Protéomique Schizosaccharomyces pombe Protéome = ensemble des protéines dune cellule,

Protéomique

Schizosaccharomyces pombehttp://www.nature.com/msb/journal/v3/n1/fig_tab/msb4100117_F3.html

Protéome = ensemble des protéines d’une cellule, ou d’une organelle, à un instant donné (et donc sous des conditions données)

Connaissance du génome n’implique pas la connaissance du protéome (régulation de la transcription, de la traduction, de la localisation cellulaire, etc.)

Connaissance du transcriptome n’implique pas la connaissance du protéome (régulation de la traduction et de la localisation cellulaire, durée de vie des protéines, etc.)

Protéomique


Génome = ensemble des gènes d’un organisme, ou d’une espèce

Y-a-t-il un parallèle complet entre génomique et protéomique ?

Génome versus Transcriptome et Protéome

http://www.ac-grenoble.fr/xmallet/IMG/gene_proteine.jpg

http://www.defl.ca/~debloisj_dev/cellules/images/Cell_fundp.ac.be/cellule.jpg

Protéomique


Génome = ensemble des gènes d’un organisme, ou d’une espèce

Y-a-t-il un parallèle complet entre génomique et protéomique ?

Génome : taux d’erreur de la réplication, ~10-7

modifications de la chromatine (méthylation, etc.)Protéome : taux d’erreur de la transcription, 10-4 - 10-5

erreur/polymorphisme de l’épissage

erreur/polymorphisme de l’édition

erreur de la traduction, 10-4

repliement

modifications post-traductionnelles (irréversible/réversibles)

localisation cellulaire

Électrophorèse 2D

http://www-lmmb.ncifcrf.gov/phosphoDB/2d-description.gif

Electrophorèse 2D

http://www.bio.davidson.edu/COURSES/genomics/2003/clement/Cox5b_Mouse%20Liver%202D%20Gel.jpg

DIFFÉRENTES VISIONS DE LA PROTÉOMIQUE

• Protéomique fonctionnelle : interactions protéines-protéines (double-hybride, PCA, Tap-Tag MS-MS, etc.), etc.

• Protéomique structurale : structure tridimensionnelle de toutes les protéines (cristallographie, RMN, etc.)

• Pharmacoprotéomique

• Etc.

--> description de toutes les protéines à un instant t en utilisant la spectrométrie de masse

http://assoxenope.free.fr/cours/proteomique.pdf



http://www.erudit.org/revue/ms/2004/v20/n5/008428arf001n.jpg




Le peptide trypsique

NH3+

C

C

R1

O

NH

C

C

NH

R2

O

C

C

R3

O

NH

C

C

OOH

CH2

(CH2)3

NH3+

Se termine par une Lysine ou une Arginine donc 2 sites basiques protonables par peptide : le NH2 terminal et le NH2 de la chaîne latérale de la Lys ou de l’Arg

Lysine

coursenligne.u-strasbg.fr/depotcel/DepotCel/279/Intranet/Carapito.ppt



http://pbil.univ-lyon1.fr/events/jobim2005/presentations/vandenbrouck.pdf

www.univ-lille1.fr/master-proteomique/proteowiki/images/2/23/Structure_d%27une_source_MALDI.png

Désorption-ionisation laser assistée par matriceMatrix-Assisted Laser Desoption/Ionisation (MALDI)

Avantages : * Possibilité d'ioniser des molécules de hautes masses moléculaires * Méthode d'ionisation douce : peu de fragmentation des ions moléculaires * Permet d'analyser des échantillons de faible concentration (de l'ordre de la picomole (10-12) et de la femtomole (10-15) ) * Produit principalement des ions monochargés, spectre plus simple à analyser * Grande tolérance aux sels et aux tampons

Tampon et sels Masse molaire (en g/mol)

Concentration maximale compatible avec le MALDI (en mM)

Tris 121 100

HEPES 238 100

Bicine 163 50

Urée 60 500

Guanidine 96 250

DTT 154 500

Glycérol 92 130

PEG 2000 2000 0,5

Triton X-100 628 1,6

NP 40 603 1,7

SDS 288 0,35

Inconvénients : * Formation d'adduits (combinaison directe de 2 espèces chimiques distinctes) et d'ions de matrice

Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)

http://www.univ-lille1.fr/master-proteomique/proteowiki/index.php/D%C3%A9sorption-ionisation_laser_assist%C3%A9e_par_matrice

Ionisation par électrosprayElectrospray Ionisation (ESI)

Pression

élevée

Pression faible

http://www.univ-lille1.fr/master-proteomique/proteowiki/index.php/Ionisation_par_%C3%A9lectrospray

[M+nH]n+

n pouvant aller jusqu'à plusieurs dizaines

m/z = (M+3)/3, (M+4)/4, (M+5)/5, (M+6)/6

Avantages :• molécules en solution• La multicharge permet l’étude de molécule de plus haut

poids moléculaire que la limite de l'analyseur

Inconvénients :• complique l'analyse de spectre


m étant la massev la vitessel la distance parcourue pendant le volt le temps de volz la charge de l’ionV la tension accélératricee étant la charge élémentaire

Temps de volTime Of Flight (TOF)

QuickTime™ et undécompresseur TIFF (LZW)

sont requis pour visionner cette image.

QuickTime™ et undécompresseur TIFF (LZW)sont requis pour visionner cette image.



http://fr.wikipedia.org/wiki/Spectrom%C3%A8tre_de_masse#L.27ionisation_.C3.A9lectronique_.28EI.29

• Le temps de vol• L'analyseur quadripolaire• Le piège ionique quadripolaire• Le FT-ICR• L'orbitrappe• L'analyseur à secteur magnétique

• Chambre d'ionisation• Jonction au silicium• Scintillateur• Cage de Faraday• Détecteur à induction• Multiplicateur d'électrons• Détection dans un spectromètre de masse à résonance cylcotronique• Détecteur hybride• Détecteur cryogéniquehttp://www.univ-lille1.fr/master-proteomique/proteowiki/index.php/Portail:Spectrom%C3%A9trie_de_masse

Détecteur en spectrométrie de masse

+ grande diversité de fabricants

Multitudes de types d’information et de formats de fichier

http://w3.umh.ac.be/~ichim/docs/99-05/principe.gif

Spectrométrie de masse en tandem

CH

R1

R2

CO NH

a b c

x y z

NH2 CH CO NH CH COOH

R3CH2

v w

d

Règles de fragmentation des peptides Biemann, 1990

Ions de série a, b et c : charge positive portée par la partie N-terminal

Ions de série x, y et z : charge positive portée par la partie C-terminal

Ions de série d, v et w : fragmentation des chaînes latérales

Fragmentations basse énergie

Fragmentations haute énergie

Biemann K., Appendix 5, Nomenclature for peptide fragment ions (positive ions), Methods Enzymol, 1990, 193, 886-7


+ALLLFSDGR+

Fragmentation des peptides : La loi du proton mobile

+ALLLFSDGR+

+ALLLFSDGR+

+ALLLFSDGR+

+ALLLFSDGR+

Fragmentation dans la cellule de collision

Les peptides ne cassent qu'une seule fois pour générer préférentiellement les fragments y et b

+ALLLFSDGR+

+ALLLFSDGR+

Dongré et al., Journal of Mass Spectrometry, Vol. 31, 339-350 (1996)

+A+AL+ALL+ALLL+ALLLF+ALLLFS+ALLLFSD+ALLLFSDG

Fragments b

LLLFSDGR+

LLFSDGR+

LFSDGR+

FSDGR+

SDGR+

DGR+

GR+

R+

Fragments y


En abscisse, le rapport masse/charge ; en ordonnée, le pourcentage des ions possédant une masse donnée. En pratique, seul l'espacement entre les pics est interprété, pas leur hauteur. En interprétant ces espacements, il est possible de reconstituer la séquence peptidique. Sur cet exemple, la lecture du spectre de droite à gauche permet de reconstituer la séquence EWMPGQPR

Exemple de spectre MS/MS

http://interstices.info/upload/proteomique/schema-spectre.gif

Peptide Mass Fingerprint

Cut out2D-Gel

Spot

http://www.umiacs.umd.edu/~nedwards/teaching/BCHM676_Spring_2007/handouts/Lecture3.ppt

Concentrations as low as 10 femtomoles (10-15)


Trypsin Digest



MS




Protein Sequence

• Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPETL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA IIHVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG


Protein Sequence

• Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPETL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA IIHVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG


Peptide Masses

1811.90 GLSDGEWQQVLNVWGK

1606.85 VEADIAGHGQEVLIR

1271.66 LFTGHPETLEK

1378.83 HGTVVLTALGGILK

1982.05 KGHHEAELKPLAQSHATK

1853.95 GHHEAELKPLAQSHATK

1884.01 YLEFISDAIIHVLHSK

1502.66 HPGDFGADAQGAMTK

748.43 ALELFR



GL

SD

GE

WQ

QV

LN

VW

GK

VE

AD

IAG

HG

QE

VL

IR

LF

TG

HP

ET

LE

K

HG

TV

VL

TA

LG

GIL

K

KG

HH

EA

EL

KP

LA

QS

HA

TK

GH

HE

AE

LK

PL

AQ

SH

AT

KY

LE

FIS

DA

IIH

VL

HS

K

HP

GD

FG

AD

AQ

GA

MT

K

AL

EL

FR




http://www.expasy.ch/pig/publi/Thesis-StevenGay.pdf

Sensitivité versus spécificité

• Sensitivité : identifier le plus de protéines (le moins de faux négatifs)

• Spécificité : identifier le plus de vrais positifs

PLOS Comp. Biol. (2008) 4:e12

Le Dalton est une unité de masse qui correspond à peu près à la masse d’un atome d’hydrogène.Exprimé en g, 1 Da correspond à environ 1,66 10-24 g.

Petit rappel

Glycine 75Alanine 89Sérine 105Proline 115Valine 117Thréonine 119Cystéine 121Isoleucine 131Leucine 131Asparagine 132Aspartate 133Glutamine 146Lysine 146Glutamate 147Méthionine 149Histidine 155Phénylalanine 165Arginine 174Tyrosine 181Tryptophane 204

Précision de la spectrométrie de masse : 0,1 dalton à 10 daltons

Modifications post-traductionnelles

Acétylation 33Méthylation 15Glutamylation 146Glycylation 75Glycosylation >30Isoprénylation >100Phosphorylation 95

Digest with specific protease

Trypsin (K, R; not followed by P)Chymotrypsin (F, W, Y, L, M)Lys-C (K)Arg-C (R)Asp-N (D, N-terminal)V8-bicarb (E)V8-biphosph (E, D){CNBr (M)}

http://academic.uofs.edu/organization/IMBM/PMF_talk.ppt


Why trypsin?

High specificity (K or R, not followed by P)

Acetylated form commercially available

(acetylation lessens autodigestion)

Autolysis peaks are great internal calibrants

(842.509 and 2212.11)

(2254.12), guanidinated



>RBME00320 Contig0311_1089618_1091255 EC-mopA 60 KDa chaperonin GroELMAAKDVKFGR TAREKMLRGV DILADAVKVT LGPKGRNVVI EKSFGAPRIT KDGVSVAKEV ELEDKFENMG AQMLREVASK TNDTAGDGTT TATVLGQAIV QEGAKAVAAG MNPMDLKRGI DLAVNEVVAE LLKKAKKINT SEEVAQVGTI SANGEAEIGK MIAEAMQKVG NEGVITVEEA KTAETELEVV EGMQFDRGYL SPYFVTNPEK MVADLEDAYI LLHEKKLSNL QALLPVLEAV VQTSKPLLII AEDVEGEALA TLVVNKLRGG LKIAAVKAPG FGDCRKAMLE DIAILTGGQV ISEDLGIKLE SVTLDMLGRA KKVSISKENT TIVDGAGQKA EIDARVGQIK QQIEETTSDY DREKLQERLA KLAGGVAVIR VGGATEVEVK EKKDRVDDAL NATRAAVEEG IVAGGGTALL RASTKITAKG VNADQEAGIN IVRRAIQAPA RQITTNAGEE ASVIVGKILE NTSETFGYNT ANGEYGDLIS LGIVDPVKVV RTALQNAASV AGLLITTEAM IAELPKKDAA PAGMPGGMGG MGGMDF

546 aa 60 kDa; 57 461 Da pI = 4.75



Trypsin yields 47 peptides (theoretically)

501.3 533.3 544.3 545.3 614.4 634.3

674.3 675.4 701.4 726.4 822.4 855.5

861.4 879.4 921.5 953.4 974.5 988.5

1000.6 1196.6 1217.6 1228.5 1232.6 1233.7

1249.6 1249.6 1344.7 1455.8 1484.6 1514.8

1582.9 1583.9 1616.8 1726.7 1759.9 1775.9

1790.6 1853.9 1869.9 2286.2 2302.2 2317.2

2419.2 2526.4 2542.4 3329.6 4211.4

Peptide masses in Da:

http://us.expasy.org/tools/peptide-mass.html




501.3 533.3 544.3 545.3 614.4 634.3

674.3 675.4 701.4 726.4 822.4 855.5

861.4 879.4 921.5 953.4 974.5 988.5

1000.6 1196.6 1217.6 1228.5 1232.6 1233.7

1249.6 1249.6 1344.7 1455.8 1484.6 1514.8

1582.9 1583.9 1616.8 1726.7 1759.9 1775.9

1790.6 1853.9 1869.9 2286.2 2302.2 2317.2

2419.2 2526.4 2542.4 3329.6 4211.4




Théorie et Pratique

Supposant que l’on connaisse la séquence exacte, on peut prédire une liste de peptides (et leur masse), mais on va en voir moins par MS

Digestion incomplète :¤ enzyme n’est pas parfait (e.g. trypsine coupe

moins bien quand un a.a. basique est adjacent au site de

clivage)¤ empêchement stérique¤ cinétiquePeptides perdus au cours de l’expérience :¤ lavages¤ mauvaise ionisationPeptides supplémentaires :¤ contaminations¤ clivage non spécifique¤ modifications (e.g. oxydation de la méthionine)



501.3 533.3 544.3 545.3 614.4 634.3

674.3 675.4 701.4 726.4 822.4 855.5

861.4 879.4 921.5 953.4 974.5 988.5

1000.6 1196.6 1217.6 1228.5 1232.6 1233.7

1249.6 1249.6 1344.7 1455.8 1484.6 1514.8

1582.9 1583.9 1616.8 1726.7 1759.9 1775.9

1790.6 1853.9 1869.9 2286.2 2302.2 2317.2

2419.2 2526.4 2542.4 3329.6 4211.4




501.3 533.3 544.3 545.3 614.4 634.3

674.3 675.4 701.4 726.4 822.4 855.5

861.4 879.4 921.5 953.4 974.5 988.5999.71000.6 1196.6 1217.6 1228.5 1232.6 1233.71245.41249.6 1249.6 1344.7 1455.8 1484.6 1514.8

1582.9 1583.9 1616.8 1726.7 1759.9 1775.91786.21790.6 1853.9 1869.9 2286.2 2302.2 2317.2

2419.2 2526.4 2542.4 3329.6 4211.4

Fragfit : une approche simple

Fragfit (PNAS, 1993, 90:5011-5015

1. Requiert une liste de peptides (et leur masse) et une base de données de séquences protéiques

2. Calcule, pour chaque protéine, la liste théorique3. Calcule, pour chaque protéine, le nombre de

peptides qui “matchent” (en fonction d’un seuil défini a priori)

4. Donne la liste des protéines par ordre décroissant de nombre de matches





Seulement une protéine avec 5 matches parmi > 100 000 protéines

Journal of the American Society for Mass Spectrometry (2003) 14:931-942

• Quel seuil choisir ?• Favorise les grosses

protéines (e.g. titine, 3 Mda)

Remplacer le nombre de fragments trouvés par la fréquence des fragments

trouvés

http://www.bioinformatics.ca/workshop_pages/proteomics/lectures/DAY2/2.4.pdf










MASCOT, une approche probabiliste

Perkins et al. (1999) Electrophoresis 20:3551-3567

Définir un modèle et calculer la probabilité qu’un spectre correspond à une protéine

particulière• Distribution a priori de la taille des peptides en fonction

de la taille de la protéine• Probabilité de non coupure par la protéase• Probabilité de modifications post-traductionelles ou

chimiques (en particulier des extrémités N et C terminales)

• Précision de la mesure de la masse (intervalle)

MASCOT, une approche probabiliste

Avantages :• Fournit naturellement une e-value• Corrige naturellement pour la taille des protéines

Inconvénients :• Temps calcul• Limitations du modèle


Génome versus Transcriptome et Protéome

http://www.ac-grenoble.fr/xmallet/IMG/gene_proteine.jpg

http://www.defl.ca/~debloisj_dev/cellules/images/Cell_fundp.ac.be/cellule.jpg

Quelles améliorations ?

• Fournir des informations supplémentaires (taille de la protéine, pI, etc.)

• Utiliser une banque de spectres pré-établis plutôt qu’une banque de séquences (suppose que le spectre est assez reproductible)

• Développer des statistiques permettant de garder le taux de faux positifs en dessous de e.g. 5%

• Filtrer les spectres de masse a priori pour éliminer les contaminants

• Utiliser des distributions plutôt que des intervalles pour prendre en compte l’erreur de mesure

• Identifier des mélanges de protéines (cadre Bayésien)• Approche consensus• Séquençage (étiquette - 3 a.a. - ou ensemble du

fragment)

Documents

Protéomique Schizosaccharomyces pombe Protéome = ensemble des protéines dune cellule,