Rev. Fr. Transfus. H6moblol., 1989, 32, 391-400 391

TE CHNOL OGlE TRANSFUSIONNELLE

Purification de la thrombine humaine par chromatographie d'affinite en vue

de son utilisation dans les preparations de colle biologique

pa r J .L. L o m e , M. Al la ry et E. Boschet t i*

Centre de Transfusion sanguine des Arrn6es ~ Jean-Julliard ~ (CTSA), 1, rue du Lieutenant Raoul-Batany, 92140 Clamart.

* IBF-Biotechnics, 35, avenue Jean-Jaurbs, 92390 Villeneuve-la-Garenne.

RESUME

La colle biologique, mOlange appropriO de produits dbrigine plasmati- que humaine contient une s6rine protOase qui est la thrombine. La throm- bine utilisOe f ce jour 6tant d'origine 6quine ou bovine, nous avons d6veloppO un protocole de pr6paration d partir de plasma humain.

Nous prOsentons clans ce rapport particulikrement dOtaill6 une m6thode partir d'un matkriel primaire obtenu [acilement par simple acidification du

vlasma. De ce materiel nous avons s~par~ la thrombine par chromatographie en

~ne seule ~tape sur benzamidine-Sph~rodex. Trois m~thodes d~lution ont ~t~ ~tudi~es dont une non-sp~cifique (gradient de chlorate de sodium) et une ,p~cifique competitive en utilisant de l'arginine m~thylester ou de la benza- ~idine. Le rendement de l'op~ration selon le cas est compris entre 67 % et ~4 % avec un [acteur de purification d~passant 160.

La thrombine obtenue a montr~ sa capacit~ d remplacer avantageuse- nent clans la colle biologique, la thrombine dbrigine animale.

Manuscrit re~u le 6.07.89. Acceptk le 3.10.89.

392 LORNE ZL. et coll.

SUMMARY

Biological glue is obtained by mixing different specific plasma proteins including a serine protease, thrombin. Surprisingly at present the thrombin used in such a mixture is ~om equine or bovine origin while all other components are ~om human.

In this paper we describe a particular efficient and specific chromatogra- phic method for the purification of human thrombin usable as a serine protease in the preparation of biological glue. A pure and active thrombin is obtained from a plasma fraction after adsorption on benzamidine-Spherodex followed by an elution with non specific (sodium chloride gradient) or biospecific competitors (arginin methylester or benzamidin). The obtained thrombin with a yield close to 80 % and a purification factor close to 160, showed good properties in the replacement of animal thrombin in the condition of biological glue.

I N T R O D U C T I O N

La thrombine est une s+rine protbase circulante gbn6r6e par activa- tion de la prothrombine. Bien que la thrombine ait un r61e important dans le processus r6actionnel conduisant fl la coagulation, cette enzyme poss6de de multiples autres propri6t6s biologiques. A titre d'exemple on peut citer ses interactions avec certains facteurs de la coagulation dont le facteur XIII [27] ; ou son r61e de stimulateur au cours de la sbcr6tion et l'agr6gation des plaquettes apr~s une 16sion [17].

De nombreuses publications d6crivent des mbthodes d'isolement de la thrombine. Les techniques de purification les plus frbquentes font appel fl la chromatographie sur r6sine 6changeuse d'ions [6, 29], 6ventuellement associ6e fl la filtration sur gel [1]. Plus r6cemment, la chromatographie d'affinit6 a bt6 largement utilis6e avec l'apparition de supports comme la p-aminobenzamidine-agarose [14] oll l'h6parine-agarose [4, 10, 18].

A noter la m6thode originale propos6e par Patel et Schultz [19] qui fait appel fl la chromatographie d'affinit6, par formation d'une liaison covalente r6versible entre cette s6rine prot6ase et le ligand.

Par son aptitude fl transformer le fibrinogbne en fibrine, la thrombine trouve des applications thbrapeutiques en tant qu'h6mostatique local dans divers traitements cliniques. Darts une de ces applications, la colle biologi- que, la thrombine employ6e actuellement est d'origine animale, particu- li~rement 6quine ou bovine [26, 24, 5, 16].

Dans ce contexte, s'agissant de mat6riel biologique appliqu6 sur l'homme, l'usage de la thrombine animale ne semble pas totalement satisfaisant dans la mesure off il s'agit d'une prot6ine h6t6rologue.

Bien qu'il n'y ait pas encore des donn6es scientifiques dans la litt6ra- ture, l'id6e de substituer la thrombine animale par de la thrombine humaine est non seulement attrayante mais peut devenir utile, voire n6cessaire, ne serait-ce qu'en raison des probl6mes d'antig6nicitb.

PURIFICATION DE LA THROMBINE HUMAINE 393

Dans ce rapport, nous d6crivons une mbthode originale d'isolement par chromatographie d'affinit6, sur support de silice, de la thrombine humaine et 6tudions son efficacit6 dans la colle biologique.

MATERIEL ET METHODES

Produits chimiques

- L-arginine, ester m6thylique d'arginine, benzamidine ont 6t6 obtenus chez Sigma.

- Substrat synth6tique S 2238 (ph6nylalanyl-pip6coyl-arginine p-nitro- anilide dihydrochloride) provient de chez Kabivitrum.

- Thrombine humaine, fibrinogbne humain proviennent de chez Sigma. -Prot6ines 6talons pour l'61ectrophor~se: phosphorylase b (94 000),

albumine (67000), ovalbumine (43000), anhydrase carbonique (30 000), trypsin inhibitor (20 100) et a-lactalbumine (14 400) ont 6t6 achet6es chez Pharmacia.

- Les supports pour chromatographie ont 6tb fournis par IBF-Biotech- nics.

Extraction et activation de la prothrombine A partir de p lasma

Le plasma humain frais est dilu6 10 fois ~ l'eau distill6e et acidifi6 jusqu'~ un pH de 5,3 avec de l'acide ac6tique g 2 %. I1 est ensuite centri- fug6 20 minutes ~ 2 000 g. Le prbcipit6 est repris dans du s6rum physiolo- gique (250 ml par litre de plasma) et est neutralis6 avec une solution aqueuse de carbonate de sodium/~ 2 % jusqu'fi pH 7. Apr~s addition de chlorure de calcium pour avoir une concentration finale de 21 mmole/1 et s6jour de 2 heures ~ temp6rature ambiante, on r6cup~re un surnageant contenant la thrombine (STP) (1).

Le pr6cipit6 est 61imin6 par filtration ou par centrifugation.

Activation de la prothrombine fi partir du P.P.S.B.

Le complexe prothrombinique (PPSB provenant du d6partement de fractionnement plasmatique du CTSA) est d'abord repris selon les indica- tions par du s6rum physiologique et 6ventuellement neutralis6/t pH 7 par addition de petites quantit6s de carbonate de sodium en solution aqueuse ~2%.

L'activation de la prothrombine en thrombine est ensuite effectu6e par addition de chlorure de calcium jusqu'~ avoir une concentration finale de 83 mmolA et s~jour de 2 heures ~ temp6rature ambiante.

(1) STP: Solution de Thrombine Pr6purifi6e.

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Purification de la thrombine par chromatographie

8 ~ 10 ml de benzamidine-Sph6rodex pr6par6 par immobilisation de la p-aminobenzamidine sur Sphbrodex (dextran-coated silica beads) apr6s activation ~ raide du butanedioldiglycidylether selon la m6thode originale de Sundberg et Porath [25], ont 6t6 introduits dans une colonne de 1,1 cm de diambtre. La colonne a 6t6 par la suite 6quilibr6e avec un tampon Tris-HC1 0,05 M, NaC1 0,1 M ~ pH 8 et utilis6e pour la purification de la thrombine.

Les 6chantillons utilis6s (PPSB activ6 ou pr6cipit6 plasmatique acide active) ont 6t6 inject6es dans la colonne apr~s avoir 6t~ dialys6s contre le tampon Tris-HC1 0,05 M, NaC1 0,1 M, pH 8. Sous un d6bit de 40 ml/heure l'injection a 6t6 suivie d'un lavage avec le tampon pour 6liminer les prot6ines non adsorb6es.

Ensuite la thrombine adsorb6e sur le benzamidine-Sph6rodex a 6t6 d6sorb6e selon le cas en utilisant les solutions suivantes (Fig. 1) :

|m A 2 8 0 n m

A

°

I " \ ;J[ ~ ,

0

6 0 1 8 0 m!

: \ , ",, ! , \

4 0

2 0

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/ - - - x • P /

/ E ;' L c 40 m o ', N : L

6"0 180 mL

FIG. 1. -- Profils chromatographiques de la sbparation de la thrombine sur p-aminobenzamidine-Sp6rodex. Colonne : 1,1 x 8 cm (8 ml) ; tampon initial : Tris-HCl 0,05 M, NaCI 0,1 M, pH 8 ; Elution : NaC10,5 M dans le tampon initial (A), arginine 60mM(B), arginine-m6thylester 15mM(C), benzami- dine 15 mM (D). Mat6riel de d6part : pr6cipit6 acide du plasma.

PURIFICATION DE LA THROMBINE HUMAINE 395

- tampon Tris-HC1 0,05 M, NaC1 0,5 M, pH 8 ; - tampon Tris-HC1 0,05 M, NaC1 0,1 M, L-arginine 60 mM, pH 8 ; - tampon Tris-HC1 0,05 M, NaC1 0,1 M, L-arginine m6thylester 15 mM, p H S ; - tampon Tris-HC1 0,05 M, NaC1 0,1 M, benzamidine 15 mM, ph 8.

Le pic rbcup6r6 au cours de l'61ution a 6t6 ensuite conserv6 pour d6terminer le contenu prot6ique et l'activit6 thrombinique.

Dosage des prot6ines

Le dosage des prot6ines a 6t6 effectu6 par des m6thodes colorim6tri- ques classiques : Biuret [ 13] ou Bradford [2] ; cette dernibre m6thode a 6t6 adopt6e en particulier dans le cas de concentrations en protbines infbrieu- res ~t 5 mg/ml.

Les dosages prot6iques des fractions chromatographiques recueillies en prbsence d'arginine, d'ester m6thylique d'arginine ou de benzamidine ont 6t6 pratiqubs aprbs dialyse contre un tampon Tris-HC1 0,05 M, NaC1 1 M, pH 8 pour dissocier le complexe ligand-thrombine et 61iminer le ligand.

Dosage de l'activit6 amidasique de la thrombine

Cette activit6 a 6t6 mesur6e par hydrolyse du substrat S-2238 selon un protocole d6riv6 de celui de Funahashi et al. [10] : 0,5 ml de pr6paration de thrombine dilu6e de fagon appropri6e dans le tampon Tris-HC1 0,05 M, NaC1 0,175 M, contenant de I'EDTA 7,5 Me t de l'aprotinine 75 KUI/1, pH 8, est pr6-incub6e ~ 37 °C. Ensuite 0,3 ml de substrat S-2238 sont ajout6s ~ la concentration 1 mM dans le tampon. La r6action est arr6t6e au bout de 90 secondes par addition de 0,3 ml d'acide ac6tique ~ 50 %.

L'absorbance est lue ~ 405 nm et l'activit6 de la thrombine est exprim6e en termes de nanokatals (nkat), off 1 nkat est la quantit6 de thrombine capable de lib6rer 1 nmole de p-nitroanilide par seconde [9].

Dosage de l'activit6 pro-coagulante

L'activit6 pro-coagulante de la thrombine est d6termin6e en unit6s internationales (NIH) par comparaison avec une courbe standard 6tablie avec de la thrombine humaine commerciale d'activit6 connue. L'activit6 thrombique y est dbfinie par le temps de coagulation du fibrinogbne. 200 ~1 de fibrinogbne humain (5 mg/ml) dissous dans une solution de NaC1 0,15 M sont prb-incub6s 30 secondes ~ 37 °C. On y ajoute 100 ~l de thrombine humaine de r6f6rence dilube dans le tampon citrate de sodium 0,05 M, NaC1 0,15 M, pH 6,5 et le temps de coagulation est mesur6. La thrombine que nous avons purifi6e est prbalablement dialysbe une nuit

396 LORNE ZL. et coiL

contre le tampon citrate de sodium 0,05 M, NaC10,15 M, pH6,5 avant d'effectuer le dosage.

Electrophor6se sur gel de polyacrylamide en pr6sence de SDS

Les 6lectrophorbses SDS-PAGE sont r6alis6es g l'aide de l'appareil Phast System de Pharmacia en utilisant un gel de polyacrylamide d'un gradient de concentration compris entre 10 et 15 %.

Avant migration 61ectrophor6tique les 6chantitlons sont trait6s 100 % pendant 5 minutes dans le tampon Tris-HC1 10 raM, EDTA ! raM, NaC1 0,1 M, SDS 2,5 %, pH 8.

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) 0 , - , d ~

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m ~ m ~ "~"-- 370 0 0 d

d6p6t

1 2 3 4 5 6 FI~, 2. - Analyse 61ectropnor6tique sur gradient de polyacrylamide-SDS de 10 ~ 15 % des diff6rentes

fractions protbiqnes obtenues : 1 : mat6riel protbique initial avant fracfionnement (STP). 2 : 61uat chromatographique pa r NaCI 0,5 M (voir fig. 1,4). 3 : 61uat chromatographique pa r benzamidine 15 M (voir fig. 1 1)). 4 : 61uat chromatographique pa r arginine m6thylester 15 M (voir fig. 1 C). 5 : 6talons de masse mol6culaire (voir section mat6riel et m6thodes). 6 : thrombine commerciale constituant la coUe biologique. La flbche c6t6 droit indique le niveau de masse Inol6culaire correspondant h la thrombine.

PURIFICA~ON DE LA THROMBINE HUMAINE 397

AprSs migration 61ectrophor6tique les bandes prot6iques sont r6v616es par coloration au bleu de Coomassie (Fig. 2).

Filtration sur gel

Les filtrations sur gel des 6chantillons de thrombine ont 6t6 faites sur ane colonne de Superose 12 (10/30) pr66quilibr6e dans un tampon pho- sphate disodique 0,09 M, phosphate monosodique 0,02 M, azide de so- dium 0,02 M, pH 7,5.

Propri6t6s de pr6paration de la colle biologique

La colle biologique est un concentr6 de prot6ines hurnaines coagula- ~les par la thrombine, fi usage local. Ce concentr6 de facteurs de l'h6mos- :ase est cryodess6ch6 et pr6par6 fl partir du plasma humain [21, 22, 23, !4, 28].

Le fibrinogSne, constituant majeur de ]a colle, est transform8 en :ibrine soluble par addition de thrombine calcique, ]e facteur XII I permet- ant ]a transformation et ]a stabilisation en un r6seau de fibrine insoluble. .'aprotinine ajout6e au m6lange initial 6vite pendant un certain temps ]a :ibrinolyse due aux prot6ines d'origine plasmatique et tissulaire.

Habituellement selon les instructions des producteurs, la colle biolo- ;ique est obtenue en m61angeant deux solutions: l 'une contenant les :onstituants prot6iques et l'aprotinine, rautre contenant la thrombine en ~r6sence de chlorure de calcium. A 37 ° C il se forme alors un r6seau ridimensionnel solide et r6sistant.

Pour l'6tude de la thrombine produite selon notre protocole, nous ~vons procbd6 aux m6mes manipulations en remplagant la thrombine de :heval par une 6gale quantit6 de thrombine humaine. Nous avons en ~articulier dans le cadre de cette 6valuation prbliminaire, dbtermin6 le emps de prise en masse et l'aspect rnorphologique de la colle obtenue.

RESULTATS

Le travail exp6rimental de s6paration de la thrombine a 6t6 fait fl mrtir de deux sortes de mat6riel primaire : le complexe prothrombinique m PPSB, et une fraction prot6ique obtenue par pr6cipitation du cryosur- ~ageant en milieu l~g~rement acide.

Oue ron parte de rune ou rautre source de mat6riel primaire, la ransformation de la prothrombine en thrombine se fait suivant le mSme ~rotocole. En presence d'ions Ca**, la conversion se fait en environ ',heures. Cette m6thode peut, bien entendu, 8tre remplac6e par des n6thodes alternatives d6jfi d6crites comme par exemple l'emploi de hromboplastine tissulaire [30, 8] ou le venin de certains serpents [3, 12].

3 9 8 L O R N E J.L. et coll.

Dans les deux cas (PPSB ou prbcipit6 acide) on obtient une solution brute contenant de la thrombine dont l'activit6 sp6cifique est comprise entre 2 et 30 unit6s NIH/mg.

A parfir de ce matbriel, la thrombine a pu 6tre purifibe par chromato- graphie d'affinit6 en une seule 6tape sur benzamidine-Sph6rodex.

En utilisant des conditions d'61ution appropribes, le choix d 'un tel adsorbant a 6t6 justifi6 par le fait que la thrombine en tant que s6rine prot6ase possbde une affinit6 marqu6e pour le groupement guanidinium. II a 6t6 dbcrit, en effet, des m6thodes de purification utilisant l 'arginine ou certains dbriv6s de l 'arginine comme ligands d'affinit6 [30, 20, 11].

Bien qu 'au cours de cette 6tape chromatographique, nous ayons mis rapidement en 6vidence que la thrombine pouvait s 'adsorber par affinit6 sur le benzamidine-Sphbrodex, l'61ution nous a cependant demand6 un travail important de mise au point afin d 'aboutir h une thrombine de puret6 acceptable (Fig. 1).

L'utilisation d 'un gradient d'blution en NaC1 de 0,1 /~ 0,5 M nous a permis de rbcup6rer une fraction avec une bonne activit6 spbcifique en thrombine mais une puret6 61ectrophor6tique moyenne. En effet cette fraction soumise h une SDS-PAGE mont re la pr6sence d 'une bande principale de masse mol6culaire correspondant h la thrombine (-~ 37 000) accompagn6e d 'un certain nombre d'autres prot6ines de masse mo16cu- laire variable (Fig. 2). Ceci peut s'expliquer par le fait que l 'adsorbant utilis6 compor tant des fonctions guanidinium, est partiellement charg6 positivement et adsorbe en effet des petites quantit6s d'autres protbines, 61ubes par augmentat ion de la force ionique (effet d'6change d'ions).

L'utilisation d 'un gradient en chlorure de sodium s'est soldbe par l 'obtention d 'un pic de thrombine dont l'activit6 sp6cifique 6tait de 1 960 U.NIH/mg avec Tan rendement d 'environ 67 % (Tab. I).

Tableau I

Purification de la thrombine par chromatographie d'affinit~ sur benzamidine-Sph~rodex d parfir de la fraction acide (moyenne de huit experiences).

M6thode Fraction Volume Activit6 Activit6 Prot6ines Activit6 d'61ution (ml) totale totale (rag) sp6cifique

(U.KAT) (U.N]H) (U.NIH/ mg)

N a C 1 Echantillon 74 7 717 3 966 333 11,9 inject~

0,5 M Eluat 235 5 128 2 668 1,36 1 962

Arginine Echantinon 31,5 4 968 2 320 160 14,5 m6thyl inject6 ester 15 M Eluat 100 4 209 1 950 1,25 1 560

Benzami- Echantillon 20 4 768 2 677 114 23,4 dine inject6 15 M Eluat 100 3 818 2 110 1,45 1 455

Facteur Rende- de ment

purification (%)

1

165 67,3

1

107 84

1

62 78,8

PURIFICATION DE LA THROMBINE HUMAINE 399

Nous avons par la suite essay6 d'61uer la thrombine par des comp6ti- teurs sp6cifiques du ligand comme rarginine, l'arginine m6thylester et la benzamidine dissoutes dans le tampon d'adsorption.

L'arginine jusqu'fl 60 mmol/1 dans le tampon ne nous a pus permis de dbsorber la thrombine alors que le d6riv6 mbthylester/~ la concentration de 15 mmole s'est av6r6 efficace (Tab. II). Le rendement de r6cupbration de la thrombine a 6t6 duns ce cas de prSs de 84 %. La SDS-PAGE a mis en 6vidence une puret6 assez 61evbe : une petite bande de masse mo16culaire relativement 61ev6e accompagne la thrombine. L'acfivit6 sp6cifique de cette thrombine est de plus de 1 500 unitbs NIH/mg (Tab. I).

Tableau n Purification de la thrombine par chromatographie d'a~finit~ sur benzamidine-Sph~rodex ~ partir du complexe

prothrombinique (PPSB) : ~lution : NaCl 0,5 M.

Fraction Volume Activit6 Activit6 Prot6ines Activit6 Facteur Rende- (ml) totale totale (mg) sp6cffique de rnent

(U.KAT) (U.NIH) (U.NIH/mg) purification (%)

PPSB activ6 20 13 679 6 800 3 120 2,18 1 Eluat 260 7 194 3 600 1,7 2 117 971 52,9

L'inefficacit6 de l'arginine fi dbsorber la thrombine peut s'expliquer par une trop faible affinit6 de cet acide arnin6 due/~ la pr6sence d'un :arboxyle trbs hydrophile. Son est6rification doit contribuer fl augmenter l'interaction arginine-thrombine qui poss6derait une composante hydro- phobe. L'utilisation de l'arginine mbthylester comme ligand a en effet d6jfl ~t6 dbcrite par Fischer et al. [8], mettant en 6vidence l 'importance de la :omposante hydrophobe duns l'interaction entre la thrombine et ses inhibiteurs.

La benzamidine fl la concentration de 15 mmol/1 a 6galement conduit l'61ution de la thrombine. Les rbsultats sont assez comparables ~ ceux

abtenus avec l'arginine mbthylester aussi bien au niveau de l'activit6 ~p6cifique (1 450 unitbs NIH/mg) qu'/t celui du rendement (environ 78 %) ~t de la puret6 61ectrophor6tique (Fig. 2). Ce dernier agent d'61ution, un peu moins performant que l'arginine m6thylester engendre par ailleurs an inconvfnient d'ordre technique, car 6tant de nature aromatique il est plus difficile de suivre les trac6s chromatographiques par absorption U.V.

280 nm. Quel que soit le mode d'61ution choisi, la rbcup6ration finale de cette

Lhrombine obtenue par chromatographie dolt obligatoirement se faire par une dialyse pr6liminaire ou ultrafiltration en milieu NaC1 1 M pour dissocier le complexe form6 avec l'agent d'61ution. Ensuite le sel sera 51imin6 par dialyse contre de l'eau et du glucose g 10 g/1 afin de placer la protbine duns des bonnes conditions pour la lyophiliser.

Au cours des essais de remplacement de la thrombine de cheval par de la thrombine humaine obtenue selon le protocole d6crit, duns la

400 L O R N E J..L. et coil.

pr6paration de la colle biologique nous avons abouti /~ des r6sultats positifs trSs rapidement.

Lorsque nous avons remplac6 une thrombine par l 'autre (mSme activit6 biologique exprim6e en unit6s NIH/mg) nous avons remarqub une formation de colle suivant un processus normal. Le temps de prise en masse 6tait tout ~ fait comparable : A 25 °C, 18 secondes ont 6t6 n6cessai- res fi la formation d 'une masse solide, alors que le temps de prise a 6t6 de 10 secondes/~ 37 °C. Ces r6sultats sont fi comparer aux 24 secondes et 11 secondes obtenues respect ivement/ t 25 ° et 37 °C avec de la thrombine standard de cheval. Les aspects morphologiques des produits obtenus 6taient tout g fait comparables.

L'61ution sp6cifique de la thrombine par la L-arginine m6thylester n'est cependant pas ~ 6carter a pr ior i car elle permet de s'assurer d 'une 61ution comp6titive biosp6cifique. Dans cette optique le proc6d6 est beaucoup plus satisfaisant mais suppose une 61imination compl6te de l 'agent d'61ution avant utilisation de la thrombine.

Ouant ~ l'usage de la benzamidine comme agent d'61ution nous pensons qu'il est difficilement exploitable sur le plan technique, des interf6rences de d6tection 6tant 6videntes avec les protbines. De plus nous avons obtenu des r6sultats plut6t moins bons qu'avec les deux autres agents d'6lution.

Sur le plan du choix du support chromatographique il nous a sembl6 intbressant de souligner que l'utilisation de l 'adsorbant benzamidine- Sph6rodex est bien adapt6e pour les pr6parations des grandes quantit6s de thrombine. En effet sa rigidit6 totale permet d 'obtenir des dbbits trSs 61evbs sans problbme de tassement des colonnes. De plus, de par sa stabilit6 en milieu acide et basique, en milieu solvant et par la stabilit6 de la liaison p-aminobenzamidine sur le support, les problSmes de r6g6n6ra- tion et de sanitisation sont totalement r6solus. Les lavages en milieu 6thanol 60 % - acide ac6tique 0,5/~ 1 M autorisent en effet un nettoyage en profondeur du support tout en 61iminant d'6ventuels pyrog6nes et en inactivant les microorganismes 6ventuellement pr6sents.

Les conditions nous semblent maintenant r6unies pour en tamer une 6tape plus approfondie sur l 'extrapolation de la product ion de la throm- bine sur des plus grosses colonnes et de faire une 6tude plus syst6matique dans la constitution de la <~ colle biologique ,~. Des travaux plus complets sur ces deux points sont en train d'&re d6velopp6s dans nos laboratoires et feront l'objet d 'un autre rapport.

DISCUSSION ET CONCLUSION

Les r6sultats obtenus tout au long de nos exp6riences montrent que pour la pr6paration de l '6chantillon de d6part pour la chromatographie, il est int6ressant de partir non seulement du complexe prothrombinique PPSB, ce qui avait 6t6 d6crit dans la litt6rature [6, 7, 8, 30], mais 6galement d 'une fraction s6par6e aprSs acidification du plasma. Cette derni~re