Outil PCR et surveillance de la résistances des [Mode de com

5/12/2018 Outil PCR et surveillance de la résistances des [Mode de com - slidepdf.com

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Outil PCR et surveillance de laOutil PCR et surveillance de la

résistances des pathogènesrésistances des pathogènes

responsablesresponsables

de maladies infectieuses SIMRde maladies infectieuses SIMR

Pr DossoPr Dosso

IntroductionIntroduction

Détection et/ ou Quantification acidesDétection et/ ou Quantification acidesnucléiques joue un rôle majeur dans denucléiques joue un rôle majeur dans de

nombreux domaines de la biolo ienombreux domaines de la biolo ie

Intérêt de la biologie moléculaireIntérêt de la biologie moléculaireen infectiologieen infectiologie

Détection d’agent pathogèneDétection d’agent pathogène

’’

ypage agen pa og neypage agen pa og ne

Evaluation de la charge viraleEvaluation de la charge virale

EpidémiologieEpidémiologie

Agents pathogènesAgents pathogènes

H elminthes Ascaris lumbricoides AD N + ARN

Protozoaires Plasmodium falciparum ADN + ARN

amp gnons sperg us um ga us +

Escherichia coli ADN + ARNBactériesChlamydia pneumoniae ADN + ARN

Herpès simplex AD NVirus

Haemophilus influenzae ARN

Techniques moléculaires et biologieTechniques moléculaires et biologie

Diagnostic des maladiesDiagnostic des maladies

– – Infectieuses , Cancers, Génétique… Infectieuses , Cancers, Génétique…

Facteurs de virulence:Facteurs de virulence: Toxine, Enzymes, Capsule…Toxine, Enzymes, Capsule…

Résistances :Résistances :

Antibioti uesAntibioti ues

AntivirauxAntiviraux

AntiparasitaireAntiparasitaire

Diversité génétiqueDiversité génétique

– – Tracabilité des épidémiesTracabilité des épidémies – – RéinfectionRéinfection

– – CoinfectionCoinfection

– – RechuteRechute

Techniques moléculaires et biologie (2)Techniques moléculaires et biologie (2)

Détermination de la charge virale:Détermination de la charge virale:

Suivi des thérapeutiques et appréciation de laSuivi des thérapeutiques et appréciation de la

gravitégravité

– – VIH (efficacité du traitement)VIH (efficacité du traitement)

– – VHC (pronostic de réponse au traitement)VHC (pronostic de réponse au traitement)

– – Virus herpétiques (détection de réactivation)Virus herpétiques (détection de réactivation)

Diagnostic anténataux : Biologie prédictiveDiagnostic anténataux : Biologie prédictive



Liste révisée des maladies prioritaires, des affections et des évènements

Maladies à potentiel épidémique, affections et évènements recommandés par le RSI

1.Choléra

2.Dysenterie

3.Rougeole

4.Méningite

5.Peste

6.Fièvres hémorragiques virales (Ebola, Marburg, fièvre de la

vallée du Rift…)

7.Grippe humaine due à un nouveau sous type

1.Fièvre jaune

2.SRAS

3.Variole

4.Dengue

5.Trachome

6.Chikungunya

7.Anthrax

8.Fièvre Typhoïde

9.Hépatite-B

Maladies à Eradiquer et à Eliminer

. o iomyéi te

2.Dracunculose

3.Lèpre

1.Tétanos néonatal

2.Noma

Autres Maladies d’Importance en Santé Publique

1.Diarrhée chez les enfants de moins de 5 ans

2.Pneumonie chez les enfants de moins de 5 ans

3.VIH/SIDA

4.Paludisme

5.Onchocercose

6.Infections sexuellement transmissible (IST)

7.Trypanosomiase

1.Tuberculose

2.Filarioses

3.Ulcère de Buruli

4.Asthme

5.Diabète sucré

6.Epilepsie

7.Hypertension artérielle

8.Drépanocytose

9.Malnutrition

10.Cancers

11.Rage

12.Schistosomiase

INTERET DE L’UTILISATION DE LA PCR MULTIPLEX DANSINTERET DE L’UTILISATION DE LA PCR MULTIPLEX DANSLE DIAGNOSTIC DE LA VIRULENCE DESLE DIAGNOSTIC DE LA VIRULENCE DES

ENTEROBACTERIES PRODUCTRICES DE BETALACTAMASESENTEROBACTERIES PRODUCTRICES DE BETALACTAMASESA SPECTRE ETENDU (B.L.S.E).A SPECTRE ETENDU (B.L.S.E).

COULIBALY N.COULIBALY N.abab,, EKAZAEKAZAaa, W. LOUBIENGA, W. LOUBIENGAbb, GUESSENND, GUESSENNDbb, DOSSO., DOSSO.abab

INTRODUCTION

Variabilité profil biochimique Problèmes identification classique

Utilisation autres méthodes de caractérisation des micro-organismes :

Bactéries résistantes et virulentes = Problème de santé publique

es marqueurs mo cu a res

Génome = succession de gènes nécessaires pour multiplication et adaptation

Gènes spécifiques Utilisation comme empreintes génétiques

Identification, caractérisation des micro-organismes

Marqueurs moléculaires = gène, groupe de gènes ou séquences spécifiqu

Détection et caractérisation d’organisme (empreinte génétique)

Prédiction d’activité chez l’hôte (pathogénèse, virulence)

Nature marqueurs moléculaires = facteurs de virulence, gènes de régulatio

sé uences d’insertion sé uences ré été

LES FACTEURS DE VIRULENCE

Eléments microbien qui participent à leur capacité à infecter et à

provoquer une maladie chez une espèce donnée.

Exemple:facteur K des E.coli sur les pili…

,

ObjectifObjectif

Caractériser chez des souches productrice de bêta-lactamases

à spectre étendu (BLSE), des facteurs de virulence

(facteurs favorisant la résistance)

Méthodologie:Echantillons:

28 Souches E. coli BLSE

23 Souches K. pneumoniae BLSE

Extraction d’ADN plasmidiqueUtilisation de la technique d’amplification in-vitro: PCR multiplex (+s cibles

Extraction d’ADN par Choc Thermique’

Gènes cibles = facteurs de virulencesta (Heat-stable toxine) = souches entérotoxinogènesLT (Heat-labile toxine) = souches entérotoxinogènesipaH = souches entéroinvasives

sa on amorces sp c ques es ac eurs e v ruence c esAmplification spécifique in-vitro et révélation sur gel d’agarose.



18 19 20 21 22 23 24 25 M 26 28 (+)

1 2 3 4 5 6 7 9 M 10 11 12 13 14 15

27

16 17

(-)

424 pbipaH

8

Résultats (1)

424 pb218 pb

RésultatsRésultats (2)(2)

Présence de plasmide :Présence de plasmide :

10 souches10 souches K. pneumoniaeK. pneumoniae (origine résistance?)(origine résistance?)

00 souches00 souches E. coli E. coli

Facteurs de virulenceFacteurs de virulence

Souches entérotoxinogènesSouches entérotoxinogènes

15 % (15 % (stasta))

00 (00 (LT LT ))

Souches entéroinvasivesSouches entéroinvasives51 % (51 % (ipaipaH,H, E. coli E. coli +++)+++)

Tuberculose :Tuberculose :Méthodes de diagnosticMéthodes de diagnostic

Méthodes phénotypiquesMéthodes phénotypiques

– – Microscopie: examen de baseMicroscopie: examen de base

– – Culture et identification d’espèceCulture et identification d’espèce

– – MycobiogrammeMycobiogramme

Méthodes génotypiquesMéthodes génotypiques

– – Génotypage des souches :Génotypage des souches : gènegène rpoB, cat G…rpoB, cat G…

Méthodes génétiquesMéthodes génétiques : études des gènes: études des gènes

INTERET DE LA PCR COMME OUTIL DEINTERET DE LA PCR COMME OUTIL DE

DETECTION DES ENTEROCOQUES RESISTANTSDETECTION DES ENTEROCOQUES RESISTANTS

A LA VANCOMYCINE (VRE)A LA VANCOMYCINE (VRE)

EN SITUATION DE COLONISATION DANS LES SERVICESEN SITUATION DE COLONISATION DANS LES SERVICES

DE REANIMATION DES CHU D’ABIDJANDE REANIMATION DES CHU D’ABIDJAN

IntroductionIntroductionENTEROCOQUESENTEROCOQUES = Bactéries ubiquistes= Bactéries ubiquistes(intestin/homme, animaux, environnement)(intestin/homme, animaux, environnement)

BACTERIES PATHOGENES OPPORTUNISTESBACTERIES PATHOGENES OPPORTUNISTES

·· Infection graves / septicémie, endocardite,Infection graves / septicémie, endocardite,

·· Surinfection plaies chirurgicalesSurinfection plaies chirurgicales

·· Infections nosocomialesInfections nosocomiales ++++++ ( resp 10% Inf.( resp 10% Inf.urinaires nosocomiales)urinaires nosocomiales)

ENTEROCOCCUS FAECALIS ENTEROCOCCUS FAECALIS ++++++

(85(85--90%)90%)AUTRESAUTRES:: E.faecium, avium, duransE.faecium, avium, durans ……

Introduction (2)Introduction (2)

VREVRE = Entérocoques portant des gènes de= Entérocoques portant des gènes derésistance à la vancomycine (van)résistance à la vancomycine (van)

6 Types6 Types

Acquis:Acquis: VanVan A, B, D, E, GA, B, D, E, G

Intrinsèques:Intrinsèques: VanVan CC ((E. gallinarum,E. gallinarum,

casseliflavus, flavescenscasseliflavus, flavescens))

Gènes mobilesGènes mobiles portés par des plasmides ou deportés par des plasmides ou detransposons transfert de la résistancetransposons transfert de la résistanceà d’autres espèces (à d’autres espèces (S. aureusS. aureus))



OBJECTIFSOBJECTIFS

Déterminer le génotype des souches deDéterminer le génotype des souches de

colonisation digestive de VRE isoléescolonisation digestive de VRE isolées

c ez es pa en s osp a s s ans esc ez es pa en s osp a s s ans es

services de réanimation des 3 CHUservices de réanimation des 3 CHUd’Abidjand’Abidjan

MATERIELMATERIEL

TYPE D’ETUDETYPE D’ETUDE

Etude expérimentale: Septembre 2004Etude expérimentale: Septembre 2004

ECHANTILLONSECHANTILLONS

11 Souches d’11 Souches d’Enterococcus faecalisEnterococcus faecalis VRE isolées en 2002VRE isolées en 2002

-- Ecouvillonnage rectal de patients hospitalisés dans lesEcouvillonnage rectal de patients hospitalisés dans les

services de réanimation des CHU de Cocody,services de réanimation des CHU de Cocody,

Yopougon et TreichvilleYopougon et Treichville

-- Méthodes bactériologiquesMéthodes bactériologiques

conventionnellesconventionnelles

-- Résistantes à la vancomycine à l’ATBRésistantes à la vancomycine à l’ATB

-- CMI > 256 µg/ml par la méthode des E testCMI > 256 µg/ml par la méthode des E test

METHODESMETHODES

PCR MULTIPLEXPCR MULTIPLEX Typage / IdentificationTypage / Identification

Extraction d’ADNExtraction d’ADNMéthode physique: Choc thermiqueMéthode physique: Choc thermique

Amplification génique: Type PCR multiplexAmplification génique: Type PCR multiplex

Amorces spécifiques / SéquencesAmorces spécifiques / SéquencesE. faecalisE. faecalis

55’’--ATCATC AAGAAG TACTAC AGTAGT TAGTAG TCTTCT--33’’

55’’--ACGACG ATTATT CAACAA AGCAGC TAATAA CTGCTG--33’’

E. faeciumE. faecium

5’5’--TCG AAT GTG CTA CAA TCTCG AAT GTG CTA CAA TC--3’3’

5’5’--TAG AGA CAT TGA ATA TGC CTAG AGA CAT TGA ATA TGC C--3’3’

RESULTATSRESULTATS

11 souches11 souches déclarées VRE à l’antibiogrammedéclarées VRE à l’antibiogramme

GENESGENESVanVan A = 0/11A = 0/11VanVan B = 0/11B = 0/11

VanVan D = 0/11D = 0/11

ESPECESESPECESE. faecalisE. faecalis = 10/11,= 10/11, E. faeciumE. faecium = 0/11= 0/11

DISCUSSIONDISCUSSION

LL’’analyse des produits danalyse des produits d’’amplification namplification n’’aa

permis de dpermis de déétecter tecter aucun des gaucun des gèènesnes

E.E. faecalisfaecalis ontont ééttéé confirmconfirmééeses..

Les gènesLes gènes VanVan G et E n’ont pas étéG et E n’ont pas été

recherchésrecherchés

Cas des techniques

PCR en temps réel

Maladies virales



ConclusionsConclusionsL’utilisation en routine des marqueurs moléculaires est d’ungrand intérêt en région tropicale où sévissent de nombreusesmaladies infectieuses causées par les micro-organismes :

Diagnostic de virulence (PCR multiplex)

Recherche de réservoir environnemental

Acquisition de nouvelles propriétés

Contribution à la traçabilité microbiologique dans les écosystèm

Compréhension de la virulence bactérienne dans les écosystèm

Documents

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