont pas produits en présence de fer
(Meyer et Abdallah, 1978), et donc la perte partielle du potentiel antagoniste peut être due à
l’absence de sidérophores dans un environnement riche en fer (sol).
La fluctuation du niveau des sources de carbone dans la rhizosphère pourrait être une
des raisons de la variation des résultats in vitro et in vivo concernant les mêmes isolats
bactériens, puisque dans la rhizosphère les nutriments deviennent disponibles de façon
aléatoire (Lynch, 1990). Ces bactéries en carence pour des périodes plus ou moins longues
pourraient donc ne pas produire les substances antifongiques qui ont été observées sur les
milieux de culture (riches en nutriments). James et Gutterson (1986) ont remarqué aussi que la
production des antibiotiques n’est pas influencée que par la quantité mais aussi par la qualité
de la source de carbone.
Les essais de lutte biologique à l’aide de ces souches bactériennes ont montré qu’il
était possible de limiter l’incidence du F. oxysporum et du V. dahliae, bien que le niveau de
protection ne soit pas assez important. Néanmoins, l’utilisation de ce traitement biologique
permet de maintenir la maladie à un seuil acceptable, d’autant plus que les mesures
prophylactiques préconisées seront effectivement mises en pratique.
D’autres travaux ont permis de démontrer l’importance de l’action inhibitrice exercée
par des souches de Pseudomonas spp. sur le F. oxysporum ciceri, agent de la fusariose du pois
chiche (Inam-ul-Haq et al., 2003).
Uppal et al. (2008) ont noté une réduction significative de l’incidence de la
verticilliose sur la culture de la pomme de terre par des souches de Pseudomonas spp.
D’autre part, Ahmed Idriss et al., (2007) et Zhang et al., (2008) ont signalés que des enzymes
du genre Bacillus spp. auraient un rôle dans la lyse hyphale de certains champignons
phytopathogènes tels que Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Pythium ultimum et
Alternaria solani.
Dans la majorité des travaux relatifs à l’utilisation des Pseudomonas spp. et Bacillus
spp., la présélection des souches repose, en grande partie sur l’activité de l’antagonisme in
vitro. Cependant, la corrélation entre les potentialités exhibées in vitro et les niveaux des
actions de biocontrôle ou de biostimulation de la croissance végétale, n’est pas toujours
évidente (Toua, 1996 ; Benchaabane et al., 2000). Cette différence de comportement
antagoniste des souches bactériennes in vitro et invivo a été également signalée par Mercado-
Blanco et al. (2004), qui ont montré l’absence de corrélation entre le traitement des plantes
d’oliviers infectés par V. dahliae et les essais in vitro en présence de Pseudomonas spp.
L’antibiose in vitro pour la présélection, impose des restrictions devant la découverte
et la mise en évidence d’autres mécanismes d’actions. Il est très utile d’utiliser des méthodes
relatives aux aptitudes des souches, qui sont plus stables et qui se rapprochent le mieux
possible des conditions d’utilisation in situ (Défago et al., 1990 ; Delorme, 2001 ; Latour et
al., 2003).
Conclusion et perspectives
Nous avons débuté ce travail en isolant des bactéries à partir de 3 échantillons de sol
rhizosphérique provenant du nord-ouest de l’Algérie. Ceci nous a permis d’isoler et de pré-
identifier 36 souches, dont 18 souches correspondent au genre Pseudomonas, 17 à celui des
Bacillus et une souche de genre inconnu.
Les 36 souches ont été testées par les méthodes de confrontation sur boîtes de Petri (in
vitro), il en est ressorti que la méthode la plus efficace sur la croissance mycélienne des
parasites était la méthode directe sur boîte comparée à celle par action des substances volatiles
et à celle par action des filtrats de culture. Nous avions choisi à la lumière de ces résultats 2
meilleurs antagonistes : Bacillus BM1 et Pseudomonas PM1, pour les essais sur plants de
tomate (in vivo).
L’ajout d’une suspension bactérienne à des graines de tomate (4 variétés) a réduit de
façon significative la colonisation fongique de ces dernières avec même un certain effet
bénéfique sur la croissance de la graine Heinz pré-inoculée par les souches BM1 et PM1.
Les résultats des essais en serre sur plants de tomate ont montré des résultats
encourageants de suppression des maladies variant de 19 à 42 %, mais aussi que certaines
souches bactériennes étaient efficaces sur les champignons chez une variété de tomate mais
pas dans l’autre supposant une différence possible dans les exsudats racinaires chez ces 2
variétés.
Les essais de lutte biologique à l’aide de ces souches bactériennes ont montré qu’il
était possible de limiter l’incidence du F. oxysporum et du V. dahliae, bien que le niveau de
protection ne soit pas assez important. Néanmoins, l’utilisation de ce traitement biologique
permet de maintenir la maladie à un seuil acceptable, d’autant plus que les mesures
prophylactiques préconisées seront effectivement mises en pratique.
Les mécanismes qui régissent les interactions plante-bactérie-champignon sont
complexes. Il est primordial de ne pas considérer la maladie seulement comme une relation
entre la plante hôte et le parasite, mais de tenir compte aussi des organismes non pathogènes,
du phylloplan et /ou de la rhizosphère. L’équilibre entre ces trois éléments est fragile, il
dépend grandement des conditions extérieures, tels que le climat et la nature du sol (Bora et
Ozaktan, 1998).
Les essais effectués in vitro et in vivo nous ont permis de mettre en évidence des effets
antagonistes de quelques souches bactériennes. Ces effets antagonistes non négligeables
pourraient s’ajouter aux autres méthodes de lutte, chimique ou génétique. Selon Henni (1987)
et Omar et al. (2006), il serait intéressant de combiner la lutte biologique avec la lutte
chimique à moindres doses. Les tests que nous avons développés peuvent servir de base à la
mise en évidence de propriétés antibiotiques des Bacillus et des Pseudomonas. La mise au
point d’autres tests permettra de révéler d’autres aspects de l’activité antagoniste des souches
bactériennes et de rechercher des espèces plus efficaces afin de les utiliser dans la lutte contre
les maladies d’origine tellurique.
Enfin, bien qu’il s’agisse d’un domaine de recherche assez récent par rapport à la lutte
chimique, nous pensons que des possibilités de lutte biologique s’étendront aux différents
types de cultures et espèces végétales. D’ailleurs, plusieurs auteurs (Akkopru et Demir, 2005 ;
He et al., 2006), estiment qu’elle sera appelée dans un temps proche à jouer le rôle d’un
fongicide, puisque dans plusieurs cas, le contrôle de leur application devient souvent difficile,
parfois impraticable (Sedra et Maslouhy, 1995 ; Snissi et al., 2006).
S’il est bien vrai que la sélection des agents antagonistes est une des principales voies
à nous fournir des agents biologistes efficaces, il est certain aussi qu’elle sera la seule à nous
fournir des agents antagonistes et hautement compétiteurs. Les résultats des essais que nous
avons réalisés confirment la nécessité de continuer à effectuer des tests de pouvoir
antagonistes et de sélection d’agents de bio-contrôle au laboratoire, puis à petite échelle les
compléter par d’autres méthodes plus perfectionnées. Ainsi, une collection d’agents plus ou
moins antagonistes serait sélectionnée tout en étant d’origines différentes, adaptées au milieu,
pour obtenir à la fin une banque d’agents performants, susceptibles d’être incorporés dans les
travaux de lutte biologique.
Pour lutter contre les bio-agresseurs, il faut introduire le bon auxiliaire, au bon
moment et à la bonne dose. Cependant, un bon antagoniste défini dans des conditions
expérimentales doit posséder certaines propriétés pour être utiliser dans la lutte biologique à
grande échelle :
- aptitude à la colonisation de la rhizosphère et à la conservation.
- propriétés technologiques, telle que la multiplication facile de l’antagoniste.
- propriété toxicologique : indemne de pathogénéité pour l’homme, les animaux et les
végétaux traités et ne présentant pas de risque lors de sa préparation.
- et une propriété agronomique, l’utilisation de l’antagoniste doit pouvoir s’inscrire
dans un itinéraire technique aboutissant à la meilleure stratégie visant à associer la lutte
biologique à une lutte chimique ou à une amélioration des plantes (Fernandes, 2005).
En ce qui concerne notre travail, il reste à identifier certaines de nos souches
bactériennes, ainsi que la nature chimique des substances antibiotiques mises en jeu dans le
phénomène d’antibiose vis-à-vis du parasite. La mise en évidence et l’identification de tels
composés in vitro sont relativement simples, mais sont par contre compliquées in situ en
raison de leur faible concentration (Dommergues et Mangenot, 1970 ; Mangenot et Diem,
1979).
Il est à noter qu’une étude sur une caractérisation préliminaire des substances actives
secrétées par les 2 antagonistes (BM1 et PM1) a été entamée, mais malheureusement, cette
étude n’a pas été poursuivie faute de temps et de non disponibilité de matériel spécifique à ce
genre d’étude.
Nous suggérons que ce travail soit repris sur un nombre de souches plus important,
tout en diversifiant les origines géographiques. Il serait également très intéressant de
poursuivre ce travail de screening de souches bactériennes, afin de réduire l’incidence de la
fusariose et de la verticilliose.
Ce travail a fait l’objet d’une présentation scientifique lors du séminaire national sur
Agriculture, Environnement et Santé en avril 2008 à Khemis Miliana.
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Annexe 1
Préparation des milieux de culture
- la dissolution des ingrédients s’effectue dans de l’eau distillée (volume déterminé) dans un bécher. - le milieu est stérilisé à l’autoclave pendant 20 minutes, à une température d’environ 120 °C et correspondant à une pression de 1 bar. - il est ensuite placé à température ambiante afin de le refroidir pour le manipuler plus facilement et surtout afin d’éviter la condensation sur les couvercles des boîtes de Petri.
Milieu YPG
Extrait de levure : 5 g Peptone : 5 g Glucose : 20 g eau distillée : q.s.p 1000 ml pH : 6.8
Milieu Bouillon Nutritif
Extrait de viande : 1.0 g Extrait de levure : 2.0 g Peptone : 5 g Chlorure de Sodium : 5 g eau distillé : q.s.p 1000 ml pH : 7.4 Ajouter 15 g d’Agar pour obtenir de la gélose nutritive
Milieu citrate de Simmons
Citrate de sodium : 1.0 g Bleu de bromothymol : 0.08 g Chlorure de sodium : 5.0 g Sulfate de magnésium : 0.2 g K2HPO4 : 1.0 g NH4H2PO4 : 1.0 g Agar : 15 g eau distillée : q.s.p 1000 ml pH : 7.1
Milieu King B
Peptone : 20 g Glycérol : 10 ml K2HPO4 : 1.5 g MgSO4, 7H2O : 1.5 g eau distillée : q.s.p 1000 ml pH : 7.2
Milieu PDA
Infusion de pomme de terre : 200 ml Dextrose : 20 g Agar : 20 g Eau distillée : q.s.p 1000 ml pH : 5.6
Eau physiologique
Chlorure de sodium : 9g eau distillée : q.s.p 1000 ml
Annexe 2
La cellule de Malassez
Cette cellule permet de mesurer la quantité de particules en suspension dans un volume déterminé. Ce volume est compris entre le plan inférieur de la cellule et la face d’une lame appliquée sur deux épaulements situés à 0.2 mm du plan inférieur de la cellule.
Un réticule permet de matérialiser un quadrillage, chaque carreau a un volume de 1/100 de mm3. Surface du réticule : 2.5 x 2 = 5 mm2 Epaisseur : 0.2 mm Volume : 5 x 0.2 = 1 mm3
Réticule de la cellule de Malassez Suspension sporale de Fusarium oxysporum sous microscope (640x).
Annexe 3
Le terreau
Terreau professionnel AGROFINO
Matière organique en pourcentage de la matière sèche : Matière sèche en pourcentage de produit brut : pH (H2O) : Conductivité électrique (µS/cm): Rétention en air (%) : Rétention en eau (%) : Capacité d’eau (en g/ 100 M.S) : Volume en L : Humidité (en % du produit brut) :
95 35 5.8 500 15 70 800 80 57
Résumé :
Les champignons pathogènes causent de nombreuses maladies des plantes, dont la
gravité peut être atténuée par les bactéries non-pathogènes associées. Un total de 36 souches
(18 Pseudomonas, 17 Bacillus et 1 de genre inconnu) ont été isolées et pré-identifiées à partir
de différents sols rhizosphériques du nord ouest algérien (Mohammadia, Tlemcen et Ain
temouchent). Diverses méthodes de confrontation avec les champignons phytopathogènes
(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici et Verticillium dahliae) ont été utilisées, parmi les
méthodes in vitro la méthode par confrontation directe sur boîte de Petri a donné les meilleurs
résultats et plus particulièrement avec les souches BM1, BA10 et PM1.
La bactérisation des graines de tomate, ainsi que la pré-inoculation des plantules de
tomate par les souches bactériennes BM1 et PM1 avant l’ajout du champignon, ont pour la
plupart montrées une diminution de la gravité de ces maladies.
Mots-clés: Bacillus, Pseudomonas, Fusarium oxysporum, Verticillium dahliae, lutte biologique, tomate. Abstract:
The fungi cause many diseases of plants, whose seriousness can be attenuated by the
non-pathogenic associated bacteria. A total of 36 strains (18 Pseudomonas, 17 Bacillus and 1
of unknown genus) were isolated and pre-identified from different rhizosperhic soils of the
Algerian western north (Mohammadia, Tlemcen and Ain Temouchent).
Various methods of confrontation with plant pathogenic fungi (Fusarium oxysporum
f.sp. lycopersici and Verticillium dahliae) were used, among in vitro methods the method by
direct confrontation on Petri dishes gave the best results and especially with the strains BM1,
BA10 and PM1.
The tomato seeds bacterisation as well as the pre-inoculation of tomato seedlings by
bacterial strains BM1 and PM1 before adding the fungi, have mostly shown a decrease in the
severity of these diseases.
Key words: Bacillus, Pseudomonas, Fusarium oxysporum, Verticillium dahliae, biological
control, tomato.
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