LES METHODES D’ETUDE DES COMPOSES PHENOLIQUES

Présenté par

Aitfella radhia

2009-2010

Plan du travailIntroduction

1. Définition

3. Méthodes d’étude des composés phénoliques

2. Classification des composés phénoliques

Plusieurs études ont consacrés ces quarante dernières années aux méthodes

d’analyse des composés phénoliques, et ont permit de mettre en évidence à la fois les principales techniques modernes utilisées

et les principaux résultats quant au dosage, caractérisation et identification de ces

composés.Ces nombreuses techniques ont permis de confirmer et de préciser l’importance des

composés phénoliques dans certaines technologies liées aux activités humaines,

dans les domaines industriels, de l’environnement et de la santé humaine.

Cet exposé consiste à présenter essentiellement les principales

méthodes d’étude de ces composés les plus fréquemment

utilisées, à savoir, les techniques de dosage,

d’identification et de caractérisation des composés

phénoliques d’origine végétale.

Introduction

1. Définition et généralités

Noyau benzéniq

ue

OH

Éther

Ester

Hétéroside

Végétaux / micro-

organismesLes

organismes animaux

Alimentation ou symbiose

Les Végétaux

METABOLITES SECONDAIRE

S

V. Shikimate

V. Acétate

Voies d’aromagen

èse

(aminoacides, vitamines,

pigments,…etc.)

2. Classification

La complexité du squelette de base (allant d’un simple C6 à des formes très polymérisés) Le degré de modifications de ce

squelette (degré d’oxydation, d’hydroxylation, de méthylation…),

Les liaisons possibles avec d’autres molécules (glucides, lipides, protéines, autres métabolites secondaires pouvant être ou non des composées phénoliques…).

Phénol

s simple

s

C6 à C6-C4

FlavonoïdesC6 – C3- C6

Lignines(C6-C3)n

(C15)n

Tannins

Les composés phénoliques

StilibènesC6 – C3- C6

Les anthocyanidines

Les flavones Les flavanes

Les isoflavones

Les flavonols

Les flavanols

Les flavanones

CyanidinePélargonidine

Kaempférol, Quecétine

Daidzéine

Catéchine, épicatéchine

Naringénine

Flavonoïdes Les

tanninsLes

tannins condensés

Les tannins

hydrolysables

Les tannins

hydrolysables

Hydrolyse chimique/enzymatique

Partie non

phénolique

Glucose, ou l’acide

quinique

Partie phénoliq

ue Acide gallique

Gallotannins

Dimère de l’acide

gallique

Ellagitannins

Les tannins

condensés

Oligomères/polymères de Flavane-3-ols ou flavane-3,4-diols dérivés de la (+) catéchineRésistants à l’hydrolyse

Traitement acide à chaud Pigments

rougesProanthocyani

dines

3. Méthodes d’étude des composés phénoliques

Préparation des échantillons

L’extraction des composés phénoliquesMéthodes de séparation, de dosage et

d’identification des composés phénoliques

Par leurs spectres d’absorption en ultra violet ou en lumière visible 

Par les méthodes chromatographiques

1. Préparation des échantillons

Ultrafiltration (échantillons liquides)

Hydrolyses chimiques ou enzymatiques (des

glycosides/formes condensées)

Étapes d’extraction / purification

Grande variabilité des composés phénoliques /

propriétés

Polarité

AciditéNombre Des Groupements

Hydroxyles / Noyaux Aromatiques Concentration

Complexité de la matrice

Broyage / homogénéisa

tionSéchage /

lyophilisation

Extraction

Une étape d’une importance capitale préalable à tout type d’analyse fiable.

Plusieurs méthodes de préparation ont été développées afin de déterminer la fraction

phénolique dans une large gamme de types d’échantillons.

Par conséquent, il est important de choisir convenablement une méthode optimale de prétraitement en accord avec les structures chimiques et les

propriétés physicochimiques des composés phénoliques.

L’objectif de l’extraction c’est de libérer les composés phénoliques

présents dans des structures vacuolaires par rupture du tissu

végétal en utilisant plusieurs techniques:

L’hydrodistillation

Extraction par

expression

Extraction par les solvants

Extraction au fluide

supercritique

Dissoudre le composé recherché dans un solvant non miscible avec l’eau et à séparer la phase organique contenant

le composé à extraire de la phase aqueuse.Hexane, éther diéthylique,

chloroforme, méthanol…….

Concrète

L’ absolu

La nature du

solvant

pH du milieu d’extraction

(degré de solubilité des substances)

La tempréture:

0-4°C

Nombre d’extraction/ volume du

solvant

Taille/forme des particules

Agent réducteur

Inhibiteur des glucosidases

Les facteurs :

L’extraction des tannins

Tissus frais ou conservés

par congélation

ou lyophilisatio

n

Rendement

optimal

Distillation

Dichlorométhane

Acétate d’éthyle

Mélange eau/acétone

Solution aqueuse

- Proanthocyanidols dimères - Tannins galliques Proanthocyanidols polymères Tannins galliques PM élevé…

2. Méthodes de séparation, de dosage et d’identification des

composés phénoliques

Méthodes spectrophotométriques ou colorimétriques 

Tous les composés phénoliques

UV / visible

Coloration des organes végétaux (fleurs, fruits…)

Cycles benzéniques Fonctions hydroxyles (phénoliques)Doubles liaisons

Dosage des composés

phénoliques

La loi de Beer-Lambert

DO = C d

Dosage total des

composés phénoliques

Phosphotungstiate (WO4

2-)- Phosphomolybdate (MoO4 2-)

Oxydation des phénolates, réduction des polyhétérocycles

Le réactif de Folin-Ciocalteu

Formation d’un complexe molybdène-tungstène bleu mesuré au spectro-photomètre

Acide ascorbique

Extraits suffisamment purifiés Réaliser des témoins négatifs

Exprimer la teneur à un composé de référence (par exemple en équivalents d’acide chlorogénique, ou gallique).

Dosage des

tannins

Tannins condensés La technique au butanol-HCl

La technique à la vanillinePrécipitation par le formaldéhyde

Par l’iodate de potassium

Tannins hydrolysables

Les gallotannins

Par la rhodanine

La technique au NaNO2/HCl

L’oxydation à l’acide nitreux

Les ellagitannins

Dosage des

flavonoïdes

La méthode du trichloride

d’aluminium (AlCl3)

La quercétine

Le Catécho

l

• Des solvants d’élution (pH, large gamme de polarité depuis l’eau très polaire

jusqu’au benzène fortement apolaire)

Identification chimique spécifique et caractérisation

Les méthodes chromatographiques Sur papier, sur couches

minces Les méthodes électrophorétiques

Une première approche qualitative concernant un matériel végétal inconnu.

Sur papier

• Des supports chromatographiques (cellulose du des couches minces, silice,

polyamide…),

• Les propriétés chimiques des composés phénoliques eux même qui permettent

leurs révélations caractéristiques sur les chromatogrammes.

De (s) groupement(s) phénolique(s) porté(s) par le cycle benzénique

Cycle (s) benzénique

(s)

Les tannins

• Examen en UV• Révélateurs

Les tannins

hydrolysables

Coloration, précipité bleu noir

Les tannins

condensés

Coloration, précipité

brun verdâtres

Sels ferriques

Les gallotanni

ns

Coloration rose

Les ellagitanni

ns

Coloration rose

l’iodate de potassium

l’acide nitreux (milieu acétique)

Les flavonoïdes

Acide sulfurique/NH4OH

Bleu violacé

Anthocyane

La réaction à la

cyanidine

Rose orangée

Flavone

Rose- violacée

Flavanones

Rouge

flavonones, flavanonol

Chrommatographie liquide à haute performance

(CHLP)• Une faible quantité d’échantillon

végétal• combine en une seule opération

rapide et reproductible les analyses qualitatives et

quantitatives d’un extrait phénolique complexe

•Des phases stationnaires

•solvant d’élution

•Composés phénoliques (degré d’hydroxylation, glycosylation,

et méthylation)

Composés phénoliques non polaires

• Phase stationnaire de silice

• Solvant apolaire de composition

constante (par exemple le mélange héptane-éthanol)

Fixation sur une phase dite inversée

• La silice sur la quelle on a

préalablement greffé des chaines aliphatiques

apolaires• élution par un mélange de solvants (fréquemment eau/acide

acétique/acétonitrile ou eau/méthanol) dont on fait varier la composition (la polarité)

avec le temps de l’analyse.

Lumière visible pour les anthocyanes (vers 520nm)

UV (280, 325 ou 360nm) pour tous les autres phénols 

La surface de chacun des pics est proportionnelle à la concentration du composé.

Dosé à la longueur d’onde choisie pour l’analyse par référence à des composés témoins obtenus commercialement ou à partir d’analyses antérieures.

Conclusion

Des avancés spectaculaires et l’amélioration des techniques analytiques et des approches moléculaires ont aujourd’hui

permis de confirmer et de préciser la diversité et l’importance de ces composés

phénoliques végétales.Notamment la reconnaissance de leur activité anti-oxydante mais également anti-inflammatoire et antimicrobienne. elle est

pour une part à l’origine du regain d’intérêt que l’on porte à ces composés dans le

domaine de la nutrition et de la pharmacologie.

Merci pour votre attention