Laboratoire de Physiologie vegctale, Universite de Nice, 06034 NICE Cedex, France

Separation et Identification des BetaIai"nes Synthetisees par Ies Tissus de Tige de M yrtillocactus geometrizans Cultives «in vitro»

Separation and Characterization of some Betalains Synthetized by

Myrtillocactus geometrizans Stem Tissues Cultivated «in vitro»

JACQUELINE COLOMAS, PHILIPPE BARTHE et CAMILLE BULARD

Res:u Ie 22 novembre 1977 . Accepte Ie 14 decembre 1977

Summary

Sephadex gel column chromatography enabled us to separate betalains present in stem tissue cultures as well as in fruits of Myrtillocactus geometrizans. The identification of the isolated fractions was attempted by means of paper chromatography, electrophoresis, spectrum analysis and Sephadex gel chromatography. Three pigments - one betaxanthin and two betacyanins -, have been identified in both materials. Indicaxanthin and betanin were characterized with relative certainty. Another betacyanin was tentatively identified as phyllocactin.

Key words: betalains, tissue cultures, Sephadex gel chromatography, Cactaceae.

Introduction

Un certain nombre d'auteurs (MOREL, 1971; CONSTABEL et NASSIF-MAKKI, 1971; ENDRESS, 1976) ont montre que les tissus de plusieurs especes de Centrospermales, cultives «in vitro», sont intensement colores par des pigments violets. Nous avons constate ce phenomene sur des cultures de tissus de tiges d'une Cactacee, Myrtil­locactus geometrizans (COLOMAS et BULARD, 1977). La pigmentation violette, souvent localisee dans des ilots au sein des cals, suggere la presence de betacyanines. Nous avons essaye d'en determiner la nature et nous avons en outre recherche la presence eventuelle de betaxanthines, pigments jaunes qui leur sont souvent associes. A des fins de com­paraison, il nous a paru interessant de mener une etude parallele sur les fruits de la m~me espece, seuls organes avec les fleurs qui sont susceptibles de synthetiser des betalatnes «in vitro».

Abreviations utilisees: 2,4 D: acide 2,4-dichlorophenoxyacetique; BHT: diter-butyl 2,6 p-crcsol.

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Nous presenterons tout d'abord les resultats obtenus par chromatographie sur gel de Sephadex conduisant a une separation fine des betacyanines et des betaxanthines, suivant ainsi un procede dont nous avons anterieurement montre l'interet (COLO­MAS, 1977).

Nous apporterons en suite un faisceau de preuves en faveur de l'identification de trois pigments constitutifs (1 betaxanthine et 2 betacyanines), utilisant leurs proprietes spectrales et electrophoretiques ainsi que leurs caracteristiques de migration en chromatographie sur papier et sur gel de Sephadex.

Nous consacrerons enfin la derniere partie de ce travail a une analyse de l'in­fluence du pH sur l'ordre de migration en chromatographie sur gel de Sephadex, ayant con state que les pigments identifies ne migraient pas selon l'ordre attendu, c'est a dire en fonction de leur poids moleculaire.

Materiel

Cette etude a ete realisee a partir de fruits de Myrtillocactus geometrizans et de cals proven ant de cultures de tissus de tige de plantule de la m&me espece. Les fruits sont recoltes a maturite au Jardin exotique de Monaco et sont conserves a la temperature de - 25 DC. En ce qui cone erne les cals, ils proviennent de fragments de tige de plantules ensemences sur Ie milieu de White enrichi de lait de coco et de 2,4 D et transferes au moins 5 fois sur Ie milieu de Linsmaier-Skoog additionne d'IAA et de kine tine (COLOMAS et BULARD, 1977). Seules les portions de cals presentant des il8ts intensement colores en violet sont prelevees pour nos essais; elles sont utilisees directement ou conservees a -25 DC.

Methode

L'extraction et la separation des pigments s'effectuent a la temperature de 5 DC selon la m&me technique qu'il s'agisse de fruits ou de portions de cals colonfes en violet. Apres broyage dans l'eau distilleen presence d'un antioxydant (BHT), l'homogenat est centrifuge a 18.000 g pendant 10 min. Le surnageant est ajuste a pH 3 et recentrifuge dans les m&mes conditions. Nous obtenons ainsi l'extrait brut qui est ensuite ajuste a pH 2,3 avant d'hre soumis a la chromatographie sur gel de Sephadex G-15. La colonne (1,5 X 20 cm) est equilibree et eluee par une solution tampon acetate de pH 4,5.

Parallelement aux etudes faites sur les extraits et a des fins d'identification de l'indica­xanthine et de la betanine de reference sont chromatographiees separement sur gel de Sepha­dex.

Dans tous les cas, la chromatographie dure 6 heures, Ie debit est regie a 6 mllh. Des fractions de 1 ml sont recuperees grace a un collecteur de fractions GILSON place dans une enceinte refrigeree (5 DC).

Pour les essais d'identification des pigments, plusieurs techniques sont utilisees: electro­phorese et chromatographie sur papier, spectrophotometrie. Des substances de reference servent de comparaison.

Pour les essais effectues sur gel de Sephadex en vue de dHinir l'influence du pH de l'eluant sur la vitesse de migration des pigments, nous avons utilise un melange d'indicaxan­thine et de betanine de reference. Cinq experiences paraUeles sont realisees dans des conditions identiques a ceUes precedemment decrites. Seul Ie pH de l'eluant differe; il est compris entre 3,6 et 8,6. Dans tous les cas, la force ionique est largement superieure a 0,02:

- tampon citrate-phosphate (0,025 M) pH 3,6 - tampon acetate (0,05 M) = pH 4,5

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- tampon citrate-phosphate (0,025 M) - tampon phosphate (0,05 NI) - tampon tris-HCI (0,1 M)

pH 5,5 pH 6,8 pH 8,6

Les n:sultats sOnt exprimes alors par Ie volume d'e!ution relatif (Ve/Vo) et par Ie coef­Ve-Vo

ficient de partage KU \- = -V -V t- 0

- Vo = volume d'exclusion - Ve c= volume d'elution de la substance - Vt = volume total du gel.

Resultats

I. Separation des differentes fractions colorees a partir d'extraits de fruits et de cals

Quelle que soit l'origine de l'extrait, apres 6 heures d'elution, nous recueillons 36 fractions de 1 ml dont les 11 premieres sont incolores. Les 12, 13, 14, 15, 16 et 17 e fractions presentent une coloration jaune et ont les proprietes spectrales des betaxanthines (MABRY et TURNER, 1964; WYLER et al., 1965). Nous obtenons ensuite deux zones qui possedent les caracteristiques spectrales des betacyanines (PIATTELLI

et MINALE, 1964). L'une (fractions 24 a 30) est de couleur violette, l'autre (frac­tions 31 a 36) est de coloration rose pale. La seule difference perceptible entre les extraits provenant de fruits et de cultures de tissus reside au niveau des fractions 18 a 23, incolores dans Ie premier cas et presentant une coloration rose dans Ie deuxieme cas.

II. Essais d'identification

A. Etude des fractions jaunes

Des essais d'identification ont pu &tre envisages a partir des fractions 13, 14 et 15 grace a une intensite de coloration suffisante et ceci aussi bien a partir des cals que des fruits.

1. Electrophorese sur papier

A partir de ces trois fractions, quel que soit Ie solvant de migration utilise, tampon phosphate 0,05 M: pH 6,8 ou tampon borate 0,2 M: pH 8,6, nous obtenons une seule tache coloree en jaune qui presente la m&me mobilite electrophoretique que l'indicaxanthine de reference.

2. Chromatographie sur papier

La chromatographie sur papier de ces fractions 13, 14 et 15 dans Ie solvant ethanol-acetate de sodium en solution aqueuse 0,3 Ofo: 4-1 (v/v) permet de dece!er la presence d'une seule tache de Rf egal a 0,17, correspondant a ce!ui de l'indica­xanthine de reference.

3. Etude spectrale

L'etude spectrale de ces trois fractions revele dans Ie visible un maXimum d'absorption a 485 nm avec un epaulement a 464 nm. Dans l'ultra violet, on

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retrouve deux maxima a 305 nm et 260 nm. Toutes ces proprietes correspondent bien a celles de l'indicaxanthine (PIATELLI et al., 1964).

4. Chromatographie sur gel de Sephadex

L'indicaxanthine de reference, en solution dans Ie tampon d'elution, sou mise au traitement de chromatographie sur gel de Sephadex se retrouve dans les fractions 12 a 16, avec une concentration maximale au niveau des 13e et 14e fractions.

B. Etude des fractions violettes

Les fractions d'elution 24 a 30, proven ant d'extraits de fruits ou de cals ont ete soumises a des essais d'identification.

1. Electrophorese sur papier

Le solvant de migration acide formique (0,01 M)-pyridine (0,05 M): pH 4,5 revele la presence de deux taches colorees. L'une rose intense, possede la meme mobilite electrophoretique que la betanine de reference (Eb = 1,00), l'autre de coloration plus faible a une valeur de Eb egale a 1,25, ce qui correspond a la mobilite electrophoretique de la phyllocactine (PIATELLI et MINALE, 1964).

Dans l'acide formique (0,01 M): pH 2,4 on ne decele qu'une tache rose violacee dont Ie Eb est egal a 1,00; la phyllocactine et la beta nine ayant la meme mobilite electrophoretique dans ce solvant (PIATELLI et MINALE, 1964).

2. Chromatographie sur papier

Dans Ie solvant phenol-eau 4-1 (v/v) nous obtenons une tache rose qui est localisee au meme niveau que la beta nine de reference (Rf = 0,20), une autre zone coloree egalement en rose s'individualisant sur la ligne de depart.

3. Etude spectra Ie

L'etude spectrale de ces fractions dans Ie visible revele une absorption maximale a 538 nm.

4. Chromatographie sur gel de Sephadex

La betanine de reference, chromatographiee sur gel de Sephadex, dans des con­ditions strictement identiques se retrouve au niveau des fractions 21 a 26.

II I. Influence du pH sur l'ordre d'e/ution de la betanine et de l'indicaxanthine

A partir d'une solution contenant a la fois de la betanine et de I'indicaxanthine, nous avons envisage l'influence du pH du tampon d'elution sur les volumes d'cHution de ces deux suhstances. Les resultats obtenus sont consignes dans Ie tableau 1.

Nous constatons que les volumes d'elution relatifs de ces deux substances ainsi que leurs coefficients de partage varient tres peu quel que soit Ie pH du tampon d'elution pour des valeurs comprises entre 3,6 et 8,6. L'indicaxanthine de poids moleculaire plus faible que la betanine s'elue toujours en premier.

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Tab. 1: Influence du pH des differents eIuants sur les volumes d'elution relatifs et les coefficients de part age de l'indicaxanthine et de la betanine de reference.

pH des differents eluants

3,6 4,5 5,5 6,8 8,6 VelVo Kav VelVo Kav VelVa Kav VelVa Kav VelVa Kav

Indicaxanthine 1,8 0,14 1,93 0,12 1,86 0,11 2 0,13 2 0,13 Betanine 3,30 0,30 3,36 0,31 3,28 0,30 3,43 0,32 3,36 0,31

Discussion

Quelle que soit l'origine de l'extrait (fruits ou cultures de tissus), naus avons pu mettre en evidence une betaxanthine associee a plusieurs betacyanines (3 ou 4 selon qu'il s'agit de fruits ou de cals). La betaxanthine a pu ~tre identifiee a l'indicaxanthine, les caracteristiques spectrales de m~me que Ie comportement en electrophorese, en chromatographie sur papier et sur gel de Sephadex etant identiques. Les chromatographies sur papier dans Ie solvant ethanol-acetate de Na et la presence des maxima d'absorption dans Ie visible et dans l'ultra violet ont constitue des criteres particulierement valables (PIATTELLI et al., 1965). Parmi les quatre betaeyanines separees, deux seulement, presentes en concentration suffisam­ment elevee ont pu ~tre identifiees; il s'agit de betanine et de phyllocactine. Les resultats de l'analyse spectrale dans Ie visible n'auraient pas permis a eux seuls de caracteriser valablement ces deux pigments, d'autres betacyanines possedant un maximum d'absorption a 538 nm (PIATELLI et MINALE, 1964). En revanche, les caracteristiques electrophoretiques ont fourni de serieuses presomptions en faveur de l'identification dans un cas comme dans l'autre. En ce qui concerne la beta nine, des preuves supplementaires ont ete apportees par l'utilisation de la substance de reference lors d'essais en chromatographie sur papier ou sur gel de Sephadex et en electrophorese.

La methode de separation utilisee, Ie gel de Sephadex G 15, s'est done revelee fructueuse une fois de plus dans Ie cas des betalalnes et ceci bien que l'ordre de migration des pigments ne cor responde pas a celui attendu, en fonction de leurs poids moleculaires. A ce propos nous avons montre que Ie pH de l'eluant n'etait pas responsable de cette anomalie. Un phenomene analogue a ete signale a propos de la separation de diverses cytokinines (ARMSTRONG et al., 1969) ou gibberellines (MACMILLAN et WELS, 1973). La separation entre acide abscissique et acide gibberel­lique presente aussi cette anomalie, l'acide abscissique de poids moleculaire plus faible que l'acide gibberellique s'eIuant toujours avant eelui-ci (REYNOLDS, 1970).

II nous parah utile pour terminer, d'insister sur les points suivants a propos du materiel vegetal utilise:

comme chez de nombreuses Cactacees, la phyllocactine se trouverait chez Myrtil­locactus associee a la beta nine (PIATTELLI, 1976),

- les conditions de culture «in vitro» permettraient a la tige d'exprimer des poten-

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tialites de biosynthese de betalaines qui normalement ne se manifesteraient sur la plante entiere qu'au niveau de la fleur ou du fruit.

Nous remercions MM. les Dr. PIATELLI et IMPELLIZZERI pour les echantillons de betanine et d'indicaxanthine mis gracieusement a notre disposition.

Bibliographie ARMSTRONG, D. ]., W. ]. BURROWS, P. K. EVANS et F. SKOOG: Biochem. Biophys. Res.

Commun. 37, 451 (1969). COLOMAS, ].: Z. Pflanzenphysiol. 85, 227 (1977). COLOMAS, ]. et C. BULARD: Bull. Soc. Bot. Fr. 124, 385 (1977). CONSTABEL, F. et H. NASSIF-MAKKI: Ber. Dtsm. Bot. Ges. 84, 629 (1971). ENDRESS, R.: Biochem. Physiol. Pflanzen 169, 87 (1976). MABRY, T. J. et B. L. TURNER: Taxon 13, 197 (1964). MACMILLAN, ]. et C. M. WELS: J. Chromatogr. 87, 271 (1973). MOREL, G.: 96e Congres national des Sociches Savantes Toulouse IV, 287 (1971). PIATELLI, M. et L. MINALE: Phytochem. 3, 547 (1964). PIATELLI, M., L. MINALE et G. PROTA: Tetrahedron 20, 2325 (1964). PIATELLI, M., L. MINALE et R. A. NICOLAUS: Phytochem. 4,817 (1965). PIATELLI, M.: In: T. W. GOODWIN (Ed.), Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments,

vol. 1,560, Academic Press, 1976. REYNOLDS, T.: J. Exp. Bot. 21, 702 (1970). WYLER, H., M. E. WILCOX et A. S. DREIDING: Helv. Chim. Acta 48,361 (1965).

JACQUELINE COLOMAS, Laboratoire de Physiologie Vegetale, Universite de Nice, F - 06034 Nice CEDEX, France.

Z. P/lanzenphysiol. Bd. 87. S. 341-346. 1978.