Plate-forme de Recherche Clinique en CYTOMIQUE

Biomarqueurs cellulaires innovants CPER 2007-2013: Innovations thérapeutiques et

Technologies de la Santé (ITTS-CIC-B)

Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires du CHUN (Pr F Plenat) dédié à la recherche clinique et translationnelle Mutualisation des compétences Complémentarités humaines et technologiques Ouverture régionale et interrégionale

Ensemble type « Flow cytometry core facility » Cytométrie en flux multiparamétrique Cell Search Veridex Image Stream System (Amnis)

Une démarche commencée en 2005!

Cytométrie de flux multiparamétrique

Navios (Beckman Coulter) Software Kaluza

CMF 3 lasers 10 couleurs <… 5 Laboratoire d’Immunologie (Pr GC FAURE, Pr MC BENE,

Dr M de CARVALHO) Service d’Hématologie biologique (Pr T LECOMPTE, Dr V

LATGER) Unité de thérapie cellulaire et tissulaire (Pr JF STOLTZ, Pr

A DALLOUL) Anatomopathologie (Pr F PLENAT, Dr K MONTAGNE)

CancéropoleCytométrie de flux multiparamétriqueEvénements rares et populations discrètes… après « single platform » et

Onco-Hématologie NoE European Leukemia Net STIC DHOS Maladie résiduelle (LAL, LAM) Maladie Résiduelle LLC Myélodysplasies Projet INCA SIGLAM Phase périphérique des LMNH

Réponse immunitaire anti-tumorale et thérapie cellulaire Tregs, cellules dendritiques, cellules NK Production cytokiniques spécifiques d’Ag

Microparticules et cellules endothéliales

Cytométrie de flux multiparamétrique (2)MC Béné, au nom du GEIL, GTLLF, GOELAMSMoelle normaleMaladie résiduelle

valorisation démarche détection et quantification d’événements rares au sein des « bermudes »

CD34 CD45

CD13 SSC

Publications récentes Four- and five-color flow cytometry analysis of

leukocyte differentiation pathways in normal bone marrow: a reference document based on a systematic approach by the GTLLF and GEIL.

Arnoulet C, Béné MC, Durrieu F, Feuillard J, Fossat C, Husson B, Jouault H, Maynadié M, Lacombe F.

Cytometry B Clin Cytom. 2010 Jan;78(1):4-10. How and why minimal residual disease studies are

necessary in leukemia: a review from WP10 and WP12 of the European LeukaemiaNet.

Béné MC, Kaeda JS. Haematologica. 2009 Aug;94(8):1135-50.

ELN http://www.leukemia-net.org/content/diagnostics/diagnostics/morphology

Consensual Documents provided by WP10 Created by: M.C. Béné , generated 2008/01/12 ,

last changed: 2008/04/22 …. useful for the immunophenotypic

diagnosis of leukemias by flow cytometry. Flow cytometry atlas

Created by: F Lacombe, C Arnoulet, F Durrieu, J Feuillard, C Fossat, B Husson, H Jouault, M Maynadié, MC Béné , generated 2008/07/12 , last changed: 2009/01/04

Cytométrie de flux multparamétrique (2) Réponse immunitaire anti-

tumorale spécifique (M de Carvalho, P Eschwege + …) Antigènes candidats (cancer

prostate) Problématique: événements rares

+ caractérisation multiparamétrique phénotypique et fonctionnelle de sous populations cellulaires

Signatures cytokiniques Transfert de l’expérience

acquise dans la réponse spécifique anti-mycobacterium tuberculosis et anti-adenovirus

Cytométrie de flux multiparamétrique (3) Microparticules, thrombose et cancer (V Latger-

Cannard, Th Lecompte)

Standardization of platelet-derived microparticle counting using calibrated beads and a Cytomics FC500 routine flow cytometer: a first step towards multicenter studies? Robert S, Poncelet P, Lacroix R, Arnaud L,

Giraudo L, Hauchard A, Sampol J, Dignat-George F.

J Thromb Haemost. 2009 Jan;7(1):190-7. Epub 2008 Oct 18.

Projets en cours Hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN)

(V Latger, MC Béné) Déficit en molécules GPI-linked

Lymphocytoses B (JF Lesesve, MCB) SIGLAM (MCB - INCA)

Activation intracellulaire

Septiflux recherche translationelle Inserm (J Feuillard Limoges, S Gibot et Immuno

Nancy) Marqueurs lymphoïdes et monocytaires

Cell Search Veridex® Combinaison de méthodes

Immunologiques spécifiques Séparation immunomagnétique Quantification en imagerie photonique automatisée

Standardisation et automatisation de la phase préparative

Très grande sensibilité (5 évts/tube de 7,5mL) soit #10-7 outil de choix pour l'étude des cellules

endothéliales circulantes en recherche clinique.

Validation antérieure en recherche clinique pour les cellules tumorales circulantes pour des études pronostiques.

Capacités d’isolement des cellules en vue d’études moléculaires complémentaires

Projets Cell Search Cancéropole et au-delà…

Cellules Tumorales Circulantes (CTCs) Sein (CIC Cancérologie CHU-CLCC E Luporsi –

GSK/NOVARTIS – INCA?) Poumon

AO Cancer 2009 Région Lorraine, Nancy Y Martinet, JM Vignaud comparaison ISET STIC Nice, Strasbourg P Oudet, M Beau-Faller

Prostate (Nancy Urologie: J Hubert, P Eschwege; Paris: S Loric LIBM) Validation clinique en réseau interrégional, national, voire

européen (IMI?) Cellules Endothéliales Circulantes (CECs)

Thérapies antiangiogéniques Inflammations: sepsis (CPRC S Gibot) Neuroectodermoses: Sclérose tubéreuse de Bourneville (J

Hubert, Necker)

Résultats littérature Stratification Baseline levels

predicts outcome Changes predicts

survival

Cell search CTCs (1) CERONC – Poumon (Y Martinet, E Quoix,

M Beau-Faller, P Oudet) Evaluation de l’intérêt clinique de la

détection des cellules tumorales circulantes dans le cancer bronchique métastatique

Avec ajout de marqueurs d’intérêt (EGFR, X) Isolement des cellules en vue d’études

moléculaires CERONC – Prostate (P Eschwege, J

Hubert, D Peiffert) Evaluation préthérapeutique

Autres projets CTCs Cancer Poumon

Projet CIRCUBRON C Clement Duchene

Cancer ORL Collaboration CAV: G Dolivet, R

Mastronicola Dilution limite

B Faivre: Thrombose, Hémostase et Cancer ORL

Cell Search CECs (2) Projet Sepsis

CPRC CHU Nancy (Pr S Gibot, GCF) Quantification des CEC Isolement des CECs pour études

moléculaires Projet STB (Sclérose Tubéreuse de Bourneville)

Evaluation des CECs comme biomarqueurs d’angiogénèse pour l’évaluation et le suivi des tumeurs vasculaires rénales

Demande en cours ASTB, PHRC maladies rares (GCF, Pr J Hubert, Necker – D Joly, Lyon – O Rouvière)

Sepsis…. STB Résultats

préliminaires Collaboration

Bordeaux

Sepsis (CPRC) C3, B2 Suivi séquentiel

Autres projets CECs Hémangiomes (propranolol-6)

Maladie Rendu-Osler

Vascularites (10)

Suites infarctus (<20) Anévrysmes aortiques?

Eclampsie (2)

Thérapeutiques anti-angiogéniques (12)

Imagerie en fluxImage stream X AMNIS®

Le système AMNIS®, système d’imagerie en flux combinant cytométrie en flux et imagerie photonique

Observation directe, de la localisation précise, cellule par cellule, des marqueurs fluorescents utilisés pour identifier: membrane, organites intracellulaires, noyau.

Parmi les applications réalisables en simultané Marquages membranaires multiples et colocalisation de

marqueurs de surface Marquages nucléaires (FISH en suspension) Translocation nucléaire, Apoptose Etudes fonctionnelles Coopérations cellulaires (synapse immunologique)

Image stream X AMNISApplications…. etc

Biologie cellulaire – Immunologie

Cancérologie

Cycle Cellulaire

Signalisation Cellulaire Analyse Morphologique

Mort cellulaire

Dommage de l’ADN

Interactions cellulaires

Spectral decomposition

element

detector

laserbrightfield illuminator

cells in flowvelocity detector

autofocus

Frame.movtdiSynchCW2.mov

Spectral decomposition

element

detector

laserbrightfield illuminator

cells in flow velocity

detectorautofocus

ImageStream Layout

Untreated MCP-1 60.99.5MCP-1Untreated

Shape Change, Primary Monocytes

Circularity = average radius divided by radial varianceMCP-1 causes a ‘loss in circularity’ in the majority of the monocytes

R3

MONOMONOMONO

T CELLT CELLT CELL

MONOMONOMONO

T CELLT CELLT CELL

1e50 1e4-1e3 1e3 1e6

Intensity_A-750 CD3

1e5

1e6

1e4

-1e3

0

1e3

Inte

nsity

_PE

CD

14

9_BF 6_SSC 7_DAPI 2_FITC NFkB 3_PE CD14 4_PETR CD45 11_AF647 CD16 12_A750 CD3

325

718

969

1246

9_BF 6_SSC 7_DAPI 2_FITC NFkB 3_PE CD14 4_PETR CD45 11_AF647 CD16 12_A750 CD3

316

943

1142

3592

Monocytes

T cells

NF-kB translocation in whole blood subsets

Incubate PBMC with CpGB

Label pDC with BDCA PE, CD71 or CD107a FITC

Quantify: Internalization and colocalization of CpGB to endosomes and lysomes

Internalization / trafficking in primary cells

Collect 20,000 event image files on the ImageStream

Chongwei CuiDr. Pat Fitzgerald-BocarslyUMDNJ

T cell / APC interactions

Identification of molecular recruitment to the immune synapse. Dr. Brandon Burbach

University of Minnesota

%ADAP in Synapse0 20 40 60 80 100

0

.2

.4

.6

.8

1

1.2

R5

%ADAP in Synapse

Asp

ect R

atio

Inte

nsity

_AD

AP

OVA

%ADAP in Synapse0 20 40 60 80 100

0

.2

.4

.6

.8

1

1.2

R5

%ADAP in Synapse

Asp

ect R

atio

Inte

nsity

_AD

AP

UNTX

17.6

1.3

ImageStream: Standard

Imaging

Cells exhibit common artifacts

associated with defocus making

spot counting difficult

Jurkat cells probed with ChrX (Spectrum Green) and Chr8 (Spectrum Orange)

ImageStream: Extended

Depth of Field Imaging

Same sample (different cells) with

WFC element. FISH spots

maintain size independent of focal

position within nucleus

EDF – FISH analysis

Cell Cycle / Mitosis / Apoptosis

ProphaseMetaphase Anaphase TelophaseInterphase Atypical

• HL60 cells were labeled with anti-HLA AF488 and DRAQ5• DNA condensation pattern and Brightfield contrast help distinguish the phases of mitosis from apoptotic and interphase nucleiIntensity_DRAQ5

0 1e4 2e4 3e4 4e4 5e4 6e4

0

1

2

3

4

G0/1

G2/M

Sub-G0

Intensity_DRAQ5

Nor

mal

ized

Fre

quen

cy %

DNA Content

CV= 4.0

Apoptotic

Plate-forme de recherche clinique en CYTOMIQUE

Biomarqueurs cellulaires innovants CPER: Innovations thérapeutiques et Technologies de

la Santé (ITTS-CIC-B) Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires

du CHUN (REDIF: Pr Th Lecompte; CIC-B Pr GC Faure) dédié à la recherche clinique

Ensemble type « Flow cytometry core facility » Cytométrie en flux multiparamétrique Cell Search Veridex Image Stream System (Amnis)