PCR Toxoplasma et Pneumocystis : infection ou colonisation ?

Jean Menotti Laboratoire de Parasitologie-Mycologie Hôpital Saint-Louis / Université Paris-Diderot jean.menotti@sls.aphp.fr

Diagnostic de la toxoplasmose chez le patient immunodéprimé

•  Attitude pragmatique :

–  imagerie +++

–  sérologie positive

–  épreuve thérapeutique

•  Mise en évidence directe du parasite difficile :

–  examen direct peu sensible

–  inoculation à l’animal ou culture cellulaire : délai trop long

⇒ diagnostic par PCR +++

IRM cérébrale

Toxoplasmes dans un LBA

Diagnosis of toxoplasmosis by PCR

 PCR assays on B1 gene, P30 gene, rRNA gene…  conventional PCR  real-time PCR

 PCR assays on a genomic 300-fold repetitive 529 bp DNA fragment

Burg et al., 1989; Franzen et al., 1997; Lamoril et al., 1996; Robert-Gangneux et al., 1999; MacPherson et al., 1993; Ostergaard et al., 1993

Costa et al., 2000; Lin et al., 2000; Kupferschmidt et al., 2001 ; Joss et al., 2008

Homan et al., 2000; Reischl et al., 2003; Cassaing et al., 2006 ; Fekkar et al., 2008

Development and evaluation of a 5’-nuclease real-time PCR assay for quantitative detection of Toxoplasma gondii DNA

Aim:

  To develop a new 5’-nuclease real-time PCR assay that targets the 200- to 300-fold repetitive AF146527 gene

  To assess its performances for diagnosis and treatment follow-up of toxoplasmosis

Real-time PCR for the quantitation of Toxoplasma gondii DNA: primers and probe design

T. gondii AF146527 gene (529 bp)

398 483

TaqMan probe (432-457)

TG-F primer

TG-R primer

Standard curve

Retrospective analysis

  Clinical specimens: 144 clinical specimens previously analyzed for the presence of T. gondii DNA by a PCR-ELISA assay that targets the B1 gene of T. gondii (Robert-Gangneux et al., 1999)

  DNA extraction from blood, blood buffy coats, sera, cerebrospinal fluid, BAL fluid, aqueous humor, biopsies or placenta by using QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)

Retrospective analysis: results

PCR-ELISA on B1 gene

positive negative

Real-time PCR on AF146527 gene

positive 72 15 87

negative 0 57 57

72 72 144

Observation

  Patient de 43 ans présentant une leucémie myéloïde chronique (sérologie T. gondii positive)

  greffe de moelle allogénique (sang de cordon séronégatif pour T. gondii)

  à J40, 41 et 42 : fièvre, céphalées, photophobie   TDM cérébrale : plusieurs lésions hypodenses mais

sans halo périlésionnel   Traitement par sulfadiazine (6 g/j) + pyriméthamine (75

mg/j)   Apyrexie 48 h après initiation du traitement   Amélioration progressive des images radiologiques sous

traitement

Menotti et al., JCM 2003

Quantitation of T. gondii DNA by real-time PCR assay targeting AF146527 gene

Whole blood

0 25 50 75 100 125 0.1

1

10

100

1000

10000

Days

No.

of t

achy

zoite

s/m

l Initiation of treatment by pyrimethamine + sulfadiazine

Comparison between real-time PCR assays using 2 different targets

Whole blood

0 25 50 75 100 12520

25

30

35

40

45B1 geneAF146527

Days

Ct Mean gain of

7.7 cycles

Prospective analysis

  203 clinical specimens: all clinical specimens received at Saint-Louis Hospital during a 4-month period.

  Each specimen was tested both by:   the new real-time PCR assay   the PCR-ELISA assay that targets the B1 gene of T. gondii

(Robert-Gangneux et al., 1999)

Prospective analysis: results Patient Clinical background Specimen Date PCR-ELISA Real-time PCR

(No. of tachyzoites/ml) P1 HIV infection CSF Oct. 11th + 3600 P2 HIV infection CSF Oct. 15th + 71 P3 HIV infection CSF Nov. 22nd + 67 P4 HIV infection Whole blood Dec. 4th + 7.9

Whole blood Dec. 6th + 180

BAL fluid Dec. 11th + 6200

Whole blood Dec. 13th + 3900

Buffy coat Dec. 13th + 360

Bone marrow Dec. 13th + 16000

P5 HIV infection Serum Dec. 21st - 3.3 P6 Toxoplasmic

seroconversion during pregnancy

Placenta Dec. 23rd - 140

P7-P61 Various Various Various - Undetectable Menotti et al., CMI 2010

Conclusions

  Très bonnes sensibilité et spécificité de la technique de PCR en temps réel amplifiant le gène AF146527

  Confirmation de l’intérêt d’utiliser ce gène hautement répété pour améliorer le diagnostic de la toxoplasmose

  Intérêt majeur de la PCR en temps réel pour le suivi thérapeutique

  Diagnostic plus précoce, parfois avant l’apparition des signes cliniques

Classification des toxoplasmoses survenant après allogreffe de moelle

Martino et al. for the European Group for Blood and Marrow Transplantation Infectious Diseases Working Party

  Etude prospective de 106 patients allogreffés de moelle osseuse pour l’incidence de la réactivation toxoplasmique dans les 6 premiers mois après la greffe :   Incidence de la toxoplasmose-infection : 16% (IC95 : 8-21%)   Incidence de la toxoplasmose-maladie : 6% (IC95 : 1-10%)   Chez la plupart des patients, le début de la maladie ou du

traitement de l’infection était précédé par une augmentation des charges parasitaires sanguines

  Conclusions :   Incidence élevée de la toxoplasmose après HSCT allogénique   PCR = outil approprié pour décider d’un traitement préemptif

chez des patients à haut risque de toxoplasmose

Martino et al, CID 2005

Genre Pneumocystis

  Micromycètes atypiques (classe des Ascomycètes)

  Etroite spécificité d’hôte :   P. jirovecii : homme   P. carinii et P. wakefieldiae : rat   P. murina : souris   P. oryctolagi : lapin

  Liaison spécifique aux pneumocytes de type I

  Prolifération dans les alvéoles pulmonaires → pneumonie à Pneumocystis (PCP) chez les sujets immunodéprimés

Pneumonie à Pneumocystis (PCP) Triade classique d’apparition progressive de : - fièvre - toux sèche - dyspnée d’intensité croissante

Thomas et Limper, 2004

Imagerie : pneumopathie interstitielle (absence dans 10-15% des cas) Scanner : verre dépoli irrégulier Hypoxie ++

Populations à risque : - Infection VIH - Hémopathies malignes - Greffe de moelle osseuse - Transplantation d’organes solides

- Cancers solides - Maladies inflammatoires et auto- immunes - Traitements immunosuppresseurs - Nourrissons prématurés ou atteints de déficits immunitaires

VIH + VIH - Début insidieux brutal Fièvre + +

Toux sèche + + Dyspnée +/- + Evolution lente rapide Mortalité 10 à 20 % 30 à 60 %

22

  Prélèvements: LBA, expectoration induite, biopsie

  Examen à frais   Amas spumeux

  Colorations   Formes trophiques (MGG, RAL)   Kystes (Gomori Grocott, Bleu toluidine)

  Immunofluorescence   Directe   Indirecte

AA

B

C Source des photos CD-ROM ANOFEL 3

Diagnostic microscopique

PCR classique Nested PCR Wakefield et al., 1990 Wakefield et al., 1996 ARNr ARNr

PCR en temps réel 21 références depuis 2001 ARNr, MSG, DHPS, DHFR, HSP70

- plus rapide - moins de manipulation

- quantification (PCP / colonisation)

Larsen et al., 2002 Flori et al., 2004 Bandt et al, 2007 Huggett et al., 2008 Alanio et al., 2011

Question: interprétation d’une PCR positive ? - Infection ?

- Pneumocystose ?

- Portage ?

Diagnostic moléculaire

Très bonne VPN de la PCR Pneumocystis (Azoulay et al., 2009)

Risque de contaminations +++

PCR quantitative sur LBA et expectorations induites

Alanio et al., CMI 2011

Diagnostic moléculaire

•  Charge supérieure chez patients VIH+ par rapport à VIH-

•  Discrimination possible entre portage et PCP, en utilisant 2 valeurs de cut-off

PCR quantitative sur LBA et expectorations induites

Alanio et al., CMI 2011

Diagnostic moléculaire

•  Charge supérieure chez patients VIH+ par rapport à VIH-

•  Discrimination possible entre portage et PCP, en utilisant 2 valeurs de cut-off

Eur Respir J 2012

Conclusions   Test sensible pour la détection d’ADN de P. jirovecii

  Nouvel outil pour discriminer PCP et colonisation :   Charge fongique élevée ⇒ PCP   Charge fongique intermédiaire ⇒ PCP ou colonisation   Charge fongique faible ⇒ colonisation (sous réserve de la

qualité du prélèvement)

Concept de colonisation

  Détection de Pneumocystis ou de son ADN chez un hôte qui ne présente pas de signe de pneumonie

  Mise en évidence grâce au développement des méthodes moléculaires de détection (PCR, PCR en temps réel)

Populations colonisées Population Colonisation Facteurs de risque Références

Enfants immunocompétents (primo-infection)

16 à 32% Vargas 2001 ; Nevez 2001 ; Totet 2003 ; Larsen 2007

Patients infectés par le VIH

10 à 68% (nPCR) CD4 < 400 (p=0,03) Tabagisme (p=0,02) Résidence (p=0,002)

Leigh 1993 ; Nevez 2001 ; Matos 2001 ; Wakefield 2003 ; Morris 2004 ; Davis 2008 ; Alanio 2011

Immunodépression hors VIH

11 à 60% Transplantation CD4 < 400 (p<0,001) Corticoïdes (p<0,001) Grossesse (p=0,04)

Nevez 1999 ; Helweg-Larsen 2002 ; Maskell 2003 ; Vargas 2003 ; Mori 2009 ; Alanio 2011

Pathologie pulmonaire sous-jacente

Mucoviscidose : 1,3-22% BPCO : 16-55%

Sévérité BPCO Cancer petites cellules Tabagisme (p=0,02)

Sing 1999 ; Probst 2000 ; Sing 2001 ; Helweg-Larsen 2002 ; Matos 2003 ; Calderon 2004 ; Morris 2004 ; de la Horra 2004 ; Respaldiza 2005 ; Nevez 2006 ; Vidal 2006 ; Calderon 2007 ; Le Gal 2010

Personnels hospitaliers 8 à 37% Contact avec patients ayant une PCP

Vargas 2000 ; Miller 2001 ; Durand-Joly 2003 ; Medrano 2005

  Conséquences cliniques et physiopathologiques   Risque évolutif d’une colonisation en PCP: mal évalué   Simple marqueur du processus pathogène sous-jacent ?   Pathogénicité de la colonisation ?

Persistent pneumocystis colonization leads to the development of chronic obstructive pulmonary disease in a nonhuman primate model of AIDS. Shipley TW, Kling HM, Morris A, Patil S, Kristoff J, Guyach SE, Murphy JE, Shao X, Sciurba FC, Rogers RM, Richards T, Thompson P, Montelaro RC, Coxson HO, Hogg JC, Norris KA. J Infect Dis. 2010 Jul 15;202(2):302-12

Airway obstruction is increased in pneumocystis-colonized human immunodeficiency virus-infected outpatients. Morris A, Alexander T, Radhi S, Lucht L, Sciurba FC, Kolls JK, Srivastava R, Steele C, Norris KA. J Clin Microbiol. 2009 Nov;47(11):3773-6.

Colonisation : conséquences

  Conséquences cliniques et physiopathologiques   Risque évolutif d’une colonisation en PCP: mal évalué   Simple marqueur du processus pathogène sous-jacent ?   Pathogénicité de la colonisation ?

  Prise en charge des patients colonisés   Faut-il traiter ?

  Bénéfice collectif: diminution du réservoir   Bénéfice individuel: ?

  Conséquences environnementales et épidémiologiques –  Colonisés = réservoir de Pneumocystis ? –  Isolement des patients colonisés vis-à-vis des patients

immunodéprimés ? –  Évaluation du risque d’aérotransmission Connaissance des conditions de transmission/infection

Colonisation : conséquences

Voies de transmission