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Analyse protéomique des endosulfatases humaines HSulfs,
enzymes clés de la modulation de la sulfatation de l’héparane sulfate
Thèse de doctorat de l'Université Paris-Saclay Préparée à l’Université Evry Val d'Essonne
École Doctorale n°577 Structure et Dynamique des Systèmes Vivants (SDSV)
Thèse présentée et soutenue à Evry, le 31/08/2018, par
SEFFOUH Ilham
Composition du Jury:
Sandrine SAGAN Directrice de Recherche, Sorbonne Université (Laboratoire des Biomolécules, CNRS UMR 7203) Rapporteur
Fabrice ALLAIN Professeur, Université de Lille 1 (Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle CNRS UMR 8576) Rapporteur
Jérôme AUSSEIL (président du jury) Professeur, Université de Picardie Jules Verne (Laboratoire de Biochimie Métabolique, CHU Amiens Picardie) Examinateur
Régis DANIEL Directeur de Recherche, Université Evry Val d'Essonne (LAMBE, CNRS UMR 8587) Directeur de thèse
Florence GONNET Professeure, Université Evry Val d'Essonne (LAMBE, CNRS UMR 8587) Co-Directeur de thèse
Cédric PRZYBYLSKI Ingénieur de Recherche, Sorbonne Université (IPCM, CNRS UMR 8232) Co-Directeur de thèse
NN
T :
20
18
SA
CLE
031
3
Table des matières
Liste des abréviations……………………………………………………………………………………………………………6
Introduction générale et objectifs de la thèse……………………………….…………………………………….8
Chapitre I Les endosulfatases eucaryotes, une classe singulière dans la famille des sulfatases……………………………………………………………………………………………………………………………10
I.1 Les sulfatases……………………………………………………………………………………………….11
I.1.1 Classification et mécanisme catalytique des sulfatases…………………….………….11
I.1.2 Les sulfatases humaines et leur localisation sub-cellulaire……………..…………….17
I.1.3 Caractéristiques générales des hydro-FGly-sulfatases…………………………………..20
I.1.4 Formation du résidu Cα-formylglycine au site catalytique des hydro-FGly-sulfatases………………………………………………………………………………………………………………………….…21
I.1.5 Les signatures des hydro-FGly-sulfatases …………………………………………….…..…23
I.1.6 Organisation structurale des hydro-FGly-sulfatases humaine…………..……….…27
I.1.7 Spécificités de substrat des hydro-FGly-sulfatases …………………………………..…29
I.2 L’hydro-FGly-endosulfatase humaine HSulf-2…………………………………..…………30
I.2.1 Les Sulfs: des sulfatases récemment mises en évidence et les premières opérant en milieu extra-cellulaire. ………………………………………….…………………………………….……………..….30
I.2.2 Spécificités des endosulfatases humaines HSulfs…………………………..…………..…31
I.2.3 Caractéristiques structurales des HSulfs…………………………………………..………..…32
I.2.3.1 Organisation en domaines des HSulfs …………………………………………….……………32
I.2.3.2 Les modifications post-traductionnelles de HSulf-2………………….………..…………39
I.2.3.3 Importance fonctionnelle des domaines de HSulf-2………………………………..……42
I.2.4 Cible(s) ou substrat(s) de(s) HSulf(s) …………………………….………………………..……46
I.2.4.1 Les glycosaminoglycanes………………………………………………………………………………46
I.2.4.2 Spécificité du substrat et processivité enzymatique de HSulf-2………….………..55
I.2.5 Différences entre HSulf-1 et HSulf-2……………………………………………..………………56
I.2.6 Fonctions physiologiques et pathologiques liées aux HSulfs………….…………..…58
I.2.6.1 Fonctions physiologiques……………………………………………………………………..………58
I.2.6.2 Pathologies liées aux HSulfs……………………………………………………………………….…61
4
I.2.7 Inhibiteurs des HSulfs……………………………………..……………………………………………67
Chapitre II Caractérisation protéomique, structurale et biochimique de HSulf-2………………71
II.1 Expression, purification et activité enzymatique de HSulf-2 ...........................72
II.1.1 Expression et purification…………………………………………………………………………..…72
II.1.2 Activités enzymatiques de HSulf-2 purifiée……………………………………..……………74
II.2 Détection et caractérisation de HSulf-2………………………………………………..………75
II.3 Recherche de N-glycosylation dans HSulf-2………………………………….……..…….…78
II.4 Caractérisation de HSulf-2 entière par SDS-PAGE en conditions semi-dénaturantes et par spectrométrie de masse MALDI-TOF……………………..…………...…..82
II.5 Mise en évidence des ponts disulfure de HSulf-2…………………………………….……85
II.6 Caractérisation de HSulf-2 par couplage nanoLC-ESI-MS/MS…………..……………86
II.6.1 Digestion trypsique de HSulf-2 en solution……………………………..………………...…86
II.6.2 Digestion de HSulf-2 en solution par différentes protéases……………………….…88
II.7 Mise en évidence du résidu catalytique formylglycine de HSulf-2……..….…..…91
II.8 Conclusion……………………………………………………………………………………………………92
Chapitre III Mise en évidence d’une nouvelle modification post-traductionnelle inédite chez HSulf-2……………………………………………..…………………………………………….…………………………………94
III.1 Un groupement polyanionique est associé à HSulf-2…………………….….……….…95
III.2 HSulf-2 : un protéoglycane avec une chaîne de chondroïtine sulfate ? ………102
III.3 Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF du double mutant HSulf-2 ΔSG……………………………………………………………………………………………………………………..…104
III.4 N-glycosylation de la chaîne courte de HSulf-2……………………………….……….…107
Chapitre IV Caractérisation de la modification post-traductionnelle de type glycosaminoglycane présente chez HSulf-2…………………………………………………….………….…….109
IV.1 Analyse C-PAGE du polyanion libéré de HSulf-2 ……………………………….……..…110
5
IV. 2 Dépolymérisation de la chondroïtine sulfate liée à HSulf-2 par différentes chondroïtinases…………………………………………………………………………………………..…………112
IV.3 Analyse des oligosaccharides de chondroïtine sulfate de HSulf-2 par MALDI-TOF………………………………………………………………………………………………………………………..116
IV.4 Analyse des disaccharides de la chondroïtine sulfate liée à HSulf-2 par chromatographie HILIC couplée à la spectrométrie de masse…………………….………….122
Chapitre V Discussion générale et perspectives…………………………………………..………..…………125
Chapitre VI Matériels et méthodes…………………………………………………………………………..………139 VI.1 Solvants et réactifs ……………………………………………………………………………….……140
VI.2 Enzymes……………………………………………………………………………………………..………141
VI.3 HSulf-2…………………………………………………………………………………………..………..…142
VI.4 Électrophorèse des protéines sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) ……………………………………………..…………………………….……..…143
VI.5 Électrophorèse des glucides sur gel de polyacrylamide (C-PAGE) …….……..…144
VI.6 Déglycosylation enzymatique de HSulf-2………………………………………………….…146
VI.7 Digestion protéolytique de HSulf-2………………………………………………..……..……151
VI.8 Préparation des peptides protéolytiques pour l’analyse nanoLC-MS/MS…………………………………………………………………………………………………………….….…155
VI.9 Analyse des peptides par NanoLC-ESI-MS/MS….…………………………………………155
VI.10 Analyse MALDI-TOF………………………………………………………………………………….…157
VI.11 Purification des oligosaccharides de chondroïtine sulfate pour l’analyse par MALDI TOF. ………………………………………………………………………………..…………………………160
VI.12 Marquage différentiel des cystéines de HSulf-2……………………………..………..…161
VI.13 Couplage de la chromatographie d’interaction hydrophile avec la spectrométrie de masse …………….…………….…………………………………………………………………………....……161
Annexes………………………………………………………………………………….…………………………………………164
Références bibliographies……………………………………………………….……………………………………..…177
Publications ………………………………………………………..…………………………………………………….….….196
6
Liste des abréviations
A
Ac: acétylation
AH: acide hyaluronique
Asn: asparagine
Aa: acides aminés
B
BSA: albumine de sérum bovin
C
C4ST: chondroïtine 4-O-sulfotransférase
C6ST: chondroïtine 6-O-sulfotransférase
CS/DS2ST: 2-O-sulfotransférase
CID: dissociation induite par collision
C-PAGE: Carbohydrate-PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis
CS: chondroïtine sulfate
CSase : chondroïtinase
CSPG: Protéoglycane-chondroïtine sulfate
CHC: carcinome hépatocellulaire
D
DO : densité optique
DP : degré de polymérisation
DS : dermatane sulfate
DHB : 2,5-Dihydroxybenzoic acid
E
ESI: ionisation par électronébulisation
ESI-MS: source électrospray pour une analyse par
spectrométrie de masse
EXTL-3: exostosin like glycosyltransferase 3
EGFR: epidermal growth factor receptor
F
FGly: Cα-formylglycine
FGF: facteur de croissance des fibroblastes
FGFR: récepteur des facteurs de croissance des
fibroblastes
FTMS: spectrométrie de masse à transformée de
Fourier
Fz: récepteur Frizzled
G
GAG(s): glycosaminoglycane(s)
Gal: D-galactose
GalN: D-galactosamine
GalT: galactosyltransférase
GalNAc: N-acétyl-D-galactosamine
GalNAcT-I: β-N-acétylgalactosaminyltransférase I
Glc: D-glucose
GlcA: acide D-glucuronique
GlcN: D-glucosamine
GNS: N-acetylglucosamine-6-sulfatase
G6S: N-acetylglucosamine-6-sulfatase
GlcNAc : N-acétyl-D-Glucosamine
H
HA: acide hyaluronique
HABA: acide 2-(4’-hydroxybenzeneazo) benzoïque
HexN: hexosamine
HGF: hepatocyte growth factor
HILIC: chromatographie d’interaction hydrophile
HP : héparine
HPLC: chromatographie liquide haute performance
HS: héparane sulfate
HSPG: protéoglycane d’héparane sulfate
HS2ST: 2-O-sulfotransférase
HS3ST: 3-O-sulfotransférase
HS6ST: 6-O-sulfotransférase
HPases: héparinases
HILIC: chromatographie par interaction hydrophile
I
IAA: Iodo-Acétamide
IdoA: acide-L-iduronique
ISC: cellules souches intestinales
K
KS : kératane sulfate
L
7
LC-MS : chromatographie liquide couplée à la
spectrométrie de masse
M
m/z: rapport masse sur charge
MALDI: désorption ionisation laser assistée par
matrice
Man: mannose
MS: spectrométrie de masse
MS2: spectrométrie de masse en tandem ou multi-
étapes
4-MUS: 4-méthylumbelliferyl sulfate
MPS: mucopolysaccharidoses
N
NA: N-acétylé
NDST: N-Déacétylase/N-Sulfotransférase
NS: N-sulfaté
O
6-OST: 6-O-sulfotransférase
P
pNPS: p-nitrophénylsulfate
PBS: tampon phosphate salin
PG: Protéoglycane
PAGE: électrophorèse en gel de polyacrylamide
PM: poids moléculaire
pI: point isoélectrique
MPTs: modifications post-traductionnelles
PF : protéines fibreuses
R
RMN: Résonance Magnétique Nucléaire
Fz: récepteur Frizzled
S
S: sulfatation
SA: Sinapic acid
Ser: sérine
SDF-1: Stromal cell-Derived Factor-1
SDS: sodium dodécyl sulfat
STAT3: Signal Transducer and Activator of
Transcription
SG: sérine glycine motif sur lequel une chaîne de
GAG peut se greffer
SDF-1: Stromal Cell-Derived Factor-1
FGF: facteur de croissance de fibroblaste
VEGF: facteur de croissance endothéliale vasculaire
VEGFR: récepteurs du facteur de croissance de
l'endothélium vasculaire
stat3: signal transducer and activator of
transcription 3
SEC: chromatographie d’exclusion stérique
T
TA: température ambiante
TFA: acide trifluoroacétique
Thr: thréonine
TMG : 1,1,3,3-tétraméthylguanidine
TOF: temps de vol
TEMED: N,N,N,N-Tetraméthyléthylènediamine
TGN: trans-golgien
U
UA: acide uronique
V
VEGF: facteur de croissance de l’endothélium
vasculaire
4-VP: 4-vinylpyridine
X
Xyl: xylose
XylT: xylosyltransférase
8
Introduction générale et objectifs de la thèse
Les endosulfatases HSulf-1 et HSulf-2 forment une classe singulière dans la famille des
sulfatases. Découvertes en 2002, ces enzymes sont encore assez mal connues. Les travaux
décrits dans ce manuscrit de thèse portent sur la caractérisation structurale de HSulf-2. Le
premier chapitre de ce manuscrit décrit la diversité des sulfatases et donne l’état des
connaissances actuelles sur les endosulfatases. Nous y présentons la grande variété des
sulfatases en introduisant une classification et une annotation plus informative de ces
enzymes. Puis, nous focalisant sur les endosulfatases humaines HSulfs, nous en soulignons les
caractéristiques structurales et fonctionnelles qui les distinguent des autres sulfatases et plus
particulièrement des 15 autres sulfatases humaines connues à ce jour. Les HSulfs ont une
localisation extra-cellulaire; elles catalysent l’hydrolyse régio-sélective du groupe 6-O sulfate
des résidus glucosamines sulfatés de l’héparane sulfate (HS). Les chaînes de HS sont des
polysaccharides complexes capables de fixer un grand nombre de ligands, dont elles modulent
l'activité biologique. Les grandes propriétés interactives des HS dépendent du profil de
sulfatation, finement régulé non seulement au cours de la biosynthèse du polysaccharide mais
aussi de manière post-synthétique par l'action des endosulfatases HSulfs à la surface
cellulaire. En modifiant le profil de sulfatation, les HSulfs contrôlent les propriétés
d’interaction de HS, ce qui fait de ces enzymes des acteurs cruciaux dans de nombreux
processus physiopathologiques. Ainsi, l’une des formes humaines, HSulf-2, module la liaison
de nombreux facteurs de croissance et angiogéniques. À ce titre, elle est clairement identifiée
comme une cible thérapeutique prometteuse, notamment dans la recherche anti-cancéreuse.
A l’heure actuelle, aucune structure cristallographique d’endosulfatase Sulf n’a été décrite ni
chez l’homme ni chez aucun autre organisme eucaryote. Dans ce contexte, le travail de thèse
présenté dans ce manuscrit s’inscrit dans une démarche visant à améliorer les connaissances
structurales de HSulf-2. Les chapitres II à IV décrivent l’ensemble des résultats obtenus sur
HSulf-2 par des approches combinant des méthodes biochimiques et de protéomiques basées
entre autres sur la spectrométrie de masse (MS). Dans le chapitre II, nous décrivons la
première étude de HSulf-2 par spectrométrie de masse MALDI-TOF et ESI-LTQ-Orbitrap, visant
à mieux comprendre son organisation structurale et à souligner la contribution des
modifications post-traductionnelles, notamment de type N-glycane. Le chapitre III est
consacré à la mise en évidence d’une modification post-traductionnelle originale et
9
inattendue pour une enzyme, et correspondant à un polysaccharide sulfaté. Le chapitre IV
s’attache à caractériser la nature de type glycosaminoglycane de ce polysaccharide sulfaté.
Enfin, les perspectives ouvertes par ces nouvelles données structurales sont discutées.
Des hypothèses seront formulées quant aux rôles, dans un contexte biologique, de cette
modification post-traductionnelle inédite de type GAG.
10
Chapitre I
Les endosulfatases eucaryotes, une classe singulière dans la
famille des sulfatases
11
I.1 Les sulfatases
Présentes chez les procaryotes et les eucaryotes, les sulfatases constituent un
ensemble d’enzymes hautement conservées au cours de l’évolution. Les sulfatases catalysent
l'élimination des groupements sulfate à partir d’une grande variété de substrats sulfatés de
type esters de sulfate (C-O-SO3-) et sulfamates (C-NH-SO3-), et en empruntant plusieurs voies
catalytiques, hydrolytiques (ester sulfurique hydrolases EC 3.1.6.- et sulfamidase EC 3.10.1.-)
et oxydatives (dioxygénase EC 1.14.11.-) (Barbeyron et al. 2016; Müller et al. 2004).
I.1.1 Classification et mécanisme catalytique des sulfatases
La plupart des enzymes catalysant l'élimination des groupements sulfate sont
dénommées sulfatases. Néanmoins, cette appellation très générale n’offre aucune indication
quant au mécanisme catalytique par lequel le groupement sulfate est éliminé, ni ne réfère au
substrat naturel de l’enzyme, ce dernier n’étant par ailleurs pas toujours connu. Afin d’offrir
une classification plus informative, nous proposons dans ce chapitre de décrire la grande
variété des sulfatases selon une nouvelle annotation construite à partir du large travail de
recensement récemment publié par l’équipe de Gurvan M. (Barbeyron et al. 2016) et de la
base de données SulfAtlas récemment mise en ligne (http://abims.sb-roscoff.fr/sulfatlas/).
Nous avons choisi de structurer cette classification selon le type de mécanisme catalytique,
puis selon les caractéristiques du site actif et enfin en fonction de la spécificité de substrat de
l’enzyme. Selon ce schéma, la famille des sulfatases se divise selon leur mécanisme catalytique
en deux groupes: les hydro-sulfatases (hydrolases-sulfatases) très majoritaires, et les oxydo-
sulfatases (oxydases-sulfatases) (Schéma I.1).
Les hydro-sulfatases constituent le plus grand groupe des sulfatases avec 97,7% des sulfatases
recensées dans la base de données Uniprot* (4550 sulfatases) (Barbeyron et al. 2016). Elles
réunissent toutes les sulfatases de type hydrolase, c’est-à-dire dont le mécanisme catalytique
utilise une molécule d'eau pour éliminer un groupement sulfate. On peut diviser ce groupe
des hydro-sulfatases en deux sous-groupes, selon la présence ou non au site actif du résidu
catalytique Cα-formylglycine (FGly), respectivement les hydro-FGly-sulfatases (hydrolase-
formylglycine-sulfatases) et les hydro-nonFGly-sulfatases (hydrolases-non formylglycine-
sulfatases).
* UniProt est une base de données de séquences de protéines, accessible en ligne sur le site : http://www.uniprot.org
12
Schéma I.1: Classification des sulfatases répertoriées dans la base de données Uniprot
(Version 1.0 du Novembre 2016) d’après (Barbeyron et al. 2016)
Les hydro-FGly-sulfatases constituent la plus grande part des sulfatases (89,25%) recensées
dans la base de données Uniprot (Barbeyron et al. 2016). Présentes chez les procaryotes et les
eucaryotes, elles sont le seul type de sulfatases connu à ce jour chez les mammifères (Appel
and Bertozzi 2015). L’activité des hydro-FGly-sulfatases dépend de la présence dans leur site
actif du résidu catalytique unique Cα-formylglycine (FGly), appelé également 3-oxoalanine
(Barbeyron et al. 2016; Thomas Dierks et al. 1999; Knaust et al. 1998). Il s’agit d’une fonction
aldéhyde formée par oxydation de la chaîne latérale d’une cystéine ou d’une sérine (Figure
I.1a) située dans le motif consensus hautement conservé (C/S)-X-P-X-R-X-X-X-L-T-G-R, motif
identifié par comparaison des séquences protéiques de 14 sulfatases (8 humaines, 4
d’eucaryotes inférieurs et 2 de procaryotes) (Figura et al. 1998) (voir paragraphe I.1.4). Jusqu'à
présent chez les eucaryotes, le résidu FGly n’a été trouvé formé qu’à partir d’un résidu
cystéine. En revanche, chez les bactéries, il peut être issu soit d’une cystéine soit d’une sérine
(Benjdia et al. 2010; Toesch, Schober, and Faber 2014).
Le mécanisme catalytique d’hydrolyse de l'ester de sulfate par les hydro-FGly-sulfatases est
illustré en détail dans la Figure I.1b. L’hydro-FGly-sulfatase catalyse l’hydrolyse de l’ester de
sulfate par une attaque nucléophile du résidu FGly sur l’atome de soufre du substrat, libérant
13
le soufre sous forme de sulfate d’hydrogène (HSO4-) et le substrat transformé en l’alcool
correspondant.
Figure I.1: Schéma de conversion de la cystéine/sérine en Cα-formylglycine, et mécanisme catalytique des
hydro-FGly-sulfatases. a) Formation du résidu Cα-formylglycine à partir d’une cystéine ou d’une sérine. b)
Mécanisme catalytique des hydro-FGly-sulfatases: le cycle catalytique commence par l’addition d’une molécule
d’eau sur la fonction aldéhyde du résidu Cα-formylglycine pour former l'hydrate correspondant. Ce dernier étant
un nucléophile fort, il exerce une attaque nucléophile sur l'atome de soufre du substrat, qui est positionné dans
le site actif de l’enzyme par un ion métallique divalent tel que Ca2+ ou Mg2+. Il en résulte la rupture de la liaison
S-O de l'ester de sulfate alors que le centre chiral (*) reste inchangé. Ainsi le groupement sulfate reste lié de
manière covalente au résidu d'hydrate d'aldéhyde catalytique, et l’alcool correspondant est expulsé du site actif
en tant que produit d'hydrolyse, avec rétention de configuration. L'élimination de sulfate d'hydrogène du site
actif, régénère ensuite la fonction aldéhyde et clos le cycle catalytique (Gadler and Faber 2006).
14
Les hydro-FGly-sulfatases sont divisées ensuite par une approche phylogénétique en 73 types
en fonction de la nature de leur substrat naturel ou supposé, et parfois inconnu (Barbeyron et
al. 2016). Notons que la plupart des hydro-FGly-sulfatases sont très souvent appelées dans la
littérature « arylsulfatases », en raison de leur activité sur des esters de sulfate aromatique p-
nitrophénylsulfate (pNPS) et 4-méthylumbelliferyl sulfate (4-MUS), qui sont des substrats
synthétiques standards utilisés in vitro pour la détection de l’activité sulfatase (Appel and
Bertozzi 2015; Hanson, Best, and Wong 2004). Cependant, les substrats naturels connus des
hydro-FGly-sulfatases sont très variés: tels les substrats d’esters de sulfate phénoliques des
Stéryl-sulfatases, également appelées Arylsulfatase C, Steroid sulfatase ou Steryl-sulfate
sulfohydrolase (EC3.1.6.2), ou non phénoliques comme les glucides sulfatés, substrat par
exemple de l’acétylgalactosamine-6-sulfatase, également appelée Chondroitine sulfatase ou
Galactose-6-sulfate sulfatase (EC 3.1.6.4). A ce jour, Il est notable que les substrats naturels
de la plupart des hydro-FGly-sulfatases microbiennes n’ont pas encore été identifiés (Appel
and Bertozzi 2015; Hanson, Best, and Wong 2004).
Les hydro-nonFGly-sulfatases, présentes chez les procaryotes et eucaryotes, constituent un
petite sous-groupe de sulfatases correspondant à 8.45% des sulfatases recensées dans la base
de données Uniprot (Barbeyron et al. 2016). Elles catalysent l'élimination des groupements
sulfate selon un mécanisme hydrolytique ne recourant pas au résidu FGly comme nucléophile.
Le mécanisme hydrolytique de ces hydro-nonFGly-sulfatases fait appel à l’activation d’une
molécule d’eau en ion hydroxyle par deux atomes de zinc (Figure I.2a). Cet ion hydroxyle
effectue une attaque nucléophile du groupement ester de sulfate.
Toutes les hydro-nonFGly-sulfatases sont des enzymes à zinc qui présentent la séquence très
conservée de liaison à l’ion Zn2+ THxHxDHxGG (les résidus aspartate et histidine sont impliqués
dans cette coordination aux métaux), identifiée également chez les métallo-ß-lactamases
(Clarke et al. 1998). Plus de 96% de ces hydro-nonFGly-sulfatases, c’est-à-dire la vaste majorité
de ces sulfatases, agissent sur des substrats de type alkyle.
Elles sont représentées de manière emblématique par l’alkylsulfatase Pisa1 de Pseudomonas
sp. DSM6611 (Knaus et al. 2012) et l'alkylsulfatase SdsA1 de Pseudomonas aeruginosa PAO1
(Hagelueken et al. 2006). L'alkylsulfatase SdsA1 est capable d’agir sur le substrat sodium
dodécyl sulfate (SDS). Le clivage des esters sulfatés catalysé par ces hydro-nonFGly-
15
alkylsulfatases intervient avec ou sans inversion de la stéréochimie selon le site de l’attaque
nucléophile. Cette attaque peut avoir lieu sur l'atome de carbone chiral portant le groupement
sulfate, ce qui rompt la liaison C-O et libère un sulfate inorganique et l'alcool de configuration
inversée. Pour le mécanisme conservant la stéréochimie, l’attaque nucléophile est effectuée
sur l’atome de soufre de la liaison S-O, libérant ainsi l’ion hydrogénosulfate et l'alcool sans
altération stéréochimique (Figure I.2b) (Toesch, Schober, and Faber 2014).
Figure I.2: Mécanisme l’action des hydro-nonFGly-alkylsulfatases : a) Sphère de coordination des atomes de
Zn2+ dans le site actif des sulfatases de type ß-lactamase; l'attaque nucléophile par la molécule d'eau peut se
produire sur la liaison S-O ou la liaison C-O. b) En fonction de l'attaque nucléophile sur S-O ou C-O, les
caractéristiques stéréochimiques peut être soit une rétention de configuration (S-O, libérant l'alcool du produit
sans altération stéréochimique) ou une inversion de configuration (l'attaque d'une molécule d'eau sur l'atome
de carbone chiral portant le groupement sulfate, rompant ainsi la liaison C-O et libérant l'alcool de configuration
inversée) (Gadler and Faber 2006; Toesch, Schober, and Faber 2014).
Enfin, un très petit nombre d’hydro-nonFGly-sulfatases (0.3% des sulfatases de la base de
données Uniprot) se distingue de ce groupe par l’absence d’homologie de séquence, excepté
pour la séquence consensus de liaison au zinc (T/S)HxHxD. Elles sont représentées de manière
emblématique par l’arylsulfatase AtsA de bactérie marine Pseudoalteromonas
carrageenovora, cette enzyme étant active sur le substrat synthétique méthylumbelliferyl
sulfate (Barbeyron et al. 1995, 2016).
16
Les oxydo-sulfatases constituent le deuxième groupe des sulfatases, avec une faible
représentation puisqu’elles ne rassemblent que 2,28% des sulfatases recensées (jusqu’en
septembre 2016) dans la base de données Uniprot. De plus, ces dernières sont identifiées
uniquement chez les procaryotes (bactéries), et sont très peu connues dans le « monde » des
sulfatases. Elles appartiennent à la classe des métallo-enzymes à fer de type dioxygénases (EC
1.14.11.-). Les oxydo-sulfatases sont des alkylsulfodioxygenases qui catalysent le clivage d’une
variété de substrat d’esters d’alkylsulfate selon un mécanisme oxydatif illustré par la Figure
I.3 (Barbeyron et al. 2016; Kahnert and Kertesz 2000). La réaction dépend du dioxygène, du
Fe2+ et de l’alpha-cétoglutarate comme co-substrat, pour former l'aldéhyde à partir de l’alkyle
sulfate et libérer le sulfate sous forme inorganique.
Figure I.3: Réaction de désulfatation d'ester alkyl sulfate catalysée par l’alkylsufatase AtsK de Pseudomonas
putida S-313 α-cetoglutarate et fer dépendante. L’atome de carbone formant la liaison ester hexyl sulfate est
hydroxylé par un atome d'oxygène dérivé de l'oxygène moléculaire pour former le 1-hydroxyhexyl sulfate.
Simultanément, le co-substrat alpha-cetoglutarate est oxydé et décarboxylé (accepteur d'électrons) en succinate
et dioxyde de carbone. Le sulfate de 1-hydroxy-hexyle se décompose spontanément en hexanal et acide
sulfurique (Kahnert and Kertesz 2000).
Les oxydo-sulfatases sont représentées par l'alkylsulfatase AtsK de Pseudomonas putida S-
313, la première sulfatase de ce groupe biochimiquement caractérisée. Elle catalyse la
désulfatation d'une gamme d'esters de sulfate d'alkyle, avec des longueurs de chaîne alkyle
allant de C4 à C12, tels que le dodécylsulfate de sodium pour lequel une activité optimale est
obtenue à pH 7. L'enzyme n'est exprimée que dans des conditions d’absence de soufre, offrant
17
un avantage sélectif pour la croissance bactérienne dans les sols et la rhizosphère. De plus,
cette enzyme est spécifiquement requise pour l'utilisation d'esters de sulfate aliphatiques, et
non aromatiques.
Parmi tous les groupes de sulfatases présentés précédemment, seul celui des hydro-FGly-
sulfatases a été identifié à ce jour chez les mammifères.
I.1.2 Les sulfatases humaines et leur localisation sub-cellulaire
L’analyse bio-informatique du génome humain a révélé l’existence de 17 gènes
distincts gouvernant la biosynthèse d’hydro-FGly-sulfatases (Sardiello et al. 2005). Nous
pouvons répartir les hydro-FGly-sulfatases humaines en trois catégories en fonction de la
localisation subcellulaire et de leur pH optimal d’activité (Tableau I.1) (Buono and Cosma
2010).
La première catégorie réunit les sulfatases localisées dans le lysosome et qui fonctionnent à
un pH acide. Le lysosome est un organite intracellulaire essentiel à la dégradation des
macromolécules en monomères grâce à de nombreuses enzymes dîtes lysosomales:
protéases, nucléases, lipases, glycosidases, phosphatases et les sulfatases. Six sulfatases
(ARSA, ARSB, GALNS, HG6S, SGSH et IDS) sont présentes dans le lysosome et fonctionnent à
un pH acide. Toutes, à l’exception d’ARSA qui hydrolyse les groupements sulfate des
cérébrosides, sont impliquées dans le catabolisme des glycosaminoglycanes (GAGs). Le
catabolisme lysosomal des GAGs est séquentiel, opérant à partir de l'extrémité non-réductrice
de la chaîne polysaccharidique, ce qui nécessite l'action de multiples glycosidases et sulfatases
(Dhamale et al. 2017).
La deuxième catégorie est constituée des sulfatases fonctionnant à un pH neutre et localisées
dans la fraction microsomale comprenant le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi.
Cette catégorie de sulfatases dites non-lysosomales réunit neuf sulfatases : ARSC, ARSD, ARSF,
ARSG, ARSI, ARSJ, ARSE, ARSH et ARSK. Aucune de ces hydro-Fgly-sulfatases humaines non-
lysosomales n’est active sur les GAGs. A titre d’exemple, ARSC est impliquée dans la
désulfatation des stéroïdes sulfates qui représentent un réservoir ou source de précurseurs
pour la production d'hormones actives (Diez-Roux and Ballabio 2005).
18
Enfin la dernière catégorie est composée de sulfatases secrétées dans le milieu extracellulaire
et fonctionnant à un pH neutre-très faiblement basique (~7.5) : ce groupe compte uniquement
les deux sulfatases HSulf-1 et HSulf-2 actives sur les GAGs d’héparane sulfate (HS) et sur
l’héparine (HP). Par leur action sur l’HS, les HSulfs sont des modulateurs de la liaison d’un
grand nombre de cytokines (facteurs de croissance, chimiokine, morphogène) à l’HS. Cette
dernière catégorie a donc un impact sur la signalisation induite par ces cytokines. A ce titre,
les HSulfs sont impliquées dans des processus physiologiques tel que le développement ou
pathologiques tels que les cancers.
Le processus de sécrétion et de localisation des HSulfs dans le milieu extracellulaire distinguent
ces enzymes de toutes les autres hydro-FGly-sulfatases.
19
Tableau I.1 : Les sulfatases humaines: leur localisation subcellulaire, leurs activités dépendantes du pH et leurs
substrats physiologiques et synthétiques.
Modifié d’après (Buono and Cosma 2010; Dhamale et al. 2017; Diez-Roux and Ballabio 2005; Hanson, Best, and
Wong 2004; Kowalewski et al. 2012)
Localisation cellulaire
(pH activité optimale)
Nom de la sulfatase
Substrat
Lysosomale
pH acide
(3.8-5.7)
Arylsulfatase A (ARSA)
4MUSb, pNCSb , ascorbic acid-2S,
cerebroside-3S, seminolipid-3S, psychosine-
3S et tyrosine-S
Arylsulfatase B (ARSB)
galactosamine-4-sulfatase 4MUSb, GalN4S-(CS/DS) et tyrosine-S
N-acetylgalactosamine-6-sulfatase
(GALNS) 4MUSb, GalNAc6S-(CS) et Gal6S-(KS)
N-acetylglucosamine-6-sulfatase (GNS, G6S)
4MUSb, GlcNAc6S-(HS), GlcNAc6S-(KS)
GlcNAc6S
N-sulfoglucosamine sulfohydrolase
(ou heparan N-sulfatase) (SGSH)
4MUSb, GulNS-(HS), GulNS-IdoA2S et
GulNS
Iduronate-2-sulfatase (IDS) 4MUSb et 2-sulfoiduronate (IdoA2S-HS)
4MUSb
Non-
Lysosomale
pH neutre
(7)
microsomale
Arylsulfatase C
(Ou Steryl-sulfatase, la Steroid
sulfatase) (ARSC, STS)
4MUSb, pNPSb estrone-S, pregnolone-S,
cholesterol-S, DHEA-S, testosterone-S,
estrogènes et vitamine D3 S
Réticulum
endoplasmique
Arylsulfatase D (ARSD) 4MUSb
Arylsulfatase F (ARSF) 4MUSb
Arylsulfatase G (ARSG)
3-O-sulfatase
4MUSb, GlcNS3S (HS)
(Kowalewski et al. 2012)
Arylsulfatase I (ARSI) 4MUSb
Arylsulfatase J (ARSJ) 4MUSb
Appareil de Golgi Arylsulfatase E (ARSE) 4MUSb
Non déterminé
Arylsulfatase H 4MUSb
Arylsulfatase K
glucuronate-2-sulfatase (GDS)
4MUSb, 2-sulfoglucuronate de HS, DS
(Dhamale et al. 2017)
Extracellulaire
pH Neutre-basique =
(≈ 7.5)
Sulfatase 1 4MUSb et GlcN6S (endo)
Sulfatase 2 4MUSb et GlcN6S (endo)
Les quatre dernières sulfatases identifiées (ARSH, ARSI, ARSJ et ARSK) Les sulfatases soulignées dans le tableau représentent les sulfatases dont la structure a été déterminée par cristallographie
20
b substrat synthétique
I.1.3 Caractéristiques générales des hydro-FGly-sulfatases:
L’analogie entre les séquences protéiques des hydro-FGly-sulfatases procaryotes et
eucaryotes, suggère que ces enzymes ont évolué à partir d'un gène ancestral commun (C
Peters 1990). Les hydro-FGly-sulfatases partagent ainsi des caractéristiques communes (Diez-
Roux and Ballabio 2005; Hanson, Best, and Wong 2004; Schmidt et al. 1995) :
Une région N-terminale hautement conservée, l’homologie de séquence variant de 20
à 60 % sur toute la longueur de la protéine (Hanson, Best, and Wong 2004).
Un site actif situé dans la première partie N-terminale de l’enzyme.
Une modification post-traductionnelle d’une cystéine très conservée au niveau du site
catalytique dans la région N-terminale, en N-formylglycine requise pour l’activité
catalytique (Hanson, Best, and Wong 2004; Schmidt et al. 1995).
Chez les eucaryotes, une large glycosylation nécessaire aux transports des sulfatases
vers différents compartiments cellulaires (milieu extracellulaire, réticulum
endoplasmique, appareil de Golgi ou lysosome) (Hanson, Best, and Wong 2004).
Chez les mammifères, une taille comprise entre 500 et 600 acides aminés à l’exception
des hydro-FGly-sulfatases extracellulaires, Sulfs, qui comptent environ 870 acides
aminés (Hanson, Best, and Wong 2004).
Toutes les hydro-FGly-sulfatases humaines catalysent l'élimination des groupements sulfate
de molécules substrat de taille petite à moyenne (monomère, dimère et oligomère) au cours
du catabolisme, à l’exception notable des hydro-FGly-sulfatases extracellulaires Sulfs qui
catalysent l’élimination des groupements sulfate des chaînes polysaccharidiques d’héparane
sulfate.
De nouveau les sulfatases Sulfs se distinguent des autres sulfatases, en l’occurrence ici par leur
capacité à agir sur un substrat biopolymérique.
21
I.1.4 Formation du résidu Cα-formylglycine au site catalytique des hydro-FGly-
sulfatases
Toutes les hydro-FGly-sulfatases possèdent dans leur site catalytique un résidu Cα-
formylglycine essentiel pour l'activité enzymatique. Il est formé suite à la conversion oxydative
d’un résidu cystéine ou sérine hautement conservé en un résidu aldéhyde (Thomas Dierks,
Miech, et al. 1998; Schmidt et al. 1995). Ce mécanisme de modification post-traductionnelle
a lieu dans le réticulum endoplasmique avant le repliement du polypeptide et le transport des
hydro-FGly-sulfatases vers différents compartiments subcellulaires (lysosome, appareil de
Golgi), vers la surface de la cellule ou sa rétention dans le RE (T. Dierks, Schmidt, and von
Figura 1997; Thomas Dierks, Lecca, et al. 1998). Chez les hydro-FGly-sulfatases eucaryotes et
procaryotes, le résidu cystéine ou sérine à modifier se trouve en région N-terminale au sein
d’un motif consensus conservé de 12 acides aminés (C/S)-X-P-(S/X)-R-X-X-X-(L/X)-(T/X)-(G/X)-
(R/X) du site actif. La séquence (C/S)-X1-P-X2-R (chez les hydro-FGly-sulfatases humaines
X1=T/C/S/A et X2=S) représente le motif central de la séquence consensus, conservé dans
toutes les autres hydro-FGly-sulfatases (Thomas Dierks et al. 1999; Hanson, Best, and Wong
2004). Dans ce pentapeptide, le résidu arginine (R) a été montré comme étant: 1) important
pour la formation de FGly (Thomas Dierks et al. 1999) ; 2) une partie intégrante du site actif
capable de stabiliser le résidu FGly (Boltes et al. 2001) ; 3) un élément structural important
(Knaust et al. 1998). Le résidu proline, très conservé, intervient également dans la formation
du résidu FGly et fait partie de l’hélice α responsable du bon positionnement de ce résidu au
sein du site actif (Thomas Dierks et al. 1999; Knaust et al. 1998). Il existe une deuxième
signature peptidique partagée par les hydro-FGly-sulfatases eucaryotes et procaryotes,
définie par la séquence consensus: G-(Y/V)-X-(S/T)-X-X-X-G-K-X-X-H. Les résidus très conservés
Lysine (K) et Histidine (H) font partie du site actif et sont essentiels lors de la conversion
catalytique d'esters de sulfate (Anne Waldow 1999; Hanson, Best, and Wong 2004).
A la différence des hydro-FGly-sulfatases eucaryotes, les sulfatases d’organismes procaryotes
ont leur résidu Cα-formylglycine formé à partir soit d’une cystéine (C), soit d’une sérine (S)
comme cela a été montré chez certaines espèces bactériennes (Thomas Dierks, Miech, et al.
1998; Miech et al. 1998). Il faut noter que le résidu sérine se trouve à la même position dans
la séquence, que la cystéine habituellement à l’origine du résidu FGly. Cela a conduit à la
classification des sulfatases procaryotes en «Cys-type» ou «Ser-type» (Marquordt et al. 2003;
22
Schirmer and Kolter 1998). Ainsi, la signature commune à toutes les hydro-FGly-sulfatases
procaryotes et eucaryotes est le segment peptidique (C/S)-X1-P-X2-R (X1= T/C/S/A et X2=
S/A/T) (Hanson, Best, and Wong 2004). De plus, les hydro-Fgly-sulfatases de type cystéine se
trouvent de façon caractéristique dans le cytosol, tandis que les hydro-Fgly-sulfatases de type
sérine sont situées dans le périplasme bactérien (Toesch, Schober, and Faber 2014). Un autre
fait remarquable est que le résidu FGly reconnu comme spécifique des sulfatases, existe
également chez deux phosphatases alcalines (phosphate monoester hydrolase ; U44852) et
alkaline phosphatase; AF047381) où l’on retrouve le motif (C/S)-X-P-X-R (Hanson, Best, and
Wong 2004; Jonas et al. 2008). Il a ainsi été démontré que la phosphonate monoester
hydrolase/phosphodiesterase de la bactérie Rhizobium leguminosarum est la première
enzyme non sulfatase, connue pour utiliser un résidu formylglycine comme nucléophile
indispensable à l’action catalytique (Jonas et al. 2008). Un lien évolutif entre les hydro-FGly-
sulfatases et les phosphatases alcalines est sans doute possible (Barbeyron et al. 2016; Jonas
et al. 2008)
Chez les hydro-FGly-sulfatases eucaryotes et les sulfatases procaryotes Cys-type, la
modification de la cystéine en FGly est produite par l’action de l'enzyme FGE (Formylglycine
Generating Enzyme, également appelée sulfatase modifying factor 1; SUMF1) dont la
biosynthèse est gouvernée par le gène SUMF1 (Cosma et al. 2003; T. Dierks, Schmidt, and von
Figura 1997; Thomas Dierks et al. 2003), un membre d'une famille de gènes fortement
conservés au cours de l'évolution, des bactéries à l’homme (Landgrebe et al. 2003). L'enzyme
FGE est une oxydase utilisant l’oxygène pour convertir le résidu cystéine en formylglycine
(Figure I.4) (Knop et al. 2017).
23
Figure I.4: Schéma du mécanisme de formation de la cystéine en Cα-formylglycine : FGE reconnaît la séquence
consensus de cinq acides aminés C–X-P-X-R. Il catalyse l'oxydation de la fonction thiol de la cystéine en un
aldéhyde pour former FGly. La première réaction consiste en l'oxydation du groupement thiol en thioaldéhyde,
par l’intermédiaire d’un accepteur d'hydrogène X. La deuxième réaction est l'hydrolyse du thioaldéhyde avec
libération de sulfure d'hydrogène et formation du résidu catalytiquement actif Cα-formylglycine (Figura et al.
1998).
Chez les procaryotes Ser-type, la modification de la sérine en FGly est produite par l’action de
l'enzyme AtsB non homologue de FGE et codée par le gène AtsB (Thomas Dierks, Miech, et al.
1998; Fang, Peng, and Dierks 2004; Schirmer and Kolter 1998). Ainsi, le paradigme actuel de
la formation de FGly décrit deux mécanismes distincts et indépendants, agissant sur des
hydro-FGly-sulfatases de type Cys ou de type Ser et impliquant respectivement des facteurs
de modification SUMF1 ou AtsB. Les sulfatases sont les seules cibles cellulaires connues à ce
jour des systèmes enzymatiques FGE et AtsB générateurs de FGly (Sardiello et al. 2005).
L'inactivation individuelle des sulfatases chez l'homme peut conduire à des maladies graves
telles que la leucodystrophie métachromatique. Cette dernière est causée par la mutation du
gène gouvernant la biosynthèse de la cérébroside sulfatase (ARSA ; EC 3.1.6.8) et dont
l’absence engendre un stockage anormal de cérébroside-3-sulfate dans les lysosomes. De
plus, des mutations de l'enzyme FGE conduisant à l’absence du résidu catalytique FGly,
abolissent les activités de toutes les sulfatases humaines, menant à une maladie de surcharge
lysosomale très rare et fatale, appelée « déficience en sulfatase multiple », sans traitement à
ce jour (Cosma et al. 2003; Thomas Dierks et al. 2003; Schmidt et al. 1995).
I.1.5 Les signatures des hydro-FGly-sulfatases
Les deux motifs/séquences consensus présentés précédemment (paragraphe I.1.4) ,
représentent les deux signatures historiques des hydro-FGly-sulfatases, mais ayant été définis
sur un nombre limité de hydro-FGly-sulfatase (Hanson, Best, and Wong 2004). Récemment,
l’équipe de Gurvan M. (Barbeyron et al. 2016) a réactualisé ces deux signatures en criblant un
nombre bien plus considérable de séquences à partir de l’alignement de 4058 hydro-FGly-
24
sulfatases répertoriées dans la base de données UniProt (Figure I. 5A et B). Ce travail a permis
d’identifier trois nouvelles signatures (Figure I. 5C-E), portant aujourd’hui à 5 les séquences
consensus signatures des hydro-FGly-sulfatases.
La première signature dite séquence catalytique correspond à la version actualisée et affinée
de la séquence consensus décrite plus haut contenant la cystéine catalytique (Figure I. 5A):
[SAPG] - [LIVMSTPAR] - [CS] - [STACGMV] - [PA] - [STAGF] -RX- [PRFWYH] - [LIVMFWYHQ] (2)-
[TASL] -G. Les résidus Cys51, Arg55, Pro53, Thr60 et Gly61 (numérotation sur la base de la
séquence de la sulfatase AtsA de Pseudomonas aeruginosa PAOI en référence, P51691) sont
ceux que l’on retrouvait déjà dans la première séquence consensus décrite plus haut : (C/S)-
X-P-(S/X)-R-X-X-X-(L/X)-(T/X)-(G/X)-(R/X). Outre Cys51, Pro53 et Arg55, le dipeptide terminal
Thr60-Gly61 est également conservé dans la signature de la séquence catalytique. La Thr60
marque la fin de l'hélice α contenant le site catalytique, et Gly61, très conservée, permet le
changement de direction de la chaîne polypeptidique (Lukatela et al. 1998).
La deuxième signature correspond à la version également actualisée et affinée de la seconde
séquence catalytique conservée décrite plus haut (Figure I. 5B) : GYx- [TSCV] -x(3) –G-K-
[IVGTLSEHDCA] (0,3) - [WMYNLF] - [HLGN]. Les acides aminés les plus conservés dans cette
version actualisée sont Gly105, Tyr106, Gly112 et Lys113, que l’on retrouvent dans la
deuxième séquence consensus décrite plus haut: G-(Y/V)-X-(S/T)-X-X-X-G-K-X-X-H.
Comme les hydro-FGly-sulfatases sont des enzymes dépendantes du calcium (Hanson, Best,
and Wong 2004), quatre résidus : Asp13, Asp14, Asp317 et Asn318, sont responsables de la
coordination de l'ion Ca2+, et sont distribués dans deux autres séquences signatures:
* la troisième signature, première séquence de liaison de l’ion Ca2+ inclut Asp13 et Asp14
[PM] -x (0,1) - [NHD] - [IVFL] - [LIV] - [FLVIY] - [IVLF] - [LMVFITYW] - [ATVSLI] - [DE] - [DQ] -
[LMQVH] - [GRANTDS] (Figure I. 5C).
* la quatrième signature, seconde séquence de liaison de l’ion Ca2+ inclut Asp317 et Asn318
(Figure I. 5D), [ND] - [TSA] -x (0,2) - [ILVYMF] - [VILF] - [IVFLM] - [FYVL] -x (0,1) - [TSLMIVFAWGC]
- [STGA] -D- [NHQ] -G.
La cinquième signature de fonction inconnue représente néanmoins une séquence très
conservée: P- [FWLI] - [FLCMY] - [LMAVI] - [YWVMTF] - [LVIYFM] - [ASGNP] - {RK} -x (2) - [PVTM]
25
-H (Figure I. 5E). Pro200 et His211, également très conservées, suggèrent que ces acides
aminés sont essentiels pour les FGly-sulfatases. En particulier, Pro200 induit un coude entre
l’hélice et le feuillet de la sulfatase AtsA, quant à His211, elle est située au sein du site actif.
26
Figure I.5: Séquences consensus conservées identifiées dans l'alignement multiple des Hydro-FGly-sulfatases:
les numéros sous les séquences du logo indiquent la position dans la séquence de référence de la sulfatase AtsA
(AtsA P51691). Les pourcentages en indice indiquent le taux de conservation au sein des milliers de séquences
criblées. Les acides aminés catalytiques et les résidus impliqués dans la liaison des ions calcium sont représentés
en gras (Barbeyron et al. 2016).
27
I.1.6 Organisation structurale des hydro-FGly-sulfatases humaine
Les hydro-FGly-sulfatases adoptent une organisation structurale générale similaire,
mono-caténaire, comprenant deux domaines, un domaine N-terminal contenant le site
catalytique et un plus petit domaine C-terminal (Barbeyron et al. 2016).
Chez l’homme, seulement six des dix-sept sulfatases répertoriées ont leur structure
tridimensionnelle caractérisée par cristallographie aux rayons X : il s’agit de cinq sulfatases
lysosomales (ARSA, ARSB, GALNS SGSH et IDS) et de la sulfatase microsomale STS. Concernant
la sulfatase lysosomale Arylsulfatase A (ARSA), son domaine N-terminal contient la
formylglycine catalytique (Cys69) et neuf autres résidus également conservés au site actif
(Lukatela et al. 1998) : (i) quatre résidus acides / polaires (Asp29, Asp30, Asp281 et Asn282)
associant un ion calcium qui lie et active le groupement sulfate du substrat, (ii) cinq acides
aminés basiques (Arg73, Lys123, His125, His229 et Lys302) stabilisant la formylglycine et / ou
liant le groupement sulfate. Récemment, la structure par cristallographie aux rayons X de la
sulfatase lysosomale iduronate-2-sulfatase (IDS) avec un groupement sulfate lié de manière
covalente au site actif a été déterminée (Demydchuk1 et al. 2017). La superposition des
structures des six hydro-FGly-sulfatases humaines a montré un repliement et une organisation
en domaines qui se ressemblent globalement, malgré une faible identité au niveau de la
séquence protéique (~20%) et la diversité de substrats transformés par les six enzymes. Toutes
les sulfatases cristallisées présentent, malgré une homologie de séquence parfois limitée, une
topologie assez semblable de protéine globulaire de structure sandwich alpha/béta (α/β). On
note en particulier des similitudes du côté N-terminal autour du core catalytique constitué
toujours d'un noyau central de feuillets β (Figure I.6a) (en nombre variable -de 7 à 10- selon
les sulfatases), et du côté C-terminal avec un ensemble de 4 feuillets β que l'on retrouve chez
toutes ces sulfatases (Demydchuk1 et al. 2017).
Malgré des séquences très divergentes et la diversité des substrats traités par ces enzymes,
certains résidus du site actif sont très conservés et sont presque totalement superposables
dans les six hydro-FGly-sulfatases humaines (Figure I. 6b), ce qui nous laisse penser que tous
les résidus conservés du site actif sont importants pour un mécanisme catalytique commun
d’élimination du groupement sulfate, mais qu’ils ne gouvernent pas la spécificité de substrat
de l’enzyme.
28
Figure I.6: Alignement de la structure de l'IDS avec d'autres structures des sulfatases humaines: (a)
Superposition basée sur la structure secondaire de l'IDS (bleu), ARSA (rose), ARSB (vert), STS (jaune), GALNS
(ardoise) et SGSH (rouge foncé) dans deux vues orthogonales. Les résidus du site actif sont représentés par des
bâtonnets gris. Encadré: éléments structuraux de base partagés par toutes les sulfatases humaines, montrant
seulement les régions conservées avec le squelette ; (b) Superposition des résidus du site actif conservé. Les ions
métalliques sont représentés par des sphères grises (Demydchuk1 et al. 2017).
A ce jour, aucune structure cristallographique des deux sulfatases extra-cellulaires (Sulf-1 et
Sulf-2) n’a été décrite ni chez l’homme ni chez aucun autre organisme eucaryote.
29
I.1.7 Spécificités de substrat des hydro-FGly-sulfatases
La grande similitude des sulfatases au niveau de leur site actif se traduit par un mécanisme
de désulfatation commun à toutes les sulfatases; néanmoins chaque sulfatase possède une
spécificité quant à la nature et à la taille -très variable- des substrats, recouvrant des petites
molécules telles les hydroxystéroïdes et sulfolipides jusqu’à des macromolécules comme les
glycosaminoglycanes (GAGs) (Diez-Roux and Ballabio 2005) (tableau I.1). La réaction de
désulfatation intervient dans divers processus allant du catabolisme à la modulation de la
signalisation cellulaire au cours de processus de développement (Hanson, Best, and Wong
2004; Parenti, Meroni, and Ballabio 1997; Sardiello et al. 2005). Les sulfatases lysosomales
agissent sur les glycolipides sulfatés et les oses sulfatés, et leur activité est nécessaire à la
dégradation de ces glycosides. Les sulfatases du réticulum endoplasmique, notamment la
sulfatase microsomale arylsulfatase C, régulent les niveaux d'hormones stéroïdiennes par
désulfatation de précurseurs inactifs tels que le dehydroepiandrosterone 3-sulfate et
l'iodothyronine de sulfate (Hanson, Best, and Wong 2004). Les sulfatases extracellulaires (Sulf-
1, Sulf-2) modulent le niveau de sulfatation de l'HS présent à la surface cellulaire, ce qui
permet de réguler les événements de signalisation, critiques pour le développement et la
progression de tumeur (Dhoot et al. 2001; Morimoto-Tomita et al. 2005). La déficience d’une
des enzymes lysosomales impliquées dans la dégradation des HS, dont les sulfatases,
provoque l’accumulation de GAGs engendrant de graves et irréversibles lésions cellulaires et
tissulaires. Chez l’Homme, ceci conduit à des pathologies graves nommées
mucopolysaccharidoses (MPS)(Diez-Roux and Ballabio 2005).
Les dernières hydro-FGly-sulfatases humaines découvertes sont HSulf-1 et HSulf-2, mises
en évidence au début des années 2000, pour la première fois dans l'embryon de caille, puis
chez les mammifères. Les HSulfs présentent deux caractéristiques uniques parmi les sulfatases
humaines puisqu'à ce jour, elles sont les seules sulfatases connues à être sécrétées dans le
milieu extracellulaire, et à être actives sur un substrat macromoléculaire polymérique. Les
Sulfs agissent sur la chaîne de HS, en modulant son profil de sulfatation. Elles permettent, de
ce fait, une fonctionnalisation plus spécifique des chaînes HS présentes à la surface cellulaire.
De par leur implication dans un très grand nombre de processus physiologiques et
pathologiques, les HSulfs présentent un intérêt évident en recherches fondamentale et
30
appliquée. Dans le chapitre suivant, nous décrirons les données connues à ce jour concernant
ces dernières sulfatases découvertes chez l’homme.
I.2 L’hydro-FGly-endosulfatase humaine HSulf-2
Parmi les hydro-Fgly-sulfatases décrites précédemment, les 6-O-endosulfatases Sulfs
représentent un sous-sous-groupe relativement récent, et comptant chez l’homme deux
enzymes distinctes HSulf-1 et HSulf-2. Nous décrirons l’état des connaissances de ces
endosulfatases humaines, en centrant notre propos sur HSulf-2 qui constitue l’objet de ce
travail de thèse.
I.2.1 Les Sulfs: des sulfatases récemment mises en évidence et les premières
opérant en milieu extra-cellulaire.
Les Sulfs sont deux nouveaux membres de la famille des hydro-Fgly-sulfatases
identifiés au début des années 2000 chez les eucaryotes (Sulf-1 et Sulf-2). En 2001, Dhoot et
al.(Dhoot et al. 2001) ont été les premiers à décrire un gène aviaire identifié dans l'embryon
de caille et appelé QSulf-1. Ce gène a été supposé être celui d’une sulfatase, car l'alignement
de la séquence protéique déduite du gène QSulf-1 montre une forte homologie avec l’hydro-
Fgly-sulfatase lysosomale humaine N-acetylglucosamine-6-sulfatase (GNS ou G6S). G6S est
une exosulfatase impliquée dans la dégradation des unités saccharidiques d’héparane sulfate
(GlcNH2-6-sulfate et GlcNAc-6-sulfate) dans le lysosome (Parenti, Meroni, and Ballabio 1997;
Robertson et al. 1992). L’homologie de séquence entre QSulf-1 et G6S s’étend sur toute la
région N-terminale comprenant la séquence consensus avec le résidu cystéine conservé chez
les hydro-Fgly-sulfatases, et déterminant la présence du résidu catalytique N-Formylglycine
requis pour une enzyme catalytiquement active. L’importance de cette découverte a été
soulignée par la capacité de l'enzyme à moduler la voie de signalisation Wnt dans le
développement de l’embryon de caille. Il a été montré que l’expression de QSulf-1 dans les
cellules souches musculaires est capable de réguler positivement la signalisation Wnt (Dhoot
et al. 2001). Les protéines Wnt sont retenues à la surface cellulaire par interaction avec les
chaînes HS, ce qui régule leur activité (Dhoot et al. 2001). Un orthologue de QSulf-1 a ensuite
été identifié dans l'embryon de rat, qui a été nommé RSulfFP1 (FP1 pour floor plate 1) en
raison de son expression abondante dans la plaque du plancher du cerveau en développement
(Ohto et al. 2002). En 2002, Morimoto-Tomita et al. ont signalé pour la première fois le clonage
des orthologues humains et de souris HSulf-1 et MSulf-1, et de leurs homologues respectifs
31
HSulf-2 et MSulf-2. Ces protéines HSulf-1/2 et MSulf1/2 de mammifères ont été décrites
comme étant sécrétées dans les milieux de culture conditionnés des cellules transfectées.
Elles montrent de plus une activité arylsulfatase à un pH neutre et une activité endosulfatase
dans des sous-régions spécifiques des chaînes d'HS (Morimoto-Tomita et al. 2002). Il est
important de noter que les études précédentes de QSulf-1 et de RSulfFP1 n'ont pas permis
d’obtenir l'expression des protéines sous une forme soluble, et donc n'ont pas permis de
rapporter de preuve directe de leur activité sulfatase sur les HS (Uchimura, Morimoto-Tomita,
et al. 2006). Dhoot et al. ont déduit l’activité sulfatase QSulf-1 à partir de l’homologie de
séquence entre QSulf-1 et la sulfatase lysosomial G6S d’une part, et de la perte de la capacité
de QSulf-1 à moduler la signalisation Wnt par la mutation de la cystéine conservée (Cys 89)
d’autre part (Dhoot et al. 2001).
A ce jour, outre chez la caille, le rat, la souris et l’homme, les gènes Sulf-1 et -2 ont été
également identifiés chez le poulet (Braquart-Varnier et al. 2004), le xénope (Freeman et al.
2008; Winterbottom and Pownall 2009), le poisson Zèbre (Gorsi, Whelan, and Stringer 2010),
l’oursin (Fujita et al. 2010) et la drosophile (Wojcinski et al. 2011).
Le plus grand nombre des sulfatases humaines correspond à des sulfatases
lysosomiales, impliquées dans la dégradation des substrats sulfatés dans un environnement
acide. Sulf 1/2 sont les dernieres sulfatases identifiées à ce jour et sont les premières à avoir
une activité endosulfatase s’exerçant à pH neutre et à l’extérieur de la cellule, plus précisément
à la surface cellulaire sur les chaînes d’héparane sulfate.
I.2.2 Spécificités des endosulfatases humaines HSulfs
Les hydro-FGly-sulfatases HSulf-1 et HSulf-2 diffèrent des autres sulfatases humaines
d’abord par leur localisation. En effet, elles se retrouvent majoritairement dans le milieu
extracellulaire, retenues à la surface de la membrane cellulaire (Morimoto-Tomita et al. 2002;
Tang and Rosen 2009). Néanmoins, les Sulfs ont aussi été détectées (par immunofluorescence)
dans le réticulum endoplasmique intracellulaire et l’appareil de Golgi, il s’agit alors de la forme
non mature de la protéine (Ai et al. 2006; Morimoto-Tomita et al. 2002). De plus, de toutes
les hydro-Fgly-Sulfatases, les Sulfs sont les seules sulfatases bicaténaires. En effet, elles ont
été identifiées comme cible de la protéase furine, qui catalyse le clivage de la protéine en deux
chaînes (Tang and Rosen 2009). Une autre caractéristique différenciant ces sulfatases est le
32
nombre d'acides aminés très supérieur à celui des autres sulfatases, HSulf-1/-2 étant
composés de 870 ou 871 d'acides aminés, elles sont donc plus longues d’environ 300 résidus
que les autres hydro-FGly-sulfatases humaines (552 acides aminés pour la sulfatase
lysosomale G6S). Cela est également vrai pour les autres Sulfs, à titre d’exemple QSulf-1 et -2
comptent respectivement, 867 et 877 acides aminés et RSulf-1 et -2 respectivement, 870 et
875 acides aminés. La longueur accrue est apportée par l'insertion d'un domaine hydrophile
(domaine HD) dans le premier tiers du côté C-terminal de la protéine (Dhoot et al. 2001;
Morimoto-Tomita et al. 2002). Le domaine HD est une caractéristique structurale hautement
conservée et spécifique des Sulfs. Enfin, les Sulfs sont les seules hydro-FGly-sulfatases qui ont
une action directe et non catabolique sur des chaînes intactes de HS et dont l’action conduit
à une régulation de la signalisation, à la différence des hydro-Fgly-sulfatases lysosomales qui
sont impliquées dans le catabolisme de substrats sulfatés (Morimoto-Tomita et al. 2002;
Robertson et al. 1992).
Les spécificités des Sulfs se résument dans leur localisation extracellulaire inhabituelle
comparée aux autres sulfatases humaines. Les Sulfs représentent les sulfatases de plus grande
taille en raison de l’insertion de domaine HD. Les Sulfs exercent une activité endosulfatase
unique sur les chaînes intactes d’héparane sulfate.
I.2.3 Caractéristiques structurales des HSulfs
I.2.3.1 Organisation en domaines des HSulfs
HSulf-1 et HSulf-2 sont codées par deux gènes distincts localisés sur les chromosomes
8q13.2-q13.3 (HSulf-1) et 20q13.12 (HSulf-2) (Morimoto-Tomita et al. 2002). HSulfs montrent
des caractéristiques structurales similaires à celles des autres Sulfs déjà caractérisées Qsulf-1
(Dhoot et al. 2001), RSulFP1 (Ohto et al. 2002), Msulf-1 et MSulf-2 (Morimoto-Tomita et al.
2002), RSulFP2 (Nagamine et al. 2005) et QSulf-2 (Ai et al. 2006). Les HSulfs sont des protéines
multi-domaines (Figure I.7). La séquence protéique débute par un peptide signal de 22 et 24
acides aminés (aa) pour HSulf-1 et HSulf-2, respectivement. Il a été montré que chez QSulf-1
cette séquence dirige la sécrétion de Sulf-1 à la surface de la cellule (Ai et al. 2006). Le peptide
signal sert à adresser Sulf vers le milieu extracellulaire. Eliminé au cours de la sécrétion de Sulf,
il est absent de la forme mature de Sulf. Le peptide signal précède le domaine N-terminal,
appelé aussi le domaine catalytique, de 392 aa (HSulf-1) et 391 aa (HSulf-2). Le domaine N-
33
terminal des deux HSulfs est fortement conservé et montre une homologie de séquence très
élevée de 42% pour HSulf-1 et 44% pour HSulf-2 avec la région N-terminale de l’hydro-FGly-
sulfatase lysosomale humaine HG6S. Dans ce domaine N-terminal se trouve les deux
séquences consensus fortement conservées et qui dessinent la signature des hydro-FGLY-
sulfatase (1er signature PMCCPSRSS(M/I)LTG pour HSulf-1/2 et la 2eme signature =
GYRTAFFGKYLNE pour HSulf-1 et 2, soulignée en gras dans la Figure I.8) (Morimoto-Tomita et
al. 2002; Ohto et al. 2002). Dans la première signature, on trouve le résidu Cys indispensable
pour former le résidu formylglycine (Morimoto-Tomita et al. 2002). Les HSulfs présentent à la
suite du domaine N-terminal un autre domaine dénommé domaine HD constitué de résidus
basique/hydrophile. Ce domaine HD est propre aux Sulfs, et ne présente aucune homologie
de séquence avec d’autres protéines connues. Le domaine HD (327 aa pour HSulf-1 et 307 aa
pour HSulf-2) est remarquablement riche en acides aminés chargés (nombre de résidus acides
(Asp et Glu) et basiques (Arg et Lys), respectivement 46/76 pour HSulf-1 et 39/ 66 pour HSulf-
2. Cette caractéristique contribue à des pI théorique de HSulf-1 (pI: 9,28) et HSulf-2 (pI: 9,31)
très basiques comparés à celui de HG6S (pI: 7,9) Par conséquent, les deux HSulfs sont
fortement chargées positivement à pH neutre. Les séquences N- et C-terminales du domaine
HD sont très conservées entre les Sulfs de différentes espèces de vertébrés et entre QSulf-1
et QSulf-2. Parmi ces séquences conservées, on note en particulier un groupe de 12 résidus
basiques du côté C-terminal du domaine HD Figure I.7. La séquence interne de domaine HD
est nettement moins conservée et inclut des séquences spécifiques des Sulf-2 rencontrés chez
les vertébrés, mais beaucoup moins conservées entre Sulf-1 et Sulf-2 (Ai et al. 2006; Frese et
al. 2009).
Enfin, le domaine C-terminal, (130 aa pour HSulf-1 et 148 aa pour HSulf-2), montre une
identité de séquence significative avec la région C-terminale de la sulfatase HG6S de 22 et 25
%, respectivement pour HSulf-1 et HSulf-2. C’est pourquoi, les HSulfs sont parfois décrites de
manière très simplifiée comme des analogues de sulfatases HG6S présentant l’insertion de
domaine HD entre les extrémités N-terminale et C-terminale de cette sulfatase.
34
Figure I.7 : Représentation schématique de l'organisation en domaines de HSulf-2.
Les différents domaines de HSulf-2 sont indiqués par des couleurs distinctes et par leurs 4 résidus terminaux : Peptide signal (orange, 24 aa);
Domaine catalytique (bleu-marine, 391 aa); Domaine basique/hydrophile (HD) (vert 307 aa); Domaine C-terminale (bleu, 148 aa). Fgly 64:
Formylglycine au site actif, formée par modification post-traductionnelle du résidu cystéine C88 (Morimoto-Tomita et al. 2002). RSIR 538 : site de
coupure reconnu par la protéase de type Furine (fréquent), RNLTKR 565: site de coupure reconnu par la protéase de type Furine (moins fréquent)
(Nagamine et al. 2010; Tang and Rosen 2009). 702 KRKKKLRKLLKR 713: groupe de résidus basiques dans la partie C-terminale du domaine HD (12
aa) (Ai et al. 2006; Frese et al. 2009)
35
HSulf-1 et HSulf-2 affichent une homologie de séquence globale élevée de 64% (Figure I.8),
l’homologie de séquence est plus importante au niveau du domaine N-terminal et C-terminal
avec respectivement, 81 % et 71%, et relativement plus faible au niveau du domaine HD avec
43% d’homologie de séquence. En revanche, elles présentent une homologie plus élevée dans
les régions N- et C-terminales du domaine HD suggérant une fonction à ces séquences. Comme
indiqué précédemment, toute la divergence de séquence est localisée au niveau de la région
interne du domaine HD, remarque également relevée chez QSulf-1 et QSulf-2 (Ai et al. 2006).
Le découpage en domaines de la séquence protéique des HSulfs, et la différence au niveau de
la séquence protéine de HSulf-1 et HSulf-2 est résumé dans le Tableau I.2. La comparaison des
séquences de HSulf-2 à d'autres Sulfs de mammifères, révèle une similitude étendue sur toute
la longueur de la protéine avec 93% d’homologie entre HSulf-2, RSulf-2 et MSulf-2 (Figure I.9).
Les pourcentages d’homologie de séquence en acide aminé sont effectués par l’alignement
de séquence sur Align-UniProt (http://www.uniprot.org/align/).
Tableau I.2: Comparaison du découpage en domaines de la séquence protéique des HSulfs*
* L’indication du numéro d’acide aminé correspond à son emplacement dans la séquence de la base de données.
Caractéristiques structurales HSulf-1 HSulf-2
Nombre d’acides aminés 871 870
Peptide signal M1 - C22 M1 - A24
Domaine N-terminal S23 - E414 F25 - E415
Domaine hydrophile (HD) R415 - L741 R416 -M722
Domaine C-terminal P742 – G871 P723 – G870
36
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN ---MKYSCCALVLAVLGTELLGSLCSTVRSPRFRGRIQQERKNIRPNIILVLTDDQDVEL 57
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN MGPPSLVLCLL--SATVFSLLGGSSAFLSHHRLKGRFQRDRRNIRPNIILVLTDDQDVEL 58
. * * :. .***. .: : *::**:*::*:******************
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN GSLQVMNKTRKIMEHGGATFINAFVTTPMCCPSRSSMLTGKYVHNHNVYTNNENCSSPSW 117
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN GSMQVMNKTRRIMEQGGAHFINAFVTTPMCCPSRSSILTGKYVHNHNTYTNNENCSSPSW 118
**:*******:***:*** *****************:**********.************
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN QAMHEPRTFAVYLNNTGYRTAFFGKYLNEYNGSYIPPGWREWLGLIKNSRFYNYTVCRNG 177
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN QAQHESRTFAVYLNSTGYRTAFFGKYLNEYNGSYVPPGWKEWVGLLKNSRFYNYTLCRNG 178
** ** ********.*******************:****:**:**:*********:****
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN IKEKHGFDYAKDYFTDLITNESINYFKMSKRMYPHRPVMMVISHAAPHGPEDSAPQFSKL 237
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN VKEKHGSDYSKDYLTDLITNDSVSFFRTSKKMYPHRPVLMVISHAAPHGPEDSAPQYSRL 238
:***** **:***:******:*:.:*: **:*******:*****************:*:*
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN YPNASQHITPSYNYAPNMDKHWIMQYTGPMLPIHMEFTNILQRKRLQTLMSVDDSVERLY 297
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN FPNASQHITPSYNYAPNPDKHWIMRYTGPMKPIHMEFTNMLQRKRLQTLMSVDDSMETIY 298
:**************** ******:***** ********:***************:* :*
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN NMLVETGELENTYIIYTADHGYHIGQFGLVKGKSMPYDFDIRVPFFIRGPSVEPGSIVPQ 357
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN NMLVETGELDNTYIVYTADHGYHIGQFGLVKGKSMPYEFDIRVPFYVRGPNVEAGCLNPH 358
*********:****:**********************:*******::***.** *.: *:
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN IVLNIDLAPTILDIAGLDTPPDVDGKSVLKLLDPEKPGNRFRTNKKAKIWRDTFLVERGK 417
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN IVLNIDLAPTILDIAGLDIPADMDGKSILKLLDTERPVNRFHLKKKMRVWRDSFLVERGK 418
****************** * *:****:***** *:* ***: :** ::***:*******
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN FLRKKEESSKNIQQSNHLPKYERVKELCQQARYQTACEQPGQKWQCIEDTSGKLRIHKCK 477
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN LLHKRDNDKVDAQEENFLPKYQRVKDLCQRAEYQTACEQLGQKWQCVEDATGKLKLHKCK 478
:*:*:::.. : *:.*.****:***:***:*.******* ******:**::***::****
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN GPSDLLTVRQSTRNLYARGFHDKDKECSCRESGYRASRSQRKSQRQFLRNQGTPKYKPRF 537
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN GPMRLGGSRA-LSNLVPKYYGQGSEACTCDSGDYKLSLAGRRKK------LFKKKYKASY 531
** * * ** : : : .: *:* ...*: * : *:.: . *** :
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN VHTRQTRSLSVEFEGEIYDINLEEEEELQVLQPRNIAKRHDEGHKGPRDLQASSGGNRGR 597
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN VRSRSIRSVAIEVDGRVYHVGLGDAA-----QPRNLTKRHWPGAPEDQ--DDKDGGDFSG 584
*::*. **:::*.:*.:*.:.* : ****::*** * : : ..**: .
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN MLADSSNAVGPPTTVRVTHKCFILPNDSIHCERELYQSARAWKDHKAYIDKEIEALQDKI 657
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN T--GGLPDYSAANPIKVTHRCYILENDTVQCDLDLYKSLQAWKDHKLHIDHEIETLQNKI 642
.. . . ::***:*:** **:::*: :**:* :****** :**:***:**:**
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN KNLREVRGHLKRRKPEECSCSKQSYYNKEKGVKKQEKLKSHLHPFKEAAQEVDSKLQLFK 717
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN KNLREVRGHLKKKRPEECDCHKISYHTQHKGRLKH--RGSSLHPFRKGLQEKDKVWL-LR 699
***********:::****.* * **:.:.** *: * ****::. ** *. ::
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN ENNRRRKKERKEKRRQRKGEECSLPGLTCFTHDNNHWQTAPFWNLGSFCACTSSNNNTYW 777
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN E-QKRKKKLRKLLKRLQNNDTCSMPGLTCFTHDNQHWQTAPFWTLGPFCACTSANNNTYW 758
* ::*:** ** :* ::.: **:**********:********.** ******:******
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN CLRTVNETHNFLFCEFATGFLEYFDMNTDPYQLTNTVHTVERGILNQLHVQLMELRSCQG 837
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN CMRTINETHNFLFCEFATGFLEYFDLNTDPYQLMNAVNTLDRDVLNQLHVQLMELRSCKG 818
*:**:********************:******* *:*:*::*.:**************:*
SP|Q8IWU6|SULF1_HUMAN YKQCNPRPKNLDVGNKDGGSYDLH------------------RGQLWDGWEG 871
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN YKQCNPRTRNMDLGLKDGGSYEQYRQFQRRKWPEMKRPSSKSLGQLWEGWEG 870
******* :*:*:* ******: : ****:****
37
Figure I.8: Comparaison des séquences d'acides aminés de HSulf-1 et de HSulf-2
Alignement par Align-Uniprot (http://www.uniprot.org/align/) de la séquence d’acides aminés (aa) de HSulf-1
avec HSulf-2. Peptide signal (orange), domaine N-terminal (bleu marine), domaine HD (vert) et domaine C
terminal (bleu claire). (*) Indique l'identité en aa pour les deux protéines, (*) le résidu cystéine qui est converti
en résidu Cα-formylglycine et qui est essentiel pour l'activité enzymatique. (:) signifie une différence en aa dans
les deux séquences de HSulfs. Les soulignements indiquent les deux séquences de signatures historiques des
sulfatases contenant des séquences consensus qui sont fortement conservées parmi la famille des hydro-FGLY-
sulfatases. SG : Motif sur lequel une chaîne de GAG peut se greffer.
38
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN M-------------GPPSLVLCLLSATVFSLLGGSSAFLSHHRLKGRFQRDRRNIRPNII
tr|B2GUU3|B2GUU3_RAT M-------------APPGLPLWLLSTALFSLLAGSSAFLSYPRLKGRFQRDRRNIRPNII
sp|Q8CFG0|SULF2_MOUSE M-------------APPGLPLWLLSTALLSLLAGSSAFLSHPRLKGRFQRDRRNIRPNII
sp|P15586|HG6S _HUMAN MRLLPLAPGRLRRGSPRHLP--SCSPALLLLVLGGCL--------GVFGVAAGTRRPNVV
* .* * *.::: *: *.. * * . ***::
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN LVLTDDQDVELGSMQVMNKTRRIMEQGGAHFINAFVTTPMCCPSRSSILTGKYVHNHNTY
tr|B2GUU3|B2GUU3_RAT LVLTDDQDVELGSMQVMNKTRRIMEQGGAHFINAFVTTPMCCPSRSSILTGKYVHNHNTY
sp|Q8CFG0|SULF2_MOUSE LVLTDDQDVELGSMQVMNKTRRIMEQGGAHFINAFVTTPMCCPSRSSILTGKYVHNHNTY
sp|P15586|HG6S _HUMAN LLLTDDQDEVLGGMTPLKKTKALIGEMGMTFSSAYVPSALCCPSRASILTGKYPHNHHVV
*:****** **.* ::**: :: : * * .*:*.:.:*****:******* ***:. sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN TN--NENCSSPSWQAQHESRTFAVYLNS-TGYRTAFFGKYLNEYNG------SYVPPGWK
tr|B2GUU3|B2GUU3_RAT TN--NENCSSPSWQAQHESRTFAVYLNS-TGYRTAFFGKYLNEYNG------SYVPPGWK
sp|Q8CFG0|SULF2_MOUSE TN--NENCSSPSWQAQHESRTFAVYLNS-TGYRTAFFGKYLNEYNG------SYVPPGWK
sp|P15586|HG6S _HUMAN NNTLEGNCSSKSWQKIQEPNTFPAILRSMCGYQTFFAGKYLNEYGAPDAGGLEHVPLGWS
.* : **** *** :*..**.. *.* **:* * *******.. .:** **.
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN EWVGLLKNSRFYNYTLCRNGVKEKHGSDYSKDYLTDLITNDSVSFFRTSKKMYPHRPVLM
tr|B2GUU3|B2GUU3_RAT EWVGLLKNSRFYNYTLCRNGMKEKHGSDYSTDYLTDLITNDSVSFFRTSKKMYPHRPVLM
sp|Q8CFG0|SULF2_MOUSE EWVGLLKNSRFYNYTLCRNGVKEKHGSDYSTDYLTDLITNDSVSFFRTSKKMYPHRPVLM
sp|P15586|HG6S _HUMAN YWYALEKNSKYYNYTLSINGKARKHGENYSVDYLTDVLANVSLDFLDYKSNF---EPFFM
* .* ***::*****. ** .***.:** *****:::* *:.*: ..:: .*.:*
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN VISHAAPHGPEDSAPQYSRLFPNASQHITPSYNYAPNPDKHWIMRYT-GPMKPIHMEFTN
tr|B2GUU3|B2GUU3_RAT VISHAAPHGPEDSAPQYSRLFPNASQHITPSYNYAPNPDKHWIMRYT-GPMKPIHMEFTN
sp|Q8CFG0|SULF2_MOUSE VISHAAPHGPEDSAPQYSRLFPNASQHITPSYNYAPNPDKHWIMRYT-GPMKPIHMEFTN
sp|P15586|HG6S _HUMAN MIATPAPHSPWTAAPQYQKAFQNVFAPRNKNFNIH-GTNKHWLIRQAKTPMTNSSIQFLD
:*: .***.* :****.: * *. . .:* ..:***::* : **. ::* :
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN MLQRKRLQTLMSVDDSMETIYNMLVETGELDNTYIVYTADHGYHIGQFGLVKGKSMPYEF
tr|B2GUU3|B2GUU3_RAT MLQRKRLQTLMSVDDSMETIYDMLVETGELDNTYIVYTADHGYHIGQFGLVKGKSMPYEF
sp|Q8CFG0|SULF2_MOUSE MLQRKRLQTLMSVDDSMETIYDMLVETGELDNTYILYTADHGYHIGQFGLVKGKSMPYEF
sp|P15586|HG6S _HUMAN NAFRKRWQTLLSVDDLVEKLVKRLEFTGELNNTYIFYTSDNGYHTGQFSLPIDKRQLYEF
*** ***:**** :*.: . * ****:****.**:*:*** ***.* .* ***
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sp|Q8CFG0|SULF2_MOUSE DIRVPFYVRGPNVEAGSLNPHIVLNIDLAPTILDIAGLDI-PADMDGKSILKLLDSERPV
sp|P15586|HG6S _HUMAN DIKVPLLVRGPGIKPNQTSKMLVANIDLGPTILDIAGYDLNKTQMDGMSLLPILRGASNL
**:**: ****.::.. . :* ****.******** *: ::*** *:* :* :
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN NRFHLKKKMRVWRDSFLVERGKLLHKRDNDKVDAQEENFLPKYQRVKDLCQRAEYQTACE
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sp|P15586|HG6S _HUMAN ----------TWRSDVLVE-----------------------------------------
.**...***
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN QLGQKWQCVEDATGKLKLHKCKGPMRL---GGSRALSNLVPKYYGQGSEACTCD----SG
tr|B2GUU3|B2GUU3_RAT QLGQKWQCVEDASGALKLHKCKGPVRF-GGGGDRALSNLVPKYDGQSSEACSCDGGGGGG
sp|Q8CFG0|SULF2_MOUSE QLGQKWQCVEDASGTLKLHKCKGPMRFGGGGGSRALSNLVPKYDGQSSEACSCD-SGGGG
sp|P15586|HG6S _HUMAN ------------------------------------------YQGEG-------------
* *:.
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN DYKLSLAGRRKKLFKKKYKASYVRSRSIRSVAIEVDGRVYHVGLGDAAQPRNLTKRHWPG
tr|B2GUU3|B2GUU3_RAT DYKLGLAGRR-KLFKKKYKTSYARNRSIRSVAIEVDGEVYHVGLDNMPLPRNLTKRHWPG
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**::. *.
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sp|P15586|HG6S _HUMAN LS----------------------------------------------------------
.
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN HIDHEIETLQNKIKNLREVRGHLKKKRPEECDCHKISYHTQHKGRLKHRGSSLHPFRKGL
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sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN QEKDKVWLLREQKRKKKLRKLLKRLQNNDTCSMPGLT-CFTHDNQHWQTAPFWTLGPFCA
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sp|P15586|HG6S _HUMAN ---------------------------------PGVSQCF----------------PDCV
**:: ** * *.
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN CTSANNNTYWCMRTINETHNFLFCEF--ATGFLEYFDLNTDPYQLMNAVNTLDRDVLNQL
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sp|Q8CFG0|SULF2_MOUSE CTSANNNTYWCLRTINETHNFLFCEF--ATGFIEYFDLSTDPYQLMNAVNTLDRDVLNQL
sp|P15586|HG6S _HUMAN CEDAYNNTYACVRTMSALWNLQYCEFDDQEVFVEVYNLTADPDQITNIAKTIDPELLGKM
* .* **** *:**:. *: :*** *:* ::*.:** *: * .:*:* ::*.::
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN HVQLMELRSCKGYKQCNPRTRNMDLGLKDGGSYEQYRQFQRRKWPEMKRPSSKSLGQLWE
tr|B2GUU3|B2GUU3_RAT HVQLMELRSCKGYKQCNPRTRNMDLGLRDGGSYEQYRQFQRRKWPEMKRPSSKSLGQLWE
sp|Q8CFG0|SULF2_MOUSE HVQLMELRSCKGYKQCNPRTRNMDLGLRDGGSYEQYRQFQRRKWPEMKRPSSKSLGQLWE
sp|P15586|HG6S _HUMAN NYRLMMLQSCSGPTCRTPGV------FDPGYRFDPRLMFSNRGSVRTRRFSKHLL-----
: :** *:**.* . .* . : * :: *..* . :* *.: *
sp|Q8IWU5|SULF2_HUMAN GWEG
tr|B2GUU3|B2GUU3_RAT GWEG
sp|Q8CFG0|SULF2_MOUSE GWEG
sp|P15586|HG6S _HUMAN ----
39
Figure I.9 : Comparaison des séquences en acides aminés de HSulf-2 avec celles des Sulf-2 de rat et souris et
de la sulfatase lysosomale humaine HG6S.
Alignement par Align-Uniprot (http://www.uniprot.org/align/) de la séquence d’acides aminés (aa) de HSulf-2,
RSulf-2, MSulf-2 et HG6S (N-acétylglucosamine-6-sulfatase). Peptide signal (orange), domaine N-terminal (bleu
marine), domaine HD (vert) et domaine C-terminal (bleu clair). (*) Indique l'identité en aa pour les quatre
protéines, (*) le résidu cystéine qui est converti en résidu Cα-formylglycine et qui est essentiel pour l'activité
enzymatique. (:) signifie identité en aa dans trois des quatre protéines. Les soulignements indiquent les deux
séquences de signatures historiques des sulfatases contenant des séquences consensus qui sont fortement
conservées parmi la famille des hydro-FGLY-sulfatases. SG: Motif sur lequel une chaîne de GAG peut se greffer.
I.2.3.2 Les modifications post-traductionnelles de HSulf-2
Les enzymes HSulf-1 et HSulf-2 sont produites sous forme d’une pré-pro-protéine qui va
subir différentes modifications post-traductionnelles pour constituer une protéine mature et
active.
I.2.3.2.a Clivage protéolytique
La forme pré-pro-protéine pro-active des HSulfs subit un premier clivage, celui du peptide
signal qui est éliminé dans le réticulum endoplasmique pour donner la pro-protéine
(Morimoto-Tomita et al. 2002; Tang and Rosen 2009). La pro-protéine est ensuite clivée par
la protéase furine dans le réseau trans-golgien (TGN)/ système endosomal (Thomas 2002). Il
existe deux sites de coupure par la furine, localisés au milieu du domaine HD (Figure I.7): le
premier site qui contient la séquence classique de clivage par la furine (RXXR= 511RSIR514 pour
HSulf-2) est le site de coupure le plus fréquent, comparé au second ((K/R)XXX(K/R)R =
536RNLTKR541 pour HSulf-2). Ces deux sites de clivage par la furine sont très conservés chez
l’homme et chez d'autres espèces telles que la souris et le rat (Nagamine et al. 2010; Tang and
Rosen 2009). Le site de clivage préférentiel de HSulf-2 a été identifié par plusieurs méthodes:
analyse par la méthode d’Edman, analyses biochimiques par utilisation d’un inhibiteur de
furine et mutagénèse. La suppression du premier site de clivage de HSulf-2 bloque
partiellement le clivage de la protéine, mais la suppression du second site n’a aucun effet sur
le clivage. Néanmoins, le clivage est presque complètement absent lorsque les deux sites ont
été supprimés pour la protéine HSulf-2. Il est important de noter que l’absence de clivage
d’HSulf avec la furine n’a pas d’effet, ni sur l'activité enzymatique aryl et endo-sulfatase, ni sur
la sécrétion et le maintien de l’enzyme sur la membrane cellulaire. Néanmoins, la localisation
de HSulf-2 non clivée dans les rafts lipidiques est diminuée avec pour conséquence une
40
altération de l’activité biologique de HSulf-2 dans la signalisation Wnt (Tang and Rosen 2009).
Ces résultats suggèrent que le clivage par la furine est impliqué dans la localisation correcte
de l’enzyme à la surface cellulaire.
L’action de la protéase furine sur HSulf conduit à une structure bicaténaire des sulfs qui
n’est pas retrouvée chez les autres sulfatases, qui toutes sont monocaténaires (en effet les
sites de clivage sont dans le domaine HD qui n’existe pas chez les autres sulfatases). A l’issue
de ces clivages protéolytiques, la forme mature des HSulfs est obtenue, constituée de deux
sous-unités que nous appellerons ci-après chaîne longue et chaîne courte par référence aux
nombres d’acides aminés qui les composent.
I.2.3.2.b Le(s) pont(s) disulfure de HSulf-2
L’analyse par Western blot de HSulfs en conditions réductrices et non-réductrices a
confirmé la présence de ponts disulfure dans la forme mature de HSulf. En effet, une analyse
de HSulf-2 par western blot en conditions non réductrices, fait apparaitre une bande à 125
kDa, alors qu’en conditions réductrices les deux chaînes sont détectées (Tang and Rosen
2009). La protéine possède 23 cystéines susceptibles de former au moins un pont disulfure
pour lier les deux chaînes, longue et courte. Toutefois, à ce jour l’identité des cystéines
impliquées dans la formation de pont(s) disulfure(s) et la participation de ces liaisons dans la
formation de la poche catalytique ne sont pas encore déterminées.
I.2.3.2.c Glycosylation de HSulf-2
La masse moléculaire théorique de la pro-protéine HSulf-2 (Hsulf-2 sans le peptide signal)
calculée d’après la séquence en acide aminé donnée dans UniProt (Accession number :
Q8IWU5) est de 98151,85 Da, le clivage protéolytique par la furine de HSulf-2 engendrant deux
chaînes à 59338,86 Da (chaîne longue) et à 38831 Da (chaîne courte), il s’agit également des
masses théoriques déduites de la séquence en acides aminés de HSulf-2. Cependant, après
analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) en conditions non-réductrices et
détection par immunoblot de la protéine, une bande très large est détectée à environ 250
kDa. Elle peut s’expliquer par la formation d’oligomères de HSulf-2 (Morimoto-Tomita et al.
2002; Tang and Rosen 2009). Des bandes à 132 kDa (Morimoto-Tomita et al. 2002) et 125 kDa
(Tang and Rosen 2009) attribuées à la protéine entière sont visibles, et à 75 et 50 kDa,
attribuées respectivement à la chaîne longue et la chaîne courte sont également détectées
(Tang and Rosen 2009). Les différences avec les valeurs de masses théoriques, de 98 à 132
41
kDa pour HSulf-2 entière, de 59 à 75 kDa pour la chaîne longue et de 39 à 50 kDa pour la chaîne
courte, peuvent être notamment attribuées à de la N-glycosylation. La glycosylation protéique
N-liée a lieu dans la lumière du réticulum endoplasmique, en même temps que la traduction,
par le transfert d'une unité glycosyle sur des résidus asparagine dans la séquence tripeptidique
Asn-Xaa-(Ser/Thr) (Bolt, Kristensen, and Steenstrup 2005). Cette première étape est catalysée
par l'oligosaccharyltransférase, un composant de la machinerie de traduction des protéines
dans la membrane du RE. Au fur et à mesure que la protéine nouvellement glycosylée est
transportée du RE vers l'appareil de Golgi, d'autres saccharides sont ajoutés pour former des
chaînes de N-glycanes plus ou moins longues et ramifiées. On compte 10 et 12 sites potentiels
de N-glycosylation, respectivement pour HSulf-1 et HSulf-2 (http://www.uniprot.org),
distribués sur les deux chaînes (Morimoto-Tomita et al. 2002). HSulf-1 et 2 présentent 7 sites
potentiels de N-glycosylation au niveau du domaine N-terminal de la chaîne longue sur Asn
64, 111, 131, 148, 170, 197 et 240 pour HSulf-1, et Asn 65, 112, 132, 149, 171, 198 et 241 pour
HSulf-2. Les sites potentiels de N-glycosylation sont moins nombreux sur la chaîne courte, à
savoir 3 pour HSulf-1 sur Asn 623, 773 et 783, et 5 pour HSulf-2 sur Asn 561, 608, 717, 754 et
764. Outre les chaînes glycosylées liées à l'asparagine, d'autres types de glycosylation peuvent
intervenir, comme la O-glycosylation avec des chaînes O-liées aux résidus Ser/Thr. Cependant,
aucune position n’est prédite pour la O-glycosylation pour Sulfs (Frese et al. 2009). En outre,
le traitement enzymatique des HSulfs par la N-glycanase conduit à la détection d’une bande à
~100 kDa après western-blot. Une telle diminution de masse apparente révèle que HSulfs sont
effectivement N-glycosylées (Morimoto-Tomita et al. 2002). Des résultats similaires ont été
rapportés chez le rat après un traitement par la N-glycanase (Nagamine et al. 2010). Pour
QSulf-1, il a été montré que la glycosylation est indispensable à la reconnaissance du substrat,
l’activité enzymatique, la sécrétion et le positionnement de l’enzyme à la surface cellulaire
(Ambasta, Ai, and Emerson 2007). La glycosylation N-liée est souvent essentielle pour le
repliement des protéines, la stabilité, le transport intracellulaire, la sécrétion et l'activité
fonctionnelle. Les HSulfs sont des glycoprotéines avec des chaînes de type N-glycane dont la
localisation, la nature et le rôle ne sont pas caractérisés/ identifiés à ce jour.
I.2.3.2.d Conversion de la cystéine en Fomylglycine chez HSulf-1/2
A l’image de toutes les hydro-FGly-sulfatases, l’activité des deux HSulfs repose sur la
conversion d’une cystéine hautement conservée dans le domaine N-terminal en Cα-
42
formylglycine. En effet, la mutation par substitution en alanine de la cystéine susceptible
d’être convertie en Cα-formylglycine dans HSulf-1 (Cys87) et HSulf-2 (Cys88) entraîne la perte
totale de l’activité enzymatique, aussi bien arylsulfatase vis-à-vis du substrat synthétique 4-
methylumbelliferyl sulfate (4-MUS), que endosulfatase vis-à-vis de leur substrat naturel l’HS
(Frese et al. 2009; Morimoto-Tomita et al. 2002). Actuellement, aucune étude ne décrit une
identification directe au niveau protéique de la présence du résidu catalytique formylglycine
dans Sulfs. Ceci car l’identification de la cystéine; sujet de la conversion en Cα-formylglycine
chez les Sulfs; est déterminée de façon indirecte par déduction à partir de la séquence
consensus des sulfatases et la mutation en alanine des deux cystéines adjacentes pour HSulf-
1 (Cys87 et Cys88) et HSulf-2 (Cys88 et Cys89) (Lamanna et al. 2008; Morimoto-Tomita et al.
2002)
I.2.3.3 Importance fonctionnelle des domaines de HSulf-2
I.2.3.3.a Les domaines N- et C-terminaux de HSulf
La chaîne longue formée à la suite du clivage par la furine contient le domaine N-terminal
avec le site catalytique et son résidu Cα-formylglycine ainsi qu’une partie du domaine HD
(Figure I.10a) (S1N, S2N). Lorsque la chaîne longue avec le résidu Cα-formylglycine est
exprimée seule, elle n’a aucune activité enzymatique aussi bien arylsulfatase avec le substrat
synthétique 4-MUS, qu’endosulfatase avec le substrat naturel HS (Figure I.10b). Cependant,
quand la partie N-terminale de la chaîne longue est exprimée avec le domaine C-terminal de
la chaîne courte (HSulf sans le domaine HD) (Figure I.10a) (S1 ΔHD, S2 ΔHD), cet assemblage
montre uniquement une activité arylsulfatase (Figure I.10c) (Tang and Rosen 2009).
43
Figure I.10: Importance de la chaîne courte et du domaine HD dans l’activité enzymatique de HSulfs
a) Schéma des différentes constructions de HSulf-1 et -2 avec délétion de la chaîne courte (S1N, S2N) ou délétion
du domaine HD (S1 ΔHD, S2 ΔHD) 1 et 2 pour HSulf-1 et 2 respectivement. Les rayures indiquent les régions
apparentées à la sulfatase HG6S et le gris indique les domaines hydrophiles. b) et c) Activité aryl- ,et
endosulfatase des HSulfs sauvages et des différentes constructions de HSulf-1 et -2, sur substrats 4-MUS et HS
marqué (35S). Des quantités similaires d'enzymes ont été utilisées dans des dosages enzymatiques comme le
montre le transfert Western FLAG (N terminal) (Tang and Rosen 2009).
44
Comme présenté précédemment (voir paragraphe I.1.5), la poche catalytique des six hydro-
FGly-sulfatases humaines dont la structure est caractérisée, est formée de la formylglycine
catalytique et neuf autres résidus conservés. Parmi ces résidus, quatre sont impliqués dans
l’association à un ion calcium, qui va lier et activer le groupement sulfate du substrat, et cinq
autres acides aminés stabilisent le résidu formylglycine. A ce jour, les résidus entrant dans la
formation de la poche catalytique des Sulfs ne sont pas identifiés. On suggère que les résidus
qui forment la poche catalytique présentant une activité arylsulfatase proviennent de la partie
N-terminale de la chaîne longue et de la partie C-terminale de la chaîne courte, mais
n’appartiennent pas au domaine HD.
I.2.3.3.b Le domaine hydrophile
Comme mentionné précédemment, une différence majeure des Sulfs avec les autres
hydro-FGly-sulfatases lysosomales est leur domaine hydrophile (HD). Plusieurs études ont été
menées pour déterminer son rôle:
-Une fonction enzymatique: l’expression des HSulfs sans leur domaine HD montre une activité
arylsulfatase réduite alors que l'activité endosulfatase sur HS est complètement perdue (Frese
et al. 2009; Tang and Rosen 2009). En revanche, la suppression de la région interne du
domaine HD (résidus 458 à 617 pour HSulf-1) n'affecte ni l'activité, ni la spécificité de substrat
de HSulf-1 vis-à-vis de l’HS et du substrat synthétique 4-MUS (Frese et al. 2009). Ce résultat
souligne donc l’importance des régions N- et C-terminales dont il faut rappeler l’homologie de
séquence élevée entre toutes les Sulfs, toute la divergence de séquence étant localisée au
niveau de la région interne de HD (Ai et al. 2006; Frese et al. 2009). Il est important de noter
que l'extrémité C-terminale du domaine HD de HSulf-1 renferme un groupe de résidus
basiques (résidus 721 à 736) que l’on retrouve aussi chez HSulf-2 (Figure I.7) et qui semble
être essentiel, mais insuffisant, pour l'activité de l’enzyme. En effet, une construction de HSulf-
1, ne conservant du domaine HD que ce groupe de résidus basiques, n’a pas montré une perte
totale de son activité endosulfatase vis-à-vis des HS, à la différence de la forme de HSulf-1,
dépourvue de la totalité du domaine HD. Cependant, cette activité reste inférieure à l’activité
de HSulf-1 intègre, ou à celle de la forme ne conservant que les extrémités C- et N- terminales
du domaine HD (Frese et al. 2009).
45
Le domaine HD semble conférer aux HSulfs de façon directe ou indirecte, l’activité
endosulfatase dont sont dépourvues les exosulfatases lysosomales. Le mécanisme impliqué
n’est pas encore élucidé, mais plusieurs hypothèses ont été émises, attribuant à l’HD un rôle
dans la présentation directe du substrat au site catalytique ou dans le positionnement du site
catalytique à proximité du site de liaison du substrat. Ainsi, selon le modèle proposé par Ai X.
et al. (Ai et al. 2006) et par Frese et al. (Frese et al. 2009), le domaine HD lierait la chaîne HS
d'abord pour neutraliser sa charge négative, puis pour la présenter au site actif pour une
catalyse efficace (Ai et al. 2006; Frese et al. 2009).
-Une fonction de reconnaissance du substrat polysaccharide anionique HS/HP: Il a été
montré que le domaine HD est un site d'interaction avec l’HS/HP. En effet, l’analyse par
chromatographie d'affinité et résonance plasmonique de surface de la liaison des HS/HP au
domaine HD isolé a montré une interaction de forte affinité de HD avec les HP/HS (Kd1 = 0.6
nM et Kd2 = 17 nM correspond à deux sites de liaison indépendants, un site de haute affinité
au niveau du C-terminal du domaine HD et un site de faible affinité au niveau du N-terminal
du domaine HD). Toutefois, cette interaction est perdue quand l’HS/HP est 6-O-désulfaté par
une HSulf, révélant le rôle primordial des groupements 6-O-sulfate des HS/HP dans la
reconnaissance du substrat (Frese et al. 2009).
-Une fonction dans la localisation extracellulaire des HSulfs: Il a été montré que le domaine
HD est requis pour la localisation de HSulf1 à la surface cellulaire, alors que le cluster basique
à son extrémité C-terminale n'est pas suffisant pour permettre cette localisation (Frese et al.
2009).
La suppression de tout le domaine HD de Sulf-1 réduit fortement la localisation de HSulf-1 à
la surface cellulaire (localisation mise en évidence par microscopie-immunofluorescence
indirecte en utilisant un anticorps dirigé contre l’étiquette en C-terminale) et entraîne une
augmentation considérable de HSulf-1 dans le surnageant cellulaire. D’autre part, la délétion
de la région intérieure du domaine HD n'affecte pas la localisation de HSulf-1 à la surface
cellulaire (Frese et al. 2009). En accord avec ces données concernant le domaine HD de HSulf-
1, il a été montré que le domaine hydrophile des QSulfs est également nécessaire à l’ancrage
des QSulfs à la surface de la cellulaire (Ai et al. 2006). Par ailleurs, l’association de HSulf-1 à la
surface cellulaire est très diminuée par l’action d’héparinases, ce qui indique que la
46
localisation et l'association des HSulfs à la surface cellulaire sont assurées par le domaine HD
et son interaction avec l'HS (Frese et al. 2009).
-Fonction indirecte de domaine HD dans la localisation de HSulf dans les radeaux lipidiques:
le domaine HD comporte dans sa séquence les sites de clivage par la furine ; l’absence de
clivage des HSulfs conduit à une répartition non-homogène de l’enzyme HSulf sur la
membrane cellulaire. En effet, HSulf non clivée est moins présente dans les rafts lipidiques et
son action dans la régulation de la signalisation Wnt est perdue. Le mécanisme exact par
lequel le clivage module l’accumulation de HSulf dans les rafts lipidiques n’est pas connu à ce
jour (Tang and Rosen 2009).
Des études supplémentaires sont encore nécessaires pour mieux comprendre le rôle du
domaine HD in vivo.
Le domaine HD est essentiel pour la désulfatation des chaînes d’HS. Cette spécificité est en
partie due à sa capacité à se lier avec une forte affinité aux chaînes de HS, ce qui permettrait
l’ancrage de HSulf à la surface cellulaire en interaction avec son substrat. Les régions N- et C-
terminales (très basiques et conservées chez les Sulfs) du domaine HD agissent comme les sites
de liaison à l’héparine et à l’héparane sulfate fortement anioniques. Ces données suggèrent
qu’hormis les neuf résidus de la poche catalytique des hydro-FGly-sulfatases, d’autres résidus
localisés au niveau des régions N- et C-terminales du domaine HD, interviennent également
dans la fonction enzymatique, en particulier dans la reconnaissance et la présentation du
substrat HS à la poche catalytique.
I.2.4 Cible(s) ou substrat(s) de(s) HSulf(s)
Les endosulfatases Sulfs ont comme substrat naturel une sous-famille de GAGs, les
glucosaminoglycanes (HS et HP). Les GAGs constituent une classe de molécules complexes,
polymériques, anioniques, non codées génétiquement. En raison de cette dernière
caractéristique, la cellule s’est dotée d’un dispositif enzymatique unique pour construire ces
polymères (biosynthèse) et pour l’HS d’en moduler la structure post-biosynthèse.
I.2.4.1 Les glycosaminoglycanes
Les GAGs sont des hétéropolysaccharides linéaires, possédant un squelette osidique
constitué de la répétition d’unités disaccharidiques formées d'un acide uronique (UA) et d'une
hexosamine. Les unités UA peuvent être soit l'acide ß-D-glucuronique (GlcA) soit son épimère
47
en C5, l'acide α-L-iduronique (IdoA). L’hexosamine peut être soit à base de glucose (Glc) (α-D-
ou β-D-glucosamine, GlcN), soit à base de galactose (Gal), sous forme de N-acétyl-β-D-
galactosamine (GalNAc). On peut ainsi diviser les GAGs en deux groupes: les
glucosaminoglycanes comprenant l'héparane sulfate (HS), l’héparine (HP) (acide hexuronique
/ N-acétyl-glucosamine) (Figure I.11a), le kératane sulfate (KS, galactose / N-acétyl-
glucosamine) (Figure I.11c) et l'acide hyaluronique (HA, acide glucuronique / N-acétyl-
glucosamine), et les galactosaminoglycanes comprenant l’ensemble des chondroïtines et
dermatane sulfate (CS et DS, acide hexuronique / N-acétyl-galactosamine) (Figure I.11c). Le
squelette des GAGs (sauf HA) subit au cours de la biosynthèse une série de modifications
d’épimérisation, de sulfatation et de dé-acétylation, créant des motifs séquentiels qui
constitueront des sites de liaison plus ou moins spécifiques de certaines protéines. Chez les
eucaryotes, seul l’HS à la propriété de pouvoir subir une étape supplémentaire de modification
post-synthétique de sa structure à la surface cellulaire : il s’agit de la 6-O-désulfatation
catalysée par les endosulfatases HSulfs.
48
Figure I.11: Structures générales des GAGs: (a) Schéma d'un disaccharide d'héparane sulfate avec toutes les
modifications possibles et les enzymes responsables de ces modifications: NDST (N -décacétylase-
sulfotransférase), GLCE (C5 -glucuronyl-épimérase), HS2ST (HS-2 O - sulfotransférase), HS3ST (HS-3- O-
sulfonférases) et HS6ST (HS-6- O- sulfotransférase). (b) Schéma d'un disaccharide de chondroïtine / dermatane
sulfate avec toutes les modifications possibles. Le dermatane sulfate est caractérisé par la présence d'acide
iduronique. Les enzymes responsables des modifications sont indiquées: CS / DS5epi (C5 -glucuronyl-épimérase),
UST (uronyl-2-O-sulfonférase), C4ST / D4ST (chondroïtine / dermatane-4- O- sulfotransférase), C6ST
(chondroïtine-6- O- sulfotransférase), GalNAc4S-6ST (GalNAc4S-6- O- sulfotransférase) (Townley and Bülow
2018).
I.2.4.1.a Biosynthèse et structure des protéoglycanes d’héparane sulfate (HSPG) et
protéoglycanes de chondroïtine sulfate (CS/DSPG)
La biosynthèse et l’élongation de la chaîne de GAGs sulfatés s’opèrent via son attachement
à un core protéique pour former les protéoglycanes ancrés à la surface membranaire (PG)
(Figure I.12). La voie d’insertion d’un GAG au core protéique est complexe et implique
plusieurs réactions enzymatiques. Pour l’HS, sa biosynthèse est initiée par la liaison O-
glycosidique d’un résidu xylose (Xyl) à la sérine (parfois thréonine) du core protéique au niveau
d’une séquence consensus Ser-Gly. Cette étape de xylosylation catalysée par l’enzyme
xylosyltransférase (XylT) dans le réticulum endoplasmique et / ou dans l'appareil de Golgi, est
suivie par la fixation de deux résidus Gal par la galactosyltransférase-1 (GalT1) et la
49
galactosyltransférase-2 (GalT2) et enfin par celle d’un acide D-glucuronique (GlcA) par la
glucuronyltransférase-1 (GlcAT1) pour former le tétrasaccharide de liaison GlcAβ(1-3)Galβ(1-
3)Galβ(1-4)Xylβ1-O-Ser) (Esko and Zhangt 1996; Sugahara, K., and Kitagawa 2002). A partir de
ce tétrasaccharide, débute l’élongation de la chaîne HS par l'attachement d’un premier résidu
GlcNAc au tétrasaccharide d’ancrage par l’exostosin like glycosyltransferase 3 (EXTL-3), grâce
à son activité GlcNAc transférase-1 (Busse-Wicher et al. 2014). Puis, le complexe enzymatique
appelé HS polymérase (ou Exostosin glycosyltransferase) constitué par les enzymes EXT1 et
EXT2 intervient pour ajouter alternativement des résidus GlcA et GlcNAc grâce à leurs activités
GlcA-T et GlcNAc-T (Busse and Kusche-Gullberg 2003). Entre 40 et 160 disaccharides sont ainsi
enchaînés pour former un polymère linéaire constitué d’unités répétées formées d’un acide
D-glucuronique (GlcA) relié par une liaison β (1-4) à une N-acetylglucosamine (GlcNAc); les
unités disaccharidiques sont liées entre elles par une liaison α (1-4); la chaîne peut se terminer
par l’un ou l’autre des résidus GlcA ou GlcNAc, en fonction du type cellulaire (Esko and Selleck
2002).
L’unité disaccharidique peut subir une série de modifications/substitutions. La première
d’entre elles est la N-dé-acétylation / N-sulfatation des résidus GlcNAc en GlcNS, catalysée par
des enzymes de type N-Déacétylase/N-Sulfotransférase (NDST). La glucosamine peut donc
être N-acétylée (GlcNAc), N-sulfatée (GlcNS) ou plus rarement demeurée non substituée
(GlcNH2) (Grobe et al. 2002; Rabenstein 2002). Cette première modification (sulfatation) est
requise pour que les modifications suivantes aient lieu : l'épimérisation catalysée par la
glucuronyl C5-épimérase, qui convertit l'acide D-glucuronique (GlcA) en acide L-iduronique
(IdoA) dans les régions N-sulfatées des chaînes HS ; la O-sulfatation en position C2
principalement du résidu IdoA par la 2-O-sulfotransférase (HS2ST), dont l’action bloque
l’épimérisation et empêche donc la reconversion d’un IdoA en GlcA. La sulfatation d’acide
glucuronique en position C2 est très rare. D’autres sulfatations peuvent avoir lieu sur les
fonctions hydroxyle majoritairement en position C6 et plus rarement en C3 de la glucosamine
par la 6-O-sulfotransférase (HS6ST) et la 3-O-sulfotransférase (HS3ST), respectivement
(Kusche-Gullberg and Kjellén 2003). La 3-O-sulfatation au niveau des unités GlcNS6S peut
également se produire (GlcNS3S6S) dans l’HS et l’HP, mais elle est plus fréquente dans les
chaînes d’HP; un pentasaccharide contenant ce résidu monosaccharide inhabituel confère une
50
forte affinité pour l'antithrombine et, par conséquent, une activité anticoagulante élevée sur
l’HP.
Figure I.12: Représentation schématique d’une chaîne HS attachée à une protéine via un linker tétrasaccharide
caractéristique et présentant les différents domaines de degré de sulfatation élevé (NS), faible (NS / NA) ou nul
(NA). Un motif de liaison putatif FGF1 est montré (Townley and Bülow 2018).
Il faut noter que ces modifications de dé-acétylation, épimérisation et sulfatation sont
irrégulières, et que certaines régions de la chaîne HS peuvent échapper à ces modifications,
ce qui conduit à des domaines avec différents niveaux de sulfatation et/ou acétylation le long
du polysaccharide. Cela confère aux HS une organisation moléculaire unique dans laquelle
trois domaines variables possédant différents niveaux de sulfatation peuvent être délimités
(Figure I.12): le domaine NS ou NA/NS, une région riche en N-sulfatation intercalée entre des
régions non modifiées N-acétylées appelées domaine NAc ou NA et des régions NA/NS
partiellement sulfatées appelées domaines de transition. C’est au sein des domaines NS que
se trouvent principalement les motifs saccharidiques responsables de la reconnaissance et la
fixation des différents ligands protéiques des HS.
L’héparine est très proche structuralement de l’HS mais avec un degré de sulfatation
plus élevé (Sarrazin et al. 2011). De plus, l’HP contient beaucoup plus de résidus IdoA. Ainsi,
le motif majoritaire de HP est constitué du disaccharide trisulfaté IdoA2S-GlcNS6S, motif
possédant le taux de sulfatation maximum, donnant une organisation de type domaine NS
plus homogène, et plus étendue (Tableau I.3). Une autre différence entre HS et HP réside dans
51
leur localisation. HS est ubiquitaire, présent à la surface de toutes les cellules de l’organisme
alors que HP, bien connue en médecine pour ses propriétés anticoagulantes, est
essentiellement produite et contenue dans les granules des mastocytes des tissus conjonctifs.
Tableau I.3: Différences majeures entre l’ héparane sulfate et l’héparine (Soares da Costa, Reis, and Pashkuleva
2017)
Propriétés Héparane sulfate Héparine
Masse molaire (kDa) 10-70 7-20
Rapport Sulfate/Glucosamine 0,8-1,8 1,8-2,6
Nombre de groupements sulfate par disaccharide
1 2,7
Taux de GlcNS 40-60% ≥80
Taux de IdoA 30-50% ≥70%
Site de biosynthèse Toutes les cellules Tissus conjonctifs
(mastocytes)
Il est à noter que parmi ces GAGs, seuls les chondroïtines sulfate (CS) et le dermatane
sulfate (DS) débutent leur biosynthèse de la même manière que celle de HS et HP, c’est-à-dire
par la synthèse du tétrasaccharide de liaison GlcAβ(1-3)Galβ(1-3)Galβ(1-4)Xylβ1-O-Ser
(Breton, Fournel-Gigleux, and Palcic 2012; Sugahara, K., and Kitagawa 2002). Les éléments qui
déterminent la nature de la chaîne de GAG, HS/HP ou CS/DS, à partir de ce tétrasaccharide
demeurent mal connus. Néanmoins, il a été montré que le type de GAG attaché au
tétrasaccharide est influencé par la structure du core protéique et par les modifications du
tétrasaccharide (Prydz 2015).
L’élongation des CS/DS a lieu après l’ajout d’un résidu GalNAc par la β-N-
acétylgalactosaminyltransférase I (GalNAcT-I). Cette élongation est assurée par une
Chondroïtine Synthase ayant à la fois une activité β1-3-GlcAT et une activité β1-4-GalNAcT. De
ce fait, le motif disaccharidique de base, répété dans une chaîne de CS/DS, est un acide
glucuronique associé par une liaison β(1-3) à une N-acetylgalactosamine, les motifs
disaccharidiques sont liés entre eux par une liaison β(1-4) pour former la chaîne CS ou DS
(Kitagawa, Uyama, and Sugahara 2001). À la différence des HS/HP, les CS/DS ne subissent pas
de N-déacétylation/N-sulfatation, le résidu GalNAc restant donc sous la forme N-acétylée.
52
Ainsi une C5-épimérase peut transformer les résidus GlcA en IdoA pour former une chaîne DS
aussi appelé chondroïtine sulfate de type B. La chaîne de CS peut subir plusieurs sulfatations
en différentes positions pendant la polymérisation, en C4 et C6 de GalNAc et C2 de IdoA,
catalysées respectivement par la chondroïtine 4-O-sulfotransférase (C4ST), la chondroïtine 6-
O-sulfotransférase (C6ST) et la 2-O-sulfotransférase (CS/DS2ST). La chaîne de DS est
également sulfatée en plusieurs positions, 2-O-sulfatation des acides uroniques (aussi bien
GlcA que IdoA), 4-O-sulfatation et 6-O-sulfatation des GalNAc. De nombreuses unités IdoA de
CS subissent une 2-O-sulfatation qui est catalysée par CS/DS2ST. Cette sulfotransférase a une
plus grande activité vis-à-vis de l’IdoA, et de ce fait IdoA 2-O-sulfaté est plus abondant dans le
DS que GlcA 2-O-sulfaté dans le CS. En raison de l'orientation différente de leurs groupements
carboxyliques, les chaînes de DS sont plus flexibles que les chaînes de CS, ce qui permet des
interactions spécifiques entre plusieurs protéines et polysaccharides (Soares da Costa, Reis,
and Pashkuleva 2017). On distingue différents types de CS en fonction des unités
disaccharidiques constitutives (Figure I.13): unité non sulfatée (GlcA-GalNAc) pour CS-O, unité
mono-sulfatée en position 4 du résidu GalNAc (GlcA-GalNAc4S) pour CS-A, unité mono-
sulfatée en position 6 du résidu GalNAc (GlcA-GalNAc6S) pour CS-C, unité di-sulfatée en
positions 4 et 6 du résidu GalNAc (GlcA-GalNAc4S6S) pour CS-E et une unité di-sulfatée en
position 2 de GlcA et en position 6 du résidu GalNAc (GlcA2S-GalNAc6S) pour CS-D (Mikami
and Kitagawa 2013; Shioiri et al. 2016). Le degré de sulfatation du DS peut varier entre un et
trois groupements sulfate par unité disaccharidique (Lindahl 1978).
Il est important de noter que les oligosaccharides CS / DS sont généralement nommés d'après
le disaccharide prédominant ce qui n’exclut pas la présence d’autres types de disaccharides
(Townley and Bülow 2018).
53
Figure I.13: Structures des principaux disaccharides CS saturés. O, GlcA-GalNAc; A, GlcA-GalNAc4S; C, GlcA-
GalNAc6S; E, GlcA-GalNAc4S6S; D, GlcA2S-GalNAc6S (Shioiri et al. 2016).
La longueur des chaînes de GAGs peut varier considérablement, à la fois entre les
différents types de GAG et parmi les chaînes du même type de GAG. Ainsi, la gamme de masse
moléculaire des GAGs est très large, allant de quelques kDa à plus d’une centaine de kDa. La
masse moléculaire de CS-A, CS-B et CS-C est d’environ 20-60 kDa, correspondant à environ 35-
130 unités disaccharidiques pour les CS-A,-B et -C. En outre, les processus de biosynthèse
peuvent modifier le poids moléculaire (PM) des GAGs (Pomin and Mulloy 2018).
I.2.4.1.b Interaction HS/HPPG aux ligands protéiques
L’interaction des motifs de HS (de quelques disaccharides à des dodécamères) avec les
protéines est gouvernée à trois niveaux: électrostatique, séquence saccharidique et
structuration en domaines (Clarke et al. 1998; Kahnert and Kertesz 2000). Les interactions
électrostatiques impliquent les groupements chargés négativement (groupements
carboxyliques et sulfates de forte densité électronique) du GAG et les résidus basiques de la
protéine. Ensuite, les séquences d’HS peuvent se lier à des protéines sur la base d’une
reconnaissance de séquences spécifiques (ex. : la séquence pentasaccharidique de HP qui lie
l'antithrombine III pour réguler la coagulation, ou encore la séquence d’HS qui lie le facteur
de croissance des fibroblastes ; FGF). Enfin, L’interaction et la liaison des protéines peut
résulter de la reconnaissance d’une distribution précise de motifs, par exemple celle de deux
motifs de domaine NS séparés par un domaine non modifié (domaine NAc) de longueur
54
variable (Townley and Bülow 2018). Par exemple, IL-8 se fixe spécifiquement aux disaccharides
trisulfatés GlcNS (6S)-IdoA(2S) localisés dans un hexasaccharide sulfaté au sein d’un domaine
NS. Néanmoins sa dimérisation requiert que ces motifs soient séparés par au moins sept
unités disaccharidiques de type domaine NAc. La dimérisation, dans ce cas, est rendue
possible grâce à la flexibilité du domaine NAc (Pichert et al. 2012).
I.2.4.1.c Modification post-synthétique des HS/HPPG et CS/DSPG
Les modifications opérées au cours de la biosynthèse de l’HS (dé-acétylation, sulfatation
et épimérisation) étaient considérées comme les seuls déterminants de la structure de ces
GAGs jusqu'à la découverte des enzymes HSulfs (Bülow and Hobert 2006). Les Sulfs sont
responsables des modifications post-synthétiques des chaînes de l’HS en catalysant la 6-O-
désulfatation des domaines NS fonctionnels. La mise en évidence expérimentale de l'activité
des HSulfs a été obtenue par le traitement d’héparine intacte par du milieu de culture
contenant HSulf secrétée par des cellules transfectées par HSulf. HP a été ensuite digérée par
l’heparinase pour produire des disaccharides analysés ensuite par chromatographie
d’échange d'anions. HSulf-1 et HSulf-2 ont conduit à une réduction d'environ 80% de la
quantité d'unités trisulfatées (IdoA2S-GlcNS6S) et en parallèle à une augmentation des unités
disulfatées (IdoA2S-GlcNS). Parallèlement, aucun effet n’a été observé sur les unités
disulfatées, monosulfatées ou non sulfatées. La mutation de la cystéine catalytique dans les
deux Sulfs a entraîné la perte complète de cette activité sur l’unité trisulfatée (Morimoto-
Tomita et al. 2002). Cette action de Sulf sur la 6-O-sulfatation entraîne la diminution d’environ
5-7% de la teneur totale en sulfate de HS (la somme de tous les N- et O-sulfate, expérience in
vitro en utilisant QSulf1) (Ai et al. 2003). Bien que cette diminution globale soit relativement
faible, elle suffit à modifier significativement les propriétés des liaisons de l’HS à des molécules
extracellulaires, modulant ainsi une large gamme de voies de signalisation.
Contrairement aux HS, à ce jour aucune preuve scientifique n’a été apportée montrant
que les CS/DS peuvent aussi subir des modifications post-synthétiques chez les eucaryotes.
Toutefois, deux endosulfatases bactériennes ont été récemment identifiées. Celles-ci
éliminent régio-sélectivement le groupement 4-O-sulfates des disaccharides ou des
polymères de CS/DS. Il s’agit de la 4-O-endosulfatase identifiée chez la bactérie Bacteroides
thetaiotaomicron du microbiote intestinal humain (BT_3349) (Ulmer et al. 2014) et de la 4-O-
endosulfatase de la bactérie marineVibrio sp. FC509 (Wang et al. 2015). Ces deux
55
endosulfatases n’ont qu’une faible homologie de séquence (38%) et ne possèdent pas le
domaine HD décrit chez les Sulfs (Ulmer et al. 2014). Il a été montré que la présence de
l’endosulfatase FC509 augmente significativement la vitesse de dégradation des CS/DS par la
lyase HCLase (une lyase qui dépolymérise l’HA et et les CS, excepté les motifs CS-E) (Han et al.
2014; Peng et al. 2018). Le traitement des CS/DS par l’endosulfatase FC509 inhibe
significativement l'interaction des chaînes CS/DS avec une forme très basique de la GFP
(ScGFP= supercharged GFP), utilisée comme protéine modèle basique. (Neira et al. 2016;
Wang et al. 2015). Ce résultat suggère un rôle de cette CS/DS 4-O-endosulfatase, à l’image de
celui des Sulfs, dans la modification des propriétés de liaisons de ligands protéiques aux CS/DS
en plus de leur fonction catabolique.
Existe-t-il chez les eucaryotes un homologue de ces CS/DS endosulfatases bactériennes
permettant une régulation post-synthétique du niveau de sulfatation des chaînes de GAGs?
La plupart des sulfatases de GAGs qui ont été identifiées jusqu’à maintenant chez les
eucaryotes et les procaryotes sont des exosulfatases. Par conséquent, ces enzymes n'agissent
sur les résidus saccharidiques sulfatés qu’à partir des extrémités de la chaîne de GAG, en
particulier sur les oligosaccharides courts, tels que les disaccharides, qui sont formés au cours
de la dépolymérisation des GAGs (Sugahara and Kojima 1996). Chez les eucaryotes, les Sulfs
représentent les seules enzymes avec une activité endosulfatase. L’alignement de la séquence
entre HSulf-1, HSulf-2 et les deux endo-4-O-sulfatases bactériennes spécifiques montre une
homologie de séquence très faible de l’ordre de 5%.
I.2.4.2 Spécificité du substrat et processivité enzymatique de HSulf-2
La liaison des HSulfs à HS dépend de la présence de groupes 6-O- sulfate (Frese et al. 2009)
résidant dans les domaines NS, et principalement dans l’unité disaccharide trisulfaté [IdoA(2S)
– GlcNS(6S)] d’héparine (Morimoto-Tomita et al. 2002; Saad et al. 2005) et héparane sulfate
(Ai et al. 2003; Viviano et al. 2004). Les deux HSulfs présentent la même spécificité de substrat
pour les disaccharides trisulfatés internes aux chaînes d’HS. Néanmoins, les HSulfs peuvent
également hydrolyser le groupement 6-O-sulfate à partir de disaccharides disulfatés en
position N- et 6-O- de la glucosamine [IdoA - GlcNS6S] de HS (Pempe et al. 2012). En revanche,
aucune activité n’est observée in vitro sur des disaccharides comprenant une GlcNAc6S,
suggérant la nécessité des groupements NS pour leur action (Lamanna et al. 2008). Outre les
domaines NS internes, l'extrémité non-réductrice d‘une chaîne de HS et de HP peut aussi être
56
substrat de HSulf-2 (Huang et al. 2014; Staples, Shi, and Zaia 2011). En revanche, les HSulfs
sont inactives sur le N-acétylgalactosamine 6-sulfate, substrat dérivé de CS (Ai et al. 2006;
Morimoto-Tomita et al. 2002).
HSulf-2 désulfate la chaîne d’HS par un mécanisme d’action dit processif: la 6-O-
désulfatation par HSulf-2 est initiée d’abord au niveau de l’extrémité non-réductrice de la
chaîne HS, pour ensuite opérer la désulfatation vers l’intérieur de la chaîne dans le domaine
NS. Cela a été vérifié in vitro sur un octasaccharide d’HP [(IdoA,2S)-GlcNS,6S)]4, et in vivo en
utilisant des lignées cellulaires de type épithéliales WISH, qui expriment naturellement de
grandes quantités d’HS à leur surface. Dans ce dernier cas, des anticorps spécifiques des HS
sont utilisés: un qui reconnaît spécifiquement un domaine NS particulier, situé à l’extrémité
non-réductrice de la chaîne d’HS (NS4F5), et un second qui reconnaît les domaines NS situés
le long des HS (HS3A8). Après traitement par HSulf-2, une action de l’enzyme à partir des
extrémités non réductrices de HS a été mise en évidence, conduisant dans un premier temps
à la perte de l’épitope NS4F5, puis la progression de l’enzyme le long de la chaîne, en éliminant
dans un deuxième temps les épitopes de l’anticorps HS3A8. In vitro, l’octasaccharide d’HP est
traité de façon ménagée par HSulf-2, puis des analyses par des techniques biochimiques
(séquençage d’oligosaccharides) et biophysiques (MS et RMN) ont révélé que la 6-O-
désulfatation est initiée au niveau de l’extrémité non-réductrice et s’opère suivant un
mécanisme processif en direction de l’extrémité réductrice (Seffouh et al. 2013).
Ces résultats suggèrent que l’enzyme agit de façon processive en partant de l’extrémité
non réductrice de la chaîne d’HS, et que son action s’exerce spécifiquement sur les unités
trisulfatées (UA2S-GlcNS6S).
I.2.5 Différences entre HSulf-1 et HSulf-2
Les deux endosulfatases HSulf-1 et HSulf-2 agissent sur le même type de substrat, l’HS et les
protéoglycanes d'héparane sulfate (HSPG). Ces enzymes ont la même localisation cellulaire, à
la surface cellulaire et dans la matrice extracellulaire (Lamanna et al. 2008; Morimoto-Tomita
et al. 2002). Ainsi, il a été suggéré que QSulf-1 et Qulf-2 sont des enzymes redondantes ayant
une spécificité de substrat identique vis-à-vis du disaccharide trisulfaté [IdoA(2S) – GlcNS(6S)]
dans les domaines NS de l’HS (Ai et al. 2006). Cependant, QSulf1 et QSulf2 sont exprimées
dans des tissus embryonnaires distincts, et leur expression est régulée dynamiquement in vivo
57
(Dhoot et al. 2001). Chez les mammifères, Sulf-1 et Sulf-2 peuvent se comporter différemment
in vivo, comme l’ont montré des expériences d’invalidation génique (knock-out) simples ou
doubles pour les deux endosulfatases de souris mSulf1 et mSulf2 (Lamanna et al. 2006;
Nagamine et al. 2012). Les invalidations simples sont viables et les souris ne présentent pas
de défauts phénotypiques ou histologiques graves. De plus, l'analyse comparative des niveaux
de sulfatation de HS à partir des souris sauvages et d’invalidations simples a montré une
augmentation considérable de la 6-O-sulfatation lors de l'inactivation du Sulf-1 (mSulf1 - / -), et
en particulier une augmentation des teneurs en UA-GlcNAc(6S) (spécifique aux domaines de
transition NA/NS), de UA (2S)-GlcNS(6S) (spécifique aux domaines NS) et de UA-GlcNS (6S)
(présents dans les deux domaines précédents) par rapport à celles dans les souris sauvages.
Un effet différent est observé dans mSulf2 - / -, où l’on constate une augmentation de l'UA-
GlcNAc(6S) mais une diminution marquée des différents disaccharides UA(2S)GlcNS(6S) et UA-
GlcNS(6S). Il a ensuite été montré que l'expression de SULF1 est régulée, notamment par
surexpression/augmentation dans les cellules dépourvues de SULF2. A l’inverse, la perte de
SULF1 n'est pas compensée par une surexpression de SULF2. Les doubles mutants, mSulf-1 - /
- et mSulf-2 - / - souffrent quant à eux de multiples anomalies de développement, et d’une
mortalité néonatale élevée. Le niveau de 6-O-sulfate d’HS dans les double mutants est
significativement plus élevé que celui observé dans la mSulf1 - / -. L’ensemble de ces données
suggèrent une coopérativité fonctionnelle entre les deux enzymes mSulf-1 et mSulf-2. Bien
que les deux enzymes présentent un comportement coopératif et que l’expression accrue de
mSulf-1 puisse compenser la perte de mSulf-2, cette dernière est incapable de substituer
complètement l’activité de mSulf-1 (Lamanna et al. 2006). Ces résultats suggèrent que Sulf-1
et -2 contribueraient de façon différenciée à la formation de motifs de sulfatation spécifiques
pour chaque organe (Lamanna et al. 2006; Nagamine et al. 2012). D’autre part, la perte de
HSulfs influence les niveaux d'expression de sulfo-transférases N-, 2-O-, et 6-O-
sulfotransférase, des enzymes de la biosynthèse de HS (Tableau I.4) (Lamanna et al. 2008). Ces
données suggèrent que les HSulfs exercent une action non seulement post-biosynthétique,
mais également lors de la biosynthèse, puisque in vivo, leur niveau d’expression est capable
d’influencer la machinerie de biosynthèse d’HS, et donc également la sulfatation des HSPG
(Lamanna et al. 2008).
58
Tableau I.4 : Influence de l’invalidation de(s) Sulf(s) sur les niveaux d'expression de sulfo-transférases
impliquées dans la biosynthèse de HS. d’après (Lamanna et al. 2008)
Enzymes de la
biosynthèse de HS Sulf-1 - / - mSulf-2 - / - mSulf-1 - / - et mSulf-2 - / -
Hs2st1 = ↘ (2,5 fois) ↗ (1,5fois)
Hs6st1 = ↘ (1,5 fois) ↗ (2 fois)
Hs6st2 ↗ (2 fois) ↘ (1,5 fois) ↗ (3 fois)
Hs6st3 ↗ (2 fois) ↗ (1,3 fois) =
NDST Non déterminé
I.2.6 Fonctions physiologiques et pathologiques liées aux HSulfs
I.2.6.1 Fonctions physiologiques
Découvertes initialement pour leurs rôles dans le développement d’embryons de caille
[2001 par Dhoot et al.], les endosulfatases de types Sulf ont vu leurs fonctions physiologiques
d’abord attribuées à l’embryogénèse et à la morphogénèse. QSulf-1 est essentiel à l'activation
de facteurs de transcription myogéniques MyoD impliqués dans la spécification de
progéniteurs musculaires dans les somites embryonnaires. QSulf-1 favorise également la
signalisation dépendante de Wnt dans les myoblastes (Dhoot et al. 2001). La voie Wnt est
impliquée dans l’embryogénèse et la morphogénèse, en modulant l’expression de signaux
intercellulaires qui contrôlent la croissance, la migration et la programmation des cellules
souches vers la différenciation ou la prolifération. Bien que les HS soient nécessaires à l'activité
d’effecteurs protéiques de la voie Wnt, une interaction de très forte affinité avec le
polysaccharide empêcherait leur liaison au récepteur Frizzled (Fz) et donc bloquerait la
signalisation subséquente (Ai et al. 2003; Dhoot et al. 2001). Ce rôle des Sulfs dans le
développement embryonnaire a aussi été démontré chez les mammifères comme l’on montré
des expériences sur des souris déficientes en Sulf-1 et Sulf-2. Ces souris présentent une létalité
néonatale associée à de multiples défauts de développement, y compris des anomalies au
niveau du squelette ou des organes tels que le rein et le poumon, ou encore des défauts de
l'œsophage. Les conséquences phénotypiques graves de la double mutation indiquent que les
59
deux isoformes de Sulfs jouent un rôle essentiel pour le développement et la survie néonatale
des souris (Holst et al. 2007; Lum et al. 2007).
L’étude des fonctions physiologiques des Sulfs nous conduit à rappeler les rôles des
protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) et héparine, en particulier dans la liaison à des
ligands protéiques. L’interaction de ces ligands dépend du profil de sulfatation des chaînes de
GAGs et plus particulièrement du groupement 6-O-sulfate des domaines NS des HS, le substrat
naturel des Sulfs. Il a été établi que les fonctions des HSPG de la surface cellulaire et la matrice
extracellulaire résultent de leur capacité à interagir et à moduler l’activité de nombreuses
molécules effectrices de la signalisation et des composants de la matrice extracellulaire. Les
HSPG agissent comme des co-récepteurs pour de nombreuses molécules de signalisation
telles que les facteurs de croissance, les chimiokines, les morphogènes et les facteurs
angiogéniques (par exemple le facteur de croissance des fibroblastes FGF; le facteur de
croissance vasculaire endothélial VEGF; ou encore le facteur de croissance hépatocytaire HGF)
(X. Lin 2004; Morimoto-Tomita et al. 2005; Perrimon, N, and Bernfield 2000; Sarrazin et al.
2011). La liaison avec affinité de ces ligands à HSPG dépend principalement du profil de
sulfatation du GAG, en particulier au sein de séquences spécifiques de reconnaissance. Il a été
montré, in vitro, que l’élimination sélective des groupements 6-O-Sulfate de HP et de HS par
HSulf-2, inhibe l’interaction de FGF-1, de VEGF165 et de certaines chimiokines comme SDF-1
(Stromal Cell-Derived Factor-1) (Uchimura, Morimoto-Tomita, et al. 2006).
Dans le cas des facteurs de croissance des fibroblastes (FGF-1 et FGF-2), impliqués dans
l’angiogenèse, la cicatrisation, le développement embryonnaire et les cancers (Vivès, Seffouh,
and Lortat-Jacob 2014), il a été montré que le groupement 6-O-sulfate est nécessaire pour la
formation d'un complexe ternaire entre ce facteur de croissance, l’HS et son récepteur FGFR1.
Dans ce cas, le rôle de la 6-O-sulfatation est de permettre l’interaction de l’HS avec le FGFR,
mais pas avec les FGFs (Schlessinger et al. 2000). Ce complexe déclenche l’activation des voies
de signalisation. L’action des Sulfs réprime la signalisation des FGF (Vivès, Seffouh, and Lortat-
Jacob 2014): il a été démontré que la signalisation de FGF-2 est réduite de près de 60% dans
les fibroblastes de souris déficientes en 6-OST1 et 6-OST2 (Sugaya et al. 2008), alors que
l’inhibition de l’expression des Sulfs dans les fibroblastes embryonnaires de souris rétablit
l’activité mitogène de FGF-2 (Lamanna et al. 2006).
60
Le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), connu pour son implication dans
l’angiogenèse et les cancers (Vivès, Seffouh, and Lortat-Jacob 2014) est séquestré dans la
matrice extra-cellulaire. L’action de HSulf-2 libère le VEGF, ce qui augmente son activité par
l’augmentation de sa biodisponibilité pour les cellules endothéliales qui expriment les
récepteurs de signalisation appropriés (Uchimura, Morimoto-Tomita, et al. 2006).
Dans le cas des chimiokines, nombre d’entre elles interagit avec les HS au niveau du domaine
NS, ce qui suggère que l’action de Sulf peut changer considérablement leurs propriétés
d’interaction (Stringer et al. 2002). Dans ce contexte, Uchimura et al. (Uchimura, Morimoto-
Tomita, et al. 2006) ont démontré in vitro par test ELISA que Sulf-2 affecte la fixation des
chimiokines SDF-1 (CXCL12) (stromal cell-derived factor 1) et IL-8 (CX-CL8) (l'interleukine 8) à
l’HP. Par la suite, d’autres études ont confirmé ce résultat, en montrant que la liaison SDF-
1/HP est dépendante des groupements 6-O-sulfate et que l’IL-8 se fixe uniquement sur des
motifs disaccharidiques de type [IdoA(2S) – GlcNS(6S)], le motif substrat préférentiel des Sulfs
(Pichert et al. 2012; Spillmann, Witt, and Lindahl 1998; Zhang P. et al. 2012; Zhang S. et al.
2012). Ces données suggèrent que HSulf-2 exerce une activité régulatrice des interactions de
ligands protéiques avec l’HS et l’HP, conférant donc à HSulf-2 un rôle important de régulateur
de certaines voies de signalisation.
Récemment, Takemura et al. (Takemura and Nakato 2017) ont montré que DSulf-1 est
nécessaire pour l'arrêt de la division des cellules souches intestinales (ISC) au cours de la
régénération. La suppression des groupements 6-O-sulfate de l’HS chez la drosophile
déficiente en sulfotransférase 6-OST (knock down) a induit une réduction de l’activité de
division des ISC pendant la régénération intestinale. A l’inverse, la perte de Sulf-1 conduit à
une augmentation de l'activité mitotique des ISC, imputée à une régulation positive de la
signalisation mitogène incluant la voie de signalisation JAK-STAT (Janus kinase et transducteur
de signal et activateur de transcription) et celle de EGFR (epidermal growth factor receptor).
D’autre part, les ISC de mutants DSulf-1 n’arrêtent pas leur division à la fin du processus de
régénération intestinale. Ces résultats témoignent que la 6-O-sulfatation des HS joue un rôle
crucial dans l'activation et l'inactivation de la mitose des ISC, et que DSulf-1 est nécessaire
pour arrêter la division des ISC à la fin de la régénération (Takemura and Nakato 2017).
61
Les conséquences de l’action catalytique de Sulf-1/Sulf-2 s’observent à plusieurs niveaux
puisqu’elles modulent, non seulement les ligands des HSPGs et leur voie de signalisation, mais
participent également aux événements nucléaires liés au cycle cellulaire, comme le laisse
penser la détection récente de ces enzymes associées aux noyaux de cellules en prolifération
(Krishnakumar et al. 2018).
I.2.6.2 Pathologies liées aux HSulfs
Les enzymes HSulfs suscitent, depuis leur découverte il y a une quinzaine d’années, un
nombre considérable d’études biologiques cherchant à établir leur lien ou leur implication
dans des processus pathologiques. Parmi ceux-ci, les cancers sont souvent évoqués comme
pouvant être dus à une dérégulation des HSulfs. Plus récemment, d’autres pathologies comme
les diabètes et l’arthrose ont également été évoquées comme influencées par l’action des
HSulfs.
HSulf-1 et HSulf-2 dans les cancers
Chez l’homme, de nombreuses études ont montré l’altération des niveaux
d’expression de HSulf-1 et HSulf-2 dans plusieurs types de cancers (Hammond et al. 2014;
Khurana, Beleford, et al. 2013; Vivès, Seffouh, and Lortat-Jacob 2014).
***Il a été montré que HSulf-1 est régulée à la baisse dans les lignées de cellules
cancéreuses provenant de divers types de cancers humains, incluant ceux de l’ovaire, du sein,
de l'estomac, du rein et du foie (sous forme de carcinome hépatocellulaire ; CHC). L’expression
de l’enzyme est régulée par des mécanismes épigénétiques, impliquant une hyper-
méthylation de l’ADN dans la région promotrice de HSulf-1, et l’acétylation des histones, qui
constituent des marqueurs souvent associés à une répression transcriptionnelle (Chen et al.
2009; Monneret 2005; Staub et al. 2007). La surexpression de HSulf-1 dans les cellules
cancéreuses du sein inhibe la croissance tumorale et l'angiogenèse et augmente, in vivo,
l’apoptose des cellules cancéreuses. Ces effets reposent sur la régulation négative de l'activité
des facteurs pro-angiogéniques liant HP, y compris VEGF165 (Narita et al. 2006). De plus, la
surexpression de HSulf-1 dans les cellules cancéreuses hépatocellulaires, a montré un impact
négatif sur la prolifération et la migration et un effet positif sur l'apoptose dans le carcinome
hépatocellulaire. Ces effets reposent sur la régulation négative de la voie de signalisation stat3
(signal transducer and activator of transcription 3).En effet, HSulf-1 s'est avérée inhiber la
62
phosphorylation de stat3, bien connue pour réguler la prolifération, la motilité et l'apoptose
cellulaire. L'activité antiproliférative de HSulf-1 dans les cellules HepG2 du carcinome
hépatocellulaire, exprimant de manière stable HSulf-1, est également due à l'arrêt du cycle
cellulaire menant à l'apoptose (Liu et al. 2014). Récemment, une autre étude a confirmé le
rôle suppresseur de tumeur de HSulf-1 dans le cancer de l’ovaire, la perte de HSulf-1 induisant
une tumorigénicité accrue chez les souris nude in vivo, accompagnée d’une diminution de
l’expression de la protéine pro-apoptotique Bim après la perte de HSulf-1. Inversement, la
surexpression de HSulf-1 inhibe la croissance tumorale (He X1, Khurana A, Roy D, Kaufmann S
2014).
Toutes ces données convergent vers un rôle anti-tumorigène de HSulf-1. Toutefois, d’autres
études apportent des résultats contradictoires sur l’activité de HSulf-1, en présentant
notamment une surexpression de l’enzyme dans le cancer du sein (Castro et al. 2008;
Fernandez-Vega et al. 2013; Grigoriadis et al. 2006), de l’ovaire (Backen et al. 2007), des voies
digestives (Hur et al. 2012; Junnila et al. 2010), du pancréas (Abiatari et al. 2006; Li et al. 2005;
Nawroth et al. 2007) et dans la leucémie (Bret et al. 2011). La surexpression de HSulf-1, dans
le cancer du pancréas, est associée à un effet pro-tumoral (Abiatari et al. 2006; Nawroth et al.
2007). De plus, les cellules cancéreuses pancréatiques sur-exprimant HSulf-1 présentent un
caractère invasif avéré in vitro et forment des métastases in vivo (Abiatari et al. 2006). Une
étude récente a montré que la surexpression de Sulf-1/2 entraîne une augmentation de la
viabilité et de la prolifération, ainsi qu'une augmentation de la migration cellulaire dans les
cellules du cancer colorectal (Vicente et al. 2015).
À l’heure actuelle, malgré ces données contradictoires, on considère que Sulf-1 est une
protéine suppresseur de tumeur. À l’inverse, Sulf-2 est considérée comme impliquée dans la
progression du cancer: Sulf-2 est surexprimée dans les cellules cancéreuses et favorise la
tumorigenèse dans le cancer du poumon (Lemjabbar-Alaoui et al. 2010), le cancer du pancréas
(Nawroth et al. 2007), les carcinomes hépatocellulaires (J. Lai et al. 2008), le cancer colorectal
(Tao et al. 2017), et le cancer du sein (Morimoto-Tomita et al. 2005; Zhu, He, et al. 2016). En
revanche, Sulf-2 est un suppresseur de tumeurs du sein (Peterson et al. 2010), du myélome
(Dai et al. 2005), du cancer colorectal (Tao et al. 2017), gastrique (Hur et al. 2012) et du rein
(Kumagai et al. 2016).
63
***Morimoto-Tomita et al. (Morimoto-Tomita et al. 2005) ont signalé que le niveau
d'expression de Sulf-2 est huit fois plus élevé dans les carcinomes du sein, que dans les tissus
normaux. Une telle augmentation n’ayant pas été observée avec Sulf-1 dans le cancer du sein
humain et dans des modèles murins. Sulf-2 peut également être détectée dans certaines
lésions pré-cancéreuses et dans les tumeurs. L’hypothèse est que Sulf-2 est capable de libérer,
et de mobiliser, les facteurs angiogéniques liés à l’HS ou séquestrés dans la matrice
extracellulaire, ce qui conduit à une augmentation de l'angiogenèse tumorale (Morimoto-
Tomita et al. 2005). Toujours dans l’hypothèse selon laquelle HSulf-2 pourrait potentiellement
être un oncogène dans le cancer du sein, Khurana et al. ont trouvé que l'inhibition de
l'expression de HSulf-2 dans les cellules MCF10DCIS1, induit la mort cellulaire, en favorise
l'apoptose et par conséquent atténue la progression in situ du carcinome canalaire vers un
carcinome canalaire invasif in vivo (Khurana et al. 2012). Plus tard, Khurana et al. ont montré
que l’inhibiteur du proteasome (Bortezomib) réduit la taille de la tumeur, et que ceci est
accompagné d’une apoptose massive et d’une réduction du niveau d’expression de Sulf-2 in
vivo. Le Bortezomib, est également efficace pour réprimer l’expression de HSulf-2 dans un
certain nombre de lignées cellulaires de cancer humain (Khurana, Jung-Beom, et al. 2013). Les
mécanismes par lesquels ces composés inhibent HSulf-2 sont cependant inconnus et
nécessitent de plus amples investigations (Khurana, Jung-Beom, et al. 2013). Récemment, une
étude comparative de l’effet de la surexpression et de la diminution de la traduction de HSulf-
2, par l’utilisation d’un ARN interférant, a montré que l’expression de HSulf-2 favorise la
progression du cancer du sein en stimulant la prolifération des cellules cancéreuses, et en
accroissant l'invasion et la mobilité. La surexpression de Sulf-2 est liée à une augmentation de
la capacité de cicatrisation et d'adhésion cellulaire à la fois in vitro et in vivo. HSulf-2 inhibe
également l'apoptose des cellules cancéreuses, favorise in vivo la tumorigénicité des cellules
cancéreuses du sein et stimule l'expression des gènes liés aux tumeurs dans le cancer du sein
comme celui du VEGF-D. VEGF-D est un ligand des récepteurs du facteur de croissance de
l'endothélium vasculaire (VEGFRs) qui peut activer les voies de l'angiogenèse, de la
lymphangiogenèse, de la croissance et de la migration des cellules endothéliales. À l’inverse,
l’inhibition de la traduction de HSulf-2 diminue significativement la prolifération cellulaire,
1 Cellules qui expriment HSulf-2 et forment in situ un carcinome canalaire de type comédon, progressant ensuite vers le
carcinome canalaire invasif, lorsqu'elles sont transplantées chez des souris immunodéficientes
64
l'invasion, la mobilité et l'adhésion, en augmentant l'apoptose cellulaire, et en réprimant
l’expression de VEGF-D dans les cellules cancéreuses mammaires (Zhu, He, et al. 2016; Zhu,
Qi, et al. 2016). Sur la base de ces études et des niveaux d’expression élevés de Sulf-2 dans
plusieurs cancers, Sulf-2 est considérée comme un agent cancérigène dans plusieurs types de
cancer et joue un rôle important dans la progression tumorale.
Toutefois, comme pour HSulf-1, la littérature rapporte des résultats contradictoires. Ainsi,
Peterson et al. ont montré qu’une expression stable de Sulf-2 dans les cellules du cancer du
sein inhibe la signalisation due aux FGFs, diminue la prolifération, l'invasion et la métastase
des cellules du cancer du sein in vitro. Ces résultats ont ensuite été confirmés par la diminution
de la croissance tumorale in vivo. En revanche, l'administration intra-tumorale de Sulf-2
recombinante n’inhibe pas davantage la croissance tumorale in vivo, suggérant que l’effet
thérapeutique de Sulf-2 nécessite un niveau d’expression stable (Peterson et al. 2010). Une
autre étude réalisée in vivo, a montré que HSulf-1 et HSulf- 2 sont de puissants inhibiteurs de
la croissance tumorale du myelome par la diminution de la signalisation due au FGF-2. Les
Sulfs peuvent réguler la croissance cellulaire dans un microenvironnement tumoral par un
nouveau mécanisme faisant intervenir HS comme co-récepteur des facteurs de croissance.
Selon ce mécanisme HSulf inhibe les signalisations déclenchées par ces facteurs en altérant le
niveaux de 6-O-S des HS (Dai et al. 2005).
L’ensemble de ces données, apparaissant comme pour Sulf-1 parfois contradictoires, indique
un rôle de Sulf-2 dans la progression du cancer, mais les mécanismes sans doute très
complexes, demeurent encore mal compris. L'implication de Sulf-2 dans la croissance
tumorale varie selon le type de cancer, la lignée cellulaire, le stade et les niveaux d'expression
de Sulf-2. Néanmoins, plusieurs travaux scientifiques proposent l’utilisation de Sulf-2 comme
un biomarqueur pour le diagnostic de cancers. En effet le taux de HSulf-2 est très élevé dans
le sérum des patients atteints de cirrhose, comparé aux individus en bonne santé, suggérant
son utilisation comme outil de diagnostic (biomarqueur sérologique) (Singer et al. 2015). Les
taux sanguins de HSulf-2 peuvent jouer un rôle important également dans le diagnostic et
pronostic potentiel dans le cancer du poumon (Natalie S. Lui et al. 2016).
Les Sulfs peuvent être impliquées dans des pathologies autres que le cancer. Par
exemple, les Sulfs étant exprimées dans le cartilage articulaire, il a été montré que les souris
knock-out pour Sulf-1 développent une arthrose sévère du genou (S. Otsuki et al. 2010). C’est
65
pourquoi, récemment, pour agir sur cette pathologie, Otsuki S et al. (Shuhei Otsuki et al. 2017)
ont montré que l'injection intra-articulaire de Sulf-1 empêche la dégénérescence du cartilage
dans un modèle d'arthrose chez la souris. Cet effet serait dû à une augmentation de
l'expression du collagène de type II et à la diminution de l'expression de la métalloprotéinase
matricielle (MMP-13, collagénase) d'une manière dépendante de la concentration de Sulf-1
injectée. L'injection de Sulf-1 dans le genou ostéo-arthritique de souris a atténué
significativement la perte de GAGs et l'expression de MMP-13. Cet effet peut s'expliquer par
l’atténuation de la voie de signalisation Erk1/2 (Extracellular signal-regulated kinases, des
kinases, qui phosphorylent des protéines effectrices afin de les activer) impliquant FGF-2, sous
l’effet de l’action de HSulf-1. Ces découvertes indiquent que Sulf-1 prévient la dégénérescence
du cartilage, en supprimant la MMP-13 via un effet sur la signalisation induite par FGF2/Erk1/2
(Shuhei Otsuki et al. 2017).
Le diabète pourrait également faire intervenir les HSulf, et particulièrement HSulf-2. Ainsi, la
surexpression hépatique de Sulf-2 a été relevée dans des modèles murins de diabète de type
2 et chez des patients diabétiques de type 2 (DT2) et/ou obèses (H.C. Hassing et al. 2012; H
Carlijne Hassing et al. 2015). Il a été proposé que, chez l’homme, la surexpression de HSulf-2
interfère dans la clairance postprandiale des lipoprotéines riches en triglycérides (H Carlijne
Hassing et al. 2015). En effet, il a été observé que l'inhibition de l'enzyme réduit
l'hypertriglycéridémie post-prandiale et rétablit la capacité des hépatocytes à lier les VLDL, ce
qui fait de Sulf-2 une cible thérapeutique particulièrement attrayante pour améliorer la
dyslipidémie athérogène dans le DT2 et l’obésité (H.C. Hassing et al. 2012).
Récemment, des études ont sugéré l’implication de HSulf-2 dans la maladie d’Alzheimer via
les domaines hautement sulfatés de HS. Cette maladie neurodégénérative progressive est
caractérisée par la présence extracellulaire des plaques amyloïdes formées à partir de
l’accumulation du peptide β-amyloïde (Aβ) dans le milieu extracellulaire des zones du cerveau
responsables des fonctions cognitive et mémorielle. Il a été montré que les domaines
hautement sulfatés au sein de HS sont cruciaux pour l'agrégation de Aβ in vitro, et ces mêmes
domaines sont dégradés par Sulf-1 et Sulf-2 in vivo (Hosono-Fukao et al. 2012). Ainsi, il a été
montré que les domaines HS tri-sulfatés sont accumulés dans des plaques amyloïdes
cérébrales de modèles de souris transgéniques et des patients atteints de d'Alzheimer
(Hosono-Fukao et al. 2012). Il a été proposé que dans la maladie d’Alzheimer ces domaines
66
hautement sulfatés, comprenant plus particulièrement le disaccharide tri-sulfaté [IdoA(2S) –
GlcNS(6S) substrat de Sulf, accélèrent la formation de fibrilles Aβ et protègent la fibrille contre
la phagocytose (Hosono-Fukao et al. 2012). Récemment, Reuillon et al. (Roberts, Kang, and
Roberts 2017) ont montré une réduction significative du niveau d'expression de HSulf-2 au
niveau de la corne d’Ammon de l’hippocampe, de la matière grise de gyrus para-
hippocampique et de la matière grise du lobe frontal chez les patients atteints d'Alzheimer
par rapport aux témoins normaux. Aucune variation d’expression de HSulf-1 n’a été observée
dans l'hippocampe ou le lobe frontal des sujet atteints d'Alzheimer par rapport aux témoins
(Roberts, Kang, and Roberts 2017). Ces résultats sont cohérents avec les données de Hosono-
Fukao et al. (Hosono-Fukao et al. 2012) qui relèvent une augmentation du nombre de
domaines HS fortement sulfatés susceptibles d'être digérés par SULF1 et SULF2 dans le
cerveau de modèle de souris transgéniques, ainsi que dans le cerveau humain atteint
l'Alzheimer.
Dans les trois cas – arthrose, diabète et Alzheimer – l’implication des HSulfs passe par leur
action sur les GAGs et la modulation de l’interaction avec leurs ligands protéiques qui, eux,
sont directement impliqués dans la pathologie.
67
I.2.7 Inhibiteurs des HSulfs
La surexpression de HSulf-2 dans plusieurs tumeurs fait de cette enzyme une cible
thérapeutique potentielle. Plusieurs inhibiteurs ont été testés et développés parmi lesquels:
- Des inhibiteurs de protéasome (MG132, lactacystine et bortézomib) : ces inhibiteurs
de la machinerie protéosomale sont également efficaces pour réprimer l’expression d’HSulf-
2 dans certains cancers humains. Le VELCADE® (bortézomib) réduit considérablement la taille
des tumeurs mammaires obtenues après greffe in vivo (Khurana, Beleford, et al. 2013).
Cependant, les mécanismes reliant l’inhibition du protéasome à la répression de HSulf-2 et à
l’action anti-tumorale sont inconnus et nécessitent de plus amples investigations.
- Des inhibiteurs de la méthylation de l'ADN, tels que la Zebularine, ont montré, in
vitro et in vivo, des activités anti-tumorales prometteuses contre certaines lignées cellulaires
cancéreuses (J. P. Lai et al. 2008), sur la base des études montrant que la répression de HSulf-
1 dans le cancer de l'ovaire était liée à une hyperméthylation de l’ADN dans la région
promotrice de HSulf-1. Ainsi le traitement avec un agent de déméthylation (5-aza-2'-
deoxycytidine) a conduit à la réactivation de l'expression de HSulf-1 dans les lignées cellulaires
du cancer de l'ovaire négatif (Staub et al. 2007).
-Un dérivé phénylsulfonyl (nommé OKN007 et anciennement NXY-059) est une petite
molécule (Figure I.14), déjà utilisée dans un essai clinique pour le traitement des accidents
vasculaires cérébraux ischémiques, et qui s’est aussi révélée comme un inhibiteur catalytique
de HSulf-2 (Floyd et al. 2009, 2011). Ce composé possède également des propriétés
inhibitrices de la croissance tumorale du carcinome hépatocellulaire. Il a été montré que
l'activité antitumorale de OKN-007 est plus prononcée dans les cellules exprimant HSulf-2.
Ainsi, l'effet anti-tumoral de OKN-007 s’exerce in vitro sur les cellules cancéreuses Huh7 qui
expriment un niveau élevé de HSulf-2, cet effet est supprimé chez ces cellules dont
l’expression de HSulf-2 est réprimée. Il semble donc que l'expression de HSulf-2 est requise
pour les effets de OKN-007 à la fois in vitro et in vivo (Zheng, Gai, and Roberts 2013).
68
Figure I.14: Structure chimique de OKN-007 (2,4-disulfonylphényl- tert- butylnitrone) d’après
(Floyd et al. 2011).
-Des inhibiteurs mimant les HS (ou HS-mimetics) ont été développés, en vue d'obtenir
une molécule plus spécifique et de plus haute affinité. L’oligosaccharide sulfaté PI-88, un
phosphomannopentaose polysulfaté (Figure I.15), initialement développé comme agent anti-
héparanase, présente également une activité inhibitrice des Sulfs (Hossain et al. 2009). PI-88
exerce ses effets anti-métastatiques en inhibant l'héparanase, et donc le clivage de HS dans la
matrice extracellulaire, ce qui bloque la libération de facteurs de croissances angiogéniques.
PI-88 se lie également de manière compétitive à des facteurs de croissance, tels que FGF-1 et
FGF-2 et VEGF, pour exercer un effet anti-angiogénétique (Kudchadkar, Gonzalez, and Lewis
2008). Les essais cliniques visant à apprécier l’efficacité du PI-88 pour le traitement de certains
cancers ont cependant signalé des effets secondaires graves, dont un risque de
thrombocytopénie immunitaire induite, en raison de son large éventail d'activités
(Kudchadkar, Gonzalez, and Lewis 2008).
69
Figure I.15: Structure chimique de PI-88 (Raman and Kuberan 2010)
Mathias et al. ont conçu des analogues de la glucosamine-6-sulfamate (Figure I.16) inhibant
de manière sélective les HSulfs (Mathias et al. 2012). Toutefois, les auteurs soulignent qu’il
serait intéressant d’inclure des épitopes saccharidiques spécifiques au sein de ces mimétiques
d’HS, afin de cibler sélectivement certaines voies de signalisation. Enfin, le développement
d'anticorps monoclonaux dirigés contre HSulf-2 pourrait conduire à des thérapies à base
d'anticorps (Natalie Shaubie Lui et al. 2012).
Figure I.16: Structure du GlcN-6-sulfamate, et de ses quatre analogues inhibant HSulf-1 et
HSulf-2 (Mathias et al. 2012).
Récemment, Reuillon et al. (Reuillon et al. 2016) ont mis au point de nouveaux inhibiteurs de
Sulf-2 sur la base de biphenyl sulfamate et de biphenyl ether sulfamate (Figure I.17). L’étude
de ces inhibiteurs sur HSulf-2, ARSA et ARSB vis-à-vis de la désulfatation in vitro du 4-MUS, a
montré des valeurs de concentration d’inhibition (IC50) de l’ordre de la centaine à plusieurs
centaines de micromolaire. Ces essais ont révélé que le groupement trichloroéthylsulfamate
70
se comporte comme un nouveau pharmacophore pour l'inhibition de HSulf-2. Néanmoins, ces
études doivent être poursuivies pour déterminer le mécanisme conduisant à l'inhibition de
HSulf-2 par les dérivés trichloroéthylsulfamates.
Figure I.17: Structure du trichloroéthylsulfamate, un inhibiteur de Sulf-2 (Reuillon et al. 2016).
En raison des conséquences multiples de l’action catalytique de Sulf-1/Sulf-2 au cours du
développement et des cancers, il est primordial de concevoir des inhibiteurs hautement
sélectifs soit de HSulf-1, soit de HSulf-2.
Malgré le très grand nombre d’études soulignant l’implication des HSulfs dans différents
processus pathologiques, la quantité de données disponibles dans la littérature consacrée à
la recherche d’inhibiteurs spécifiques reste comparativement faible. Les inhibiteurs décrits
jusqu’ici sont peu nombreux, non ciblés, moyennement puissants et leur(s) mécanisme(s)
d’inhibition sont mal compris. Ils se divisent en deux catégories : a) ceux agissant
spécifiquement sur les HSulfs ou b) ceux agissant indirectement sur les HSulfs, en ciblant le
niveau d’expression de ces enzymes. Les inhibiteurs qui ciblent directement les enzymes
HSulfs, visent soit le site actif (inhibiteur catalytique, analogue de substrat, sulfamate et
trichloroéthylsulfamate) soit des épitopes protéiques (anticorps). Il n’existe aucun inhibiteur
visant un des traits spécifiques des HSulfs, le domaine HD. Les freins dans le développement
d’inhibiteurs sont entre autres l’absence de données structurales moléculaires précises du site
actif (donc pas de pharmacophore) et de la protéine entière.
71
Chapitre II
Caractérisation protéomique, structurale et biochimique de
HSulf-2
72
II.1 Expression, purification et activité enzymatique de HSulf-2
II.1.1 Expression et purification
L’enzyme HSulf-2 recombinante utilisée dans l’ensemble des expériences de cette
étude a été produite par l’équipe du Dr. Romain VIVES au Laboratoire Structure et Activité des
Glycosaminoglycanes (Institut de Biologie Structurale, Grenoble) avec lequel nous
collaborons. Le gène codant pour HSulf-2 est cloné dans le vecteur [PcDNA3.1 (-)] d’expression
en cellules de mammifère HEK293. L’enzyme a été purifiée dans ce laboratoire par la Dr. Amal
SEFFOUH puis Mme Rana EL MASRI, selon un protocole comptant deux étapes successives de
chromatographie, une chromatographie échangeuse d’ions puis une chromatographie
d’exclusion stérique (SEC). Nous présentons ici succinctement une partie de la méthodologie
utilisée par ce laboratoire (Thèse d’Amal Seffouh, Caractérisation Biochimique et
fonctionnelle de l’enzyme HSulf, université Grenoble Alpes, 2016). HSulf-2 recombinante
présente une étiquette SNAP en position N-terminale de la chaîne longue et une étiquette
6xHis en position C-terminale de la chaîne courte, facilitant ainsi à la fois sa détection et sa
purification. La protéine est libérée de ces deux étiquettes par un clivage par la protéase TEV.
Le point isoélectrique (pI) théorique de la protéine étant de 9,28, le surnageant de culture
contenant HSulf-2 est d’abord chargé sur une colonne échangeuse de cations (phase
stationnaire Sépharose, 1,2 mL, GE Healthcare), préalablement équilibrée dans le tampon 50
mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl. Un gradient variant de 0,1 à 1 M
NaCl (0,5 mL/min pendant 70 min) est utilisé pour l’élution de la protéine, qui est détectée
sous un pic majoritaire à ~0,42 M NaCl (Figure II.1A haut). Des fractions de 0,5 mL sont
recueillies, analysées en conditions dénaturantes et réductrices sur gel SDS-PAGE à 10 %,
coloré au bleu de Coomassie (Figure II.1A bas). Les fractions contenant HSulf-2 (17-33) sont
réunies, concentrées puis traitées par la protéase TEV (une nuit à 4°C sous faible agitation).
L’extrait protéique qui en résulte est ensuite injecté sur une colonne d'exclusion stérique
Superdex 200 (20 ml, GE Healthcare; Figure II.1B haut). Des fractions de 0,5 mL sont recueillies,
analysées en conditions dénaturantes et réductrices sur gel SDS-PAGE à 10 %, coloré au bleu
de Coomassie (Figure II.1B bas). HSulf-2 est éluée majoritairement dans les fractions 13 à 15
correspondant au Pic 1 (8 à 10 mL), ainsi que minoritairement dans les fractions 22 et 23 (Pic
2, 12,5 à 13,5 mL). Les fractions correspondant au pic 2 présentent des signes de dégradation
(Figure II.1B bas) et ne sont donc pas conservées. Les fractions correspondant au pic 1 sont
73
réunies puis concentrées, dosées par mesure de l’absorbance à 280 nm (NanoDrop, Thermo
Scientific, ε= 166660 L.mol−1.cm−1) et congelées à -80 °C. La Figure II.1C présente le gel SDS-
PAGE à 10% des fractions 13 à 15 réunies. L’enzyme HSulf-2 étudiée tout au long des travaux
décrits ci-après correspond aux fractions rassemblées du Pic 1. La concentration des
différentes préparations d’HSulf-2 utilisées varie de 0,57 à 2,48 mg/mL dans le tampon Tris-
HCl 50 mM, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7,5 (avec ou sans ajout d’anti-
protéases).
Figure II.1: Purification de HSulf-2 – (A haut) Chromatogramme correspondant à l’étape de purification sur
colonne échangeuse de cations (SCX). En bleu: absorbance à 280 nm; en rouge: les fractions de 0,5 mL; en vert :
gradient de NaCl. (A bas) Gel SDS-PAGE (10%), coloré au bleu de Coomassie, de certaines des fractions SCX de
0,5 mL. (B haut) Chromatogramme correspondant à l’étape de purification sur colonne d’exclusion stérique (SEC)
(Superdex 200). En bleu: absorbance à 280 nm ; en rouge : fractions de 0,5 mL. (B bas) Gel SDS-PAGE (10%) de
certaines des fractions SEC, coloration par bleu de Coomassie. (C) Gel SDS-PAGE (10%), des fractions SEC 13 à 15
réunies Pic 1 (P1), coloration par bleu de Coomassie [Thèse d’Amal Seffouh, Caractérisation Biochimique et
fonctionnelle de l’enzyme HSulf, université Grenoble Alpes, 2016].
74
II.1.2 Activités enzymatiques de HSulf-2 purifiée
L’activité aryl-sulfatase de HSulf-2 recombinante purifiée est mise en évidence grâce
au test de spectrofluorescence utilisant le substrat 4-methylumbelliferyl sulfate (4-MUS).
L’enzyme est incubée 3 heures à 37°C avec le substrat non-fluorescent 4-MUS qui est converti
en produit fluorescent (4-MU) par l’activité aryl-sulfatase de HSulf-2 (Figure II.2A) (Uchimura,
Kenji, et al. 2006). L’activité endo-6-O-sulfatase de HSulf-2 est évaluée en analysant la
composition disaccharidique de l’héparine (HP) prétraitée par HSulf-2 pendant 48h à 37°C.
Cette analyse effectuée après dépolymérisation enzymatique exhaustive de l’héparine au
moyen d’un cocktail d’enzymes (héparinases I, II et III) suivie de l’analyse des produits de
digestion par chromatographie d’exclusion stérique (Superdex Peptide 10/300 GL) Figure II.
2B bas. La composition disaccharidique de l’HP non traitée par HSulf-2 est également analysée
et utilisée comme référence Figure II.2B haut. L’analyse des chaînes de HP digérées par HSulf-
2 montre une diminution de la quantité de disaccharide tri-sulfaté [IdoA(2S) – GlcNS(6S)] au
profit de l’augmentation d’un disaccharide disulfaté (Figure II.2B), confirmant ainsi l’action de
l’endo-6-O-sulfatase sur HP.
Figure II.2: Activité enzymatique de HSulf-2 purifiée – A) Fluorescence d’une solution de 4-MUS (20 mM dans
50 mM Tris pH 7.5, 20 mM MgCl2), et de la même solution après ajout de HSulf-2 recombinante. B)
Chromatogrammes d’exclusion stérique correspondant à la composition disaccharidique de Hp après
dépolymérisation exhaustive : Haut : non traitée ; Bas : prétraitée par HSulf-2. [Thèse d’Amal Seffouh,
Caractérisation Biochimique et fonctionnelle de l’enzyme HSulf, université Grenoble Alpes, 2016].
75
L’enzyme HSulf-2 recombinante utilisée pour nos travaux est fonctionnelle comme
l’indiquent ces tests d’activité enzymatique avec le substrat synthétique 4-MUS et avec le
substrat polysaccharide sulfaté héparine, analogue au substrat naturel héparane sulfate
Figure II.2. De plus, le séquençage N-terminal d’Edman de HSulf-2 en solution a permis
d’identifier clairement deux séquences peptidiques correspondant aux deux extrémités N-
terminales de la chaîne longue (à partir du résidu Phe1) et de la chaîne courte (à partir du
résidu Sérine 515) de HSulf-2. Cette dernière information confirme la position du site de
clivage par la furine, identifié précédemment dans la littérature (Tang and Rosen 2009).
II.2 Détection et caractérisation d’HSulf-2
La masse moléculaire théorique de la pro-protéine HSulf-2 (HSulf-2 sans le peptide
signal) est de 98151,85 Da, le clivage protéolytique par la furine de HSulf-2 engendrant deux
chaînes à 59338,86 Da (chaîne longue) et à 38831 Da (chaîne courte) Il s’agit des masses
théoriques déduites de la séquence en acides aminés de HSulf-2 (Figure I.7). HSulf-2 est
susceptible de former au moins un pont disulfure pour lier les deux chaînes, longue et courte
afin de former un hétéro-dimère.
HSulf-2 recombinante est analysée par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, c’est-à-
dire en présence de SDS, d’un agent de réduction (le β-mercaptoéthanol) et après chauffage
à 95°C. Ces traitements ont pour objectif de dissocier la chaîne longue et la chaîne courte de
HSulf-2, et de les séparer sur gel pour déterminer leur masse moléculaire apparente. La
détection sur gel SDS-PAGE est effectuée dans un premier temps par une coloration au bleu
de Coomassie Figure II.3A. HSulf-2 en absence ou en présence d’anti-protéases présente le
même profil électrophorétique, avec une seule bande majoritaire et clairement visible à une
masse apparente d’environ 79 kDa, qui peut correspondre à la chaîne longue. D’autres bandes
plus ou moins diffuses sont également observées sur le gel SDS-PAGE. En conditions
dénaturantes, deux bandes étaient attendues: une première à environ 59 kDa correspondant
à la chaîne longue et une seconde à environ 39 kDa correspondant à la chaîne courte selon la
masse théorique de HSulf-2 déduite de sa séquence en acides aminés. L’absence de détection
d’une seconde bande de HSulf-2 n’est pas imputable à la sensibilité de détection par le bleu
de Coomassie, puisque la coloration plus sensible au nitrate d'argent ne permet pas non plus
de mettre en évidence une bande supplémentaire (Figure II.3B).
76
Figure II.3: Analyse SDS-PAGE de HSulf-2 - Gel polyacrylamide à 12%, 3 µg de HSulf-2 déposés en absence (-) ou
en présence (+) d’anti-protéase par puits, dans un tampon de dénaturation Laemmli en présence d’un agent de
réduction (β-mercaptoéthanol). Révélation par une coloration par A) Bleu de Coomassie ou B) Nitrate d’argent.
A ce stade, plusieurs questions se posent: quelle est la nature de la bande à 79 kDa,
correspond-elle à l’une des chaînes de HSulf-2, et si oui laquelle des deux, chaîne longue ou
chaîne courte? Dans l’hypothèse où la bande à 79 kDa serait la chaîne longue, sa masse
moléculaire observée serait cependant bien supérieure à la masse théorique attendue de 59
kDa. Des modifications post-traductionnelles (MPTs) pourraient expliquer cette différence
puisque la chaîne longue possède 7 des 12 sites potentiels de N-glycosylation de HSulf-2. Cette
hypothèse laisse en suspens l’absence de détection de la chaîne courte. Pour l’expliquer, deux
hypothèses au moins sont possibles: 1) chaîne courte et chaîne longue seraient co-localisée
sur le gel au niveau de la bande à 79 kDa, étant donné que cette bande est assez large; 2) pour
une raison inconnue, la chaîne courte serait indétectable par les deux colorations utilisées. A
ce stade, nous avons supposé que certaines MPT(s) pouvaient empêcher la liaison des
molécules de colorant à la protéine, rendant impossible la révélation de la chaîne courte.
Pour répondre à ces interrogations, nous avons entrepris dans un premier temps de
déterminer l’identité de la bande à 79 kDa. Pour ce faire, cette bande a été digérée en gel par
la trypsine. Les peptides issus de la digestion ont été ensuite analysés par nanoLC-ESI-MS/MS
77
sur un instrument LTQ-Orbitrap™ XL (Thermo- Finnigan). La couverture de séquence obtenue
à partir de ces analyses est présentée Figure II.4.
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Figure II.4: Couverture de séquence de HSulf-2 obtenue après analyse par nanoLC-ESI-MS/MS de la bande à 79
kDa du gel SDS-PAGE de la Figure II. 3A. Les peptides identifiés expérimentalement (en rouge) appartiennent
majoritairement à la chaîne longue de HSulf-2.
C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation; RS: site de clivage par la furine.
La majorité des peptides détectés (88 % des peptides identifiés) issus de la bande à 79
kDa appartient à la chaîne longue (résidus 1Phe à 514Arg) de HSulf-2. Ils conduisent à une
couverture de séquence expérimentale de 46% de la chaîne longue. La raison de cette
couverture de séquence moyennement élevée peut être due à la présence de MPTs, telles
que des glycosylations, qui limiteraient l’accès de la trypsine à certains sites de clivage, et donc
qui empêcherait la formation des peptides. En outre, les glycopeptides éventuellement
formés ne sont pas facilement identifiés dans nos conditions d’analyse nanoLC-ESI-MS/MS car
on ignore la composition des chaînes de glycanes de ces glycopeptides. De manière
surprenante, une faible proportion des peptides détectés (12 %, soit trois peptides) est
identifiée comme appartenant à la chaîne courte. Ils conduisent à une couverture de séquence
de 10% de cette même chaîne. En raison de la couverture de séquence plus élevée de la chaîne
longue, nous pouvons établir que la bande à 79 kDa sur le gel SDS-PAGE Figure II.3A est la
chaîne longue et exclure une co-localisation avec la chaîne courte. La masse apparente
78
supérieure à la masse théorique de la chaîne longue (59 kDa), nous conduit à rechercher la
présence de MPT(s) de type N-glycanes.
II.3 Recherche de N-glycosylation dans HSulf-2
HSulf-2 possède 12 sites potentiels de N-glycosylation au sein de séquences consensus
de type Asn-X- Ser/Thr, pour lesquelles X n’est jamais un résidu proline, ou phénylalanine, ou
tryptophane. Ces douze sites potentiels de N-glycosylation sont répartis en sept sites au
niveau de la chaîne longue et cinq sites au niveau de la chaîne courte. Pour vérifier la possible
N-glycosylation au niveau des deux chaînes, HSulf-2 est traitée en conditions dénaturantes en
solution par la N-glycosydase PNGase F. La PNGase F catalyse la coupure de la liaison N-
glycopeptidique entre Asn et le premier sucre GlcNAc de la chaîne glycosidique. L’analyse par
SDS-PAGE en conditions dénaturantes de HSulf-2 traitée par la PNGase F montre un
déplacement de la bande de la chaîne longue de 79 kDa à 65 kDa (Figure II.5). Ce résultat
indique une N-glycosylation significative de la chaîne longue en accord avec les sept sites
potentiels de N-glycosylation sur les résidus Asn 41, 88, 108, 125, 147, 174, et 217.
Figure II.5 : N-déglycosylation de HSulf-2. Analyse par SDS-PAGE de HSulf-2 en conditions dénaturantes.
Séparation de 3 µg de HSulf-2 non traité (piste 1) ou traité (piste 2) par la PNGase F (piste 3), révélation par
coloration au Bleu de Coomassie.
Les peptides issus de la digestion en gel par la trypsine de la bande à 65 kDa ont été
analysés par nanoLC-ESI-MS/MS. 87 % des peptides identifiés appartiennent à la chaîne
longue de HSulf-2. La bande à 65 kDa est donc la chaîne longue de HSulf-2 dépourvue de(s) N-
glycosylation(s). Ce résultat confirme également la limitation de la couverture de séquence de
la chaîne native induite par sa N-glycosylation. En effet, on constate une augmentation de la
79
couverture de séquence de la chaîne longue de 46% avant N-déglycosylation à 66% après N-
déglycosylation, ce qui correspond respectivement à 71% et 100 % de couvertures de
séquence calculées sur la base de la couverture de séquence théorique de la chaîne longue
après digestion par la trypsine (Figure II.6).
La différence de 14 kDa entre la bande à 79 kDa (chaîne longue N-glycosylée) et la
bande à 65 kDa (chaîne longue N-déglycosylée), représente la contribution de N-glycanes à la
masse apparente de la chaîne longue. La masse apparente d’environ 65 kDa de la chaîne
longue N-déglycosylée est très proche de la masse théorique de la chaîne longue de 59 kDa.
A noter qu’une différence de masse est également observée entre la masse théorique de 36
kDa de la PNGase F et sa détection à 39 kDa sur le gel.
Figure II.6 : N-déglycosylation de HSulf-2. Histogrammes des couvertures de séquence de HSulf-2 avant et après
la N-déglycosylation, les axes (X,Y) pour ( chaîne de HSulf-2, pourcentage %): A) pourcentages de couverture de
la séquence expérimentale de HSulf-2 pour chaque chaîne; B) pourcentages de couverture de séquence calculés
sur la base de la couverture de séquence théorique produite par la trypsine pour chaque chaîne.
Par comparaison des couvertures de séquence avant et après la N-déglycosylation, nous avons
tenté de localiser les sites N-glycosylés au niveau de la chaîne longue Figure II.7. Les sites
potentiels de N-glycosylation au niveau des résidus Asn 88, 108, 147, 174, et 217 ne sont
détectés au sein des peptides trypsiques qu’après l’action de la PNGase F. Ces sites potentiels
71
14
100
22
0
20
40
60
80
100
120
Peptides appartenant à la chaîne longue de
HSulf-2
Peptides appartenant à la chaîne courte de
HSulf-2
HSulf-2 (bande à 79kDa)
HSulf-2+PNGase F (bande à 65kDa)
46
10
66
15
0
10
20
30
40
50
60
70
Peptides appartenant à la chaîne longue de
HSulf-2
Peptides appartenant à la chaîne courte de
HSulf-2
HSulf-2 (bande à 79kDa)
HSulf-2+PNGase F ( bande à 65kDa)
B
80
de N-glycosylation ont donc une forte probabilité d’être réellement glycosylés. En revanche,
le résidu Asn 125 en position 6 au sein du peptide 120YLNEYNGSYVPPGWK134, détecté sans
traitement par la PNGase F n’est a contrario pas glycosylé. Enfin, le résidu Asn 41 n’appartient
pas à un peptide couvert ni avant ni après le traitement par la PNGase F, on ne peut donc rien
conclure.
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
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51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
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201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
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251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
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301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
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401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
Figure II.7: Couverture de séquence de la chaîne longue après N-déglycosylation de HSulf-2. Digestion trypsique
en gel et analyse nanoLC-ESI-MS/MS. Comparaison des peptides identifiés expérimentalement (en rouge) avant
(ligne supérieure, bande à 79 kDa) ou après (ligne inférieure, bande à 65 kDa) la N-déglycosylation par la PNGase
F.
C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation; RS: site de clivage par la furine.
Il est à noter qu’une digestion théorique par la trypsine indique la possibilité d’obtenir un
peptide de 23 acides aminés 19PNIILVLTDDQDVELGSMQVMNK52 contenant Asn 41 (masse
81
théorique monoisotopique : 2571,282 g/mol). Ce peptide n’a cependant pas été détecté
expérimentalement. Il est possible qu’une dégradation N-terminale de la chaîne longue ait
lieu durant la conservation; cependant, le séquençage d’Edman confirme la présence de la
séquence N-terminale de la chaîne longue. Il faut noter que la séquence N-terminale de la
chaîne longue, comprenant ce peptide de 23 acides aminés, est riche en sites de coupure par
la trypsine (principalement arginine), ce qui peut conduire à la production de peptides de
masse inférieure à 500 g/mol, qui ne sont pas fragmentés et détectés lors de l’analyse nanoLC-
ESI-MS/MS (fragmentation MS/MS uniquement des ions dont le rapport masse charge est
supérieur à 250). Pour vérifier la présence de la séquence N-terminale de la chaîne longue,
des digestions en solution avec d’autres protéases sont nécessaires.
L’élimination des chaînes N-glycanes par la PNGase F n'a pas amélioré la détection de la chaîne
courte sur le gel SDS-PAGE avec une coloration au Bleu de Coomassie. De plus, la couverture
de séquence expérimentale de la chaîne courte au niveau de la bande à 65 kDa n’est que de
15% (représentant 22% de couverture de séquence théorique de la chaîne courte après
digestion par la trypsine), ce qui confirme encore une fois que les bandes visibles sur le gel
SDS-PAGE avant et après la N-déglycosylation correspondent à la chaîne longue de HSulf-2. La
nature des chaînes de N-glycanes de la chaîne longue reste, au moment de la rédaction de ce
document, à déterminer.
L’analyse SDS-PAGE en conditions dénaturantes ne permet ni d’observer la protéine
entière ni de déterminer expérimentalement la masse exacte de HSulf-2 et celles de ses deux
chaînes, et en particulier celle de la chaîne courte qui contient une grande partie du domaine
hydrophile (domaine HD), une caractéristique structurale propre aux Sulfs et très importante
pour leur activité (voir paragraphe I.2.3.3.b). Les méthodologies suivantes ont donc été mises
en œuvre pour obtenir des informations à l’échelle de HSulf-2 entière et de la chaîne courte:
l’électrophorèse SDS-PAGE en conditions semi-dénaturantes; c'est-à-dire en présence de SDS
et chauffage à 95°C, mais en absence d’agent de réduction; et la spectrométrie de masse
MALDI-TOF appliquée pour la première fois aux endosulfatases.
82
II.4 Caractérisation de HSulf-2 entière par SDS-PAGE en conditions semi-
dénaturantes et par spectrométrie de masse MALDI-TOF
HSulf-2 recombinante est analysée par SDS-PAGE 10% en conditions semi-
dénaturantes (non réductrices), avec une détection par coloration au bleu de Coomassie
(Figure II.8).
Figure II.8: Analyse SDS-PAGE de HSulf-2 en conditions semi-dénaturantes: Gel polyacrylamide à 10%, 3 µg de
HSulf-2 en absence (piste 1) et en présence (piste 2) de β-mercaptoéthanol. Révélation par coloration au Bleu de
Coomassie.
Plusieurs bandes sont révélées, et notamment une bande majoritaire clairement
visible entre 250-300 kDa, et une autre d’intensité plus faible vers 130 kDa. D’autres bandes
faiblement visibles à des masses moléculaires apparentes supérieures à 300 kDa sont
suspectées d’être HSulf-2 agrégée. La bande comprise entre 250-300 kDa reflète
probablement la capacité de HSulf-2 à se dimériser comme suggéré dans la littérature
(Morimoto-Tomita et al. 2002; Tang and Rosen 2009). La bande à 130 kDa représente
vraisemblablement HSulf-2 entière avec ses MPTs et notamment des chaînes N-glycanes sur
la chaîne longue et peut-être également sur la chaîne courte. Sur la base de la masse théorique
de HSulf-2 entière de 98169,86 g/mol et de la masse apparente de N-glycosylation de la chaîne
longue (14 kDa), une masse apparente de 18 kDa peut être attribuée à la MPT de la chaîne
courte. Cette valeur de 130 kDa attribuée à HSulf-2 entière atteste de la présence de la chaîne
courte dans la préparation de HSulf-2 malgré son défaut de détection sur gel SDS-PAGE en
83
présence d’un réducteur. Le déplacement de la bande de 130 kDa à 79 kDa, induit par la
présence d’un réducteur, indique que les deux chaînes de HSulf-2 sont liées par un ou de(s)
pont(s) disulfure(s). L’identification des bandes à 250-300 et 130 kDa par digestion trypsique
en gel et analyse nanoLC-MS/MS est en cours.
Compte tenu du manque de précision des masses déduites à partir de l’analyse par
SDS-PAGE et de la difficulté à détecter la chaîne courte de HSulf-2, nous avons réalisé une
analyse par spectrométrie de masse (MS) MALDI-TOF en ionisation positive, dans des
conditions non-réductrices pour détecter la protéine entière, et en conditions réductrices pour
détecter les deux chaînes de HSulf-2. De nombreux essais pour évaluer diverses conditions de
prétraitement (en absence ou en présence d’urée, avec ou sans dessalage par ziptip C18 ou
sur cassette de dialyse) et différentes matrices (DHB, SA, HABA) dans l’eau/ACN/TFA à
50%/50%/0,1% ou 50%/50%/1% (résultats non montrés), ont été nécessaires pour définir les
conditions optimales avant l’analyse MS MALDI-TOF. Seul la diafiltration de HSulf-2 à l’aide de
modules Microcon® DNA Fast Flow à 100 kDa a permis l’obtention de spectres à l’image de
celui de la Figure II.9. Le rétentat de diafiltration est analysé par MALDI-TOF en utilisant la
matrice SA (eau/ACN/TFA 50%/50%/0,1%).
Figure II.9 - Analyse MALDI-TOF de HSulf-2 entière –Spectre de masse de HSulf-2 (diafiltrée sur une membrane
avec un seuil de coupure de 100 kDa) en mode linéaire et polarité positive, avec la matrice SA. L’ion mono-chargé
[M+H]+ à m/z 133412, attribué à la molécule HSulf-2 entière est détecté dans le spectre (A) et est absent dans le
spectre (B).
84
En conditions non-réductrices, le spectre MALDI de HSulf-2 native est dominé par un
pic à m/z 66 410, qui peut être attribué à l'ion doublement protoné [M+2H]2+ de l'espèce HSulf-
2 entière Figure II.9A. Il est intéressant de noter également la présence d’un ion mono-chargé
[M+H]+ de faible intensité à m/z 133 412, que nous avons attribué à la molécule HSulf-2
entière. Sur la base de ces ions mono- et doublement chargés, une valeur de masse
expérimentale moyenne de 133 115 ± 297 g.mol-1 est déterminée pour la première fois par
MS pour l'endosulfatase HSulf-2 entière. Il est à noter, qu’aucune espèce n’est observée entre
m/z de 150000 à 400000 (données non présentées). Cette masse expérimentale est beaucoup
plus élevée que la masse théorique (98 169,86 kDa) déduite à partir de la séquence d’acides
aminés de HSulf-2, avec une différence d’environ 35 kDa. Cette différence confirme une
contribution significative des MPTs à la masse moléculaire de HSulf-2. Un ion supplémentaire
à m/z 55 212 est également observé, peut-être dû à l’hétérogénéité de ces modifications post-
traductionnelles. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que cet ion pouvait correspondre à un
ion doublement protoné, dont l’espèce monochargée serait à m/z 110 423 mais non visible
sur le spectre. Le pic à m/z 66 410 présente un épaulement à environ 65 500 (m/z 65 420, et
probablement son ion doublement chargé à m/z 32 748) qui reste non identifié Figure
II.9A. Nous ne pouvons pas exclure que cet épaulement puisse être une chaîne isolée, qui reste
liée à l'enzyme, malgré l’étape de diafiltration qui permet d’éliminer toutes les molécules de
masse moléculaire inférieure à 100 kDa. Il est important de noter que du fait de variations
dans les différentes préparations de HSulf-2, l’ion à m/z 133 412 attribué à la protéine entière,
n’est pas systématiquement visualisé sur tous les spectres MALDI-TOF. Mais dans tous les cas,
le pic à m/z 65 511 est lui toujours observé (ion doublement chargé à m / z 32 811) Figure II.
9B.
Lorsque l’analyse MALDI TOF est effectuée sur le retentât réduit par le DTT, le spectre MS
révèle la présence d'ions intenses à m/z 65 764 et à m/z 68 629, qui pourraient correspondre
aux ions mono-chargés des deux chaînes de HSulf-2 avec leurs ions doublement chargés
correspondants détectés respectivement à m/z 32 671 et à m/z 34 296 Figure II.10 trace rose.
Ces résultats montrent que les MPTs sont probablement distribuées sur les deux chaînes et
pas uniquement sur la chaîne longue de HSulf-2. L’analyse MALDI TOF de HSulf-2 déglycosylée
par la PNGase F n’a pu être exploitée car les ions correspondant à cette glycosidase sont très
intenses sur le spectre et atténuent le signal de HSulf-2.
85
Figure II.10 : Analyse MALDI-TOF de HSulf-2 avant et après réduction– Superposition des spectres de masse de
HSulf-2 diafiltrée (seuil de coupure 100 kDa) sans réduction (rouge) et après réduction (rose) par le DTT, en mode
linéaire et polarité positive, avec la matrice SA.
Les changements induits par la présence ou non de réducteur observé aussi bien en analyse
SDS-PAGE qu’en analyse MALDI TOF reflètent l’existence de ponts disulfure reliant les deux
chaînes d’HSulf-2.
II.5 Mise en évidence des ponts disulfure de HSulf-2
Les ponts disulfures peuvent jouer un rôle important dans l’organisation structurale et
donc la fonctionnalité de HSulf-2. Pour les identifier, nous avons mis au point une méthode de
marquage différentiel des cystéines que nous avons préalablement validée sur le lysozyme
avant de l’appliquer sur HSulf-2 Figure II.11 (voir II.5 Mise en évidence des ponts disulfure de
HSulf-2). Le marquage différentiel des cystéines consiste, dans un premier temps, à marquer
toutes les cystéines libres par l’agent d’alkylation iodoacetamide (IAA). Dans un second temps,
les cystéines impliquées dans la formation de ponts disulfure sont réduites et les groupements
thiol nouvellement rendus accessibles sont alkylés par un autre agent d’alkylation: le 4-
Vinylpyridine (4-VP). La protéine est ensuite digérée par la trypsine puis analysée par nanoLC-
ESI-MS/MS. Ainsi, les cystéines modifiées par le groupement Pyridylethyl sont celles
impliquées dans la formation de ponts disulfure, alors que les cystéines modifiées par le
groupement carbamidomethyl sont libres.
86
Figure II.11: Marquage différentiel des cystéines par l’iodoacétamide (IAA) et le 4-Vinylpyridine (4-VP)
Il est important de noter que ce marquage différentiel des cystéines ne permet pas de définir
le couple de cystéines formant un pont disulfure dans l’hypothèse où au moins deux ponts
disulfure sont présents, une méthode complémentaire est donc nécessaire.
Pour exploiter efficacement ce protocole sur HSulf-2 en solution, il était important d’avoir une
couverture de séquence élevée permettant de couvrir en particulier le maximum de cystéines
de HSulf-2. Il a donc fallu au préalable trouver les conditions de digestion protéolytique en
solution conduisant à la couverture de séquence la plus élevée possible (cf. II.6 ci-après). Le
protocole de marquage différentiel des cystéines est en cours d’application sur l’HSulf-2.
II.6 Caractérisation de HSulf-2 par couplage nanoLC-ESI-MS/MS
L’analyse nanoLC-ESI-MS/MS de la chaîne courte n’étant pas possible à partir d’un gel
d’électrophorèse en raison de sa non-détection, cela impose d’accéder à la caractérisation de
cette chaîne à partir de la protéine entière en solution, et ainsi obtenir une couverture de
séquence la plus complète possible de la protéine entière.
II.6.1 Digestion trypsique de HSulf-2 en solution
Dans un premier temps, HSulf-2 a été digérée en solution par la trypsine dans les
conditions standards, c’est-à-dire après réduction suivie d’une alkylation préalables à la
digestion par la trypsine. Cependant, ces conditions ont conduit à une faible couverture de
87
séquence de la chaîne longue (données non présentées) comparée à celle obtenue à partir de
la digestion enzymatique en gel. Pour augmenter l'efficacité de la protéolyse, plusieurs
conditions de dénaturation ont été testées avec différents agents: urée, RapiGest™ SF,
ProteaseMax™ avec et sans urée avant la réduction, l’alkylation et la digestion trypsique
(tableau II. 1). Le traitement de HSulf-2 par l’urée seule ou avec le surfactant ProteaseMax™ a
permet d’obtenir la couverture de séquence la plus élevée. Toutefois, comme le surfactant
ProteaseMax™ est un mélange comportant également de l’urée, nous avons opté pour un
traitement de HSulf-2 par l’urée seule, la présence de l’urée imposant le dessalage des
peptides par ZipTip C18, avant l’analyse par nanoLC-ESI-MS/MS.
Tableau II.1: Effets des différents agents de dénaturation sur la couverture de séquence de
HSulf-2 digérée en solution par trypsine
agents de dénaturations Couverture de
séquence de HSulf-2
expérimentale
(peptides avec un ion
score ≥25 %)
Moyenne
%
Couverture de
séquence de HSulf-2
expérimentale
(peptides avec un ion
score ≥35)
Moyenne
%
Urée 21 20 28 23 19 19 19 19
Urée+ C18 41 38 37 39 30 32 29 31
RapiGest™ 29 27 26 27 27 25 22 25
ProteaseMAX™ 37 32 37 35 28 29 29 29
ProteaseMAX™ +urée+ C18 33 36 41 37 26 30 37 31
Cette introduction de l’urée dans le protocole a permis d’augmenter l'efficacité de la digestion
et d’obtenir une couverture de 39% pour la séquence de la chaîne courte (Ser 515 à Gly 846)
Figure II.12, soit 57% de la couverture de séquence théorique de la chaîne courte après
digestion par la trypsine.
88
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
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801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Figure II.12 - Couverture de séquence de la chaîne courte obtenue par nanoLC-ESI-MS/MS, après digestion en
solution par la trypsine. Peptides identifiés expérimentalement (en rouge).
N: site potentiel de N-glycosylation; S: site de clivage par la furine.
Toutefois, en ce qui concerne la chaîne longue, sa couverture en solution reste inférieure
(39%) à celle obtenue après isolement par gel d’électrophorèse (46%).
II.6.2 Digestion de HSulf-2 en solution par différentes protéases
Afin d’améliorer le pourcentage de couverture de séquence de HSulf-2 en solution, des
protéases de spécificité variable (trypsine / Lys-C, Arg-C, chymotrypsine, Asp-N, Glu-C) ont été
utilisées Figure II.13 et 14. Des valeurs de couverture de séquence légèrement plus élevées
ont été obtenues pour la chaîne longue avec Arg-C et le mélange trypsine / Lys-C (43%) contre
39% avec la trypsine seule. Néanmoins, la trypsine reste la protéase la plus efficace pour
digérer la chaîne courte avec 39% de couverture de séquence contre 30% avec Arg-C et 37%
avec trypsine / Lys-c Figure II.13.
Nous obtenons une amélioration significative du taux de couverture des deux chaînes en
fusionnant les couvertures de séquences obtenues avec les différentes protéases. Ainsi une
couverture de séquence globale de 67% de la chaîne longue, et de 58% de la chaîne courte est
obtenue, ce qui correspond à une couverture de séquence de 63% de la protéine entière
Figure II.13 et 14.
89
Figure II.13: Détermination de la séquence protéique de l'enzyme HSulf-2 entière. Pourcentages de couverture
de séquence obtenus par digestion en solution de HSulf-2 par les protéases: trypsine, les mélanges trypsine /
Lys-C, Arg-C, chymotrypsine, Asp-N ou Glu-C.
Les expériences de digestion en gel de la chaîne longue suggèrent que le résidu Asn 88 serait
potentiellement N-glycosylé. Si cela est le cas, ce résidu ne devrait pas être identifié dans les
séquences peptidiques produites dans des conditions de digestion en solution de HSulf-2
native (c’est-à-dire sans déglycosylation). Or, Asn 88 a bien été identifiée dans le peptide de
la chaîne longue Figure A.1: 76YVHNHNTYTNNENCSSPSWQAQHESR102 avec des « ions scores »:
14, 51, 30 (trypsine), 46, 54, 42 (Trypsin/Lys-C) et 49, 28, 49 (Arg-C), indiquant que tout comme
Asn 125, le résidu Asn 88 n'est pas un site de N-glycosylation. Il n’est toutefois pas exclu que
Asn 88 puisse représenter un site de glycosylation hétérogène.
En ce qui concerne la chaîne courte, la détection de Asn 693 dans plusieurs peptides Figure
A.2, par exemple dans les séquences peptidiques 690LQNNDTCSMPGLTCF704 et
689RLQNNDTCSMPGLTCF704 avec les « ions scores »: 27, 43, 41 (trypsine) et 31, 34, 32 (Trypsin
/Lys-C Mix), indique que ce résidu n’est pas N-glycosylé.
90
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Figure II.14: Détermination de la séquence protéique de l'enzyme HSulf-2 entière. Carte de fusion de la
séquence de HSulf-2 déterminée en combinant les séquences de couvertes obtenues par les protéases trypsine,
trypsine / lys-C, Arg-C, chymotrypsine, Asp-N ou Glu-C.
C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation; RS: site de clivage par la furine.
En ce qui concerne les autres sites potentiels de N-glycosylation de la chaîne courte, Il est
apparu que 80% des peptides trypsiques porteurs de ces sites ne sont pas couverts. Cette
faible couverture des sites potentiels de N-glycosylation peut s’expliquer par la présence de
N-glycanes sur la chaîne courte qui limitent l’action de la trypsine et/ou la couverture MS des
peptides glycosylés.
C’est pourquoi l’analyse nanoLC-ESI-MS/MS de HSulf-2 ayant subi une N-déglycosylation par
la PNGase F avant la digestion trypsique en solution permettrait de faciliter la détection des
sites de glycosylation de la chaîne courte. De telles expériences sont actuellement en cours,
en utilisant non seulement la PNGase F, mais également les endo-glycosidases F3 et H. Les
enzymes Endo F3 et Endo-H, catalysent le clivage de la liaison entre le premier résidu GlcNAc
lié à la fonction amide de l’asparagine et le second résidu GlcNAc. De cette façon, les résidus
asparagine porteurs de chaînes N-glycanes seront marqués par le résidu GlcNAc résiduel et
ainsi plus facilement identifiés.
Outre la N-glycosylation, la présence de ponts disulfure apparaît aussi comme une
modification post-traductionnelle importante de HSulf-2, comme l’ont montré les analyses
par électrophorèse et MALDI TOF. HSulf-2 compte 22 cystéines susceptibles de former un/des
91
pont(s) disulfure, 10 au sein de la chaîne longue et 12 au sein de la chaîne légère. Afin
d’identifier les résidus cystéine impliqués, il est important que la couverture de séquence par
digestion protéolytique comprennent toutes ces cystéines. Or, avec l’actuelle couverture de
séquence de HSulf-2 entière Figure II.14, seulement 7 des 10 cystéines de la chaîne longue, et
3 des 12 cystéines de la chaîne légère sont détectées.
II.7 Mise en évidence du résidu catalytique formylglycine de HSulf-2
Le résidu formylglycine est un élément clé du site actif de la sulfatase, essentiel à son activité
catalytique (Thomas Dierks et al. 2003). Ce résidu est identifié dans la littérature pour les
endosulfatases HSulfs de façon indirecte, par mutation des deux cystéines adjacentes
susceptibles d’être converties en Cα-formylglycine, Cys 63 et 64 pour HSulf-1 et Cys 64 et 65
pour HSulf-2 (Morimoto-Tomita et al. 2002). Ainsi leur mutation en alanine se traduit par une
perte totale des activités enzymatiques aryl-sulfatase et endo-sulfatase vis-à-vis des substrats
4-MUS et héparine, respectivement (Morimoto-Tomita et al. 2002; Tang and Rosen 2009).
L’analyse par nanoLC-ESI-MS/MS après digestion protéolytique nous offre la possibilité de
détecter de façon directe le résidu formylglycine dans la séquence de HSulf-2. Effectivement,
un peptide porteur du résidu formylglycine a pu être identifié après la digestion en solution
par Arg-C uniquement, et il indique sa position sur la cystéine 64. Ce peptide
46IMEQGGAHFINAFVTTPMCCPSR68 est identifié avec confiance (détecté en triplicat avec des «
ions scores » 34, 32 et 34), le résidu C19 de ce peptide étant identifié deux fois sur trois sous
la forme N-FGly. Ce même peptide porteur du résidu catalytique au niveau de la cystéine 64 a
également été identifié après digestion trypsique en gel de la chaîne longue N-déglycosylée
(bande à 65 kDa) avec confiance (détecté en triplicat avec des « ions scores » 25, 25 et 27), le
résidu C19 de ce peptide étant identifié chaque fois sous la forme N-FGly. Cette détection du
résidu Cα-formylglycine après digestion soit en solution par Arg-C, soit en gel par la trypsine
est donc en accord avec les données de la littérature. Ce résultat constitue la première
identification directe au niveau protéique du résidu catalytique formylglycine de HSulf-2. Le
résidu formylglycine apparait comme une modification majeure de HSulf-2 en plus de la N-
glycosylation.
92
II.8 Conclusion
Les sulfatases se caractérisent entre autres par la présence d’une cystéine hautement
conservée au sein du site catalytique qui, par modification post-traductionnelle, est
transformée en un résidu formylglycine essentiel à l’activité enzymatique. Selon les résultats
des analyses nanoLC-ESI-MS/MS, c’est la cystéine 64 de la chaîne longue qui subit cette
modification post-traductionnelle. Ce résultat constitue la première détection directe du
résidu catalytique N-formylglycine dans la sulfatase HSulf-2. Il confirme les expériences de
mutagénèse dirigée décrites dans la littérature montrant que la cystéine 64 est indispensable
à l’activité enzymatique de HSulf-2 (Morimoto-Tomita et al. 2002; Tang and Rosen 2009). Il
faut remarquer que ce type d’identification directe n’a pas encore été décrit pour les autres
endosulfatases.
Dans les données de la littérature, HSulf-2 est habituellement détectée de façon
indirecte par analyse western blot basée sur des anticorps reconnaissant deux étiquettes,
l’une à l’extrémité N-terminale de la chaîne longue et l’autre à l’extrémité C-terminale de la
chaîne courte, ou via l’anticorps H2.3 dirigé contre l’extrémité C-terminale de la chaîne longue
de HSulf-2 (acides aminés 484-504) (Morimoto-Tomita et al. 2002, 2005; Tang and Rosen
2009). Ici, notre travail est basé sur la détection directe de la protéine HSulf-2 par analyse SDS-
PAGE et spectrométrie de masse MALDI-TOF. L’analyse SDS-PAGE de HSulf-2 en conditions
non réductrices montre une bande majoritaire entre 250 et 300 kDa. Nous faisons l’hypothèse
qu’il puisse s’agir de dimère d’HSulf-2, voire de multimères résistants à la dénaturation
thermique et au SDS, en nous fondant sur les données de la littérature qui indiquent la
capacité de HSulf-2 à s’oligomériser (Morimoto-Tomita et al. 2002; Tang and Rosen 2009).
Toutefois, cette hypothèse n’a pu être vérifiée par MALDI TOF car aucun ion pouvant
correspondre à de telles oligomères dans la gamme m/z entre 150000 et 400000 n’a été
détecté. En conditions réductrices, l’analyse SDS-PAGE de HSulf-2 ne montre qu’une unique
bande à environ 79 kDa au lieu des deux attendues pour la chaîne longue et pour la chaîne
courte respectivement à 79 kDa et à 50 kDa (Tang and Rosen 2009). L’analyse nanoLC-ESI-
MS/MS des peptides issus de la digestion en gel de la bande à 79 kDa a révélé qu’il s’agit de la
chaîne longue. Cette dernière est déplacée à 65 kDa après N-déglycosylation par la PNGase F,
ce qui indique une N-glycosylation de la chaîne longue. Une contribution des chaînes de N-
glycanes de masse apparente de 14 kDa peut donc être déduite de cette différence. HSulf-2
93
est décrite dans la littérature comme une glycoprotéine avec 12 sites potentiels de N-
glycosylation, dont 7 sont au niveau de la chaîne longue et 5 au niveau de la chaîne courte.
Parmi ces 12 sites, nos résultats indiquent que trois ne sont pas N-glycosylés (ou bien sont
glycosylés de manière hétérogène) au niveau des asparagines 88 et 125 de la chaîne longue
et de l’asparagine 693 de la chaîne courte, car ces résidus sont détectés sans nécessiter de
déglycosylation préalable. En revanche, les 9 sites de N-glycosylation potentiels restants, en
particulier les asparagines 108, 147, 174, et 217 de la chaîne longue, sont probablement
porteurs de N-glycanes car détectés uniquement après l’action de la PNGase F. De manière
analogue, la sulfatase humaine HG6S est également N-glycosylée avec au moins 10 sites
glycosylés sur les 13 sites potentiels (Litjens et al. 1997; Robertson et al. 1992). Pour
l’endosulfatase QSulf-1, la N-glycosylation est indispensable à la reconnaissance du substrat,
à l’activité enzymatique, à la sécrétion et au positionnement de l’enzyme à la surface cellulaire
(Ambasta, Ai, and Emerson 2007). Pour les protéines HSulf-1 et 2, le rôle des glycosylations
reste inconnu.
D’après les analyses MALDI-TOF de HSulf-2 en conditions non-réductrices, la masse
expérimentale de HSulf-2 entière est d’environ 133 115 ± 297 g.mol-1. Étant donné la masse
théorique de HSulf-2 à 98 169,86 g.mol-1, les modifications post-traductionnelles
correspondent donc à un ajout de masse d’environ 35 kDa. Si nous faisons l’hypothèse qu’en
conditions réductrices, les masses expérimentales de 68,6 et 65,7 kDa correspondent
respectivement aux chaînes longue et courte, alors leurs différences avec les masses
théoriques (59 et 39 kDa) indiquent que le(s) N-glycosylation(s) de la chaîne lourde
contribuerait pour 9.3 kDa, à comparer avec la valeur assez proche de masse apparente de 14
kDa déduite de l’analyse SDS PAGE. De la même façon, la masse correspondant aux
modifications post-traductionnelles de la chaîne courte est de 26,9 kDa. Il est impossible de
corroborer ce chiffre par une analyse SDS-PAGE avant et après déglycosylation, car nous ne
sommes pas parvenus à détecter la chaîne courte sur un gel. Cette valeur de 26,9 kDa paraît
cependant élevée pour seulement 5 sites potentiels de N-glycosylation. Ce résultat nous
conduit à émettre l’hypothèse que la chaîne courte de HSulf-2 porte des modifications post-
traductionnelles autres que la N-glycosylation contribuant à une masse élevée de HSulf-2
entière (133 115 ± 297 g.mol-1 kDa par MS MALDI TOF) et pouvant interférer avec la coloration
sur le gel.
94
Chapitre III
Mise en évidence d’une nouvelle modification post-
traductionnelle inédite chez HSulf-2
95
III.1 Un groupement polyanionique est associé à HSulf-2
Une analyse de HSulf-2 par diffusion de rayons X aux petits angles (Small Angle X-rays
Scattering, SAXS) réalisée par l’équipe du Dr. R. Vivès sur la plateforme BM29 BioSAXS
(European Synchrotron Radiation Facility –ESRF), a révélé une enveloppe protéique de forme
globulaire portant une extension assez allongée. Ce modèle suggère que HSulf-2 possède un
rayon hydrodynamique très important et expliquerait l’élution très rapide de l'enzyme lors de
l’analyse en chromatographie d'exclusion stérique. Une hypothèse a été émise selon laquelle
HSulf-2 serait isolée et co-purifiée avec un composant de la matrice extracellulaire. La matrice
extracellulaire est le siège de l’activité enzymatique de HSulf-2, elle est constituée de plusieurs
catégories de molécules organiques : des glycosaminoglycanes (GAG), des protéoglycanes
(PG), des glycoprotéines, des protéines fibreuses (PF) et des lipides. L’analyse de HSulf-2 par
SDS-PAGE que nous avons effectué n’a permis de ne visualiser qu’une seule bande de nature
protéique, attribuée à la chaîne longue, ce qui nous permet raisonnablement d’exclure la
présence dans des proportions notables d’autres composés de nature protéique qui seraient
co-purifiés avec HSulf-2. Ceci bien sûr sous réserve qu’ils ne soient pas insensibles à la
coloration au bleu de Coomassie. Compte tenu de ce résultat, l’hypothèse que nous avons
retenue propose que HSulf-2 soit purifiée sous une forme liée à un composant de la matrice
extracellulaire de type glycosaminoglycanes.
Pour vérifier cette hypothèse, nous avons employé une double coloration en gel basée sur la
combinaison du bleu Alcian et du nitrate d’argent. Cette dernière est connue pour être
spécifique des composés polyanioniques sulfatés de types GAGs (Bodet et al. 2017). Le gel
obtenu après double coloration pour HSulf-2, est présenté dans la Figure III.1B. Un premier
gel avec une coloration par le bleu de Coomassie (contrôle positif) révélant les protéines, met
en évidence la bande majoritaire déjà observée à une masse moléculaire apparente d’environ
79 kDa et attribuée à la chaîne longue Figure III.1A, puits 1. Un second gel coloré par la double
coloration spécifique des polyanions, révèle une bande large unique, distincte de celle de la
chaîne longue, à une masse moléculaire apparente supérieure à 97 kDa Figure III.1B, puits 3.
Il faut noter que cette bande est également perceptible de manière très diffuse lors de la
coloration protéique par le bleu de Coomassie Figure III.1A, puits 1.
96
Figure III.1: Analyse SDS-PAGE de HSulf-2 avec coloration spécifique des groupements polyanioniques - Gel de
polyacrylamide à 10%, 3 µg/puits de HSulf-2 (1), dans un tampon de dénaturation Laemmli en présence d’un
agent réducteur (β-mercaptoéthanol). Révélation par une coloration au A) Bleu de Coomassie (coloration de la
partie protéique de HSulf-2, contrôle positif), et B) bleu Alcian et nitrate d’argent pour mettre en évidence la
présence des groupements polyanioniques. (2) et (3) 3 ou 10 µg /puits d’Apo-transferrine, une glycoprotéine de
masse moléculaire: 76-81 kDa (contrôle négatif).
Cette double coloration ne permet pas la détection des protéines glycosylées par des
glycanes neutres, comme cela est vérifié sur le gel par l’absence de bande visible
correspondant à l’apo-transferrine (glycoprotéine avec des chaînes N-et O-glycosylées). Ce
résultat confirme la spécificité de la double coloration (bleu Alcian + nitrate d’argent) vis-à-vis
des polyanions et indique la présence d’un composant polyanionique lié de manière covalente
à HSulf-2, puisque l’analyse par SDS-PAGE en conditions dénaturantes ne détruit pas cette
liaison. Avec une masse moléculaire apparente supérieure à 97 kDa, cet ensemble protéine-
polyanion est clairement distinct de la chaîne longue. Ces données nous ont conduit à penser
que cette espèce pourrait être la chaîne courte associée à des groupements polyanioniques.
Nous avons cherché à vérifier la nature de ces groupements, en particulier s’il s’agit de chaînes
de glycosaminoglycanes (GAG).
Afin de mieux caractériser le polyanion associé à HSulf-2, la protéine a été analysée par
électrophorèse sur gel concentré (27 %) de type C-PAGE qui ne permet pas la séparation des
protéines de masse élevées mais autorise la migration et la résolution d’oligo/polysaccharides.
Ces derniers peuvent ensuite être révélés par la double coloration (bleu Alcian + nitrate
d’argent) spécifique des polyanions Figure III.2.
97
Figure III.2: Analyse C-PAGE de HSulf-2 avec coloration spécifique des groupements polyanioniques - HSulf-2
(3 μg) incubée avec (A) 5 mU*5 Héparinase I, II et III (A1 contrôle sans héparinase, A2 incubation 1h et 20h) et
(B) 10 mU chondroïtinase ABC (B1 contrôle sans chondroïtinase, B2 incubation 1h, 3h et 20h). En parallèle, le
standard de chondroïtine sulfate B (2 μg) a été utilisé comme marqueur de poids moléculaire (23 kDa, B4), et
digéré par la CSase ABC (B3, incubation 1h et 20h), et par la CSase B (B-5). Gel C-PAGE 27 %, double coloré au
bleu Alcian et nitrate d’argent.
L’analyse C-PAGE de HSulf-2 montre une bande de coloration intense qui demeure en
haut du gel de concentration (6%) Figure III.2A puits 1. Cette bande correspond probablement
à HSulf-2 entière, qui est de taille trop importante pour pénétrer et migrer dans le gel de
résolution. Sa forte coloration indique qu’un groupement polyanionique y est fortement
associé, vraisemblablement de manière covalente. Une fine bande est également détectée
(bande X, Figure III.2A puits 1) dans le gel de résolution, qui ne peut pas être attribuée à une
protéine, mais qui pourrait être une chaîne polyanionique libre initialement présente dans la
préparation de HSulf-2.
Afin de vérifier si ces groupements polyanioniques associés à HSulf-2 sont de type
glycosaminoglycanes, la protéine a été traitée par différentes enzymes dégradant
spécifiquement certaines chaînes de glycosaminoglycanes. Ces dernières sont :
i- les héparinases (HPases) I, II, et III, dégradant l’héparine et l’héparane sulfate,
ii- la chondroïtinase ABC (CSase ABC), capable de dépolymériser des chaînes de
chondroïtine et de dermatane sulfate et d’acide hyaluronique Figure IV.3.
98
HSulf-2 traitée en solution par les HPases Figure III.2A puits 2 ou la CSase ABC Figure III.2B
puits 2 a été analysée par électrophorèse C-PAGE avec révélation par la double coloration
spécifique des polyanions. Le traitement par la CSase ABC fait disparaître la coloration intense
au niveau du gel de concentration et également de la bande X détectée dans le gel de
résolution Figure III.2B puits 2. En revanche, les HPases n’induisent aucun effet au niveau du
gel de concentration, alors que la bande X apparaît très faiblement dégradée après 20h
d’incubation (Figure III.2A , puits 2). Ce résultat indique que le groupement polyanionique lié
à HSulf-2 restant dans le gel de concentration et libre au niveau du gel de séparation est de
type chondroïtine ou dermatane sulfate (CS ou DS, respectivement).
Ce GAG migre à une masse moléculaire apparente voisine de celle du standard de
chondroïtine B (23 kDa) utilisé comme marqueur de poids moléculaire Figure III.2B puits 4. Il
a en outre été possible de suivre en gel la dépolymérisation enzymatique de ce standard,
conduisant à des oligosaccharides de tailles variées Figure III.2B puits 3, mais ce type de suivi
n’a pas été possible pour la CS associée à HSulf-2, vraisemblablement en raison de sa trop
faible quantité et/ou d’une sensibilité insuffisante de la méthode de coloration.
Nous avons également étudié l’effet du traitement de HSulf-2 par la CSase ABC sur son
profil SDS-PAGE qui avait révélé une bande supérieure à 97 kDa après la double coloration
spécifique des polyanions. HSulf-2 a été traitée en solution par la CSase ABC puis analysée par
SDS-PAGE (10%, conditions dénaturantes) suivi d’une détection par le bleu de Coomassie
Figure III.3A ou la double coloration bleu Alcian + nitrate d’argent Figure III.3B.
99
Figure III.3: Analyse SDS-PAGE de HSulf-2 traitée par la Chondroïtinase ABC - 3μg d’HSulf-2 ont été traités ou
non avec 10 mU Chondroïtinase ABC (24h à 37°C), puis analysés en conditions dénaturantes et réductrices en gel
SDS-PAGE 10 %. Révélation par une coloration au (A) bleu de Coomassie (coloration de la partie protéique de
HSulf-2, contrôle positif) ou (B) bleu Alcian et nitrate d’argent (coloration des chaînes polyanionique). (1) 10
µg/puits d’Apo-transferrin, une glycoprotéine de masse moléculaire d’environ 76-81 kDa (contrôle négatif), (2)
HSulf-2 (3) HSulf-2 traité par la CSase ABC (4) CSase ABC. La chaîne courte (flèche rouge).
Sur le gel coloré au bleu de Coomassie Figure III.3A, après traitement de HSulf-2 par la
CSase ABC, on relève l’apparition d’une bande à 50 kDa très diffuse Figure III.3A puits 3, alors
que la bande à 79 kDa demeure inchangée. Sur le gel avec double coloration, la bande à 97
kDa qui apparaît sous une bande large très foncée Figure III.3B puits 2, disparaît totalement
après action de la CSase ABC Figure III.3B puits 3. L’ensemble de ces résultats nous permet de
supposer que la chaîne de glycosaminoglycane de type CS serait liée à la chaîne courte de
HSulf-2. Cette hypothèse pourrait expliquer pourquoi cette chaîne protéique serait difficile à
révéler par le bleu de Coomassie, le GAG soit interférant, soit masquant une grande partie des
sites de liaison au colorant.
Un contrôle de l’efficacité de coloration au Bleu de Coomassie a été effectué avec
l’endocane, un protéoglycane composé d'un polypeptide mature de 20 kDa et d'une chaîne
de CS/DS de 30 kDa (Béchard et al. 2001). L’endocane a été analysé en conditions
dénaturantes et réductrices par SDS-PAGE (12%) et révélée par coloration par le bleu de
Coomassie Figure III.4.
100
Figure III.4: Profil électrophorétique de l’endocane, un protéoglycane porteur d’une chaîne de CS. L’endocane
(2µg) a été traité avec la chondroïtinase ABC (10 mU) durant 24h à 37°C, puis analysés en conditions
dénaturantes et réductrices en gel SDS-PAGE 12 %. (1) Endocane (2) CSase ABC (3) Endocane traité par CSase
ABC. Révélation par coloration au bleu de Coomassie.
La coloration au bleu de Coomassie révèle une bande à environ 60 kDa très large et diffuse
avec une très faible intensité, correspondant à l’endocane mature avec sa chaîne de CS. Après
traitement avec la CSase ABC, un déplacement de la bande est observé de 60 kDa vers 25 kDa.
Cette bande très nette et facilement observable correspond au polypeptide composant
l’endocane sans la chaîne de CS. Ce résultat confirme l’hypothèse qu’une chaîne de
chondroïtine sulfate liée à une partie protéique rend difficile, voire empêche la révélation du
protéoglycane en gel SDS-PAGE par le bleu de Coomassie.
Parallèlement, nos collaborateurs de l’Institut de Biologie Structurale (Grenoble) ont
effectué un certain nombre d’expériences visant également à cerner la nature du groupement
polyanionique, en particulier en mesurant l’effet de deux glycosidases, les héparinases et la
chondroïtinase ABC, ainsi que l’effet de la force ionique sur le profil chromatographique
d’exclusion stérique de HSulf-2 Figure III.5 [Thèse d’Amal Seffouh, Caractérisation
Biochimique et fonctionnelle de l’enzyme HSulf, université Grenoble Alpes, 2016].
101
Figure III.5: Chromatogrammes correspondant à l’analyse par gel filtration (Superdex 200) de HSulf-2 (100
μg) pré-traitée ou non avec (B) 2 M NaCl/urée, (C) Heparinases I, II, III ou (D) Chondroitinase ABC. En bleu:
absorbance à 280 nm / En rouge : fractions. (E) Des fractions de 0,5 mL sont recueillies et analysées par Westen
Blot en utilisant un anticorps primaire dirigé contre l’extrémité N-terminale de HSulf-2.
Dans l’hypothèse où HSulf-2 purifiée serait liée par des interactions ioniques à son substrat,
c’est-à-dire à un fragment de chaîne d’héparane sulfate cellulaire, un traitement de HSulf-2
par une solution NaCl 2M / urée 6M a été effectué. Ceci avait pour objectif de dissocier
d’éventuels complexes non covalents et/ou de dénaturer des complexes protéiques
multimériques. Les Figure III. 5B et 5C respectivement montrent que le traitement par
NaCl/urée, et la dépolymérisation par les héparinases n’ont aucun effet sur le profil
chromatographique de HSulf-2 Figure III.5A. Le complexe suspecté n’est donc pas de nature
électrostatique, et HSulf-2 n’est pas non plus liée à une chaîne d’héparane sulfate. En
revanche, un profil chromatographique très différent est obtenu quand HSulf-2 purifiée est
soumise à l’action de la chondroïtinase ABC Figure III.5D. En effet, en plus du Pic 1 (HSulf-2)
102
proche du volume d’exclusion et du Pic 2 (HSulf-2 dégradée), un nouveau Pic noté * est
observé. Ce dernier est élué après le Pic 1 et est donc caractéristique d’une ou plusieurs
espèces ayant un volume hydrodynamique apparent inférieur à celui de HSulf-2 détectée sous
le pic 1. Ces données corroborent nos résultats obtenus par électrophorèse en gel, indiquant
clairement qu’un polyanion de type CS est lié à HSulf-2.
III.2 HSulf-2 : un protéoglycane avec une chaîne de chondroïtine sulfate ?
Les protéoglycanes (PGs) sont des biomolécules bien connues pour comporter une ou
des chaîne(s) de GAG fixée(s) de façon covalente à la composante protéique au niveau d’un
dipeptide Sérine-Glycine (motif SG). L’élongation d’une chaîne de GAG débute par
l’attachement d’un résidu xylose sur ce dipeptide, à partir duquel s’effectue l’amorçage puis
la polymérisation de la chaîne polysaccharidique. Il est remarquable que HSulf-2 contienne
dans sa séquence deux motifs SG dans son domaine HD, l’un dans la chaîne longue (484SG485)
et l’autre dans la chaîne courte (559SG600) Figure III.6.
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Figure III.6: Représentation de la séquence primaire de HSulf-2. C: formylglycine du site actif; RS: site de clivage
par la furine ; SG : motifs de liaison possible de la chaîne de chondroïtine sulfate.
Nos collaborateurs de l’Institut de Biologie Structurale (Grenoble) ont réussi à sur-
exprimer et purifier une forme double mutante, sur deux sites SG distincts de HSulf-2 (HSulf-
2ΔSG1SG2) dans laquelle les deux motifs SG ont été remplacés à chaque fois par les résidus
Alanine-Glycine. À la différence de HSulf-2 sauvage (Figure III.7B puits 1), le double mutant
HSulf-2 dénommé ici HSulf-2 ΔSG ne montre sur gel SDS-PAGE aucune coloration spécifique
103
de la présence de polyanions (Figure III.7B puits 3), en particulier autour de la zone
correspondant à une masse moléculaire supérieure 97 kDa après révélation par la double
coloration au bleu Alcian et nitrate d’argent (Figure III.7B puits 3). Ce résultat confirme
l’absence d’une chaîne de CS dans HSulf-2 ΔSG.
Figure III.7: Analyse SDS-PAGE de HSulf-2 mutant (HSulf-2 ΔSG) et HSulf-2 sauvage et traitée ou non par la
Chondroïtinase ABC - 3μg d’HSulf-2 ont été traités ou non avec 10 mU Chondroïtinase ABC (CSase) (24h à 37°C),
puis analysés en conditions dénaturantes et réductrices par gel SDS-PAGE 10 %. Révélation par une coloration
par (A) Bleu de Coomassie (coloration de la partie protéique de HSulf-2, contrôle positif), ou par (B) Bleu Alcian
et nitrate d’argent (coloration des chaînes polyanioniques, chaîne de CS). (1 & 2) HSulf-2 sauvage sans et avec
traitement par la CSase ABC (3) HSulf-2 ΔSG. Encadrements noir (la bande à 97 kDa), rouge (la chaîne longue à
79 kDa) et vert (chaîne courte à 50 kDa).
Une autre différence avec HSulf-2 sauvage, est que HSulf-2 ΔSG montre cette fois sur
gel SDS-PAGE coloré par le bleu de Coomassie Figure III.7A puits 3, deux bandes, l’une à 79
kDa et une autre diffuse à 50 kDa, que nous attribuons respectivement, à la chaîne longue et
la chaîne courte de HSulf-2 (alors que comme précédemment la chaîne courte de HSulf-2
sauvage demeure indétectable Figure III.7A puits 1). La chaîne courte est également mise en
évidence sur HSulf-2 sauvage traitée par la CSase ABC Figure III.7A puits 2. On peut donc
raisonnablement supposer que la forme mutante de HSulf-2 (HSulf-2 ΔSG) est équivalente à
HSulf-2 sauvage traitée par la CSase ABC, c’est-à-dire dépourvue de chaîne de CS.
HSulf-2 possède comme les PGs des séquences SG dont la mutation entraîne
l’impossibilité d’y attacher des chaînes de GAG, ici une chondroïtine sulfate. A notre
104
connaissance, HSulf-2 serait donc le premier exemple d’un protéoglycane qui possède aussi
une fonction enzymatique.
III.3 Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF du double mutant HSulf-2 ΔSG
Il ne nous a pas été possible d’exploiter le spectre MALDI de HSulf-2 traitée par la
chondroïtinase ABC, en raison d’ions interférents très intenses provenant de la préparation
de CSase ABC, notamment ceux de la BSA. L’analyse du double mutant HSulf-2 ΔSG nous offre
une alternative intéressante pour estimer par MALDI-TOF la masse moléculaire de la
composante de la protéine entière, c’est-à-dire sans la chaîne de CS. Pour cela, HSulf-2 ΔSG a
été diafiltrée sur une membrane à 100 kDa, puis analysée par MALDI TOF dans des conditions
non réductrices (sans DTT) par MALDI-TOF en polarité positive et en mode linéaire.
Dans ces conditions, le spectre MALDI-TOF de HSulf-2 ΔSG est dominé par un ion à m/z 53 885
qui pourrait être attribué à l'ion doublement protoné de l'espèce HSulf-2 ΔSG entière, car des
ions de faible intensité sont aussi observés à m/z 108.250 et à m/z 37 180 qui pourraientt
correspondre aux ions mono-chargé et tri-chargé, respectivemt Figure III.8A.
105
Figure III.8: Analyse par MALDI-TOF du double mutant HSulf-2 ΔSG: 3µg d’HSulf-2 ΔSG, après dessalage sur un filtre à 100 kDa, puis mélangé à la matrice acide sinapinique, A) sans (rouge) ou B) avec (vert) réduction au DTT avant la détection MALDI. C) superposition des deux spectres de HSulf-2 SG avant et après réduction. Analyse en mode linéaire et polarité positive.
A B C
106
L’analyse MALDI du double mutant HSulf-2 ΔSG, préalablement diafiltré puis réduit par le DTT,
ne révèle aucune différence avec le spectre de HSulf-2 ΔSG sans réduction Figure III.8B et C,
en particulier avec la détection des ions à m/z 108.528 (1+), 54.082 (2+) et 36.383 (3+),
démontrant que HSulf-2 ΔSG n’aurait pas été réduite. Ce résultat surprenant pose question et
au moment de la rédaction ce mémoire, aucune explication n’a pu être formulée. On peut tout
de même faire plusieurs hypothèses : 1) le double mutant ne serait pas clivé par la furine, mais
ce mutant laisse voir deux bandes en gel ; 2) les conditions de réduction de HSulf-2 ΔSG par le
DTT ne sont pas assez fortes, pourtant HSulf-2 native est réduite dans les mêmes conditions
utilisées le même jour; 3) la conformation de HSulf-2 ΔSG est très différente de HSulf-2,
menant à un faible accès aux ponts disulfure sans une dénaturation forcée : il aurait fallu
refaire l’expérience dans les conditions de dénaturation plus poussées, comme celles utilisées
pour l’analyse SDS-PAGE, mais faute de matériel elle n’a pu être effectuée.
Sur la base des ions du spectre MALDI-TOF de HSulf-2 ΔSG, une valeur de masse
moléculaire expérimentale moyenne de 108 388 ± 506 g.mol-1 est déterminée pour l'enzyme
HSulf-2 sans la chaîne de CS. Une différence d’environ 25 kDa -précisément 24,727 kg.mol-1-
est donc observée entre la masse expérimentale de HSulf-2 sauvage (133 115 ± 297 g.mol-1)
mesurée par MALDI-TOF (paragraphe chapitre II.4) et celle de sa forme mutante HSulf-2 ΔSG.
Sur la base des résultats présentés, nous formulons l’hypothèse que cette différence de masse
moléculaire corresponde à celle de la chaîne de CS. Cette valeur est en accord avec celle
estimée à 23 kDa de la chaîne polyanionique détectée par électrophorèse en gel C-PAGE (27%)
de HSulf-2 (Figure III.2). Cette chaîne polyanionique détectée seule et de faible intensité
indique que la préparation de HSulf-2 doit contenir une faible proportion de chaîne de CS
séparée de la protéine.
La valeur de 108 388 ± 506 g.mol-1 de la masse expérimentale du double mutant de
HSulf-2 est plus élevée que la masse théorique (98 170 kDa) déduite de la séquence en acides
aminés de la protéine, soit une différence de ≈10,2 kDa. Cette différence représente
vraisemblablement la contribution des chaînes de N-glycanes dont nous avons déjà établi la
présence sur la chaîne longue (cf. chapitre II.3), et potentiellement sur la chaîne courte.
107
III.4 N-glycosylation de la chaîne courte de HSulf-2
Nous avons montré dans le chapitre II que la chaîne longue de HSulf-2 était N-glycosylée sur
différents sites. Afin de mettre en évidence la présence de N-glycosylation sur la chaîne courte
de HSulf-2, une analyse comparative de HSulf-2 ΔSG par SDS-PAGE a été effectuée avec ou
sans digestion par la PNGase F Figure III.8.
Figure III.8: N-déglycosylation de la chaîne courte du double mutant HSulf-2 ΔSG. (1) HSulf-2 ΔSG; (2) HSulf-2
ΔSG traité par PNGase F; (3) HSulf-2 ΔSG traité par MIX II; (4) contrôle MIX II ; (5) contrôle Fétuine traité par MIX
II ; (6) contrôle Fétuine. La Fétuine est une protéine N- et O-glycolysée. Marqueurs de poids moléculaires (PM).
SDS-PAGE (10%) en conditions dénaturantes. 3 µg de HSulf-2 ΔSG par puits ; révélation par coloration au Bleu de
Coomassie.
En absence de traitement par la PNGase F, deux bandes majoritaires sont clairement visibles,
une large à environ 79 kDa et une seconde à environ 54 kDa correspondant, respectivement,
à la chaîne longue et la chaîne courte de HSulf-2 ΔSG Figure III.8, puits 1. Après N-
déglycosylation de HSulf-2 ΔSG par la PNGase F, on remarque une disparition totale des
bandes à 79 et 54 kDa et l’apparition de deux nouvelles bandes à 65 et 41 kDa Figure III.8,
puits 2. On formule l’hypothèse que la bande à 65 kDa est la chaîne longue dépourvue de N-
glycanes, car elle avait déjà été observée après N-déglycosylation de HSulf-2 sauvage, et que
la bande à 41 kDa correspond à la chaîne courte N-déglycosylée. La masse moléculaire
apparente d’environ 65 kDa de la chaîne longue N-déglycosylée est proche de la valeur
théorique calculée à partir de la séquence d’acides aminés et égale à 59 kDa. De même, la
masse moléculaire apparente de la chaîne courte N-déglycosylée d’environ 41 kDa est proche
de la valeur théorique 39 kDa calculée à partir de la séquence d’acides aminés (à noter qu’une
différence de masse est également observée entre la PNGase F détectée à 39 kDa sur le gel
108
pour une masse molaire théorique de 36 kDa). L’identité de ces différentes bandes a été
déterminée par analyse nanoLC-ESI-MS/MS sur un instrument LTQ-Orbitrap™ XL, indiquant
que les bandes 79 et 65 kDa correspondent à la chaîne longue, et celles à 54 et 41 kDa à la
chaîne courte à (Figure A.5, 6, 8 et 9).
Afin de vérifier si HSulf-2 ΔSG possède en plus des chaînes N-glycanes, des sites de O-
glycosylation neutre, la protéine a été traitée par un cocktail de glycosidases (Protéine
Deglycosylation Mix II, NEB ; mélange contenant la PNGase F, une O-glycosidase, la α2-3,6,8,9
neuraminidase A, la β1-4 galactosidase S et la β-N-acétylhexosaminidase F), puis analysée par
SDS-PAGE. Le profil électrophorétique de HSulf-2 ΔSG après traitement par ce mélange est
identique à HSulf-2 ΔSG traité uniquement par la PNGase F Figure III.8, puits 3. Ce résultat
indique clairement que HSulf-2 ΔSG est une glycoprotéine comprenant exclusivement des N-
glycanes. Il est important de noter qu’un traitement de HSulf-2 WT par le même cocktail de
glycosidase ne permet pas non plus de détecter la chaîne courte par gel SDS-PAGE. L’ensemble
de ces résultats montre que HSulf-2 est dépourvue de O-glycosylation conventionnelle (1 à 3
résidus osidiques) et présente de multiples N-glycosylations sur ses deux chaînes, auxquelles
s’ajoute sur la chaîne courte la liaison d’un polysaccharide sulfaté d’environ 23-25 kDa de type
chondroïtine sulfate.
109
Chapitre IV
Caractérisation de la modification post-traductionnelle de type
glycosaminoglycane présente chez HSulf-2
110
Nous avons mis en évidence dans le chapitre précédent, par la coloration spécifique des
polyanions sur gel SDS-PAGE, l’association à HSulf-2 d’un groupement de type chondroïtine
sulfate (CS) (paragraphe III.1 et 2). Cette chaîne de CS est très vraisemblablement liée de
manière covalente à la chaîne courte comme le suggère l’analyse C-PAGE de HSulf-2 avec une
coloration très intense du gel de concentration dans lequel l’enzyme entière est retenue. Il
faut noter que cette chaîne de CS peut également être retrouvée libre, car une bande fine est
observée dans le gel de séparation. La nature de type CS de cette chaîne est déduite de sa
sensibilité au traitement de HSulf-2 par la CSase ABC (paragraphe III.1).
L’objectif de ce chapitre est de caractériser plus finement ce polyanion de CS. Pour cela,
plusieurs stratégies ont été mises en place pour isoler le polyanion de HSulf-2 et l’analyser par
électrophorèse en gel et par spectrométrie de masse.
IV.1 Analyse C-PAGE du polyanion libéré de HSulf-2
Pour libérer la molécule de GAG liée à HSulf-2, celle-ci a été soumise à l’action de
l’Actinase E qui possède trois activités protéolytiques. Ce traitement vise à laisser la chaîne du
polyanion intacte et dépourvue de la composante protéique de HSulf-2. L’action de l’Actinase
E présente une spécificité de coupure au niveau des résidus Glu et Asp. Selon cette spécificité,
les coupures théoriques de HSulf-2 par l’Actinase E prévoient en particulier la libération du
nonapeptide 559FSGTGGLPD566 de la chaîne courte. Ce dernier contient le site de liaison de la
chaîne de CS au niveau de la sérine du motif SG (chapitre III, paragraphe III.2). L’analyse
d’oligo/polysaccharides par électrophorèse C-PAGE (27%) appliquée à HSulf-2 traitée au
préalable par l’Actinase E montre une bande de ~ 25 kDa, c’est à dire de masse moléculaire
apparente identique à celle de l’espèce polyanion faiblement détectée à partir de HSulf-2 non
traitée. Toutefois, dans les conditions employées ici, cette bande est d’intensité plus forte et
sans plus aucune coloration visible dans le gel de concentration Figure IV.1, puits 2. Ces
observations montrent que la protéolyse de HSulf-2 par l’Actinase E a libéré la chaîne de
polyanion de la plus grande partie de la composante protéique, lui permettant de migrer dans
le gel de séparation (27%). Ainsi, cette démarche expérimentale permet d’isoler, lorsqu’elle
est présente, une chaîne de GAG attachée à une protéine et de la détecter entière en gel.
Appliquée au mutant HSulf-2 ΔSG, dont le site de liaison de GAG « SG » a été muté en « AG »,
cette méthode ne révèle aucune bande caractéristique d’un polyanion visible sur le gel Figure
111
IV.1, puits 1, ce qui est en accord avec l’absence attendue de GAG dans Le mutant HSulf-2
ΔSG.
Figure IV.1: Analyse par C-PAGE (27%) du polyanion isolé à partir de HSulf-2. HSulf-2 sauvage (5 μg, piste 2) et
la forme mutante HSulf-2 ΔSG (5 μg, piste 1) traitées par l’Actinase E; marqueurs de poids moléculaire (2µg):
décasaccharide d’héparine 3 kDa (piste 3), dermatane sulfate 5 kDa (piste 4), héparine 16 kDa (piste 5),
dermatane sulfate 23 et 26 kDa (pistes 6 et 7). Coloration par le Bleu Alcian.
La masse moléculaire apparente d’environ 26 kDa, évaluée à l’aide de différents standards de
décasaccharide d’héparine et de polysaccharides de chondroïtine sulfate B (dermatane
sulfate), est en bon accord avec la masse moléculaire déduite de la différence de masse entre
HSulf-2 sauvage et de sa forme mutante (HSulf-2 ΔSG) mesurée par MALDI-TOF (paragraphe
II. 4 et III. 3).
D’un point de vue quantitatif, il faut noter que la bande correspondant au polyanion,
obtenue à partir du traitement de 5 ug d’enzyme HSulf-2 par l’Actinase E est bien visible sur
le gel C-PAGE coloré par le Bleu Alcian, sans besoin de recourir à une coloration plus sensible,
telle que le nitrate d’argent. Son intensité est comparable, bien qu’un peu plus faible, à celles
obtenues après dépôt de 2 µg de standards, visibles sur les pistes adjacentes Figure IV.1.
Lorsque HSulf-2 est séquentiellement traitée par l’Actinase E, puis par la CSase ABC,
l’analyse C-PAGE ne montre plus la bande correspondant au polyanion à ~25 kDa. Le profil C-
PAGE obtenu est donc identique à celui obtenu pour la forme mutante HSulf-2 ΔSG dépourvu
de GAG, confirmant la nature CS du GAG libéré de HSulf-2.
112
Figure IV.2: Effet de la chondroïtinase ABC sur le profil C-PAGE de HSulf-2. HSulf-2 (3 μg) avec (piste 1) et sans
(piste 2) traitement par la chondroÏtinase ABC, après digestion par la préparation de protéases Actinase E;
marqueurs de poids moléculaire (2 µg) : mélange de dermatane sulfate 23 kDa et de dextrane sulfate 5 kDa (piste
3), dermatane sulfate 26 kDa (piste 4). Double coloration par le Bleu Alcian et le nitrate d’argent.
IV. 2 Dépolymérisation de la chondroïtine sulfate liée à HSulf-2 par différentes
chondroïtinases
Afin de déterminer le type de chondroïtine sulfate liée à HSulf-2, la dépolymérisation de la
chaîne de CS a été testée par les trois chondroïtinases CSase AC, CSase B et CSase ABC de
spécificités de substrat distinctes Figure IV.3. La chondroïtinase AC (CSase AC) est une
enzyme de type lyase qui dégrade uniquement les chondroïtines sulfate A et C. Elle clive les
chaînes polysaccharidiques sulfatées et non sulfatées qui contiennent les liaisons β (1→4)
reliant les unités N-acétylgalactosamine (GalNAc) à celles d’acides glucuronique (GlcA). Selon
les données indiquées par le fournisseur, l'activité de l'enzyme CSase AC sur les CS-A, CS-C et
CS-B est respectivement de 1,0, 0,6 et 0,03. L’activité résiduelle observée sur la chondroïtine
sulfate B proviendrait de traces de CS-A et CS-C présentes dans la préparation de CS-B. La
chondroïtinase B (CSase B) dépolymérise uniquement le CS-B (dermatane sulfate, DS), en
catalysant le clivage de la liaison β (1→4) entre les unités GalNAc et acide iduronique (IdoA).
Elle est donc non fonctionnelle sur les CS-A et C. Enfin, la chondroïtinase ABC catalyse la
dégradation des CS-A (GlcA-GalNAc4S), CS-C (GlcA-GalNAc6S) et CS-B (IdoA-GalNAc4S). Cette
enzyme reconnaît également comme substrat les séquences non-sulfatées et di-sulfatées des
différentes chondroïtines.
113
Figure IV.3: Spécificités de substrat des différentes chondroïtinase sulfate AC, B et ABC.
Nous avons vérifié expérimentalement les spécificités attendues de ces trois CSases par une
analyse C-PAGE de leur action sur différentes CS. Les chaînes CS-A et CS-B ont été analysées
avant et après traitement par les chondroïtinases AC, B ou ABC Figure IV.4. La CSase AC
dégrade la chaîne de CS-A (Figure IV.4 pistes 1 et 2) et ne montre qu’une faible action sur CS-
B (Figure IV.4 pistes 5 et 7). La CSase B dégrade la chaîne de CS-B (Figure IV.4 pistes 5 et 6)
mais ne dégrade pas la chaîne de CS-A (Figure IV 4 pistes 1 et 3). Les résultats de l’analyse C-
PAGE confirment la stricte spécificité de la CSase B vis-à-vis de CS-B, et de l’activité de la CSase
AC sur la CS-A. Quant à la CSase ABC, elle dégrade les deux chaînes de CS-A et CS-B (Figure
IV.4 pistes 4 et 8) comme attendu.
114
Figure IV.4: Vérification des spécificités enzymatiques des chondroïtinases AC, B et ABC par analyse C-PAGE
(27%). CS-A (2µg, 26 kDa) non traité (piste 1) ou traité par CSase AC (piste 2), CSase B (piste3) ou CSase ABC (piste
4). CS-B (2µg, 23 kDa) non traité (piste 5) ou traité par CSase B (piste 6), CSase AC (piste 7) ou CSase ABC (piste
8). Coloration par le Bleu Alcian.
Nous avons ensuite étudié l’action des chondroïtinases AC, B et ABC sur le GAG de
chondroïtine sulfate préalablement libéré de la composante protéique de HSulf-2 par l’action
de l’Actinase E Figure IV.5. En absence de chondroïtinases, nous observons comme
précédemment décrit une bande correspondant à un GAG, bien résolue à environ 25 kDa
Figure IV.5 piste 3. Cette bande disparaît après traitement par la CSase AC spécifique des
chondroïtines sulfate A et C Figure IV.5 piste 4. De façon similaire, le GAG disparaît du gel
après traitement par la CSase B, spécifique de la chondroïtine sulfate B Figure IV.5 piste 5.
Figure IV.5: Identification du GAG de HSulf-2 et traitement par les chondroïtinases AC, B ou ABC puis analyse
C-PAGE (27%). CS-A (2µg, 26 kDa) non traité (piste 1) ou traité par CSase AC (piste 2), HSulf-2 (3µg) traitée par
l’Actinase E (piste3) puis traitée par CSase AC (piste 4), CSase B (piste 5) ou CSase ABC (piste 6). HSulf-2 traitée
par CSase AC (piste 7) ou par CSase B (piste 8). CSB (2µg, 23 kDa) non traité (piste 9) ou traité par CSase B (piste
10), double coloration Bleu Alcian et nitrate d’argent.
115
Néanmoins les profils électrophorétiques issus de la dégradation par les deux types de CSases
AC et B sont légèrement différents Figure IV.5 piste 4 et 5. En effet, une distribution plus
étendue des bandes, en termes de masse moléculaire apparente, est observée après
traitement à la CSase B Figure IV.5 piste 5 comparé au traitement par la CSase AC Figure IV.5
piste 4. D’autre part, plus aucune bande n’est visible suite au traitement par la CSase ABC,
indiquant une dégradation totale du GAG Figure IV.5 piste 6. La reconnaissance par les deux
Cases AC et B indique que le GAG possède des motifs de CS-A et /ou C et des motifs de CS-B.
Comme la dégradation par CSase AC et CSase B laisse apparaître un continuum de bandes
correspondant à des fragments plus ou moins longs, intenses sur le gel mais ne laissant pas
apparaître de larges fragments, nous émettons l’hypothèse que ces deux types de motifs
alternent avec des longueurs variables le long de la chaîne. La différence structurale entre les
chondroïtines sulfate A, C et la chondroïtine sulfate B réside au niveau de l’acide uronique. A
la différence de CS-A et CS-C, la CS-B comporte des acides iduroniques (IdoA) issus de
l’épimérisation en C5 d’un acide glucuronique (GlcA), alors que les chaînes CS-A et CS-C ne
comportent que des acides uroniques sous la forme glucuronique (Mikami and Kitagawa
2013).
Le traitement de HSulf-2 par la CSase AC ou par la CSase B directement sans traitement
préalable par l’Actinase E, ne permet plus de visualiser une coloration dans le gel de
concentration Figure IV.5 piste 7 et 8, indiquant que plus aucune chaîne de GAG de type CS
ne demeure liée à la protéine retenue dans le gel de concentration (voir Figure III.2). Ce
résultat conforte également l’hypothèse que la chaîne de GAG de HSulf-2 est constituée d’une
alternance de CS-A/C et CS-B le long de la chaîne, avec des tailles variables formant peut-être
des domaines précis définis en longueur et en type de CS. En effet, si la chaîne de CS est
constituée de domaines de types CS-A/C et CS-B alternant sur de longs domaines, nous
devrions visualiser une coloration dans le gel de concentration qui correspond à HSulf-2 ayant
conservé une partie de la chaîne de CS-A/C ou CS-B selon la CSase utilisée.
116
IV.3 Analyse des oligosaccharides de chondroïtine sulfate de HSulf-2 par MALDI-TOF
Afin de mieux connaître les caractéristiques structurales du type de chondroïtine
sulfate liée à HSulf-2, celle-ci a été soumise à l’action de la chondroïtinase ABC afin de former
des oligosaccharides, plus facilement analysables par spectrométrie de masse. Les
oligosaccharides obtenus ont été purifiés et dessalés par filtration sur module Toptip C18
(Bodet et al. 2017), puis analysés par MS MALDI-TOF. Les spectres de masse obtenus
présentent des ions correspondant à des oligosaccharides de type (GlcA/IdoA-GalNAc)n,
porteurs de groupements sulfate, ce qui confirme la nature polysaccharide sulfaté de type
GAG de la chaîne de polyanion liée à HSulf-2. Après une heure de dépolymérisation par la
CSAse ABC Figure IV.6 1, 2 et 3, les ions détectés correspondent majoritairement à des
disaccharides, avec encore une persistance d’octa- et hexasaccharides (Figure IV.6-3). Après
trois heures de dépolymérisation, le spectre de masse ne montre plus que des ions
correspondant à des disaccharides et à des tétrasaccharides (données non montrées), les
produits limitent de la dépolymérisation indiquant que la réaction est arrivée à son terme. Le
spectre MALDI-TOF acquis à partir de HSulf-2 non traitée par la chondroïtinase ABC ne montre
aucun ion correspondant à des oligosaccharides sulfatés.
L’interprétation des différents ions détectés a été effectuée en prenant en compte les
caractéristiques structurales suivantes :
- l’unité disaccharidique constitutive de la chondroïtine sulfate est UA-GalNAc,nS avec n=1 ou
2.
- la présence d’une insaturation en C4-C5 du résidu UA, introduite par l’activité lyase de la
CSase ABC.
Avec ces critères, quatre types d’oligosaccharides peuvent être identifiés après traitement de
la chaîne de CS de HSulf-2 par la CSase ABC pendant 1h Figure IV.6 1, 2 et 3.
117
118
Figure IV.6 Spectres MALDI-TOF des oligosaccharides de CS après action de la chondroïtinase ABC sur le GAG libéré de HSulf-2 par MALDI-TOF
pendant 1h. 1,2 et 3 correspondent à des agrandissements de différentes gammes de masse. Mode réflecteur, polarité négative, matrice
HABA/TMG2 à 9 mg/mL dopée avec 100 μM NaCl. La composition des oligosaccharides est donnée pour certains ions. Annotations: ΔDP8, 4S,
4Ac, 8Na, M=2012,13 Da ; ΔDP6, 3S, 3Ac, 6Na, M=1509,10 Da et ΔDP4, 2S, 2Ac, M= 1006,06 Da. *= ions de la matrice.
119
Par exemple, si l’on considère l’ion à m/z 1989.1, ce dernier peut être attribué à un
octasaccharide de CS comprenant 4 groupements sulfate, 4 groupements acétyle et incluant
8 atomes de sodium lorsqu’il est sous forme neutre totalement sodée (ΔDP8, 4S, 4Ac, 8Na,
masse molaire 2012,1 g.mol-1). Une telle composition/masse peut correspondre à 19
séquences (Tableau IV.1), même si certaines d’entre elles semblent peu probables compte
tenu des caractéristiques structurales connues des CS-A/C et CS-B. De manière comparable,
l’ion observé à m/z 1486,1 correspond à la forme [M-Na]- d’un hexasaccharide de CS (ΔDP6,
3S, 3Ac, 6Na de masse molaire 1509,1 g.mol-1), avec encore une fois plusieurs séquences
possibles (Tableau IV.1). Des écarts d’environ 22 u sont observables sur le spectre et
correspondent à des échanges Na/H, (ex : le m/z 1464,1 correspond à l’hexasaccharide décrit
précédemment, mais détecté sous la forme [M-2Na+H]-). Ce type d’échange de cations est
fréquent lors de l’analyse de molécules portant des groupements anioniques, et
particulièrement ceux formés de sulfates et d’acides carboxyliques. Des écarts de 101.9 u sont
également observés : ils correspondent à une perte d’un groupement sulfate sodé et
l’attachement d’un hydrogène, de masse théorique 101,94 u (Tableau A.1) (ex : le m/z 1588,0
correspond à un hexasaccharide, détecté sous forme [M-Na]- mais comprenant 4
groupements sulfate). Ce résultat indique que le polysaccharide de CS contient
majoritairement des disaccharides monosulfatés de type -(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)n- mais
aussi des motifs disaccharidiques portant deux groupements sulfate tel que -(GlcA/IdoA-
GalNAc4S6S)n. Les spectres MALDI obtenus confirment que le GAG lié à HSulf-2 est bien de
type chondroïtine sulfate.
120
Tableau IV.1: Tableau récapitulatif des ions détectés par MS MALDI-TOF et des
séquences possibles
dp m/z observé m/z théorique Séquences possibles
2
582.0
480.0
581.9
480.0
ΔUA-GalNAc4S6S
ΔUA-GalNAc4S/6S
4
1085.0
983.1
881.1
1085.0
983.1
881.1
(ΔUA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)
(ΔUA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)
(ΔUA-GalNAc4S/6S)2
(ΔUA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)
(ΔUA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)
(ΔUA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)
(ΔUA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)
6
1588.0
1588.0
(ΔUA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)2
(ΔUA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)
(ΔUA-GalNAc4S/6S)2-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)
(ΔUA-GalNAc4S6S)2-GlcA/IdoA-GalNAc)
(ΔUA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)
(ΔUA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)2
1486.1 1486.1 (ΔUA-GalNAc4S/6S)3
(ΔUA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)
(ΔUA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)
(ΔUA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)
(ΔUA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)
(ΔUA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)
(ΔUA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)
Les séquences en italiques représentent les moins abondantes.
121
dp m/z
observé
m/z
théorique Séquences possibles
8
1989.1 1989.1 (ΔUA-GalNAc4S/6S)4
(ΔUA-GalNAc4S/6S)2-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)
(ΔUA-GalNAc4S/6S)2-(GlcA/IdoA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)
(ΔUA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)
(ΔUA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)
(ΔUA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)
(ΔUA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)
(ΔUA-GalNAc4S6S)2-(GlcA/IdoA-GalNAc)2
(ΔUA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)2-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)
(ΔUA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)
(ΔUA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)2-(GlcA/IdoA-GalNAc)
(ΔUA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)
(ΔUA-GalNAc)2-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)2
(ΔUA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)2-(GlcA/IdoA-GalNAc)
(ΔUA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)
(ΔUA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)2
(ΔUA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)2-(GlcA/IdoA-GalN4S6S)
(ΔUA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)-(GlcA/IdoA-GalN4S6S)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S/6S)
(ΔUA-GalNAc)-(GlcA/IdoA-GalNAc4S6S)-(GlcA/IdoA-GalN4S/6S)2
122
IV.4 Analyse des disaccharides de la chondroïtine sulfate liée à HSulf-2 par
chromatographie HILIC couplée à la spectrométrie de masse
La chromatographie par interaction hydrophile (HILIC) est particulièrement adaptée à la
séparation de composés polaires et ionisables avec une phase mobile contenant
majoritairement de l’eau et une composante organique volatile. Dans notre cas, pour l’analyse
d’oligosaccharides sulfatés, il s’agit d’acétonitrile, ce qui facilite son couplage à une source
électrospray pour une analyse par spectrométrie de masse (ESI-MS). Cette méthode HILIC
couplée ou non à la spectrométrie de masse s’impose depuis quelques années pour la
séparation des glycanes et plus récemment pour celle d’oligosaccharides sulfatés issus de la
dépolymérisation des GAGs (N. Lin et al. 2017; Ouyang et al. 2016). Nous avons mis au point
une méthode de séparation et d’analyse des disaccharides de CS/DS par HILIC-ESI-MS afin de
séparer les disaccharides qui ne diffèrent que par le nombre et/ou la position des
groupements sulfate. Nous avons pour cela employé une colonne ZIC-HILIC de silice greffée
par des groupements zwitterioniques phosphorylcholine (colonne SeQuant® ZIC®-cHILIC 3µm,
100 A 150 X 2,1 mm PEEK coated HPLC column). Nous avons vérifié que cette méthode
permettait de séparer et détecter les disaccharides non-sulfatés, mono-sulfatés et di-sulfatés
de CS Figure IV.7. En outre, elle permet de discriminer les deux disaccharides mono-sulfatés
de CS-A (ΔUA-GalNAc4S) et CS-C (ΔUA-GalNAc6S) ne différant que par la position du groupe
sulfate, soit en C4 soit en C6 de la galactosamine Figure IV.7A-2 et 3, et de les détecter par
couplage en ligne ESI-MS avec une assez bonne sensibilité (25 pmol) sans recourir à leur
dérivation préalable. Cette méthode permet également de distinguer les deux disaccharides
di-sulfatés de CS-D (ΔUA2S-GalNAc,6S) et CS-E (ΔUA4S-GalNAc6S ) Figure IV.7B-2 et 3. Il est à
noter que l’injection d’un disaccharide standard, conduit à la détection de deux pics
chromatographiques, correspondant vraisemblablement à la séparation des anomères et .
Nous avons appliqué cette méthode à la caractérisation structurale des disaccharides
issus de la dépolymérisation par la chondroïtinase ABC de la chaîne de chondroïtine sulfate
liée à HSulf-2. HSulf-2 a été incubée pendant 24 h avec la Csase ABC pour obtenir un
rendement maximal de disaccharides. Les disaccharides ont ensuite été séparés de la
composante protéique de HSulf-2 et de la chondroïtinase par filtration centrifuge sur
membrane avec un seuil de coupure à 3 kDa. Le filtrat (50 µL) a ensuite été dilué avec 50 µL
d’acétonitrile pour être analysé par LC-(ZIC-HILIC)-ESI-MS Figure IV.7A-1, B-1 et C-1.
123
Figure IV.7: Analyse des disaccharides de la chondroïtine sulfate liée à HSulf-2 par LC-(ZIC-HILIC)-ESI-MS.
Chaque tracé présenté est un chromatogramme reconstruit avec la sélection d’un ion cible (EIC) d’une valeur m/z donnée
spécifique de chacun des disaccharides (dp2) de chondroïtines sulfate détectés sous forme [M-Na]- : A) dp2 mono-sulfaté,
extraction de l’ion à m/z 458 à partir de l’injection des (A-1) disaccharides issus de la dépolymérisation de la chaîne de GAG
de HSulf-2, (A-2) standard d’un disaccharide mono-sulfaté en position 6, (A-3) standard d’un disaccharide mono-sulfaté en
position 4 ; B) dp2 di-sulfaté, extraction de l’ion à m/z 538 à partir de l’injection des (B-1) disaccharides issus de la
dépolymérisation de la chaîne de GAG de HSulf-2, (B-2) standard d’un disaccharide di-sulfaté en position 2,6 (B-3) standard
d’un disaccharide di-sulfaté en position 4,6 ; C) dp2 non-sulfaté, extraction de l’ion à m/z 378 à partir de l’injection des (C-
1) disaccharides issus de la dépolymérisation de la chaîne de GAG de HSulf-2, (C-2) standard d’un disaccharide non-sulfaté.
Cette analyse révèle la présence de deux composés élués comme les disaccharides de
CS-A (ΔUA-GalNAc4S) et CS-C (ΔUA-GalNAc6S). Cette attribution a été confirmée à la fois par
les temps de rétention (injections en triplicat) et par les valeurs de m/z identiques aux deux
124
standards ΔUA-GalNAc4S et ΔUA-GalNAc6S Figure IV.7A. Ces résultats confirment que la
chaîne de chondroïtine sulfate de HSulf-2 est très majoritairement composée de disaccharides
de type CS-A et CS-C. Des traces de disaccharide de CS-0S (ΔUA-GalNAc) sont également
détectées Figure IV.7C, laissant penser que ce dernier est présent, mais de manière
minoritaire au sein de la chaîne de GAG liée à HSulf-2. La présence de disaccharides di-sulfatés
en position 2, 6 (CS-D) et/ou 4, 6 (CS-E) n’a pu être confirmé par ZIC-HILIC-ESI-MS Figure IV.7B.
Toutefois, l’analyse MALDI-TOF a clairement mis en évidence la présence de disaccharides
disulfatés Figure IV.6, tendant à prouver que dans ce cas, notre méthode par ZIC-HILIC-ESI-
MS n’est pas assez sensible pour le/les détecter.
En combinant les résultats obtenus par MALDI-TOF et par ZIC-HILIC-ESI-MS, nous
pouvons conclure que la chaîne de chondroïtine sulfate liée à HSulf-2, est majoritairement
composé de CS-A (80%) et CS-C (15%), avec des traces de CS-0S (≤5%) et de CS-2S (≤2%).
D’après les résultats de l’analyse ZIC-HILIC-ESI-MS, la chaîne de CS de HSulf-2 est
composé majoritairement de disaccharides monosulfatés en position C4 et C6 de la
galactosamine, c’est-à-dire de type A et C, ou B. Aucun disaccharide disulfaté, par exemple de
type D di-sulfaté en positions C2 de l’acide glucuronique et C6 de la galactosamine ou de type
E di-sulfaté en position C4 et C6 de la galactosamine, ne sont observés. L’existence de ces
motifs disulfatés au sein de la chaîne de CS/DS de HSulf-2 n’est cependant pas exclue car les
spectres MALDI-TOF des oligosaccharides issus de la dépolymérisation du GAG par la
chondroïtinase ABC montrent bien la présence de ces motifs disulfatés.
125
Chapitre V
Discussion générale et perspectives
126
Les endosulfatases HSulf-1 et HSulf-2 (EC: 3.1.6.- ; sulfo-esterase) représentent les
dernières hydro-FGly-sulfatases humaines découvertes à ce jour. Elles sont les seules hydro-
FGly-sulfatases localisées à la surface cellulaire à exercer une activité endosulfatase. Les HSulfs
ciblent les chaînes d’héparane sulfate (HS) composant majeur de la matrice extracellulaire,
sur lesquelles elles catalysent le clivage sélectif des groupements 6-O-sulfate. Les chaînes HS
sont des polysaccharides linéaires liés de manière covalente à un core protéique. Elles sont
impliquées dans de multiples fonctions biologiques permettant entre autres la fixation d’un
grand nombre de ligands (facteurs de croissance, chimiokines, morphogènes, etc.), dont elles
modulent l'activité biologique. L’interaction de ces ligands avec les HS dépend de son profil de
sulfatation, notamment de la distribution des groupements 6-O-sulfate situés au cœur des
domaines très sulfatés NS. Ainsi en modulant ce profil de sulfatation, les HSulfs contrôlent les
propriétés d’interaction de HS, ce qui fait de ces enzymes des acteurs cruciaux dans de
nombreux processus physiopathologiques. Ainsi, l’une des formes humaines, HSulf-2, module
la liaison de nombreux facteurs de croissance et angiogéniques, et à ce titre est clairement
identifiée comme une cible thérapeutique prometteuse dans la recherche anticancereuse.
Dans ce contexte, mon travail de thèse s’est inscrit dans une démarche visant à améliorer les
connaissances structurales de HSulf-2, en utilisant notamment la spectrométrie de masse
appliquée pour la première fois à l’étude de cette enzyme. L’objectif est d’établir les bases
structurales de son fonctionnement, pour permettre d’orienter le développement
d’inhibiteurs à visée anticancéreuse.
Masses expérimentales de HSulf-2 et de ses modifications post-traductionnelles
A ce jour, l’organisation structurale des HSulfs demeure méconnue. Synthétisées sous forme
de pro-protéine, ces endosulfatases ne deviennent mature qu’après un clivage par la furine.
Elles présentent une organisation moléculaire commune constituée de deux chaînes reliées
par des ponts disulfures. Du point de vue structural, les deux HSulfs se distinguent des autres
sulfatases principalement par leur domaine HD. HD joue un rôle dans la localisation
extracellulaire, reconnaissance du substrat HP/HS et est sans doute impliquée dans la régio-
sélectivité 6-O-sulfatase.
Les résultats présentés dans ce document, ont permis d’obtenir les premières données
structurales de HSulf-2 par MS, après un effort important d’optimisation des paramètres
d’analyse par MS MALDI-TOF et nano-LC-ESI-MS/MS. Parmi les données obtenues, nous
pouvons souligner:
127
(i) le premier séquençage protéique précis qui ne soit pas simplement, issu de l’analyse
génomique ou résultant du séquençage limité d’Edman
(ii) La localisation précise du résidu catalytique formylglycine (Cys 64, FGly) qui n’était,
jusqu’à présent, déterminé que par déduction à partir de séquences consensus des sulfatases
ou de mutations faites sur les deux cystéines contiguës de HSulf-1 (Cys87 et Cys88) et HSulf-2
(Cys88 et Cys89) (Morimoto-Tomita et al. 2002).
(iii) La masse moléculaire expérimentale de HSulf-2 entière et de ces deux sous-unités
grâce aux analyses MS MALDI-TOF (Tableau V. 1). Ces analyses ont également pu démontrer
une contribution significative des modifications post-traductionnelles. L’écart entre la masse
moléculaire théorique (basée sur la séquence en acides aminés) de HSulf-2 de 98,151 kg.mol-
1 et la masse expérimentale (MS MALDI-TOF) de 133,115 kg.mol-1, correspond à la
contribution de ces MPTs, soit une masse d’environ 34,964 kg.mol-1, dont 24,727 kg.mol-1 pour
la chaîne de chondroïtine sulfate greffée de manière covalente au domaine HD, et 10,237
kg.mol-1 pour les N-glycosylations réparties sur la chaîne longue et la chaîne courte.
Tableau V. 1: Masses moléculaires (kg.mol-1) de HSulf-2 et de ses deux chaînes
déterminées par MS MALDI-TOF
Masses moléculaires
HSulf-2 entière
Chaîne longue
Chaîne courte
Séquence en
acides aminés
98,151 59,338 38,831
Spectre MALDI-TOF de
HSulf-2 wt
133,115 65,764
/68,629
65,764
/68,629
Spectre MALDI-TOF de
HSulf-2 𝚫 SG
108,388 -- --
Les masses moléculaires expérimentales obtenues par analyse MS MALDI-TOF (Tableau V. 1)
sont plus précises que celles déduites des analyses par SDS-PAGE (Tableau V. 2). Néanmoins,
l’analyse SDS-PAGE combinée à l’action de la N-glycosidase sur HSulf-2 et son mutant HSulf-2
𝚫 SG met en évidence la présence de N-glycanes à la fois sur la chaîne longue et sur la chaîne
courte de HSulf-2 avec des contributions globales de masses apparentes estimées
respectivement à environ 14 et 13 kDa.
128
Tableau V. 2 : Masses apparentes (kDa) de HSulf-2 déduites des analyses SDS PAGE
Masses
moléculaires
HSulf-2 entière
Chaîne longue
Chaîne courte
Séquence en acides
aminés 98,151 59,338 38,831
Gel SDS-PAGE de
HSulf-2 wt 250-300 et
130
79 --
Gel SDS-PAGE de
HSulf-2 wt + PNGase
F
-- 65 --
Gel SDS-PAGE de
HSulf-2 𝚫 SG -- 79 54
Gel SDS-PAGE de
HSulf-2 𝚫 SG +
PNGase F
-- 65 41
La N-déglycosylation enzymatique augmente la couverture de séquence protéique obtenue
par analyse nano-LC-MS/MS et permet de localiser quatre sites où les Asn sont N-glycosylés
(N108, N147, N174 et N217) sur les sept existants de la chaîne longue. Une caractérisation
plus poussée des N-glycanes de HSulf-2 par MS MALDI-TOF, après leur isolement et
purification, est en cours au moment de la rédaction de ce document.
L’absence systématique de détection de la chaîne courte sur le gel d'électrophorèse, quelle
que soit la méthode de coloration protéique utilisée, peut enfin être expliquée. Nous avons
démontré qu’une chaîne de GAGs est liée de manière covalente à cette chaîne courte. Ceci
conduit à sa mobilité inattendue sur gel d’électrophorèse (masse apparente élevée à environ
97 kDa), et à une faible accessibilité des acides aminés pouvant interagir avec les molécules
du colorant. L’analyse par C-PAGE de HSulf-2 traitée avec l’Actinase E, nous a permis d’isoler
la chaîne de GAGs et d’estimer sa masse apparente à 26 kDa, alors qu’une valeur de 24,727
kg.mol-1 a été déduite des analyses MS MALDI-TOF.
129
Identification de la chondroïtine sulfate comme modification post-traductionnelle de HSulf-
2
La nature chondroïtine sulfate de la chaîne polyanionique liée à HSulf-2 a pu être démontrée
à l’aide de traitements enzymatiques par diverses chondroïtinases, combinés à des analyses
par électrophorèse en gel, MS-MALDI-TOF et par ZIC-HILIC-ESI-MS. Le traitement par les
chondroïtinases CSase AC, CSase B et CSase ABC, de spécificités de substrat distinctes montre
que la chaîne CS est hétérogène, composée de l’alternance de domaines de taille plus au
moins courte de chondroïtine sulfate (CS-A et/ou CS-C) et de dermatane sulfate (CS-B ou DS).
Les CS / DS sont des polysaccharides linéaires constitués d'unités disaccharidiques répétées
composées d'un acide uronique et d'un N-acétylgalactosamine. Néanmoins les chaînes CS
contiennent uniformément de l'acide glucuronique, alors que dans DS une partie de ces
résidus uroniques sont sous la forme épimère iduronique (IdoA). La présence de quelques
résidus IdoA est suffisante pour définir fonctionnellement le GAG en tant que DS plutôt que
CS (Béchard et al. 2001). Ainsi, la sensibilité de l'ensemble des chaînes GAG de HSulf-2 à la
chondroïtinase B, qui clive les liaisons glycosidiques du côté non réducteur des résidus
d'iduronate, définit la chaîne GAG comme une DS. L'importance de l'acide iduronique réside
dans la flexibilité que ce résidu introduit dans la chaîne du GAG, ce qui confère une certaine
souplesse conformationnelle sans doute essentielle pour les interactions avec les protéines
(Béchard et al. 2001). Nous concluons donc que HSulf-2 est un protéoglycane qui contient une
seule chaîne de GAG que nous notons CS / DS et qui fonctionnellement s’apparente à une
chaîne de DS.
La chaîne de CS / DS empêche donc la détection de la chaîne courte sur le gel SDS-PAGE
qui ne redevient détectable qu’après déGAGosylation par traitement de HSulf-2 à la CSase
ABC. De plus, la mutation de HSulf-2 sur ses deux motifs SG (uniques sites d’ancrage protéique
des GAGs) résulte en une variante de l’enzyme, HSulf-2 ΔSG, dépourvue de la chaîne de CS /
DS et parfaitement détectable sur gel d’électrophorèse (Thèse d’Amal Seffouh,
Caractérisation Biochimique et fonctionnelle de l’enzyme HSulf, université Grenoble Alpes,
2016).
Par ailleurs, Tang et al. (Tang and Rosen 2009) rapportent la détection les deux chaînes
de HSulf-2 (75 kDa et 50 kDa) sur gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie. Dans cette étude,
la bande correspondant à la chaîne courte apparait très diffuse comparée à celle de la chaîne
longue. Morimoto-tomita et al. (Morimoto-tomita et al. 2002) visualisent également la chaîne
130
courte de HSulf-2 aux alentours de 64 et 60 kDa par Western-Blot, en utilisant un anticorps
primaire dirigé contre l'étiquette Myc présente à l’extrémité C-terminale de HSulf-2. Au regard
de nos résultats, nous sommes enclins à supposer que dans leurs préparations, HSulf-2 soit
n’est pas GAGosylée, soit a perdu sa GAGosylation.
Nous observons également sur gel en absence de réducteur une bande comprise entre
250-300 kDa que nous attribuons à HSulf-2 entière avec toute ses PTMs, à savoir les chaînes
N-glycanes et celle de CS / DS. La masse molaire apparente 250-300 kDa de HSulf-2 est
supérieure à la masse déterminée par MS MALDI-TOF (133,115 kg.mol-1). Ce résultat laisse
penser que la bande à 130 kDa, également visible sur le gel, correspondrait à la forme
dégagosylée de HSulf-2 (sans CS / DS mais avec les N-glycanes) et présentant une masse de
108,388 kg.mol-1 par MS MALDI-TOF.
L’ensemble de ces résultats suggère une hétérogénéité de HSulf-2 présentes sous deux
formes avec et sans CS.
Afin de vérifier la présence de CS/DS sur l’enzyme in cellulo, nos collaborateurs de
l’Université de Grenoble Alpes (Institut de Biologie Structurale – IBS) ont vérifié l’état de
GAGosylation de HSulf-2 endogène secrétée naturellement dans le milieu conditionné des
cellules MCF-7, EA.hy926 et MEF. HSulf-2 endogène a été analysée par Western-Blot en
utilisant un anticorps anti-HSulf-2 dirigé contre l’extrémité C-terminale de la chaîne courte
(anti-C-ter HSulf-2, polyclonal de lapin, abcam®). Aucune bande correspondante à la chaîne
courte n’a pu être détectée, excepté après prétraitement avec la Chondroitinase ABC du
milieu conditionné. Ces résultats préliminaires confirment que HSulf-2 sauvage est porteuse
d’une chaîne de GAG de type CS / DS lorsque celle-ci est exprimée de manière endogène par
de nombreux types cellulaires (d’après la thèse d’Amal Seffouh, Caractérisation Biochimique
et fonctionnelle de l’enzyme HSulf, université Grenoble Alpes, 2016).
HSulf-2 possède deux sites susceptibles d’être GAGosylés: SG1 sur la chaîne longue et
SG2 sur la chaîne courte. Des mutants pour chacun des deux sites (HSulf-2ΔSG1 et HSulf-
2ΔSG2) ont été produits par nos collaborateurs de l’IBS. Le profil chromatographique du
mutant HSulf-2ΔSG1 est identique à celui de HSulf-2 sauvage alors que le chromatogramme
du mutant HSulf-2ΔSG2 est identique à celui de du double mutant HSulf-2ΔSG1SG2 et à celui
de HSulf-2 prétraité CSase ABC. En outre, la chaîne courte de HSulf-2ΔSG1 n’est visualisée sur
le gel électrophorétique, qu’après un traitement avec la CSase ABC, tout comme pour
l’enzyme sauvage. La nouvelle bande détectée est semblable à celle obtenue pour l’enzyme
131
endogène, le double mutant HSulf-2ΔSG1SG2 et le simple mutant HSulf-2ΔSG2. L’ensemble
de ces données indique clairement que des deux sites, un seul, le site SG2, porte la chaîne de
CS / DS. De manière similaire, HSulf-1 a été mutée sur trois sites SG présents au niveau du
domaine HD. Cependant, contrairement à HSulf-2, HSulf-1 ne porte aucune chaîne de GAGs
(Thèse d’Amal Seffouh, Caractérisation Biochimique et fonctionnelle de l’enzyme HSulf,
université Grenoble Alpes, 2016).
Possibles rôles de la chaîne de la chondroïtine sulfate de HSulf-2
Les travaux menés au laboratoire, ainsi que ceux menés par nos collaborateurs à l’IBS,
identifient un assemblage jamais décrit jusqu’à présent, où une enzyme est associé à un GAG
de type chondroïtine sulfate, de telle sorte que l’on peut concevoir HSulf-2 comme un
Protéoglycane-chondroïtine sulfate (CSPG) dotée d’une activité 6-O-endosulfatase. Cette
découverte a été confirmée par plusieurs méthodes de séparation et d’analyse à la fois
protéomique et glycomique.
In vitro comme in cellulo, la chaîne de GAG semble avoir peu d’influence sur l’activité
enzymatique de HSulf-2 (arylsulfatase sur le pseudo substrat 4-MUS et 6-O-endosulfatase vis-
à-vis de HS et HP). Cependant, le mutant HSulf-2ΔSG semble être plus efficace (taux de
désulfatation de HS de HSulf-2ΔSG plus élevé comparé au HSulf-2 sauvage) que l’enzyme
sauvage pour la désulfatation de HS. La présence de la chaîne de GAG pourrait limiter l’accès
de l’enzyme à son substrat naturel, expliquant de ce fait la capacité supérieure de HSulf-2ΔSG
à se lier à l’HS. L’enzyme mutante est donc plus active, vraisemblablement grâce à une
meilleure capacité d’interaction avec les éléments de la surface cellulaire. Ces données
conduisent à émettre l’hypothèse que la chaîne de CS pourrait réguler l’activité de HSulf-2 à
la surface cellulaire. (D’après la thèse d’Amal Seffouh, Caractérisation Biochimique et
fonctionnelle de l’enzyme HSulf, université Grenoble Alpes, 2016).
Le domaine HD est impliqué dans la reconnaissance du substrat (Frese et al. 2009) et il est
également fortement basique (pI théorique 9,67). Puisque liée à ce domaine HD, la chaîne
CS/DS chargée négativement doit probablement interagir avec le domaine HD et par
conséquent peut masquer les sites de reconnaissance du substrat (HS/HP). HSulf-2 serait alors
comme maintenu écartée de son substrat naturel. Cela nous conduit à émettre l'hypothèse
selon laquelle la forme GAGosylée de HSulf-2 est peu active in vivo. Inversement, HSulf-2 dé-
GAGosylée pourraient représenter la forme optimale de l’enzyme active. Cette hypothèse
132
pose la question de l’existence éventuelle d’un système qui pourrait dégrader le GAG de type
CS de HSulf-2 dans le milieu extra-cellulaire. Un tel système de dépolymérisation extra-
cellulaire de GAGs est déjà connu avec l’héparanase secrétée agissant sur les protéoglycanes
à chaînes HS pour réguler leurs fonctions biologiques (Thakkar et al. 2017). A l’instar de ce
système, il est possible d’imaginer que HSulf-2 puisse être déGAGosylée directement dans
l’environnement extracellulaire par un système enzymatique encore inconnu, spécifique de
CS, et agissant directement à la surface cellulaire.
À ce jour, aucune chondroïtinase (CSase) dégradant spécifiquement CS / DS n'a été identifiée
chez l’homme. Les enzymes humaines capables de dégrader CS appartiennent à la famille des
hyaluronidases (HAases) (EC 3.2.1.35). Parmi les six HAases humaines, trois sont actives sur
CS : HYAL-1, PH20 et HYAL-4 sont des endo-βN-acetylhexosaminidases catalysant l’hydrolyse
des liaisons (1-> 4) entre les résidus N-acétyl-β-D-glucosamine et D-glucuronate dans HA à des
pH 3,8, ~7 et 4,5-5, respectivement (W. Wenshuang, W, and Fuchuan 2017). Les HAases HYAL-
1 et PH20 sont des enzymes pouvant dégrader AH mais aussi CS à faible teneur en sulfate (W.
Wenshuang, W, and Fuchuan 2017). Récemment une étude a montré que la HYAL-1 hydrolyse
le CS-A plus rapidement que HA (Yamada 2015). En revanche, HYAL-4 est spécifique de CS et
ne digère pas HA (Kaneiwa et al. 2012; W. Wenshuang, W, and Fuchuan 2017). De ce fait,
HYAL-4 est la seule endo-hydrolase spécifique des CS identifiée à ce jour chez l’homme. Les
trois HAases précédemment citées ont des localisations cellulaire différentes: l’HYAL1 en plus
de sa location lysosomale et également sécrétée dans le milieu extracellulaire (Frost et al.
1997). PH20 est localisée au niveau de la membrane cellulaire, liée au glycosyl phosphatidyl-
inositol (GPI) (W. Wenshuang, W, and Fuchuan 2017). Enfin HYAL4 semble être attachée aux
membranes acrosomales du sperme par ancrage au GPI (Kaneiwa et al. 2012). L’ensemble de
ces données suggèrent que le système qui pourrait dégrader le GAG de type CS de HSulf-2
dans le milieu extracellulaire est une HAase. Il sera intéressant d’étudier l’activité des HAases
(HYAL-1, PH20 et HYAL-4) sur le CS de HSulf-2 et leur impact sur les propriétés d’interaction et
catalytiques de HSulf-2.
La prédiction de structures secondaires effectuée sur HSulf-2 avec le logiciel PSIPRED
révèle que la chaîne de GAG est portée par une boucle complètement déstructurée, et sans
doute sensible à la dégradation protéolytique. Une seconde hypothèse possible, est que la
GAGosylation de HSulf-2 peut être régulée, directement dans l’environnement extracellulaire,
133
sous l'action concertée de protéases et d'anti-protéases (Thèse d’Amal Seffouh,
Caractérisation Biochimique et fonctionnelle de l’enzyme HSulf, université Grenoble Alpes,
2016).
Structure de HSulf-2
A ce jour, aucune structure cristallographique n’a été décrite pour les Sulfs. Nos
collaborateurs de l’IBS, ont réussi à obtenir les premiers cristaux de HSulf-2 (labs, H.,
https://embl.fr/htxlab/ sur la plateforme de Robocrist, IBS) qui se sont cependant révélés non
diffractants. Ce résultat négatif est peut-être dû à la présence de la chaîne de chondroïtine
sulfate. La cristallisation du mutant HSulf-2𝚫SG2 ou de formes tronquées de HSulf-2 serait une
perspective possible pour obtenir des cristaux exploitables. En raison de la grande similitude
de l’organisation structurale de HSulf-1 avec HSulf-2, et de l’absence de GAGosylation de
HSulf-1, cette dernière constitue également un sujet d’étude intéressant.
Une alternative à ces expériences de cristallographie est le marquage de l’enzyme par
des radicaux hydroxyles formés sous rayonnement synchrotron. Cette méthodologie a été
développée au laboratoire pour résoudre la structure de biomolécules résistantes aux
techniques bio-structurales usuelles (RX, RMN). Elle consiste en la photolyse des molécules
d’eau constituant la première couche de solvatation de la protéine, ce qui crée des radicaux
hydroxyles au contact direct de la surface de la protéine. Ces radicaux extrêmement réactifs,
vont oxyder les résidus exposés au solvant, qui seront ensuite identifiés par MS. Cette
méthode renseigne donc sur les domaines de la protéine repliés ou masqués du fait
d’interactions ou de modifications conformationnelles. De telles expériences ont été
effectuées avec Hsulf-2 mais les interprétations n’ont pu être achevées au moment de la
rédaction de ce document. Des informations complémentaires sont attendues de la
comparaison des surfaces accessibles au solvant entre HSulf-2 et la forme mutante HSulf-
2ΔSG1SG2 dépourvue de CS / DS. En outre, la comparaison entre les domaines accessibles au
solvant de HSulf-2 sauvage et le complexe HSulf-2-substrat nous permettrons de déterminer
le domaine d’interaction de HSulf-2 avec son substrat.
L’alignement des séquences d'acides aminés de HSulf-2 avec la sulfatase ATSA de P.
Aeruginosa PAOI (P51691), la sulfatase de référence utilisée pour illustrer les cinq signatures
des hydro-FGly-sulfatases à partir de la base de données UniProt (Barbeyron et al. 2016),
révèle chez HSulf-2 la présence de tous les résidus caractéristiques des cinq signatures de
toutes les hydro-FGly-sulfatases (Figure V. 1).
134
Ainsi, les résidus de la première signature catalytique Cys51, Arg55, Pro53, Thr60 et Gly61
pour ATSA (P51691), sont également présentent chez HSulf-2 avec Cys88, Arg92, Pro90, Thr97
et Gly98. Quant aux résidus de la deuxième signature Gly105, Tyr106, Gly112 et Lys113 pour
ATSA, Gly135, Tyr136, Gly142 et Lys143 sont identifiés chez HSulf-2. Les résidus impliqués
dans la liaison de l’ion de calcium représentent la troisième signature : Asp13, Asp14 pour
ATSA et Asp52 et Asp53 pour HSulf-2. La quatrième signature concerne la séquence liant le
second ion de calcium : Asp317 et Asn318 pour ATSA et Asp317 et His318 pour HSulf-2. Enfin,
la cinquième signature de fonction inconnue pour les résidus Pro200 et His211 d’ATSA et
Pro248 et His259 d’HSulf-2 (voir le paragraphe I.1.4 et I.1.5. pour plus de détails).
A partir d’alignements multiples, d'autres acides aminés hautement conservés (à plus de 91%
de conservation) ont été identifiés (en rouge dans la Figure V. 1) notamment les résidus
Asp291, Lys375, Asp409, Thr413, Gly437 et Asp495 pour la sulfatase ATSA. Cependant, ils sont
localisés dans des séquences consensus très courtes ou associés à de nombreux résidus peu
conservés, et ne peuvent donc pas être retenus comme motif consensus spécifiques de la
famille des FGly-sulfatases. Néanmoins, l’inspection de la structure cristalline de ATSA (PDB:
1HDH) montre que ces résidus sont cruciaux pour le repliement protéique et donc sa
structuration. Tous ces acides aminés sont également conservés chez HSulf-2 avec Asp291,
Asp364, Thr368, Gly383 excepté Asp495 remplacée par la Gly470 chez HSulf-2, et Lys375
importante pour l’activité catalytique d’ATSA, et sans équivalent chez HSulf-2 (Barbeyron et
al. 2016).
135
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN MGPPSLVLCLLSATVFSLLGGSSAFLSHHRLKGRFQRDRRNIRPNIILVLTDDQDVE-LG 59
SP|P51691|ARS_PSEAE ---------------------------------------MSKRPNFLVIVADDLGFSDIG 21
. ***::::::** ... :*
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN SMQVM--NKTRRIMEQGGAHFINAFVTTPMCCPSRSSILTGKYVHNHNTYTNNE-----N 112
SP|P51691|ARS_PSEAE AFGGEIATPNLDALAIA-GLRLTDFHTASTCSPTRSMLLTGTDHHIAGIGTMAEALTPEL 80
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SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN CSSPSWQAQHESR--TFAVYLNSTGYRTAFFGKYLNEYNGSYVPP--GWKEWVGLLKN-S 167
SP|P51691|ARS_PSEAE EGKPGYEGHLNERVVALPELLREAGYQTLMAGKWHLGLKPEQTPHARGFERSFSLLPGAA 140
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SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN RFYNYTLCRNGVKEKHGSDYSKDYLTDLITNDSVSFFRTSKKMYPHRPVLMVISHAAPHG 227
SP|P51691|ARS_PSEAE NHYGFEPP-----------Y--DESTPRILKGTPALYVEDERYLD----------TLPEG 177
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SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN PEDSAP--QYSRLFPNASQHITPSYNYAPNPDKHWIMRYTGP------------------ 267
SP|P51691|ARS_PSEAE FYSSDAFGDKLLQYLKERDQSRPFFAYLPFSAPHWPLQAPREIVEKYRGRYDAGPEALRQ 237
.* : : : :: * : * * ** ::
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN --------------------MKPIHMEFTNMLQRKRLQ----------TLMSVDDSMETI 297
SP|P51691|ARS_PSEAE ERLARLKELGLVEADVEAHPVLALTREWEALEDEERAKSARAMEVYAAMVERMDWNIGRV 297
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SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN YNMLVETGELDNTYIVYTADHGYHIGQFGLVK---------------------GK----- 331
SP|P51691|ARS_PSEAE VDYLRRQGELDNTFVLFMSDNGAEGALLEAFPKFGPDLLGFLDRHYDNSLENIGRANSYV 357
: * . ******:::: :*:* . . : . *:
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN ------------------SMPYEFDIRVPFYVRGPNVE-AGCLNPHIVLNIDLAPTILDI 372
SP|P51691|ARS_PSEAE WYGPRWAQAATAPSRLYKAFTTQGGIRVPALVRYPRLSRQGAISHAFATVMDVTPTLLDL 417
:: : .**** ** *.:. *.:. :. :*::**:**:
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN AGLDIPADMD-GKSILKLLDTERPVNRFHLKKKMRVWRDSFLVERGKLLHKRDNDKVDAQ 431
SP|P51691|ARS_PSEAE AGVRHPGKRWRGREIAE--------------PRGRSWLGWLSGE-----------TEAAH 452
**: *.. *:.* : : * * . : * . *:
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN EENFLPKYQRVKDLC-QRAEYQT---ACEQLGQKWQCVEDATGKLKLHKCKGPMRLGGSR 487
SP|P51691|ARS_PSEAE DENTVTGWELFGMRAIRQGDWKAVYLPAPVGPATWQLYDLARDPGEIHDLADS----QPG 508
:** : :: . . ::.:::: . .** : * . ::*. .
Figure V. 1: Alignement partiel des séquences d'acides aminés de HSulf-2 et de la sulfatase ATSA de P.
Aeruginosa PAOI (P51691) :
Première signature catalytique : Cys51 et Arg55 Pro53 Thr60 et Gly61 pour ATSA (P51691) / Cys88 et Arg92 Pro90 Thr97 et Gly98 pour HSulf-2. Deuxième signature : Gly105, Tyr106, Gly112 et Lys113 pour ATSA (P51691) / Gly135, Tyr136, Gly142 et Lys143 pour HSulf-2. Troisième signature, séquence de liaison à l’ion de calcium : Asp13, Asp14 pour ATSA (P51691) / Asp52, Asp53 pour HSulf-2. Quatrième signature, séquence de liaison de second ion de calcium : Asp317 et Asn318 pour ATSA (P51691) / Asp317 et His318 pour HSulf-2.Cinquième signature Pro200 et His211 pour ATSA (P51691) et Pro248 et His259 pour HSulf-2. Acides aminés hautement conservés (à plus de 91% de conservation) et qui ne font pas partie des consensus spécifique à la famille des FGly-sulfatases.
Alignement UniProt (http://www.uniprot.org/align/) de la séquence d’acides aminés de HSulf-2, ATSA (P51691)
L’analyse des structures cristallines des six hydro-FGly-sulfatases humaines souligne
l’existence de résidus du site actif, très conservés et presque complètement superposables
(Figure I. 6b). Dans l’optique de la recherche d’inhibiteurs ciblant entre autres le site actif, il
nous a semblé intéressant de chercher à repérer les homologues de ces résidus au sein de
HSulf-2. Nous avons pour cela exploiter la structure cristallographique de la sulfatase humaine
Iduronate 2-sulfatase (IDS_HUMAN ou P22304,), très récemment décrite (Demydchuk1 et al.
2017). L’alignement de la séquence protéique de HSulf-2 avec celle de IDS nous a permis de
136
repérer des résidus de HSulf-2 équivalents à ceux de la poche catalytique de IDS (Figure V. 2
et 3). L’alignement a révélé que huit résidus (D45, D46, C84, R88, K135, H229, D334 et H335)
sur les douze du site actif de IDS sont hautement conservés chez HSulf-2 (D52, D53, C88, R92,
K143, H226, D317 et H318) Figure A.3. Parmi ces résidus, on distingue les résidus C88 et R92
comme faisant partie de la première signature des hydro-FGly-sulfatase, K143 appartenant à
la deuxième signature, D52 et D53 à la troisième signature représentant deux des quatre
résidus responsables de la liaison de l’ion de calcium, et enfin D317 et H318 relevant de la
quatrième signature des hydro-FGly-sulfatase.
Figure V. 2: Représentation des interactions des résidus aminés de la poche catalytique de la sulfatase humaine
IDS (IDS_HUMAN) avec le résidu FGS 84 lié au groupe sulfate. Les liaisons hydrogène (lignes pointillées jaunes)
sont affichées. Les résidus homologues présents chez HSulf-2 sont précisés (en vert) d’apés (Demydchuk1 et al.
2017).
137
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN MGPPS-----LVLCLLSATVFSLLGGSSAFLSHHRLKGRFQRDRRNIRPNIILVLTDDQD 55
SP|P22304|IDS_HUMAN MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSE------------TQANSTTDALNVLLIIVDDLR 48
* ** * * *: ::* **.. * : . *::*::.**
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN VELGSMQV---MNKTRRIMEQGGAHFINAFVTTPMCCPSRSSILTGKYVHNHNTYTNNEN 112
SP|P22304|IDS_HUMAN PSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNS- 107
.**. . . : . . * ***. :*.*** *:***: .. . * *.
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN CSSPSWQAQH-ESRTFAVYLNSTGYRTAFFGKYLNEYN----GSYVPPGWKEWVGLLKNS 167
SP|P22304|IDS_HUMAN ----YWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSE 163
*:.: : *: *::..** * .** :: . * .*. ...
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN RFYNYTLCRNGVKEKHGSDYSKD--------YLTDLI-TNDSVSFFRTSKKMYPHRPVLM 218
SP|P22304|IDS_HUMAN KYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLE--KMKTSASPFFL 221
:: * . **. * *.. . * * *::::.::. * *.::
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN VISHAAPHGPEDSAPQYSRLFPNASQHITPSYNY----APNPDKHWI----------MRY 264
SP|P22304|IDS_HUMAN AVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNI 281
.:.: ** * ::.:*:* . ::*. : * : *: :.
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN TGPMKPIHMEFTNMLQRKRLQTLMSVDDSMETIYNMLVETGELDNTYIVYTADHGYHIGQ 324
SP|P22304|IDS_HUMAN SVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGE 341
: * ** ::* . :::. : :: :* .: : . * : :.* *.:*:***: :*:
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN FGLVKGKS-MPYEFDIRVPFYVRGPNV-----------------------EAGCLNPHIV 360
SP|P22304|IDS_HUMAN HGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLV 401
.* * : .: : *** * .. * * . .:*
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN LNIDLAPTILDIAGLDIPADMDGKSILKLLDTERPVNRFHLKKKMRVWRDSFLVERGKLL 420
SP|P22304|IDS_HUMAN ELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPV-------------PSFHVELC----------REGKNL 438
:.* **: .:***::* **:: ..** *
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN HKRDNDKVDAQEENFLPKYQRVKDLCQRAEYQTACEQLGQKWQCVEDATGKLKLHKCKGP 480
SP|P22304|IDS_HUMAN LKH-FRFRDLEEDPYLPGNPRE--LIAYSQYPRPS--DIPQWNSDKPSLKDIKIMGYS-- 491
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Figure V. 3: Alignement partiel des séquences d'acides aminés de HSulf-2 et de la sulfatase la sulfatase
humaine IDS (IDS_HUMAN ou P22304, Iduronate 2-sulfatase)
Alignement UniProt (http://www.uniprot.org/align/) de la séquence d’acides aminés de HSulf-2, ATSA (P51691)
Chez la sulfatase humaine IDS, les résidus conservés H138 et H229 n’appartenant à aucune
signature, jouent vraisemblablement un rôle important dans le mécanisme catalytique. En
effet, ils établiraient des contacts directs avec les groupes hydroxyles géminaux du résidu FGly
hydraté et les atomes d’oxygène du groupement sulfate, qui dans la structure de IDS sont
reliés sous forme d’un intermédiaire réactionnel d’ester sulfate du résidu FGly (FGS). Ces deux
résidus pourraient avoir leurs homologues avec les résidus N146 et H226 chez HSulf-2. Les
groupements chargés positivement, R88, K135 et K347, équivalents chez HSulf-2 à R92, K143
et G330, établissent plusieurs liaisons au site catalytique: R88 stabilise l'orientation des
résidus impliqués dans la liaison aux métaux; K135 interagit avec D45 pour orienter
correctement la chaîne latérale pour fixer les métaux. D45 et D334, équivalents chez HSulf-2
à D52 et D317, interagissent via le métal avec les hydroxyles géminaux de FGS. (Figure V. 3)
(Demydchuk1 et al. 2017).
138
Parmi les six cystéines de IDS (la séquence de 33-455 résidus), quatre forment des ponts
disulfure. Le pont disulfure entre C171 et C184 relie des brins β courts près du site de
reconnaissance du substrat, tandis que la liaison entre C422 et C432 participe à la stabilisation
d'une boucle exposée au solvant. Les deux ponts disulfure sont importants, car la mutation de
l'une de ces cystéines provoque le syndrome de Hunter, une mucopolysaccharidose de type II
(Demydchuk1 et al. 2017). Les cystéines impliquées dans la formation des ponts disulfure de
HSulf-2 ne sont pas identifiées. Nous supposons que HSulf-2 forme au moins un pont disulfure
reliant les deux chaînes. Au cours de ce travail de thèse, nous avons mis au point un protocole
de marquage différentiel des cystéines afin de distinguer les cystéines impliquées dans des
ponts disulfure de celles restées libres. Il est important de noter que ce protocole ne permet
pas de définir le couple de cystéines formant ces ponts dans l’hypothèse où au moins deux
ponts disulfure sont présents dans HSulf-2, une méthode complémentaire est donc nécessaire.
Nous proposons des expériences MS de fragmentation par transfert d’électron (ETD) pour
tenter d’identifier et localiser les PTMs et notamment les ponts disulfure.
139
Chapitre VI
Matériels et méthodes
140
VI.1 Solvants et réactifs
L’ensemble des réactifs et produits chimiques utilisés sont obtenus à la pureté la plus
élevée disponible auprès de sources commerciales. Tous les solvants utilisés sont de pureté
analytique.
- L’eau ultra-pure utilisée est produite par un appareil Milli-Q, Millipore.
- Acétonitrile, ≥99,9%, réf.34967, Sigma-Aldrich.
- Ethanol, ≥99%, réf.20821, VWR.
- Formaldéhyde, ≥36%, réf.47608, Sigma-Aldrich.
- Acide acétique, ≥99,7%, réf.320099, Sigma-Aldrich.
- Acide chlorhydrique, ≥37%, réf.258148, Sigma-Aldrich.
- Acide trifluoroacétique, ≥99,5%, réf.73645, Fluka.
- Acrylamide/bis-acrylamide 29/1 (40%; w/v), réf.A515.1, Roth.
- Bleu alcian 8GX, réf.A9186, Sigma-Aldrich.
- Carbonate de sodium, réf.S7795, Sigma-Aldrich.
- Chlorure de calcium, réf.C5670, Sigma-Aldrich.
- Chlorure de sodium, réf.S9625, Sigma-Aldrich.
- Glycérol, ≥99,5%, réf.453752, Carlo-Erba.
- Glycine, ≥99%, réf.G7126, Sigma-Aldrich.
- Hydroxyde de sodium, réf.51230, LABOSI.
- Nitrate d’argent, >99%, réf.58157, Sigma-Aldrich.
- Tampon phosphate salin (PBS), réf.P4417, Sigma-Aldrich.
- N,N,N,N-Tetraméthyléthylènediamine (Temed), réf.T8133, Sigma-Aldrich.
- Trizma hydrochloride, réf.T3253, Sigma-Aldrich
- InstantBlue™ Protein Stain, réf.ISB1L, Expedeon, Cambridgeshire, UK.
- 4-vinylpyridine, ≥95%, réf.V3877, Sigma-Aldrich
- Dermatane sulfate (DS) Ifremer
- Chondroïtine sulfate (CS-A) Sigma-Aldrich
141
VI.2 Enzymes
- PNGase F, ≥NGas 10,000 U/mL, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, (réf.V483A,
Promega).
- Endo F3, ≥ndo 8,000 U/mL, 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5, (réf.P0771S/L,
New England Biolabs).
- Endo H, ≥95%, 500,000 U/mL, 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7,5
(réf.P0702S/L, New England Biolabs).
- Protein Deglycosylation Mix II, ≥95%, 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 2,6 mM EDTA, pH 7.5,
(réf P6044S, New England Biolabs).
- Actinase E, ≥c U/mg, la poudre est solubilisée dans l’eau 5 mg/mL (réf.P6911, Sigma-Aldrich).
- Héparine lyase I (héparinase I), 200 mU/μL, 0,2% d’albumine bovine sérique (BSA),
GRAMPIAN ENZYMES. Les solutions commerciales sont diluées et aliquotées à 5 mU/μL dans
20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,005% BSA (dilution par 40).
- Héparine lyase II (héparinase II), 16,39 mU/μL, 0,2% BSA, GRAMPIAN ENZYMES. Diluées et
aliquotées à 4,09 mU/μL dans 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,05% BSA (dilution par 4).
- Héparinase lyase III (héparinase III), 76,92 mU/μL, 0,2% BSA, GRAMPIAN ENZYMES. Diluées
et aliquotées à raison de 3,125 mU/μL dans 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,0089% BSA (dilution par
24,6).
- Chondroïtinase AC, réf.E2039, Sigma-Aldrich. Poudre solubilisée dans 100 µL H2O,
reconstituant le tampon final 25 mM phosphate de potassium, pH 6,5, 150 mM NaCl; activité
0,1 U/μL.
- Chondroïtinase B, réf.CHB-ENZ, Iduron. 1U dans 5 µL 0,1M acétate de sodium pH 7,0, 1 mM
acétate de calcium, 0.1% BSA; diluée par 45 µL 0,1M acétate de sodium pH 7.0, 1 mM acétate
de calcium, activité finale 0,02 U/μL.
- Chondroïtinase ABC, 0,2% BSA, réf.C2905, Sigma-Aldrich. Poudre solubilisée dans 20 mM
Tris-HCl, pH 7,2 (20 mU/μL); aliquotée à 2 mU/μL dans 2 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,01% BSA.
- ASP-N, 2 µg solubilisés dans 50 µL H2O (0,04 µg/µl) reconstituant le tampon final 10 mM Tris-
HCl (pH 8,0), (réf.V162A, Promega).
- Trypsin/Lys-C, 20 µg resolubilisés dans 100 µL de « resuspension Buffer » (0,2 µg/µL)
reconstituant le tampon final, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) (réf.V5071, Promega).
142
- Chymotrypsine, 25 µg resolubilisés dans 50 µL de HCl 1 mM (0,5 µg/µL), (réf.V106A,
Promega).
- Glu C, 50 µg resolubilisés dans 100 µL H2O (0,5 µg/µL), (réf.V1651, Promega).
- Arg C, 10 µg resolubilisés dans 100 µL 50 mM Tris-HCl pH 7,7, 5 mM CaCl2, 2 mM EDTA (0,1
µg/µL), (réf.V1881, Promega).
VI.3 HSulf-2
L’enzyme HSulf-2 sous sa forme sauvage (WT) et mutante (SG) a été obtenue grâce à
une collaboration avec le Dr. Romain Vivès (Laboratoire Structure et Activité des
Glycosaminoglycanes à l’Institut de Biologie Structurale, Grenoble). HSulf-2 est reçue dans un
tampon Tris-HCl 50 mM, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7,5 (avec ou sans ajout
d’anti-protéases). Sa concentration comprise entre 0,57-2,48 mg/mL est déterminée par
mesure de l’absorption à 280 nm (NanoDrop, Thermo Scientific, ε= 166660 L.mol−1.cm−1).
143
VI.4 Électrophorèse des protéines sur gel de polyacrylamide en conditions
dénaturantes (SDS-PAGE)
VI.4.1 Préparation du gel
Les gels (7,3 × 8,3 × 0,1 cm ; hauteur × largeur × épaisseur) sont préparés en utilisant
le système Mini Protean 3 (Biorad). La préparation s’effectue comme suit:
Pour le gel de concentration (staking) à 5% d’acrylamide, mélanger :
- 3,05 mL d'eau,
- 625 µL d'acrylamide / bis-acrylamide (29:1) à 40%,
- 1,25 mL de Tris 0,5 M à pH 6,8,
- 50 µL de SDS à 10%,
- 25 µL de persulfate d’ammonium (APS) à 10%,
- 5 µL de TEMED.
Pour le gel de résolution (resolving) à 10% d’acrylamide, mélanger :
- 4,85 mL d'eau,
- 2,5 mL d'acrylamide / bis acrylamide (29:1) à 40%,
- 2,5 mL de Tris 1,5 M à pH 8,8,
- 100 µL de SDS à 10%,
- 50 µL d'APS à 10%,
- 5 µL de TEMED.
II.4.2 Préparation des échantillons et conduite de l’électrophorèse
Les échantillons de HSulf-2 (3-6 µg) non traités ou après traitement par la
Chondroïtinase ABC ou la PNGase F sont mis en solution dans le tampon Laemmli 1X en
présence ou absence de réducteur (tampon Laemmli à 5X : 4 mL 1,5 M Tris-Cl pH 6,8, 10 mL
glycérol, 5 mL β-mercaptoethanol ou 5 mL d’eau, 5 g SDS et 1 mL 1% bleu de bromophénol)
et chauffés à 95°C pendant 5 min, puis séparés par SDS-PAGE (10% ou 12% acrylamide). Les
marqueurs de poids moléculaires utilisés sont 97, 66, 45, 30, 20,1 et 14,4 kDa (kit Low
Molecular Weight Calibration Kit for SDS Electrophoresis, Amersham, réf.17-0446-01).
L’électrophorèse débute à une tension de 40 V puis augmente de 20 V par 20 min jusqu'à 120
V, maintenus ensuite pendant environ 90 minutes. Le tampon de migration est composé de
Tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1% pH 8,3.
144
VI.4.3 Coloration des protéines en gel.
***Pour visualiser les protéines sur le gel SDS-PAGE deux colorations peuvent être
effectuées :
II.4.3.a Coloration au bleu de Coomassie.
Le gel est recouvert avec une solution d’InstantBlue™ pendant 20 min sous agitation
douce, suivie d’une étape de décoloration dans l’eau.
II.4.3.b Coloration à l’argent.
- le gel est fixé dans l’éthanol 30%, acide acétique 10% pendant 20min.
- Laver le gel dans l’éthanol 20% pendant 10 min.
- Effectuer trois rinçages successifs de 10 min à l’eau.
- Sensibiliser le gel avec du thiosulfate de sodium 0,02% pendant 1 min.
- Laver deux fois à l’eau pendant 20 s à 4°C.
- Incuber le gel dans du nitrate d’argent 0,1% pendant 2 h à 4°C à l’abri de la lumière.
- Laver deux fois dans l’eau pendant quelques min à 4°C.
- Révéler les bandes à l’aide d’une solution de formaldéhyde 0,04% en carbonate de
sodium 2% (1 g de carbonate de sodium, 50 mL d’eau et 20 µL formaldéhyde).
- La coloration est arrêtée à l’aide d’une solution d’EDTA 25 mM pH 8.
VI.5 Électrophorèse des glucides sur gel de polyacrylamide (C-PAGE)
D’après un protocole précédemment établi au laboratoire (Bodet et al. 2017).
VI.5.1 Préparation du gel
Les gels (7,3 × 8,3 × 0,1 cm ; hauteur × largeur × épaisseur) sont préparés en utilisant
le système Mini Protean 3 (Biorad). La polymérisation est effectuée dans un tampon Tris-HCl
pH 7,8 composé de 6 et 27% de polyacrylamide/bis-acrylamide, respectivement pour le gel de
concentration et de résolution.
VI.5.2 Préparation des échantillons et conduite de l’électrophorèse C-PAGE.
HSulf-2 (3-6 µg) traitée ou non avec l’Actinase E 20% (m/m) et/ou la CSase ABC 10 mU
suspendue dans 10% de glycérol (3-5 µL de glycérol à 50%) et 10% de rouge de phénol (1 µL).
Les marqueurs de poids moléculaires utilisés sont : CS-B (ou DS) à 26, 23 et 5 kDa (1-2
μg par piste), héparine non fractionnée à 16 kDa (Celsus Laboratories Inc, Cincinnati, OH,
USA), décasaccharide d’héparine (DP-10) à 3 kDa (2 µg par piste). L’électrophorèse est
145
conduite à une tension constante de 250 V pendant 45 min dans le tampon de migration Tris
40 mM, acide acétique 40 mM à pH 7,8.
VI.5.3 Coloration des glucides en gel C-PAGE.
- Le gel est coloré par une solution de bleu Alcian à 0,5 % (m/v) dans un mélange
eau/acide acétique (98:2 ; v/v) pendant 1 h à température ambiante sous agitation douce.
- Une décoloration dans l’eau est réalisée pendant une nuit.
- Le gel est recouvert d’une solution aqueuse de nitrate d’argent à 0,4% (p/v) pendant
10 min, à température ambiante et à l’abri de la lumière.
- Le gel est rincé 3 fois avec de l’eau.
- Les bandes sont révélées avec une solution de carbonate de sodium à 7% (p/v) dans
un mélange aqueux de formaldéhyde à 0,08 % (v/v).
- Une solution aqueuse d’acide acétique à 5% (v/v) est ajoutée pour stopper la réaction.
Cette double coloration (bleu Alcian + nitrate d’argent) peut également être appliquée
aux gels SDS-PAGE de protéines pour mettre en évidence les groupements glucidiques poly-
anioniques portés par les protéines.
146
VI.6 Déglycosylation enzymatique de HSulf-2
VI.6.1 Action de la Peptidyl N-glycosidase F.
La PNGase F coupe la liaison N-glycopeptidique entre l’aspargine et le premier GlcNAc
de la chaîne glycosidique. La N-déglycosylation de HSulf-2 par la PNGase F est effectuée
en conditions dénaturantes selon le protocole du fournisseur Promega. Brièvement, 3
ug de HSulf-2 ont été mélangés avec 1 µL de SDS 5%, puis réduits avec 1 µL de DTT 1
M dans un volume final de 14 µL, et enfin traité par dénaturation thermique à 95 °C
pendant 5 minutes. L'échantillon est refroidi pendant 5 minutes à température
ambiante. 2 µl de tampon bicarbonate d'ammonium 50 mM, pH 7,8, et 2 µL de NP-40
à 10% ont été ajoutés au milieu réactionnel. La déglycosylation de HSulf-2 dénaturée
est alors initiée par l'addition de 2 µL de PNGase F recombinante, suivie d’une
incubation pendant 3 heures à 37 ° C.
- Congélation à -20°C ou ajout de tampon Laemmli 1X, puis chauffage à 95°C pendant
5 min pour une analyse par SDS-PAGE.
VI.6.2 Action de l’endoglycosydase H
L’endoglycosydase H (Endo H) coupe la liaison osidique après le premier résidu GlcNac
s’il s’agit d’une chaîne glycosidique mannosidique ou hybride. Mais cette enzyme est
inopérante lorsqu’il s’agit de N-glycanes complexes comportant des acides sialiques.
3 µg de HSulf-2 WT/SG sont traités en utilisant le protocole du fournisseur (New England
Biolabs) suivant :
- 3 µg de HSulf-2 sont ajoutés à 1 µL de Glycoprotein denaturing Buffer 2 10X, complété
avec de l’eau pour un volume final de 10 µL.
- Incubation à 100°C pendant 10 min
- Digestion en ajoutant 2 µL de GlycoBuffer 3 10X, 4 µL d’Endo H et 4 µL d’eau. Le
volume final de la réaction est de 20 µL.
- Un contrôle est réalisé en opérant le même processus mais, en remplaçant HSulf-2
par 4 µL d’eau.
147
- Ajout de tampon Laemmli 1X, puis chauffage à 95°C pendant 5 min pour une analyse
SDS-PAGE.
VI.6.3 Action de l’endoglycosydase F3
L’endoglycosydase F3 (Endo F3) coupe la liaison glycosidique après le premier résidu
GlcNac s’il s’agit d’oligosaccharides bianténnaires ou triantennaires complexes comportant
des acides sialiques et fucosylés ou non. 3 µg de HSulf-2 WT/SG sont traités en utilisant le
protocole du fournisseur (New England Biolabs) suivant :
La digestion de HSulf-2 est réalisée dans deux conditions distinctes. Dans la condition
1, le GlycoBuffer 4 10X (B1703S, Biolabs New England) à pH 4,5 est utilisé tandis que dans la
condition 2, le GlycoBuffer 3 10X (B1720S, Biolabs New England) pH 6 est utilisé. Ces deux
conditions ont été réalisées car le protocole indique que bien que le pH optimal de clivage
des glycanes fucosylés-biantennaires et triantennaires se situe à pH 4,5, celui des glycanes
fucosylés-biantennaires peut également avoir lieu à pH 6.
Condition 1 (pH 4,5) :
- 1 µL de GlycoBuffer 4 10x est ajouté à 3 µg de HSulf-2 et complété avec de l’eau afin
d’avoir un volume finale de 10 µL.
- Digestion en ajoutant 1 µL d’enzyme au mélange
- Incubation à 37°C toute la nuit.
Condition 2 (pH 6) :
- le même protocole est suivi en remplaçant 1 µL de GlycoBuffer 4 10X par 1 µL de
GlycoBuffer 3 10X.
Pour les deux conditions :
- Un contrôle est réalisé en suivant chacun des protocoles mais, en remplaçant 3 µg de
HSulf-2 par 4 µL d’eau.
- Ajout de tampon Laemmli 1X, puis chauffage à 95°C pendant 5 min pour une analyse
SDS-PAGE.
148
VI.6.4 Action du mélange de glycosydases « protein deglycosylation Mix II »
Le réactif enzymatique protein deglycosylation MIX II est un mélange des glycosydases
(New England Biolabs) suivantes:
-La PNGase F qui clive la liaison N-glycopeptidique entre l’aspargine et le premier
GlcNAc de la chaîne glycosidique
- La β1-4 Galactosidase S qui est une exoglycosidase hautement spécifique qui catalyse
l'hydrolyse des résidus de galactose liés en β 1-4 à partir d'oligosaccharides.
-La β-N-Acetylhexosaminidase qui catalyse l'hydrolyse des résidus β-N-
acétylgalactosamine et glucosamine terminaux des oligosaccharides.
-La α2-3,6,8,9 Neuraminidase A qui catalyse l'hydrolyse des résidus d'acide N-
acétylneuraminique α2,3, α2,6, α2,8 et α2,9 à partir de glycoprotéines et d'oligosaccharides
-La Endo-α-N-Acetylgalactosaminidase qui catalyse l’hydrolyse des noyaux 1 et 3 des
disaccharides liés aux serine et thréonine des protéines.
La réaction de N-déglycosylation de HSulf-2 est réalisée en conditions dénaturantes et
non dénaturantes suivant le protocole du fournisseur (New England Biolabs):
Conditions non dénaturantes :
- 3 µg de HSulf-2 sont ajoutés à de l’eau pour un volume final de 14,4 µL
- Digestion en ajoutant 1,8 µL de tampon de déglycosylation Mix Buffer 1 (B6044S,
Biolabs New England) et 1,8 µL de « Protein Peglycosylation Mix II ». Le volume final de la
réaction est de 18 µL
- Agitation douce pour mélanger l’échantillon
- Incubation à 25°C pendant 30 min
- Incubation 37°C toute la nuit.
- le même protocole est appliqué à la protéine contrôle Fétuine qui est une
glycoprotéine dont les O- et N-glycosylations sont bien documentées.
149
-Un contrôle est réalisé en suivant le même protocole mais en remplaçant HSulf-2 par
de l’eau.
Conditions dénaturantes :
- 3µg de HSulf-2 sont ajoutés à de l’eau pour un volume final de 14,4 µL.
- Ajout de 1,8µL de tampon de deglycosylation Mix Buffer 2 (B60045S, New England
Biolabs)
- Dénaturation thermique à 75°C pendant 10 min, puis refroidissement.
- Digestion en ajoutant 1,8 µL de « Protein deglycosylation Mix II ». Le volume final de
la réaction est de 18 µL
- Application d’une légère agitation.
- Incubation à 25°C pendant 30 min
- Incubation à 37°C toute la nuit
- Le même protocole est appliqué à la protéine contrôle Fétuine.
- Un contrôle est réalisé en suivant le même protocole mais en remplaçant HSulf-2 par
de l’eau.
Dans les deux conditions, ajout du tampon Laemmli 1X, puis chauffage à 95°C pendant
5 min pour une analyse SDS-PAGE.
VI.6.5 Action des Chondroïtinases
VI.6.5 a Chondroïtinase AC
- À 3 µg d’HSulf-2 (2 µL) traités ou non par l’Actinase E (volume final 7 µL), ajouter 2 µL
de CSase AC 0,2 U et 1 µL de 1,5 M de NaCl, volume final de la réaction 10 µL.
- Mélange au Vortex et centrifugation.
150
- Incubation pendant une nuit à 37°C.
- Analyse du milieu réactionnel par C-PAGE.
VI.6 5.b Chondroïtinase B
- À 3 µg d’HSulf-2 (2 µL) traités ou non par l’Actinase E (volume final 7 µl), ajouter 2 µL
de CSase B 0,04 U et 1 µL de tampon de digestion 1 M d’acétate de sodium pH 7,0 contenant
10 mM d’acétate de calcium, volume final de la réaction 10 µL.
- Mélange au vortex et centrifugation.
- Incubation pendant une nuit à 37°C.
- Analyse du milieu réactionnel par C-PAGE.
VI.6.5.c Chondroïtinase ABC
- À 3-6 µg d’HSulf-2, ajouter 5 µL de CSase ABC 10 mU dans le tampon de digestion
Tris-HCl 20 mM pH 7,2.
- Mélange au Vortex et centrifugation.
- Incubation pendant 1, 3, 20 h ou une nuit à 37°C.
- Analyse du milieu réactionnel par SDS-PAGE, C-PAGE ou MALDI-TOF MS.
VI.6.6 Héparinases I, II and III
- À 3 µg d’HSulf-2, ajouter 5 µL du mélange d’héparinases I II III (5 mU de chaque
héparinase) dans le tampon de digestion PBS 10 mM et CaCl2 3 mM pH 7,3.
- Mélange au Vortex et centrifugation.
- Incubation pendant 20 h à 25°C.
- Analyse du milieu réactionnel par SDS-PAGE, C-PAGE ou MALDI-TOF MS
151
VI.7 Digestion protéolytique de HSulf-2
VI.7.1 Digestion par l’Actinase E.
L’actinase E est un mélange de protéases coupant au niveau des groupements
carboxyliques des acides glutamique et aspartique. Appliquée à HSulf-2, l’actinase E permet
de libérer le GAG de la partie protéique de HSulf-2. 2 µL d’HSulf-2 (3 µg) sont ajoutés à 1,2 µL
d’actinase E à 0,5 mg/mL (20% m/m) dans 8,8 µL de tampon Tris-HCl 20 mM pH 7,2, soit un
volume final de 12 µL.
- Mélange au Vortex et centrifugation.
- Incubation 24 h à 37°C.
- Arrêt de la réaction par chauffage à 95°C pendant 15 mn.
- Le milieu réactionnel peut être soit conservé à -20°C, soit analysé par C-PAGE ou traité
par la CSase ABC.
VI.7.2 Digestion par la trypsine
VI.7.2.a Digestion en solution: La trypsine est une enzyme spécifique hydrolysant la
liaison peptidique du côté C-terminal d’une lysine ou d’une arginine, sauf si ces acides aminés
sont suivis par une proline. La protéolyse de HSulf-2 WT/SG en conditions dénaturantes
s’effectue comme suit :
- 1,2 à 2,26 µL de HSulf-2 (3 µg) sont ajoutés à 2,5 µL d’urée à 8 M (2 M final) et à 6,3-
5,24 µl de tampon 50 mM NH4HCO3 pH 8,0, et incubés pendant 1 h à température ambiante.
- Réduction par ajout de 2 µL de DTT (5 mM final) pendant 1 h à 37°C sous agitation
modérée.
- Alkylation par ajout de 1 µL d’IAA (20 mM final) pendant 45 min à température
ambiante et à l’abri de la lumière.
- Diminution de la concentration de l’urée à 1 M par ajout de 6 µL de tampon 50 mM
NH4HCO3 pH 8,0.
- Digestion en ajoutant 1 µL de trypsine à 0,4 µg/µL.
- Mélange au Vortex et centrifugation.
- Incubation une nuit à 37°C.
152
D’autres protéases ont été testées seules ou combinées à la trypsine, pour induire des
coupures supplémentaires et augmenter la couverture de séquence de HSulf-2 en solution.
VI.7.2.b Digestion en gel: Après révélation (Instant Blue) des protéines en gel SDS-
PAGE 10%, la digestion en gel est effectuée selon le protocole suivant :
- Excision de la bande de protéine désirée en la découpant en petits cubes de 1 mm3.
- Décoloration des cubes dans 50 µL de tampon 0,1 M NH4HCO3 pH 8,0 pendant 5 min.
- Mélange au Vortex et centrifugation.
- Lavage avec 50 µL d’acétonitrile pendant 5 min.
- Répéter l’opération précédente 3 fois.
- Réduction par ajout de 50 µL de DTT 10 mM final pendant 35 min à 56°C.
- Lavage avec 50 µL d’acétonitrile pendant 5 min.
- Lavage avec 50 µL de tampon 0,1 M NH4HCO3 pH 8,0 pendant 5 min.
- Lavage avec 50 µL d’acétonitrile pendant 5 min.
- Alkylation par ajout de 50 µL d’IAA 50 mM pendant 30 min à température ambiante
et à l’abri de la lumière.
- Lavage avec 50 µL d’acétonitrile pendant 5 min.
- Lavage avec 50 µL tampon 0,1 M NH4HCO3 pH 8,0 pendant 5 min.
- Lavage avec 50 µL d’acétonitrile pendant 5 min.
- Evaporation à sec (speed-vac) de l’acétonitrile.
- Digestion en ajoutant 1 µL de trypsine à 0,4 µg/µL et 39 µL tampon 0,1 M NH4HCO3
pH 8,0.
- Mélange au Vortex et centrifugation.
- Incubation une nuit à 37°C.
- Récupérer le surnageant.
- Re-suspension des morceaux de gel dans 50 µL d’une solution acétontrile/eau/acide
formique 60/40/0,1%; v/v/v).
- Sonication pendant 10 min à 37°C.
- Rassembler les deux surnageants.
- Evaporation à sec (speed-vac).
- Reprise dans 30 µL de solvant A pour une analyse par nanoLC-MS/MS.
153
VI.7.3 Digestion par la chymotrypsine en solution
La chymotrypsine clive spécifiquement les liaisons peptidiques à l’extrémité C-terminale des
résidus Tyr, Phe, Trp et Leu. Met, Ala, Asp et Glu peuvent aussi être clivés mais à un taux
beaucoup plus faible. La protéolyse de HSulf-2 WT par la chymotrypsine s’effectue comme
suit :
- 2 µL d’HSulf-2 (3 µg) ont été dilués dans 5,5 µL de Tris-HCl 100 mM, 10 mM CaCl2, pH
8,0 auxquels on a ajouté 2,5 µL d'urée 8 M (concentration finale 2,1 M) ; incubation pendant
1 h à température ambiante sous agitation modérée.
- Réduction par ajout de 1,2 µL de DTT (5,1 mM final) pendant 1 h à 30°C sous agitation
modérée.
- Alkylation par ajout de 1 µL d’IAA (21,5 mM final) pendant 45 min à température
ambiante et à l’abri de la lumière.
- Avant d'effectuer la digestion, ajout de 6,8 µL de 100 mM Tris-HCl , 10 mM CaCl2, pH
8.0 pour diluer l’urée à la concentration finale de 1 M
- Digestion en ajoutant 1 µl de le chymotrypsine à 0,5 µg/µl.
- Mélange au Vortex et centrifugation.
- Incubation une nuit à 25°C.
VI.7.4 Digestion par ASP-N
ASP-N est une endoprotéinase qui hydrolyse les liaisons peptidiques du côté N-terminal des
résidus acide aspartique et cystéine (Asp et Cys). La protéolyse de HSulf-2 WT par ASP-N
s’effectue comme suit :
- 2 µL d’HSulf-2 (3 µg) sont dilués dans 5 µL de NH4HCO3 100 mM, pH 8,0 auxquels on
ajoute 2,5 µL d'urée 8 M (concentration finale 2,1 M); incubation pendant 40 min à 26 °C sous
agitation modérée.
- Réduction par ajout de 1,1 µL de DTT (5,1 mM final) pendant 1 h à 30°C sous agitation
modérée.
- Alkylation par ajout de 1 µL d’IAA (21,5 mM final) pendant 45 min à température
ambiante et à l’abri de la lumière.
- Avant d'effectuer la digestion, ajout de 5 µL de NH4HCO3 100 mM, pH 8,0 (50 mM
final) pour diluer l’urée à la concentration finale de 1 M.
154
- Digestion en ajoutant 3,75 µL d’Asp-N à 0,04 µg/µL.
- Mélange au Vortex et centrifugation.
- Incubation une nuit à 37°C.
VI.7.5 Digestion par Glu-C
Glu-C clive spécifiquement à l'extrémité C-terminale des résidus acides aspartique ou
glutamique. La spécificité de l'enzyme est plus élevée au niveau des résidus glutamiques
lorsque la réaction est effectuée dans le tampon bicarbonate d'ammonium ou acétate
d'ammonium. La protéolyse de HSulf-2 WT par Glu-C s’effectue comme suit:
- 2 µL d’HSulf-2 (3 µg) sont dilués dans 5,5 µL de Tris-HCl 100 mM pH 7,5, auxquels on
a ajouté 2,5 µL d'urée 8 M (concentration finale 2 M); incubation pendant 1 h à température
ambiante 26°C sous agitation modérée.
- Réduction par ajout de 1,2 µL de DTT (5,3 mM final) pendant 1 h à 30°C sous agitation
modérée.
- Alkylation par ajout de 1 µL d’IAA (21 mM final) pendant 45 min à température
ambiante et à l’abri de la lumière.
- Avant d'effectuer la digestion Glu-C, 6,8 µL de Tris-HCl 100 mM pH 7,5 (50 mM final
concentration), pour diluer l’urée à la concentration finale de 1 M
- Digestion en ajoutant 1,5 µL de Glu-C à 0,5 µg/µL.
- Mélange au Vortex et centrifugation.
- Incubation une nuit à 37°C.
VI.7.6 Digestion par Arg C
Arg-C est une endopeptidase qui clive à l'extrémité C-terminale des résidus arginine, y compris
ceux à côté de la proline. Le clivage se produit également au niveau des résidus lysine. Le
traitement d’HSulf-2 WT par Arg C en conditions dénaturantes s’effectue comme suit:
- 2 µL d’HSulf-2 (3 µg) sont dilués dans 5,5 µL de de tampon d'incubation (Tris-HCl 50
mM pH 7,7, CaCl2 5 mM, EDTA 2 mM) auxquels on a ajouté 2,5 µL d'urée 8 M (concentration
finale 2 M); incubation pendant 1 h à 27 ° C sous agitation modérée.
- Réduction par ajout de 1,2 µL de DTT (5,1 mM final) pendant 1 h à 30°C sous agitation
modérée.
155
- Avant d'effectuer la digestion, 2 µL de tampon d'activation 10 X (Tris-HCl 50 mM pH
7,7, 50 mM DTT, 2 mM EDTA), et 4,8 µL de tampon d'incubation ont été ajoutés aux
échantillons pour atteindre une concentration finale d'urée de 1 M.
- Digestion en ajoutant 2 µL de Trypsine / Lys-C à 0,1 µg/µL.
- Mélange au vortex et centrifugation.
- Incubation une nuit à 37°C.
VI.8 Préparation des peptides protéolytiques pour l’analyse nanoLC-MS/MS
Les peptides de HSulf-2 issus de la digestion en solution ont été purifiés/dessalés deux
fois sur ZipTip C18 (Millipore) selon la procédure du fabricant pour éliminer l'urée. EIle
comprend une étape de pré-lavage du ZipTip C18 avec 100% d'acétonitrile, puis H2O/TFA
100:0,1 (v/v), suivie de l’élution des peptides avec les mélanges acétonitrile / eau / TFA (50:
50: 0,1 ; v/v/v) et acétonitrile / eau / TFA (80: 20: 0,1 ; v/v/v), successivement. Les peptides
élués (40 µL) sont séchés sous vide (speed-vac) et conservés à -80 °C jusqu'à l'analyse.
VI.9 Analyse des peptides par NanoLC-ESI-MS/MS
II.9.1 Instrument
Les analyses NanoLC-ESI-MS/MS sont effectuées sur un système de
chromatographie Ultimate 3000 (Dionex) couplé à un spectromètre de masse LTQ-
Orbitrap ™ XL (Thermo Scientific, San Jose, CA) équipé d'une source nanospray.
VI.9.2 Conditions de séparation chromatographique et paramètres d’analyse MS
Les peptides séchés sous vide sont resuspendus dans 30 µL de solvant A
(acétonitrile/eau/acide formique, 2 :98 :0,1; v/v/v). 5 µL de la solution peptidique sont
injectés à un débit de 20 μL / min sur une pré-colonne C18 (C18 Acclaim PepMap, 5 mm x 300
μm, taille des particules 5 μm, porosité 100 Å, Dionex), et dessalés et concentrés pendant 5
min dans le solvant A (acétonitrile/eau/acide formique 2:98:0,1; v/v/v). Ensuite, la séparation
des peptides est effectuée sur une colonne capillaire C18 (C18 Acclaim PepMap, 15 cm x 75
μm, taille des particules 3 μm, porosité 100 Å, Dionex) à un débit de 300 μL / min, selon le
gradient suivant: 0% de solvant B (acétonitrile / eau / acide formique 80 :20 :0,1; v/v/v)
pendant 6 min, 0 à 70% de solvant B en 49 min, 70% à 100% de solvant B en 2 min, 100% de
156
solvant B pendant 10 min et enfin décroissance à 0% de solvant B en 3 min. La colonne est
finalement ré-équilibrée avec 100% de solvant A pendant 15 min. Le capillaire de nébulisation
(tip emitter) utilisé est en silice, avec une extrémité en verre (Pico-tip, FS360-50-15-CE-20-
C10.5, New Objective, Woburn, MA, USA).
Les analyses par spectrométrie de masse sont effectuées en mode d'ionisation
positive. Le contrôle automatique du gain (AGC), le temps maximal d’injection, et le nombre
de µscans sont respectivement de 106, 500 ms et 1 en FTMS, et 104, 100 ms et 1 en ITMS. Les
spectres MS sont enregistrés dans l’Orbitrap dans la gamme de m/z 250-1600, avec une
résolution de 60000 (à m/z 400), en mode profil.
Les 5 ions les plus intenses sont fragmentés par CID dans le piège ionique (LTQ)
automatiquement, avec une énergie de collision normalisée de 35% et une fenêtre de
sélection du précurseur à 3 Da. Les espèces mono-chargées ont été exclues de la
fragmentation; l’exclusion dynamique des ions précurseurs déjà fragmentés (à ± 1,5 m/z) a
été appliquée pendant 300 s. Le signal MS minimum pour déclencher la fragmentation MS /
MS a été réglé à 500. Les spectres MS/MS sont enregistrés en mode centroïde.
Les spectres sont analysés avec le logiciel XCalibur 2.0.7 (Thermo Scientific, San Jose, CA).
157
VI.9.3 Traitement bio-informatique
Les données acquises (fichiers RAW) sur le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap sont
converties par le logiciel Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific, San Jose, CA) en fichiers
au format générique Mascot (fichier MGF). La recherche dans les bases de données est
effectuée en utilisant le serveur Mascot v 2.2.07 (Matrix Science) installé localement. Pour
accélérer les recherches, deux bases de données incluant en autres les enzymes utilisées
(HSulf2dWTmat2 ou HSulf2dMutSG2 pour HSulf-2 WT et HSulf-2 SG) ont été créées
manuellement. Les paramètres utilisés pour les recherches sont les suivants:
- Spécificité enzymatique: chaque enzyme est déclarée avec sa spécificité, seules les
recherches effectuées sur les échantillons digérés par la trypsine sont effectuées avec la
définition « semi-trypsine ».
- Sites non digérés autorisés (Missed cleavages) : deux pour la semi-trypsine, huit pour
la chymotrypsine et un maximum de deux pour les autres protéases.
- Modifications variables: Carbamidométhyle (C), Carbamyle (K), Carbamyle (N-term),
Déamidation (QN), FormylGly (C), Oxydation (M), et uniquement pour les peptides issus de la
digestion en gel, ajout de propionamide (C) et retrait de carbamyl (N-term, K).
- Aucune modification fixe n’est utilisée.
- Paramétrage des valeurs de masse : Mono-isotopique. Tolérance de 10 ppm sur les
masses des ions précurseurs et tolérance de 0,6 Da sur les ions fragments. Les types de
fragments pris en compte étaient ceux spécifiés dans la configuration "ESI-Trap".
VI.10 Analyse MALDI-TOF
Deux instruments ont été utilisés pour obtenir l’ensemble des résultats présentés dans
le présent manuscrit de thèse : un MALDI PerSeptive Biosystems Voyager-DE Pro STR (Applied
Biosystem/MDS Sciex, Foster City, CA) et un Autoflex Speed TOF/TOF MS instrument (Bruker
Daltonics, Brême, Germany).
VI.10.1 Spectromètre de masse MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager-DE Pro
STR.
Ce spectromètre est équipé d’une source laser à azote pulsé opérant à 337
nm et à une fréquence de 20 Hz, avec une largeur de pulse de 3 ns. L’analyseur est un temps
158
de vol (TOF) de 3 m avec un réflecteur électrostatique et la détection est effectuée par une
galette de microcanaux. Le spectromètre est piloté par le logiciel Voyager Instrument Control
Panel v. 5.1 (Applied Biosystems) et le traitement des spectres est réalisé à l’aide du logiciel
Data Explorer 4.0 (Applied Biosystems). Le dépôt des échantillons s’effectue sur une plaque
en acier inoxydable poli avant ou après avoir été mélangé à la matrice. Cet instrument a été
utilisé majoritairement au cours de la thèse pour l’analyse protéique (HSulf-2) et glycomique
(glycosaminoglycanes liés à HSulf-2).
VI.10.1.a Analyse MALDI de HSulf-2 (après ZipTip C4)
Avant l’analyse de HSulf-2 par MALDI-TOF sur l’instrument Voyager-DE Pro STR, les
échantillons d’HSulf-2 sont dessalés par ZipTip C4 (Millipore). Ensuite, 1 μL de l’échantillon
dessalé est mélangé avec 1 μL de matrice SA ou DHB à 20 mg/ml dans un mélange
acétonitrile/eau/TFA (50:50:0,1 ; v/v/v), puis les 2 µL sont directement déposés sur la plaque
MALDI.
L’acquisition des spectres de HSulf-2 est réalisée en mode linéaire en polarité positive,
sur une gamme de m/z de 10000 à 30000-150000, avec une tension d’accélération de 25 kV
et un pourcentage de grille de 70 %. Les spectres sont enregistrés avec une intensité de laser
fixé à 3100 (unités arbitraires sur notre instrument). Le délai entre l'impulsion laser et
l'extraction des ions a été réglé à 400 nsec. Chaque spectre représente la moyenne d’environ
1000 tirs laser. Un étalonnage est effectué en utilisant les ions mono- et di-chargés de
l’albumine de sérum bovin (Calibration Standard Kit for AB SCIEX MALDI-TOF Instrument,
Applied Biosystems).
VI.10.1.b Analyse MALDI des oligosaccharides anioniques
L’acquisition des spectres des oligosaccharides est réalisée en mode réflecteur en
polarité négative, sur une gamme de m/z de 380 à 3000, avec une tension d’accélération de
20 kV et un pourcentage de grille de 70%. Le spectre de masse a été enregistré avec une
intensité de laser fixée entre 2500 et 2900. Le délai entre l'impulsion laser et l'extraction d'ions
a été réglé à 250 nsec. Chaque spectre représente la moyenne de 200 tirs laser.
1 µL de la solution d’oligosaccharide est mélangé avec 1 μL de matrice ionique liquide
HABA/TMG2 à 9 mg/mL (eau/méthanol 90 : 10 ; v/v) supplémentée avec 90 μM de NaCl, puis
159
les 2 µL sont directement déposés sur la plaque MALDI (Przybylski et al. 2009). Le mélange est
laissé 3-5 min à température ambiante avant l’analyse.
La matrice ionique liquide HABA/TMG2 (acide 2-(4’-hydroxybenzeneazo) benzoïque/
1,1,3,3-tétraméthylguanidine) est préparée selon un protocole précédemment établi au
laboratoire (Przybylski et al. 2009). En bref, HABA est mélangé avec TMG dans un rapport
molaire 1: 2 dans le méthanol. La solution est ensuite soniquée pendant 15 minutes à 40°C.
Après élimination du méthanol par évaporation centrifuge (SpeedVac) pendant 3 h à
température ambiante, la matrice ionique liquide est laissée sous vide pendant une nuit. Les
solutions finales sont ensuite préparées à une concentration de 90 mg.mL-1 dans du méthanol.
Une dilution est réalisée extemporanément à 9 mg/mL avec 100 μM de NaCl dans l’eau pour
limiter la désulfatation.
VI.10.2 Spectromètre de masse MALDI-TOF/TOF Autoflex Speed
Les expériences MS réalisées sur le spectromètre de masse MALDI Autoflex Speed
TOF/TOF concernent uniquement l’analyse protéique. Cet instrument est équipé d'un laser
SmartBeam IITM laser (modified Nd:YAG laser) pulsé à une fréquence de 1 kHz. Les spectres
ont été enregistrés en mode linéaire en polarité positive (délai: 600 ns; source ion 1 (IS1)
voltage: 19,0 kV; source ion 2 (IS2) voltage: 16,6 kV; lens voltage: 9,5 kV). L'acquisition des
spectres MALDI a été réalisée dans la gamme de masse 5000-150000 Da, et 10000 tirs ont été
additionnés pour chaque spectre. Les spectres de masse ont été traités en utilisant le logiciel
FlexAnalysis (version 3.3.80.0, Bruker Daltonics). L'instrument a été étalonné en utilisant les
ions mono- et multi-chargés de la solution standard de BSA (BSA Calibration Standard Kit for
AB SCIEX MALDI-TOF Instrument, Les Ulis, France). L'analyse MALDI-TOF MS a été obtenue en
mélangeant 1,5 μL de matrice d'acide sinapinique (SA) à 20 mg/mL dans de l'acétonitrile / eau
(50/50; v / v), 0,1% de TFA, avec 1,5 μL de la solution protéique dessalée/ diafiltrée avec ou
sans réduction (0,57 ou 0,71 mg/mL, respectivement).
VI.10.2. a Analyse MALDI de HSulf-2 (dialfiltrée Microcon 100 ou 30 kD)
Avant l’analyse MALDI-TOF des deux formes de HSulf-2, sauvage (WT) et mutée (SG)
sur l’instrument Autoflex speed TOF/TOF, les échantillons d’enzyme sont diafiltrés contre de
l’eau pure. Des modules Micron® DNA Fast Flow 100 kDa et Microcon® 30K devices (Millipore)
sont utilisés respectivement pour HSulf-2 WT et HSulf-2 SG. Les modules de filtration sont
160
lavés par 300 µL d'eau puis l’échantillon de HSulf-2 (30 µg, 12-53 µL) est complété à 200 µL
avec de l'eau puis déposé sur les modules de filtration. Les modules sont ensuite centrifugés
à 500 g pour HSulf-2 WT et 14000g pour HSulf-2 SG à 4°C. Ensuite 200 µL d’eau sont ajoutés
et le module est centrifugé pendant le temps suffisant (en général quelques minutes) pour
obtenir un volume de 30 µL. Enfin, le module de filtration est retourné pour récupérer ce
volume contenant HSulf-2 dans l’eau.
1,5 μL de la solution protéique diafiltrée avec ou sans réduction (0,57 ou 0,71 mg/mL,
respectivement) est mélangé avec 1,5 μL de matrice d'acide sinapinique (SA) à 20 mg/mL dans
de l'acétonitrile / eau (50/50; v / v), 0,1% de TFA, puis les 3 µL sont directement déposés sur
la plaque MALDI.
VI.11 Purification des oligosaccharides de chondroïtine sulfate pour l’analyse par
MALDI TOF.
Le mélange réactionnel d’HSulf-2 traité par la CSase ABC (voir paragraphe VI.6.5.c
Chondroïtinase ABC) est filtré sur les modules de phases mixtes Toptip C18 + Carbon graphite–
(SPE TopTip cartridge, Glygen, Columbia, MD, USA) selon un protocole précédemment établi
au laboratoire (Bodet et al. 2017) Brièvement,
- Conditionnement : le module est conditionné deux fois avec 50 µL d’un mélange Acétonitrile
/eau /TFA 80 :20 :0,1 % (v/v/v), puis laver trois fois avec 50 µL d'eau.
- Chargement : l’échantillon est dilué avec de l'eau pour obtenir un volume final de 50 µL,
déposé sur les modules TopTip et centrifugé à 3500 tours/min pendant 1 min. Les modules
sont de nouveau lavés cinq fois avec 50 µL d'eau.
- Elution : les oligosaccharides sont purifiés par élutions successives avec trois fois 50 µL
acétonitrile/eau 20 :80 (v/v) puis cinq fois 50 µL acétonitrile/eau/TFA 40/60/0,05 (v/v/v).
Toutes les étapes, du conditionnement jusqu’à l’élution sont effectuées par centrifugation à
3500 tours/min pendant 1 min. Les fractions d'élution sont ensuite collectées, lyophilisées et
dissoutes dans 10 μL d’eau MilliQ pour être analysées par MALDI-TOF.
161
VI.12 Marquage différentiel des cystéines de HSulf-2
Ce protocole de marquage différentiel des cystéines engagées dans la formation des
ponts disulfures a été mis au point sur le lysozyme (14,3 kDa). Cette protéine contient 8
cystéines qui forment 4 ponts disulfures. Le protocole utilisé est le suivant :
- Dénaturation : le lysozyme (2 µL, 20 µg) est suspendu dans l’urée 8 M final dans un volume
final de 20 µL, et incubé pendant 30 min à température ambiante.
- Alkylation des cystéines libres si présent : ajout de 1,7 µL d’IAA 20 mM final,
incubation pendant 45 min à température ambiante et à l’abri de la lumière.
- Elimination de l’IAA par filtration sur des modules illustra ProbeQuant G-50
Micro Columns (GE Healthcare Life Sciences) pré-conditionnés dans une solution
d’urée 1 M dans le tampon 50 mM NH4HCO3 pH 8,0.
- La valeur de pH 8 choisie est celle à laquelle l’activité de la trypsine est
maximale.
- Réduction par ajout au filtrat de 2,2 µL de DTT 5 mM, incubation pendant 1 h à
60°C.
- Alkylation des groupements thiols des cystéines, nouvellement rendus
accessibles par ajout de 2,5 µL d’une solution de 4-VP/méthanol 10 :90 (v/v) pour un
volume final de 20 µL, pendant 1h30 à température ambiante, à l’abri de la lumière et
sous agitation modérée.
- Protéolyse : ajout de 1 µL de trypsine à 0,4 µg/µL et 4 µL de tampon NH4HCO3 pH 8,0
0,1 M final et 1 M final d’urée.
- Mélange au Vortex et centrifugation.
- Incubation une nuit à 37°C.
- Reprise dans 20 µL de solvant A pour une analyse par nanoLC-MS/MS.
VI.13 Couplage de la chromatographie d’interaction hydrophile avec la
spectrométrie de masse
VI.13.1 Conditions de séparation chromatographique
La séparation des disaccharides de CS/DS a été effectuée par chromatographie d’interaction
hydrophile HILIC sur une colonne ZIC-HILIC (SeQuant® ZIC®-cHILIC 3μm, 100 A 150 X 2,1 mm
162
PEEK coated HPLC column) constituée d’une phase stationnaire de silice greffée par des
groupements zwitterioniques phosphorylcholine. La séparation est opérée sur un système
chromatographique HPLC (1260 infinity, Agilent technologies) équipé d'un détecteur UV-
visible à barrette de diodes. La détection est effectuée à la longueur d'onde fixe de 232 nm et
par mesure spectrale de 230 à 240 nm. Le système éluant est constitué de deux solvants:
solvant A 7,5 mM NH4HCO2, pH 4, et solvant B 100% acétonitrile. La colonne est équilibrée
dans un mélange de solvants A 26%, B 74% (v : v). L’élution est obtenue par un gradient de
solvant B: 74% de 0 à 4 min, 74% à 65% en 2 min, 65% pendant 2 min, 65% à 15% en 1 min,
15% pendant 3 min, 15% à 90% en 1 min, 90% pendant 3 min, 90% à 74% en 1 min et 74%
pendant 8 min. La séparation est effectuée à un débit de 0,3 mL/min et à une température de
colonne de 22 °C. Le volume d’échantillon injecté est de 2,5 µL.
Entre chaque série d’injections, la colonne est reconditionnée par un gradient de solvant B
selon: 74% à 95% pendant 2 min, 95% pendant 13 min, 95% à 10% en 1 min, 10% pendant 10
min, 10% à 95% en 1 min, 95% pendant 10 min, 95% à 74% pendant 1 min et 74 % pendant 7
min à un débit de 0,3 mL/min et à une température de colonne de 22 °C. Le volume d’eau
injecté est de 5 µL. Une séquence de lavage est occasionnellement appliquée en faisant varier
le solvant B: 74% à 5% pendant 1 min, 5% à 74 % pendant 4 min à un débit de 0,3 mL/min et
à une température de colonne de 22 °C. Le volume d’eau injecté est de 20 µL.
VI.13.2 Conditions d‘analyse MS
La colonne HILIC est interfacée avec une source électrospray de type Apollo couplée à un piège
à ions (ESI-QIT, AmaZon Speed ETD, Bruker) piloté par le logiciel HyStar (version 3.2) (Bruker).
L’ionisation est effectuée en mode négatif. Les expériences de MS et MS/MS (MS2) sont
effectuées en utilisant le mode de résolution améliorée «enhanced resolution mode » avec
une vitesse de balayage de 8100 m/z par seconde et une gamme de m/z comprise entre 200
et 700. La masse cible est fixée à m/z 500. Le nombre maximum d’ions accumulés et le temps
d’accumulation sont fixés respectivement à 1105 et 50 ms. Les paramètres de la source sont:
tension de capillaire 3,5 kV, avec un « end plate offset » de 400 V. Débit du gaz de nébulisation
(N2) 7.3 psi, débit et température du gaz séchant (N2): respectivement 4.0 L/min et 180°C.
L’instrument est étalonné à l’aide du mélange standard (ES tuning mix) fournit par le
163
constructeur. Les données sont traitées directement en utilisant le logiciel Data analysis v4.0
(Bruker).
VI.13.3 Préparation de l’échantillon: Avant l’analyse par HILIC-ESI-MS, 6 µg de HSulf-2 WT
sont traités par 20 mU de CSase ABC dans 10 µL de tampon de digestion : Tris-HCl 20 mM pH
7,2 pendant 24 h à 37°C. Une filtration centrifuge sur membrane de seuil de coupure 3 kDa
est effectuée afin de séparer d’une part la CSase ABC et la partie protéique de HSulf-2, et
d’autre part les oligosaccharides résultants du traitement enzymatique. 50 µL de filtrat sont
dilués avec 50 µL d’acétonitrile pour être ensuite analysés par HILIC-ESI-MS. Des disaccharides
standards de chondroïtine sulfate (CS-A ΔUA-GalNAc4S, CS-C ΔUA-GalNAc6S, CS-D ΔUA2S-
GalNAc,6S et CS-E ΔUA4S-GalNAc6S , Iduron, Cheshire, UK) sont préparés à 10 µM dans eau/
acétonitrile 50/50 (v/v) et analysés dans les même conditions.
164
Annexes
165
Figure A.1: Couverture de séquence de la chaîne longue obtenue par nanoLC-ESI-MS/MS, après digestion en
solution par différentes protéases dans l'ordre suivant: Trypsine - Trypsine/Lys-C- Arg-C – Chymotrypsine - ASP-
N - Glu-C. Peptides identifiés expérimentalement (en rouge).
C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation
Chaîne longue de HSulf-2 1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG 1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL 101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
166
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
167
Figure A.2: Couverture de séquence de la chaîne courte obtenue par nanoLC-ESI-MS/MS, après digestion en
solution par différentes protéases dans l'ordre suivant: Trypsine - Trypsine/Lys-C- Arg-C – Chymotrypsine - ASP-
N - Glu-C. Peptides identifiés expérimentalement (en rouge).
C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation
Chaîne courte de HSulf-2 SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
168
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Tableau A.1: Exemple de quelques masses monoisotopiques des résidus ou des pertes de masse fréquemment
observé pour les GAGs.
Résidus ou
modifications masses monoisotopiques
HexN (Hexosamine) 161,07
UA (Acide uronique) 176,03
H2O (Eau) 18,01
H (Hydrogène 1,01
Na (Sodium) 22,99
-SO3Na+H
(Sulfatation-Na)
101,94
-SO3K+H
(Sulfatation-K)
117,91
sulfate (SO3) 79,96
–H+COCH3 (acétylation) 42,01
DP2 (U+A) 337,10
Echange H/Na 21,98
169
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN MGPPS-----LVLCLLSATVFSLLGGSSAFLSHHRLKGRFQRDRRNIRPNIILVLTDDQD 55
SP|P22304|IDS_HUMAN MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSE------------TQANSTTDALNVLLIIVDDLR 48
SP|P51691|ARS_PSEAE --------------------------------------------MSKRPNFLVIVADDLG 16
. *.::::.**
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN VE-LGSMQV---MNKTRRIMEQGGAHFINAFVTTPMCCPSRSSILTGKYVHNHNTYTNNE 111
SP|P22304|IDS_HUMAN PS-LGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNS 107
SP|P51691|ARS_PSEAE FSDIGAFGGE-IATPNLDALAIAGLR-LTDFHTASTCSPTRSMLLTGTDHHIAGIGTMAE 74
. :*. . . : . . * *.*:* :*** . .
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN NC-----SSPSWQAQ-H-ESRTFAVYLNSTGYRTAFFGKYLNEYN------GSYVPPGWK 158
SP|P22304|IDS_HUMAN ----------YWRVH-AGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNH--TDDSPYSWS 154
SP|P51691|ARS_PSEAE ALTPELEGKPGYEGHLNERVVALPELLREAGYQTLMAGKWHLGLKPEQTPHARGFERSFS 134
:. : . :: :.. ** * ** .:.
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN EWVGLLKNSRFYNYTLCRNG-VKEKHGSDYSKD----------YLTDLI-TNDSVSFFRT 206
SP|P22304|IDS_HUMAN FPPYHPSSEKYENTKTCRGP-DGELHANLLCPV--DVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLE- 210
SP|P51691|ARS_PSEAE LLPGAANHYGFEPPYDESTPRILKGTPALYVEDERYLDTLPEGFYSSDAFGDK---LLQY 191
. : : . :. ::.
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN SKKMYPHRPVLMVISHAAPHGPEDSAPQYSRLFPNASQHITPSYNY----A--------- 253
SP|P22304|IDS_HUMAN -KMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLP--------- 260
SP|P51691|ARS_PSEAE LKERDQSRPFFAYLPFSAPHWPLQAPREIVEKYRGRYDA-GPEALRQERLARLKELGLVE 250
* *.: : . ** * : . : *.
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN --------PNPDKHWI----------MRYTGPMKPIHMEFTNMLQRKRLQTLMSVDDSME 295
SP|P22304|IDS_HUMAN --------PVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVG 312
SP|P51691|ARS_PSEAE ADVEAHPVLALTREWEALEDEERAKSA---------------RAMEVYAAMVERMDWNIG 295
. * . : :* .:
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN TIYNMLVETGELDNTYIVYTADHGYHIGQFGLVKGKS-M-------PYEFD-------IR 340
SP|P22304|IDS_HUMAN RLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNF-------DVATH-------VP 358
SP|P51691|ARS_PSEAE RVVDYLRRQGELDNTFVLFMSDNGAEGALLEAFPKFGPDLLGFLDRHYDNSLENIGRANS 355
: . * :.* : : :*:* . .
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN VPFYVRGPNV-------------------------------EAGCLNPHIVLNIDLAPTI 369
SP|P22304|IDS_HUMAN LIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYL--------DPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTL 410
SP|P51691|ARS_PSEAE YVWYGPRWAQ-AATAPSRLYKAFTTQGGIRVPALVRYPRLSRQGAISHAFATVMDVTPTL 414
:* . * . :. :.: **:
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN LDIAGLDIPADMDG-KS--------ILKLLDTERPVNRFHLKKKMRVWRDSFLVERGKLL 420
SP|P22304|IDS_HUMAN AGLAGLQVPPRCPV----------------------PSFHVELC----------REGKNL 438
SP|P51691|ARS_PSEAE LDLAGVRHPGKRWRGREIAEPRGRSWLGWLSGET--EAAHDENTVTGWEL---------F 463
.:**: * * : :
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN HKRDNDKVDAQEENFLPKYQRVKDLCQRAEYQTACEQLGQKWQCVEDATGKLKLHKCKGP 480
SP|P22304|IDS_HUMAN LKH-FRFRDLEEDPYLPGNPRE--LIAYSQYPRPS--DIPQWNSDKPSLKDIKIMGYS-- 491
SP|P51691|ARS_PSEAE GMRAIRQG-DWKAVYLPAPV-----------------GPATWQLYDLARDPGEIHDLADS 505
: : :** *: . : ::
SP|Q8IWU5|SULF2_HUMAN MRLGGSRALSNLVPKYYGQGSEACTCDSGDYKLSLAGRRKKLFKKKYKASYVRSRSIRSV 540
SP|P22304|IDS_HUMAN -----IRTIDYRYTVWVGFNPDEF-------------------L----AN---------F 514
SP|P51691|ARS_PSEAE ----QPGKLAELIEHWKRYVSETGVVEGAS------------------------------ 531
: : :
Figure A.3: Alignement partiel des séquences d'acides aminés de HSulf-2, de la sulfatase la sulfatase humaine
IDS (IDS_HUMAN ou P22304, Iduronate 2-sulfatase) et la sulfatase ATSA de P. Aeruginosa PAOI (P51691) : Les
12 résidus du site catalytique de la sulfatase humaine IDS
Alignement UniProt (http://www.uniprot.org/align/)
170
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDAGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFAG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Figure A.4: Couverture de séquence du double mutant HSulf-2 ΔSG obtenue après digestion en solution par la
trypsine, et analyse par nanoLC-ESI-MS/MS. Les peptides identifiés expérimentalement sont indiqués en rouge.
La couverture de séquence expérimentale de HSulf-2 ΔSG entière est de 50 % se décomposant en 60 % pour la
chaîne longue et 36 % pour la chaîne courte. C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation;
RS: site de clivage par la furine ; AG: mutation du motif SG en AG, le motif SG est le site d’attachement de la
chaîne de chondroïtine sulfate.
171
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDAGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFAG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Figure A.5: Couverture de séquence du double mutant HSulf-2 ΔSG après digestion en gel par la trypsine, et
analyse par nanoLC-ESI-MS/MS de la bande à 79 kDa détectée sur la piste 1 du gel SDS-PAGE présenté dans la
Figure III.8. Les peptides identifiés expérimentalement sont indiqués en rouge. La grande majorité des peptides
détectés (96 %) issus de la bande à 79 kDa appartient à la chaîne longue de HSulf-2 ΔSG (résidus Phe1 à Arg514).
Ces différents peptides correspondent à une couverture de séquence expérimentale de 54% de la chaîne longue
et 4% de la chaîne courte.
C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation; RS: site de clivage par la furine ; AG: mutation
du motif SG en AG, le motif SG est le site d’attachement de la chaîne de chondroïtine sulfate.
172
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDAGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFAG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Figure A.6: Couverture de séquence du double mutant HSulf-2 ΔSG après N-déglycosylation, digestion en gel
par la trypsine, et analyse par nanoLC-ESI-MS/MS de la bande à 65 kDa détectée sur la piste 2 du gel SDS-PAGE
présentée dans la Figure III.8. Les peptides identifiés expérimentalement sont indiqués en rouge. La majorité
des peptides détectés (97 %) issus de la bande à 65 kDa appartient à la chaîne longue de HSulf-2 ΔSG (résidus
Phe1 à Arg514). Ces différents peptides correspondent à une couverture de séquence expérimentale de 74 % de
la chaîne longue et 4% de la chaîne courte.
C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation; RS: site de clivage par la furine ; AG: mutation
du motif SG en AG, le motif SG est le site d’attachement de la chaîne de chondroïtine sulfate.
173
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDAGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDAGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
Figure A.7: Superposition de la couverture de séquence avant et après N-déglycosylation de la chaîne longue
de double mutant HSulf-2 ΔSG après digestion en gel par la trypsine, et analyse par nanoLC-ESI-MS/MS.
Comparaison des peptides identifiés expérimentalement (en rouge) avant (ligne supérieure, bande à 79 kDa ;
Figure III.8, piste 1) ou après (ligne inférieure, bande à 65 kDa ; Figure III.8, piste 2) la N-déglycosylation de double
mutant HSulf-2 ΔSG par la PNGase F.
C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation; RS: site de clivage par la furine; AG: mutation
du motif SG en AG, le motif SG est le site d’attachement de la chaîne de chondroïtine sulfate.
174
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDAGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFAG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Figure A.8: Couverture de séquence du double mutant HSulf-2 ΔSG obtenue après digestion en gel par la
trypsine et analyse par nanoLC-ESI-MS/MS de la bande à 54 kDa détectée sur la piste 1 du gel SDS-PAGE
présentée dans la Figure III.8. Les peptides identifiés expérimentalement sont indiqués en rouge. La majorité
des peptides détectés (58 %) issus de la bande à 54 kDa appartient à la chaîne courte (résidus Ser515 à Gly846)
de HSulf-2 ΔSG. Cers derniers correspondent à une couverture de séquence expérimentale de 19 % de la chaîne
longue et 40 % de la chaîne courte.
C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation; RS: site de clivage par la furine; AG: mutation
du motif SG en AG, le motif SG est le site d’attachement de la chaîne de chondroïtine sulfate.
175
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDAGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFAG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Figure A.9: Couverture de séquence du double mutant HSulf-2 ΔSG après N-déglycosylation, digestion en gel
par la trypsine, et analyse par nanoLC-ESI-MS/MS de la bande à 41 kDa détectée sur la piste 2 du gel SDS-PAGE
présentée dans la Figure III.8. Les peptides identifiés expérimentalement sont indiqués en rouge. La majorité
des peptides détectés (67%) issus de la bande à 41 kDa appartient à la chaîne courte (résidus Ser515 à Gly846)
de HSulf-2 ΔSG. Ces différents peptides correspondent à une couverture de séquence expérimentale de 17 % de
la chaîne longue et 55 % de la chaîne courte.
C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation; RS: site de clivage par la furine; AG: mutation
du motif SG en AG, le motif SG est le site d’attachement de la chaîne de chondroïtine sulfate.
176
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFAG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
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601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
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651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
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751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Figure A.10: Superposition de la couverture de séquence avant et après N-déglycosylation de la chaîne courte
de double mutant HSulf-2 ΔSG après digestion en gel par la trypsine et analyse par nanoLC-ESI-MS/MS.
Comparaison des peptides identifiés expérimentalement (en rouge) avant (ligne supérieure, bande à 54 kDa ;
Figure III.8, piste 1) ou après (ligne inférieure, bande à 41 kDa ; Figure III.8, piste 2) la N-déglycosylation du double
mutant HSulf-2 ΔSG par la PNGase F.
C: formylglycine du site actif; N: site potentiel de N-glycosylation; RS: site de clivage par la furine; AG: mutation
du motif SG en AG, le motif SG est le site d’attachement de la chaîne de chondroïtine sulfate.
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Publications
Research paper
The chondroitin sulfate/dermatan sulfate 4-O-endosulfatase frommarine bacterium Vibrio sp FC509 is a dimeric species: Biophysicalcharacterization of an endosulfatase
Jos�e L. Neira a, b, *, Encarnaci�on Medina-Carmona c, Jos�e G. Hern�andez-Cifre d,Laia Montoliu-Gaya e, Ana C�amara-Artig�as f, Ilham Seffouh g, h, Florence Gonnet g, h,R�egis Daniel g, h, Sandra Villegas e, Jos�e García de la Torre d, Angel L. Pey c, Fuchuan Li i
a Instituto de Biología Molecular y Celular, Universidad Miguel Hern�andez, Elche, Alicante, Spainb Biocomputation and Complex Systems Physics Institute, Zaragoza, Spainc Department of Physical Chemistry, University of Granada, Granada, Spaind Department of Physical Chemistry, University of Murcia, Murcia, Spaine Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Unitat de Bioci�encies, Universitat Aut�onoma de Barcelona, Bellaterra, Cerdanyola del Vall�es, Barcelona,Spainf Department of Physical Chemistry, Biochemistry and Inorganic Chemistry, University of Almería, Agrifood Campus of International Excellence (ceiA3),Almería, Spaing CNRS UMR 8587, Laboratoire Analyse et Mod�elisation pour la Biologie et l’Environnement, Evry, Franceh Universit�e Evry-Val-d’Essonne, Laboratoire Analyse et Mod�elisation pour la Biologie et l’Environnement, Evry, Francei National Glyco-engineering Research Center and State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan, China
a r t i c l e i n f o
Article history:Received 11 June 2016Accepted 24 September 2016
Keywords:Circular dichroismDifferential scanning calorimetryFluorescenceIrreversibilityMass spectrometryProtein stability
a b s t r a c t
Sulfatases catalyze hydrolysis of sulfate groups. They have a key role in regulating the sulfation statesthat determine the function of several scaffold molecules. Currently, there are no studies of theconformational stability of endosulfatases. In this work, we describe the structural features andconformational stability of a 4-O-endosulfatase (EndoV) from a marine bacterium, which removes spe-cifically the 4-O-sulfate from chondroitin sulfate/dermatan sulfate. For that purpose, we have usedseveral biophysical techniques, namely, fluorescence, circular dichroism (CD), FTIR spectroscopy,analytical ultracentrifugation (AUC), differential scanning calorimetry (DSC), mass spectrometry (MS),dynamic light scattering (DLS) and size exclusion chromatography (SEC). The protein was a dimer withan elongated shape. EndoV acquired a native-like structure in a narrow pH range (7.0e9.0); it is withinthis range where the protein shows the maximum of enzymatic activity. The dimerization did not involvethe presence of disulphide-bridges as suggested by AUC, SEC and DLS experiments in the presence of b-mercaptoethanol (b-ME). EndoV secondary structure is formed by a mixture of a and b-sheet topology, asjudged by deconvolution of CD and FTIR spectra. Thermal and chemical denaturations showed irre-versibility and the former indicates that protein did not unfold completely during heating.
© 2016 Elsevier B.V. and Société Française de Biochimie et Biologie Moléculaire (SFBBM). All rightsreserved.
1. Introduction
Sulfatases, which cleave sulfate esters in biological systems,have key roles in modulating the sulfation of several moleculesinvolved in many physiological processes. The sulfatase substrates
range from small cytosolic steroids, like estrogen sulfate, to com-plex cell-surface carbohydrates (such as glycosaminoglycans,GAGs). The GAG chains consist of repeating disaccharide units ofglucuronic/iduronic acid and hexosamine in a linear chain. Modi-fication of all these molecules is important in signalling pathways,bacterial pathogenesis, hormone regulation and even in lysosomalstorage disorders [1,2]. In humans, sulfatases have been involved ingenetic disorders and cancer [3,4]. Recently, from a biotechn-olo-gical point of view, sulfatases have been also used as synthetic toolsin the design of new therapeutic compounds or even in the
* Corresponding author. Instituto de Biología Molecular y Celular, EdificioTorregait�an, Universidad Miguel Hern�andez, Avda. del Ferrocarril s/n, 03202, Elche,Alicante, Spain.
E-mail address: [email protected] (J.L. Neira).
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Biochimie
journal homepage: www.elsevier .com/locate/biochi
http://dx.doi.org/10.1016/j.biochi.2016.09.0150300-9084/© 2016 Elsevier B.V. and Société Française de Biochimie et Biologie Moléculaire (SFBBM). All rights reserved.
Biochimie 131 (2016) 85e95
remodelling of key sulfonation sites of GAGs [1]. In these industrialapplications, understanding protein stability has important impli-cations in shaping enzymatic activity and protein redesign.Furthermore, among hydrolases, sulfatases are unique in requiringa post-translational modification on a particular active site aminoacid. This leads to the formation of 3-oxo-alanine (“formylglycine”),the sole natural residue having an aldehyde function [5].
Chondroitin sulfate (CS)/dermatan sulfate (DS) are probably themost abundant GAGs, expressed at the cell surfaces and in extra-cellular matrices in the animal kingdom. During biosynthesis, D-glucuronic acid can be epimerized at the C-5 position to give L-iduronic acid, and both of themmay be sulfated at the C-2 position.In addition, CS/DS can be sulfated at position 4 on iduronate, andmore less frequently, on glucuronates. Also, N-acetyl-galactos-amine moieties are sulfated at positions 4 and 6 [1]. Most of theendosulfatases identified so far are exosulfatases (acting at thesulfated saccharide residues at the terminus of GAGs). Recently,however, a CS/DS 4-O-endosulfatase has been identified inB. thetaiotaomicron [6], and in Vibrio sp FC509 [7]. The biochemicalcharacterization of the latter indicates that the enzyme is onlyactive in a narrow pH-range (from 6.5 to 9.0), with a maximal re-action rate at 30 �C (at pH 8.0). Since, at the best of our knowledge,there are no studies addressing the conformational stability ofchondroitin sulfate endosulfatases, we embarked in the descriptionof stability for the endosulfatase of Vibrio sp FC509.
We used several biophysical techniques, namely, fluorescence,CD, FTIR spectroscopies, AUC, DSC, MS, DLS and SEC. Our resultssuggest that the protein is a dimer with an elongated shape, asshown by SEC, AUC, DLS and MS. Dimerization did not involve thepresence of disulphide-bridges as suggested by AUC, SEC and DLSexperiments in the presence of b-ME. The protein acquired anative-like structure within a small pH-range (from 7.0 to 9.0),which is similar to that where the protein has the maximum ofactivity [7]. The structure of the protein is formed by large per-centages of a-helix and b-sheet scaffolds, as judged by deconvo-lution of CD and FTIR spectra. At low pH values, the protein lost alarge amount of its secondary and tertiary structures, and it showssolvent-exposure of hydrophobic patches. Thermal and chemical-denaturations at physiological pH were irreversible, and the ther-mal denaturation was well described by a two-state irreversiblemodel with activation energies in the range of 70 kcal mol�1.
2. Materials and Methods
2.1. Materials
Ultra-pure urea and GdmCl were from ICN Biomedicals Inc.
(USA). Concentrations of urea and GdmCl were calculated from therefractive index of the corresponding solution [8]. Trizma acid andbase, NaCl and ANS were from Sigma. The high molecular weightmarker for gel filtrationwas from GE Healthcare (Barcelona, Spain).The b-MEwas from BioRad; dialysis tubingwith amolecular weightcut-off of 3500 Da was from Spectrapore. Standard suppliers wereused for all other chemicals. Water was deionized and purified on aMillipore system.
2.2. Protein expression and purification
Expression and purification of the protein was carried out asdescribed [7]. For some preparations, we also added 2 mM b-ME inthe elution buffer (50 mM Tris, pH 7.8, with 150 mM NaCl) at thelast purification step on the semi-preparative Superdex G200 col-umn. This protein stock in 2 mM b-ME was used for spectroscopic,biophysical and hydrodynamic experiments in the presence of thereducing agent.
2.3. Size exclusion chromatography (SEC)
SEC was used to determine the RSs of EndoV at 20 �C underseveral conditions [9e11]. Protein concentrations ranged from 1 to10 mM (in protomer units). Samples were loaded in 50 mM, phos-phate buffer (pH 7.0), containing 150 mM NaCl (to avoid in-teractions with the column) at 1 ml/min, in the absence and in thepresence of 2 mM b-ME, in a calibrated Superdex 200 10/30 HRFPLC column (GE Healthcare) connected to an AKTA basic (GEHealthcare) with monitoring at 280 nm. For the experiments atdifferent pHs, the corresponding buffer (see below) at a concen-tration of 50 mM was used with 150 mM NaCl. In all chromato-grams, the Ves were obtained with UNICORN software (GEHealthcare) in three measurements. The void volume, V0,(6.47 ± 0.06ml) was determined from blue dextran; the bed one, Vi,(19.31 ± 0.03 ml) was from conductivity measurements.
The Ve of EndoV was not protein-concentration-dependent inthe range of protein concentrations explored (1e10 mM); the pH-and urea-denaturation experiments were carried out at 10 mM ofprotein concentration (in protomer units). Urea-denaturationswere carried out at pH 7.0 (50 mM phosphate buffer) with150 mM NaCl.
The protein standards used in column calibration and theircorresponding Stokes radii were: thyroglobulin (85 Å), ferritin(61 Å), catalase (52.2 Å), aldolase (48.1 Å) and BSA (35.5 Å) [12]. TheVes of the protein standards were only acquired under nativeconditions 50 mM phosphate buffer with 150 mM NaCl (pH 7.0).Protein concentrations were 10 mM.
Abbreviations used
ANS 8-anilinonapthalene-1-sulfonic acidAUC analytical ultracentrifugationb-ME b-mercaptoethanolBSA bovine serum albuminCD circular dichroismCS chondroitin sulfateDLS dynamic light scatteringDS dermatan sulfateDSC differential scanning calorimetryEndoV the 4-O-endosulfatase from the marine bacterium
Vibrio sp FC509
f frictional factorFTIR Fourier transform infrared spectroscopyGAG glycosaminoglycanGdmCl guanidine hydrochlorideMALDI-TOF matrix assisted laser desorption ionization-time of
flightMS mass spectrometryM molecular masRS hydrodynamic radiusSA sinapinic acidSEC size exclusion chromatographyUV ultravioletVe elution volume
J.L. Neira et al. / Biochimie 131 (2016) 85e9586
The weight average partition coefficients (s) were calculated as:
s ¼ ðVe�VoÞVi
. The ss were transformed by using the inverse error
function complement of s, erfc�1ðsÞ, yielding a linear relationshipwith Rs [9,11]: Rs ¼ aþ bðerfc�1ðsÞÞ, where a and b are constants.
2.4. Analytical ultracentrifugation (AUC)
Experiments were carried out as described [13,14]. Briefly, ex-periments were performed in a Beckman Coulter Optima XL-Ianalytical ultracentrifuge (Beckman-Coulter, Palo Alto, CA, USA)equippedwith UVevisible absorbance as well as interference opticsdetection systems, using an An50Ti 8-hole rotor, 12-mm-path-length charcoal-filled Epon double-sector centrepieces. The ex-periments were carried out at 20 �C in 50 mM Tris (pH 7.9) in theabsence and in the presence of 2 mM b-ME. Laser delay wasadjusted prior to the runs to obtain high-quality interferencefringes. Light at 280 nm was used in the absorbance optics mode.Sedimentation velocity runs were carried out at a rotor speed of40,000 rpm using 400 ml samples. Sample concentration was 5 mM(in protomer units).
A series of 400 scans, without time intervals between them,were acquired for each sample. A least squares boundary modellingof the sedimentation velocity data was used to calculate sedi-mentation coefficient distributions with the size-distribution c(s)method [15] implemented in the SEDFIT v13.0b software. The s20,w,density (r ¼ 1.0089 g/ml) and viscosity (h0 ¼ 1.002 cP) at 20 �Cwere estimated with SEDNTERP [16]. The protein partial specificvolume, V , was 0.726 ml/g.
2.5. Dynamic light scattering (DLS)
Experiments were performedwith a Zetasizer Nano ZS (MalvernInstruments Ltd.) using a thermostatized 12 ml quartz samplecuvette at 20 �C, as described [13]. Briefly, samples of protein wereprepared in 50 mM Hepes buffer (pH 7.0) in the absence and in thepresence of 2 mM b-ME. Sample concentration was 15 mM (inprotomer units). All the solutions were filtered; immediately beforemeasurements, protein samples were centrifuged for 30 min at14,000 rpm to remove any aggregates and dust. Datawere analyzedusing the software developed by Malvern Instruments Ltd. The Rsand M were determined from the Stokes-Einstein equation,assuming a spherical shape for the protein.
2.6. Fluorescence
Fluorescence spectra were collected on a Cary Varian spectro-fluorimeter (Agilent, USA), interfaced with a Peltier temperaturecontroller, at 25 �C. Sample concentrations were 2 mM (in protomerunits) in the pH- and chemical-denaturation experiments. The finalconcentrations of the buffers were 10 mM. The experiments wereprepared the day before and left overnight at 5 �C. A 1 cm-pathlength quartz cell (Hellma) was used.
2.6.1. Intrinsic fluorescenceThe experimental set has been described elsewhere [17], with
excitation at 280 and 295 nm. Blank corrections were made in allspectra.
Chemical-denaturations at pH 7.0 (50 mM, phosphate buffer),either followed by fluorescence or CD, were carried out by dilutionof the proper amount of an 8 M urea or 7 M GdmCl stock solution.Both urea- and GdmCl-denaturations were not reversible.
In the pH-denaturations, the pH was measured after completionof the experiments with an ultra-thin Aldrich electrode in a Radi-ometer (Copenhagen) pH-meter for each sample. The salts and
acids used have been described elsewhere [17]. Chemical-denaturations were repeated three times with new samples atany of the concentrations assayed.
2.6.2. Thermal-denaturationsThermal-denaturations were performed at constant heating
rates of 1 �C/min and an average time of 1 s. Thermal scans werecollected by excitation at 280 or 295 nm and collected at 315, 330and 350 nm from 25 to 85 �C. The rest of the experimental set wasthe same as described above. Thermal denaturations were notreversible at any pH. The apparent Tm was obtained as described[13].
2.6.3. ANS bindingThe experimental set for the pH-denaturations has been
described [17]. In all cases, blank solutions were subtracted fromthe corresponding spectra. ANS was used to monitor the pH-denaturation at 2 mM of protein (in protomer units).
2.7. Circular dichroism (CD)
Circular dichroism spectra were collected on a Jasco J815 (Japan)spectropolarimeter fitted with a thermostated cell holder and aPeltier unit. The instrument was periodically calibrated with(þ)-10-camphorsulphonic acid. Molar ellipticity was calculated asdescribed [10].
2.7.1. Far-UV spectraSpectra of EndoV at different pHs, GdmCl or urea concentrations
were acquired at a scan speed of 50 nm/minwith a response time of4 s and averaged over six scans at 20 �C. The bandwidth was 1 nm.Measurements were performed with protein concentrations of2 mM (protomer units) in 10 mM buffer, in a 0.1 cm-pathlength cell.Spectra were corrected by subtracting the corresponding baseline.The chemical-denaturations were repeated three times with newsamples. Samples were prepared the day before and left overnightat 5 �C to allow for equilibration.
2.7.2. Thermal-denaturation experimentsTheywere performed at constant heating rates of 1 �C/min and a
response time of 8 s. Thermal scans were collected following thechanges in ellipticity at 222 nm from 25 to 80 �C in 0.1 cm-pathlength cells with a protein concentration of 2 mM (in protomerunits). No difference was observed between the scans to test forpossible instrumental drift. Thermal-denaturations were notreversible at any pH, as shown by: (i) the comparison of spectrabefore and after the heating; and, (ii) the changes in the voltage ofthe instrument [18]. The apparent Tm was obtained as described[13].
2.7.3. Near-UV spectraSpectra of EndoV at pH 7.0 were acquired at a scan speed of
50 nm/min with a response time of 4 s and averaged over six scansat 20 �C. The bandwidth was 1 nm. Measurements were performedwith protein concentrations of 29.6 mM (protomer units), in an0.5 cm-pathlength cell. We did not follow the pH-denaturation ofEndoV by near-UV due to the large amounts of protein used.
2.8. FTIR
EndoV at 100 mM (protomer units) in phosphate buffer (pH 7.0,50 mM) was extensively exchanged to deuterated phosphate bufferin Amicon devices. Spectra were acquired at 25 �C in a VariantResolutions Pro spectrometer (Agilent, USA) using excavated cellswith a 50 mm path (Reflex Analytical) and the series software
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licensed under OMNIC (Thermo Scientific). Spectra were acquiredat 25 �C and processed as described [17,19].
2.9. Analysis of the pH-denaturation curves
The pH-denaturation experiments were analyzed assuming thatboth protein species, protonated and deprotonated, contributed tothe spectral feature:
X ¼�Xa þ Xb10nðpH�pKaÞ��1þ 10nðpH�pKaÞ� (1)
where X is the spectral property being observed (ellipticity orfluorescence intensity); Xa is that for the acidic species; Xb is theone at high pHs; pKa is the apparent midpoint of the titratinggroup; and n is the Hill coefficient (which was close to 1 in all thecurves reported in this work). The apparent pKa reported (fromintrinsic or ANS fluorescence, and CD) was obtained from threedifferent measurements in each technique, prepared with newsamples.
Fitting by non-linear least-squares analysis to Eq. (1) was carriedout by using Kaleidagraph (Abelbeck software) working on a PCcomputer.
2.10. Mass spectrometry
MALDI-TOF MS experiments were carried out on a Voyager-DEPro STR spectrometer (Applied Biosystems/MDS Sciex, Foster City,CA). This instrument was equipped with a nitrogen UV laser(l ¼ 337 nm) pulsed at a 20 Hz frequency. The mass spectrometerwas operated in the positive linear ion mode with an acceleratingpotential of þ25 kV and a grid percentage equal to 70%. Massspectrum was recorded with the laser intensity set at 3100 (arbi-trary units), extraction delay was set to 400 ns and mass spectrawere obtained by accumulation of 100 laser shots and processedusing Data Explorer 4.0 software (Applied Biosystems). The in-strument was externally calibrated using mono- and multichargedions of standard solution of BSA (BSA Calibration Standard Kit forAB SCIEX MALDI-TOF Instrument).
MALDI-TOFMS analysis was achieved bymixing 1 ml of sinapinicacid (SA) matrix at 20mg/ml in acetonitrile/water (50/50; v:v), 0.1%TFA, with 1 ml of the protein solution (0.6 mg/ml).
2.11. Differential scanning calorimetry (DSC)
DSC experiments were carried out in a capillary VP-DSC differ-ential scanning calorimeter (Malvern Instruments) with a cellvolume of 135 ml. Scans were performed in a 4e100 �C temperaturerange at scan rates of 1e4 �C/min, using 2e10 mM protein (inmonomer units). Experiments were performed in Tris 50 mM (pH8.0) and NaCl 150 mM (oxidizing conditions) or in Tris 50 mM (pH7.5), NaCl 200 mM and 2 mM b-ME (reducing conditions).
2.12. Analysis of DSC experiments
Thermal denaturations were analyzed using a two-state irre-versible denaturation model with first-order kinetics [20] depictedby Scheme 1.where the native protein (N) is irreversibly denaturedto a final state (F) that cannot fold back, and this kinetic conversionis characterized by a temperature dependent first-order rate con-stant (k).
The experimental DSC traces (apparent molar heat capacitiesversus Temperature) were fitted using Eq. (2), which takes intoaccount the experimental chemical baseline [21]:
Cappp ¼ CpðpreÞ þ
�CpðpostÞ � CpðpreÞ
�ð1� XNÞ � DH
�dXN
dT
�(2)
inwhich, XN is the native statemole fraction,DH is the denaturationenthalpy, Cp(pre) and Cp(post) are the pre- and post-transition base-lines (considered as linear functions of temperature). The first twoterms in the right-hand side of Eq. (2) define the chemical baseline,while the last term describes the unfolding transition (excess molarheat capacity, Cp(exc), versus Temperature). The fraction of nativeprotein and its dependence with temperature are given by Eqs. (3)and (4) [21,22]:
XN ¼ exp
"� exp
EaDTRT2m
!#(3)
and
dXN
dT¼ � Ea
RT2mexp
EaDTRT2m
!exp
"� exp
EaDTRT2m
!#(4)
where DT ¼ T-Tm, Tm is the denaturation temperature (themaximum in the plot of the excess heat capacity versus T) and Ea isthe activation energy for the process given in Scheme 1.
Alternatively, when dealing with systems displaying non-first-order kinetics (such as those involving changes in the oligomeri-zation state between the native and transition state for the rate-determining step), there have been developed expressions for XNand (dXN/dT) (Eqs. (5) and (6)). These expressions include a fittingparameter, m, that takes into account changes in oligomerizationstate (note that 1/m is the reaction order) [22,23]:
XN ¼"1þ ð1� mÞ
mexp
EaDTRT2m
!#� mm�1
�(5)
dXN
dT¼ � Ea
RT2mexp
EaDTRT2m
!"1þ ð1� mÞ
mexp
EaDTRT2m
!#� 1m�1
�(6)
Note that in the case of a dimeric native protein, m ¼ 1 in first-order kinetics (the transition state is dimeric), while m ¼ 2 whenthe transition state is monomeric.
Under first-order conditions, the rate constant, k, is obtained by[20]:
k ¼ yCpðexcÞDH � <H>
(7)
where n is the scan rate, Cp(exc) is the excess heat capacity at a giventemperature and<H> is the heat evolved at that given temperature.The temperature dependence of k following the Arrhenius equation(k ¼ A$exp(�Ea/(RT)) yields another way to estimate Ea.
The dependence of the heat evolved with temperature (<H>)can be expressed by Eq. (8), providing an additional method toestimate Ea [20]:
EaR
�1Tm
� 1T
�¼ ln
�lnðDHÞ
DH � <H>
�(8)
Scheme 1. Two-state irreversible denaturation model.
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And last, the scan rate dependence of Tm values must follow Eq.(9) and then, it provides another method to determine Ea [20]:
ln
y
T2m
!¼ C � Ea
RTm(9)
where C is a constant.
3. Results
3.1. EndoV is a dimeric species at physiological pH
To map the hydrodynamic properties of EndoV we used thefollowing complementary hydrodynamic techniques: DLS, AUC,SEC at different protein concentrations, with and without b-ME(2mM). In addition, protein self-associationwas addressed bymassspectrometry (MS).
3.1.1. EndoV in the absence of b-MEIn AUC, we could detect two main peaks with sedimentation
coefficients in water, s20,w, of 4.0 and 6.31 S (Fig. 1(A)), corre-sponding to Ms of 63.9 and 132 kDa, respectively. These two peaksroughly correspond to the monomer and dimer, respectively (thetheoretical M of the monomer is 65.5 kDa). There is a small peak ats20,w ¼ 10.16 S, with an estimated M of 271 kDa, which wouldcorrespond to the presence of a tetrameric species.
The DLS experiments (in volume) had a single peak with a hy-drodynamic radius of 53 ± 22 Å, yielding an M of 170 ± 70 kDa(assuming a spherical shape for EndoV) (Fig. 1(B)). That peak had alarge poly-dispersity: 41%, which indicates the presence of differentself-associated species.
In SEC experiments, EndoV eluted at pH 7.0 (50 mM phosphatebuffer) as a single peak at 11.10 ± 0.06 ml (the average of threemeasurements). The Ve did not change in the protein concentrationrange from 1 to 10 mM. This volume yields a RS of 46 Å, similar tothat of the marker protein aldolase (whose RS is 48 Å with an M of158 kDa). Thus, our SEC results further support that EndoV is adimer at physiological conditions. It is important to note that if wehad used the linear relationship between the M and s of a protein[24], then, the apparentM of EndoV should have been 212 kDa. Wedid not use this relationship, instead of that between the RS and s(see Materials and Methods section), since in the used column, thelinear relationship between theM and s is worse than that with theRS (regression coefficient of 0.92 versus 0.97).
The MALDI-TOF mass spectrum of EndoV exhibited two main
peaks centred at m/z 64,000 and 128,000 (Fig. 1(C)). The formermatched very well with the M expected for EndoV based on itscloned sequence. Interestingly, the detection of higher species atm/z 128,000 indicated that EndoV was also present under a dimericform. The corresponding ion was of high intensity, similar to theintensity of the monomer whatever the concentration of theenzyme used (data not shown). This result evidences the highpropensity of EndoV to form a dimer. Besides, this dimer resists theMALDI ionization conditions, suggesting a relatively well-stabilizedbio-molecular association.
We can further elaborate on the theoretical value of the RS forEndoV. The RS value for an ideal un-solvated spherical molecule canbe theoretically calculated by considering that the anhydrous mo-lecular volume,MV=NAv, is that of a sphere [24] of radius R:
R ¼ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi3MV=4NAvp
3q
, where NAv is Avogadro's number. The calculated
RS for a dimeric EndoV is 33 Å, but since the hydration shell isusually 3.2 Å wide [25], the RS of EndoV would be around 37 Å,smaller than those from SEC and DLS (46 Å). In addition, the RS of a
folded spherical protein can be also approximated by[26]:RS ¼ ð4:75±1:11ÞN0:29, where N is the number of residues; for aspherical dimeric EndoV this expression yields 30 ± 3 Å. Then, thesetheoretical results suggest that the shape of dimeric EndoV was notspherical. We further support this conclusion by calculating thefrictional coefficient of the protein, f. With the values of s20,w for thedimeric species and the M, we can calculate the frictional coeffi-cient, f [24,27], and compare with that of a spherical molecule(calculated from RS), f0. For EndoV, the ratio f/f0 was 1.54, when inglobular folded proteins is in the range 1e1.20 [24]. This high valuecould be caused either by a large shell of hydration (which is un-likely [24]) or by an elongated shape.
To sum up, the three hydrodynamic techniques and MS suggestthat, in the absence of a redox agent, EndoV was a dimer with anelongated shape.
3.1.2. EndoV in the presence of 2 mM b-MESince the above experiments were carried out in the absence of
reducing agent, we could raise the question whether the observedself-association of EndoV could be due to inter-molecular disul-phide bridges. To rule out this possibility, we carried out AUC andSEC experiments in the presence of 2 mM b-ME.
The AUC experiments showed two peaks at s20,w of 3.88 and6.23 S (data not shown), similar to those observed in the absence ofthe redox agent. The DLS experiments yielded also a single peak(red line) with similar RS as that in the absence of b-ME (black line):47 ± 13 Å (with an M of 126 ± 35 kDa) (Fig. 1(B)), with a poly-dispersity of 28%. The decrease in the poly-dispersity (whencompared to results in the absence of redox agent) could indicatethat the presence of b-ME removes some disulfide-bridgedscrambled species. We added b-ME (at 2 and 10 mM concentra-tion) to the sample which had not been purified in its presence (seeMaterials and Methods section), and we obtained a similar RS asthose in the absence of such agent (Fig. 1(B)). Finally, the Ve ofEndoV was not modified by the presence of b-ME in the SEC ex-periments. Thus, the three techniques suggest that dimerization ofEndoV is not disulfide-bridge dependent, and self-association mustbe due to an intrinsic tendency of the protein.
3.2. EndoV acquired a native-like structure in a narrow pH range
If we wanted to measure the conformational stability of EndoV,wemust firstly determine inwhich pH range the protein acquired anative-like structure. Furthermore, we wanted to find out whetherthat pH range where the protein acquires a native-like structurematches that where the protein has the maximum enzymatic ac-tivity [7]. To that end, we used several spectroscopic and biophys-ical probes, namely, ANS fluorescence, intrinsic fluorescence, far-UV CD and SEC. All those techniques give complementary infor-mation on different structural features of EndoV. We used ANSfluorescence to monitor the burial of solvent-exposed hydrophobicpatches [28]. Intrinsic fluorescence was used to monitor changes inthe tertiary structure of the protein around its tryptophans andtyrosines. We carried out far-UV CD experiments to monitor thechanges in secondary structure. And we used SEC to determinepolypeptide chain compactness.
3.2.1. Fluorescence
3.2.1.1. Steady-state fluorescence and thermal denaturations.The fluorescence spectrum of EndoV at pH 7.0 and 20 �C had amaximum at 336 nm (Fig. 2(B), inset), suggesting that: (i) proteinfluorescence was dominated by, at least, one of the eleven trypto-phans in the primary structure; and, (ii) some of them were fullyburied in the structure. The intensity at 330 nm (as at any of the
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other explored wavelengths) showed two transitions as the pH wasvaried (Fig. 2(A), blank circles). The first one occurred with apKa ¼ 5.1 ± 0.1, and the second was probably due to the titration ofthe phenol group of some of the twenty-seven tyrosine residues; inthis transition, no basic baseline was observed, and then we couldnot obtain its midpoint. We also carried out a pH-titration in thepresence of 2mM b-ME, and, as expected, the results were identicalto those in its absence.
Thermal-denaturation experiments at several pHs (2.5, 4.5, 7.4and 12.1) were carried out by intrinsic fluorescence. At pH 4.5 and7.4, we observed an irreversible sigmoidal behaviour (Fig. 1A Sup-plementary Material) from where an apparent thermal midpoint(Tm) could be obtained. The apparent Tm ranged from 62.9 ± 0.3 �C(at pH 7.4) to 49.1 ± 0.3 (at pH 4.5). At acidic and basic pHs, nosigmoidal transition was observed. These results suggest that heatprobably induced association and formation of aggregated species.Due to the irreversibility at both pHs, we could not further elabo-rate on the apparent different protein stability.
3.2.1.2. ANS-binding. At low pH, the ANS fluorescence intensity at
480 nm was very large and decreased as the pH was raised(Fig. 2(B), main panel), indicating that EndoV had solvent-exposedhydrophobic regions at low pH. The intensity at 480 nm showed asigmoidal behaviour, with a pKa ¼ 3.75 ± 0.07. This value wassmaller than that from intrinsic fluorescence, suggesting that thesolvent-exposed hydrophobic patches are buried before acquisitionof secondary and tertiary structures.
3.2.2. CDWe acquired far and near-UV spectra of the protein at pH 7.0 and
20 �C. The near-UV provides information on the asymmetry (andthen on the rigidity) of the aromatic residues (11 Trp, 27 Tyr and 22Phe). The near-UV of EndoV had two intense negative peaks at 280and 292 nm (Fig. 2(C), inset), suggesting an asymmetric environ-ment for some aromatic residues. The band at 292 nm was moreintense than that at 280 nm, indicating a rigid conformation forsome tryptophans [29,30]. The shape and intensity of the spectrumdid not change upon addition of 2 mM b-ME (data not shown).
The far-UV CD had an intense minimum at 222 nm (Fig. 2(C)),but it did not show another minimum at 208 nm, suggesting that
Fig. 1. Hydrodynamic measurements and MS of EndoV: (A) AUC results in absorbance mode. The signal at 0 S is an artefact of the analysis. (B) DLS (in volume) in the absence(black line) and in the presence of 2 mM b-ME (red line). (C) MALDI-TOF MS. SA was used as matrix.
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the protein is composed of b-sheet and a-helix. Deconvolution ofthe spectrum by using Dichroweb [31,32] (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml) yields percentages of: (i) a-helixgoing from 60% (in K2D) to 14.7% (in Contin); (ii) b-sheet going from51.7% (in Contin) to 7% (in K2D); and, (iii) random-coil of 30% in thethree programs used. Thus, it seems that EndoV at physiological pHcontains larger percentages of ordered structure than random-coil,but we cannot decide, given the large variability among the pre-dictors, which kind of secondary structure (a-helix or b-sheet) hasthe largest percentage. We also carried out experiments in thepresence of 2 mM b-ME, and we did not observe any difference inthe shape (and therefore, in the percentages of secondary structureobtained) of the spectrum.
The shape of the far-UV CD spectra changed as the pH wasvaried. Between pH 6.0 and 8.0, the ellipticity reached a maximum,to decrease at lower and higher pH. At high pH, we could not obtainthe pKa of the transition due to the absence of a plateau at basicpHs. At acidic pH, the pKa was 5.3 ± 0.1, similar, within the error, tothat measured by fluorescence (see above).
Thermal-denaturations followed by CD in EndoV (pH 2.5, 4.5, 7.4and 12.1) showed only sigmoidal, irreversible transitions at pH 4.5and pH 7.4 (as in fluorescence). The apparent Tms were56.4 ± 0.3 �C, and 57.1 ± 0.2 �C (Fig. 2 Supplementary Material),respectively. Since the processes were irreversible, we cannotspeculate more on these values and their differences with thosemeasured by fluorescence.
3.2.3. SECAt pH < 5.0, the Ves were larger than the column bed volume
(19.31 ml) (Fig. 2(D)). These results suggest that EndoV, eventhough NaCl was present, was bound to the column at those acidic
pHs. From the experiments with ANS (Fig. 2(C)), EndoV hadsolvent-exposed hydrophobic patches at low pH; we hypothesizethat those regions could interact with the column, resulting inlarger Ves. At 5.0 < pH < 7.0, the Ve was decreasing until a constantvolume of 11.10 ml was reached. Therefore, the protein did notreach a native-like compactness until physiological pH. The same Vewas observed in the presence of 2 mM b-ME.
3.2.4. FTIRTo further confirm the percentages of secondary structure found
by CD, we carried out FTIR experiments, and we deconvoluted theAmide I band (Fig. 3 Supplementary Material). We obtained a 45%of a-helix (with the band centred at 1657 cm�1); 37% of b-sheet(1633 cm�1); 7% of turns and high frequency b-sheet (1678 cm�1);and 9% of random-coil (1643 cm�1). Thus, the predictions for the a-helix were larger than those from CD deconvolution, and those forthe b-sheet were similar in both techniques. The overestimation ofthe a-helix component could be due to the fact that its centre isslightly shifted to high frequencies than expected, and thus it mayoverlap with the component for loops/turns (appearing at1660 cm�1).
3.3. Thermal denaturations of EndoV by DSC
Denaturation of EndoV by DSC revealed a single denaturationtransition, both under oxidizing and reducing conditions (Fig. 3(A)).Due to the irreversibility of the thermal denaturation, and thepresence of a slight protein concentration dependence underreducing conditions (Fig. 3(B)), we attempted the fit of the DSCscans to an irreversible two-state denaturation model with non-first-order kinetics (Eqs. (4), (7) and (8)) [20,21]. This model
Fig. 2. pH-induced structural changes of EndoV followed by biophysical techniques: (A) Changes in the molar ellipticity at 222 nm (filled squares, left axis), and in the intrinsicfluorescence at 330 nm (after excitation at 280 nm) (blank circles, right axis). (B) ANS fluorescence emission at 480 nm. (Inset) Fluorescence spectrum (after excitation at 280 nm) atpH 7 and 25 �C. (C) Far-UV (main panel) and near-UV CD (inset) at pH 7.0 and 25 �C. (D) The Ve in a Superdex 200 HR 16/60 gel filtration column. The errors are standard deviationsfrom three independent measurements.
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describes very well the experimental DSC data (Fig. 3(A)). Thevalues of mwere close to unity in the absence and in the presence ofb-ME, suggesting that deviations from first-order kinetics wereminimal (Table 1). Additionally, the use of different consistencytests (based on different procedures to estimate Ea values;Fig. 3(C)e(E)), yielded similar values, thus supporting the applica-bility of the model (Tables 1 and 2).
The average DH values were 189.6 kcal mol�1 (averageTm ¼ 62.7 �C; in the absence of the reducing agent) and143.8 kcal mol�1 (average Tm ¼ 62.3 �C; in the presence of b-ME);the Tm values were similar to those from fluorescence measure-ments (see above). Although we had observed that the dimeriza-tion state of the EndoV was not affected by the presence of thereducing agent, thermal unfolding was altered by its presence,probably due to formation of intermolecular disulphide bridges.The theoretical DH and DCp values for a 575-residue-long protein(including the His-tag) at these Tms was 444 kcal mol�1 (taking intoaccount that DH(60 �C)¼ 0.698*N (kcal$mol�1)¼ 420.9 kcal mol�1;DCp ¼ 13.86*N (cal$mol�1$K�1) ¼ 8.36 kcal mol�1 K�1) [33]. Thesedifferences suggest that thermal denaturation did not lead tocomplete unfolding of the protein.
The Arrhenius plots (Fig. 3(C)) allow extrapolation of k to 37 �C,providing values of (1.2 ± 0.5)$10�5 and (1.0 ± 0.2)$10�5 min�1
(obtained from six independent measurements) under reducing
and non-reducing conditions, respectively. These values wereidentical within the error and they correspond to half-lives of39 ± 16 and 46 ± 9 days for this unfolding reaction.
3.4. Chemical denaturations of EndoV
Since thermal-denaturations were irreversible, we carried outurea- and GdmCl-denaturations to measure the conformationalstability of EndoV by intrinsic fluorescence and CD. Denaturationswere carried out at 25 �C and pH 7.0 (phosphate buffer), where theprotein has acquired a native-like conformation. As the GdmCl orurea concentrations were increased, the ellipticity at 222 nm or thefluorescence intensity were reduced in a sigmoidal manner (Fig. 4).
Fig. 3. DSC analyses. (A) DSC profiles (excess heat capacity versus T) under oxidative (circles) and reducing (squares) conditions using 10 mM of protein (protomer units) and 4 �C/min scan rate. Lines are fits to a two-state irreversible model. (B) Protein concentration dependence of Tm values (circles, oxidative conditions; squares, reducing conditions). (CeE)Consistency tests providing values for Ea from their slopes (symbols are the same as for A and B).
Table 1Energetic parameters for thermal denaturation from DSC measurements.
Conditions Tm (Κ)a DH (kcal mol�1)b Ea (kcal mol�1)c mb
No b-ME 336.70 ± 0.05 189 ± 9 74 ± 7 0.87 ± 0.03With b-ME 336.3 ± 0.3 144 ± 16 79 ± 6 1.0 ± 0.1
a Average ± standard deviation (s.d.) from eight independent experiments atdifferent protein concentrations (2e10 mM in protomer units) and 4 �C/min.
b Average ± s.d. from at least ten independent experiments at different proteinconcentrations and scan rates.
c Average ± s.d. from four different consistency tests.
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The denaturations were irreversible with both denaturants. TheGdmCl-denaturations did not show a long native baseline(Fig. 4(A)); conversely, urea-denaturation curves did not have longenough unfolded baselines, and the transition appeared to be lessco-operative (broader) than that followed by GdmCl (Fig. 4(B)), asexpected [34]. In both denaturants, we only observed a singletransition in the curves.
4. Discussion
4.1. Structure-function relationships in EndoV
EndoV acquired a native-like conformation only between 7 and9, and did so in a two-step process, with different pKa (midpoint)values. First, it buried all the solvent-exposed hydrophobic resi-dues (ANS fluorescence) and second, it acquired concomitantly the
secondary (far-UV CD) and tertiary (fluorescence) structures, and afull compactness (SEC experiments). Thus, as the pH is close to 7.0,the protein becomes more compact, and from the variation in theVe (Fig. 2(D)), it acquired its quaternary structure between pH 5.0and 7.0. At low pH, the protein has lost approximately one-third ofits secondary structure (as judged from the values of ellipticity at222 nm), and the remnant was not rigid (as concluded from theabsence of sigmoidal behaviour in the thermal denaturations atvery low pH (pH 2.4)). We could not determine the exactoligomerization state of the protein at very low pH, but the factthat the protein precipitated at concentrations above 2 mM atpH < 4.0, together with: (i) the large amount of solvent-exposedhydrophobic patches (ANS binding experiments); and, (ii) thebinding to the column at pH < 5.0, seem to indicate that at lowpHs the protein had a tendency to form high-order self-associatedspecies.
The pH interval where the protein acquired a native-likestructure is the same where the protein shows its maximum ofactivity; in fact, the percentage of activity is lower than 50% atpH < 7.0 [7]. Thus, well-rigid secondary and tertiary structures arerequired for a full enzymatic activity.
We also determined that the Tmwas close to 62 �C, and it occursthrough an irreversible process with first-order kinetics, thusinvolving a dimeric denaturation transition state. Interestingly,enzyme activity at pH 8.0 suggests that the maximum activity washappening at 30 �C [7] and that this activity decreased abruptly atlower and high temperatures (for instance, at 40 �C, the activity wasonly 20% of that observed at 30 �C [7]). Therefore, enzyme inacti-vation occurs at temperatures lower than those for global dena-turation, suggesting lower conformational stability or enhancedflexibility of the active site. In fact, DLS control experiments at 35 �Cshowed an increase in the poly-dispersity, and in the average RS, ofthe species in solution with the incubation time at this tempera-ture. Moreover, in FTIR spectra at 35 �C the characteristic bands ofb-sheet aggregated species (1616 and 1683 cm�1) [35] werepresent.
To sum up, our structural studies at different pHs and temper-atures indicate that only when EndoV acquired a rigid orderedstructure, within a narrow pH range (7.0e9.0), it was fully active.
4.2. Structure of EndoV
Our studies provide the first clues for the structural elucidationof EndoV. We have found that EndoV is a dimer, with monomerswith a high percentage of b-sheet and/or a-helix. Although de-naturations were irreversible, the apparent two-state nature ofchemical and thermal (calorimetric) denaturations might suggestthat unfolding of EndoV implies the concomitant dissociation andunfolding of the monomers, although caution must be taken intoaccount since enzymatic inactivation occurs before the maindenaturation event by temperature. This result suggests that iso-lated monomers might not be stable enough [36,37], and then,quaternary structure might be essential for the integrity of nativeprotein monomers. Moreover, we hypothesize that the low stabilityof the isolated monomers could facilitate rapid switching off sig-nalling, and the low monomer stability could be critical in
Table 2Consistency tests for the calculation of Ea (in kcal mol�1). Data are from six to seven independent experiments at different scan rates and protein concentrations.
Conditions Ln (n/Tm2 ) versus 1/T Fits Arrhenius Ln(ln(DH/(DH/<H>))) versus 1/T Average Ea± s.d.
No b-ME 84 ± 4 69 ± 6 74 ± 1 68 ± 4 74 ± 7With b-ME 88 ± 5 76 ± 8 75 ± 2 76 ± 8 79 ± 7
Fig. 4. Chemical-denaturation of EndoV: (A) The GdmCl-curves monitored by theintrinsic fluorescence at 330 nm after excitation at 280 nm (blank, blue circles, rightaxis) and the ellipticity at 222 nm (blank, black circles, left axis). (B) The urea-curvesmonitored by the intrinsic fluorescence at 330 nm after excitation at 280 nm (blank,blue circles, right axis) and the ellipticity at 222 nm (blank, black circles, let axis).Similar curves were obtained by following fluorescence after excitation at 295 nm atany other wavelength.
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modulating the function of the protein.There are, however, differences in the percentages of the a-
helix secondary structure obtained by the FTIR and CD, and thereare large variations among the CD deconvolution programs. Thedifferences in the predictions between both techniques could bedue to the deconvolution procedures used and in the smallchanges observed in FTIR in the position of the band corre-sponding to a pure a-helix. Alternatively, the smaller a-helixpercentage in some of the CD programs could be due to the factthat, the spectral ellipticity at 222 nm was used mainly to deter-mine the percentages of helical structure, but at this region thearomatic residues (60 in the sequence of EndoV) also contribute tothe spectrum with positive or negative bands, depending of theirenvironments [38e40].
There are several X-ray crystal structures of other sulfatasessolved to date ([41] and references therein) and all of them show anoligomeric structure, with a nearly spherical globular shape. All ofthose sulfatases are a/b proteins, but their percentages of b-struc-ture are lower than that estimated in EndoV (15e20% versus 35% inthis work). Besides, the similarity of the sequence of these proteinsand EndoV was never higher than 40% [42,43]. Thus, our findingsindicate that EndoV could havemore b-structure and that the shapeof each monomer could not be spherical at all and it could define anew fold in the sulfatase family. We do not know at this stage,whether the particular function of EndoV (a 4-O-endosulfatase),when compared to those of other endosulfatases, is behind thosestructural differences, but the X-ray structural elucidation of theEndoV could provide new clues to the structure-function re-lationships of this protein.
Conflict of interest statement
The authors declare they do not have any competing interest.
Author contributions
JLN, AC-A APL, JGH-C, JGT, RD and SV designed the research. JLN,EM-C, JGH-C, LM-G, AC-A and IS acquired the experiments. FLprovided materials and vectors. JLN, AC-A APL, JGH-C, JGT, RD, FGand SV analyzed the data. JLN, AC-A APL, JGH-C, JGT, RD, FG and SVwrote the manuscript.
Acknowledgements
We deeply thank May García, María del Carmen Fuster, RaquelJorquera and Javier Casanova for excellent technical assistance. Thiswork was supported by regional grants of Generalitat Valenciana(to JLN, Prometeo 018/2013); Junta de Andalucia (to ALP, P11-CTS-07187); Generalitat de Catalunya (to SV, SGR-GRC-2014-00885);and Fundaci�on S�eneca de la Regi�on de Murcia (19353/PI/14 to JGH-C and JGT). By Spanish Ministry of Economy and Competitivenessand FEDER (EU): BIO2012-39922-C02-01/02 (ACA) and CTQ2015-64445-R (JLN), and the Spanish Institute Carlos III (FIS-PI113-01330to SV). The funding grant did not intervene in the design of theexperiments, nor inwriting the results. EMC and LMG acknowledgepre-doctoral fellowships from Andalusia government, and fromUAB, respectively.
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data related to this article can be found at http://dx.doi.org/10.1016/j.biochi.2016.09.015.
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1
MASS SPECTROMETRY ANALYSIS OF THE HUMAN ENDOSULFATASE HSULF-2
Ilham Seffouha, Cédric Przybylskia,1, Amal Seffouhb, Rana El Masrib, Romain R.
Vivèsb, Florence Gonneta, Régis Daniela*
aUniversité Paris-Saclay, CNRS, CEA, Univ Evry, LAMBE, 91025, Evry, France
bUniv. Grenoble Alpes, CNRS, CEA, IBS, Grenoble, France
*Running title: MS analysis of HSULF-2
*Corresponding author: Dr. Regis Daniel, CNRS, UMR8587, Laboratoire Analyse et
Modélisation pour la Biologie et l'Environnement, Université Evry-Val-d'Essonne F-
91025 Evry, France. Fax: + 33 01 69 47 76 55; E-mail: [email protected]
1 Present address: Sorbonne université, IPCM, CNRS UMR8232, 4 place Jussieu, 75252 PARIS
Cedex 05, France
2
ABSTRACT:
The human 6-O-endosulfatases HSulf-1 and -2 catalyze the region-selective hydrolysis
of the 6-O-sulfate group of the glucosamine residues within sulfated domains of
heparan sulfate, thereby ensuring a unique and original post-biosynthetic
modification of the cell surface proteoglycans. While numerous studies point out the
role of HSulf-2 in crucial physiological processes as well as in pathological conditions
particularly in cancer, its structural organization in two chains and its functional
properties remain poorly understood. In this study, we report the first
characterization by mass spectrometry (MS) of HSulf-2. An average molecular weight
of 133,115 Da was determined for the whole enzyme by MALDI-TOF MS, i.e. higher
than the naked amino acid backbone (98,170 Da), highlighting a significant
contribution of post-translational modifications. The HSulf-2 protein sequence was
determined by Nano-LC-MS/MS, leading to 63% coverage and indicating at least four
N-glycosylation sites at Asn 108, 147, 174 and 217. These results provide a platform
for further structural investigations of the HSulf enzymes, aiming at deciphering the
role of each chain in the substrate binding and specificities and in the catalytic
activities.
Keywords: HSulf-2; 6-O-endosulfatase; sulfatase; heparan sulfate; formylglycine;
mass spectrometry
3
1. Introduction
The human heparan sulfate 6-O-endosulfatases HSulf-1 and HSulf-2 (HSulfs, EC
3.1.6.14) catalyze the regioselective hydrolysis of the 6-O-sulfate groups within
heparan sulfate (HS) chains present on cell surface proteoglycans and extracellular
matrix [1, 2]. HSulfs exhibit two unique features among human sulfatases, since to
date they are the only known sulfatases to be secreted in the extracellular medium,
and to be active at neutral pH and at the polymer level [3]. They belong to HS 6-O-
endosulfatase family, which was firstly discovered in early 2000’s in quail embryo [4,
5], and then in chick [6], Xenopus laevis [7, 8], sea urchin [9], zebrafish [10], Drosophila
[11] and mammals [3, 12-14]. Sulf enzymes were initially found during quail embryo
development, highlighting their roles in modulating the binding of the morphogen
Wnt to HS and thereby the Wnt signaling [8, 15]. Since then, Sulfs have been shown
to be involved in key developmental and tumoral processes through an
unprecedented post-biosynthetic editing mechanism of the 6-O-sulfate pattern of HS
[16-20]. Being confined to the highly sulfated domain (NS) of HS, HSulf-catalyzed 6-
O-desulfation process leads to a modest decrease in the polysaccharide 6-O-sulfation
content, and thus to a limited impact on its overall sulfation (4-5% sulfate loss) [21].
Remarkably, such moderate but subtle changes in HS sulfation pattern lead to massive
alteration of its biological activities, affecting the polysaccharide modulatory
properties towards a large number of growth factors, morphogens and chemokines
[15, 22-23].
Despite the key role of HSulfs in the cellular glycomic machinery, these enzymes
remain elusive protein objects as regard their structure and functions. In one hand,
much effort has been devoted to the understanding of the enzyme reaction
specificities, revealing a narrow specificity of HSulfs for highly sulfated disaccharide
constituents within the NS domain of HS, and a processive oriented 6-O-desulfation
starting from the non-reducing end [3, 24]. In the other hand, much less is known
about the structural organization at a molecular level, and no crystallographic data
have been reported to date. Main structural insights arise from gene-derived sequence
analysis and from mutation/deletion experiments [3, 25-26]. HSulfs are
biosynthesized as single polypeptide chain pro-enzymes (871 and 870 amino-acids for
4
HSulf-1 (Q8IWU6) and-2 (Q8IWU5), respectively) comprising a signal peptide,
followed by a catalytic domain featuring the formylglycine residue of prototype
sulfatase active site, a hydrophilic domain (HD), and a C-terminal domain presenting
a significant homology with that of the lysosomal glucosamine-6-sulfatase [3-4, 16]. A
maturation process including the removal of the signal peptide and the cleavage
within the HD domain by a furin protease yields the mature enzyme as a two-chain
protein likely joined by disulfide bonds [3,16, 26]. As regard for HSulf-2, it results in a
maturated active heterodimer, which consists in a longer chain comprising the
catalytic domain (Phe 1 to Glu 391) and part of the HD domain cleaved at Arg 514,
and a shorter chain composed of the remaining part of the HD domain and the C-
terminal domain (Scheme 1).
Scheme 1. Schematic view of the domain organization of HSulf-2
Domains from N- to C terminus are displayed with their four ending residues: signal peptide (orange, 24 aa);
catalytic domain (dark blue, 391 aa); hydrophilic domain (green, 307 aa); C-terminus (blue, 148 aa). The
following sequence key points are indicated: Fgly 64, active site formylglycine at Cys64; RSIR 514, main furin
cleavage site in HD; RNLTKR 541, secondary furin cleavage site in HD; 678 KRKKKLRKLLKR 689, HD C-
terminus basic residues cluster.
It is worth noting that HSulfs were most often indirectly detected in previous
studies, generally by western-blotting and/or through the monitoring of its catalytic
activity. We report here the first mass spectrometry characterization of HSulf-2,
allowing its direct detection at the protein level and the coverage of the full protein
sequence by a bottom-up proteomics approach.
2. Materials and methods
2.1. Materials
5
All reagents were of analytical grade. DL-dithiothreitol (DTT), iodoacetamide (IAA),
ammonium bicarbonate (NH4HCO3), and urea were all purchased from Sigma-
Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France). Acetonitrile and formic acid were obtained
from Fluka (France); sequencing-grade trypsin, Arg-C, Chymotrypsin, Asp-N,
Trypsin/Lys-C Mix and PNGase F were from Promega (France). Purified recombinant
HSulf-2 was prepared according to a procedure described in a forthcoming report.
Briefly, the enzyme was purified from the conditioned medium of HSulf-2 transfected
HEK293F cells, using cation exchange and size exclusion chromatography,
successively (A. Seffouh et al., to be submitted). The purified active enzyme was stored
at -80 °C in 50 mM Tris buffer, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2 pH 7.5. All
buffers and solutions were prepared using ultra-pure water from a MilliQ apparatus
(Millipore, Merck, France).
2.2. N-Deglycosylation of HSulf-2
N-deglycosylation of HSulf-2 (3µg) by PNGase F was carried out under denaturing
conditions in a 20 µL final volume according to the provider instructions (Promega).
The deglycosylation of HSulf-2 was carried out by the addition of 2 µL of recombinant
PNGase F and incubation at 37 °C for 1–3 hours.
2.3. Desalting of HSulf-2
Desalting of HSulf-2 was performed by diafiltration using Microcon® DNA Fast
Flow 100 kDa (Millipore) previously washed with 300 µL water. HSulf-2 sample (30
μg, 40 µL) supplemented to 200 µL with water was centrifuged in Microcon at 500 g
for 4 min at 4°C. Then, 200 µL of water were added and centrifugation was repeated
for few min to get about 30 µL final volume. Finally, the Microcon was returned to
recover the HSulf-2 sample in 30 µL water retentate.
2.4. MALDI-TOF Mass spectrometry
MS experiments were carried out on a MALDI Autoflex speed TOF/TOF MS
instrument (Bruker Daltonics, Germany), equipped with a SmartBeam IITM laser
pulsed at 1 kHz. The spectra were recorded in the positive linear mode (delay: 600 ns;
ion source 1 (IS1) voltage: 19.0 kV; ion source 2 (IS2) voltage: 16.6 kV; lens voltage: 9.5
kV). MALDI data acquisition was carried out in the mass range 5000-150000 Da, and
6
10000 shots were summed for each spectrum. Mass spectra were processed using
FlexAnalysis software (version 3.3.80.0, Bruker Daltonics). The instrument was
calibrated using mono- and multi-charged ions of BSA (BSA Calibration Standard Kit,
AB SCIEX, France). MALDI-TOF MS analysis was achieved by mixing 1.5 µL of
sinapinic acid matrix at 20 mg/mL in acetonitrile/water (50/50; v/v), 0.1% TFA, with
1.5 µL of the desalted protein solution (0.71 mg/mL).
2.5. In-solution proteolytic digestions of HSulf-2
For trypsin digestion, 2 µL of HSulf-2 sample (3 µg) were diluted in 5.5 µL of 50
mM NH4HCO3 pH 8.0 to which 2.5 µL of 8 M urea were added (2 M final), and then
incubated for 1h at room temperature under moderate stirring. Samples were then
reduced by addition of 1.1 µL DTT (5 mM final) for 1h at 37°C under moderate stirring.
Samples were then alkylated by addition of 1 µL IAA (20 mM final) and left for 45 min
at room temperature in the dark. Before performing trypsin digestion, 6.9 µL 50 mM
NH4HCO3, pH 8.0, was added to the samples to reach a final concentration of 1 mM
urea. Trypsin (1 µL of 0.4 µg.µL-1) was then added before overnight incubation at 37
°C. Conditions for digestion by Trypsin/Lys-C Mix, Asp-N, Chymotrypsin, and Arg-
C are reported in Supplementary Materials.
2.6. In-gel proteolytic digestions of HSulf-2
HSulf-2 was analyzed in reducing conditions in 12% polyacrylamide gel. HSulf-2
treated/untreated with PNGase F (25/10 µL) was mixed with an equal volume of
Laemmli SDS-sample buffer (60 mM Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-
mercaptoethanol, 0.01% bromophenol blue), heated for 5 min at 95 °C and then
centrifuged and cooled at ambient temperature before to be loaded into wells.
The protein bands were excised, cut into small cubes, destained and washed with
50 µL of 0.1 M NH4HCO3, and then shrunk by dehydration in acetonitrile for 5 min
(repeated 3 times). The gel pieces were next incubated in 50 µL 10 mM DTT for 35 min
at 56 °C. After cooling to room temperature, the DTT solution was replaced by 50 µL
acetonitrile for 5 min, then by 50 µL 0.1 M NH4HCO3 for 5 min followed by
dehydration in acetonitrile for 5 min. Alkylation was carried out by addition of 50 µL
of 50 mM IAA and incubation for 30 min at room temperature in the dark. The gel
7
pieces were rinsed twice alternatively with 50 µL of acetonitrile, and with 50 µL of 0.1
M NH4HCO3 (5 min each), followed by a final dehydration step with acetonitrile. The
gel pieces were then rehydrated in 40 µL of 0.1 M NH4HCO3, pH 8.0, containing 0.4
µg of sequencing grade trypsin. After overnight digestion at 37°C, the supernatant
was collected, the gel pieces were re-suspended in 50 µL of acetonitrile/water/formic
acid (60:40:0.1, v/v/v) and sonicated for 10 min at 37°C. Finally, the two resulting
supernatants were gathered, vacuum-dried and stored at -80 °C until analysis.
2.7. Peptide preparation for LC-MS/MS analysis
Prior to NanoLC-MS/MS analysis, HSulf-2 peptides from in-gel digestion were re-
suspended in 20 µL of solvent A (acetonitrile/water/formic acid 2:98:0.1, v/v/v).
HSulf-2 peptides from in-solution digestion were desalted by two filtration cycles on
ZipTip C18 (Millipore) according to the manufacturer procedure to remove urea.
Eluted peptides (40µL) were vacuum-dried and stored at -80°C until analysis. HSulf-
2 peptide digests were re-suspended in 30 µL of solvent A.
2.8. Reverse phase NanoLC-MS/MS analysis
Peptide mixtures were analyzed on a Dual Gradient Ultimate 3000
chromatographic system (Dionex) coupled to a LTQ-Orbitrap™ XL mass
spectrometer (Thermo-Fisher Scientific).
5 µL of peptide solution in solvent A were injected at 20 µL/min flow rate onto a
C18 pre-column (Acclaim PepMap C18, Dionex) to concentrate and desalt for 5 min in
solvent A (water/acetonitrile/formic acid, 98:2:0.1, v/v/v). Then, peptide separation
was carried out on a C18 capillary column (Acclaim PepMap C18, Dionex) at 300
µL/min flow rate according to the gradient: 0% solvent B (acetonitrile/water /formic
acid 80/20/0,1; v/v/v) during 6 min, then 0 to 70% B over 49 min, then 70% to 100%
B over 2 min, 100% B during 10 min and finally decreasing to 0% B in 3 min. The
column was finally re-equilibrated with 100% solvent A for 15 min. The LC eluent was
sprayed into the MS instrument with a glass emitter tip (Pico-tip, New Objective,
USA).
The LTQ-Orbitrap XL mass spectrometer (Thermo-Fisher Scientific) was operated
in positive ionization mode. Singly charged species were excluded from
8
fragmentation; dynamic exclusion of already fragmented precursor ions was applied
for 300 s, with a repeat count of 1, a repeat duration of 30 s and an exclusion mass
width of +/- 1.5 m/z. The minimum MS signal for triggering MS/MS was set to 500.
One microscan was acquired for all scan modes. The Orbitrap cell recorded signals
between 250 and 1600 m/z in profile mode with a resolution set to 60,000 in MS mode.
The 5 most intense ions/scan were dissociated by CID (normalized collision energy
35%, precursor selection window 3 Da). During MS/MS scans, fragmentation and
detection occurred in the linear ion trap analyser in centroid mode. The automatic gain
control allowed accumulating up to 106 ions for FTMS scans and 104 ions for ITMSn
scans. Maximum injection time was set to 500 ms for FTMS scans and 100 ms for ITMSn
scans.
2.9. Database search
Raw data files were processed using Proteome Discover 1.4 (Thermo Fisher
scientific) to obtain Mascot-compatible .MGF files. Searches in the Swissprot Database
were performed first in human taxonomy using the Mascot server (version 2.2.07,
Matrix Science) with the following parameters: 1 missed cleavage, monoisotopic
identification, tolerance on mass measurement 10 ppm for MS and 0.6 Da for MS2. To
speed up the search, a homemade database was manually created containing the
sequences of HSulf-2 chains. The MS/MS spectra were searched with semitryptic
cleavage for trypsin, eight missed cleavage for chymotrypsin, and a maximum of two
missed cleavages for the other proteases; no fixed modification was set; the following
variable modifications were allowed: carbamidomethyl (C), carbamyl (K), carbamyl
(N-term), deamidation (QN), formylGly (C), oxidation (M), and propionamide (C)
without carbamyl (N-term, K) specifically for peptides resulting from in-gel digestion.
Fragment types taken into account were those specified in the configuration “ESI-
trap” for CID MS/MS. MS/MS spectra were all visually inspected to search for y/b
discriminating ions and validate peptide sequences.
9
3. Results and discussion
Recombinant HSulf-2 was overexpressed in the HEK293F cells, yielding an active
enzyme on HS and heparin oligosaccharide substrate [24]. Trypsin digestion of HSulf-
2 was carried out in solution in order to get complete sequence coverage of both short
and long chains. However, this digestion performed in usual reducing/alkylating
conditions led to poor sequence coverage (not shown), indicating a weak accessibility
of the cleavage sites to trypsin. To increase proteolysis efficiency, proteolytic digestion
was carried out in presence of urea. This protocol modification improved the digestion
efficiency, since the sequence of both long and short chains of HSulf-2 was
significantly covered for the first time (39% for each chain, Fig. 1). No significant
coverage increase was observed following addition of various detergents (not shown),
thus suggesting a particularly tight structural organization of HSulf-2.
To further increase the sequence coverage of HSulf-2 in solution, various other
proteases or protease mixture (trypsin/Lys-C, Arg-C, chymotrypsin, Asp-N, Glu-C)
with different specificities were used. Slightly higher coverage percentages of the long
chain sequence were obtained with Arg-C and the mix trypsin/Lys-C (43%), while
trypsin remained the most efficient protease for the short chain (39%) (Fig. 1, Fig. S1).
Overall, by merging the different peptides produced by the various proteases in a
single sequence map, 63 % of the whole HSulf-2 sequence was covered, the sequence
coverage being slightly higher for the long chain (67 %) than for the short one (58 %)
(Fig. 2). Arg-C was the only protease to produce a peptide from the long chain
containing the residue Cys 64 detected mainly as a formylglycine residue (Fig. S2,
Table S2). Formylglycine is a key feature of sulfatase active site, which is essential for
the catalytic activity [27, 28]. It worth noting that previous reported point mutation
experiments abolishing the enzyme activity, targeted simultaneously Cys 64 and the
adjacent residue Cys 65 [3, 25]. For the first time, the catalytic residue formylglycine
is thus precisely located at Cys 64 and directly identified at the protein level in HSulf-
2, appearing as a major PTM occurring in HSulf-2.
Until now, experimental molecular weight of HSulf-2 estimated to around 125 kDa
relied on previously reported SDS-PAGE analysis, which showed the long chain at 75
10
kDa and the short chain hardly visible as a faint band at 50 kDa [26]. We confirmed
this electrophoretic pattern (not shown), however, to provide an accurate mass value,
HSulf-2 was submitted to MALDI-TOF MS analysis. Interestingly, the MALDI
spectrum of the HSulf-2 showed in high m/z range a single low intensity peak at m/z
133,412, that we assigned to the mono-charged ion [M+H]+ of the whole HSulf-2
molecule (Fig. 3). A major peak at m/z 66,410 dominated the spectrum, which could be
attributed to the doubly charged ion [M+2H]2+ of the entire HSulf-2 species. Based on
these mono- and doubly-charged ions, an average experimental mass value of 133,115
± 297 g.mol-1 was determined for the first time by MS for the whole HSulf-2 enzyme.
This experimental mass value was higher that the molecular weight deduced from the
amino acid composition (98,170 g.mol-1) suggesting a significant contribution of
PTMs. An additional ion at m/z 55,212 was also detected, which could arise from
possible variations in these modifications. The peak at m/z 66,410 exhibited a shoulder
(at. m/z 65,420, and probably its doubly charged ion at m/z 32,748, Fig. 3) that remains
unidentified. We cannot rule out that the observed shoulder along the doubly charged
ion of the entire HSulf-2 species could be an isolated chain, which remains linked to
the enzyme.
A shift of the HSulf-2 bands on SDS-PAGE was previously reported after treatment
by the N-glycosidase PNGase F [3, 25], indicating the presence of N-glycans in
agreement with the potential N-glycosylation sites along the HSulf-2 sequence
(Scheme 1). We performed the trypsin in-gel digestion and nanoLC-ESI-MS/MS
analysis of the resulting peptides on the most visible band attributed to the long chain,
before and after treatment of HSulf-2 by PNGase F. The detected peptides belonged
to the long chain (residues Phe 1 to Arg 514), ascertaining thus the identity of the main
band on SDS-PAGE (Fig. 3). 46 % of the long chain sequence was covered (i.e. 71 % of
the theoretical coverage expected by using trypsin), while the sequence coverage
reached 66 % (i.e. 100 % of the theoretical coverage expected by using trypsin) after N-
deglycosylation by PNGase F. The increased sequence coverage obtained after
PNGase F treatment indicates that some cleavage sites in the long chain are protected
from trypsin by N-glycan chains. Among the seven potential N-glycosylation sites
found within the long chain (Asn 41, 88, 108, 125, 147, 174, 217), five on Asn 88, 108,
11
147, 174 and 217 were detected only in peptides obtained after N-deglycosylation.
Conversely, Asn 125 is probably not a N-glycosylation site as it was detected in both
glycosylated and N-deglycosylated forms of the long chain. The N-terminal first forty
amino acids containing a potential N-glycosylation site were not covered. We assume
that the various trypsin cleavage sites present within this N-terminal region may yield
either too small peptides (6 residues, m/z above the chosen MS cutoff at 250) or the
too acidic long peptide (PNIILVLTDDQDVELGSMQVMNK, with the potential site of
glycosylation at Asn41) to be detected.
This study provides the first detailed structural data at the molecular level of the
human endosulfatase HSulf-2 by mass spectrometry. The entire enzyme molecule was
detected by MALDI-TOF allowing the determination of its average experimental mass
at 133,115 Da, which indicated a significant contribution of post-translational
modifications to the whole molecular mass. The protein sequence was covered by
bottom-up ESI-MS/MS, evidencing the presence of the sulfatase specific catalytic
residue formylglycine at Cys 64. The five conserved signatures of formylglycine-dependent
sulfatase [29] are well identified in HSulf-2, among them the two catalytic signatures C88 to
G98 and G135 to K143, and the two signatures comprising the sequences D52 to D53 and D317
to H318 involved in the coordination of a calcium ion. The increased protein sequence
coverage upon N-deglycosylation by PNGase F support the presence of numerous N-
glycans attached to HSulf-2 in agreement with previously reported apparent
molecular mass shift on SDS-PAGE, particularly at Asn 108, 147, 174 and 217 within
the long chain. While the in-gel digestion experiments of the long chain suggested Asn
88 as potentially N-glycosylated, this residue was actually identified in several peptide
sequences formed under in-solution digestion conditions, indicating that Asn 88 was
either not N-glycosylated like Asn 125 or could be a heterogeneous glycosylation site.
Further characterization of Hsulf-2 N-glycans and whole protein top-down analysis
are currently under way. The weak MS ionization efficiency of the protein and the
need for multiple proteases to achieve the full sequence coverage in solution make
HSulf-2 a tough protein to analyze and suggest tights folding and/or additional
unusual modification of the protein backbone. This study provides the basis for
further mass spectrometry investigations of the human endosulfatases.
12
Acknowledgements: We would like to thank V. Legros, D. Lebeau and W. Buchmann for help with running the Orbitrap and MALDI analysis. . This work was supported in part by the CNRS and the GDR GAG (GDR 3739), the French Infrastructure for Integrated Structural Biology (FRISBI) ANR-10-INSB-05-01, the “Investissements d’avenir” program Glyco@Alps (ANR-15-IDEX-02), and by grants from the Agence Nationale de la Recherche (ANR-12-BSV8-0023 and ANR-17-CE11-0040) and Université Grenoble-Alpes (UGA AGIR program). Conflict of interest: The authors declare that they have no conflicts of interest with the contents of this article.
13
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17
FIGURE LEGENDS
Figure 1. Sequence coverage percentages obtained by in-solution digestion of HSulf-2 using the proteases trypsin, trypsin/Lys-C Mix, Arg-C, chymotrypsin, Asp-N and Glu-C. Figure 2. Sequence coverage of the whole HSulf-2 enzyme. Merged sequence map of HSulf-2 determined by combining the covered sequences obtained by the proteases trypsin, trypsin/lys-C Mix, Arg-C, chymotrypsin, Asp-N and Glu-C. C: formylglycine in the catalytic domain; N: potential N-glycosylation site; RS: furin cleavage site. Figure 3. MALDI-TOF mass spectrometry analysis of HSulf-2. Mass spectrum of HSulf-2 in positive ionization mode (100 kDa-filtrated Hsulf-2, mixed with sinapinic acid matrix, linear mode).
18
Figure 1
39 39 393843
30
41 43
3732
36
2722
18
27
11 913
6367
58
whole HSulf-2 HSulf-2 long chain HSulf-2 short chain
pe
rce
nta
ge o
f co
vera
ge s
eq
ue
nce
(%
)
Trypsin Trypsin/Lys-C Arg-C Chymotrypsin Asp-N Glu-C Fusion map
19
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
Figure 2
20
Figure 3
21
Supplementary Material
MASS SPECTROMETRY ANALYSIS OF THE HUMAN ENDOSULFATASE HSULF-2
Ilham Seffouha, Cédric Przybylskia,2, Amal Seffouhb, Rana El Masrib, Romain
R.Vivèsb, Florence Gonneta, Régis Daniela*
aUniversité Paris-Saclay, CNRS, CEA, Univ Evry, LAMBE, 91025, Evry, France
bUniv. Grenoble Alpes, CNRS, CEA, IBS, Grenoble, France
*Running title: MS analysis of HSULF-2
*Corresponding author: Dr. Regis Daniel, CNRS, UMR8587, Laboratoire Analyse et
Modélisation pour la Biologie et l'Environnement, Université Evry-Val-d'Essonne F-
91025 Evry, France. Fax: + 33 01 69 47 76 55; E-mail: [email protected]
2 Present address: Sorbonne université, IPCM, CNRS UMR8232, 4 place Jussieu, 75252 PARIS Cedex 05, France
22
Fig. S1. Covered sequences (in red) of the Hsulf-2 by in-solution digestion by different proteases in the following order: Trypsin - Trypsin/Lys-C Mix - Arg-C – Chymotrypsin - ASP-N - Glu-C - fusion map.
C: formylglycine in the catalytic domain; N: potential N-glycosylation site; RS: furin cleavage site.
Long Chain 1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG 1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
23
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
24
Short Chain
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
SVAIEV DGRVYHVGLG DAAQPRNLTK RHWPGAPEDQ
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
551 DDKDGGDFSG TGGLPDYSAA NPIKVTHRCY ILENDTVQCD LDLYKSLQAW
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
601 KDHKLHIDHE IETLQNKIKN LREVRGHLKK KRPEECDCHK ISYHTQHKGR
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
651 LKHRGSSLHP FRKGLQEKDK VWLLREQKRK KKLRKLLKRL QNNDTCSMPG
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
701 LTCFTHDNQH WQTAPFWTLG PFCACTSANN NTYWCMRTIN ETHNFLFCEF
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
751 ATGFLEYFDL NTDPYQLMNA VNTLDRDVLN QLHVQLMELR SCKGYKQCNP
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
801 RTRNMDLGLK DGGSYEQYRQ FQRRKWPEMK RPSSKSLGQL WEGWEG
25
In-solution proteolytic digestions of HSulf-2
Trypsin/Lys-C Mix: 2 µL of HSulf-2 samples (3 µg) were diluted in 5 µL of 100mM
Tris-HCl pH 8.0 to which 2.5 µL of 8 M urea were added (2.1 M final concentration).
After incubation for 40 min at 26°C under stirring, samples were reduced by adding
of 1.1 µL DTT (5.1 mM, final concentration) for 1h at 30°C under moderate stirring.
Samples were then alkylated by addition of 1 µL iodoacetamide (21.5 mM final
concentration) and incubation for 45 min at room temperature, in the dark. Before
performing Trypsin/Lys-C Mix digestion, 5 µL 100 mM Tris-HCl pH 8.0 (50 mM final
concentration), and 2.4 µL water were added to the samples to reach 1 mM urea final
concentration. Trypsin/Lys-C Mix (1 µL at 0.2 µg/µL) was then added before
overnight incubation at 37°C.
Asp-N: 2 µL of HSulf-2 samples (3 µg) were diluted in 5 µL of 100mM NH4HCO3,
pH 8.0 supplemented with urea (2.1 M final concentration), and incubated for 40 min
at 26°C under stirring. Reduction and alkylation were performed as described above.
Prior to Asp-N digestion, 5 µL of 100 mM NH4HCO3, pH 8.0 (50 mM final
concentration) was added to the samples to reach 1 mM of urea final concentration.
Asp-N (3.75 µL of at 0.04 µg/µL, ratio 1:20, w/w) was then added and incubated
overnight at 37°C.
Chymotrypsin: 2 µL of HSulf-2 samples (3 µg) were diluted in 5.5 µL of 100mM Tris-
HCl, 10mM CaCl2, pH 8.0 supplemented with urea (2 M final concentration), and
incubated for 1h at room temperature under stirring. Reduction with DTT (5 mM, final
concentration) and alkylation with iodoacetamide (20.5 mM final concentration) were
performed as above. Before chymotrypsin digestion, 6.8µL 100mM Tris-HCl, 10 mM
CaCl2, pH 8.0 (50 mM final concentration) was added to the samples to reach 1 mM
urea final concentration. 1 µL of chymotrypsin at 0.5 µg/µL was then added before
overnight incubation at 25°C.
Arg-C: 2 µL of HSulf-2 samples (3 µg) were diluted in 5.5 µL of incubation buffer
(50 mM Tris-HCl pH 7. 7, 5 mM CaCl2, 2 mM EDTA) supplemented with urea (2 M
final concentration), and then incubated for 1h at 27°C under stirring. Samples were
reduced with DTT (5 mM, final concentration) for 1h at 30°C under moderate stirring.
26
Before Arg C digestion, 2 µL of activation buffer, 10X (50mM Tris-HCl pH 7.7, 50mM
DTT 2mM EDTA) and 4.8 µL of incubation buffer were added to the samples to reach
1 mM urea final concentration. Arg-C (2 µL at 0.1µg/µL) was then added before
overnight incubation at 37°C.
Glu-C: 2 µL of HSulf-2 samples (3 µg) were diluted in 5.5 µL of 100mM Tris-HCl pH
7.5 to which 2.5 µL of 8 M urea were added (2 M final concentration). After incubation
for 1h at 26°C under stirring, samples were reduced by adding of 1.2 µL DTT (5.3 mM,
final concentration) for 1h at 30°C under moderate stirring. Samples were then
alkylated by addition of 1 µL iodoacetamide (21 mM final concentration) and
incubation for 45 min at room temperature, in the dark. Before performing Glu-C Mix
digestion, 6.8 µL 100 mM Tris-HCl pH 7.5 (50 mM final concentration) were added to
the samples to reach 1 mM urea final concentration. Glu-C (1.5 µL at 0.5 µg/µL) was
then added before overnight incubation at 37°C.
27
Fig. S2. MS/MS spectrum of the peptide from the long chain containing the residue Cys 64
detected as a formylglycine residue.
The catalytic residue formylglycine has been precisely located at Cys 64 as illustrated
in Fig. S2 below showing the MS/MS spectrum of the peptide 46IMEGGGAHFINAFVTTPMCC64PASR68. The detected C64 fragments demonstrate
that cys64 is converted to formylglycine. The mass differences of 85 Da between
fragments y5 (547.23) and y4 (462.21), and 103 Da between fragments y4 (462.21) and
y3 (359.20) confirm that a conversion of cysteine to formylglycine occurred at position
C64 and not at C65 (Table S3).
28
Table 2. Mascot results for MS/MS fragmentation of the peptide 46IMEGGGAHFINAFVTTPMC64CPASR68.
Variable modifications: C19 : FormylGly (C) Ions Score: 34 Expect: 5.9e-005 Matches (Bold Red): 46/252 fragment ions using the 94 most intense peaks
29
Fig. S3. Sequence coverage of the HSulf-2 long chain, after trypsin in-gel digestion and nanoLC-ESI-MS/MS. The covered sequences (in red) of the Hsulf-2 long chain without (upper line) or with (lower line) N-deglycosylation step by PNGase F were compared. C: formylglycine in the catalytic domain; N: potential N-glycosylation site; RS: furin cleavage site.
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NIILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
1 FLSHHRLKGR FQRDRRNIRP NILVLTDDQ DVELGSMQVM NKTRRIMEQG
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
51 GAHFINAFVT TPMCCPSRSS ILTGKYVHNH NTYTNNENCS SPSWQAQHES
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
101 RTFAVYLNST GYRTAFFGKY LNEYNGSYVP PGWKEWVGLL KNSRFYNYTL
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
151 CRNGVKEKHG SDYSKDYLTD LITNDSVSFF RTSKKMYPHR PVLMVISHAA
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
201 PHGPEDSAPQ YSRLFPNASQ HITPSYNYAP NPDKHWIMRY TGPMKPIHME
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
251 FTNMLQRKRL QTLMSVDDSM ETIYNMLVET GELDNTYIVY TADHGYHIGQ
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
301 FGLVKGKSMP YEFDIRVPFY VRGPNVEAGC LNPHIVLNID LAPTILDIAG
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
351 LDIPADMDGK SILKLLDTER PVNRFHLKKK MRVWRDSFLV ERGKLLHKRD
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
401 NDKVDAQEEN FLPKYQRVKD LCQRAEYQTA CEQLGQKWQC VEDATGKLKL
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
451 HKCKGPMRLG GSRALSNLVP KYYGQGSEAC TCDSGDYKLS LAGRRKKLFK
501 KKYKASYVRS RSIR
501 KKYKASYVRS RSIR
197
Titre: Analyse protéomique des endosulfatases humaines HSulfs, enzymes clés de la
modulation de la sulfatation de l’héparane sulfate.
Mots clés : HSulf-2; 6-O-endosulfatase; formylglycine; protéoglycane; héparane sulfate; spectrométrie
de masse.
Résumé: Les 6-O-endosulfatases HSulf-1 et HSulf-2 (HSulfs) catalysent l’hydrolyse régio-sélective du
groupe 6-O sulfate des résidus glucosamine sulfatés de l’héparane sulfate (HS), assurant ainsi une
modification post-synthétique unique, de ce glycosaminoglycane constitutif des protéoglycanes de la
surface cellulaire. Par cette action, les HSulfs modulent les propriétés d’interaction de HS avec un grand
nombre de ligands, faisant de ces enzymes des acteurs cruciaux dans de nombreux processus
physiopathologiques. Ainsi, un grand nombre d’études a souligné le rôle physiologique de HSulf-2 ainsi
que son implication dans des processus pathologiques, en particulier du cancer. HSulf-2 est ainsi
proposée comme une cible thérapeutique prometteuse dans la recherche anti-cancéreuse.
Néanmoins, à l’heure actuelle, aucune structure cristallographique d’endosulfatase Sulf-2 n’a été
décrite. Dans le présent travail de thèse, nous présentons la première caractérisation par
spectrométrie de masse (MS) de HSulf-2. Une masse moléculaire moyenne de 133115 g.mol-1 a été
déterminée pour l'enzyme entière par MS MALDI-TOF. Cette masse expérimentale plus élevée que la
masse théorique (98169,86 g.mol-1) déduite de la séquence en acides aminés, souligne la contribution
significative de modifications post-traductionnelles (MPTs) à la masse moléculaire de HSulf-2. La
séquence protéique de HSulf-2 a été confirmée par analyse nano-LC-MS/MS, ce qui a permis de
localiser quatre sites de N-glycosylation (N108, N147, N174 et N217) sur les sept sites potentiels de la
chaîne longue. Outre cette N-glycosylation, nous avons également identifié une nouvelle MPT de type
O-glycosylation. En combinant différentes approches d’électrophorèse (SDS-PAGE / C-PAGE) et de MS
(MALDI-TOF et HILIC-ESI-MS) nous avons caractérisé cette MPT de nature glycosaminoglycane (GAG)
et de type dermatane sulfate. L’analyse par MALDI-TOF du mutant de HSulf-2 pour les deux seuls sites
d’ancrage possibles de ce GAG a permis de déduire une contribution globale des MPTs de 34964 g.mol-
1, dont 24727 g.mol-1 pour la chaîne de dermatane sulfate. Cette dernière est greffée de manière
covalente au niveau du domaine HD de la chaîne courte. Des N-glycosylations réparties sur les deux
chaînes longue et courte, représentent les 10237 g.mol-1 restants. L’ensemble de ces résultats fournit
les bases bioanalytiques solides pour la poursuite de la caractérisation structurale des enzymes HSulfs,
visant à comprendre le rôle des MPTs, à élucider l’organisation des deux chaînes de HSulf-2, et à en
198
déchiffrer leur rôle dans la liaison au substrat et dans la formation de la poche catalytique afin de
développer un inhibiteur spécifique des HSulfs.
199
Title: Proteomic analysis of human endosulfatases HSulfs, key enzymes in the modulation
of the sulfation pattern of heparan sulfate
Keywords: HSulf-2; 6-O-endosulfatase; formylglycin; proteoglycan; heparan sulfate; mass
spectrometry.
Abstract: The human 6-O-endosulfatases HSulf-1 and -2 (HSulfs) catalyze the regio-selective hydrolysis
of the 6-O-sulfate group of glucosamine residues within sulfated domains of heparan sulfate (HS),
thereby ensuring a unique and original post-biosynthetic modification of the cell surface
proteoglycans. By their action, the HSulfs enzymes modulate the interaction properties of HS and are
thus involved in crucial physiological processes as well as in pathological conditions, particularly in
cancer. Therefore, HSulf-2 is considered as a therapeutic target in cancer research. There is no
crystallographic structure available for HSulfs and their structural organization in two chains remains
poorly understood. In this study, we report the first characterization by mass spectrometry (MS) of
HSulf-2. An average molecular weight of 133115 g.mol-1 was determined for the whole enzyme by
MALDI-TOF MS, i.e. higher than the naked amino acid backbone (98170 g.mol-1), highlighting a
significant contribution of post-translational modifications (PTMs). The HSulf-2 protein sequence was
determined by Nano-LC-MS/MS, revealing four glycosylated sites at Asn 108, 147, 174 and 217.
Besides, an unique O-glycosylation has been evidenced. By combining electrophoresis methods (SDS-
PAGE / C-PAGE) and MS analysis (MALDI-TOF / HILIC-ESI-MS), we have identified this PTM as a
glycosaminoglycan (GAG) of dermatan sulfate type. The MALDI-TOF analysis of the HSulf-2 mutant with
modification of the two GAG binding sites indicated a contribution of 34964 g.mol-1 for the whole
PTMs, including 24727 g.mol-1 for the dermatan sulfate chain. This chain is covalently linked to the HD
domain. N-glycans dispatched on both long and short chains account for the remaining 10237 g.mol-1.
Overall, these results provide a bioanalytical platform for further structural investigations of the HSulf
enzymes, aiming at deciphering the role of PTMs and of each chain in the substrate binding and
specificities and in the catalytic activities, for the discovery of specific HSulfs inhibitors.
