Universidad Nacional Andrés BelloFacultad de Ecología & Recursos NaturalesDepartamento de Ecología & Biodiversidad

REVIEW

Zebrafish as a Model Vertebrate for Investigating Chemical Toxicity

“Pez Cebra como modelo para investigación de toxicidad química en vertebrados”

Adrian J. Hill,* Hiroki Teraoka,† Warren Heideman,*,‡ and Richard E. Peterson*,‡,1

*School of Pharmacy, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin, 53705; †Department of Toxicology, School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University, Ebetsu, Japan; and ‡Molecular and Environmental Toxicology

Center, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin, 53705.

Viviana Ahumada

Agustín Cartes

Camilo Pacheco

IntroducciónIntroducción

• Valor por su genoma

• Infancia y técnicas de avance y reversa

• Identificación de end points y mecanismos de toxicidad

ObjetivosObjetivos

• La presente revisión tiene como objetivo La presente revisión tiene como objetivo demostrar por qué el pez cebra demostrar por qué el pez cebra ((Danio rerioDanio rerio) es ) es un buen modelo para la investigación de un buen modelo para la investigación de toxicidad en vertebrados, con la practica de toxicidad en vertebrados, con la practica de distintas pruebas, que muestran cómo se ve distintas pruebas, que muestran cómo se ve afectado bajo distintos tóxicos y experimentando afectado bajo distintos tóxicos y experimentando distintas patologías que serán marcadas como distintas patologías que serán marcadas como endpoints.endpoints.

• Similitudes en Phylum

• Principales Beneficios

• Fecundidad y embriones

• End points transgeneracionales

• Prevención de la pigmentación con 0,003% feniltiourea

• Genoma del pez cebra

• Uso de trangenicos

Estrategias con MorfolinoEstrategias con Morfolino

• Genetica Inversa Genetica Inversa Sustitucion de Sustitucion de Nucleotidos.Nucleotidos.

• Oligonucleotidos Morfolinos Oligonucleotidos Morfolinos Acidos nucleicos artificiales.Acidos nucleicos artificiales.

• Objetivo Objetivo ARNm. ARNm.

• Morfolino + Peces Zebras Morfolino + Peces Zebras Mutantes Mutantes Definicion de los Definicion de los genes funcionales requeridos genes funcionales requeridos para el normal desarrollo.para el normal desarrollo.

• Comparaciones entre normales y mutantes Comparaciones entre normales y mutantes End Points. End Points.

• Resistentes.Resistentes.

• Limitaciones Limitaciones fenotipos claramente visibles. fenotipos claramente visibles.

• ENU (N-etil-N-nitrosourea) : Morfogenesis,ENU (N-etil-N-nitrosourea) : Morfogenesis, Organogenesis, Diferenciacion.Organogenesis, Diferenciacion.

• Modelos enfermedades humanasModelos enfermedades humanas

Peces Cebras Mutantes: Uso en Peces Cebras Mutantes: Uso en estudios de toxicidad y estudios de toxicidad y enfermedades humanasenfermedades humanas

Lonely atrium BypassSoni youYou TooYouKurzschlussChameleon

Defectos en sistema circulatorio

Fenotipos MutantesFenotipos Mutantes

ViperWeak atriumHeart attackSlopSlinkyStill Heart

Debilidad en contraccion en 1 o 2 camaras

BreakdanceHip HopLeg longSlip Jig

Ritmo cardiaco anormal

Fenotipos MutantesFenotipos Mutantes

CardiobifidaMilesapartFaustoCasanovaNatterOne eye pinhead

• Pikwik Titina Cardiomiopatias• Silen Heart TNNT2 Cardiomiopatias• String Heart TbX5 Sindrome de Holt -

Omam

Cultivo de Celulas y Tecnologia de Cultivo de Celulas y Tecnologia de MicroarraysMicroarrays

• Lineas celulares Lineas celulares Adultos y Adultos y EmbrionesEmbriones

• Transfeccion Transfeccion COS7, COS7, elementos de respuesta a elementos de respuesta a dioxinas por luciferasadioxinas por luciferasa

• Microarrays Microarrays Genoma Genoma completo Pez Cebracompleto Pez Cebra

Toxicidad aguda y efectos Toxicidad aguda y efectos adversos en el pez cebra (adultos adversos en el pez cebra (adultos

y jovenes)y jovenes)• LimitadosLimitados

• Plomo, Uranio, Malatión, Metronidazol, Plomo, Uranio, Malatión, Metronidazol, Anilinas, Colchicina.Anilinas, Colchicina.

• Se utilizan por su genetica y biologiaSe utilizan por su genetica y biologia

• Ejemplos: Ejemplos: Peces expuestos a lindano, deltametrina y Peces expuestos a lindano, deltametrina y

atrazina por 35 dias para observar atrazina por 35 dias para observar anomalias morfologicas y supervivencia.anomalias morfologicas y supervivencia.

Peces expuestos a 17a-etinilestradiol y 17b-Peces expuestos a 17a-etinilestradiol y 17b-etinilestradiol , diferenciacion sexual etinilestradiol , diferenciacion sexual juvenil y caracteristicas sexuales adultojuvenil y caracteristicas sexuales adulto

A tener en cuenta antes de usar el A tener en cuenta antes de usar el modelo de Pez Cebramodelo de Pez Cebra

• Cronico, Subcronico y AgudoCronico, Subcronico y Agudo

• Aromaticos, pesticidas, Aromaticos, pesticidas, disruptores endocrinos, acido disruptores endocrinos, acido retinoico y ciclopamina.retinoico y ciclopamina.

• 2,3,7,8-tetraclorodibinzeno-p-2,3,7,8-tetraclorodibinzeno-p-dioxina (TCDD)dioxina (TCDD)

¿Como responde a la exposicion ¿Como responde a la exposicion de TCDD el Pez Cebra?de TCDD el Pez Cebra?

• Huevos recien fertilizados Huevos recien fertilizados edema saco pericardico, edema saco pericardico, tamaño de corazon tamaño de corazon reducido, alteracion funcion reducido, alteracion funcion cardiovascular (reduccion cardiovascular (reduccion gasto cardiaco), isquemia gasto cardiaco), isquemia tejido perisferico, desarrollo tejido perisferico, desarrollo de mandibula deteriorada, de mandibula deteriorada, hemorragias y vejiga hemorragias y vejiga natatoria desinflada que natatoria desinflada que culminan con mortalidad.culminan con mortalidad.

• Sensibilidad.Sensibilidad.

• Eclosion.Eclosion.

Mediación de la toxicidad por DDTCMediación de la toxicidad por DDTC

• Algunas dibenzo-p-dioxinas (PCDD), dibenzofuranos (PCDF), Algunas dibenzo-p-dioxinas (PCDD), dibenzofuranos (PCDF), y bifenilos (PCB) han ejercido una acción toxica a través de y bifenilos (PCB) han ejercido una acción toxica a través de la vía AHR en el pez cebra.la vía AHR en el pez cebra.

• Uso de células COS-7 para investigar genes del pez cebra Uso de células COS-7 para investigar genes del pez cebra por ensayos de transactivación con un reporte de luiferasa.por ensayos de transactivación con un reporte de luiferasa.

• zfAHR2= forma de AHR involucrada en la mediación del zfAHR2= forma de AHR involucrada en la mediación del desarrollo de toxicidad de DDTC en el pez cebra.desarrollo de toxicidad de DDTC en el pez cebra.

• Conclusiones respaldadas con inyección de un Conclusiones respaldadas con inyección de un oligonucleotidos morfolinos contra zf AHR2 como oligonucleotidos morfolinos contra zf AHR2 como prevención de la manifestación de toxicidad.prevención de la manifestación de toxicidad.

• Se usaron anticuerpos CYP1A para mostrar inducción en Se usaron anticuerpos CYP1A para mostrar inducción en varios tejidos como en vasculatura embrionaria, pero fallo, varios tejidos como en vasculatura embrionaria, pero fallo, mostrando el desarrollo de endpoints.mostrando el desarrollo de endpoints.

FIG. 2. Morpholino targeted against zfAHR2 rescued embryos fromTCDD toxicity, whereas an ARNT2 mutant zebrafish shows the typical endpoints of TCDD toxicity. These results helped determine that AHR2 (not AHR1) and ARNT1 (not ARNT2) were the key dimerization partners required for AHR mediated TCDD developmental toxicity in zebrafish. Wild type embryos exposed to a vehicle control (A) and embryos injected with zfAHR2-MO exposed to 0.4 ng/ml TCDD (C) show no endpoints of TCDD toxicity, whereas wild type (B) and ARNT2 mutant embryos (D) exposed to 0.4 ng/ml TCDD show typical endpoints of toxicity such as P: pericardial edema, and C: craniofacial malformations. Embryos were exposed at 2 hpf for 1 h to TCDD and then allowed to develop in TCDD-freewater prior to observation at 96 hpf.

Modelos alternativos al pez cebraModelos alternativos al pez cebra• El modelo más cercano al pez cebra es El modelo más cercano al pez cebra es MedakaMedaka (Oryzias latipes).(Oryzias latipes).

• Diferencias, euritermal (0-40°C) y expectativa de vida.Diferencias, euritermal (0-40°C) y expectativa de vida.

• Primer pez en el que se estableció una línea transgenica estable.Primer pez en el que se estableció una línea transgenica estable.

• Líneas transgenicas de hoy en día tienen mas ventajas respecto Líneas transgenicas de hoy en día tienen mas ventajas respecto al pez cebra, ya que permiten una efectiva visualización de GFP, al pez cebra, ya que permiten una efectiva visualización de GFP, por lo que también sirve para estudios toxicológicos.por lo que también sirve para estudios toxicológicos.

Especies de peces modelos Especies de peces modelos complementarioscomplementarios• Algunas especies ya han sido Algunas especies ya han sido

establecidas como un buen establecidas como un buen modelo para disciplinas modelo para disciplinas como la Toxicología, como como la Toxicología, como por ejemplo las carpas.por ejemplo las carpas.

• Esta y otras especies al tener Esta y otras especies al tener una genética similar, se una genética similar, se pueden usar para corroborar pueden usar para corroborar los hallazgos en el pez cebra.los hallazgos en el pez cebra.

• Pez Globo, íntimamente Pez Globo, íntimamente relacionado con el pez cebra, relacionado con el pez cebra, por lo que es un importante por lo que es un importante modelo complementario para modelo complementario para el pez cebra.el pez cebra.

Discusión Discusión

● Creemos que la utilización del pez cebra como modelo Creemos que la utilización del pez cebra como modelo biológico es una alternativa totalmente favorable, debido a biológico es una alternativa totalmente favorable, debido a que esta casi totalmente descifrado su genoma, tiene una que esta casi totalmente descifrado su genoma, tiene una biología muy simple por lo cual criarlo en cautiverio es muy biología muy simple por lo cual criarlo en cautiverio es muy sencillo y no requiere grandes costos de mantención. A sencillo y no requiere grandes costos de mantención. A demás su alta capacidad de presentar fenotipos mutantes demás su alta capacidad de presentar fenotipos mutantes ayuda entre otras cosas a estudiar, entender y homologar ayuda entre otras cosas a estudiar, entender y homologar enfermedades en modelos humanos tales como las enfermedades en modelos humanos tales como las cardiomiopatias o afecciones vasculares sin necesidad de cardiomiopatias o afecciones vasculares sin necesidad de hacerlo en modelos biológicos mas complejos y caros. Se hacerlo en modelos biológicos mas complejos y caros. Se debiesen realizar más estudios toxicologicos con el fin de debiesen realizar más estudios toxicologicos con el fin de determinar la real naturaleza de estos y como pueden determinar la real naturaleza de estos y como pueden afectar nuestra integridad y la de otros seres vivos.afectar nuestra integridad y la de otros seres vivos.

ConclusiónConclusión

• El pez cebra, como vertebrado modelo para estudios de El pez cebra, como vertebrado modelo para estudios de toxicología, farmacología, desarrollo de la biología, solo toxicología, farmacología, desarrollo de la biología, solo esta comenzando.esta comenzando.

• Será mas común establecer endpoints nuevos para tóxicos Será mas común establecer endpoints nuevos para tóxicos y terapias en el pez cebra, por nuevas tecnologías.y terapias en el pez cebra, por nuevas tecnologías.

• Estos avances ayudaran a proporcionar buenas ideas en el Estos avances ayudaran a proporcionar buenas ideas en el mecanismo de los químicos en toxicología, y a descubrir mecanismo de los químicos en toxicología, y a descubrir nuevas drogas para el tratamiento en enfermedades nuevas drogas para el tratamiento en enfermedades humanas.humanas.