Production de métabolites par les levures ... · Ma plus profonde gratitude à Marie-Ange TESTE qui m’a été d’une aide précieuse et considérable. Sa gentillesse et sa disponibilité

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur & de la Recherche Scientifique Université d’Oran

Thème

Soutenue le 14/04/2014 devant la commission d’examen composée de : Président : M. TALEB M. Z. Professeur à l’Université d’Oran.

Examinateur : M. AOUES A. Professeur à l’Université d’Oran.

Examinateur : M. ABDELWAHED D. Professeur à l’Université de Tlemcen.

Examinateur : M TOUZI A. Directeur d’Etudes au Cabinet de la Direction

Générale de la Recherche Scientifique et

Développement Technologique/Ministère de

l’ESRS.

Directeur de thèse : Mme BENBAYER Z. MC à l’Université d’Oran.

Co-directeur de thèse Pr François J.M. Professeur en Biochimie, BM et

bioNanotechnologie (Université de Toulouse, INSA).

Production de métabolites par les levures :

caractérisation et identification des arômes et des

alcools.

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biotechnologie

Thèse de Doctorat en Biotechnologie

Présentée par :

Mme REZKI-BEKKI Meriem Amina

REMERCIEMENTS

Le travail présenté dans cette thèse de doctorat a été effectué, en grande partie,

dans le Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, au sein de

l’EAD5 dirigée par le professeur Jean-Marie FRANÇOIS, à qui j’exprime ma

reconnaissance pour m’avoir accueillie au sein de son équipe de recherche et d’avoir

mis à ma disposition tous les produits et matériaux nécessaires à la réalisation de ce

travail. Merci pour son enthousiasme et son intérêt pour ce projet. J’ai beaucoup

appris auprès de lui et de son équipe et j’ai bénéficié de sa compétence, et de sa

patience contagieuse pour la recherche.

Il m’est très agréable d’adresser mes sincères remerciements à Mme BENBAYER

Zoubida pour avoir accepté de diriger ce travail, pour ses judicieux conseils et son

inlassable dévouement.

Je tiens aussi à remercier les membres du jury:

Monsieur TALEB M.Z., qui a accepté d’orchestrer le débat en tant que président

de ce jury de thèse,

Messieurs Touzi A., Abdelwahed D. et Aouès A. d’avoir accepter cette lourde

charge en examinant ce travail et de nous honorer par leur présence.

Je remercie également Laurent BENBADIS et Gustavo de BILLERBECK, qui ont su

chacun à leur tour me remotiver en mettant en valeur mon travail par leurs

connaissances scientifiques. J’ai beaucoup appris de nos discussions en particulier avec

Laurent qui a participé aux longues nuits devant le fermenteur.

Ma plus profonde gratitude à Marie-Ange TESTE qui m’a été d’une aide

précieuse et considérable. Sa gentillesse et sa disponibilité constantes ont participé au

bon déroulement de ce travail.

Une pensée très particulière à Ceren ALKIM avec qui j’ai partagé mes joies, mes

déceptions et mes nuits blanches au laboratoire.

Je remercie également M Philippe BLANC pour l’intérêt qu’il a porté à mon

travail et pour sa collaboration scientifique et amicale.

Parmi les personnes qui ont contribué à ce travail, je remercie Marie-Odile

LORET qui a porté sa part du projet, Thomas Walther pour ses conseils scientifiques et

Jean-Luc PARROU avec qui j’ai apprécié nos longues discussions et qui m’a épaulée

dans les moments difficiles.

Un grand merci au reste de l’équipe « JMF’slab » EAD5/LISBP: les deux Marion,

Audrey, Dong-Dong,…pour leur soutien plus que scientifique.

J’adresse mes sincères remerciements au directeur du LBRAP et amitiés à toutes

celles et ceux qui m’ont aidée de loin ou de près.

Et enfin, j’adresse mes remerciements, et pas des moindres, à ceux qui ont

toujours été là pour moi, qui m’ont soutenue quand le moral n’allait pas ou lorsque je

n’avais plus d’énergie pour continuer, ma petite famille: mon époux et mes deux chers

enfants, Mimi et Ramzi qui ont beaucoup pris sur eux pendant mon absence, merci

mes deux petits cœurs. Je vous aime et vous aurez toujours une très grande place dans

mon cœur.

RESUME

L’objet de cette thèse avait pour but l’isolement des levures à partir de biotopes algériens et

la caractérisation des souches qui possèdent des capacités intéressantes en termes de bio

productions. La taxonomie moléculaire sur la base des séquences du domaine D1/D2 de

l’ARN ribosomique 26S des isolats a aboutit à neuf espèces différentes. Notre étude s’est

concentrée sur cinq espèces: Clavispora lusitaniae, Hanseniaspora uvarum, Kodamaea

ohmeri, Issatchenkia orientalis et Trichosporon asahii qui proviennent de biotopes

particuliers et sont très peu étudiées. L’étude des caractéristiques physiologiques a permis

de sélectionner la souche d’Issatchenkia orientalis (connu également sous le nom de Pichia

kudriavezii) qui possède des potentialités importantes en production et résistance à

l’éthanol qui en plus de sa résistance à de multiple stress comme les stress thermique, salin,

osmotique et pH en fait une candidate idéale pour l’intensification de la production du

bioéthanol.

Cette étude a également porté sur le profil d’accumulation des alcools supérieurs chez ces

souches cultivées sur milieu glucosé en absence et en présence d’excès en acides aminés:

leucine, isoleucine et phénylalanine. Elles ont révélé une production importante de

différentes molécules en particulier une production entre 250 et 300 mg/L du 2-

méthylbutanol chez Clavispora lusitaniae, de 400 mg/L en 3-méthylbutanol pour la souche

Kodamaea ohmeri. Quand à la souche I. orientalis, elle a montré une production

remarquable en 2-phényléthanol avec une concentration très proche des 1000 mg/L

représentant pratiquement le double de la concentration donnée par la souche contrôle S.

cerevisiae CEN.PK122-2N. De plus, ce niveau de production très élevé du 2-phényléthanol

par I. orientalis est corroboré par une grande résistance de cette levure à cet alcool

supérieur allant à une concentration de 5 g/L. Cette dernière représente le double de la

concentration à laquelle résiste la souche de référence S. cerevisiae.

Mots clefs : Levures, taxonomie, physiologie, éthanol, stress, fermentation,

arômes.

SUMMARY

This study was designed for the isolation of yeasts from Algerian habitats and

characterization of strains that possess valuable capabilities in terms of bioproduction. The

molecular taxonomy based on the sequences of the D1/D2 domain of the 26S ribosomal RNA

of the isolates results in nine different species. Our study focused on five of them: Clavispora

lusitaniae, Hanseniaspora uvarum, Kodamaea ohmeri, Issatchenkia orientalis and

Trichosporon asahii that come from specific habitats and are poorly studied at the

physiological level. The study of physiological characteristics was used to select the

Issatchenkia orientalis strain (also known as Pichia kudriavezii) that has significant potential

in ethanol production. This potential, together with its resistance to multiple stresses such as

heat, pH, salt, osmotic and ethanol stress, makes this species an excellent candidate for the

intensification of production of bio-ethanol.

This study also concerned the profile of accumulation of superior alcohols to these selected

yeast species cultivated on a glucose media in the presence of excess amino acids leucine,

isoleucine, phenylalanine. This study showed an important production of various

biomolecules in particular a production of 2-methylbutanol ranging 250 and 300 mg/L by

Clasvispora lusitaniae, of 400 mg 3-methylbutanol by Kodamaea ohmeri. Remarkably, the

Issatchenkia orientalis species exhibted a remarkable production of 2-phenylethanol to up

1000 mg/L, which was about 2 times higher than that obtained by the control

Saccharomyces cerevisiae strain CEN.PK122-2N. Furthermore, this higher PE production by

Issatchenkia orientalis corroborated with a high resistance of this yeast species to this

superior alcohol that can go up to 5 g/L 2-phenylethanol, which is two times higher than that

obtained for S. cerevisiae.

Keywords: Yeast, taxonomy, physiology, ethanol, stress, fermentation aromas.

الملخص

هذؾ هزا انعمم نعضل خمبئش مه عذة مىبطق خضائشت و ححذذ هىت انسالالث انمخحصم عههب و

دساست أهمخهب انبىحكىىنىخت

، به 26S نهحبمط انشبD2/D1إن االعخمبد عهى بىنىخب اندضئبث ـ حصىفهب بذساست انمدبل

ؼش أن دساسخىب انمعمقت حشكضث عهى خمست . أن هزي انسالالث حىخم نخسعت أخىبط مخخهفت مه انخمبئش

,Hanseniaspora uvarum ،Clavispora lusitaniae ، , Kodamaea ohmeri :اخىبط ه

Issatchenkia و Trichosporon asahii و انخ عضنج مه بعط انمىبطق اندضائشت راث طببع خبص نم

. خم دساسخهب بعذ

Issatchenkia orientalisإن دساست انخصبئص انفسىنىخت نهزي انخمبئش مكىخىب مه اخخبس انسالنت

و انخ حمخبص بخصبئص اوخبخت خذ مهمت و مقبومخهب نخأثش Pichia kudriaveziiانمصىت أعب ححج اسم

اإلثبوىل ببإلظبـت إنى مقبومخهب نخأثش انحشاسة، انمهىحت، األسمىصت انعبنت و انحمىظت ممب ششحهب

. السخعمبنهب ـ اوخبج اإلثبوىل انبىنىخ

نقذ خصص خضء كبش مه هزي انذساست نخحذذ وىعت انكحىالث انمىخدت مه قبم هزي انسالالث و رانك

بعذ حىمخهب عهى وسط حخىي عهى انؽهكىص ـ وخىد او ؼبة ـبئط مه األحمبض األمىت

إن انىخبئح انمخحصم عههب بىج بأن انسالالث حمخهك phénylalanine. و leucine, isoleucine :انخبنت

و 250 اوخدج مب به Clavispora lusitaniae خصبئص عبنت ـ إوخبج عذة خضئبث مثال انسالنت

أمب méthylbutanol-3ل مه /مػKodamaea ohmeri 400 وانسالنت méthylbutanol-2ل مه /مػ300

حث بهػ phényléthanol-2 ـخمخبص بإوخبخهب انىـش مه Issatchenkia orientalisـهب خعهق ببنسالل

S. cerevisiae ل أي مب عبدل ظعؿ انكمت انمىخدت مه قبم انسالنت انمشخعت/مػ.1000حشكضي

CEN.PK122-2N .

ل اي مب عبدل /غ5اظبـت انى رنك حمخبص هزي انسالنت بمقبومخهب نكمت عبنت مه هزا انكحىل حصم انى

. ظعؿ انكمت انخ حخحمههب انسالنت انمشخعت

SOMMAIRE

RESUME ................................................................................................................................... 3

SUMMARY .............................................................................................................................. 4

RESUME EN ARABE ............................................................................................................. 5

INTRODUCTION GENERALE ......................................................................................... 10

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................................ 13

Chapitre I : Généralités et caractéristiques biologiques des levures .............................. 14

1-Morphologie ..................................................................................................................... 16

1.1-La forme levure ....................................................................................................... 16

1.2- La forme pseudomycélium .................................................................................... 16

1.3- La forme mycélium ............................................................................................... 17

2- Structure cellulaire de la forme levure ............................................................................ 17

2.1- La paroi ................................................................................................................... 18

2.2- L’espace périplasmique .......................................................................................... 18

2.3- La membrane plasmique .......................................................................................... 18

2.4- Le cytoplasme .......................................................................................................... 19

2.5- Le noyau et le réticulum endoplasmique ................................................................. 19

3- Les exigences nutritionnelles .......................................................................................... 20

4- Métabolisme .................................................................................................................... 21

4.1- Métabolisme oxydatif .............................................................................................. 21

4.2- Métabolisme fermentaire ......................................................................................... 22

4.3- Métabolisme oxydo-réductif .................................................................................. .22

4.4- Métabolisme des monosaccharides ......................................................................... 23

4.5- Métabolisme des di- et tri-saccharides .................................................................... 24

4.6- Métabolisme des pentoses ...................................................................................... 25

4.7- Métabolisme des polysaccharides. ......................................................................... 27

4.8- Le transport des sucres .......................................................................................... 28

4.9- Le transport des ions ammonium .......................................................................... 28

4.10- Le transport des acides aminés ............................................................................. 29

4.11-Le transport des peptides et des polypeptides ...................................................... 30

5-Facteurs influençant le comportement des levures ......................................................... 31

5.1- Effet de la température ........................................................................................... 31

5.2- Effet du pH ............................................................................................................. 31

5.3- Effet de la pression osmotique et l’activité de l’eau ................................................ 32

5.4- Effet de l’oxygène et du dioxyde du carbone ......................................................... 32

5.5- Effet de la concentration d’éthanol ........................................................................ 33

5.6- Effet de l’acide acétique .......................................................................................... 33

Chapitre II : Utilisation industrielle des levures ................................................................ 34

A/ Production microbienne de l’éthanol .............................................................................. 35

1-Intérêts de cette production .............................................................................................. 35

2-Procédés utilisés au cours de la fermentation................................................................... 36

2.1-Fermentation type batch …. ................................................................................... 36

2.2- Fermentation type fed-batch …….. ...................................................................... 37

2.3- Fermentation type continu … ................................................................................ 37

3-Les substrats utilisés au cours de cette production………………… ............................... 37

4-Les microorganismes utilisés au cours de cette production ….. ...................................... 38

5-Inhibition et tolérance à l’éthanol..................................................................................... 38

B/ Production microbienne des arômes ……….. ................................................................. 39

1-Définition …….. .............................................................................................................. 39

2- Les différents types d’arômes……. ................................................................................ 40

2.1- Les arômes naturels….. ........................................................................................... 40

2.2- Les arômes de synthèse ………………… .............................................................. 40

2.3- Les arômes de transformation……… ................................................................... .41

2.4- Les arômes de fumée…………. .............................................................................. 41

3-Utilisation des arômes……….. ........................................................................................ 41

4- Les arômes issus des biotechnologies …... ..................................................................... 41

4.1- Les modes de production…... .................................................................................. 42

4.2- Les microorganismes utilisés ................................................................................. 43

4.3- Les composés volatils formés par les microorganismes . ....................................... 45

4.4- Le 2-phényléthanol (2PE)…… ................................................................................ 46

5-Problématiques de production microbienne des arômes …….. ....................................... 48

MATERIEL ET METHODES …….. .................................................................................. 49

1-Matériel biologique ........................................................................................................ 50

2-Méthodes d’isolement des levures ………. ................................................................... 51

2.1- Isolement à partir des échantillons solides ............................................................ 52

2.2- Isolement à partir du lait …… ................................................................................. 52

2.3-Isolement à partir du miel ……………… ................................................................ 52

3- Méthodes d’identification des souches de levures …… ................................................. 53

3.1-Méthode conventionnelle …. ................................................................................... 53

3.2- PCR sur histones ……… ......................................................................................... 53

3.3- Identification moléculaire au CIRM ...................................................................... 54

4- Milieux et conditions de culture… .................................................................................. 55

4.1- Milieux de culture . .................................................................................................. 55

4.2- Conditions de culture .............................................................................................. 55

5- Analyse phénotypique ……. ........................................................................................... 58

5.1- Etude des caractères culturaux ……. ...................................................................... 58

5.2- Etude des caractères morphologiques ….. ............................................................. 58

5.3- Effet de quelques stress sur la croissance des souches retenues …….................... 58

6- Méthodes analytiques ….. ............................................................................................. 60

6.1- Détermination de la biomasse …….. ...................................................................... 60

6.2- Extraction d’alcools supérieurs et de leurs acétates……… .................................... 62

6.3- Analyse chromatographique par HPLC pour le dosage des différents sucres,

éthanol, glycérol et acétate …. .................................................................................. 63

6.4- Analyse chromatographique par GC-FID pour le dosage des alcools supérieurs et

leurs acétates ………. ........................................................................................... 63

7- Analyse physiologique …… ........................................................................................... 64

7.1- Culture en anaérobiose ………… ......................................................................... 64

7.2- Assimilation des substrats carbonés ……… .......................................................... .64

RESULTATS ET DISCUSSION ....................................................................................... 66

1- Identification des isolats de levure……….. .................................................................... 67

1.1- PCR sur histones …….. .......................................................................................... 67

1.2- Identification moléculaire …. .................................................................................. 68

2- Caractères culturaux et morphologiques ……….. .......................................................... 71

2.1- Caractères culturaux .. ............................................................................................. 71

2.2- Caractères morphologiques. .................................................................................... 73

3-Effet des différents stress .. .............................................................................................. 76

3.1- Effet de la température ……. .................................................................................. 76

3.2- Effet du pH …… ..................................................................................................... 77

3.3- Effet du stress salin …. ............................................................................................ 78

3.4- Effet du stress osmotique … .................................................................................... 79

3.5- Effet de l’éthanol ……. .......................................................................................... 81

4- Analyse de la physiologie des cinq souches de levures retenues …. .............................. 84

4.1- Assimilation des substrats carbonés (Galerie API ID 32C)………. ....................... 85

4.2- Cinétiques et productions en aérobiose … .............................................................. 87

4.3- Cinétiques et productions de la souche Issatchenkia orientalis et CEN.PK122-2N

sur YPD et MMS en anaérobiose ……. ..................................................................... 91

4.4- Cinétiques et productions sur différents substrats glucidiques ……….. ................ 94

4.4.1- Culture et productions des cinq souches sur xylose.. ........................................ 97

5- Profil aromatique des cinq souches de levures retenues…….. ...................................... 99

5.1- Le profil d’accumulation des alcools supérieurs et de leurs acétates …… ............. 99

5.2- Tolérance au 2-phényléthanol …….. .................................................................... 103

6- Intérêt et dynamique physiologique de la souche Issatchenkia orientalis. .................. 105

6.1- Analyse de la viabilité cellulaire ……. ................................................................. 107

6.2- Aspect macrocinétique de la fermentation alcoolique type batch ….. ................. 109

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES……. .......................................... 112

ANNEXES . ........................................................................................................................... 115

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .... ...................................................................... 123

LISTE DES TABLEAUX… .............................................................................................. 154

LISTE DES FIGURES ........................................................................................................ 156

INTRODUCTION GENERALE

Introduction générale

10

Les levures sont des acteurs essentiels intervenant dans divers domaines et l’intérêt qu’elles

suscitent aujourd’hui est dû à leur grande diversité. Un grand nombre de levures

communément utilisées en biotechnologie a été obtenu à partir d’habitats naturels où elles

ont développé une faculté d’adaptation à un grand nombre de niches écologiques grâce à

leurs propriétés physiologiques très caractéristiques. L’ingénierie de ces levures a donc

trouvé dans l’industrie de la fermentation un champ d’application privilégié pour produire

divers métabolites comme les arômes et l’éthanol.

L’éthanol est un produit chimique industriel important pouvant avoir plusieurs destinées en

industrie chimique, pharmaceutique, cosmétique, etc. Aujourd’hui, il possède de nouveaux

potentiels en tant que biocarburant. Le bioéthanol grâce à ses propriétés physico-chimiques

compatibles avec l’essence, représente une alternative très prometteuse aux énergies

fossiles, couteuses et très polluantes. Grâce à leur capacité fermentaire, les levures

produisent cet alcool à partir de sucres qui peuvent être obtenus soit à partir de biomasse

sucrée (canne à sucre, betterave sucrière, etc.) ou amylacée (maïs, pomme de terre, manioc,

etc.), soit à partir de biomasse lignocellulosique (herbe, résidus agro-forestiers, bois, etc.).

Elles sont générées par les activités agricoles et agro-industrielles, c’est le cas par exemple

de la palmeraie algérienne, qui constitue le pivot de l’écosystème oasien par l’importance de

sa production et qui génère à chaque compagne des quantités importantes de déchets. La

valorisation de ces déchets, permet d’alimenter le marché national par des substances à

forte valeur ajoutée, en particulier l’alcool éthylique, substance énergétique stratégique et

base de nombreuses industries (Kaidi et Touzi, 2001). La production du bioéthanol à partir

de cette filière présente un très grand intérêt vu la diversité et la disponibilité des ressources

et la possibilité d’éviter la concurrence entre les usages alimentaires et énergétiques.

Mais comme dans tout procédé biotechnologique, il faut veiller à éviter les inhibitions par

les substrats utilisés et les métabolites produits. Or, l’inhibition par l’éthanol produit est un

frein majeur à l’obtention d’un titre et d’une productivité élevée en éthanol. La littérature

qui nous donne des pistes sur les perturbations cellulaires engendrées par l’éthanol et sur les

changements physiologiques et moléculaires mis en place par la levure en réponse à la

présence d’éthanol dans son environnement, précise que l’utilisation de Saccharomyces

cerevisiae a été fortement relancée suite au contexte économique et écologique actuel. Cet

organisme eucaryote unicellulaire et non-pathogène pour l’homme représente un modèle

expérimental avec de nombreux avantages dont la petite taille de son génome, sa facilité à

le manipuler génétiquement, la disponibilité de la séquence de son génome en 1996 et une

abondante littérature sur sa génétique et physiologie.

Introduction générale

11

Les arômes produits par les levures, constituent un élément important dans l’élaboration de

nombreux aliments en conférant à ces derniers leurs propriétés organoleptiques. Leur

marché est en plein essor afin de répondre aux demandes des consommateurs qui sont de

plus en plus attentifs à leur santé et à la composition de leurs aliments. Ces consommateurs

exigent des arômes dont l’innocuité est garantie et qui peut être satisfaite par les arômes

produits par voie microbiologique, en particulier par les levures.

Cependant ces métabolites, comme l’éthanol, deviennent des facteurs de stress importants

car ils s’accumulent dans le milieu de culture et inhibent la croissance des levures ainsi que

leur viabilité (Hu et al., 2007), ce qui diminue leurs rendements (Pina et al., 2004) et affecte

sérieusement les entreprises industrielles. L’étude et la maîtrise de la tolérance à ces

produits ont donc des intérêts économiques pour ces derniers. Cette problématique qui est

un sujet crucial pour la biotechnologie constitue notre deuxième objectif. De ce fait, la

recherche des souches à partir de divers biotopes algériens non encore exploités peut

répondre à ces contraintes. C’est dans ce contexte que s’intègre le présent travail dans

lequel les levures ont été isolées à partir des échantillons biologiques provenant de

différents biotopes. La capacité fermentaire et de production ainsi que leurs pouvoirs de

résistance ont été également étudiés.

Dans ce manuscrit, la première partie présente une étude bibliographique divisée en deux

chapitres distincts. Le premier rapporte des données générales sur les levures à l’échelle

structurale et physiologique. Le deuxième portera sur l’utilisation des levures de manière

très restreinte et se focalisera plus précisément sur les deux métabolites étudiés: l’éthanol et

les arômes.

La deuxième partie est consacrée aux matériels et aux protocoles expérimentaux mis en

place pour la réalisation de ce travail de thèse.

La troisième partie représente et discute l’ensemble des résultats obtenus à la suite de cette

étude.

Nous terminons par une conclusion générale et en envisageant les perspectives possibles à

la poursuite de ce travail.

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

Etude Bibliographique

13

Chapitre I : Généralités et caractéristiques biologiques des

Levures

Les levures, champignons unicellulaires pour tout ou une partie de leur cycle végétatif,

forment un groupe très hétérogène. Il existe des formes intermédiaires entre levures et

champignons supérieurs typiques qui rendent leur distinction avec les champignons

filamenteux très subjective (Kreger-Van-Rig, 1984). Certaines levures ont une reproduction

sexuée qui correspond à une phase de leur cycle biologique où on note une alternance des

phases haploïde et diploïde. Le bourgeonnement qui est le mode de reproduction végétatif

le plus fréquent, est représenté par une évagination qui apparaît à un point de la cellule

mère. Le bourgeon grandit peu à peu en formant une nouvelle cellule qui se détache de la

cellule mère. Deux autres modes de reproduction végétative peuvent être rencontrés: la

fission, caractéristique du genre Schizosaccharomyces, qui se manifeste par la formation

d’une paroi transversale au grand axe de la levure et le bourgeonnement sur stérigmates,

propre au Sterigmatomyces, où la cellule fille prend naissance sur une protubérance formée

sur la cellule mère.

Ces micro-organismes ubiquitaires (Phaff et al., 1978 et Bonaly, 1990) peuvent coloniser

l’air, le sol, l’eau (Lo Presti et al., 2001), le tube digestif de certains animaux et les galeries

d’insectes (Rose et Harrison, 1987 ; Lachance et al., 1998 ; Lachance et al., 2001 et Lachance

et al., 2006). Certaines levures ont été isolées à partir d’environnements extrêmes comme

celles isolées à partir de l'Antarctique (Satyanarayana et Kunze, 2009). D’autres vivent

principalement sur les végétaux riches en sucres, dans les liquides sucrés, ou dans des

aliments tels que le pain et les céréales (Rocco et al., 1985). Les levures utilisatrices de

lactose se rencontrent ainsi dans les produits laitiers (Baroiller et Schmidt, 1990).

Les levures des produits alimentaires n’étant pas pathogènes, elles ne causeront pas

d’intoxication alimentaire mais peuvent produire par leur développement des altérations de

la qualité marchande de ces aliments (Rambaud, 2004). Enfin un petit nombre de levures

pathogènes sont à signaler, tout spécialement Candida albicans responsable du muguet des

jeunes enfants, des vaginites, etc. et Cryptococcus neoformens disséminé par les pigeons et

qui peut provoquer des méningites fatales (Koenig, 1995 ; Senet, 1995 ; Odds, 1995 et Hart

et Shears, 1997).

En se basant sur cette large distribution des levures, différents produits provenant de

différents biotopes algériens ont été choisis pour leur isolement:

Les dattes

Les dattes, famille des Palmacées, sont des fruits charnus, de 4 à 6 cm de long avec un

noyau allongé. Elles sont jaunes, oranges, rouges ou même brunes lorsqu’elles arrivent à


14

maturité. Elles sont très énergétiques avec une valeur de 287 Kcal/100 g et très riches en

sucre (glucose, fructose et saccharose), en sels minéraux (potassium, calcium, magnésium et

fer) et en vitamines, en particulier les vitamines B2, B3, B5 et B6. Leur richesse en fibres est

très importante. Par contre, elles sont pauvres en protéines (4 à 6%) et leur teneur en eau

est de 20% pour les dattes sèches et de 70% pour les dattes fraîches. Elles sont très

appréciées pour leur forte concentration en antioxydants (principalement les caroténoïdes

et les composés phénoliques) et leur pauvreté en matières grasses. Ils existent au moins

1200 variétés de dattes en Algérie. Les trois variétés choisies sont parmi les plus

consommées en Algérie à cause de leur consistance et de leurs multiples destinées: Deglet-

Nour est destinée à la consommation, Gharas pour la pâtisserie et Hamira pour la confiture

(Matallah, 2004).

Le melon C’est un fruit savoureux, sucré et parfumé, très consommé en Algérie. Le cantaloup,

variété possédant une note parfumée très prononcée, a été utilisé pour l’isolement. Il

constitue de plus une source importante de sels minéraux en particulier le potassium. Il est

également très riche en antioxydants, majoritairement des caroténoïdes qui représentent

85% et qui lui confèrent sa couleur rouge-orangée ; ainsi que certains composés

phénoliques, des superoxyde-dismutases et différentes vitamines comme la vitamine A et C

(Lester et Crosby, 2004).

Le cornichon Le cornichon, proche du concombre, présente les mêmes caractéristiques nutritionnelles.

Il contient des vitamines, des fibres et des minéraux en particulier le sodium (700mg/100g),

dû au sel utilisé pour le dégorger. Il reste un condiment très apprécié pour son léger piquant

qui ne prend pas le dessus sur les notes aromatiques et acidulées pour lesquelles il a été

choisi.

Le lait Le lait, liquide biologique de couleur blanchâtre légèrement visqueux, constitue un

aliment très riche dont la composition et les caractères physico-chimiques varient

sensiblement en fonction de plusieurs facteurs tels que l’espèce et la race animale, la région

et la saison. C’est la raison pour laquelle nous avons choisi différentes régions et animaux

pour la récolte de nos échantillons. Le lait est un mélange très complexe et très instable qui

contient principalement des protides, des glucides (lactose) et très peu de lipides. Les

éléments minéraux sont très variés puisqu’il contient du calcium, du magnésium, du

phosphore et du sodium, et d’autres oligoéléments comme le fer, le fluor et le zinc. Son

profil vitaminique est très riche et est représenté par la vitamine A, D et les vitamines du

groupe B.

Le lait de brebis est plus riche que le lait de vache puisqu’il contient plus de matière grasse et

de matière azotée avec des teneurs en lactose et en sels minéraux plus élevées.


15

Le lait de chèvre est plus blanc car il ne contient pas de β-carotène.

Le lait de chamelle contient autant de protéines que le lait de vache avec une teneur élevée

en sels minéraux (sodium, potassium, magnésium et l’iode), en vitamines B (thiamine en

particulier) et C. Il présente la teneur la plus élevée en vitamines C parmi toutes les espèces

analysées (3,5 mg/100 ml). Ce lait se caractérise par sa teneur faible en sucre et une matière

grasse naturellement basse où on note 40 % de cholestérol de moins que le lait de vache

(Dillon, 1989). Ces caractéristiques diététiques sont à l’origine de l’augmentation de sa

consommation ces dernières années malgré son prix inabordable. Malgré les multiples

études microbiologiques principalement sur les bactéries lactiques, aucune étude n’a abordé

jusqu’à ce jour la nature des levures, leurs diversités et leur potentiel technologique dans ce

produit, ce qui a justifié le choix de ce lait pour notre étude.

Le miel Le miel est une solution saturée en sucres principalement le glucose et le fructose (en

plus du maltose, du saccharose et d’autres polysaccharides). Il est très riche en vitamines,

essentiellement les vitamines B1, B2, B3, B5, B6, C et accessoirement les vitamines A, B8, B9, D

et K. Il est très apprécié pour son effet antibactérien.

D’autres composants sont présents comme les flavonoïdes, les arômes, les grains de pollen,

les acides organiques, les sels minéraux et les protides où on note un très grand nombre

d’acides aminés. Cet échantillon, choisi pour sa richesse en différents sucres, a été récolté de

la région de Mostaganem très riche en flore. A notre connaissance aucune étude

microbiologique n’a étudié la nature des levures de ce produit, d’où son choix pour cette

étude.

1- Morphologie La morphologie des levures est très variée. On distingue trois formes: la forme levure, le

pseudomycélium et le mycélium.

1.1- La forme levure

C’est la plus simple, il s’agit de cellules uniques, libres ou associées deux à deux ayant une

morphologie caractéristique: sphérique, ovoïde, globuleuse ou cylindrique. Des formes

spécifiques sont parfois distinguées comme la forme apiculée (Hanseniaspora et Kloeckera),

en bouteille (Pityrosporum), triangulaire (Trigonopsis) ainsi que la forme pyramidale et

ogivale (Dekkera) (Walker et White, 2005). Ceci en plus des arthrospores, des ballistospores

et des chlamydospores (Barnett et al., 1983). Sous cette forme unicellulaire, les dimensions

sont de 2,5 à 10,5 µm de large et de 4,5 à 21 µm de long. Cette longueur peut dépasser, chez

certaines espèces, les 30 µm. Ces dimensions, ainsi que leurs aspects dépendent

fréquemment de l’âge des cellules et des conditions de culture (Scherr et Weaver, 1953).


16

1.2- La forme pseudomycélium

Chez certaines espèces et après bourgeonnement, les cellules filles restent associées les

unes aux autres et donnent des chaînettes constituées de plusieurs cellules formant un

pseudomycélium. Ce dernier peut être rudimentaire ne comptant que quatre à cinq cellules

comme il peut être plus important et présenter des ramifications. Souvent les cellules

centrales s’allongent et dessinent un axe principal, tandis que les cellules localisées aux

extrémités restent courtes et forment des blastospores (ou blastoconidies) au niveau des

constrictions, l’anaérobiose favorisent la production de cette forme (Belin, 1996).

1.3- La forme mycélium

La propriété de donner un vrai mycélium séparé par des cloisons ou septa caractérise

certaines espèces de levures. Cette différenciation résulte d’un allongement important des

cellules et l’hyphe ainsi formée prolifère par une croissance apicale. Dans la majorité des cas,

c’est le pseudomycélium qui se transforme en mycélium, mais il existe des espèces chez

lesquelles les levures donnent directement un filament sans passer par ce dernier. Son

élaboration débute par l’émergence d’un tube germinatif qui, par croissance apicale,

génèrera un filament qui s’étendra à un rythme constant, se cloisonnera et se ramifiera pour

constituer une hyphe et un mycélium qui se propagera pour donner un réseau bien

enchevêtré (Bouix et Leveau, 1980). Occasionnellement un septum peut séparer la forme

levure de la forme mycélium, c’est ce qui a été observé par Rahary et ses collaborateurs chez

C. albicans en mettant en évidence l’action de la cytohélicase de la cellule mère dans la

formation de ce septum (Rahary et al., 1984). La transition inverse existe également et selon

plusieurs auteurs, les levures apiculées qui se multiplient par bourgeonnement bipolaire,

seraient intermédiaires entre la forme mycélienne et la forme unicellulaire bourgeonnante

(Lodder, 1971).

Ce dimorphisme, voire ce polymorphisme est un phénomène marquant de certaines

espèces. Plusieurs hypothèses ont été proposées pour expliquer ce mécanisme (Nickerson et

Falcone, 1956 ; Bartnicki-Garcia, 1963 ; Bartnicki-Garcia et Lippman, 1969 ; Kanetsuna et al.,

1972 et San-Blast, 1979), mais ces dernières sont très anciennes et reposent sur les

observations de trois espèces seulement. Ce phénomène reste donc inexpliqué. Cependant,

il est sûr que cette transition levure-mycélium peut être provoquée par des facteurs

externes variés comme la température, le pH et la teneur en glucose (Pollack et Hashimoto,

1987 et Vidotto et al., 1988).

2- Structure cellulaire de la forme levure La structure cellulaire des levures, qui est sous la dépendance des conditions physico-

chimiques et de l’âge de la culture, est de type eucaryote et possède une paroi épaisse et

rigide, un noyau limité par une membrane nucléaire, un cytoplasme contenant divers

organites et inclusions dont des mitochondries et une grande vacuole. Chez certaines


17

levures, on note l’existence d’une capsule constituée de phosphomannanes solubles dans

l’eau (Hansenula, Pichia), de mannanes plus ou moins ramifiés (Rhodotorula) ou

d’hétéropolysaccharides (Cryptococcus) (Larpent, 1991).

2.1- La paroi

C’est une structure dynamique externe qui englobe toute la cellule conférant sa rigidité et

sa forme caractéristique. Elle représente 15 à 20% de la matière sèche de la cellule,

d’épaisseur 150 à 230 nm. Sa composition chimique qui est sujette à des variations

importantes suivant les espèces, le cycle cellulaire et les conditions de culture (Aguilar-

Uscanga et François, 2003) comprend environ 80% de polysaccharides principalement des

mannanes (Peat et al., 1961 ; Gorin et al., 1969 et Mc Ellan et Lampin, 1969) et des glucanes

(Bacon et al., 1969 et Manners et masson, 1969) en proportion quasi égales, 10 à 20% de

protéines, 7 à 10% de lipides, 5% de sels minéraux et 1 à 3% de chitine qui se trouve

majoritairement au niveau des cicatrices de bourgeonnement afin de maintenir l’intégrité de

la paroi (Suarit et al., 1988 et Lipke et Ovalle, 1998). La couche intérieure de la paroi est en

grande partie responsable de sa force mécanique et fournit aussi les sites d'attachement pour

les protéines qui forment sa couche extérieure (Klis et al., 2002). Cette structure joue un rôle

important en maintenant une structure élastique qui assure une protection osmotique et

constitue une barrière physique.

2.2- L’espace périplasmique C’est un espace qui est délimité par la membrane plasmique et la couche interne de la

paroi et représente le seul site de localisation cellulaire des enzymes telles que l’invertase

(Neumann et Lampen, 1967), la phosphatase acide (Schurr et Yagile, 1971 et Arnold, 1981),

les β-galactosidases, les β-glucanases (1-3) et β (1-6) et des protéases (Barnett et Robinow,

2002).

2.3- La membrane plasmique C’est une membrane simple et fragile qui se trouve sous la paroi avec une épaisseur de

7,5 nm, retenant l’ensemble des constituants intracellulaires et résistante aux pH acides

mais altérée par des pH alcalins. Les membranes biologiques sont composées de deux types

de constituants principaux: les lipides et les protéines. La diversité des membranes étant très

grande, les compositions lipidiques diffèrent selon les organismes. Dans la composition

lipidique de la membrane plasmique, on distingue les phospholipides et les stérols. Parmi ces

derniers c’est l’ergostérol qui est le dérivé majeur et dont la teneur varie d’une espèce à

l’autre et en fonction de l’âge des cellules. Les autres stérols sont des précurseurs de

l’ergostérol. Un grand nombre de travaux démontrent qu’en aérobiose les levures

contiennent surtout des stérols insaturés tels que l’ergostérol, tandis qu’en anaérobiose

elles renferment des quantités non négligeables de squalène, triterpène linéaire


18

intermédiaire de la biosynthèse des stérols. Ces derniers qui sont soit libres soit estérifiés

avec un acide gras augmentent la rigidité de la membrane et diminuent sa perméabilité

(Bayley et Parks, 1975). Les phospholipides, qui sont intimement associés aux protéines et

aux stérols, assurent à la membrane sa fluidité permettant ainsi le bon fonctionnement des

processus métaboliques.

2.4- Le cytoplasme Le cytoplasme renferme en plus des organites cellulaires tels que les mitochondries (qui

contiennent des ADN, ARN, ARN polymérase et des enzymes respiratoires) et l’appareil de

Golgi, des vacuoles (où se trouve le pool des acides aminés en plus des purines, des

orthophosphates polymérisés et des hydrolases) et des ribosomes. Il contient également des

enzymes, notamment celles de la glycolyse et de la fermentation alcoolique, des

polysaccharides, des polyphosphates, du glycogène et du tréhalose (Larpent, 1991).

2.5- Le noyau et le réticulum endoplasmique La levure possède en général un seul noyau qui est entouré d’une enveloppe à deux

membranes où la membrane externe est en relation continue avec un système membranaire

cytoplasmique important, le réticulum endoplasmique. En de multiples endroits les

membranes externe et interne fusionnent pour former des pores, ces derniers permettent

les échanges entre le noyau et le reste de la cellule. Il contient le génome de la levure qui est

réparti sur les chromosomes dont la structure est semblable à celle des autres eucaryotes

avec un enroulement de l’ADN en «grains de chapelet» formés par des nucléosomes

constitués d’histones de type H2a, H2b, H3 et H4. Ce nucléosome, découvert grâce aux

progrès de la biophysique et de la microscopie électronique est considéré comme unité de

base comprenant 146 paires de bases d’ADN, enroulés autour d’un octamère de protéines

histones.

Le nombre des chromosomes varie selon les espèces, pouvant atteindre 3 chez

Hansenula holstii, 2 chez H. anomala et 16 chez S. cerevisiae haploïde. Chez cette dernière,

le génome comporte environ 12,5 millions de paires de bases qui ont été entièrement

séquencées en 1996 dans le cadre d’un travail international qui a pris environ 8 années en

utilisant les technologie standard de séquençage par la méthode Sanger (Goffeau et al.,

1996). Depuis, beaucoup d’autres levures ont été séquencées utilisant de technologies

nouvelles de séquençage (Souciet et al., 2009). On estime que la levure S. cerevisiae partage

23% de son génome avec l’homme, raison pour laquelle elle est utilisée comme organisme

modèle en biologie moléculaire et en génétique. Les levures peuvent être haploïdes,

diploïdes ou polyploïdes. La polyploïdie est fréquente chez les souches industrielles. Ceci en

plus des plasmides, petite molécule cyclique à ADN en double brin possédant 6Kpb qui est

un élément extra chromosomique présent chez presque toutes les souches de S. cerevisiae

(Guerineau et al., 1971). Le rôle de ce plasmide, 2µm, localisé dans le noyau de la levure à

raison de 60 copies (Livingston, 1977) n’est pas très bien connu. En revanche il est très utilisé

en tant que vecteur au cours des transformations (Broach, 1982).


19

3- Les exigences nutritionnelles Pour leur croissance, les levures ont besoin d’une température et d’un pH adéquats,

d’oxygène, de carbone, d’azote minéral ou organique, de divers minéraux, principalement le

soufre assimilé sous forme inorganique SO42- (Rose, 1980) et le phosphore qui participe au

maintien de l’intégrité de la membrane ainsi qu’à la synthèse des lipides et des hydrates de

carbone (Winter, 1988). Certaines d’entre elles ont besoin d’une ou plusieurs vitamines,

dont la biotine, la thiamine, l’acide pantothénique (ou la β alanine) et plus rarement

l’inositol et autres facteurs de croissance. Par contre, il est fréquent que les vitamines soient

de bons activateurs de la croissance sans être rigoureusement indispensables (Delcourt,

2011).

Les composés carbonés sont d’une grande importance pour les levures puisqu’elles

fournissent, le carbone nécessaire pour la biosynthèse de constituants cellulaires et l’énergie

nécessaire à son fonctionnement. Les glucides sont les plus fréquemment utilisés, en

particulier les monosaccharides comme les hexoses, les disaccharides et les trisaccharides.

D’autres glucides abondants et peu couteux comme les pentoses et les polysaccharides ont

fait l’objet de nombreux travaux ces dernières années (Waldron, 2010). Cependant, d’autres

composés carbonés peuvent être utilisés tels que les alcools, les acides ou les composés

moins oxygénés comme les hydrocarbures. On peut citer à titre d’exemple les alcanes qui

sont utilisés principalement par les levures du genre Candida (Lévi et al., 1979). Mais aucune

levure n’est capable d’utiliser le méthane contrairement au méthanol qui est métabolisé par

plusieurs genres tels que Candida, Hansenula, Pichia et Torulopsis (Veenhuis et al., 1983).

Les sources de carbone pouvant être utilisés par les levures sont résumées dans le tableau 1.

Tableau 1: Les sources de carbone pouvant être utilisées par les levures

(Modifié de : Walker et White, 2005)

Sources de carbone Exemples

Hexoses D-glucose, D-galactose, D-fructose, D-mannose

Disaccharides maltose, saccharose, lactose, tréhalose, mélibiose,

cellobiose, mélézitose

Trisaccharides raffinose, maltotriose

Polysaccharides inuline, cellulose, hemicellulose, chitine

Oligosaccharides maltotetraose, maltodextrines

Pentoses L-arabinose, D-xylose, D-xylulose, L-rhamnose

Alcools méthanol, éthanol, glycérol

Acides organiques acétate, citrate, lactate, malate, pyruvate, succinate

Acides gras oléate, palmitate

Hydrocarbones alcanes

Composés aromatiques phenol, cresol, quinol, resourcinol, catechol, benzoate


20

L’azote est le deuxième constituant important, jouant un rôle capital puisqu’il entre dans la

composition de plusieurs molécules, essentielles au fonctionnement cellulaire allant des plus

simples comme les acides aminés, les sucres aminés, les nucléotides, les coenzymes et les

vitamines jusqu’aux macromolécules, telles que les protéines, les acides nucléiques et la

chitine (Sanchez, 2008). La plupart des levures sont capables d’utiliser les sources azotées

minérales simples sous forme d’ion ammonium qui sont apportés dans le milieu par le

chlorure d’ammonium, le nitrate d’ammonium, le phosphate d’ammonium et surtout le

sulfate d’ammonium, meilleur composé car il apporte en même temps du soufre nécessaire

à la synthèse de certains acides aminés. L’azote peut être apporté également par des

composés organiques divers tels que les acides aminés, les peptides ou des polypeptides

dont la taille nécessite pour leur utilisation une hydrolyse par des peptidases intracellulaire.

Certaines levures, en particulier les Hansenula, Pachysolen, Citeromyces et certaines espèces

de Candida et de Trichosporon, sont capables d’utiliser les nitrites et les nitrates.

Généralement, les espèces qui utilisent les nitrates utilisent les nitrites, mais l’inverse n’est

pas toujours vrai, ainsi Debaryomyces hansenii et Pichia pinus utilisent les nitrates mais pas

les nitrites. Chez Brettanomyces bruxellensis et B. intermedius, l’utilisation des nitrates est

une caractéristique stable au moins à l’intérieur de l’espèce ce qui en fait un outil utilisé à

des fins taxonomiques (Lodder, 1970 ; Kreger Van Rij, 1984 et Moore et al., 1988). Enfin

l’urée en association avec la biotine et les bases puriques et pyrimidiques peut aussi être

utilisée comme source d’azote.

4- Métabolisme Le métabolisme des levures est orienté par la source carbonée et les conditions

environnementales pour être : oxydatif, oxydo-réductif ou fermentaire. La voie de

dégradation des glucides, la glycolyse, convertit les sucres en pyruvate. L’entrée dans cette

voie varie selon le glucide tandis que la destinée du pyruvate dépend à la fois du sucre utilisé

et de l’espèce de levure considérée (Marden, 2007).

4.1- Métabolisme oxydatif Ce type de métabolisme nécessite la présence d’oxygène et une concentration en

substrat limitée afin d’éviter un changement métabolique vers la production d’éthanol et

d’autres co-métabolites (effet Crabtree). Dans ces conditions, le glucose est oxydé via les

voies métaboliques de la glycolyse, du cycle de Krebs et de la phosphorylation oxydative. Le

cycle de Krebs permet la réduction du NADH et FADH2 grâce à la production des co-enzymes

et la synthèse de nombreux précurseurs nécessaires à la formation des principales

macromolécules (Rose et Harrison, 1971 et Van Dijken et Scheffers, 1986). Quant à la

phosphorylation oxydative, elle permet la régénération des co-enzymes réduits NADH et

FADH2 produits lors de la glycolyse. Ainsi les électrons libérés sont transférés à l’oxygène

moléculaire pour former une molécule d’eau et les protons exportés permettent de

maintenir le potentiel transmembranaire entre l’espace intermembranaire et la matrice de


21

la mitochondrie. De cette manière, l’entrée des protons à l’intérieur de la mitochondrie

permet la synthèse d’ATP à partir d’ADP et de phosphate inorganique grâce aux ATP synth

ases situées à la membrane interne mitochondriale. L’efficacité de la chaîne respiratoire est

illustrée par le rapport du nombre de moles d’ATP formées par atome d’oxygène consommé

(P/O) variable selon les souches. Ce métabolisme qui conduit à la formation du CO2 et H2O

est très énergétique et permet aux levures de se maintenir en vie, de synthétiser de la

matière organique et de produire de la biomasse (X) avec un rendement cellulaire élevé (Lai,

2010). Dans ce cas l’oxydation du sucre est complète et le bilan énergétique théorique de

cette voie métabolique est décrit par l’équation suivante :

C6H12O6 + 6 O2 + 28Pi + 28 ADP→ X + 6 CO2 + 6 H2O + 28 ATP.

4.2- Métabolisme fermentaire En anaérobiose, les levures sont capables de fermenter le glucose en éthanol, en dioxyde

de carbone, avec coproduction de glycérol, de certains acides et esters (Leyral et Vierlin,

2007 et Lai, 2010). Dans ce métabolisme, la fonction d’accepteur final d’électrons est

assurée par des molécules organiques où la levure utilise d’abord le NAD+ comme accepteur

intermédiaire d’électrons qui est réduit en NADH. La réduction finale de l’acétaldéhyde en

éthanol et en dioxyde de carbone permet ainsi de maintenir l’équilibre de la balance redox

en réoxydant les NADH produits au cours de la glycolyse, voie principale de dégradation du

sucre en pyruvate. Le bilan énergétique de cette transformation est décrit par l’équation qui

suit:

C6H12O6 + 2Pi + 2 ADP → 2 C2H6O + 2 CO2 + ATP (20 Kcal).

4.3- Métabolisme oxydo-réductif Certaines levures comme S. cerevisiae sont très sensibles au glucose et un excès de ce

sucre peut faire basculer le métabolisme oxydatif vers un métabolisme oxydo-réductif. Elles

sont alors définies comme levures Crabtree positive.

Une autre interprétation du shift métabolique chez la levure (oxydatif/oxydo-réductif) est

basée sur le phénomène d’overflow du carbone au niveau des nœuds pyruvate et

acétaldéhyde (figure 1). Au niveau du nœud pyruvate, la pyruvate déshydrogénase a une

affinité plus forte pour le pyruvate que la pyruvate décarboxylase, mais sa vitesse maximale

est plus faible. Aux faibles flux glycolytiques, le pyruvate est converti via le pyruvate

déshydrogénase vers le cycle de Krebs. Quand le flux glycolytique dépasse une valeur

critique, l’enzyme pyruvate déshydrogénase est saturée et de l’acétaldéhyde est formé. Il en

est de même au niveau du nœud acétaldéhyde. Celui-ci est préférentiellement converti en

acide acétique mais lorsque l’acétaldéhyde déshydrogénase est saturée, l’acétaldéhyde

serait transformé en éthanol (Lei et al., 2001).


22

Figure 1: Nœud métabolique du pyruvate et de l'acétaldéhyde

(Lei et al., 2001).

4.4- Métabolisme des monosaccharides Les monosaccharides sont métabolisés différemment après le passage à travers la

membrane plasmique qui constitue la première étape dans ce métabolisme.

4.4.1- Le glucose, le fructose et le mannose

Ces sucres sont utilisés par toutes les levures et leur catabolisme laisse distinguer: les

levures à métabolisme uniquement respiratoire où le pyruvate formé à partir de ces sucres

est oxydé par le cycle de Krebs et les levures à métabolisme aéro-anaérobie où l’utilisation

des sucres se fait par la voie de la glycolyse qui a lieu dans le cytosol (voie d’Embden-

Meyerhof). En anaérobiose, ces sucres sont métabolisés en éthanol et en dioxyde de

carbone. La concentration des sucres n’a pas d’effet sur ce métabolisme. En revanche, en

aérobiose, la concentration de ces sucres est importante et peut inhiber chez certaines

levures la respiration. Le métabolisme est alors orienté vers la voie fermentaire même en

présence d’oxygène. C’est ainsi que la respiration et la fermentation contribuent à la

dégradation de ces sucres. On peut alors distinguer quatre phases:

Une première phase exponentielle où le métabolisme est essentiellement

fermentaire. On note une production de biomasse et d’éthanol à la suite de la

consommation du sucre.

Une phase diauxique qui explique la consommation du sucre et au cours de la quelle

par dérepression des enzymes correspondantes, le métabolisme est orienté vers un

métabolisme oxydatif.

La troisième phase est purement respiratoire où la levure consomme l’éthanol

produit lors de la première phase.


23

Quand l’éthanol est épuisé, la croissance s’arrête et les cellules entrent en phase

stationnaire.

4.4.2- Le galactose et le mélibiose

L’utilisation de ces sucres se fait selon la voie de Leloir (Caputto et al., 1949) où le

galactose est converti en glucose-1-phosphate qui entrera dans la glycolyse comme le

montre la figure 2.

Figure 2 : Voie de Leloir (métabolisme du galactose et du mélibiose)

(Timson, 2007 et Pannala et al., 2010).

4.5- Métabolismes des di- et tri-saccharides Les disaccharides sont utilisés selon deux manières :

La première, où après avoir traversé la membrane plasmique le sucre est hydrolysé

dans le cytoplasme, c’est le cas pour le maltose.

La deuxième où les sucres sont hydrolysés dans l’espace périplasmique par l’invertase

pour le saccharose et le raffinose et par le mélibiase pour le mélibiose.

Ainsi les monosaccharides obtenus après hydrolyse sont utilisés par la levure comme

décrit précédemment.

4.5.1- Le lactose : est un disaccharide formé d’unité de galactose lié en β-1,4 à une

unité de glucose. Son hydrolyse conduit donc au galactose qui entre dans la voie

métabolique citée précédemment en faisant intervenir trois enzymes: kinase, transférase et

épimérase.


24

4.5.2- Le maltose : est un disaccharide constitué de deux unités de glucose liés en α-

1,4. Son hydrolyse par l’α-glucosidase donne du glucose qui entre dans la glycolyse. Son

transport est inactivé par la répression catabolique du glucose ainsi que l’inhibition de la

synthèse protéique en carence azotée (Brondijk et al., 2001).

4.5.3- Le saccharose : est un disaccharide constitué d’une unité de glucose liée en α-

1,2 à une unité de fructose. Son hydrolyse est assurée par l’invertase (β-fructofuranosidase).

Deux types d’invertase peuvent être rencontrée chez la levure : la première localisée dans le

cytoplasme et nécessite le transport du saccharose à travers la membrane plasmique pour

son hydrolyse (Stambuk et al., 1999) et la seconde est localisée dans l’espace périplasmique.

La forme cytoplasmique est exprimée de façon constitutive alors que l’expression de la

forme périplasmique est réprimée par de fortes concentrations en glucose (Carlson et

Botstein, 1982) et au contraire induite par de faibles taux de glucose (Ozcan et al., 1997).

4.5.4- Le tréhalose : est un disaccharide composé de deux unités de glucose reliées

entre elles par une liaison α-1,1 : α-D-glucopyranonyl-α-D-glucopyranoside. Il se caractérise

par son rôle de protecteur contre divers stress environnementaux et un rôle de sucre de

réserve à l’instar du glycogène. Son utilisation comme substrat carboné requiert une

tréhalase dite ‘acide’ codée par le gène ATH1 (Parrou et al., 2005).

4.5.5- L’isomaltose : est un disaccharide constitué de deux unités de glucose liées en

α- 1,6. Il est hydrolysé avec l’α-méthylglucoside, son analogue chimique, par des isomaltases

codés par cinq gènes (Naumov et Naumova, 2010 et Teste et al., 2010).

4.5.6- Le mélibiose : est un disaccharide constitué d’une unité de galactose liée en α-

1,6 à une unité de glucose. Son hydrolyse est assurée par une enzyme secrétée dans le

périplasme et appelée mélibiase et les sucres libérés sont transportés à l’intérieur de la

cellule par les transporteurs d’hexoses. Le glucose sera ainsi utilisé par la voie d’Embden-

Meyerhof et le galactose par la voie de Leloir.

4.5.7- Le raffinose : est un tri-saccharide constitué d’une unité de galactose, une

unité de glucose et une unité de fructose (α-D-galactopyranonyl-(1-6)-α-D- glucopyranosyl-

(1-2)-β-D-fructofuranose). Son hydrolyse se fait en deux étapes: la première utilise

l’invertase en libérant le fructose et du mélibiose et la seconde au cours de laquelle ce

dernier est dégradé par la mélibiase qui est une alpha-galactosidase codée par les gènes

MEL.

4.6- Métabolismes des pentoses Le xylose est un aldopentose majoritaire de l’hémicellulose qui représente 20 à 50% de la

biomasse végétale terrestre (déchets agricoles, produits dérivés du bois, etc.) (Gnangui,

2010) et constitue, après le glucose, le sucre le plus abondant dans la nature (Carvalho,

2013) qu’on retrouve dans de nombreuses plantes (Ali et al., 2010 ; Buckeridge et Goldman,


25

2011 ; Xu et Lou, 2012 ; Jayapal et al., 2013 et Zheng et al., 2013). La production du

bioéthanol à partir du xylose présent dans cette biomasse représente donc un enjeu

économique important puisque cette biomasse est renouvelable (Ragauskas et al., 2006). Le

L-arabinose est également présent dans les hydrolysats lignocellulosique, bien que moins

abondant. C’est ce qui a conduit ces dernières années, de nombreux chercheurs à s’orienter

vers ces glucides abondants et peu couteux. Ces deux pentoses (D-xylose et L-arabinose)

entrent dans la voie des pentoses phosphate après leur conversion en D-xylulose (figure 3)

et l’utilisation du xylose serait due à une xylitol deshydrogenase (Wenger et al., 2010).

Certaines souches de Saccharomyces cerevisiae peuvent pousser sur xylose comme seule

source de carbone, mais aucune n’est capable de le fermenter aussi efficacement que le

glucose (Attfield et Bell, 2006). Seul le xylulose, isomère du xylose peut être fermenté par

Saccharomyces cerevisiae. De nombreuses stratégies d’ingénierie métabolique ont été

employées au cours de ces années pour créer des souches de levures capables de fermenter

ces deux pentoses. Des enzymes hétérologues de la voie métabolique du xylose ont été

introduites chez S. cerevisiae (Kotter et al., 1990, Kuyper et al., 2003 et Kuyper et al., 2004).

Des efforts ont été également faits pour améliorer ou ajuster les activités enzymatiques de la

voie métabolique du xylose (XR, XK et XDH) (Jeffries et Jin, 2004 ; Toivari et al., 2004 et Van

Maris et al., 2007), le flux de la voie des pentoses phosphate (Jeppsson et al., 2002), ou

accroître l’utilisation du xylose par évolution dirigée ou mutagénèse aléatoire (Sonderegger

et Sauer, 2003 et Ni et al., 2007). Des méthodes d’ingénierie évolutive sont utilisées pour

améliorer la conversion de ces deux sucres en éthanol (Garcia-Sanchez et al., 2010 ;

Okamoto et al., 2012 et Kim et al., 2013).

En dépit du nombre des résultats obtenus, il apparaît que la construction de souches de

levures génétiquement modifiées capables de convertir efficacement le xylose et l’arabinose

en éthanol est un objectif difficile car il requiert de modifier les flux métaboliques de la

levure et ses équilibres redox et énergétiques. En revanche d’autres levures comme Candida

shehatae, Pachysolen tannophilus et Pichia stipitis peuvent convertir le D-xylose en éthanol

(Maleszka et Schneider, 1982 ; Lu, 2007 ; Agbogbo et Coward-Kelly, 2008 ; Dufour et al.,

2011 et Silva et al., 2012), mais elles présentent des performances fermentaires nettement

inférieures à celles de S. cerevisiae, ainsi qu’une forte sensibilité à l’éthanol et aux inhibiteurs

présents dans les hydrolysats (acide acétique par exemple). Ces limitations et ces contraintes

constituent une barrière à leur utilisation à l’échelle industrielle, mais elles ont été utilisées

pour caractériser les voies de l’utilisation du xylose dans la perspective d’utiliser leurs gènes.


26

Figure 3 : Schéma simplifié de la voie métabolique de la dégradation du xylose par les levures (Modifié de: Chu et Lee, 2007 ; Lee et al., 2012).

Abréviations : XR (Xylose réductase) ; XDH (Xylose déshydrogénase) ; XK (Xylulokinase) ; XI (Xylose isomérase) ; ADH (Acétaldéhyde déshydrogénase).

4.7- Métabolisme des polysaccharides Les polysaccharides nécessitent pour leur hydrolyse des enzymes extracellulaires que la

plupart des souches de levure, en particulier S. cerevisiae, ne possèdent pas. Cependant

d’autres enzymes hétérologues telles que amylases, cellulases, xylanases et pectinases, sont

exprimées chez S. cerevisiae afin qu’elle puisse fermenter un nombre de carbohydrates plus

large. Deux polysaccharides peuvent être utilisés : l’amidon qui est une ressource biologique

renouvelable importante et le glycogène qui représente un sucre de réserve et donc une

source d’énergie directement accessible pour la levure.

4.7.1- Amidon : est un polysaccharide constitué de deux homopolymères (l’amylose

et l’amylopectine) qui sont formés d’unités glucose liées en α-1,4 et ramifiées grâce à des

liaisons α-1,6 se distinguant par leur degré de polymérisation. L’amylose est très légèrement

ramifiée avec de courtes branches et est formée de 600 à 1000 molécules de glucose.

L’amylopectine est ramifiée avec de longues branches toutes les 24 à 30 molécules et est

formée de 10.000 à 100.000 unités glucose. L’exclusivité dans l’utilisation de ce

polysaccharide est réservée aux souches Saccharomyces cerevisiae var diastaticus, qui

possèdent des gènes codant la glucoamylase extracellulaire (1-4-α-D-glucohydrolase)

capable de métaboliser l’amidon. Ceci en plus de quatre espèces de Schwanniomyces qui

fermentent l’amidon en éthanol qui n’est pas utilisé totalement mais avec de faibles

concentrations (Stewart et Russel, 1983).


27

4.7.2- Glycogène : est un polymère formé d’unités de glucose liées en α-1,4 (pour les

chaînes principales) et des liaisons α-1,6 entraînant la structure ramifiée de ce

polysaccharide. C’est sous cette forme que certaines espèces, comme Saccharomyces

cerevisiae, stockent le glucose. C’est un sucre de réserve très important utilisé lors des

conditions stressantes.

4.8- Le transport des sucres Le transport des hexoses tels que le glucose et le fructose vers l’intérieur de la cellule

s’effectue par diffusion facilitée, un mécanisme passif sans apport d’énergie (Maier et al.,

2002), caractérisé par leur faible affinité pour le glucose (Km: 10 à 20 mM) et le fructose

(Km: 50 à 70 mM) (Serrano et Delafuente, 1974). Quand au galactose et au mélibiose, le

passage à travers la membrane plasmique se fait par l’intermédiaire d’un transporteur

inductible qui est réprimé par de fortes concentrations en glucose (Ozcan et Johnston,

1999). Cette activité de transport des hexoses est régulée par la disponibilité en azote

assimilable dans le milieu extérieur et par l’activité de synthèse protéique des cellules

(Busturia et Lagunas, 1986). Cette diminution d’activité correspondrait à une séquestration

des transporteurs membranaires par endocytose suivi d’une dégradation plus tardive de ces

transporteurs par protéolyse. Une addition d’azote assimilable en cours de phase

stationnaire permet de restaurer partiellement une activité de synthèse protéique et en

conséquence une réactivation des systèmes de transport des hexoses, restaurant ainsi une

certaine activité fermentaire (Bely et al., 1994). Toutefois cette restauration d’activité de

transport des hexoses peut s’effectuer en présence d’un inhibiteur spécifique de la

glycosylation des systèmes de transport (tunicamycine B), indiquant ainsi qu’une synthèse

De Novo des systèmes de transport n’est pas nécessaire pour une reprise de l’activité de

transport: ce résultat pourrait étayer le rôle d’une séquestration des systèmes de transport

des hexoses par endocytose dans le phénomène d’inactivation catabolique.

Le transport du xylose est assuré par deux systèmes de forte affinité et un de faible affinité

qui consiste en une diffusion facilitée (Gardonyi et al., 2003). Chez S. cerevisiae, le xylose est

transporté par les transporteurs d’hexoses mais avec une affinité moins forte que pour le

glucose, en plus le transport du xylose est inhibé par ce dernier (Saloheimo et al., 2007). En

revanche, le système de transport du L-arabinose est totalement différent de celui du xylose

malgré la ressemblance de leur catabolisme comme il a été démontré par Fonseca et ses

collaborateurs. Les deux transporteurs caractérisés sont très spécifiques à l’arabinose

(Fonseca et al., 2007).

4.9- Le transport des ions ammonium L’ion ammonium représente la source azotée la plus assimilée par la levure. Chez

Saccharomyces cerevisiae, par exemple, Dubois et Grenson ont montré l’existence de deux

transporteurs (perméases) pour l’ion ammonium qui possèdent des affinités différentes (Km:


28

0.2 et 2 mM respectivement). Ils ont également montré que ce transport s’effectue par

l’intermédiaire d’un uniport électrophorétique accumulatif permettant d’atteindre des

concentrations intracellulaires de l’ordre de 850 à 1000 fois la concentration extracellulaire

(Dubois et Grenson, 1979). Cette activité de transport nécessite la présence d’une source de

carbone énergétique pour être fonctionnelle. En revanche, elle est inhibée de façon non

compétitive par certains acides aminés comme l’arginine et l’aspartate (Roon et al., 1975 et

Egbosimba et Slaughter, 1987). Cependant et pour des raisons d’équilibre de charge de part

et d’autre de la membrane plasmique, l’entrée de l’ion ammonium est couplée à l’excrétion

d’un proton par la pompe ATPase de la membrane plasmique selon le mécanisme présenté

dans la figure 4.

Figure 4: Représentation schématique du fonctionnement de l’uniport électrophorétique accumulatif responsable de l’entrée de l’ion ammonium chez Saccharomyces cerevisiae.

4.10- Le transport des acides aminés Trois grands groupes de transporteurs d’acides aminés existent chez les levures: le

premier est un transporteur unique relativement aspécifique fréquemment appelé GAP

(General Amino Acids Permease) qui est réprimé quand les levures se développent en

présence d’ammonium. Le second groupe implique des perméases spécifiques pour chacune

des classes d’acides aminés (acides, neutres et basiques). Et le troisième groupe inclut des

perméases spécifiques de chaque acide aminé à haute affinité pour la molécule et sont

responsables de l’introduction des acides aminés qui ne peuvent pas être synthétisés de

novo par la cellule (Horak, 1986 et Garrett, 1989).


29

4.10.1- Le transporteur GAP

Il s’agit d’une protéine qui a très peu d’affinité pour les acides aminés et permet le transport des stéréoisomères D et L qui se trouvent en fortes concentrations dans le milieu. Cette perméase générale des acides aminés sert de convoyeur et est composée d’un complexe contenant trois polypeptides de poids moléculaire 53000, 45000 et 30000 daltons respectivement et d’une protéine périplasmique avec un poids moléculaire de 14000. Cette dernière partie est considérée comme responsable de la liaison avec les molécules d’acides aminés pour assurer leur transport à travers la membrane plasmique (Woodward et Kornberg, 1980). Pour Saccharomyces cerevisiae la GAP assure le transport de la plupart des acides aminés basiques et neutres (Grenson et al., 1970 et Darte et Grenson, 1975) et serait pour les acides aminés tels que la glycine, l’alanine, la phénylalanine, le tryptophane, la tyrosine (Greasham et Moat, 1973 et Cooper, 1982) et la proline (Lasko et Brandriss, 1981) la principale porte d’entrée. La GAP, dont la structure est mieux connue que celle des systèmes de transport spécifique, peut être inhibée et réprimée par la présence de l’ion ammonium.

4.10.2- les systèmes de transporteurs spécifiques

Les transporteurs spécifiques d’acides aminés, décrits pour la première fois par

Grenson et ses collaborateurs en 1966, ne semblent pas être inhibés par la présence d’ion

ammonium dans le milieu. Ainsi, chaque acide aminé possède son propre système de

transporteurs mais certains acides aminés peuvent être pris en charge par deux systèmes de

transport distincts, comme par exemple la L-Lysine (Keenan et al., 1982 et Kotyk et al.,

1982). Une forte compétition a été observée entre les acides aminés d’une part et les

différents systèmes de transporteurs d’autre part et ceci à cause du nombre important de

ces derniers. Ces systèmes de transport sont de type transporteurs actifs symports

(Ribereau-Gayon et al., 1998 et Salmon et al., 1998). En parallèle, d’autres travaux ont décrit

sept systèmes actifs antiport proton/acide aminé indépendants qui sont tous conduits par la

force motrice du proton, établie par hydrolyse de l’ATP. Ce transport peut être couplé aussi

à la diffusion de molécule K+ pour maintenir le gradient électrochimique de part et d’autre

de la membrane plasmique.

4.11- Transport des peptides et des polypeptides S’il est acquis que de nombreux di et tripeptides peuvent être utilisés par la levure (Payne

et Nisbet, 1981), ainsi que certains polypeptides comprenant jusqu’à cinq acides aminés

(Becker et al., 1973), peu d’informations sont disponibles sur les transporteurs des peptides

et des polypeptides même chez Saccharomyces cerevisiae.

5-Facteurs influençant le comportement des

levures Les capacités de croissance et de production des levures sont généralement affectées par les

conditions environnementales qui peuvent ralentir ou arrêter leurs activités (Sainz et al.,

2003). Parmi ces conditions: la température (Laluce et al., 2002 ; Aldiguier et al., 2004), le


30

pH, l’apport en oxygène, les apports nutritionnels (sels, vitamines, glucose, etc.) (Alfenore et

al., 2002 ; Voit, 2003 et Wang et al., 2007), le mode de conduite du procédé (Gibson et al.,

2007 ; Lei et al., 2007), la concentration en éthanol (Tagaki et al., 2005 ; Canetta et al., 2006 ;

Lei et al., 2007 ; Wei et al., 2007) et les coproduits dans le milieu de culture (Ferreira et al.,

2004 ; Gibson et al., 2007 et Hirasawa et al., 2007). Ces derniers, considérés comme des

substances inhibitrices, sont parfois difficiles à éviter puisqu’ils sont souvent substrats ou

produits de la réaction biochimique considérée (Gryta et al., 2000). La réponse de la levure

face à ces phénomènes de stress est dynamique avec ou non une capacité d’adaptation à ces

conditions (Attfield, 1997 ; Sonnleitner 1998 ; Henson, 2003 et Lacroix et Yildirim, 2007) et

ceci à différents niveaux (macroscopique, microscopique et moléculaire) telles que la

modification du métabolisme cellulaire, des capacités de croissance et des fonctions

physiologiques. Ces modifications s’étendent naturellement sur leur rendement et leurs

productivités.

5.1- Effet de la température La levure, comme les autres microorganismes, ne peut fonctionner que dans une gamme

de température «optimale» située entre 25°C et 30°C, jusqu’à une température critique au

delà de laquelle elle ne peut survivre. Dans la majorité des cas, la température ne reste pas

constante pendant la croissance. Les levures peuvent y résister, mais cette dernière peut

avoir des effets sur le métabolisme qui diffèrent d’une souche à une autre. Certains travaux

ont bien montré, chez certaines levures et en particulier chez S. cerevisiae, qu’une

température supérieure à 30°C accroît la vitesse de production de certains métabolites

comme l’éthanol (Aldiguier et al., 2004) mais augmente la sensibilité et accroît l’effet néfaste

des stress (chocs osmotiques, inhibition par l’éthanol) en entraînant une diminution de la

viabilité (Beney et al., 2001) et de l’activité cellulaire (Maréchal et al., 1999). En plus cette

élévation de température au dessus de la température maximale de croissance entraîne des

mutations et entraine également des modifications dans les protéines: certaines protéines

ne sont plus synthétisées alors qu’on note l’apparition d’autres protéines spécifiques

(Watson et al., 1987).

Toutefois, il a été démontré que la température de croissance influe sur la composition en

acides gras des membranes plasmiques (Watson et Rose, 1980). Ainsi la membrane

cytoplasmique des cellules cultivées à température élevée est plus résistante aux

dénaturations thermiques que celle des cellules cultivées à basse température.

5.2- Effet du pH Le maintien du pH cytoplasmique est indispensable à la survie de la levure et les limites

de leur pH reportées dans la littérature se situent entre 2,4 et 8,6 avec un pH optimal entre

4,4 et 6,5 (Jones et al., 1981). La nature de l’acide (forme dissociée ou non) a une grande

importance. Les levures supportent la plupart des acides organiques et sont inhibées par les

acides lactique, citrique et acétique et elles le sont encore plus avec les acides sorbique et

propionique. D’autres stress peuvent modifier ce pH comme il a été démontré par Jones et


31

ses collaborateurs (1981) où le stress éthanolique provoque une chute du pH cytoplasmique,

ce qui induit le décès cellulaire. Cette diminution du pH intracellulaire peut être due soit à un

influx de protons (Birch et Walker, 2000 et Kasemets et al., 2006) ou à une accumulation

d’intermédiaires de la réaction tels que l’acide acétique, le glycérol (Ferreira et al., 2004).

5.3- Effet de la pression osmotique et l’activité de l’eau La teneur en eau du milieu est importante à considérer. Certaines levures sont

osmotolérantes et supportent des aw de l’ordre de 0,65 comme de nombreuses levures

xérotolérantes telles que Zygosaccharmyces rouxii, Debarymyces hansenii, Hansenula

anomala, Pichia ohmeri, Schizosaccharomyces pombe et même plus allant jusqu’à 0,70

comme Zygosaccharomyces bisporus, Torulopsis candida, T. versatilis et T. etchellsii, valeurs

auxquelles aucun autre microorganisme ne peut se développer. Ces derniers marquent une

résistance importante mais avec un métabolisme lent (Leveau et Bouix, 1979). Toutefois,

l’influence de la pression osmotique est à relier à la nature des composés du milieu en

particulier les sels et à la température de résistance de ces levures. Leurs mécanismes de

résistance se manifeste par l’accumulation de polyols afin de minimiser la différence de

pression osmotique entre la cellule et le milieu et d’hydrater les polymères intracellulaire

grâce leurs groupements hydroxyles (Schobert, 1977).

5.4- Effet de l’oxygène et du dioxyde du carbone La concentration en oxygène dissous dans le milieu de culture est un paramètre

important qui va orienter (en fonction de la souche utilisée, du mode de conduite, etc.) le

métabolisme de la levure. L’oxygène intervient aussi dans la synthèse des stérols et de

l’acide nicotinique. Un apport faible en oxygène peut en effet augmenter la tolérance à

l’éthanol (Ryder et Sinclair, 1972 et Ryu et al., 1984). En revanche, la solubilité du dioxyde de

carbone peut être influencée par plusieurs facteurs tels que le pH et la température

(Aguilera et al., 2005). Ce dernier (CO2) présent dans le ciel gazeux du réacteur et produit in-

situ par les réactions biologiques, peut être dissous dans le milieu liquide sous forme d’acide

carbonique (H2CO3), lequel est dissocié en bicarbonate (HCO3-), carbonate (CO3

-2) et

hydrogène (H+) (Debs-Louka et al., 1999 et Garcia-Gonzalez et al., 2007).

Le CO2 peut être à la fois activateur et inhibiteur du métabolisme levurien (Kunkee et Ough,

1966 et Hirasawa et al., 2007). Il initie les voies anaplérotiques à faible concentration. Jones

et Greenfield (1982) ont montré que le rendement de conversion du substrat augmentait de

25% lors d’une croissance en aérobie sur glucose sous une pression partielle de 0,2 bar de

CO2. Par ailleurs, une augmentation trop importante de la pression partielle en gaz

carbonique semble entraîner une chute de la viabilité cellulaire (Ben Chaabane, 2006).

5.5- Effet de la concentration d’éthanol En fermentation alcoolique, l’éthanol semble représenter la principale cause de stress et

devient toxique à des concentrations allant de 8 à 18% (P/V) pendant la culture qui limite sa

production et ceci selon son état physiologique et selon les souches. Une fois la


32

concentration de l’éthanol augmente dans le milieu de culture, on assiste à une diminution

de la vitesse de croissance, de la viabilité cellulaire, de l’activité métabolique et de la

capacité de production de la levure. De nombreux travaux ont confirmés ces phénomènes,

en particulier chez Saccharomyces cerevisiae (Aguilera et al., 2006 ; Canetta et al., 2006 ; Hu

et al., 2006 ; Hirasawa et al., 2007 ; Kitagaki et al., 2007 ; Lei et al., 2007 ; Wang et al., 2007;

Watanabe et al., 2007 ; Wei et al., 2007).

5.6- Effet de l’acide acétique L’acide acétique, co-métabolite du métabolisme oxydo-réductif, semble plus toxique pour

la levure que l’éthanol (Ferreira et al., 2004) et a un effet inhibiteur sur la croissance

cellulaire en provoquant une diminution de la production de biomasse (Giannattasio et al.,

2005). En milieu acide, les acides faibles non dissociés peuvent diffuser à travers la

membrane plasmique, dans un environnement intracellulaire plus alcalin (cytoplasme) où la

dissociation a lieu (Imai et Ohno, 1995 ; Ferreira et al., 1997 et Pampulha et Loureiro-Dias,

2000).


33

Chapitre II : Utilisation industrielle des levures

Les levures sont les premiers microorganismes à avoir été utilisé par l’homme puisque la

production des boissons alcoolisées est documentée depuis 6 000 ans avant notre ère chez

les Sumériens et les Babyloniens. Elles sont également les premiers microorganismes à avoir

été observé au microscope par A. Van Leeuwenhoek. C’est également grâce aux levures que

Pasteur contribua à la fondation de la microbiologie et Büchner au développement de la

biochimie. Leur rôle historique dans le domaine de l’agroalimentaire ne s’est pas démenti et

elles interviennent de nos jours dans la fabrication de nombreux produits alimentaires

(brasserie, vinification, fromagerie, etc.) en occupant une place essentielle dans cette

industrie. Elles participent aussi à la revalorisation des déchets agricoles et industriels et à la

production des protéines, des enzymes, des lipides et des vitamines.

Actuellement, ces microorganismes sont largement utilisés dans les secteurs de la recherche

biomédicale et des biotechnologies en raison de leur double état de micro-organismes et

d’eucaryotes. Ainsi, des levures modifiées génétiquement produisent l’antigène de surface

du virus de l’hépatite B utilisé dans le vaccin anti-hépatite. D’autres produisent la sérum-

albumine humaine.

La facilité d’approvisionnement, de conservation et de mise en culture de ces

microorganismes ainsi que la variété des espèces et des souches disponibles sont des atouts

majeurs pour les enseignants et font intervenir les levures dans le domaine de la pédagogie.

Enfin la biologie des levures permet d’illustrer concrètement la plupart des principes

fondamentaux de la biologie dans des domaines variés: biochimie, microbiologie, génétique,

biologie cellulaire, biotechnologie, etc., et ceci avec un intérêt dans les secteurs industriels,

économiques et scientifiques les plus divers. C’est un organisme modèle, peu encombrant,

peu exigeant et peu coûteux. La figure 5 résume les principales utilisations de la levure qui

représente le microorganisme le plus exploité par l’homme. Je ne m’attacherai dans ce

chapitre à traiter que deux productions: celle de l’éthanol et des arômes. Deux métabolites

étudiés au cours de notre travail.


34

Figure 5 : représentation schématique des différents domaines

d’utilisation de la levure

A/ Production microbienne du l’éthanol

L’éthanol est un produit chimique industriel important pouvant avoir plusieurs destinés en

industrie chimique, pharmaceutique, cosmétique…etc. Aujourd’hui, il possède de nouveaux

potentiels en tant que biocarburant pour ses propriétés physico-chimiques compatibles avec

l’essence. C’est la raison pour laquelle, ces dernières années, sa production connaît un

intérêt considérable et un effort particulier est fait sur la recherche de nouveaux procédés

plus performants, notamment au niveau de la production d’éthanol par voie microbienne.

1- Intérêts de cette production Les biocarburants, dont l’utilisation date de la fin du 19ème siècle avec l’invention de

l’automobile, ont été jugés peu rentables et ont été rapidement écartés pendant plusieurs

années. Mais le prix du pétrole de plus en plus élevé et le problème économique actuel a fait

que la production de biocarburant a connu un regain d’intérêt ces vingt dernières années.

Parmi ces biocarburants qui sont multiples, l’éthanol produit par voie biologique (Farell et

al., 2006), constitue un additif des essences soit directement, soit sous forme de dérivés

oxygénés renforçant ainsi les propriétés antidétonantes. Ainsi l’augmentation de sa


35

production est actuellement considérée comme une stratégie visant à réduire le coût de

l’énergie (Maiorella et al., 1984). Plusieurs pays ont développé cette stratégie en le

produisant à partir de matières agricoles (biomasse) produites localement afin de diversifier

les sources énergétiques en développant une énergie renouvelable. C’est le cas notamment

de l’Amérique, en particulier les USA et le Brésil qui le produisent respectivement à partir du

maïs et de canne à sucre (Coelho, 2005). Et récemment l’union européenne, qui fixe comme

condition la réglementation de l’ajout de l’éthanol dans l’essence sans modification des

moteurs conventionnels.

Cette énergie qui est une alternative prometteuse au pétrole fossile (Bothast et Saha, 1997

et Zaldivar et al., 2001) est à la fois renouvelable et écologique et pourrait diminuer les

problèmes engendrés par les combustibles fossiles en particulier les émissions de gaz à effet

de serre. Des études ont montré que ces émissions sont réduites de 75 % quand un litre

d'essence est remplacé par un litre d'éthanol. L’intérêt de cette production a mené à de

nombreux progrès afin de réduire le coût des étapes des procédés de sa production,

notamment au niveau de l’étape de prétraitement et la distillation (Wyman, 2001). D’autres

efforts ont porté sur l’amélioration de l’étape de fermentation, notamment par la recherche

de souches plus résistantes aux différents stress rencontrés lors de la fermentation

alcoolique comme la température, la faible concentration en glucose et en particulier la

haute concentration en éthanol. De plus les sources de carbones utilisables ont été

améliorées et diversifiées (utilisation du pentose par exemple) dans le but d’augmenter le

rendement (Jeffries et Jin, 2004), d’autres dans le but de réduire la pollution qui fragilise

l’équilibre de notre environnement.

2- Procédés utilisés au cours de la fermentation De nombreux procédés ont été testés dans différents travaux en envisageant d’augmenter le

titre final et le rendement en éthanol dans le but de minimiser le coût d’exploitation de cette

énergie. En effet l’éthanol en tant que molécule chimique est produit principalement par

trois types de procédés: le batch, le fed-batch (ou semi-continu) et les procédés continus.

Les procédés batch et continu sont les plus utilisés à l’échelle industrielle.

2.1-Fermentation type batch C’est un procédé très simple où le bioréacteur est considéré comme un système fermé

contenant une quantité fixée de milieu de culture. Les microorganismes qui servent pour

l’inoculation ont déjà subi une phase d’adaptation. La culture en mode batch est

caractérisée par une productivité faible, limitée par les concentrations en biomasse liée à la

concentration maximale admissible en substrat évitant toute inhibition des capacités

fermentaires du microorganisme. Les performances dépendent des conditions de culture et

des substrats utilisés. Les rendements de conversion sont de l’ordre de 90 à 95% du

rendement théorique pour une concentration finale en éthanol de 10 à 16% (V/V) (Casey et

Ingledew, 1986).


36

2.2- Fermentation type fed-batch Ce terme a été introduit par Yoshida et ses collaborateurs (1973), il s’agit d’un dérivé du

mode batch où la culture est alimentée de façon séquentielle ou continue en éléments

nutritifs et substrats. La conduite permet ainsi d’atteindre de plus hautes concentrations en

biomasse et produits que le mode batch en évitant l’inhibition par la concentration en

substrat et la limitation en éléments nutritifs et en réduisant les effets toxiques des produits

par dilution lors des apports (Ward, 1989 et Roukas, 1994). La production d’éthanol, qui peut

être retiré au fur et à mesure de sa production, se déroule selon deux phases: une phase de

croissance cellulaire et de production d’éthanol et une phase de production sans croissance.

Les concentrations finales en éthanol ont atteint 19% (V/V) en 2 jours pour Saccharomyces

cerevisiae (Alfenore et al., 2002) et 20,8% (V/V) en 20 jours pour Saccharomyces sake

(Hayashida et Ohta, 1981).

2.3- Fermentation type continu Le réacteur en mode continu est un système ouvert, dans lequel le milieu de culture est

continuellement additionné et le milieu de fermentation qui contient les métabolites

produits, est continuellement extrait, avec un volume réactionnel constant dont le but de

maintenir les cellules en phase de croissance exponentielle et de production d’éthanol

(Ward, 1989). Elle permet l’obtention d’une productivité élevée (Vasconcelos et al., 2004),

facilite le contrôle du procédé et la maîtrise des rendements. Parmi les inconvénients de ce

mode de conduite est la limitation du taux de dilution afin d’éviter le lavage du réacteur ainsi

que l’inhibition du métabolisme (croissance et production) par les produits de la réaction

biochimique et la perte de viabilité. Cependant, plusieurs techniques ont été couplées telles

que l’évaporation, l’extraction avec des solvants et la filtration membranaire (Kargupta et

al., 1998).

3-Les substrats utilisés au cours de cette

production Une multitude de substrats, à faible coût et dont la majorité sont d’origine végétale comme

le canne à sucre, le blé, le maïs, le riz, le manioc, le sorgho, peuvent être fermentés, du

moment qu’ils contiennent une quantité importante de sucres assimilables. Parmi la réserve

glucidique contenue dans ces produits agricoles, le glucose et le fructose sont les sucres les

plus assimilables en particulier par l’espèce Saccharomyces cerevisiae, la plus connu et la

plus utilisée en fermentation alcoolique. Cependant, une part importante de la plante reste

encore inexploitée. C’est pourquoi, depuis quelques années, on s’est orienté vers la partie

lignocellulosique, abondamment présente dans les végétaux. Cette dernière se compose de

molécules très résistantes et difficiles à hydrolyser en molécules assimilables par les

microorganismes impliqués dans la fermentation alcoolique. Son hydrolyse libère

majoritairement du glucose, du galactose, du mannose, du xylose et de l’arabinose.


37

4-Les microorganismes utilisés au cours de cette

production Une grande variété de microorganismes produit de l’éthanol à partir des sucres. Les

bactéries produisent en plus d’autres alcools, des acides organiques, des polyols, des

cétones, ou des gaz (méthane, dioxyde de carbone, hydrogène, etc.). On cite quelques

souches de Clostridium qui peuvent avoir de bons rendements en éthanol. Cependant, seule

Zymomonas mobilis qui présente l’avantage d’être anaérobie stricte, est considérée comme

un strict producteur d’éthanol avec très peu de biomasse (Kosaric et Vardar-Sukan, 2001).

Mais les levures sont les microorganismes qui possèdent les meilleurs atouts et les meilleurs

potentiels pour cette production. Les plus utilisées sont Saccharomyces cerevisiae,

Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces sp présentant chacune

des avantages et des désavantages, notamment en fonction de la composition du substrat et

du procédé employé (Zaldivar et al., 2001). Cependant Saccharomyces cerevisiae reste la

préférée car elle offre une efficacité en terme de production et de croissance à bas pH

(jusqu’à 4), un facteur important qui évite les contaminations. En plus, cette levure

représente un modèle expérimental avec de nombreux avantages (la petite taille et le

séquençage de son génome, la facilité à sa manipulation génétique, et la disponibilité de la

littérature). Toutefois peu de microorganismes sont réellement compétitifs en termes de

rendement en éthanol par rapport au substrat consommé, de capacité fermentaire, de

tolérance élevée à l’éthanol et d’adaptation aux conditions de fermentation.

5-Inhibition et tolérance à l’éthanol L’éthanol, comme signalé précédemment, a un effet négatif aussi bien sur la croissance

cellulaire que sur la capacité fermentaire (D'Amore et Stewart, 1987). L’inhibition de la

croissance est effective autour de 20 g/L (Casey et Ingledew, 1986) et varie selon les souches

et les espèces. En revanche, l’inhibition de la capacité fermentaire est moins importante et la

production d’éthanol peut se poursuivre même après l’arrêt de la croissance.

La tolérance à l’éthanol est représentée par la capacité des levures à maintenir leur viabilité

à de fortes concentrations en éthanol. C’est un phénomène très difficile à étudier en raison

de l’absence de techniques universelles permettant sa quantification. Cependant, d’autres

valeurs sont utilisées telles que les valeurs relatives à la croissance cellulaire (Thomas et

Rose, 1979 et Beavan et al., 1982), à la vitesse spécifique de la production de l’éthanol

(Thomas et Rose, 1979) et à la viabilité cellulaire (Dombek et Ingram, 1987 et Birch et

Walker, 2000) ainsi que le flux de protons à travers la membrane plasmique (Jiménez et Van

Uden, 1985).

Les études réalisées dans ce domaine ont rapporté que l’accumulation de forte

concentration en éthanol augmente, chez la levure, la fluidité de la membrane plasmique qui


38

perd son intégrité (Cot, 2006), inhibe l’activité de l’ATPase de la membrane plasmique et des

enzymes de la glycolyse (Casey et Ingledew, 1986 et Salmon et al., 1998) et réprime le

système de transport du glucose ce qui perturbe ainsi le métabolisme et l’appauvrit en

énergie (Alexandre et al., 1998). D’autres travaux ont soulignés d’autres effets de ce stress

au niveau de la paroi comme la variation de sa composition en phospholipides, en ergostérol

et en acides gras (Alexandre et al., 1994 et Ding et al., 2009).

Cependant, les levures sont des microorganismes qui ont développé diverses stratégies pour

contrer les différents types de dommages produits par cet alcool (Ding et al., 2009). Parmi

elles, Saccharomyces cerevisiae qui présente les meilleurs atouts génétiques et

métaboliques et qui a toujours été considérée comme le producteur traditionnel d’éthanol:

la modification de la composition de la membrane plasmique en particulier en lipides

(Cot et al., 2007 ; Lei et al., 2007). A ce niveau, il a été précisé que les niveaux

d’acides gras insaturés (You et al., 2003), d’ergostérol et de phospholipides (Daum et

al., 1998 ; Swan et Watson, 1998 et Lei et al., 2007) peuvent être augmentés.

L’expression de facteurs qui stabilisent et/ou répare les protéines dénaturées en

faisant intervenir le tréhalose.

La synthèse des protéines impliquées dans l’expression des gènes liés au stress.

Ainsi que l’augmentation de l’activité de l’ATPase au niveau de la membrane

plasmique et la dismutase mitochondriale (Aguilera et al. 2006, Lei et al., 2007 et

Ding et al., 2009).

En effet, l’étude et la maîtrise de la tolérance en éthanol a non seulement des intérêts

fondamentaux pour les scientifiques, mais également une importance économique. C’est un

caractère de grande valeur économique en particulier pour l’industrie des biocarburants (Hu

et al., 2007), la raison pour laquelle, au cours de ces dernières années, les connaissances sur

la tolérance de la levure à ce stress a été très bien développée (Zhao et Bai, 2009). Et

beaucoup d’effort sont consacrés à la réaction de souches de levure qui tolèrent des niveaux

élevés d’éthanol (Piper, 1995 et Jeffries et Jin, 2004).

B/ Production microbienne des arômes

1-Définition Les arômes sont des préparations concentrées de substances aromatiques (odorantes ou

gustatives) destinées à être ajoutées à des solutions ou des denrées alimentaires afin de leur

donner ou renforcer une odeur et/ou un goût (Moll et Moll, 1990). Ils se traduisent

généralement par la présence, au sein d’une matrice complexe, de nombreux composés

volatils de diverses propriétés physico-chimiques avec des impacts sensoriels différents. Ils

sont classés selon leur structure chimique et répartis en 11 familles: alcools, aldéhydes,


39

cétones, acides, esters, lactones, composés soufrés, phénols, hétérocycles aromatiques,

hydrocarbures terpéniques et éther-oxydes (Omelianski, 1923).

2- Les différents types d’arômes

2.1- Les arômes naturels Ces composés naturels aromatisants peuvent être des préparations dont la composition

est plus ou moins bien déterminée ou des substances chimiquement définies (Moll et Moll,

1990). Ils sont obtenus soit à partir de matières végétales ou animales par extraction

(procédés physiques), soit par biotechnologie (procédés enzymatiques ou microbiologiques).

Dans le premier cas, l’extraction à partir de matières premières traditionnelles n’est pas

toujours rentable économiquement puisque les molécules naturelles recherchées sont dans

des mélanges complexes et à faibles doses. Cependant, le second cas pourrait permettre de

faire face à ces limitations vu que le développement récent des biotechnologies a fait ses

preuves et suscite une activité scientifique très importante ces dernières années (Mayer,

1991).

2.2- Les arômes de synthèse Les arômes de synthèse qui sont produit par voie chimique à partir de différentes

sources, se divisent en deux groupes : les arômes «nature-identiques» et les arômes

artificiels.

2.2.1- Arômes « identiques aux naturels »

Ces arômes possèdent une constitution identique à celle d’une substance présente

dans les produits naturels, mais ils sont obtenus par synthèse chimique ou isolés par des

procédés chimiques. Contrairement aux naturels, ces arômes ont une grande pureté qui leur

permet de présenter des caractéristiques organoleptiques bien définies, uniques et plus

régulières en résistant mieux aux températures élevées. De plus, cet état de pureté leur

assure un pouvoir aromatisant remarquable avec un prix très compétitif par rapport aux

substances naturelles, raison pour laquelle ils sont très utilisés et en très faibles quantités. Ils

sont très souvent employés pour améliorer certaines caractéristiques olfactives d’extraits

naturels qui sont très souvent altérés au cours de l’extraction (Mayer, 1990)

2.2.2- Arômes artificiels

Certains arômes, obtenus par synthèse chimique, n’ont jamais été identifiés dans la

nature (Etievant, 1991). Ils ne peuvent être utilisés que s’ils figurent sur la liste des

substances aromatiques autorisées. Celles-ci sont peu nombreuses, elles possèdent des

propriétés olfactives très intenses et leurs structures, dans certains cas, sont très proches

des molécules naturelles qui ont servi de point de départ pour leur élaboration. C’est le cas

de l’éthylvanilline qui possède une odeur proche de la vanille mais plus intense et dont le

prix est beaucoup moins élevé. Dans d’autres cas, la structure des arômes artificiels est

totalement différente, comme par exemple, le méthylphénylglycidate d’éthyle qui possède

un arôme rappelant celui de la fraise. Ces molécules de synthèse ont permis des avancés


40

spectaculaires dans la connaissance de l’aromatisation, mais actuellement une grande

tendance oriente le marché vers un retour au naturel.

2.3- Les arômes de transformation Ces arômes issus de la réaction de Maillard résultent d’un mélange de sucres et de

produits azotés afin de reproduire industriellement des notes de « viande », « poulet »,

« grillé », etc. Ces derniers sont utilisés par les industries agroalimentaires dans la

préparation des soupes, des sauces, des plats cuisinés, etc. (Fiess, 1995).

2.4- Les arômes de fumée Ces derniers sont obtenus par combustion de bois tels que le hêtre, bouleau, mesquite,

etc. Les fumées ainsi obtenues sont récupérées, condensées et utilisées dans la préparation

des sauces, des sauces barbecue, des chips, du saumon et de la charcuterie goût fumé

(Fiess, 1995).

3-Utilisation des arômes Les composés aromatiques étaient d’une grande importance dans la médecine

traditionnelle. En raison de leur activité biologique très élevée et de leur faible toxicité, les

composés aromatiques sont souvent utilisés dans les produits pharmaceutiques,

cosmétiques, particulièrement en parfumerie et dans le tabac.

Parce qu’ils possèdent des propriétés olfactives et gustatives bien définies, les arômes sont

aussi des additifs indispensables utilisés dans l’industrie alimentaire où ils participent

également à l’amélioration de la durée de vie des fruits transformés (Anese et al., 1997 et

Lanciotti et al., 2004). Les arômes alimentaires sont dépourvus de tout intérêt nutritionnel et

servent exclusivement à renforcer ou à améliorer le goût des aliments conférant ainsi aux

denrées alimentaires une saveur caractéristique (Mayer, 1991 et Aguedo et al., 2004) dans le

but de satisfaire le consommateur. Dans ce cas, ils peuvent soit modifier ou compléter le

profil aromatique d’un produit quelconque, soit aromatiser des produits

organoleptiquement neutres ou encore masquer des flaveurs désagréables comme les

produits issus du soja ou les concentrés protéiques.

4- Les arômes issus des biotechnologies Les méthodes classiques de production d’arômes naturels ne s’avèrent plus performants et

satisfaisants face à la demande croissante des industries alimentaires. L’extraction à partir

matières premières naturelles présente de nombreux inconvénients: la production agricole

est saisonnière et limitée, leurs qualités varient en fonction de facteurs incontrôlables

(conditions climatiques et géographiques) et le prix de revient est très élevé. La synthèse

chimique, quand à elle, ne convient plus aux consommateurs qui apprécient peu les

composés artificiels. La nécessité tant technique qu’économique de diversifier les voies


41

d’obtention des matières aromatiques ainsi que les progrès réalisés dans le secteur des

biotechnologies ont conduit à explorer puis à exploiter les possibilités offertes par celles-ci.

Effectivement, les arômes produits par les biotechnologies semblent être la réponse pour

faire face à ces difficultés (Mayer, 1991) et le fait qu’elles puissent bénéficier du label naturel

a été un élément déterminant dans l’intérêt suscité au cours des dernières années. De plus,

la stéréospécificité de certains systèmes enzymatiques microbiens permet d’accéder

aisément à des molécules optiquement actives, difficiles à obtenir par synthèse. Les

biotechnologies donnent de surcroît la possibilité de réaliser en une seule étape des

synthèses qui nécessitent souvent de nombreuses réactions, ce qui entraîne des rendements

faibles et variables (Peyvatin et al., 1986). Grâce aux progrès réalisés dans le domaine des

connaissances sur le fonctionnement des organismes vivants, le champ d’application des

procédés utilisant des microorganismes qui ont historiquement joué un rôle essentiel dans

l’élaboration de ces composés dans de nombreux aliments (vins, bière, fromage, etc.)

(Chandrasekaran, 1997), des enzymes purifiées ou même des cellules végétales dont

l’approche est basée sur la capacité biochimique et génétique de ces cellules (Scragg, 1997

et Kim et al., 2001) pour la production d’arômes a été considérablement élargi. La

multiplicité des espèces naturelles utilisables, la variabilité induite par des conditions de

culture et la variabilité supplémentaire induite par le choix des procédés réalisés dans le

domaine du génie génétique permettent de modifier les systèmes biologiques au niveau

moléculaire, ainsi il est possible d’obtenir d’une part des microorganismes recombinés ayant

de nouvelles propriétés métaboliques, d’autre part des enzymes capables de surproduire

certaines arômes (Lerch et Schilling, 1992).

Bien que ces arômes issus des biotechnologies soient plus chers que les nature-identiques,

ils restent toujours moins onéreux que de véritables extraits (Lerch et Schilling, 1992) et leur

nombre reste limité.

4.1- Les modes de production Les arômes produits par les biotechnologies sont parfois appelés «arômes néonaturels», ils

sont synthétisés par des systèmes enzymatiques proches ou identiques à ceux normalement

mis en jeu dans la matière première végétale. La voie la plus proche des systèmes

traditionnels consiste à synthétiser des substances aromatiques par bioproduction, c'est-à-

dire par voie de fermentation où la culture microbienne peut être améliorée par

l’optimisation des souches et des conditions de culture. Toutes ces molécules aromatiques

issues de fermentation résultent de réactions diverses telles que l’oxydation, la réduction,

l’estérification, l’hydrolyse, la décarboxylation, la méthylation, la condensation et

l’isomérisation. Ces réactions spécifiques effectuées par voie microbienne permettent de

simplifier une ou plusieurs des réactions nécessaires par synthèse chimique (Etievant, 1991).

La culture de cellules de plantes aromatiques in vitro a également été envisagée mais elle

présente des obstacles importants. L’expression des gènes contrôlant la production de ces


42

composés présente beaucoup de difficultés et les temps de croissance de ces cellules sont

trop élevés pour qu’elles soient appliquées à une production industrielle.

Enfin, il est possible d’utiliser des systèmes enzymatiques, particuliers et définis, connus

comme responsables de la production d’arômes dans les plantes. Ces systèmes

enzymatiques peuvent être utilisés in vivo dans les microorganismes ou bien in vitro après

avoir été isolés (Schreier, 1995). Dans les deux cas, les réactions mises en jeu sont simples et

unitaires, elles permettent la conversion d’un précurseur particulier naturel en une molécule

ou une série homologue de molécules aromatisantes. Ce mode de production n’est plus une

bioproduction mais une bioconversion. Il est important d’ajouter que pour synthétiser des

arômes par de tels systèmes enzymatiques, l’utilisation de «cellules entières» reste la plus

favorable car elle permet de réaliser des réactions pour lesquelles les enzymes impliquées

nécessitent des cofacteurs (NADH, NADPH, ATP, etc.). Cet avantage est capital car la

régénération des cofacteurs est souvent un obstacle à l’utilisation de nombreuses enzymes

purifiées et immobilisées sur support (Degorce-Dumas et al., 1984).

Fermentations, cultures de cellules végétales ou réactions enzymatiques sont autant de

procédés biotechnologiques très attrayants pour la production de substances aromatiques.

En effet, l’emploi de telles technologies permet d’une part de s’affranchir d’une matière

première souvent importée, parfois rare et coûteuses et d’une qualité peu constante et

d’autre part d’obtenir des produits pouvant bénéficier du label naturel (Etievant, 1991).

4.2- Les microorganismes utilisés Les microorganismes sont capables de produire de nombreuses molécules aromatiques,

certains d’entre eux sont utilisés traditionnellement à cette fin par les industries agro-

alimentaires. En effet, on exploite depuis 25 ans de façon plus ou moins empirique les

flaveurs complexes produites par les microorganismes au cours des processus fermentaires.

Ce n’est que récemment que l’on a envisagé de recourir aux microorganismes, aux cellules

végétales ou aux enzymes pour la production de composés d’arôme. Les cultures

microbiennes peuvent être utilisées soit spécifiquement pour l’application comme additifs

alimentaires ou in situ en tant qu’une partie de la fermentation. Il est aussi possible d’utiliser

leurs capacités pour produire des molécules pures à hautes concentrations qui entrent alors

dans la composition d’arômes «naturels». Les souches utilisées et qui peuvent être des

bactéries, des champignons filamenteux ou des levures, proviennent des écosystèmes

naturels ou des collections de cultures microbiennes. Des mutants, obtenus par des modes

de sélection classiques, ou même des souches transformées par génie génétique, sont

souvent préférées aux souches sauvages pour leur productivité améliorée (Belin et al.,

1992).

4.2.1- Les bactéries productrices d’arômes

Les bactéries sont depuis très longtemps connues pour la synthèse d’arômes et peut

s’effectuer selon deux voies différentes : la première correspond à la biosynthèse d’arômes à


43

partir de substrats métabolisés par la bactérie, la seconde à une bioconversion à partir de

précurseurs particuliers ajoutés dans le milieu de culture (Romero, 1992). Par ailleurs, une

étude menée par Gupta et ses collaborateurs (1992) révèle qu’il est possible d’obtenir des

arômes par culture mixte. Le diacétyl, arôme du beurre, est obtenu par la souche

Enterobacter cloacae qui convertit le glucose en un mélange acétoïne-diacétyl lorsqu’elle est

placée dans un surnagent de culture de Trichoderma reesei. Certaines bioconversions sont

intéressantes parce qu’elles permettent de bons rendements à partir de précurseurs peu

coûteux : Lactococcus lactis, par exemple, synthétise du diacétyl au cours du métabolisme

du citrate (Romero, 1992).

Les données bibliographiques concernant les capacités des bactéries à produire des arômes,

révèlent que les concentrations obtenues sont bien souvent inférieures à 100 mg/L, il

s’avère donc indispensable de faire appel à l’amélioration des souches afin d’accroître les

productivités. Les travaux de Kuila et ses collaborateurs (1971) révèlent qu’après traitement

à la nitrosoguanidine (NTG) associée aux UV, les capacités de Streptomyces diacetilactis, à

produire différents composés aromatiques, sont considérablement améliorées et à des taux

plus élevés. Cette même souche, traitée uniquement aux UV, subit des modifications qui

conduisent à l’obtention de mutants performants en termes de production du diacétyl.

4.2.2- Les champignons filamenteux producteurs d’arômes

Il existe également un grand nombre de mycètes producteurs d’arômes, déjà utilisés

pour donner directement leurs qualités organoleptiques aux produits de fermentation

(boissons alcoolisées, fromages, etc.). Ils offrent maintenant de nouvelles possibilités mais

leurs applications dans la synthèse d’arômes et d’enzymes sont encore récentes. Les

champignons les plus étudiés pour la production d’arômes sont les basidiomycètes et avec

près de 25 000 espèces, ils forment un groupe important considéré comme le plus évolué de

tous les mycètes. Ils sont aussi mieux connus du fait de leur taille macroscopique et de leur

intérêt dans le domaine de l’alimentaire. Leurs enzymes sont très utilisés dans des procédés

de bioconversion.

4.2.3- Les levures productrices d’arômes

Les levures et notamment Saccharomyces cerevisiae, utilisées en alimentaire depuis

des temps très anciens participent à l’amélioration du goût et de la flaveur de nombreux

produits comme la bière, le vin, le saké et le pain (Lerch et Schilling, 1992). L’augmentation

de ces productions d’arômes peut être réalisée par l’amélioration des souches de levures. En

effet, la sélection de mutants de S. uvarum, sur milieu enrichi en analogues d’acides aminés,

conduit à la surproduction d’alcools et d’esters dans la bière (Lee et al., 1995). De plus des

recombinaisons génétiques réalisées sur des levures de saké permettent d’obtenir de

meilleures productions d’alcools supérieurs (Anonyme, 1993).

Les bactéries et les levures présentent des avantages considérables par rapport aux

champignons, notamment dans leur facilité de mise en œuvre, leur connaissance biologique

plus approfondie, et la diversité des interventions génétiques réalisées sur ces


44

microorganismes. Toutefois les champignons filamenteux possèdent des potentialités de

biosynthèse très intéressantes en ce qui concerne les composés à noyau benzénique (Gros

et Asther, 1989).

4.3- Les composés volatils formés par les microorganismes Ces composés sont synthétisés par les microorganismes au cours des fermentations et

sont caractérisés par une note aromatique qui leur confère un intérêt d’application dans

l’industrie alimentaire en tant qu’additifs dans les crèmes, les glaces, les pâtisseries, les

boissons et en confiserie afin d’améliorer les qualités organoleptiques des aliments. Ils sont

utilisés également en industrie pharmaceutique et cométique en particulier en parfumerie

(Furia et Bellanca, 1971). Parmi ces derniers on peut citer les composés suivants:

A°) Acétaldéhyde : c’est une molécule intermédiaire de la fermentation alcoolique formée

par décarboxylation de l’acide pyruvique qui donne une odeur de pomme.

B°) Alcools supérieurs : ce sont des alcools à chaînes longues et complexes obtenus au

cours des fermentations par les microorganismes (levures) et qui ont des propriétés

organoleptiques très intéressantes. Parmi les principaux alcools figurent le propanol-1, le 2-

méthylpropanol (isobutanol), le 3-méthylbutanol, le 2-méthylbutanol-1 (alcools

isoamyliques). La synthèse de ces alcools dérive :

soit des cétoacides issus de la voie des sucres et notamment de l’acide pyruvique,

soit des α-cétoacides obtenus par la voie d’Ehrlich après désamination des acides

aminés correspondants (Parfait et Jouret, 1975).

Les α-cétoacides qui se forment par décarboxylation et réduction sont respectivement: α-

cétoisovalérianique, α-cétoisocapronique, α-céto-β-méthylisovalérianique. Les mêmes α-

cétoacides provenant des acides aminés contenus dans le milieu de culture, selon la voie

d’Ehrlich, sont obtenus par des réactions de transamination impliquant un autre α-

cétoacide (acide α-cétoglutarique) sur lequel le groupe aminique est transféré. L’alpha-

cétoacide est par la suite décarboxylé puis réduit en alcool supérieur correspondant

(Usseglio-Tomasset, 1989).

C°) Les esters : très appréciés pour les arômes fruités qu’ils fournissent

Acétate d’éthyle : est un ester formé entre l’acide acétique et l’éthanol et qui

donne une odeur éthérée piquante.

Acétate d’amyle : cet ester, qui a une note fruitée caractéristique de la poire, est

formé à partir de l’alcool correspondant associé à l’acide acétique.

Acétate d’isoamyle : se forme à partir de l’alcool correspondant associé à l’acide

acétique et donne une note fruitée caractéristique de la banane. Sa production a

été mise en évidence par de nombreuses études chez les levures telles que Pichia


45

anomala dans le vin par Rojas et ses collaborateurs (2001) et Hanseniaspora

uvarum.

Acétate du 2-phényléthyle : il provient de l’estérification entre l’acide acétique et

le 2-phényléthanol et donne une odeur de rose renforcée par une note fraîche

très fruitée. Le 2PEA est produit par des levures qui font partie des levures non

saccharomyces. Il a été décelé chez de nombreuses levures comme

Hanseniaspora guilliermondii dans le vin (Rojas et al., 2001).

Isovalérate de phényléthyle : c’est un ester qui est formé à partir de l’alcool

correspondant associé à l’acide isovalérique. Il a une odeur de rose renforcée par

une note de miel.

D°) Les acides :

Acide acétique : il est issu de l’oxydation de l’éthanol.

Acide 2-phénylacétique : c’est un acide avec une odeur de rose qui résulte de

l’oxydation du 2-phényléthanol.

Parmi les composés volatils d’origine microbienne, trois seront étudiés au cours de ce

travail le 2MB (2-méthylbutanol), le 3MB (3-méthylbutanol) et le 2PE (2-phényléthanol).

Je m’attarderai sur ce dernier car c’est un composé très utilisé actuellement et dont la

production par voie microbienne est en expansion.

4.4- Le 2-phényléthanol (2PE) 4.4.1- Intérêt et propriétés physiques du phényléthanol

Le phényléthanol est un alcool benzénique qui présente une odeur douce de rose avec

des notes de jacinthe et un goût légèrement amer puis sucré rappelant celui de la pêche. Il

est, après l’éthanol, l’un des principaux alcools d’un point de vue commercial, au même titre

que l’alcool benzylique (Welsh et al., 1989). C’est un agent antimicrobien avec un effet

antiseptique et désinfectant (Corre et al., 1990). Grâce à ses propriétés conservatrices et son

odeur, il est le plus utilisé des fragrances en parfumerie alcoolique et en cosmétique. Il entre

donc dans la composition de nombreux parfums à des teneurs allant de 5 à 20%. En

revanche, en alimentaire, il n’est utilisé qu’à des concentrations de l’ordre de 1 à 3 ppm dans

les boissons alcoolisées, les crèmes glacées, en confiserie, en pâtisserie, etc. (Lugay, 1986 et

Anonyme, 1999).

Les propriétés physico-chimiques de ce composé est résumé comme suit :

Nom: alcool phénéthylique ou phényléthanol.

Synonymes: Benzèneéthanol, Benzylcarbinol.

Aspect: liquide visqueux incolore.

Formule: C8H10O.


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Poids moléculaire: 122,17 g/mol.

Densité: 1,02 à 25°C.

Point d’ébullition: 220-222°C.

Solubilité dans l’eau: faible.

Caractéristique: odeur de rose.

4.4.2- Sources de phényléthanol naturel

A°) Origine végétale

Le phényléthanol a été retrouvé dans de nombreuses plantes aromatiques. Il a été

identifié dans les huiles essentielles de narcisse, de jacinthe, de géranium Bourbon, de pin

d’Alep et particulièrement dans les huiles de Rosa centifolia. On le retrouve à des teneurs

allant de 1-5% à 55%. Par ailleurs, une absolue de rose, obtenu par traitement chimique de

boutons floraux de roses, peut contenir jusqu’à 60% de phényléthanol (Pillivuyt, 1991 et

Savina et al., 1999). Malgré le coût élevé d’un tel arôme, la demande en phényléthanol

naturel, extrait de sources végétales, reste supérieure à l’offre. En conséquence, et afin de

pallier à ce manque, l’industrie aromatique se tourne de plus en plus vers la production

d’arômes par voie biotechnolgique.

B°) Origine microbienne

De nombreux travaux ont mis en évidence certaines bactéries qui produisent du

phényléthanol comme Microbacterium sp qui le produit sur milieu liquide à base de

« trypcase de soja », Brevibacterium linens qui le synthétise en dégradant la phénylalanine

(Jollivet et al., 1992) et par plusieurs souches de Xanthobacter (Hartmans et al., 1989). Cette

production est également observée chez les champignons du genre Polyporus, phellinus,

Penicillium (Welsh et al., 1989) et même Aspergillus niger (Wani et al., 2010). Une étude

réalisée sur Polyporus benzoinum montre que cette souche synthétise jusqu’à 360 mg/L de

2-phényléthanol (Fabre et al., 1996).

Certaines levures et notamment Saccharomyces cerevisiae produisent aussi du

phényléthanol qui entre dans la composition des flaveurs des boissons alcoolisées (bière,

saké, etc.). Il a été démontré, par les travaux de Hanssen et ses collaborateurs (1984) qu’une

souche de Kluyveromyces lactis produit environ 70 composés volatils parmi eux le

phényléthanol dont la concentration atteint 240 mg/L après 17 jours d’incubation. Par

ailleurs, les travaux de Jiang (1995) réalisés sur une autre souche de K. lactis CBS 5670

confirment cette production, mais à une concentration de 72 mg/L après une incubation de

5 jours seulement. Ceux de Liu et ses collaborateurs (2012) confirment cette production chez

Hanseniaspora uvarum. De plus d’autres levures comme Hansenula anomala, Kluyveromyces

marxianus et S. cerevisiae ont montré un fort potentiel pour la production du phényléthanol.


47

Dans la plupart des cas cette production dérive de la bioconversion de la phénylalanine

(Fabre et al., 1998 et Starck et al., 2002). La plupart des études réalisées sur la production

du 2-phényléthanol par les levures montrent que les concentrations ne dépassent

généralement pas les 100mg/L, cependant les travaux d’Albertazzi et collaborateurs (1994)

révèlent l’existence d’autres souches de S. cerevisiae et Hansenula anomala qui sont

capables de produire plus si on augmente la quantité du phénylalanine et des souches de

Pichia pastoris et de Kloeckera saturnus qui poursuivent la conversion de la phénylalanine

au-delà du phényléthanol conduisant à l’ester (le 2-phénylacétate).

Les effets inhibiteurs du 2-phényléthanol ont déjà fait l’objet de nombreuses études chez

d’autres espèces de levures afin de lever cette inhibition liée à une concentration critique

responsable non seulement de la bioconversion partielle de la phénylalanine mais aussi de la

diminution du pourcentage de viabilité de la souche au cours du temps (Fabre et al.,1997).

Cette sensibilité pose un véritable problème et a poussé les chercheurs à adopter d’autres

stratégies afin d’obtenir des concentrations économiquement intéressantes. L’amélioration

de la tolérance de la souche vis-à-vis du phényléthanol a été notamment recherchée en

utilisant un chemostat et en optimisant la composition du milieu et des conditions de culture

(Fabre et al., 1997). Mais les résultats n’étaient pas très concluants car il est difficile de

poursuivre la bioconversion au-delà d’une concentration critique de 3,1 g/L d’arôme.

Une seconde alternative repose plus sur l’élaboration d’une technique permettant de

détourner cette inhibition par l’extraction de l’arôme visant à améliorer la production en 2-

phényléthanol (Fabre et al., 1995 et Serp et al., 2003). Parmi ces travaux on peut citer

l’utilisation du polypropylène glycol 1200 afin d’éliminer en continu le 2-phényléthanol à

partir du milieu de fermentation (Etschmann et Schrader, 2006).

5-problématiques de production microbienne des

arômes La production des arômes par les microorganismes s’est révélée limitée. Les études réalisées

dans ce sens ont montré que l’arrêt de la biosynthèse des arômes peut être occasionné par

leur propre accumulation dans le milieu qui exerce une inhibition de l’activité ou une

répression de la synthèse des enzymes impliquées dans la voie biosynthétique du

métabolite. Ceci réduit la tolérance des levures ainsi que la concentration du produit final.

Pour améliorer cette productivité et pallier à ces inconvénients plusieurs stratégies ont été

étudiées et il s’avère que la récupération du produit in situ a connu un grand succès.

Plusieurs méthodes d’extraction ont été proposées telles que la distillation à la vapeur,

l’extraction par des solvants, l’extraction par des fluides supercritiques (FSC), l’extraction par

adsorption sur support, l’extraction par inclusion dans des cyclodextrines, l’extraction par

des procédés membranaires, l’extraction par micro-ondes, etc.

Bien que l’industrie des arômes se soit développée grâce au perfectionnement des

méthodes d’extractions, ces dernières présentent toutes des inconvénients. Certaines ne


48

résolvent pas tous les problèmes légaux d’innocuité ou de préservation des qualités

aromatiques, d’autres conduisent souvent à des produits dégradés par la chaleur ou

modifiés par les réactions secondaires avec les solvants d’extraction. Cependant, des levures

naturellement résistantes peuvent résoudre ce problème et permettent de faire face à ce

phénomène d’inhibition et d’augmenter ainsi la productivité.

MATERIEL ET METHODES

Matériel et Méthodes

50

1- Matériel biologique Différents isolats de levures ont été obtenus à partir de plusieurs échantillons

biologiques récoltés en Algérie: des fruits tels que les dattes, le melon et le cornichon,

différents types de laits et de miel. La liste des échantillons et leur région de provenance

sont représentées dans le tableau 2 et la figure 6.

Tableau 2 : Provenance des échantillons biologiques utilisés pour l’isolement des

levures.

Echantillons Variétés Nombre d’échantillon (s) Régions

Dattes Deglet-Nour 1 Ghardaïa

Gharass 1 Bechar

Hamira 1 Ouargla

Laits Lait de vache 2 Ghardaïa et Oran

Lait de brebis 2 Ghardaïa et Oran

Lait de chèvre 2 Ghardaïa et Ain

Temouchent

Lait de chamelle 3 Ghardaïa, Bechar et

Ouargla

Melon Cantalou 1 Oran (marché)

Miel Miel d’Acacia 1 Sidi Lakhdar

(Mostaganem)

Cornichon Délicatesse 1 Oran (marché)


51

Figure 6 : Localisation géographique des régions de récolte des différents échantillons

biologiques

2- Méthodes d’isolement des levures L’isolement a été réalisé selon la méthode préconisée par Ducastelle et Lenoir en 1965

(Ducastelle et Lenoir, 1965). Elle varie en fonction de la consistance de l’échantillon.


52

2.1- Isolement à partir des échantillons solides

Ces échantillons sont le cornichon, le melon et les trois variétés de dattes (Deglet-Nour, Gharass et Hamira) qui proviennent de trois régions différentes (Tableau 2). La chair du melon, le cornichon et les dattes dénoyautées sont broyés et homogénéisés séparément dans des mortiers stériles. Un gramme de chaque pâte est prélevé et dissout dans une solution stérile de citrate de sodium à 2% préalablement chauffée à 45°C afin de la ramollir, de dissoudre ses constituants et de libérer les cellules microbiennes.

2.2- Isolement à partir du lait Les différents échantillons de lait (Tableau 2) ont été recueillis directement auprès des

éleveurs, puis répartis dans des tubes et placés dans une étuve à 30°C. Après coagulation

sous l’effet de la flore lactique endogène, les tubes sont quotidiennement suivis jusqu’à

l’intervention des levures révélée par leur odeur caractéristique.

2.3-Isolement à partir du miel L’échantillon utilisé provient de Sidi-Lakhdar de la région de Mostaganem (Tableau 2). Ce

dernier est directement introduit dans la solution de citrate de sodium à 2% tiède.

La présence des levures dans tous ces échantillons est d’abord confirmée par observation

microscopique directe sur un frottis fixé à chaud, dégraissé au xylène et coloré au violet de

Gentiane (Guittonneau et al., 1939).

0,1 ml de chaque échantillon, contenant des levures, est ensuite étalé sur milieu OGA

(0,5% Yeast Extract et 2% Glucose) rendu sélectif par un pH acide (5 à 5,6), par l’ajout de

deux antibiotiques (Chloramphénicol à 0,5mg/ml et Oxytétracycline à 0,1mg/ml) et d’un

antifongique (thiabendazole à 3mg/L) car ces aliments contiennent, en plus des levures, des

bactéries et des moisissures (Vergeade et al., 1976 et Bouix et Leveau, 1980). Les boites sont

ensuite incubées à 30°C.

A partir de chaque boîte contenant une centaine de colonies, six colonies sont prélevées

au hasard, ensemencées chacune sur d’autres boîtes contenant le même milieu et incubées

à la même température. Après isolement, les isolats de levures ont été purifiés par

technique d’épuisement et conservés sur milieu « Sabouraud-Chloramphénicol » (1%

Bactopeptone, 2% Glucose) en gélose inclinée à 4°C afin d’éviter d’éventuelles

contaminations par des bactéries. Des repiquages réguliers sont effectués tous les trois mois

(Schmidt et Lenoir, 1978). Pour une conservation plus longue, les isolats sont conservés à –

80°C dans leur propre milieu de culture dilué de moitié avec une solution stérile de glycérol

40%.


53

3- Méthodes d’identification des souches de levures

3.1-Méthode conventionnelle L’identification des levures, selon les méthodes conventionnelles, repose sur la

détermination de divers caractères morphologiques et physiologiques (Lodder, 1971 ;

Barnett et Pankhurst, 1974 ; Schmidt et al., 1979 et Schmidt, 1984).

Les critères morphologiques comportent l’aspect de la cellule, l’aptitude à former de vrais

filaments mycéliens et à la sporulation, ainsi que l’apparence des cultures en milieu liquide

et sur milieu solide. Parmi les critères physiologiques, figurent l’assimilation de divers

composés azotés, l’assimilation et la fermentation de différentes sources de carbone, et la

résistance à certaines conditions défavorables du milieu de culture (présence

d’antibiotiques, absence de vitamines, etc.). Ces méthodes sont sûres, mais leur mise en

œuvre est longue et difficile, les lectures s’étendant parfois sur plusieurs semaines. Ceci

nous a amené à nous orienter vers une méthode moléculaire, universellement applicable qui

est la PCR sur histone.

3.2- PCR sur histones Cette technique a été utilisée par P.J. L. Bell en 2004 sur plusieurs souches de levures

(Bell, 2004).

3.2.1- Extraction de l’ADN génomique

L’ADN génomique des dix huit isolats retenus (cf. 1er paragraphe-Résultats et

discussion) ainsi que celui des 6 souches contrôles a été extrait après culture toute une nuit

sur milieu complet YPD liquide (1% Yeast Extract, 1% Bactopeptone et 2% glucose). Les

souches contrôles appartenant à l’EAD5/LISBP/INSA de Toulouse sont :

Deux souches de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK122-2N (souche diploïde) et BY

4741 (souche haploïde);

Yarrowia lipolytica;

Saccharomyces pombe;

Kluyveromyces lactis;

Pichia guilliermondi.

Les ADN génomiques ont été extraits en utilisant le kit Masterpure Yeast DNA

purification kit de chez Epicentre (Ref MPY 80200). 300µl de chaque culture sont centrifugés

et le culot est resuspendu de façon énergique dans 60µl d’une solution de lyse. Les mélanges

ainsi obtenus sont placés au bain-marie à une température de 65°C pendant 15 minutes puis

dans la glace pendant 5 minutes. 30µl de solution de précipitation sont ensuite ajoutés et la

solution est mélangée par inversion du tube pendant 2 minutes.


54

Après une centrifugation de 10 minutes, le surnageant est récupéré dans un autre tube et

100µl d’isopropanol sont ajoutés afin de précipiter l’ADN. Après une nouvelle centrifugation

de 10 minutes le culot est lavé avec 200µl d’éthanol à 70%. Le tube est séché et le culot

d’ADN repris dans 25µl de TE (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, pH8). De la RNase (5µg/µl, 1

heure à 37°C) est ajoutée afin d’éliminer les ARNs qui pourraient être gênants pour voir

l’amplification de petits produits PCR. L’ADN génomique ainsi préparé est conservé à -20°C.

3.2.2- Amplification par PCR

La réaction de PCR se fait dans un volume final de 50µl:

5µl de tampon de réaction (10X) ; 5µl de dNTPs à 2,5 mM et 5µl de chaque amorce à 2,5µM

(Tableau 3) auquel on ajoute 0,5µl de pHFusion High-Fidelity DNA polymerase (Ref M0530L).

L’ADN génomique préalablement préparé (voir ci-dessus) servira de matrice (100ng). Le

programme de PCR est le suivant : étape initiale de dénaturation (98°C, 10 s), puis trente

cycles incluant les étapes: dénaturation (98°C, 10s), hybridation (44°C, 30s), élongation

(72°C, 1min 30s) et élongation finale (72°C, 5min). 5µl de produit PCR sont ensuite déposés

sur gel d’agarose (1,5% d’agarose, TAE) pour vérification.

Tableau 3: Le nom et les séquences des amorces utilisées pour l’amplification

des histones H3 et H4 (Bell, 2004)

Nom des amorces Séquences des amorces

H3R2CERE CTCTCAAGGCAACAGTACCTGG

H3R2YEAS CTCTCAAGGCNACNGTNCCNGG

H4R1CERE GATAGCTGGCTTAGTGATACC

H4R1YEAS GATAGCTGGYTTNGTNATNCC

3.3- Identification moléculaire au CIRM Nous nous sommes orientés vers le Centre International de Ressources Microbiennes

(CIRM, Thiverval Grignon, Paris) pour réaliser l’identification moléculaire de nos isolats dont

le nombre a été réduit à dix (cf 1er paragraphe-Résultats et discussion). Cette taxonomie

moléculaire utilise la procédure mise au point par Kurtzman et Robnett (Kurtzman et

Robnett 1997 et Kurtzman et Robnett, 1998) qui est basée sur l’amplification par PCR et

séquençage des amplicons du domaine D1/D2 de la région 26S de l’ADN ribosomique. Les

espèces ont été identifiées par une recherche Blast de D1/D2 séquences déposées dans la

base de données GenBank.


55

4- Milieux et conditions de culture

4.1- Milieux de culture Les milieux qui ont été utilisés pour réaliser les différentes études sur ces souches de

levures sont les suivants :

Le milieu complet YP (1% Yeast Extract, (BIOKAR), 1% Bactopeptone, (DIFCO)) auquel

sera ajouté le sucre à une concentration de 2% (glucose (YPD), fructose (YPF),

saccharose (YPS), lactose (YPL)) et de l’agar à une concentration de 2% si le milieu est

utilisé à l’état solide.

Le milieu synthétique minimum YN (0,17% de Yeast Nitrogen base sans acides

aminés et sans sulfate d’ammonium (DIFCO), 0,5% de sulfate d’ammonium)

tamponné à un pH 5 avec un mélange acide succinique (1,35%)/soude (0,65%). Le

sucre utilisé est ajouté à une concentration de 2% (glucose (YNB), xylose (YNX)). Dans

le cas où ce milieu est utilisé à l’état solide de l’agar à 2% est alors ajouté.

Ces deux milieux sont directement autoclavés à 120°C pendant 20 minutes.

Un milieu minéral synthétique, MMS (Verduyn et al., 1992), dans lequel l’apport de

tous les éléments nutritifs peut être contrôlé. Ce dernier est composé de quatre

solutions qui sont préparées séparément et stérilisées différemment :

- solution 1 : 5g (sulfate d’ammonium), 3g (KH2PO4) et 0,5g (MgSO4) dans 900ml

d’eau distillée.

- solution 2 : 20g (Source de carbone) dans 100ml d’eau distillée.

- solution 3 : on mélange 1,5g (EDTA di-sodium) à 0,45g (ZnSO4, 7H2O) dans 75ml

d’eau distillée où le pH est ajusté à 6 avec du NaOH 1M. Cet ajustement doit être fait

après l’ajout de chacun des éléments suivants : 0,1g (MnCl2, 4H2O), 0,03g (CoCl2,

6H2O), 0,03g (CuSO4, 5H2O), 0,4g (Molybdène di-spodique (Na2MoO4, 2H2O)), 0,45g

(CaCl2, 2H2O), 0,3g (FeSO4, 7H2O) et 0,1g (Acide borique(H3BO3)). Le volume est

ensuite complété avec de l’eau distillée.

- solution 4 : on dissout 10mg de d-Biotine dans 5ml de NaOH 0,1M, puis le volume

est complété avec de l’eau distillée à 75ml et on ajuste le pH à 6,5 avec HCl 1M. Ce

pH doit être maintenu après l’ajout de chacun des constituants suivants afin de

faciliter leur dissolution : 100mg de Ca (D+) pantothénate, 100mg d’acide nicotinique,

250mg (My-Inositol), 100mg (Thiamine HCl), 100mg (Pyridoxal HCl) et 20mg (Acide

paminobenzoïque).

La solution 1 est autoclavée à 120°C pendant 20 minutes, la solution 2 est autoclavée à

110°C pendant 30 minutes et les solutions 3 et 4 sont filtrées (0,2µm) et conservées à 4°C à


56

l’abri de la lumière. Le milieu MMS est alors préparé en mélangeant les solutions 1 et 2 à 1

ml de chacune des solutions 3 et 4.

4.2- Conditions de culture 4.2.1- Pré cultures

Les pré-cultures utilisées au cours de ce travail sont réalisées dans le milieu désigné pour

l’expérience (YPD, YNB ou MMS) en tube (3ml) ou en Erlenmeyer si la pré-culture est

destinée à l’ensemencement d’un fermenteur. Cette pré-culture doit être fraîche et réalisée

à partir de colonies isolées (conservées sur gélose) et est incubée à une température de 30°C

sous agitation (100 rpm).

4.2.2- Cultures

4.2.2.1- Cultures sur milieu solide

Afin d’évaluer les exigences nutritionnelles de ces souches, deux milieux ont été

utilisés. Un milieu complet (YPD) et un milieu minimum (YNB). La lecture des résultats se fait

pendant trois jours à une incubation de 30°C pour noter d’éventuels changements.

4.2.2.2- Cultures en fioles Erlenmeyer

Les cultures réalisées dans ce travail ont été faites dans des fioles Erlenmeyer non

bafflées remplies au 1/10 afin de réduire le problème de transfert d’oxygène. Leur

incubation se fait à 30°C avec une agitation d’environ 200 rpm sur table agitante. Deux

milieux ont été utilisés (YPD et MMS) afin de suivre la croissance des souches sélectionnées.

Des prélèvements sont réalisés à différentes phases de croissance et des dosages effectués

par HPLC afin de comparer la production de trois métabolites (éthanol, glycérol et acétate)

ainsi que la consommation du sucre pour suivre la dynamique physiologique de ces cultures.

4.2.2.3- Culture en fermenteur

La souche utilisée au cours de cette fermentation est Issatchenkia orientalis, isolée

à partir du lait de chamelle. La pré-culture est réalisée dans 50ml de YNB (2% de Glucose:) et

incubée à 30°C pendant 12h sous agitation (100 rpm). Cette pré-culture (taux

d’ensemencement de 10% (V/V)) a servi à ensemencer 1L de milieu YNB contenu dans un

bioréacteur de 2L. L’ensemble est stérilisé à l’autoclave (120°C, 20mn) sous une pression

relative de 1 bar.

Cette fermentation en mode batch a été réalisée dans un fermenteur SARTORIUS, Biostat B

Plus (figure 7). Le pH est ajusté à 3 à l’aide d’une solution d’ammoniaque à 14% (V/V). La

température de la fermentation est maintenue à 30°C grâce à un baffle chauffant et un

système de refroidissement (en double cloison). Le bioréacteur a été balayé en permanence

par de l’air à un débit de 0,1L/mn. La vitesse d’agitation est fixée à 400 rpm jusqu’à ce que

pO2 atteigne 20%, puis augmentée pour éviter toute limitation d’oxygène dans le milieu. Ces

systèmes sont connectés à un ordinateur et un programme informatique qui réalise en ligne

l’acquisition des paramètres contrôlés (taux d’agitation, pH, température, débit d’air et

pression partielle de l’oxygène dissous) (figure 8). Cette culture est suivie et des


57

prélèvements, à travers un septum prévu à cet effet situé au centre du bioréacteur, sont

effectués toutes les heures pour des dosages hors ligne (glucose, éthanol, glycérol et

acétates).

Figure 7: Le fermenteur utilisé : SARTORIUS, Biostat B Plus.

Figure 8: Fermenteur SARTORIUS, Biostat B Plus avec son système d’acquisition pour le

contrôle des différents paramètres de la croissance


58

5- Analyse phénotypique

5.1- Etude des caractères culturaux L’étude des caractères culturaux des cinq souches retenues (C. lusitaniae, H. uvarum, K.

ohmeri, I. orientalis et T. asahii) (cf. 1er paragraphe-Résultats et discussion) nous a conduits à

examiner l’aspect des cultures en milieu liquide et sur milieu solide après incubation à 30°C.

5.1.1- Caractères culturaux en milieu liquide

L’ensemencement des souches précédemment identifiées est réalisé sur milieu YPD

liquide réparti dans des tubes à essai avec des cloches de Durham. L’aspect de la culture de

chaque souche est soigneusement noté, on observe:

la présence de dépôt au fond du tube ainsi que son aspect (fin, modéré ou épais).

la présence de voile ou de pellicule en surface.

la production de gaz.

5.1.2- Caractères culturaux sur milieu solide

La culture de ces souches sur YPD gélosé (même période et même température

d’incubation) nous a permis de définir la forme, la couleur et l’aspect des colonies.

5.2- Etude des caractères morphologiques Cette étude a pour but l’examen microscopique de la forme des cellules, des différentes

organisations qui peuvent exister chez les levures et de «spores» asexuées ainsi que le mode

de reproduction végétative. Elle est réalisée sur des cultures fraîches en YPD liquide

incubées sous agitation à l’état frais, lutées à la paraffine (Bourgeois et al., 1996). Par contre

l’organisation des cellules de levure et les «spores» asexuées sont recherchées par

observation sur un fragment de colonie prélevé sur YPD solide.

5.3- Effet de quelques stress sur la croissance des souches retenues Les expositions aux différents stress sont réalisées sur des cellules en pleine phase

exponentielle de croissance avec deux répétitions et ceci afin d’évaluer les performances de

nos souches.

5.3.1- Effet de la température

Afin de mettre en évidence l’effet du stress thermique sur ces souches, ces dernières sont

ensemencées sur YPD solide puis placées dans des étuves à quatre températures différentes

(25°C, 30°C, 37°C et 40°C) excepté pour la souche Issatchenkia orientalis (très résistante)

dont la culture a été poursuivie jusqu’à 42°C. Leur croissance est suivie quotidiennement,

pendant trois jours.

5.3.2- Effet du stress salin et osmotique

Les stress salin et osmotique sont provoqués par ajout d’une solution concentrée de

l’agent salin (NaCl à 0.5M) ou osmotique (sorbitol 2M) dans le milieu de culture (YNB). Ces

concentrations ont été mises au point par LISBP/INSA Toulouse.


59

Après l’ensemencement des cinq souches, une incubation a été faite à 30°C. A chacun de ces

stress on en a ajouté un autre qui est le stress thermique en réalisant une autre incubation à

40°C. Ainsi l’effet combiné des deux stress peut être déterminé (salin-thermique et

osmotique- thermique).

5.3.3- Effet du pH

Le milieu YPD solide a été préparé à quatre pH différents, trois acides (pH 2,5 ; 4 et 5)

ajustés avec du HCl 1M et un basique (pH 7) ajusté avec du NaOH 0,1M. L’agar (2%) est

ajouté aux deux milieux à pH 5 et 7 avant autoclavage alors que pour les milieux à pH 2,5 et

4 il est rajouté après autoclavage (agar 4% à diluer deux fois) afin d’éviter son hydrolyse.

Pour chaque souche, une pré-culture a été préparée, centrifugée à 13 000 tr/mn pendant

3mn et lavée avec de l’eau distillée stérile. Après un bref passage au vortex et centrifugation,

les cellules sont remises en suspension avec 100µl d’eau distillée stérile. Des dilutions

séquentielles (10-1, 10-2, 10-3 et 10-4) ont été préparées et 10µl de chaque dilution sont

déposés stérilement sur les boites précédemment préparées. Après séchage, elles sont

incubées à 30°C et à 40°C. Les résultats sont ainsi suivis et notés quotidiennement pendant

trois jours.

5.3.4- Effet de l’éthanol et du phényléthanol

Ces deux stress ont été étudiés sur les milieux YPD et YNB solides. L’éthanol est ajouté aux

concentrations suivantes: 0%, 5%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, et 22% (V/V) et le

phényléthanol à 0 ; 1 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 3,5 ; 4 ; 4,5 et 5 g/L. Les boites de Petri (fermées

rapidement afin d’éviter toute évaporation) sont ensemencées de la même manière que

précédemment (cf. paragraphe 5.3.3). L’incubation se fait à deux températures différentes

(30°C et 40°C), car en dehors de la toxicité de l’éthanol s’ajoute le facteur de la température

élevée qui pose un problème au cours de la fermentation. Les résultats sont ainsi suivis et

notés quotidiennement pendant trois jours.

La souche I. orientalis, montrant une résistance importante, a été sélectionnée afin de suivre

sa croissance en milieu YPD et YNB liquides en présence d’éthanol aux concentrations

suivantes: 0%, 5%, 8%, 12% et 20% (V/V d’éthanol). L’ensemencement est réalisé à 2UDO et

l’incubation à 30°C sous agitation (200 rpm). La croissance cellulaire est ainsi suivie à

intervalle de temps régulier par la mesure de la densité optique (600 nm, cf. paragraphe

6.1.1) et la viabilité cellulaire est déterminée par étalement sur milieu solide et par un

comptage après coloration au bleu de méthylène (cf. paragraphe 6.1.3). La première

technique est utilisée pour vérifier la fiabilité du comptage. C’est cette dernière qui sera

représentée.


60

6- Méthodes analytiques

6.1- Détermination de la biomasse 6.1.1- Mesure de la densité optique (DO)

L’évolution de la densité optique est estimée par spectrophotométrie à 600nm

(Spectrophotomètre Biochrom Libra S11) dans une cuve de 1mm de trajet optique. Afin de

favoriser le détachement des cellules et leur propagation dans le milieu, un bref passage au

sonificateur a été réalisé avec certaines souches qui préfèrent rester associées les aunes aux

autres. La zone de linéarité du spectrophotomètre se situant entre 0,1 et 0,3 unités

d’absorbance, des dilutions seront réalisées afin d’obtenir une densité optique située dans

cet intervalle.

6.1.2- Détermination de la matière sèche

La détermination de la biomasse sèche (g/L) par une méthode gravimétrique a été

réalisée de la manière suivante : un volume connu de culture est filtré à l'aide d'une pompe

à vide sur des membranes (Sartolon polyamide 0,45 µm SARTORIUS®) préalablement

séchées et pesées, puis rincées à l’eau distillée. Ces dernières sont ensuite séchées à l’étuve

à 60°C sous vide (200mm de Hg) pendant 48h puis pesées. La différence de masse des

membranes avant et après filtration de la suspension cellulaire permet de déterminer la

masse sèche (g/L). De plus le suivi de la croissance a permis d’établir une corrélation entre

ces deux paramètres (DO et matière sèche) afin d’homogénéiser la présentation des

résultats.

6.1.3- Détermination de la viabilité cellulaire et du nombre de cellules

6.1.3.1- Mesure de la viabilité au bleu de méthylène

Le principe de cette première technique repose sur la propriété que possède le bleu de

méthylène à pénétrer par diffusion dans toutes les cellules. La solution sera préparée

comme suit : 10mg de bleu de méthylène sont dilués dans 10ml d’eau distillée auxquels sont

ajoutés 2g de tricitrate de sodium dihydraté. L’ensemble est filtré sur une membrane

Minisart 0,2µm (SARTORIUS®) puis on complète 100ml avec de l’eau distillée stérile.

Le bleu de méthylène est une molécule organique qui réagit avec les oxydoréductases des

cellules actives. Il peut exister sous les deux formes :

* la forme oxydée en donnant une couleur bleue

* la forme réduite incolore.


61

Le bleu de méthylène sera réduit si les cellules sont actives (Bapat et al., 2006) tandis que les

cellules mortes seront colorées en bleu (Manabu et al., 1994).

6.1.3.2- Cellule de Thoma

La cellule de Thoma est composée de 16 grands carrés identiques. Ce grand carré

est lui-même formé de 16 (4X4) surfaces élémentaires (ou petits carrés) qui mesure chacune

1/400mm2. Le comptage est réalisé dans 10 grands carrés, pris en fer à cheval dans

l’ensemble de la cellule de Thoma. L’épaisseur entre lame et lamelle au niveau du

quadrillage est de 0,1mm et le volume observé est ainsi parfaitement défini. Le résultat est

exprimé comme suit :

10 X 16 X 1/400 X 0,1 = 0,04 mm3

Soit « n » le nombre de levures comptées. Le nombre de levures dans 1ml est

représenté par N et calculé comme suit

N = (n x1000)/0,04 = 25 000 n

La concentration cellulaire est ainsi exprimée en nombre de cellules/ml.

6.1.3.3- Comptage

Afin d’estimer le pourcentage des cellules viables, un mélange de 200µl de la

solution de bleu de méthylène avec 200µl de la suspension cellulaire est réalisé dans les

puits d’une microplaque ELISA. Après homogénéisation et 10mn d’incubation à température

ambiante, le mélange est introduit dans la cellule de Thoma et les cellules de levures sont

alors comptées au microscope optique (Nikon Eclipse E 400, grossissement 40 x 10). Ces

cellules se répartissent sur la lame de manière aléatoire. Les règles de comptage appliquées

sont les suivantes: pour des cellules chevauchant les lignes de quadrillage, seules les cellules

chevauchant la ligne horizontale supérieure et la ligne verticale droite sont comptées. Dans

le cas des levures bourgeonnantes, la cellule fille est comptée comme une cellule seulement

si sa taille est supérieure ou égale à la moitié de la taille de la cellule mère. Le nombre de


62

cellules doit être compris entre 150 et 300 pour diminuer l’erreur effectuée sur le comptage

au dessous de 10% (Postgate, 1967 ; McLean et al., 2001). Il suffit de compter les cellules

bleues et les cellules incolores.

Le pourcentage de viabilité est calculé en faisant le rapport entre le nombre de cellules

viables et le nombre total de cellules, en utilisant la formule suivante :

% viabilité = Nombre de Cellules Actives / (Nombre de Cellules Viables + Nombre de

Cellules Non Viables).

6.1.4- Dénombrement après culture

Les cellules viables sont définies comme étant des cellules capables de se dupliquer.

Cette méthode permet donc de les quantifier en comptant les colonies qu’elles forment.

Cette fraction de la population est déterminée par étalement sur milieu solide. Des dilutions

sont réalisées avec de l’eau physiologique (0,9 w/v NaCl : H2O). Un échantillon est prélevé

stérilement de la culture et dilué successivement au dixième jusqu’à atteindre le niveau de

dilution permettant d’obtenir au mieux une cellule par millilitre de suspension. 100µl de

chaque dilution sont alors étalés sur milieu gélosé avec trois répétitions afin de faire la

moyenne des résultats. Après 48 heures d’incubation à 30°C, un comptage est réalisé sur les

boites dont le nombre de colonies se situe entre 30 et 300. Le résultat du comptage est

donné en unités formant une colonie (UFC/ml).

6.2- Extraction d’alcools supérieurs et leurs acétates La production de trois alcools supérieurs (2-méthylbutanol, 3-méthylbutanol et 2-

phényléthanol) ainsi que leurs acétates (2-méthylbutylacétate, 3-méthylbutylacétate et 2-

phényléthylacétate) a été étudiée chez les cinq souches sur trois milieux : YPD, MMS avec le

sulfate d’ammonium comme source d’azote et MMS dont la source d’azote est représentée

par trois acides aminés : leucine, isoleucine et phénylalanine.

La cinétique de ces souches et celle de la souche CEN.PK122-2N prise comme souche de

référence, a été suivie et des prélèvements réalisés en phase exponentielle sont centrifugés.

Les surnageants récupérés sont conservés à -20°C.

L’étalon inter, qui va servir pour l’extraction, est préparé en prenant 25µl d’octanol dans une

fiole jaugée auquel on ajoute de l’éther jusqu’à 25ml. Ce mélange, qui est préparé

rapidement et avec précision sous une hotte, est mélangé et réparti dans des flacons qui se

ferment hermétiquement puis placé dans de la glace dans une chambre froide.

L’extraction des arômes est réalisée dans une chambre froide en mélangeant 1ml de chaque

échantillon avec 500µl de l’étalon inter. Ce mélange est vortexé pendant une minute puis

centrifugé à 400 rpm, à 16°C pendant 5 minutes. Deux phases sont alors obtenues (une

phase aqueuse et une phase organique).


63

En travaillant toujours à froid, 400µl de la phase organique sont récupérés dans des flacons

qui sont rapidement scellés afin d’éviter toute évaporation et qui seront analysés en

chromatographie en phase gazeuse.

6.3- Analyse chromatographique par HPLC pour le dosage des

différents sucres, éthanol, glycérol et acétate L’HPLC, chromatographie liquide à haute pression, est une technique qui nous a permis

de quantifier les concentrations en sucres et autres métabolites tels que l’éthanol, l’acide

acétique et le glycérol sécrétés au cours des cultures réalisées. Tous ces composés ont fait

l’objet d’un étalonnage qui a été réalisé à partir de solutions contenant les différents

composés à analyser dans des gammes de concentrations variables. Les échantillons

prélevés du milieu de culture ou de fermentation à différentes phases de la croissance sont

centrifugés deux fois 13 000 tr/min pendant 5 mn et le surnageant est ensuite filtré avec des

filtres nylon 0.22µm avant d’être analysés. Les filtrats sont placés dans des flacons fermés

munis d’un septum perforable par l’aiguille d’injection.

L’appareil utilisé dispose d’une colonne (Aminex HPX-87H 300 mm x 7.8 mm -BioRad-)

spécifique pour la séparation des sucres, des alcools et des acides organiques. La phase

mobile utilisée est une phase polaire constituée d’un mélange d’acide sulfurique (H2SO4) et

d’eau ultrapure à une concentration de 5 mM circulant à un débit de 0,5ml/mn pendant

toute la durée de l’acquisition. Cet éluant est préparé et préalablement dégazé sous vide.

La température de la colonne est fixée à 48°C et le volume de la boucle d’injection est de

20µl. La détection de chaque composant se fait à l’aide d’un réfractomètre (Refractomètre

Waters modèle 410). L’acquisition et le traitement des données se font par un logiciel

spécialisé, Chromeleon Chromatography Management System (Thermo Scientific Dionex),

permettant de calculer la surface des pics détectés. Cette surface est corrélée à une valeur

de concentration par l’intermédiaire d’une droite de calibration déterminée préalablement

pour chaque constituant.

6.4- Analyse chromatographique par GC-FID pour le dosage des

alcools supérieurs et leurs acétates Cette analyse a été réalisée avec un appareil Agilent 6890N et une colonne de type

Agilent HP5 (longueur 30 m, diamètre 320 µm, épaisseur de film 0.25 µm) selon les

conditions suivantes :

Gaz vecteur : Helium.

Injecteur : 250°C, Split ratio = 10, Volume injecté = 2 µL.

Détecteur : FID, 270°C, Débit H2 = 30 ml/min, Air = 300 ml/min.

Conditions thermiques de séparation : 40°C 5 min.

Rampe de 30°C/min jusqu’à 250°C.


64

250°C 5 min

7- Analyse physiologique

7.1- Culture en anaérobiose Les cinq souches (C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii) ont été

examinées pour leur capacité à croitre en anaérobiose sur YPD solide à 30°C.

D’autres cultures ont été réalisées sur YPD liquide dans des fioles (figure 9), auxquelles ont

été ajoutés de la resazurin sodium salt (1000X) à 1g/L comme indicateur d’oxygène, du

Tween 80 (200X, dilué dans de l’eau) et de l’ergostérol (1000X, dilué dans de l’isopropanol)

qui est un facteur de croissance nécessaire en anaérobiose. L’incubation se fait sous

agitation (100 rpm).

Figure 9: Flacons pour la culture en anaérobiose des levures à 30°C

7.2- Assimilation des substrats carbonés Les méthodes rapides actuellement commercialisées peuvent se substituer efficacement

à la démarche classique qui est longue et lourde à mettre en œuvre. Parmi ces dernières la

galerie ID 32C permet d’effectuer de nombreux tests en un temps court et sa relative

simplicité rendant son utilisation dans un laboratoire très appréciable.

7.2.1- Principe et description du dispositif

La galerie ID 32C est un système standardisé pour l’identification des levures et qui

comprend 32 tests d’assimilation miniaturisés. Elle comporte principalement 32 cupules

contenant chacune un substrat carboné sous forme déshydratée (Annexe 1) et des milieux


65

semi-solides (API C Medium) (Annexe 2) qui permettent de mettre en suspension les levures

à tester.

Après avoir mis en culture nos souches, on suspend quelques colonies de chaque souche

dans de l’eau distillée stérile dont l’opacité est comparée au Mac Farland point 2. 250µl de

chaque suspension sont transférés dans une ampoule qui contient le milieu semi solide API C

Medium, fourni dans le coffret. Après homogénéisation, on inocule la galerie en distribuant

135µl de la suspension par cupule puis on place le couvercle sur la galerie et on l’incube à

30°C.

Une première lecture est réalisée après 24 heures d’incubation et une autre après 48

heures, en notant la présence éventuelle d’un trouble et ceci par comparaison au contrôle

(O) qui est en position 1.F sur la galerie.

RESULTATS ET DISCUSSION

Résultats et Discussion

67

Les levures sont largement distribuées dans la nature et leur aspect ubiquitaire est encore

une fois confirmé par leur présence dans les échantillons biologiques choisis. Les levures

représentent une part notable de la flore microbienne des dattes, du melon, du cornichon,

du lait, et du miel où elles sont susceptibles de participer activement aux différentes

modifications biochimiques qui sont à l’origine du développement de la saveur et de l’arôme

de ces produits (Grippon, 1978 ; Schmidt et al., 1979 ; Schmidt, 1984 et Baroiller et Schmidt,

1990).

1- Identification des isolats de levure

1.1- PCR sur histones A partir de ces biotopes, l’isolement a en effet aboutit à soixante quinze isolats. Une

première sélection a été faite en prenant la croissance comme premier critère et tous les

isolats à croissance lente ont été éliminés. Une deuxième sélection nous a permis de garder

dix-huit isolats, éliminant ceux qui avaient les mêmes caractéristiques morphologiques et

culturales et qui provenaient du même échantillon biologique.

Parmi ces dix huit isolats sélectionnés nous avons pu identifier par PCR sur histones les cinq

suivants S6, S7, S10, S11, S12 (figure 10) qui appartiennent au genre Yarrowia et à l’espèce

lipolytica. Cette technique est très fiable puisqu’elle a démontré que les régions promotrices

des gènes H3-H4 codant les histones dans la levure représentent une zone de choix pour une

identification rapide et précise permettant de différencier les différentes espèces entre elles

(Bell, 2004). Mais à cause du nombre limité de souches contrôles les autres isolats n’ont pas

pu être identifiées comme le montre les profils d’amplification qui sont représentés dans la

figure 10.


68

Figure 10: PCR des produits d’amplification (Amplicons H3 et H4) des 18 isolats

de levures

T: marqueur de taille; A: S. cerevisiae CEN.PK122-2N; B: S. cerevisiae BY4741; C: S. pombae; D: Kluyveromyces lactis; E: Yarrowia lipolytica; F: Pichia guilliermondi;

S: souches à identifier.

1.2- Identification moléculaire Une identification moléculaire s’est avérée nécessaire puisque l’ensemble des levures n’a

pu être identifié. Cette identification, comme indiqué dans matériel et méthodes, a été

réalisée au Centre International de Ressources Microbiennes (CIRM) en se basant sur

l’amplification par PCR et séquençage des amplicons du domaine D1/D2 de la région 26S de

l’ADN ribosomique (Kurtzman et Robnett 1997 et Kurtzman et Robnett, 1998). Cette

technique a été utilisée dans l’identification de toutes les levures isolées à partir de produits

alimentaires (Huang et al., 2010) et de nombreux travaux ont souligné la fiabilité et la

rapidité de cette méthode dans l’identification des levures (Baffi et al., 2011).

Le nombre d’isolats a été limité à dix. Les amplicons obtenus ont été séquencés et leurs

séquences ont été comparées aux bases de données. Les identités de séquences (100%) ont

permis de classer les dix isolats suivants en neuf espèces :

Clavispora lusitaniae

Hanseniaspora uvarum isolées à partir des dattes

Kodamaea ohmeri

Issatchenkia orientalis

Trichosporon asahii

isolées à partir du lait de chamelle


69

Candida parapsilosis

Yarrowia lipolytica

Zygosaccharomyces bailii

Zygosaccharomyces rouxii

L’ensemble de ces résultats sont représentés dans le tableau 4 et le rapport de l’alignement

des séquences est en annexe 3.

Tableau 4: Résultats du séquençage des amplicons obtenus après amplification par

PCR, du domaine D1/D2 de la région 26S de l’ADN ribosomique et comparaison aux

séquences de la base de données du NCBI faites à CIRM (Grignon, Paris)

Code de la souche origine Espèces

AH1 (S1) Dattes Clavispora lusitaniae

AJ3 (S2) Dattes Hanseniaspora uvarum

BFK (S3) Dattes Kodamaea ohmeri

MJ2 (S5) Melon Candida parapsilosis

LVG/PC (S6) Lait de vache (Ghardaïa) Yarrowia lipolytica

LVB/PR (S7) Lait de vache (Oran) Yarrowiali polytica

LBN/CR (S10) Lait de brebis Yarrowia lipolytica

LCT/CV (S11) Lait de chèvre Yarrowia lipolytica

LCS/ CS (S14) Lait de chamelle (Ghardaïa) Issatchenkia orientalis

LCW/GC (S15) Lait de chamelle (Bechar) Trichosporon asahii

C/PC2 (S17) cornichon Zygosaccharomyces bailii

MM2 (S18) Miel Zygosaccharomyces rouxii

La présence de Yarrowia lipolytica dans le lait de vache, de brebis et de chèvre n’était pas

fortuite en raison de la teneur élevée de ces produits en lipides (Choisy et al., 1987 ;

Guerzoni et al., 1998 ; Wyder et Puham, 1999 ; Guerzoni et al., 2001 ; Suzzi et al., 2001). La

présence de Zygosaccharomyces bailii dans le cornichon n’est pas étonnante non plus car

elle est très tolérante au sel (Praphailong et Fleet, 1997) et c’est aussi le cas de

Zygosaccharomyces rouxii qui est présente dans le miel et qui est très résistante au sucre

(Barnett et al., 1990 ; Jansen et al., 2003).

isolée à partir du melon

isolée à partir du lait de vache, de brebis et de chèvre

isolée à partir du cornichon

isolée à partir du miel


70

En revanche, Trichosporon asahii et Candida parapsilosis sont considérées comme des

pathogènes opportunistes dont le principal habitat est la peau des êtres humains et des

animaux (Ebright et al., 2001). Il est peu probable que ces souches aient été initialement

présentes dans les échantillons biologiques choisis.

La large gamme d’habitat de l’espèce Clavispora lusitaniae comme l’a signalé Lachance et

ses collaborateurs en 2003 est en adéquation avec sa présence dans les dattes. Wyder et

Puham (1999) ainsi que El-Sharoud et ses collaborateurs (2009) ont également signalé sa

présence dans les fromages et certains produits laitiers car elle participe à leur affinage.

C’est une espèce qui a été retrouvée également dans les déchets industriels et quelques

échantillons cliniques (Gargeya et al., 1990).

L’isolement de Hanseniaspora uvarum à partir des dattes est en accord avec ce fruit puisque

cette espèce se retrouve couramment sur la peau des fruits riches en fructose et glucose

comme la peau des raisins (Baffi et al., 2011) et des pommes (Pando Bedrinana et al., 2011).

Elle a été retrouvée également dans le jus d’orange où elle participe à sa fermentation

(Mingorance-Cazola et al., 2003).

La présence de Kodamaea ohmeri dans les dattes est moins évidente car c’est une levure

qui est transporté par les insectes et les abeilles lors de leur visite sur les fleurs éphémères

(Lachance et al., 2001 et Benda et al., 2008). C’est une espèce qui a été isolée par Chi et ses

collaborateurs (2012) à partir de l’écosystème des mangroves (Chine), de la chair et des

excréments du poulet (avec I. orientalis) pour une éventuelle utilisation en tant que

probiotiques chez les animaux (Garcia-Hernandez et al., 2011 et Chi et al., 2012). Ajoutons à

ces travaux, ceux de Zhu et ses collaborateurs qui ont isolé à partir des sources naturelles

osmophiles, une souche de K. ohmeri capable de produire le D-arabitol, qui a une saveur

sucrée plus faible que le saccharose et moins sucré que le xylitol avec une valeur calorique

proche du zéro, et qui était jusque là produit uniquement par Candida famata (Zhu et al.,

2010).

Issatchenkia orientalis est l’une des levures indigènes présente sur la peau des raisins (Baffi

et al., 2011) et dans le vin (Clemente-Jimenez et al., 2004) qui se caractérise par sa tolérance

à l’acidité et à l’éthanol (Okuma et al., 1986). Elle a été également isolée à partir du Kéfir et

utilisée comme additif alimentaire microbien pour les animaux (Lee et al., 2002). Sa

présence peut s’expliquer par le fait que l’isolement a été réalisé après la fermentation du

lait de chamelle. Sa tolérance à la température, à l’acidité et à l’éthanol, ainsi que sa capacité

à assimiler du citrate et à fermenter du glucose et du saccharose lui permette de jouer un

rôle dans la fermentation du cacao (Daniel et al., 2009). Elle a été aussi retrouvée dans les

olives (Arroyo-Lopez et al., 2006) et certains produits laitiers tels que les fromages (El-

Sharoud et al., 2009) où elle participe à la protéolyse et la formation de composés d’arômes

dans le fromage type camembert (Chen et al., 2011) et les yaourts (Lourens-Hattingh et

Viljoen, 2002).


71

Il est à noter que l’étude réalisée par Galzy et ses collaborateurs (1996) a bien confirmé la

présence de C. lusitaniae, H. uvarum et Z. bailii dans les fruits, celle d’I. orientalis et de Y.

lipolytica dans les laitages et de Z. rouxii dans le miel.

De nombreux travaux ont été réalisés sur les souches Yarrowia lipolytica (Barth et Gaillardin,

1997), Zygosaccharomyces bailii et Z. rouxii (Merico et al., 2003 ; Martorell et al., 2007),

nous avons donc concentré notre étude physiologique sur les cinq souches restantes, à

savoir: C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii. Ces espèces sont isolées

à partir des dattes et du lait de chamelle, provenant d’un biotope particulier caractérisé par

son climat désertique et sa température élevée. De plus ces souches sont très peu étudiées

ce qui donne à notre travail un caractère novateur.

2- Caractères culturaux et morphologiques Nous avons débuté notre étude par des cultures en milieu complet liquide et solide afin de

déterminer l’aspect des cultures de ces souches, la morphologie des cellules isolées, une

éventuelle organisation particulière des cellules (mycélium ou pseudo-mycélium), la

formation ou non de « spores » asexuées (chlamydospores, ballistospores, arthrospores) et

leurs modes de reproduction végétative qui peut se faire par scissiparité ou par

bourgeonnement. Dans ce dernier cas, l’arrangement du (ou des) bourgeon (s) sur la cellule

mère (bourgeonnement monopolaire, bipolaire ou multipolaire) mérite une attention.

L’ensemble de ces résultats sont regroupés dans le tableau 5.

2.1- Caractères culturaux 2.1.1- Sur milieu liquide

La croissance de ces levures en milieu liquide se manifeste de façon différente. On

note le caractère gazogène de l’ensemble des souches qui se traduit par la présence du CO2

dans la cloche de Durham, excepté pour Trichosporon asahii. On observe la présence d’une

pellicule qui nappe la paroi du tube uniquement chez les souches isolées à partir du lait à

savoir Trichosporon ashii et Issatchenkia orientalis. La formation de cette pellicule a déjà été

observée chez cette dernière. Elle correspond à des polysaccharides produits par ces

souches. Les dépôts, qui renseignent sur la masse cellulaire, sont fins chez la souche H.

uvarum, cotonneux chez T. asahii, modéré chez la souche K. ohmeri et épais chez les souches

C. lusitaniae et I. orientalis (figure 11).


72

Figure 11: Aspect des cultures des cinq souches sur YPD liquide à 30°C pendant 3 jours

C.l: Clavispora lusitaniae ; H.u: Hanseniaspora uvarum ; K.o: Kodamaea ohmeri ;

T.a: Trichosporon asahii ; I.o: Issatchenkia orientalis

2.1.2- Sur milieu solide

Après une croissance de trois jours à 30°C sur milieu solide, ces souches à l’exception

de la souche T. asahii, possèdent en commun la forme ronde, le contour régulier et la

couleur blanche des colonies. On note cependant des différences d’aspect qui sont

représentées dans la figure 12 et sont résumées dans le tableau 5. T. asahii donne des

colonies veloutées et plissées. Ces caractères concordent très bien avec ceux cités dans la

littérature.


73

Figure 12: Aspect macroscopique des colonies des cinq souches après 3 jours d’incubation

sur YPD solide à 30°C

C.l: Clavispora lusitaniae ; H.u: Hanseniaspora uvarum ; K.o: Kodamaea ohmeri ;

I.o: Issatchenkia orientalis ; T.a: Trichosporon asahii.

2.2- Caractères morphologiques La morphologie des cellules, comme l’illustre la figure 13, est variable. Elle est sphérique

chez C. lusitaniae et K. ohmeri, apiculée chez H. uvarum, ovoïde chez I. orientalis et allongée

chez T.asahii. Le mode de reproduction végétatif se fait par bourgeonnement pour la totalité

des souches. Il est bipolaire chez H. uvarum et multipolaire chez C. lusitaniae, K. ohmeri et I.

orientalis. La présence de pseudomycélium, formé par une succession de bourgeons allongés

et en chaines ramifiées, a été observée chez toutes les souches excepté pour I. orientalis. Par

contre chez T. asahii, des mycéliums bien développés où le thalle est bien organisé autour

d’un axe filamenteux à cloisons transversales, ont été remarqués en plus des

pseudomycéliums et des arthrospores, arrangées en « zigzag », qui résultent de la

désarticulation du mycélium.


74

Figure 13: Aspect microscopique des cellules des cinq souches après une culture de 24 h sur YPD liquide à 30°C


75

Tableau 5: Les caractères culturaux et morphologiques des cinq souches de levures

retenues cultivées sur milieu YPD solide et liquide et incubées à 30°C

Souches Caractères culturaux

sur milieu liquide

Caractères culturaux

sur milieu solide

Caractères morphologiques

Clavispora

lusitaniae

-Souche gazogène.

-Dépôt épais.

-Colonie ronde, lisse et brillante

-Bord régulier

-Blanche et bombée.

-Cellules sphériques.

-Bourgeonnement

multipolaire.

-Présence de

pseudomycélium.

Hanseniaspora

uvarum

-Souche gazogène.

-Dépôt fin.

-Colonie ronde, bord régulier

-Contour lisse, centre velouté

-Blanche

-Bombée avec le centre en

cône.

-Cellules apiculée (en forme

de citron).

-Bourgeonnement bipolaire.

-Présence de pseudo-

mycélium.

Kodamaea ohmeri -Souche gazogène.

-Dépôt modéré.


-Velouté

-Blanche

-Bombée avec

le centre en cône.

-Cellules sphériques.

-Bourgeonnement

multipolaire.

-Présence de pseudo-

mycélium.

Issatchenkia

orientalis

-Souche gazogène.

-Dépôt épais.

-Présence de

voile.


- Velouté

-Blanche

-bombée.

-Grosses cellules ovoïdes.

-Bourgeonnement

multipolaires.

Trichosporon asahii -Souche

non gazogène.

-Dépôt fin.

-Présence de

voile.

-Colonie ronde, bord dentelé

-Velouté avec surface plissée

- Blanche

-Bombée.

-Forme variable souvent

allongée.

- Présence de pseudo-

mycélium.

-Mycélium bien développé.

-Présence d’arthrospores.


76

3-Effet des différents stress Les levures rencontrent au cours de leur croissance et leur cycle de reproduction différentes

contraintes. Elles sont exposées à un ensemble de stress tels que les stress osmotique,

oxydatif, thermique, stress éthanol ou carence nutritive. Ces conditions de stress,

considérées comme des variations dans le milieu de culture des levures, impactent leur

comportement en affectant leurs capacités de croissance et leurs productions, causant ainsi

un dysfonctionnement pouvant aller jusqu’à la mort des cellules (Estruch, 2000 et

Hohmann, 2002). Il est important que les cellules disposent de moyens pour faire face à ces

stress afin de résister à ces dommages et réparer ceux causés au niveau macromoléculaire.

Ils sont notamment cruciaux pour les procédés de bioconversions et l’une des contraintes

dans un tel bioprocédé est de trouver un bon compromis entre d’une part leur optimisation

pour la productivité, le rendement et la viabilité des cellules et d’autre part la minimisation

du coût énergétique liés à ces régulations. Ce qui souligne l’importance de cette étude.

3.1- Effet de la température La température est l’un des facteurs les plus importants qui agit sur la croissance des

microorganismes et leurs productions. Très peu d’études ont été consacrées à ce facteur et

son impact sur le comportement des levures au cours de la fermentation comme il a été

mentionné par Torija et ses collaborateurs (Torija et al., 2003). En revanche, on sait que la

température a un effet direct sur la viabilité cellulaire, la production d’éthanol et de glycérol

(Aldiguier et al., 2004). L’impact de ce paramètre, sur les cinq souches de levure retenues (C.

lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii), a été étudié et a donné les

résultats illustrés dans la figure 14.

Figure 14: Effet de la température sur les cinq souches de levure étudiées cultivées

sur milieu YPD solide

Ces résultats montrent que seule Hansenispora uvarum est incapable de soutenir une

croissance au-delà de 30°C et montre une sensibilité très nette à 37°C. Les quatre autres

souches affichent une bonne croissance jusqu’à 40°C. Il est important de noter que la

croissance d’Issatchenkia orientalis a été la moins affectée à haute température et elle peut

poursuivre sa croissance jusqu’à 42°C (résultat non présenté). Ces résultats sont en accord

avec les propriétés thermo-tolérantes de cette espèce signalées dans les travaux précédents


77

(Gallardo et al., 2010 ; Gallardo et al., 2011 ; Kwon et al., 2011 et Yuangsaard et al., 2013),

elle doit avoir une membrane plasmique plus résistante aux dénaturations thermiques. De

plus, Gallardo et ses collaborateurs ont montré que non seulement cette espèce poursuit sa

croissance à de telles températures mais donne le meilleur de sa production en éthanol à

42°C contrairement à Saccharomyces cerevisiae connue pour sa production maximale

d’éthanol entre 30-35°C (Gallardo et al., 2010). Cette souche peut avoir une grande valeur

pour des applications biotechnologiques en particulier lorsque la température dépasse les

39°C au sein d’un système de fermentation continu.

3.2- Effet du pH Les levures apprécient bien l’acidité, mais elles n’ont pas la même sensibilité au pH.

Chacune est caractérisée par un seuil en dessus duquel elle ne se développe pas. La capacité

que possède les levures à résister à l’acidité a été étudiée chez de nombreuses souches de

levures (Wyder Puham, 1999) qui précisent l’importante inhibition par des pH très acides

(inférieur à 3) (Thomas et al., 2002) en ralentissant la consommation du sucre et réduisant

par conséquent la productivité (Torija et al., 2003) ou en affectant le transport actif de

l’azote (Dubois et Grenson, 1979 et Gregory et al., 1982), d’où l’importance des souches

résistantes à des pH bas.

Dans ce contexte et compte tenu du rôle essentiel que joue le pH sur différents aspects,

nous avons mis au point l’effet de ce stress sur les souches de levures retenues. Les résultats

reportés sur la figure 15 montrent une bonne résistance de toutes les souches aux pH= 4 - 5

et 7. En revanche à un pH très acide comme 2,5, la croissance n’est observée qu’avec les

souches Clavispora lusitaniae, Hanseniaspora uvarum et Issatchenkia orientalis qui arrivent

à y résister. Les deux autres souches, en particulier Trichosporon asahii, présentent une

forte sensibilité à cette valeur. Il convient de noter que malgré la sensibilité de la souche H.

uvarum à la température, cette dernière montre une résistance importante aux pH très

acides.


78

Figure 15: L’effet du pH sur les cinq souches de levure étudiées sur milieu YPD solide, incubées à 30°C

T.a: Trichosporon asahii ; I.o: Issatchenkia orientalis ; K.o: Kodamaea ohmeri ;

H.u: Haseniaspora uvarum ; C.l: Clavispora lusitaniae.

Cette résistance persiste même à 40°C avec la souche Issatchenkia orientalis qui affiche la

plus large gamme de pH pour sa croissance (résultats non présentés). Ceci concorde très

bien avec les travaux qui ont souligné la résistance de cette espèce à des pH très bas et à

différents acides comme l’acide lactique (Halme et al., 2004), l’acide acétique (Casey et

Dobson, 2003) et l’acide malique (Seo et al., 2007 et Kim et al., 2008) auxquels beaucoup de

levures sont sensibles.

3.3- Effet du stress salin Le stress salin est l’un des plus sévères pour les microorganismes, y compris les levures.

Des concentrations élevées en sel dans le milieu peuvent avoir des effets toxiques sur le

métabolisme cellulaire car le potentiel hydrique est diminué. Une concentration importante

en ions rend difficile, voir impossible, l’absorption de l’eau par la levure puisqu’elle a un

potentiel hydrique inférieur à celui du milieu environnant. Pour maintenir constante l’eau

intracellulaire, la concentration cytoplasmique des composés osmotiques actifs doit être

supérieur à celle du milieu environnant (phénomène de « salt-in »). C’est le moyen


79

qu’utilisent les levures pour répondre à ce genre de stress. Afin d’évaluer la réponse à ce

stress par nos souches, nous les avons cultivées sur un milieu minimum avec une

concentration de 0,5M de NaCl.

Cette étude a montré qu’à 30°C, température optimale pour la croissance des levures, les

cinq souches (C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii) ont bien toléré

cette concentration de NaCl (figure 16). Les études, peu nombreuses, réalisées sur ce stress

chez les levures ont montré que le glycérol joue un rôle important dans la résistance

puisqu’il constitue le principal soluté accumulé en réponse à la salinité (Jennings, 1984 et

Bellinger et Larher, 1988).

Figure 16: Effet du NaCl (0,5M) sur les cinq souches cultivées sur milieu YNB avec une

incubation à 30°C et à 40°C.

3.4- Effet du stress osmotique La levure, comme les autres cellules, est capable de détecter un changement de la

pression osmotique du milieu extérieur et y répond par une déformation de la membrane

cellulaire ou par un changement de l’hydratation des protéines de la membrane (Deardorff,

1980 ; Kopell et Westhead, 1982 ; Hohmann, 2002 ; Fullerton et al., 2006 et Sun et al., 2007).

En général, elles répondent plus rapidement à un environnement hypo-osmotique qu’à un

environnement hyper-osmotique, puisque le risque d’éclatement est plus sévère (Potts,

1994 et Wood, 1999). Le mécanisme de résistance des levures à des milieux à activité d’eau

faible se traduit par l’accumulation dans la cellule de polyols. C’est le cas de

Zygosaccharomyces, souche xérotolérante, qui accumule de l’arabitol et du glycérol quand

l’activité de l’eau est faible (Rose, 1987). La résistance à ce stress a été également évaluée

chez nos souches en les cultivant de la même manière que le stress salin avec une

concentration de 2M de sorbitol. Des résultats similaires à ceux du stress salin ont été

obtenus avec le stress osmotique. Une croissance nette à 30°C des cinq souches comme le

montre la figure 17.


80

Figure 17: Effet du sorbitol (2M) sur les cinq souches cultivées sur milieu

YNB avec une incubation à 30°C et à 40°C.

L’effet des stress osmotique et salin ont été étudiées chez d’autres souches (Jakobsen et

Narvhus, 1996 ; Laubscher et Viljoen, 1999 et Fleet, 2007) mais sans l’effet de la

température. Notre étude a combiné ces stress avec le stress thermique et les résultats

obtenus montrent qu’à 40°C seules les souches C. lusitaniae et I. orientalis résistent à l’effet

synergique (figure 16 et 17). La souche H. uvarum, ne pousse pas à cette température et les

deux autres souches (K. ohmeri et T. asahii) ne résistent pas à l’effet combiné de ces deux

stress. Ces résultats sont résumés dans le tableau 6.


81

Tableau 6: Effet des différents stress sur les cinq souches de levures étudiées

(+ : Croissance positive ; - : pas de croissance)

Souches pH Températures (°C) NaCl (0,5M) Sorbitol (2M)

2,5 4 5 7 25 30 37 40 42 30°C 40°C 30°C 40°C

Clavispora

lusitaniae

+ + + + + + + + - + + + +

Hanseniaspora

uvarum

+ + + + + + - - - + - + -

Kodamaea

ohmeri

- + + + + + + + - + - + -

Issatchenkia

orientalis

+ + + + + + + + + + + + +

Trichosporon

asahii

- + + + + + + + - + - + -

3.5- Effet de l’éthanol Bien que l’éthanol soit le produit final de la fermentation, il devient un facteur de stress

important en s’accumulant dans le milieu. Il est connu comme un inhibiteur de la croissance

des microorganismes. Une fois produit par les levures, il diffuse à travers la membrane

plasmique, inhibe la croissance (Piper, 1995), diminue la viabilité des cellules (Bai et al.,

2004), affectant considérablement les fonctions et les propriétés physico-chimiques de la

membrane plasmique (Alexandre et al., 1994 et Alexandre et al., 1998) et réduit ainsi le

rendement en éthanol (Pina et al., 2004), ce qui impacte sérieusement les entreprises

industrielles. Les effets toxiques de cet alcool sur les souches de levure sont nombreux et

plusieurs études ont été réalisées dans ce sens. Déterminer l’effet de l’éthanol sur nos

souches nous a paru important à définir.

L’impact de ce stress sur nos souches ainsi que sur S. cerevisiae CEN.PK122-2N qui a servi de

souche de référence, a été étudié sur YPD avec différentes concentration en éthanol et à

deux températures (30°C et 40°C). La figure 18 illustre la réponse observée à ces stress et

montre clairement que l’effet inhibiteur de l’éthanol diffère d’une souche à une autre.


82

Figure 18: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YPD solide incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)

C.N: souche de référence (CEN.PK122-2N) ; T.a: Trichosporon asahii ; I.o: Issatchenkia orientalis ; K.o: Kodamea ohmeri ; H.u: Hanseniaspora uvarum ;

C.l: Clavispora lusitaniae.

A 30°C, les souches les plus sensibles sont Hanseniaspora uvarum et Trichosporon asahii

dont la résistance ne dépasse guère les 8%. La résistance pour la souche Kodameae ohmeri

atteint les 10% avec une inhibition complète à 12%. Celle de Clavispora lusitaniae atteint les

8% avec une inhibition totale à 10%. La souche de référence CEN.PK122-2N montre une

résistance importante allant jusqu’à 16%. Cependant, la souche Issatchenkia orientalis s’est

révélée la plus résistante à la toxicité de l’éthanol et d’une manière significative puisqu’elle

peut se développer en présence de 18% d’éthanol.

A 40°C, H. uvarum ne pousse pas, quand à T. asahii, sa résistance ne dépasse pas les 8%. La

résistance de la souche K. ohmeri baisse à 5% et de la souche de référence à 10%. En

revanche, une reprise de croissance de la souche C. lusitaniae a été constatée à cette

température mais avec un aspect de colonies différent, ceci laisse supposer l’apparition de

mutants. La souche I. orientalis reste la souche la plus résistante même à 40°C, une

température favorable à sa croissance comme il a été montré précédemment et à sa

production en éthanol, puisque cette production est meilleure à 42°C comme il a été

démontré par d’autres études (Gallardo et al., 2010 et Kwon et al., 2011)

On peut en déduire que lorsque la température et l’éthanol induisent des effets synergiques

sur la croissance, la résistance de ces levures diminue. Ceci a été montré chez S. cerevisiae

où la contribution de la température de la fermentation combinée avec le stress éthanol

influe sur la production en biomasse, la viabilité cellulaire et les différents types de

production notamment celle de l’éthanol et du glycérol (Aldiguier et al., 2004). Cependant


83

d’autres travaux ont bien montré que la concentration critique de l’éthanol à partir de

laquelle la levure cesse de croître est influencée par plusieurs facteurs (Casey et Ingledew,

1986 ; Van Uden, 1985 ; D’Amore et Stewart, 1987 et Jones, 1989).

Nous avons voulu compléter ce travail en étudiant l’effet de ces deux stress sur ces souches

dans un milieu minimum (YNB), ceci permettrait de mieux cerner l’impact du stress et de le

gérer efficacement au cours des fermentations en conditions contrôlés. La figue 19 montre

la gamme de concentration d’éthanol au cours de laquelle on note l’effet inhibiteur pour les

différentes souches analysées.

Figure 19: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YNB solide incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)

C.N: souche de référence (CEN.PK122-2N) ; T.a: Trichosporon asahii ; I.o: Issatchenkia orientalis ; K.o: Kodamea ohmeri ; H.u: Hanseniaspora uvarum ;

C.l: Clavispora lusitaniae.

A 30°C, les souches H. uvarum, T. asahii, K. ohmeri et C. lusitaniae donnent les mêmes

résultats que sur YPD. La souche I. orientalis donne une croissance très faible avec 16 et 18%

d’éthanol. Quand à la souche de référence sa croissance s’est arrêtée à la concentration en

éthanol de 14%.

Par contre à 40°C, dans des conditions minimum on note une baisse significative de la

résistance qui est passée à 5% pour la souche de référence, K. ohmeri et T. asahii et à 10%

pour la souche I. orientalis qui reste la souche la plus résistante. Il importe également de

noter qu’aucun mutant n’a été observé chez la souche C. lusitaniae sur ce milieu dont la

résistance ne dépasse guerre les 5% à cette température. La souche d’Issatchenkia orientalis


84

possède donc un caractère de très grande valeur en termes de résistance, ce qui peut

impliquer son utilisation à l’échelle industrielle en particulier pour la production de l’éthanol.

Cette étude est importante car Saccharomyces cerevisiae, producteur traditionnel d’éthanol,

a toujours été considérée comme une souche sensible aux fortes concentrations en éthanol

(Bai et al., 2004 ; Pina et al., 2004). Différentes stratégies ont été utilisées afin d’améliorer la

production d’éthanol et la viabilité de Saccharomyces cerevisiae comme la composition du

milieu, les paramètres de fonctionnement et le niveau d’oxygène (Zhao et Bai, 2009).

D’autres travaux se sont intéressés à une alimentation exponentielle en vitamines (Alfenore

et al., 2002) et en acides aminés qui ont un effet protecteur (Morita et al., 2003 ; Sekine et

al., 2007 et Takagi, 2008) comme l’isoleucine, la méthionine, la phénylalanine et la proline

(Hirasawa et al., 2007 ; Ding et al., 2009).

L’extrait de levure, qui a également un rôle dans la protection des cellules (Casey et al.,

1983 ; Thomas et Inglewed, 1992 ; Thomas et al., 1993 ; Jones et Ingledew, 1994), le

magnésium (Dombek et Ingram, 1986 et Birch et Walker, 2000), l’ammonium (Leao et Van

Uden, 1986 ; Jones et Ingledew, 1994 et Nissen et al., 2000) et le calcium (Nabais et al.,1988)

ont également fait l’objet de plusieurs utilisations pour contrer l’effet de l’éthanol. Mais les

résultats restent toujours très limités et cette souche de levure demeure toujours incapable

de résister à des taux très élevés d’éthanol. La tolérance à cet alcool montre une complexité

importante qui implique de multiples gènes (Hu et al., 2007). Plus de 400 gènes tolérants à

l’éthanol ont été répertoriés (Alexandre et al., 2001 ; Fujita et al., 2004 ; Teixeira et al.,

2009 ; Ma et Liu, 2010).

Devant cette incapacité de créer une souche de Saccharomyces cerevisiae avec une

tolérance bien améliorée, des levures naturellement tolérantes à l’éthanol peuvent avoir un

intérêt fondamental pour les scientifiques et économique pour les industriels. Ces premiers

résultats obtenus avec la souche d’Issatchenkia orientalis montrent qu’elle est multi-

résistante et la capacité à tolérer divers stress est l’un des critères importants dans le choix

des souches performantes pour la fermentation. Elle peut être donc une candidate idéale et

constituer une souche robuste pour la fermentation alcoolique. Cependant, des recherches

supplémentaires et complémentaires doivent être menées afin de confirmer cette résistance

sur milieu liquide et comprendre l’origine et le mécanisme de résistance chez cette souche.

4- Analyse de la physiologie des cinq souches de

levures retenues

Plusieurs caractéristiques physiologiques des levures contribuent à leur succès en tant que

microorganisme industriel (Skinner et al., 1980 ; Kirsop, 1982 ; Reed, 1983 ; Triveldi et al.,

1986 ; Rose et Harrison, 1987 et Larpent, 1991).


85

4.1- Assimilation des substrats carbonés (Galerie API ID 32C) Parmi les substrats utilisés par les levures, les composés carbonés sont les plus

importants. Certaines levures peuvent utiliser une large gamme de composés carbonés

contrairement à d’autres qui en assimilent un petit nombre. Ce critère étant très important

pour la physiologie des levures, nous avons réalisé une galerie API : ID 32C dont les résultats

sont résumés dans le tableau 7.

Tableau 7: Assimilation des substrats carbonés par les cinq souches de levure réalisée

sur la galerie: ID 32C

-: pas de trouble ; +: léger trouble ; ++: trouble moyen ; +++ : très bon trouble

TESTS Substrats C.lusitaniae H.uvarum K.ohmeri I.orientalis T.asahii

GAL D-GALactose +++ ++ +++ ++ +++

ACT Cycloheximide

(ACTidione)

- ++ - - +++

SAC D-Saccharose +++ - +++ +++ +++

NAG N-Acétyl-Glucosamine +++ - +++ +++ +++

LAT acide LAcTique +++ - + +++ +++

ARA L-ARAbinose ++ - - - ++

CEL D-CELlobiose +++ ++ +++ ++ +++

RAF D-RAFfinose ++ + +++ - -

MAL D-MALtose +++ - +++ ++ +++

TRE D-TREhalose +++ - +++ - +++

2KG potassium 2-

cétoGluconate

++ ++ +++ - +++

MDG Méthyl-αD-

Glucopyranoside

+++ - +++ - +++

MAN D-MANnitol +++ - +++ + +

LAC D-LACtose (origine

bovine)

- - - - +++

INO INOsitol - - - - -

O Pas de substrat 0 0 0 0 0


86

Comme prévu toutes les espèces de levures ont consommé de façon très active le glucose et

le galactose comme sources de carbone. Ces sucres simples représentent les formes

préférentielles de transport à l’intérieur de la cellule (Botton, 1991).

La souche Hanseniaspora uvarum a le spectre de l’utilisation de sucre le plus restreint pour

sa croissance puis qu’elle n’utilise pas certains substrats tels que le saccharose, le maltose et

le tréhalose, contrairement à la souche Kodamaea ohmeri dont le spectre est assez large.

Notons la capacité de croissance des souches Clavispora lusitaniae et Trichosporon asahii sur

les sucres à cinq carbones (C5) comme l’arabinose et le xylose (Tableau 7).

Cette analyse qualitative a montré que le spectre des sources de carbone utilisées par ces

souches ressemble beaucoup à celui trouvé dans la littérature excepté pour la souche

TESTS Substrats C.lusitaniae H.uvarum K.ohmeri I.orientalis T.asahii

SOR D-SORbitol ++ - +++ - -

XYL D-XYLose +++ - - - +++

RIB D-RIBose ++ ++ + - +++

GLY GLYcérol +++ - +++ ++ -

RHA L-RHAmnose +++ - + - +

PLE PaLatinosE +++ - +++ ++ +++

ERY ERYthritol - - - - ++

MEL D-MELibiose - - - - -

GRT sodiumGlucuRonaTe ++ - - - +++

MLZ D-MéLéZitose +++ - + ++ +

GNT potassium GlucoNaTe ++ ++ - ++ +++

LVT acide LéVulinique

(LeVulinTe)

++ - + - -

GLU D-GLUcose +++ ++ +++ +++ +++

SBE L-SorBosE +++ - ++ - +

GLN GLucosamiNe ++ - ++ - ++

ESC ESCuline

citrate de fer

++ ++ ++ - -


87

d’Issatchenkia orientalis. Cette souche isolée à partir du lait de chamelle du Sahara algérien

est sans doute génétiquement différente de celle qui a été isolée à partir du sirop de la

canne à sucre par Gallardo et ses collaborateurs et qui était incapable de croitre sur du

saccharose (Gallardo et al., 2011) et de la souche DMKU-3ET15, isolée à partir des saucisses

de porc fermentés incapable aussi de se développer sur du galactose, du maltose, du

saccharose et du melizitose (Yuangsaard et al., 2013).

4.2- Cinétiques et productions en aérobiose 4.2.1- Croissance sur milieux solides

Le milieu de culture crée un environnement favorable (humidité, température, pH,

etc.) et apporte tous les éléments nécessaires aux synthèses cellulaires et aux besoins

énergétiques des levures favorisant ainsi leur croissance. Cette dernière permet de suivre la

série d’interactions entre les levures et leur environnement. Pour ceci et dans un premier

temps trois milieux de culture: un milieu riche et complet (YPD), un milieu minimum (YNB) et

un milieu minéral synthétique (MMS) ont été utilisés pour vérifier la croissance des cinq

souches de levures retenues. Les résultats obtenus ne montrent aucun changement pendant

les trois jours de suivi et sont représentés dans la figure 20.

Figure 20: Culture des cinq souches de levures sur les milieux YPD, YNB et MMS solides

incubées à 30°C

Cette première culture réalisée sur ces milieux à l’état solide a montré que ces levures

trouvent tous les éléments nécessaires à leur synthèse et leur besoin énergétique dans ces

milieux en affichant une bonne croissance. Ceci à l’exception de la souche Hanseniaspora

uvarum qui exige trois vitamines pour croitre sur MMS: la vitamine B2 (riboflavine), la

vitamine B3 (niacine) et la vitamine B9 (l’acide folique) comme le montre la figure 21. Il

importe de noter que la composition du milieu YNB sur lequel elle a donné une croissance

positive et l’échantillon biologique à partir duquel elle a été isolée (les dattes) nous ont aidé

dans la détermination de son auxotrophie pour ces trois vitamines.


88

Figure 21: Culture de la souche Hanseniaspora uvarum sur MMS(A)

et MMS + vitamine B2, B3 et B9 (B)

A: Pas de croissance ; B: Croissance positive

En effet, la riboflavine (vitamine B2) et l’acide folique (vitamine B3) font partie des vitamines

qui représentent des facteurs de croissance pour certaines souches de levures. Par contre, la

niacine (Vitamine B9) qui est impliquée par l’intermédiaire des NAD+ et NADP+ dans la

synthèse de l’ATP, est synthétisée par la plupart des levures (Henry, 1983).

4.2.2- Cinétiques et productions sur milieux liquides

Afin de compléter ce travail, une cinétique a été suivie sur YPD et MMS liquides. Les

mesures spectrophotométriques ont permis d’évaluer le dédoublement de la population

pendant la croissance des quatre souches (H. uvarum ne pousse pas sur MMS). Les résultats

(figure 22) ont montré que la croissance des deux souches C. lusitaniae et I. orientalis, est

aussi importante sur YPD que sur milieu minéral synthétique (MMS) en donnant une

biomasse très proche. On note au contraire pour les deux autres (K. ohmeri et T. asahii) que

la biomasse donnée est plus faible sur MMS, que dans un milieu riche comme YPD, où elles

puisent directement les constituants de base dont elles ont besoin. Sur un milieu minimum,

elles doivent en effet synthétiser tous leurs constituants à partir des quelques substances

minérales et molécules organiques essentielles incluses dans ce le milieu. Une grande partie

de la source de carbone et d’énergie, en l’occurrence le glucose, est alors investi dans ces

voies anaboliques au détriment de la formation de la biomasse qui ne peut atteindre les

niveaux observés en croissance dans un milieu riche.


89

Figure 22: Cinétique des quatre souches de levures sur les milieux YPD et MMS,

incubées à 30°C

Le dosage du glucose et des métabolites à savoir l’éthanol, le glycérol et les acétates dans les

milieux de cultures précédents a été déterminé par HPLC. Les résultats représentés par la

figure 23 montrent que les souches C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri et I. orientalis

produisent, sur YPD, de l’éthanol à des quantités variant entre 4 et 6 g/L. Cette production

est très proche de celle de la CEN.PK122-2N qui atteint les 8 g/L. Même constatation pour le

glycérol et les acétates dont la production est assez faible.

Des résultats similaires ont été obtenus sur MMS à l’exception de la souche H. uvarum qui

exige sur ce support un supplément des trois vitamines citées précédemment. Seule la

souche T. asahii ne présente aucune production intéressante et les concentrations de

l’éthanol et du glycérol données sont très faibles. En effet, les levures sous la forme

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 3,5 6,5 9,5 12,5 15,5 18,5 24

K. ohmeri

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 23,

5 56,

5 89,

5 11

12,5 14

15,5 17

18,5 20

24

25,5

DO

600

C. lusitaniae YPD

MIN

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 23,

5 56,

5 89,

5 1112

,5 1415

,5 1718

,5 20 2425

,5

DO

600

Temps (h)

I. orientalis

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 2 3,5 5 6,5 12,5 15,5 18,5 24 30

Temps (h)

T. asahii


90

Figure 23: Productions des cinq souches et de la souche de référence CEN.PK122-2N

après culture sur milieux YPD et MMS et incubation à 30°C

indépendante révèlent un métabolisme plus actif que sous la forme mycélienne. Ceci est

fonction du rapport des masses et des surfaces respectives car elles offrent une plus grande

aire de contact avec le milieu extérieur.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4

Eth

, Gly

, Acé

t (g

/L)

Points de prélèvement

Trichosporpon asahii

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4

Points de prélèvement

CEN.PK122-2N

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4

Issatchenkia orientalis

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4

Eth

, Gly

, Acé

t (g

/L)

Kodamaea ohmeri

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4

Eth

, gly

,Acé

t (g

/L)

Clavispora lusitaniae

Eth/YPD

Eth/MIN

Gly/YPD

Gly/MIN

Acét/YPD

Acét/MIN

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4

Hanseniaspora uvarum


91

Sur la base de ces analyses, on peut conclure qu’à l’exception la souche T. asahii qui semble

différente car présente un métabolisme oxydatif pur, les autres souches présentent un

métabolisme oxydo-réductif avec assimilation de glucose aux rendements très proche de

celui de Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK122-2N).

4.3- Cinétiques et productions de la souche Issatchenkia orientalis

et CEN.PK122-2N sur YPD et MMS en anaérobiose Après avoir confirmé l’oxydation en aérobiose du sucre utilisé (le glucose), des cultures

réalisées en absence d’oxygène sur milieu solide et liquide ont montré qu’à l’exception de

Trichosporon asahii qui a un métabolisme oxydatif comme signalé précédemment, les autres

souches sont capables de croitre en anaérobiose et de fermenter le glucose.

La souche Issatchenkia orientalis qui sort du lot par ses capacités de résistance a été

sélectionnée pour être comparée à la souche de référence CEN.PK122-2N. Leur croissance

en anaérobiose, la consommation du sucre et leurs productions (éthanol, glycérol et

acétates dosés en HPLC) ont été suivies sur les mêmes milieux et sous les mêmes conditions

de culture que précédemment.

Les résultats (figure 24A) montrent que tout en consommant du glucose la souche

CEN.PK122-2N produit 8 g/L d’éthanol sur YPD et environ 10 g/L d’éthanol sur MMS pendant

la croissance. Cette production se stabilise au cours de la phase stationnaire et ce métabolite

n’est pas consommé dans ces conditions d’anaérobiose. Le glycérol est produit à une

quantité double sur MMS que sur YPD.

En anaérobiose et sur YPD, la production en éthanol de la souche Issatchakia orientalis est

de 20% supérieur à celle de la souche de référence CEN.PK122-2N, une production qui

dépasse les 10 g/L (figure 24B). Il en est de même pour la production du glycérol qui est plus

importante avec des valeurs deux fois supérieures à la souche de référence.

La différence au niveau de la production de ces deux métabolites (éthanol et glycérol) par les

deux souches est très bien appréciée sur les figures 25 et 26.


92

Figure 24: Cinétiques et productions de la souche CEN.PK122-2N (A) et de la souche

Issatchenkia orientalis (B) sur les milieux YPD et MMS après une incubation à 30°C en

anaérobiose

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6,5 9,5 23 26 Glu

, Eth

, Gly

, Acé

t (g

/L)

DO

600

Glycérol Acétates DO 600Glucose Ethanol

YPD

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6,5 9,5 23 26

Glu

, Eth

, G

ly, A

cét

(g/L

)

DO

600

MMS

A

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6,5 9,5 23 26

Glu

, Eth

, Gly

, Acé

t (g

/L)

DO

600

Temps (h)

YPD

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0

2

4

6

8

10

12

14

16

6,5 9,5 23 26

Glu

, Eth

, GLy

, Acé

t (g

/L)

DO

600

Temps (h)

MMS

B


93

Figure 25: Production d'éthanol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS)

par les deux souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis)

Figure 26: Production de glycérol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS)

par les deux souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis) (CN.PK-2: CEN.PK122-2N ; I orient: Issatchenkia orientalis ; MIN: MMS)

Fiechter et ses collaborateurs précisent que la croissance en anaérobiose n’est possible

qu’avec les levures sensibles au glucose à condition qu’il y ait un apport en ergostérol, en

acides gras insaturés et parfois certaines vitamines comme l’acide nicotinique car ces

molécules ne sont pas synthétisées dans ces conditions. Ils précisent aussi que dans les

cultures de Saccharomyces cerevisiae développées en anaérobiose, seulement 10% du

0

2

4

6

8

10

12

6,5 9,5 23 26

Eth

an

ol (

g/L

)

Temps (h)

CN.PK-2/YPD I orient/YPD CN.PK-2/MIN I orient/MIN

0

0,5

1

1,5

2

2,5

6,5 9,5 23 26

Gly

céro

l (g

/L)

Temps (h)

CN.PK-2/YPD I orient/YPD CN.PK-2/MIN I orient/MIN


94

glucose est converti en biomasse et le restant est transformé en produits de fermentation

que sont l’éthanol, le glycérol, l’acétate et le succinate (Fiechter et al., 1981). C’est ce qui a

été remarqué sur la figure 24A où la quantité de biomasse est faible par rapport aux cultures

en aérobiose. Il semble que la souche I. orientalis s’investit elle aussi dans la production

d’éthanol et de glycérol (figure 24B) en anaérobiose.

4.4- Cinétiques et productions sur différents substrats glucidiques Le sucre est le composé majoritaire dans le milieu après l’eau avec une teneur de 20 g/L.

Il influence les caractères physico-chimiques du milieu et agit sur sa viscosité. D’un milieu

riche en sucre en début de fermentation, on obtient une solution hydro-alcoolique

contenant très peu ou pas de sucre en fin de fermentation.

L’alcool est le composé majoritaire produit lors de la fermentation alcoolique, suivi du

glycérol et des acides produits en faibles quantités mais responsables des variations du pH.

Dans ce sens et afin de comparer et de compléter les résultats obtenus par la galerie ID 32C,

des cultures sont réalisées avec cinq substrats glucidiques: le glucose, le fructose, le

saccharose et le lactose, utilisés avec le milieu YP et le xylose avec le milieu YNB. Ces sucres,

en particulier le glucose, le saccharose et le lactose représentent les sucres majoritaires des

sous-produits comme le lactosérum et les mélasses utilisés dans la production du

bioéthanol. Le résultat de leurs cinétiques est résumé dans le tableau 8. Les dosages de leurs

productions ont montré une production très faible en acétates, les autres productions à

savoir l’éthanol et le glycérol sont représentées dans le tableau 9.

Tableau 8: Croissance des cinq souches sur quatre substrats glucidiques avec leur taux de croissance (µ [h-1])

(Milieu: YP et température d’incubation: 30°C)

(+ : Croissance positive, - : Pas de croissance).

.

Souches Glucose Fructose Saccharose Lactose

Clavispora lusitaniae + (0,88)

+ (0,89)

+ (0,75)

Faible

Hanseniaspora uvarum + (0,75)

+ (0,67)

-

-

Kodamaea ohmeri + (0,91)

+ (0,89)

+ (0,92)

-

Issatchenkia orientalis + (0,97)

+ (0,95)

Faible -

Trichosporon asahii + (0,31)

+ (0,30)

Faible Faible


95

Tableau 9: Productions des cinq souches sur quatre substrats glucidiques

(Milieu: YP et température d’incubation: 30°C)

(G: Glucose, F:Fructose, S: Saccharose, F: Fructose)

(-: Pas de production)

En consommant les trois sucres (glucose, fructose et saccharose), C. lusitaniae, qui ne pousse

pas sur le lactose, produit de l’éthanol à des concentrations sensiblement égales autour de 5

g/L. Cependant, une croissance insignifiante avec le saccharose et le lactose est observée

chez la souche Hanseniaspora uvarum. En revanche, avec les autres sucres elle donne une

production en éthanol comparable à celle de C. lusitaniae.

Le lactose ne semble pas favorable à la croissance de Kodamaea ohmeri. Par contre cette

dernière est très bien stimulée par les autres sucres, en particulier le saccharose. Les taux de

croissance obtenus avec ces sucres sont très proches et la production d’éthanol est

sensiblement égale. Même constatation pour le glycérol. Le dosage des différents sucres a

montré que chez cette souche, le saccharose qui est un diholoside est hydrolysé, comme le

précise la littérature, en glucose et fructose à l’extérieur de la membrane plasmique par des

glycosidases périplasmiques, contrairement à Saccharomyces cerevisiae où ce sucre est

transporté intact à travers le plasmalemme par un mécanisme de transport actif de type

symport-H+ (Santos et al., 1982).

La croissance de la souche Issatchenkia orientalis est beaucoup plus faible avec le lactose

qu’avec les autres sucres. La meilleure croissance est obtenue avec le glucose et le fructose

après une phase de latence d’un peu plus de trois heures et un taux de croissance plus élevé

que celui obtenu avec les autres sucres (tableau 8). Des études ont confirmé la fermentation

de ces deux sucres chez cette espèce (Barnett et al., 2000 et Gallardo et al., 2010). Cette

souche produit environ 8 g/L avec le glucose et le fructose, et ce dernier n’est pas assimilé,

Souches Ethanol (g/L) Glycérol (g/L)

G F S L G F S L

Clavispora lusitaniae 5,95 5,86 5,95 - 0,46 0,39 - -

Hanseniaspora uvarum 5,30 5,24 - - 0,54 0,85 - -

Kodamaea ohmeri 4 ,47 4,42 4,62 - 1,1 1,37 1,05 -

Issatchenkia orientalis 8,96 8,40 - - 1,24 1,5 - -

Trichosporon asahii 0,56 - - - 0,53 - - -


96

un résultat très intéressant. De même le glycérol est produit seulement avec le glucose et le

fructose et à des taux semblables (tableau 9). L’assimilation de ces métabolites a été

démontrée chez d’autres souches d’I. orientalis par Gallardo et ses collaborateurs (2010).

Cette propriété explique son utilisation dans la production des boissons alcoolisées (Basilio

et al., 2008 et Gallardo et al., 2010).

Même si la croissance n’est pas très importante et la phase de latence est un peu plus

longue, Trichosporon asahii poussent pratiquement sur tous les sucres (tableau 8). Mais au

niveau production cette souche n’est pas intéressante (tableau 9).

Sur la base de ces analyses de croissance et à l'exception de T. asahii, les autres souches de

levures en croissance exponentielle sur glucose, saccharose et fructose montrent des

vitesses de croissance très élevées. Ces souches et en particulier K. ohmeri peuvent être

utilisées dans la valorisation des mélasses de canne à sucres et de betteraves qui

contiennent principalement du glucose et du saccharose.

Les analyses obtenues avec ces quatre sucres reflètent les résultats de la galerie ID 32C et

confirment que le glucose est le sucre utilisé par l’ensemble des levures. Ceci en plus

d’autres monosaccharides dont certains entrent directement en chaînes de réaction de la

fermentation comme le fructose. Ces sucres simples sont en effet les formes préférentielles

de transport à l’intérieur de la cellule.

Le dosage de l’éthanol, du glycérol et des acétates qui résultent de la consommation de ces

sucres montre que:

l’acide acétique est produit à des quantités très faibles (données non représentés), ce

qui est mentionné dans la littérature. Cette production peut être augmentée dans un

milieu alcalin à cause de l’enzyme responsable (l’acétaldéhyde déhyrogénase) qui

fonctionne très bien en condition basique. Cet acide toxique pour les levures, ainsi

que les autres acétates traversent le plasmalemme des levures par diffusion passive.

Cette diffusion, lente à pH neutre, est favorisé par un pH acide et entraine une

acidification à l’origine d’une protéolyse généralisée conduisant à la mort cellulaire.

Le glycérol produit est formé par la réduction de la dihydroxyacétone phosphate

grâce à la glycérol-3-phosphate déshydrogénase à NAD qui donne le glycérol-3-

phosphate qui est hydrolysé en glycérol par une phosphatase spécifique (Holzer et

al., 1963). Il peut être obtenu par une autre voie grâce à la glycérol déshydrogénase à

NADP qui catalyse la transformation du glycéraldéhyde en glycérol après action d’une

phosphatase sur le glycéraldéhyde 3-phosphate. Cette fermentation est souvent en

équilibre avec la voie de synthèse de l’éthanol et les conditions défavorisant cette

production sont également celles qui stimulent la formation du glycérol.


97

L’éthanol représente le métabolite majeur produit par toutes les souches excepté T.

asahii principalement avec le glucose et le fructose. Les réactions qui conduisent à

l’éthanol sont les suivantes :

L’acide pyruvique est, dans une première étape décarboxylé en CO2 et

acétaldéhyde, grâce à la pyruvate décarboxylase qui a pour coenzyme la

thiamine pyrophosphate ;

Dans une deuxième étape l’acétaldéhyde est réduit en éthanol par l’alcool

déshydrogénase, ce qui permet la réoxydation du NADH.

Le système de transport d’électrons ne fonctionne pas et il n’y a aucune synthèse d’ATP

correspondante. Ce métabolisme fermentaire du glucose est localisé dans le cytoplasme et

les cellules en fermentation ont peu de mitochondries qui sont caractérisées par l’absence

de crêtes bien développées. L’énergie est obtenue seulement à partir de la glycolyse (2 ATP

par molécule de glucose consommée) et le cycle de Krebs est fortement réduit bien qu’il

serve encore à produire des intermédiaires pour les biosynthèses.

4.4.1- Cultures et productions des cinq souches sur xylose

La production de l’éthanol à partir de la biomasse renouvelable tels que les matières

lignocellulosiques et les résidus agricoles, appelé biocarburant ou agrocarburant peut

résoudre, du moins partiellement, les problèmes annoncés de la disparition des énergies

fossiles et réduire les émissions de gaz à effet de serre (Bothast et Saha, 1997 et Zaldivar et

al., 2001). Ceci représente l’objectif de plusieurs travaux afin que ce type de production

devient une alternative prometteuse au pétrole (Klinke et al., 2004 ; Liu, 2006). Pour essayer

de répondre à cette problématique nous avons choisi d’étudier la croissance de nos souches

sur xylose.

Les cultures réalisées sur un milieu minimum (YNB) avec xylose comme seule source de

carbone (YNX) affichent une croissance seulement de deux souches: Clavispora lusitaniae et

Issatchenkia orientalis (figure 27).

La croissance en erlenmeyer sur xylose confirme l’incapacité des autres souches (H. uvarum,

K. ohmeri et T. asahii) à pousser avec ce substrat glucidique. Les seules souches qui utilisent

ce dernier donnent une croissance très faible en particulier I. orientalis et ceci après une

longue phase de latence (figure 28). Les dosages réalisés par HPLC ne décèlent aucune

production en éthanol (figure 29). Ce résultat explique que ces deux souches ne fermentent

pas le xylose et que ce dernier est converti en xylitol, qui en s’accumulant est connu pour

devenir toxique à la cellule (Hahn-Hägerdal et al., 2007).


98

Figure 27: Culture des cinq souches sur milieu YNX (2%) solide et liquide

I.o : Issatchenkia orientalis C.l : Clavispora lusitaniae

Figure 28: Cinétique de C. lusitaniae et I. orientalis sur YNX incubées à 30°C

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 3 4,5 7,5 24 28 33 48 54 58 67 73

DO

600

Temps (heures)

C.lusitaniae I.orientalis

I.o C.l


99

Xyl: Xylose ; Eth: Ethanol ; Gly: Glycérol ; Acét: Acétates.

Figure 29: Productions de C. lusitaniae et I. orientalis sur YNX

Les études réalisés sur la conversion de ce sucre soulignent deux enzymes métaboliques clés

que les levures utilisent dans la dégradation du xylose: la xylose réductase (XR) et la xylitol

déshydrogénase (XDH). Chez la levure, la phosphorylation des pentoses s’effectue

généralement après la transformation des aldopentoses en cétopentoses (pentuloses), ainsi,

le D-xylose est isoméré en D-xylulose. Ces cétopentoses sont utilisés par un grand nombre

de levures mais seulement un petit nombre possédant les isomérases spécifiques utilisent

les aldopentoses. La XR convertit le xylose en xylitol et la XDH catalyse l'oxydation du xylitol

pour la production du xylulose. Ce dernier est phosphorylé par une xylulokinase (XK) en

xylulose 5-phosphate puis métabolisé en éthanol en suivant la voie de la glycolyse et la voie

des pentoses phosphate (Lee et al., 2012). Ces résultats nous laissent supposer que C.

lusitaniae possède au moins la XR (xylose réductase).

5- Profil aromatique des cinq souches de levures

retenues

5.1- Le profil d’accumulation des alcools supérieurs et leurs acétates Dans les fermentations alcooliques, en dehors de l’éthanol, les levures produisent des

alcools (Mallouchos et al., 2002). Ces derniers ainsi que leurs esters présentent des

0

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

25

30

35

40

28 48 54 67 73X

yl, E

th, G

ly, A

cét

Do

600

Temps (heures)

Glycérol (g/L) Acétates (g/L)

DO 600 Ethanol (g/L)

Xylose (g/L)

0

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

25

30

35

40

28 48 54 67 73

Xyl

, Eth

, Gly

, Acé

t

DO

600

Temps (heures)


100

propriétés organoleptiques intéressantes, très utiles et appréciées par le consommateur.

Certains de ces agents aromatisants continuent à être produits par des procédés chimiques.

C’est le cas du 2-phényléthanol, alcool utilisé pour son arôme de rose, qui est encore

synthétisé par voie pétrochimique à partir du toluène, du benzène, du styrène (Nomura et

al., 2001) produits cancérigènes et/ou dangereux pour la santé et l’environnement (Clarck,

1995 ; Etschmann et al., 2002) ou qui est extrait à partir des pétales de rose par un processus

très coûteux (Fabre et al., 1998).

Alors que la demande des consommateurs pour ces additifs alimentaires naturels est en

hausse (Lugay, 1986 et Anonyme, 1999), l’option de l’obtention de ces produits par voie

microbienne paraît donc la plus appropriée. En effet, de nombreux travaux ont été réalisés

dans ce sens et le profil aromatique de différentes souches de levure a été étudié. C’est le

cas de quatre de nos espèces sélectionnées connues pour participer à la maturation des

fromages en améliorant et en rehaussant leurs saveurs et leurs odeurs. K. ohmeri et I.

orientalis ont été isolées respectivement à partir des produits laitiers traditionnels brésiliens

(Borelli et al., 2006) et égyptiens (El-Sharoud et al., 2009). C. lusitaniae (Wyder et Puham,

1999) et H. uvarum (Pando-Bedrinana et al., 2011) ont été isolées à partir d’autres types de

fromage comme le camembert (Chen et al., 2011). Ces souches jouent également un rôle

capital dans les boissons alcoolisées en assurant un meilleur équilibre entre les alcools

supérieurs et leurs esters (Mingorance-Cazola et al., 2003 ; Clemente-Jimenez et al., 2004 et

Baffi et al., 2011) et peuvent de ce fait avoir une valeur applicative importante dans

l’optimisation de ces derniers (Kim et al., 2008 ; Hernandez-Orte et al., 2008 et Wang et al.,

2011).

Un des objectifs de nos recherches a été d’étudier la production des arômes par ces cinq

souches. Les souches sélectionnées et la souche de référence Saccharomyces cerevisiae

CEN.PK122-2N ont été cultivées sur glucose. L’azote est apporté par le sulfate d’ammonium

dans les milieux YPD et MMS (milieu minéral synthétique), alors que le milieu MMS-AA

(milieu minéral synthétique enrichi) a été supplémenté par trois acides aminés (la leucine,

l’isoleucine et la phénylalanine). La présence de ces acides aminés provoque un besoin

anabolique chez ces souches qui les transforment en alcools par la voie d’Erlich. La nature

des sources carbonées et azotées joue donc un rôle prépondérant dans la production

d’arômes tant sur le plan qualitatif que quantitatif (Yong et al., 1985 ; Yong et Lim, 1986 ;

Berger et al., 1987 et Gross et al., 1989). L’analyse chromatographique des bouillons de

fermentation de ces levures a permis d’identifier: un alcool amylique (2MB: 2-

méthylbutanol), un alcool isoamylique (3MB: 3-méthylbutanol) et le 2-phényléthanol (2PE).

Les profils d’accumulation de ces trois alcools supérieurs sont illustrés dans la figure 30.


101

Figure 30: Profil d’accumulation des alcools supérieurs (2MB, 3MB et 2PE)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

YPD MMS MMS-AA

2MB

(m

g/L

)

2MB

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

YPD MMS MMS-AA

3MB

(m

g/L

)

3MB

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

YPD MMS MMS-AA

2PE

(mg/

L)

Milieux

C. lusitaniae H. uvarum K. ohmeri I. orientalis T. asahii CEN.PK122-2N

2PE


102

par les six souches de levures étudiées sur trois

milieux différents (YPD, MMS et MMS-AA)

Nous observons que la souche T. asahii ne produit aucun de ses alcools. Elle a été plutôt

utilisée pour la production de la coumarine en assimilant des phénylalcanes avec des chaînes

d’alkyle de 7 à 12 atomes de carbones (AWE et al., 2009). Ce produit a une odeur douce,

poudrée et amandée qui évoque le foin et le tabac, est très utilisé en note de fond dans de

nombreux parfums orientaux et est un excellent fixateur. En revanche les résultats obtenus

avec les autres espèces montrent des productions variables.

La production de ces composés aromatiques est plus importante sur YPD, milieu complexe

riche en acides aminés qui proviennent de la peptone. En revanche elle est très faible sur le

MMS, ce qui était attendu car c’est un milieu minimum qui ne possède que le sulfate

d’ammonium comme seule source d’azote. Lorsqu’on ajoute au milieu MMS les acides

aminés, précurseurs de ces alcools supérieurs, la production est augmentée. Ce qui indique

que la production de ces alcools supérieurs dans un milieu riche est le résultat de la

bioconversion de l’excès des chaînes ramifiées et des acides aminés présents dans le milieu

de culture par la voie catabolique Ehrlich (Hazelwood et al., 2008).

Sur YPD, c’est Issatchenkia orientalis qui semble trouver dans ce milieu les acides aminés

nécessaires à la synthèse de ces alcools en particulier le 3MB et le 2PE dont la production

dépasse légèrement les 150 mg/L, suivie de la souche de référence (CEN.PK122-2N) et de

Kodamaea ohmeri (exception faite pour le 2PE). Pour les souches Clavispora lusitaniae et

Hanseniaspora uvarum, la production la plus importante qui a été noté sur ce milieu est celle

du 3MB qui est autour de 100 mg/L.

Les acides aminés (leucine, isoleucine et phényalanine) semblent bien stimuler la production

de ces alcools pour les autres souches, mais à des concentrations différentes:

Le 2MB: C. lusitaniae et la souche de référence donnent les meilleures productions

entre 250 et 300 mg/L suivies de K. ohmeri et d’I. orientalis dont la production est

inférieure à 100 mg/L.

Pour le 3MB, la différence n’est pas très significative entre les quatre souches et leurs

productions varient entre 300 mg/L et 400 mg/L.

Par contre, une différence considérable est affiché au niveau du profil du 2PE où I.

orientalis a été remarquablement singulier avec une concentration très proche des

1000 mg/L représentant pratiquement le double de la concentration donné par S.

cerevisiae en mg/L. Notre souche C. lusitaniae dont la production dépasse

légèrement les 700 mg/L, possède des performances de bioconversion deux fois

supérieurs à celle étudiée par Etschmann et Schrader en 2006 (C. lusitaniae DS MZ

70487) dont la production était de 330 mg/L.


103

Il est important de souligner que l’addition de phénylalanine stimule fortement la

production du 2PE (Fabre et al., 1998 et Starck et al., 2002). Ceci a été démontré chez

S. cerevisiae (Albertazzi et al., 1994), chez Kluyveromyces marxianus (Fabre et al.,

1997), ainsi que chez K. thermotolerantis (Etschmann et al., 2002). Notre étude le

confirme chez I. orientalis et C. lusitaniae. Ce résultat suggère que la bioconversion

de la phénylalanine en 2-phényléthanol par la voie Ehrlich est plus efficace chez I.

orientalis que chez Saccharomyces cerevisiae. Il serait donc intéressant de comparer

les capacités enzymatiques de la voie Ehrlich entre ces deux souches de levure et en

particulier celles de la transaminase et la décarboxylase qui jouent un rôle clef dans

cette voie (Hazelwood et al., 2008).

Parmi les espèces testées, C. lusitaniae peut être sélectionnée pour la production du 2-

méthylbutanol, K. ohmeri pour la production du 3-méthylbutanol et I. orientalis pour la

production du 2-phényléthanol.

Les esters correspondant à ces alcools supérieurs (2MBA, 3MBA et 2PEA) sont au dessous du

seuil de détection pour la majorité des souches testées (donnés non représentés). Seules H.

uvarum et I. orientalis qui donnent une petite production :

H. uvarum produit du 2MBA (2-méthylbutylacétate) à une quantité très faible (13,14

mg/L) avec des notes sensorielles très prononcées sur le milieu YPD. Ces notes ont

été décelées dans le vin ainsi que dans d’autres boissons alcoolisées comme celle

obtenue à partir du jus d’orange (Mingorance-Cazola et al., 2003). Plusieurs travaux

ont déjà souligné l’efficacité des souches apiculées dans la production des esters sans

aucune influence négative sur la production d’alcools supérieurs (Liu et al., 2012).

Et I. orientalis qui produit du 3MBA (3-méthylbutylacétate), sur MMS-AA, à une

concentration de 225,5 mg/L et le 2PEA (2-phényléthylacétate) à 12,5 mg/L. Ce

composé aromatique (2PEA) essentiel pour les industries alimentaire et cosmétique a

déjà fait l’objet de nombreuses études.

5.2- Tolérance au 2-phényléthanol Parmi les produits aromatiques cités ci-dessus notre intérêt s’est porté plus

particulièrement sur le 2-phényléthanol dont la production était très importante chez la

souche d’ I. orientalis. Ce produit s’avère toxique pour les levures et entraîne l’arrêt de leur

croissance, ce qui réduit leur tolérance ainsi que leur production finale (Starck et al., 2002 et

Starck et al., 2003). Ces constations, nous ont orientés vers l’étude de cette inhibition avec

nos souches afin de voir si elles sont moins affectées par la présence du 2-phényléthanol.

Des essais (au nombre de trois) ont été réalisés en faisant varier la concentration en

phényléthanol exogène de 1 à 5 g/L (figure 31).


104

Figure 31: Croissance des souches à différentes concentrations du 2-phényléthanol

sur YPD solide incubées à 30°C et à 40°C

(CN : CEN.PK122-2N ; Ta : Trichosporon asahii ; Io : Issatchenkia orientalis; Ko : Kodamaea ohmeri ;

Hu : Hanseniaspora uvarum ; Cl : Clavispora lusitaniae).

1g/L

2g/L

2,5g/L

3g/L

5g/L

10-1

10-2

10-3

10-4

10-1

10-2

10-3

10-4

10-1

10-2

10-3

10-4

10-1

10-2

10-3

10-4

10-1

10-2

10-3

10-4

30°C 40°C

CN Ta Io Ko Hu Cl CN Ta Io Ko Hu Cl


105

Sur un milieu riche (YPD), on note une sensibilité de toutes les espèces à partir de 2 g/L de

phényléthanol, y compris la souche de référence S. cerevisiae dont la résistance ne dépasse

pas les 2,5 g/L de phényléthanol. En revanche I. orientalis montre une résistance qui atteint

les 5 g/L à une température d’incubation de 30°C et de 2,5 à 3g/L à 40°C. Sur milieu

minimum (YNB) la résistance est moins marquée même pour la souche I. orientalis qui ne

dépasse guerre 2 g/L (résultats non représentés). Ces résultats confirment l’action délétère

du phényléthanol exogène sur ces souches et traduisent une inhibition de leur croissance au

fur et à mesure que la concentration augmente dans le milieu. De plus l’effet synergique du

phényléthanol et de la température est évident sur l’ensemble des souches.

Le niveau de production très élevé du 2-phényléthanol par I. orientalis est corroboré avec la

plus grande résistance de cette espèce à ce produit. Elle se révèle donc doublement

résistante par rapport aux autres levures étudiées jusqu’à présent, en particulier S.

cerevisiae qui résiste à 2,5 g/L. I. orientalis est donc une candidate importante pour la

production du 2-phényléthanol. Il serait intéressant de poursuivre cette étude dans des

conditions contrôlées pour analyser la bioconversion réalisée par cette souche.

6- Intérêt et dynamique physiologique de la

souche Issatchenkia orientalis

La production du bioéthanol par voie biologique a été couronnée de succès car considérée

comme une stratégie visant à réduire le coût de l’énergie (Maiorella et al., 1984). En plus,

elle peut se faire à partir de biomasse qui n’est pas en concurrence avec la production

alimentaire comme les résidus agricoles, les déchets alimentaires et industriels. Par

conséquent, l’utilisation des levures tolérantes à plusieurs types de stress qui constituent

des inhibiteurs de la fermentation est souhaitable. De nombreuses études ont été réalisées

dans ce sens et différentes levures ont été soumises à ces stress tels que les changements de

températures, de pH et des concentrations élevées en éthanol (Keatig et al., 2006 ; Gibson et

al., 2007 et Liu et al., 2009). Parmi ces dernières ont peut citer celle de Caker et ses

collaborateurs qui ont rapporté le génie évolutif de S. cerevisiae qui présentait une

résistance accrue au stress thermique, au stress éthanol et aux contraintes oxydatives (Caker

et al., 2005). Récemment, Benjaphokee et ses collaborateurs ont développé une souche de

S. cerevisiae présentant une grande productivité en éthanol (plus de 90%) sous différentes

contraintes (41°C et un pH de 3,5) (Benjaphokee et al., 2011). Mais les résultats apportés

jusque là présentent des inconvénients car ses souches sont manipulées génétiquement et

que le rendement à l’échelle industrielle est onéreux.

De même pour le phényléthanol qui est utilisé dans différents domaines et occupe la

deuxième place après l’éthanol sur le plan commercial, dont la sensibilité pose un problème


106

sérieux qui a incité les chercheurs et les industriels à adopter des méthodes très couteuses

comme l’extraction de cet arôme.

Des souches naturellement résistantes sont préférables car elles présentent certains

avantages par rapport au coût et à leur manipulation.

Les résultats de notre travail montrent que la souche Issatchenkia orientalis, connu

également sous le nom de Pichia kudriavezii ou Saccharomyces krusei ou Candida krusei

présente des caractéristiques intéressantes, dont une meilleure capacité de production et

une résistance à l’éthanol et au phényléthanol.

De plus en évaluant la tolérance de nos souches aux diverses conditions stressantes la

souche Issatchenkia orientalis, isolée à partir du lait de chamelle, est sortie du lot grâce à ses

propriétés multi-résistantes en affichant clairement une grande résistance à tous les stress

étudiés :

Cette souche est restée viable en raison de sa tolérance à des températures allant

jusqu’à 42°C, des conditions thermiques qui sont mortelles pour certaines souches de

Saccharomyces cerevisiae. Ce résultat est très prometteur car les levures capables de

croître et de produire de l’éthanol à grande température peuvent étendre le

processus de fermentation au-delà des limites tolérées par S. cerevisiae (35°C) (Isono

et al., 2012). En plus la sélection et l’adaptation des levures à hautes températures

est très importante dans la production à grande échelle en particulier dans les

régions tropicales où le refroidissement du système est très couteux. Certaines

souches thermo-tolérantes étaient capables de produire de l’éthanol à des

températures variant entre 30°C et 40°C comme Kluyvermyces marxianus (Singh et

al., 2006), mais aucune autre espèce n’a donné jusqu’à présent des productivités

importantes en éthanol à une température variant entre 41 et 43°C comme

Issatchenkia orientalis (Isono et al., 2012). Cette espèce peut représenter donc un

organisme de choix car la résistance à la température est un paramètre crucial pour

les procédés de bioconversion.

Elle est également tolérante aux pH acides, une tolérance allant jusqu’à 2,5 et peut

être plus. A ce pH, une souche industrielle de S. cerevisiae est capable de produire de

l’éthanol (De Molo et al., 2010) mais I. orientalis est plus résistante à l’acide lactique

(Thalagala et al., 2009) et l’acide acétique (Sarkar et al., 2012) que S. cerevisiae. Cette

tolérance aux conditions acides est très importante car elle permet de minimiser les

risques de contamination bactérienne et de réduire le coût de la stérilisation.

Cette souche affiche également une résistance aux stress osmotique et salin qui sont

d’une importance considérable à l’échelle industrielle car ils permettent de réduire le

coût du dessalement et de diminuer les risques de contamination (Isono et al.,

2012).


107

Une étude détaillée sera intéressante pour caractériser mieux les résistances de cette

souche. Pour atteindre cet objectif, cette partie de la thèse explore donc le comportement

de cette souche au cours du processus de fermentation en suivant les données macro-

cinétiques tels que les concentrations en substrats (glucose) et en produits (éthanol, glycérol

et acide acétique). Ce travail a été précédé par une caractérisation et une quantification de

la résistance de la souche Issatchenkia orientalis placée sous contraintes environnementales

en utilisant des concentrations croissantes en éthanol sur milieu liquide en focalisant la

viabilité cellulaire.

6.1- Analyse de la viabilité cellulaire L’effet néfaste de l’augmentation de la concentration initiale en éthanol sur les

paramètres globaux de croissance ne fait aucun doute et la perte de viabilité des cellules

pendant la fermentation pose un problème sérieux pour la production de l’éthanol. Dans ce

sens et afin de compléter notre étude une analyse de la viabilité cellulaire a été réalisé sur

des cultures avec de l’éthanol exogène avec les mêmes milieux (YPD et YNB) à l’état liquide

et une incubation à 30°C. La série de culture a été réalisée en utilisant différentes

concentrations en éthanol qui ont été choisies en fonction des résultats obtenus sur milieu

solide. Ainsi l’évolution de la croissance mesurée par spectrophotmétrie et de la viabilité

cellulaire mesurée par comptage microscopique après coloration au bleu de méthylène ont

été suivies en fonction du temps. Cette étude analyse la dynamique de réponse du

paramètre « viabilité» face aux changements d’environnement « éthanol » qui peut être

caractérisée par l’évolution temporelle de la viabilité en fonction de l’état physiologique

initial et de la concentration en éthanol produit.

Les résultats de croissance où chaque courbe correspond à une culture contenant une

concentration différente en éthanol initialement ajoutée ainsi que ceux de la viabilité

cellulaire sont rassemblés dans la figure 32.


108

Figure 32: Evolution de la croissance de la souche I. orientalis et de la proportion des

cellules viables au cours de cultures avec différentes concentrations en

éthanol exogène sur deux milieux YPD et YNB à 30°C

Les résultats montrent qu’une baisse de croissance de la souche I. orientalis est noté à partir

de 5% d’éthanol (V/V) par rapport à la culture témoin (0% d’éthanol (V/V)) et ceci sur les

deux milieux (YPD et YNB) où on a obtenu les même résultats au niveau de la croissance et

du pourcentage des cellules viables qui est de 80%.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 2

3,5 5

6,5 8

9,5 11

12,5 25 28 30 32 34

DO

600

0% 5% 8% 12% 20%

0102030405060708090

100

0 10 20 30

Po

urc

enta

ge

des

cel

lule

s vi

ab

les

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

DO

600

Temps (h)

0% 5% 8% 12% 16%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30

Po

urc

enta

ge

des

cel

lule

s vi

ab

les

Temps (h)

YPD

YNB


109

Pour une concentration initiale en éthanol de 8% d’éthanol (V/V), on remarque une

croissance faible, une phase de latence longue et une diminution au niveau des cellules

viables en particulier sur YNB puisque la viabilité cellulaire a été réduite de 35% sur YPD et

de 40% sur YNB. La souche a donc besoin d’une période d’adaptation beaucoup plus longue

lorsque la concentration initiale en éthanol dans le milieu est élevée.

Une inhibition totale de la croissance est observée pour une concentration initiale en

éthanol supérieure à 12% et la viabilité cellulaire diminue de façon significative pour se

situer aux alentours de 50% sur YPD et de 70% sur YNB au bout de 20h. Cette valeur seuil

s’est avérée être différente de la valeur obtenu sur milieu solide et ceci peut s’expliquer par

la concentration cellulaire de l’inoculum utilisé. Mais cette souche reste la plus intéressante

en terme de résistance.

Il importe de noter que le test de la reprise des capacités de croissance réalisée comme

indiqué dans la partie matériel et méthodes a montré que cette dernière était positive et on

a noté en 14 h seulement une reprise de 37,32% de cellules viables sur milieu liquide et une

croissance qui était d’autant plus rapide que la concentration initiale en éthanol dans le

milieu est faible.

6.2- Aspect macrocinétique de la fermentation alcoolique type batch En plus de l’étude de l’effet « choc-éthanol », une autre approche de compréhension a

été réalisée afin d’analyser l’effet de l’éthanol produit par la souche au cours de la

fermentation en condition contrôlée et d’évaluer la performance de cette souche pour la

production de cet alcool.

La fermentation présentée dans cette thèse a été réalisée en mode batch sur milieu

minimum YNB en utilisant le glucose comme substrat carboné et le sulfate d’ammonium

comme source d’azote. Plusieurs paramètres sont contrôlés et régulés: le pH à 3, la

température à 30°C et l’agitation et l’aération afin de maintenir une pression partielle en

oxygène au-dessus de 20% (cf. Matériel et Méthodes).

Pour répondre à notre objectif, l’impact de l’éthanol est suivi au cours de cette fermentation

ainsi que l’évolution des différents paramètres tels que le substrat, la biomasse, l’éthanol et

autres co-métabolites (glycérol, acide acétique) en fonction du temps.

Les résultats présentés dans la figure 33 nous permet de souligner quelques différences par

rapport aux autres souches de levures y compris la souche de référence Saccharomyces

cerevisiae.


110

Figure 33: Evolution cinétique de la biomasse, du glucose, de l’éthanol et co-produits au cours d’une culture en mode batch de la souche Issatchenkia

orientalis sur YNB.

Tout d’abord, le taux maximum de croissance (0,389 h-1) est obtenu dans les premières

heures et la croissance cellulaire est couplée à la production d’éthanol et du glycérol

pendant toute la fermentation. Ceci est observé chez les autres levures, principalement

Saccharomyces cerevisiae, uniquement pendant la première phase de la fermentation

(Barford, 1981 ; Van Dijken et Pronk, 1995 et Pham et al., 1998). La production de cette

fermentation est de 8,61 g/L d’éthanol, 1,50 g/L de glycérol et 0,42 g/l d’acide acétique.

On note que la production d’acide acétique est très faible et que la quantité du glycérol

produit augmente avec celle de l’éthanol. Ce comportement peut être lié, selon plusieurs

auteurs, au rôle attribué au glycérol dans la protection de la cellule «en conditions

stressantes » (Omori et al., 1996 et Nevoigt et Stahl, 1997), elle est également associée à la

production de biomasse pour l’équilibre redox.

La productivité en éthanol, qui reflète la performance d’une fermentation, reste stable le

reste du temps de la fermentation. Aucune chute de croissance n’a été notée ce qui reflète

la capacité d’adaptation de cette levure et explique sa résistance à ce stress. L’originalité de

ces résultats réside dans :

l’absence de toute concentration critique en éthanol,

et la non consommation de l’éthanol produit, contrairement à la plupart des autres

levures ainsi qu’à certaines souches d’I. orientalis comme la DY252 étudiée par Shin

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

0,00

5,00

10,00

15,00

- 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Glu

-E

tOH

-G

ly -

Ace

(g

/L)

DO

60

0

Temps (h)

Glycérol Acétate DO600 Glucose Ethanol


111

et ses collaborateurs (2002) où on marque une transition diauxique à 1h de la

consommation du glucose.

Elle maintient de plus ses capacités de croissance et de productions ce qui est très important

et même indispensable pour l’intensification des productions microbiennes. Ajoutons à cela

son grand niveau de tolérance, une condition importante qui permet d’augmenter le

rendement en éthanol.

Au vu de l’ensemble de ces résultats, cette souche se révèle intéressante et mérite une

attention particulière pour déterminer le mécanisme de cette résistance. D’autres

fermentations doivent être envisagées afin de pouvoir améliorer le niveau de production de

cette souche en jouant sur les paramètres de culture.

CONCLUSION GENERALE

ET PERSPECTIVES

Conclusion Générale et Perspectives

113

L’étude et la maîtrise de la tolérance à certains stress sont très importantes. Ces contraintes peuvent entraîner une baisse de la croissance des levures en affectant leur production. Cette étude traite un sujet important dans les technologies microbiennes. En complément à de nombreux travaux qui ont étudié l’effet des différents stress sur la physiologie des levures, ce travail permettra de prolonger ces connaissances sur d’autres levures provenant de divers biotopes non explorés et très peu étudiées. Il s’agit des souches sauvages issues d’un écosystème naturel particulier. Ainsi les traits originaux de ces levures peuvent être exploités.

L’étude des caractéristiques culturales et morphologiques ont permis de mettre au point les

différences phénotypiques entre les cinq souches isolées (Clavispora lusitaniae,

Hanseniaspora uvarum, Kodamaea ohmeri, Issatchenkia oreintalis et Trichosporon asahii). L’étude physiologique de ces souches qui a porté principalement sur l’assimilation des

différents substrats carbonés et la croissance sur différents milieux de culture, en aérobiose

et en anaérobiose a déterminé le type trophique et le métabolisme glucidique de chacune

de ces souches. Les résultats obtenus montrent qu’en anaérobiose, la souche I. orientalis

s’investit dans la production de l’éthanol qui dépasse légèrement celle de la souche de

référence et dont la production du glycérol est deux fois plus élevée que celle obtenue par la

CEN.PK122-2N. Ces analyses ont été complétées par le dosage en HPLC de la consommation

des différents substrats et de certains métabolites tels que l’éthanol, le glycérol et les

acétates. Ces dosages révèlent une production importante autour de 8 g/L d’éthanol

produite par la souche I. orientalis avec le glucose et le fructose comme substrats

glucidiques.

En complément, la tolérance à certains stress tels que la température, le pH, la salinité, le

stress osmotique et le stress éthanol a permis de souligner l’importance de certaines d’entre

elles en particulier la souche Issatchenkia orientalis (portant également le nom de Pichia

kudriavezii) qui possède des potentialités très intéressantes en terme de résistance. Elle

résiste à une température allant jusqu’à 42°C, un pH très acide de 2,5. Sa résistance au stress

salin (NaCl: 0,5M) et au stress osmotique (sorbitol : 2M) persiste même à 40°C. Avec

l’éthanol, elle a démontré une résistance importante dépassant celle de la souche de

référence. Sur un milieu riche (YPD solide), elle résiste jusqu’à 18% d’éthanol (V/V) à 30°C et

40°C. En revanche dans des conditions minimum (YNB solide), elle résiste à 18% d’éthanol

(V/V) à 30°C et cette résistance baisse à 10% d’éthanol (V/V) à 40°C. Cependant, et dans de

telles conditions, elle reste toujours supérieur aux limites données par la souche de

référence Saccharomyces cerevisiae CEN.PK122-2N. Cette souche, encore peu étudiée,

montre des intérêts importants en biotechnologie, principalement dans la production du

bioéthanol.

Conclusion Générale et Perspectives

114

La deuxième partie de ce travail a porté sur l’étude des profils aromatiques de chacune de

ces souches (C.lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii) en ciblant les

molécules les plus produites par les levures telles que le 2-méthylbutanol (2MB), le 3-

méthylbutanol (3MB) et le 2-phényléthanol (2PE). Des cultures puis des extractions ont été

réalisées en utilisant trois milieux avec différents substrats azotés. Les dosages réalisés en

CPG-FID ont révélé que pour le 2MB, c’est C. lusitaniae et la souche de référence qui

donnent les meilleures productions variant entre 250 et 300mg/L. Pour le 3MB, la souche K.

ohmeri se caractérise par une production dépassant les 400mg/L. Par contre, la souche I.

orientalis a donné une production remarquable en 2PE avec une concentration très proche

des 1000 mg/L représentant pratiquement le double de la concentration donnée par S.

cerevisiae en mg/L. Le niveau de production très élevé du 2-phényléthanol par I. orientalis

est corroboré avec la plus grande résistance de cette espèce à ce produit. Elle se révèle donc

doublement résistante par rapport aux autres levures étudiées jusqu’à présent, en

particulier S. cerevisiae qui résiste à 2,5 g/L. I. orientalis est donc une candidate intéressante

pour la production du 2-phényléthanol.

Cette souche a bénéficié d’une attention particulière et la dynamique de sa physiologie a été

poussée plus loin en étudiant une fermentation en mode batch. Cette dernière a permis de

noter l’absence d’une phase diauxique qui explique que l’éthanol produit par cette souche

n’est pas consommé ; ceci reflète sa performance dans la production de cet alcool. En plus,

aucune chute de croissance et aucune concentration critique n’ont été remarquées, ce qui

confirme sa capacité d’adaptation et sa résistance à ce stress.

Ces premiers résultats obtenus avec la souche d’Issatchenkia orientalis montrent qu’elle est

multi-résistante, la capacité à tolérer divers stress étant l’un des critères les plus importants

pour choisir des souches performantes pour la fermentation. Elle peut donc être une

candidate intéressante et constituer une souche robuste pour la fermentation alcoolique qui

est d’une importance particulière pour la production de l’éthanol. Cependant, des

recherches supplémentaires et complémentaires à l’échelle physiologique et moléculaire

doivent être menées afin de comprendre l’origine et le mécanisme de résistance chez cette

souche.

ANNEXES

Annexes

116

ANNEXE 1

La composition de la galerie ID 32C

Cupules Tests Substrats Quantité (mg/cup) 1.0 GAL D-GALactose 0,70

1.1 ACT cycloheximide(ACTidione) 0,014

1.2 SAC D-SACcharose 0,66

1.3 NAG N-Acétyl-Glucosamine 0,64

1.4 LAT acide LAcTique 0,64

1.5 ARA L-ARAbinose 0,70

1.6 CEL D-CELlobiose 0,66

1.7 RAF D-RAFfinose 2,34

1.8 MAL D-MALtose 0,70

1.9 TRE D-TREhalose 0,66

1.A 2KG potassium 2-cétoGluconate 1,09

1.B MDG Méthyl-αD-Glucopyranoside 1,92

1.C MAN D-MANnitol 0,68

1.D LAC D-LACtose (originr bovine) 0,70

1.E INO INOsitol 0,70

1.F 0 Pas de substrat -

0.0 SOR D-SORbitol 2,72

0.1 XYL D-XYLose 0,70

0.2 RIB D-RIBose 0,70

0.3 GLY GLYcérol 0,82

0.4 RHA L-RHAmnose 0,68

0.5 PLE PaLatinosE 0,66

0.6 ERY ERYthritol 1,44

0.7 MEL D-MELibiose 0,66

0.8 GRT sodiumGlucuRonaTe 0,76

0.9 MLZ D-MéLéZitose 0,66

0.A GNT potassium GlucoNaTe 0,92

0.B LVT acide LéVulinique (LeVulinTe) 0,48

0.C GLU D-GLUcose 0,78

0.D SBE L-SorBosE 0,70

0.E GLN GLucosamiNe 0,68

0.F ESC ESCuline citrate de fer

0,28 0,069

Les numéros indiqués sont ceux qui figurent sur la galerie.

Annexes

117

ANNEXE 2

Composition du milieu semi-solide (API C Medium)

API C Mediem (7mL)

Sulfate d’ammonium 5g Phosphate monopotassique 0,31g Phosphate dipotassique 0,45g Phosphate disodique 0,92g Chlorure de sodium 0,1g Chlorure de calcium 0,05g Sulfate de magnésium 0,2g L-Histidine 0,005g L-Tryptophane 0,02g L-Methionine 0,02g Agent gélifiant 0,5g Solution de vitamines 1 mL Solution d’oligo-éléments 10 mL Eau minéralisée qsp 1000mL pH final : 6,4-6,8 à 20-25°C

Annexes

118

ANNEXE 3

IDENTIFICATION MOLECULAIRE

L’identification moléculaire est obtenue par amplification, séquençage et comparaison du domaine

D1/D2 de la région 26S de l’ADN ribosomique aux séquences de la base de données du NCBI

(Kurtman et Robnett 1997 et Kurtman et Robnett 1998).

N° IDENT espèces Identitées

S1 Clavispora lusitaniae 500/500 (100%)

S2 Hanseniaspora uvarum 525/527 (99%)

S3 Kodamaea ohmeri 487/487 (100%)

S5 Candida parapsilosis 535/535 (100%)

S6 Yarrowia lipolytica 525/525 (100%)




S14 Issatchenkia orientalis 526/526 (100%)

S15 Trichosporon asahii 563/563 (100%)

S17 Zygosaccharomyces bailii 545/545 (100%)

S19 Zygosaccharomyces rouxii 543/543 (100%)

LES SEQUENCES:

S1 D1D2 26S rDNA

TACGCCAGCGTCCTAGAATCGCAGGCCTCGAAAAGG

GATGGAGGCGTCAACACGAGCTATAACACGCGCGCCCGAAGGTGCGCGCC

ACATTCTCGAGTTCTTGTTCCTCCCCCCTTTTCGACGCTGGCCCGGTAAA

ACCGTGTCTGCTTGCAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTGCTGTTT

CACTCTCTTTTCAAAGTGCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGC

TATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTT

AGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTCGGAGCCGCGGTGTACAAAG

Annexes

119

AGTCGGCGTGCGCCATACGGGGCTCTCACCCTCCCAGGCGCCATGTTCCA

ATGGACTTGGGCGCGGCCGACTCAGACCACGAAACCTTCAAATTACAATT

CCCGCAGGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGG

GGCAATCCCTGTTG

S2 D1D2 26S rDNA

ACATCCTTGCcgAAGCGCAGTCCTCAATCCCG

GCTAACAGTATTCCAAAAAGCTATAACACTACAGAGTAGCTACATTCTTA

ATGATTTATCCTGCTGCCAGAATTGATGTTGGCCCAGTGAAATTTTTGAG

AGGCCCAAGCCCACGAGAGGCGAGTGCATGCAAAAAACACCATGTCTGAT

CAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTC

AAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTC

GCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTTGAGCTGCATTC

CCAAACAACTCGACTCTTCGAAAAAGTCTTACAGAGAAAAGGTATCCTCG

CCAAACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGAC

AAGGACCTAATCAAAGACAAATTCTACAAATTACAACTCGGGCACTGAAA

GTACCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTACCGCTTCACTCGCCGTA

S3 D1D2 26S rDNA

CGTCGGTGTCCTCAAAGCAGGCCTCGGAAAGAGACGGGGCATGA

ACTGCGGCTATAACACCCGAGGGCCACGTTCCACAGTCTTTGTACCCCGC

TTCTTACCCACACTGACAATCTGACGGCATGCCCTTCCCTTTCAACAATT

TCACGTGCTGTTTCACTCTCTTTTCAAAGTGCTTTTCATCTTTCCATCAC

TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCTGTATTTAGCTTTAGATGGAAT

TTACCACCCACTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTCGAGAGC

GCCTTATAAGGAGCCGGGGGCCGTGCCGCACGGGATTCTCACCCTCTGTG

ACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACACGGTCGCCTCCAAGACGCAATCTT

CAAATTACAACTCCCCGGGGGGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCA

CTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCG

S5 D1D2 26S rDNA

ACATCCTAGGCCGAAGCCGCAGTCCTCAGTC

TAAGCTGGCAGTATCGACAAAGACTATAACACACTACCGAAGCAGTGCCA

CATTTCTTTGCACTTATCCTACCGCTCAAACTGATGCTGGCCCGGTAAAC

TGTAGAGGCCACCCCCGAGAGAGTAACATACAAAATACCAAGTCTGATCT

CAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAA

Annexes

120

AGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGC

CAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATTCCC

AAACAACTCGACTCTTCGAAGGAACTTTACATAGGTCTGGGACATCTCAT

CGCACGGGATTCTCACCCTCTGTGACGTTCTGTTCCAAGAAACATAGACA

AGAGCCAGACCCAAAGATACCTTCTTCAAATTACAACTCGGACACTGAAA

GTGCCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGCTACTAAG

GCAA

S6 S7 S10 S11 D1D2 26S rDNA

TCAAGACGGGTGAAATGGGTGGATTATGTCGTCG

GTGGCAGTGTGGAGGGTTAGGGGAGAACGCCCGAAGGCGCTCCCATTTGT

AACCCTCGTCTCGCTATCGATGACTCGGCGTCGGCAGTACACCGCCCACG

AGGGGCGGCTGAAACCTCGGCCACTCTCCACTCATTTCCTTCCCTATCAA

CAATTTCACATACTATTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCACCTTTCC

TTCACAGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCACCAGTATTTAGCTTTAGAT

GGAGTTTACCACCCACTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTTG

ATAAGGCAATACATGGAGAACGGTTAGCCAGACGGGGTTGTCACCCTCTA

TGACGTACTATTCCAAGCAACTTGGGTTAGCTTTCTCCAATGCCAAATCT

TCAAATTACAATCCCGAGGGTTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTC

GCCGTTACTGAGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGC

S14 D1D2 26S rDNA

GCATCCGTGACCTACACGGCCGCAGTCCTC

GGTCCCCGCACGCAGCATCTGGCCCTGGCTATAACACTCCGAAGAGCCAC

GTTCCAGAACCCCTTCTCCTGCAGCAAGAACCGATGCTGGCCCAGGGAAA

GCCCAGAGCGCCGCCCACGAGAGGCAGCGGTGCGCAATCCCCATGTCGGG

CGCAATACCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTGCTGTTTCACTCTCTTTT

CAAAGTGCTTTTCATCTTTCCTTCACAGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCT

CGCCAGTATTTAGCCTTAGATGGAATTTACCACCCGCTTGGAGCTGCATT

CCCAAACAACTCGACTCGTCAGAAGGGCCTCACTGCTTCCGCCGGCATCC

CACGGGGCTCTCACCCTCCTGGGCGCCCTGTTCCAAGGGACTTGGACACC

GCCTTCCACACAGACTCCAACCTGCAATCTACAACTCGTGCCGCAAAGCA

CGATTTCAAATCTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGCTACTGAGG

Annexes

121

S15 D1D2 26S rDNA

TATGTCAACATCCTAAGCTCGAACGTGCCCGAAGGCCG

GCCATAAAGGCGAGCTGCAGTCCTCAGTCTCACCCAGTGTATGTGATAAT

AGGCTATAACACTTCCGGAGAAGTCACATTCCTACTACCTTTATCCACCG

GACAAAACTGATGTTGACCCGTTCCAAGGAAGTAGACCAGCAGAACTGGC

TGAATCCAAAGAACACGACTGACTTCAATCGTTTCCCTTTCAACAATTTC

ACGTACTGTTTAACTCTCTTTCCAAAGTGCTTTTCATCTTTCCCTCACGG

TACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTC

ACCACCCATTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTAGAAGACGT

ATCACAGAGCACCGGTGGTCGTGTTAAGTACGGGATTATCACCCTCTTTG

ATACTCCTTTCCAGGAGACTTGGACACGGTCCGGCACGGAAAACGCCTCT

ATAGATTACAACTCGGACAATCGAAGACTGCCAGATTTCAAATTTGAGCT

CTTCCCGCTTCACTCGCCGTTACTA

S17 D1D2 26S rDNA

ATTATGCCAGCATCCTTGACTAAAAGTCGCATTCCTCAG

TCCCAGCTGGCAGTATTCCCCTGGACTATAAGTTCGTCCGCCACGAAGTG

GTAGAGCTACATTCCCAGGGATTTATCCTGCCGCCAAAACTGATGCTGGC

CCAGTGAACTGCGAGATTCCCCCACCCACGAGAGGCGAGGGGCGCAAAAC

ACCATGTCTGATCAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTT

CACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGC

TATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTT

AGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAGGCACTCTACAAAGAA

CTGGGATCCTCGCCATACGGGATTCTCACCCTCCATGACGTCCTGTTCCA

AGGAACATAGACAAGGACCAGCCCCAGAGTCGCCTTCTACAAATTACAAC

TCGGGCACCGAAGGTACCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACT

CGCCGT

S19 D1D2 26S rDNA

TTATGCCAACATCCTTGACAAAATGTCGCATACCTCAGT

CCCAGCTGGCAGTATTCCCCTGGGCTATAACACTCCCTCCCGAAGAAAGA

AGCCACATTCCCAGAGATTTATCCTGCCGCCAAAACTGATGCTGGCCCAG

TGAGCTGCGAGATTCCCCCACCCACGAGGAGCGAGGGGCACAAAACACCA

Annexes

122

TGTCTGATCAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTCCTTTTTCACT

CTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATC

GGTCTCTCGCCTGTATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAG

CTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAAGCGTTCTACAAAGAACTGG

ATCACCTCGCCTCACGGGGTTCTCACCCTCTATGACGTCCTGTTCCAAGG

AACATAGGCAAGGGCCAGTCCCAGAATCACTTTCTCCAAATTACAACTCG

GGCACCGAAAGGTACCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCG

CCGT

REFERENCES

BIBLIOGRAPHIQUES

Annexes

124

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Annexes

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LISTE DES TABLEAUX

Liste des tableaux

155

Tableau 1: Les sources de carbone pouvant être utilisées par les levures……………………........20

Tableau 2: Provenance des échantillons biologiques utilisés pour l’isolement des levures….50

Tableau 3: Le nom et les séquences des amorces utilisés pour l’amplification des histones H3

et H4……………………………………………………………………………………………………………………………………54

Tableau 4: Résultats du séquençage des amplicons obtenus après amplification par PCR, du

domaine D1/D2 de la région 26S de l’ADN ribosomique et comparaison aux séquences de la

base de données du NCBI faites à CIRM (Grignon, Paris)……………………………………………………..69

Tableau 5: Les caractères culturaux et morphologiques des cinq souches de levure retenues cultivées sur milieu YPD solide et liquide et incubées à 30°C …………………………………………….. 75

Tableau 6: Effet des différents stress sur les cinq souches de levures étudiées…………………..81

Tableau 7: Assimilation des substrats carbonés par les cinq espèces de levure réalisés sur la

galerie: ID 32C……………………………………………………………………………………………………………………85

Tableau 8: Croissance des cinq souches sur quatre substrats glucidiques avec leurs taux de

croissance (µ)…………………………………………………………………………………………………………………….94

Tableau 9: Productions des cinq souches sur quatre substrats glucidiques……………………… 95

LISTE DES FIGURES

Liste des figures

157

Figure 1: Nœud métabolique du pyruvate et de l'acétaldéhyde………………………………………….23

Figure 2: Voie de Leloir (métabolisme du galactose et du mélibiose)…………..……………………..24

Figure 3: Schéma simplifié de la voie métabolique de la dégradation du xylose par les levures………………………………………………………………………………………………………………………………..27 Figure 4: Représentation schématique du fonctionnement de l’uniport électrophorétique accumulatif responsable de l’entrée de l’ion ammonium chez Saccharomyces cerevisiae……………………………………………………………………………………………………………………………29 Figure 5: représentation schématique des différents domaines d’utilisation de la levure……35

Figure 6: Localisation géographique des régions de récolte des différents échantillons

biologiques………………………………………………………………………………………………………………………….51

Figure 7: Le fermenteur utilisé: SARTORIUS, Biostat B Plus………………………………………………….57

Figure 8: Fermenteur SARTORIUS, Biostat B Plus avec son système d’acquisition pour le

contrôle des différents paramètres de la croissance……………………………………………………………57

Figure 9: Flacons pour la culture en anaérobiose des levures à 30°C…………………………………. 64

Figure 10: PCR des produits d’amplification (Amplicons H3 et H4) des 18 isolats de levures.68

Figure 11: Aspect des cultures des cinq souches sur YPD liquide à 30°C pendant 3 jours…….72

Figure 12: Aspect macroscopiques des colonies des cinq souches après 3 jours d’incubation sur YPD solide à 30°C…………………………………………………………………………………………………………..73

Figure 13: Aspect microscopique des cellules des cinq souches après une culture de 24 h sur YPD liquide à 30°C……………………………………………………………………………………………………………….74

Figure 14: Effet de la température sur les cinq souches de levure étudiées cultivées sur

milieu YPD solide…………………………………………………………………………………………………………………76

Figure 15: L’effet du pH sur les cinq souches de levure étudiées sur milieu YPD solide, incubées à 30°C…………………………………………………………………………………………………………………. 78

Figure 16: Effet du NaCl (0,5M) sur les cinq souches cultivées sur milieu YNB avec une

incubation à 30°C et à 40°C…………………………………………………………………………………………………79

Figure 17: Effet du sorbitol (2M) sur les cinq souches cultivées sur milieu YNB avec une

incubation à 30°C et à 40°C…………………………………………………………………………………………………80

Figure 18: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YPD solides incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)………………………………………………………………………………………...82

Liste des figures

158

Figure 19: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YNB solides incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)……………………………………………………………………………………….. 83

Figure 20: Culture des cinq souches de levures sur les milieux YPD, YNB et MMS solides

incubées à 30°C ………………………………………………………………………………………………………………….87

Figure 21: Culture de la souche Hanseniaspora uvarum sur MMS(A) et MMS + vitamine B2, B3

et B9 (B)………………………………………………………………………………………………………………………………88

Figure 22: Cinétique des quatre souches de levures sur les milieux YPD et MMS à 30°C……..89

Figure 23: Productions des cinq souches et de la souche de référence CEN.PK122-2N après

culture sur milieux YPD et MMS et incubation à 30°C………………………………………………………….90

Figure 24: Cinétiques et productions de la souche CEN.PK122-2N (A) et de la souche

Issatchenkia orientalis (B) sur les milieux YPD et MMS après une incubation à 30°C en

anaérobiose………………………………………………………………………………………………………………………..92

Figure 25: Production d'éthanol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS) par les deux

souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis)……………………………………………………………………………...93

Figure 26: Production de glycérol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS) par les

deux souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis)……………………………………………………………………..93

Figure 27: Culture des cinq souches sur milieu YNX (2%) solide et liquide…………………………..98

Figure 28: Cinétique de C. lusitaniae et I. orientalis sur YNX incubées à 30°C………………………98

Figure 29: Productions de C. lusitaniae et I. orientalis sur YNX…………………………………………….99

Figure 30: Profil d’accumulation des alcools supérieurs (2MB, 3MB et 2PE) par les six souches

de levures étudiées sur trois milieux différents (YPD, MMS et MMS-AA)………………………….101

Figure 31: Effet du phényléthanol à 30°C et à 40°C sur YPD……………………………………………..104

Figure 32: Evolution de la croissance de la souche I. orientalis et de la proportion des cellules viables au cours de cultures avec différentes concentrations en éthanol exogène sur deux milieux YPD et YNB à 30°C ……………………………………………………………………………………………….108

Figure 33: Evolution cinétique de la biomasse, du glucose, de l’éthanol et co-produits au cours d’une culture en mode batch de la souche Issatchenkia orientalis sur YNB……………..110

Documents

Production de métabolites par les levures ... · Ma plus profonde gratitude à Marie-Ange TESTE qui m’a été d’une aide précieuse et considérable. Sa gentillesse et sa disponibilité