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Modèles précliniques de pharmacologie anti-tumorale. Radio-sensibilisants / radioprotecteurs
S. Rivera, E. Deutsch
Département de radiothérapie DU TORINO 1404/2016
Historique et définitions (1)
1895: Découverte des rayons X (Roentgen)
1906: Premières observations (Bergonié et
Tribondeau; Claudius Regaud)
Radiobiologie descriptive:
Premières notions de radiosensibilité
-Grande activité mitotique= Cellules plus radiosensibles
-Radiosensibilité de certaines cellules (spermatogonies)
Historique et définitions (2)
1956: Courbes de survie in vitro (Puck et
Markus)
1959:Courbes de survie in vivo (Hewitt)
1981: Radiosensibilité intrinsèque (Fertil et
Malaise): lien entre radiocurabilité des
tumeurs humaines et radiosensibilité
Radiobiologie quantitative:
RADIOSENSIBILITE INTRINSEQUE
-Probabilité de mort cellulaire par unité de temps
Historique et définitions (3)
1980: Techniques de détection des lésions de l’ADN
(Elution sur filtre, électrophorèse en champs pulsé)
1990: Protéines de réparation de l’ADN
2000: Leur organisation (complexes
multiprotéiques), leurs mutations (syndromes
d’hyperradiosensibilité), les facteurs extrinsèques
Bases moléculaires de la radiosensibilité
RADIOSENSIBILITE: Probabilité de perte de la
capacité proliférative par unité de dose
Echelle de temps en radiobiologie
10-18 S
10-12 S
10-6 S
100 S
106 S
Réactions physiques: Ionisations-Excitations: microdépôts d’énergie
Réactions chimiques: Radicaux libres: lésions de l’ADN
Réactions biochimiques et biologiques: détection/signalisation
Réactions biologiques tissulaires: Aigues/tardives
Echelle de dose en radiobiologie
Dose nécessaire pour induire 50% de létalité chez un fibroblaste humain:
Cytoplasme:
200-500Gy
Noyau:
1-3Gy
Importance de l’ADN pour la létalité
Irradiation ultra focalisée
par source émettrice
alpha
L’ADN est la cible!!!
Dommages radio induits sur
l’ADN et principaux systèmes
de réparation
Dommages sur l’ADN induits par les
rayonnements ionisants
Radiation
ionisante
eaq-
O
H H
OH°
O2-
Effets directs (60%):
Excitation/ionisation
Effets indirects (40%):
Radicaux libres par
radiolyse de l’eau
Incidence des lésions et demi-vie de
réparation
IRRADIATION:
1 Gy
10 000 Bases
endommagées
1000 Cassures
simple-brin
40 Cassures
double-brin
5-10 min 10-15 min >50 min
Temps nécessaire à la réparation de 50% des lésions
Joubert A, Foray N Cancer/Radiother 11 (2007) 129-142
Réponses aux radiations ionisantes
La mort cellulaire en radiobiologie
= Perte de la capacité de division et non disparition physique de la cellule!!!
Une cellule morte peut métaboliser
La létalité ↗ avec la dose mais la cinétique de réparation est constante
La mort cellulaire en radiobiologie
La mort cellulaire par apoptose
La mort cellulaire par autophagie
La mort cellulaire par catastrophe
mitotique
La mort cellulaire par nécrose
La mort cellulaire par sénescence
Principaux dommages et systèmes
de réparation après irradiation
Qualité de la
réparation Fidèle Fidèle
Peu
fidèle Fidèle
Réparation des dommages
radioinduits de l’ADN
PARP
Signalisation des cassures double-
brin radio-induites (CDB)
Réparation des cassures double-brin:
Recombinaison homologue (HR)
Reconnaissance
Façonnage
Recherche
d’homologie
Invasion et
échange de brins
Synthèse
Ligature (Ligase1)
DBS= cassure
double-brin
ADN homologue
Recombinaison
homologue entre
les 2 ADN
Réparation fidèle
Réparation des cassures double-brin: Jonction des terminaisons non homologues
DBS= cassure double-brin
(NHEJ)
Reconnaissance
Recrutement
Façonnage
Alignement
Ligature (LigaseIV)
H2AX
Réparation non fidèle
Artemis
Cernunnos
Réparation des cassures simple-brin:
Reconnaissance
Recrutement
Façonnage
Alignement
Synthèse
Ligature
3’
5’
5’
3’
SSB SSB= « single strand
brake » : cassure
simple brin
PARP1
Complèxes
multiprotéiques
XRCC1, ligase 3
ADN polymérase:
Polß
ADN Ligase 3
Réparation fidèle
Réparation des dommages de base:
réparation par excision de base (BER)
Reconnaissance
Excision
Façonnage
Synthèse
Ligature Réparation fidèle
Réparation par excision de nucléotide
Adduits et ponts intra-brin (NER)
Reconnaissance
Recrutement
Séparation des brins
Incision et excision
de la lésion
Synthèse (Pol ɗ/Ɛ)
Ligature (Ligase1) Réparation fidèle
Réparation « standard »
via XPC/hHR23B
Réparation d’urgence:
Réparation couplée à la
transcription
via RNAPol II/CS-B
Ciseaux moléculaires:
ERCC1/XPF, XPG
Réparation des mésappariements
Conséquences des dommages
radio induits
Multiples facteurs de transcription
induits par l’irradiation
P53 au centre de la réponse aux
dommages radio-induits
P53 au centre de la réponse aux
dommages radio-induits
Dommages radio induits autres
que sur l’ADN
L’irradiation du cytoplasme induit
des mutations
L’effet By Stander
L’effet By Stander
Quelle(s) cible(s)?
La cible: l ’ADN
La cible: membrane/cytoplasme
Bystander effect
Paramètres influençant la
radiosensibilité tumorale
Paramètres influençant la
radiosensibilité tumorale
Paramètres influençant la
radiosensibilité tumorale
Paramètres influençant la
radiosensibilité tumorale
Paramètres influençant la
radiosensibilité tumorale
Paramètres influençant la
radiosensibilité tumorale
Paramètres influençant la
radiosensibilité tumorale
Outils de détection des
dommages radio induits sur
l’ADN et de leurs
conséquences
Détection indirecte des CDB:
marquage immunofluorescent de H2AX
Induction et réparation des CDB
visualisées par IF de foyers H2AX
Détection des cassures d’ADN:
Test des comètes
Electrophorèse sur
des noyaux de
cellules isolées
Test des comètes:
Electrophorèse sur des noyaux de cellules isolées
Analyse du profil d’expression des
gènes après irradiation: Puce à ADN
Analyse du profil d’expression de
gènes : Puce à ADN
Présentation des résultats d’une
puce à ADN
Surexprimé
Médiane
Sous exprimé
Modèles d’étude de
radiosensibilité:
-in vitro
-in vivo
Modèles in vitro Mesure de la
fraction survivante
Modèles in vitro Mesure de la
fraction survivante
Modèles in vitro Courbes de survie:
test des colonies
Modèles in vitro Courbes de survie:
test des colonies
Modèles in vitro Courbes de survie:
test des colonies
Modèles in vitro Courbes de survie:
test des colonies
Fra
ction s
urv
ivante
Dose en Gy
Modèle linéaire quadratique
( FertilB et Malaise EP,J
RadiatOncolBiolPhys1981;7:621-629)
Dose en Gy
No
mb
re d
e c
ellu
les s
urv
iva
nte
s
Modèle linéaire quadratique
Modèle linéaire quadratique
Fraction survivante à 2Gy:
radiosensibilité intrinsèque
Tissus à renouvellement rapide
Tissus à renouvellement lent
Facteurs influençant la survie
clonogénique
Facteurs influençant la survie
clonogénique
Modèles in vitro: concept de cellule
souche cancéreuse
Modèles in vitro: concept de cellule
souche cancéreuse
Modèles in vitro: concept de cellule
souche cancéreuse
Modèles in vitro: concept de cellule
souche cancéreuse
Modèles in vitro: concept de cellule
souche cancéreuse
Modèles in vitro: concept de cellule
souche cancéreuse
Modèles in vitro: concept de cellule
souche cancéreuse
Modèles in vitro: concept de cellule
souche cancéreuse
Modèles in vivo: Xénogreffes
Retard de croissance
tumorale
TCD50: Evaluation de la
dose permettant 50% de
contrôle tumoral
Vo
lum
e t
uom
ora
l
Possibilité d’évaluation de la radiosensibilité extrinsèque
Modèles in vivo: Xénogreffes
Modèles in vivo: Xénogreffes
INDEX THERAPEUTIQUE
Modèles in vivo: greffes
orthotopiques
Implantation de la tumeur dans un
environnement plus relevant
Modèle d’invasion métastatique
pulmonaire
Modèles orthotopiques: tumor in the right place!
Mordant et al, PLoS One 2011
Injection of HPV16 E6/7 expressing cells in
syngenic immunocompetent mice
TC1/Luc cells primary epithelial cells of
C57BL/6 mice cotransformed with
HPV16 E6 and E7 and c-Ha.ras
oncogenes (J.C. Wu, Johns Hopkins University )
IVIS
imaging
5000 25000 50000 cells
Isogenic grafting of
TC1/Luc cells in the oral
mucose of
immunocompetent mice
Injection of
Luciferase+
cells in the oral
mucosa
Day 0 Day 3
Randomization Treatment start
Day 4
Ctl/ Local IR +/-
treatment with drug
X/ drug X
82
Follow-up with IVIS
Percutaneous
injection of
Luciferase+
cells in mice
lung through
pleura
Day 0 Day 3
Randomization after
graft evaluation by
IVIS
Treatment start
Day 4
Ctl/ Local IR +/-
treatment with drug
X/ drug X
Orthotopic lung tumor model
Follow up of Orthotopic lung grafts
84
• Mice weight
• IVIS
• histopathological assessment after sacrifice of mice
Mordant et al, PLoS One 2011
MicroPET/ CTscan imaging
Various PET tracers available
Development of imaging tools
For lung toxicity
M Mangoni, Uni Firenze
Novel preclinical models? Toxicities
Lind, Senan, Smit, JCO 2011 Mangoni et al Rad Oncol
HES staining: cardiac surface measurement
Control 16Gy (30weeks)
Radiation is inducing
Cardiac remodeling and hypertrophy
Mesurable signs of cardiac
hypertrophy
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
control 16Gy 17Gy
A.U.
2X
Control 16Gy
Oral mucosa toxicity assessment model
Ex: antiVEGF +IR
Mangoni et al, BJC 2012
Oral mucosa toxicity assessment model
Mucositis: increased edema and inflammatory cells
infiltration
Mangoni et al, BJC 2012
Modulation de la radiosensibilité
What can we optimize ?
The beam
Better targeting
Biomodulation
Better prediction
Modulation de la radiosensibilité par
l’association aux drogues
Associations radiochimiothérapie
Associations radiothérapie et
thérapies ciblées
« Intrinsic »
radiation response Anti EGFr, mTOR, PI3K.. COX-2,
Proteasome inhibitors, TNFr inducers
« extrinsic »
micro environment Anti VEGFr, FGFr
More than 60 new agents tested in phase I
or II trials
*Source : www.clinicaltrials.gov
Targeted agents + XRT : facts
>50 oncology drugs registrations since 2000
To date only 2 drugs :
C225 & Temodar recently registered combined to radiotherapy
>60 agents
in phase I/II
combined to XRT*
*source : clinicaltrials.gov
Optimal tumor profile
Appropriate trial design
Proof of concept
Differential effect
bottleneck
hundreds
preclinical
« drug + radiotherapy »
hits on pubmed
Pourquoi moduler biologiquement la réponse tumorale à
l’irradiation?
Cured Cancer
~ 49% by surgery
~ 40% by radiotherapy
~ 11% by chemotherapy
SBU. The Swedish council on technology assessment in health care:
radiotherapy for cancer. Volume 1. Acta Oncol 1996;35.
Seulement 30 phase I impliquant la radiothérapie
publiées par an pour presque 400 Phase I de
cancérologie sans radiothérapie.
Glass C et al. Int. J Radiat Oncol 2010: 78 (3)
Sponsorship par phase des essais
thérapeutiques
• Majoritairement en Phase I et II, seulement 36 en Phase III
Soutien pharmaceutique 33%, et seulement 16% des Phase III
Types de tumeurs pour lesquels des drogues
sont en development avec la radiothérapie
HN: 26%, 14 Phase III studies
Distribution des Phase I and II dans le temps
Exemple 1: traget driven lethality - EGFR
108
Exemple 1: traget driven lethality - EGFR
109
C225 & irradiation :
transfert from bench to clinic
Toxicities of new agents
Budach W, New England Journal of Medicine, 2007
Anti EGFr + Radiotherapy :
One (unusual) case of grade IV skin necrosis
The usefulness of functionnal imaging :
the example of tyrapazamine
Bioreductive agent when hypoxic
Radiosensitizer
Randomized phase III
RT + CDDP
RT + CDDP + Tyrapazamine
Overall results : 2 arms similar!!
Tirapazamine : Hypoxia PET to select the patients?
Rischin, JCO 2006
Antivascular agents :
a way to increase RT efficacy?
Wilett, Nature Medicine 05
Immunité et radiosensibilité
Cellule dendritique
Abscopal effect has become clinical reality
Ipilimumab and radiotherapy :
Radiation necrosis of the brain (3 cases)
Melanoma
metastasis
in the right
frontal lobe
SBRT :
20Gy
1 year later 2 years later :
increase in size
and surrounding oedema
Post Surgery
Necrosis
& gliosis
Du Four et al. / European Journal of Cancer 48 (2012)
Ipilimumab started 3
months later
Looking toward the future..
Prédiction moléculaire de la radiosensibilité
Personalised medicine :
Challenges rely on tumor response
probability
Optimise radiotherapy
Decrease late effects
Radiation sensitizer
Poor prognosis :
Tumor « response » profile :
Toward molecular profiling?
Preoperative Radiotherapy
in rectal cancer
responders
non responders
Watanade Can Res 2006
Fractionnation
Radiation sensitizers (EGFr…)
High Tech RT,
IGRT
Drugs adapted
to
Molecular
pathology
Increasing the antitumor
efficacy of
radiotherapy
will require…
..integration of all aspects of
radiation biology
Conclusions
Radiosensitization..
DNA damage
modification
Apoptosis
induction
Increase in PA02
Nucleotide
depletion
Inhibition
of DNA repair
Cell cycle
redistribution
Classical view : radiosensitization….
