BIOCHIMIE, 1971, 53, 751.

Solubilisation micellaire du cholestdrol par les sels biliaires et les lecithines extraits de la bile humaine.

J. C. MONTET et D. G. DERVICHIAN.

Unitd de R e c h e r e h e s de P a t h o l o g i e Diges t i ve , I .N.S.E.R.M., D i r e c t e u r : Pro f . H. SARLES, ~6, c h e m i n de ta Gage - - 1 3 - M a r s e i l l e (90.

S e r v i c e de B i o p h y s i q u e , I n s t i t u t P a s t e u r - - 7 5 - P a r i s (150. (19-$-71).

Summary . - - Solubilisation limits in vitro of cholesterol have been studied under conditions as similar as possible to those of biliary medium.

Incorporation of cholesterol shows a maximum for a biliary salt/lecithin ratio of 7/3.

The solubilisations obtained with various biliary salts are almost similar, whether cholate alone is considered, or conjugated biliary salts of human or bovine origin.

The nature of lecithins (extracted from bile or egg yolk) has no influence either. The presence of a certain proportion of unsaturated fatty acid chains is solely effective.

INTRODUCTION.

On salt clue les sels bi l iaires ~ cux seuls n 'entrai- nent que tr6s peu la disso~lution du cholest6rol dans l 'ean. Plusieurs auteurs [1, 2, 3] avaient d6j/t insist6 sur le r61e de la 16cithine dans la solubili- sation du cholest6rol en pr6sence de sels biliaires. ISAKSSON I31 en par t icul ie r avait montr6 que les sels bi l iaires et la lbcithine formaient un syst6me soluble dans l 'eau et que ce systbme 6tait capable de dissoudre le cholest6rol in v i t ro . HOFMANN [4] avait sugg6r6 q u e s i des quantit6s re la t ivement impor tantes de cholest6rol se t rouvent h l '6tat dissous dans la bile, cela 6tait dfi h son incorpo- ration dans des inicelles mixtes ternaires renfer- mant en ra6me temps des sels biliaires, des 16ci- thines et lc cholest6rot.

En proc6dant h une s6rie d'6tudes syst6matiques sur des m61anges ternaires et quaternaires de sel bil iaire, de 16cithine, de cholest6rol et d'eau, dans toutes les propor t ions possibles, SMALL, BOURGES et DERVtCHIAN [5, 6, 7] ont montr6 que de tels m61anges donnaient , selon les propor t ions , soit trois types de phases paracr is tal l ines , soit une phase mice,llaire, celle-ci 6rant la solution isotrope p roprement dite.

La 16cithine, qui ne peut que gonfier dans l 'eau sans se dissoudre, est solubilis6e sous forme d 'une solution mice,llaire par l ' addi t ion de sels biliaires. Ainsi, si le cholest6rol ne peut pas se dissoudre dans l 'eau, il peut, en s 'associant avec la 16cithine, 6tre entrain6 darts des micelles mixtes par l 'addi- tion de sels biliaires. La solubilisation du cho-

lest6rol dans la bile apparai t ainsi li6e ~ un cer- tain 6quil ibre entre les propor t ions respectives de 16cithine, de cholest6rol et de sels hiliaires.

Cependant, ces 6tudes syst6matiques de la solu- bil isation du cholest6rol avaient 6t6 faites d 'une part en util isant la 16cithine du jaune d'ceuf et d 'autre part p r inc ipa lement le cholate de sodium, alors que la bile ne cont ient que des sels bi l ia ires conjugu6s. Une 6rude avait bien 6t6 faite avec les m61anges de sels bi l ia ires de bceuf, mats en utili- sant encore la 16cithine du jaune d'oeuf.

Le but du pr6sent travail a 6t6 de v6rifier si les con di~tions de solubilisation d6finies dans ce tra- vai'l ant6rieur res ia ient valables lorsque la compo- sition en sels bii taires et en 16cithine 6tait celle du mil ieu bi l ia i re humain. Nous avons pour cela ntilis6 les sels bi l ia ires conjugu6s et les 16cithines extraites de la bile humaine.

MATERIEL ET M~THODES.

La bile a 6t6 pr61ev6e chez des patients por teurs de drain en T ptac6 dans la vote bi l ia i re pr inci - pale.

P u r i f i c a t i o n des l d c i t h i n e s b i t i a i re s h u m a i n e s .

Les l ipides bi l ia i res sont s6par6s des sels bi- l ia ires conjugu6s par un partage suivant la mb- thode de FOLCH et coll. [8]. Les 16eithines sont ul t6r ieurement purifl6es par chromatographie sur eolonne d 'aeide si l ieique sous haute pression [9].

752 J. C. M o n t e t et D. G. D e r v i c h i a n .

Le programme d'61ution choisi permet de re- cuei l l i r dans le c h l o r o f o r m e / m O h a n o l (90/10) les l ipides neutres, dans le ch lo ro fo rme/m6thano l (80/20) les pigments bil iaires, darts le chloro- fo rme/m6thanol (60/40) les phosphat idylchol ines .

Les 16cithines obtenues song chromatographi - quement pures. La composi t ion en acides gras est obtenue par chromatographie en phase gazeuse, soit en pour cent :

C14 : 0 Graces C18 : 1 20 C16 : 0 42,6 C18 : 2 24,7 C16 : 1 5 C18 : 3 Graces C18 : 0 5,4 C20 : 4 2,2

Cette composi t ion en acides gras est asscz diff6- rente de celle des 16cithines extraites du jaune d'~eu f :

C14 : 0 Graces C18 : 1 31 ,6 C16 : 0 31,3 C18 : 2 16,3 C16 : 1 3 C18 : 3 0,3 C18 : 0 13 C20 : 2 0,2

C20 : 3 3,7

Les 16cithines bi l iaires sont plus r iches en acides palmit ique et l inol6ique mats cont iennent une plus faib.le p ropor t ion d 'acides st6arique et ol6ique.

Puri f icat ion des sets biliaires conjagu~s.

Nous avons extrai t les m61anges de sels bi l ia ires par t i r de bile humaine et de bile de bceuf.

De la bile est m61ang6e avec du charbon v6g6- tal en poudre, puts 6vapor6e. Le r6sidu sec pulv6- risk est 6puts6 par l '6thanol absolu. Les extraits sont filtr6s et concentr6s. Le l iquide obtenu est pr6cipit6 par de l 'oxyde d'~thyle anhydre sous forme de flocons blancs.

La composi t ion moyenne du m61ange des sels bi l ia ires est pour la bile humaine en p. cent mo- l a i r e :

taurocholate de sodium

taurodi OH I taurodesoxyeholate . . . . . . . . . 12 p. cent taurochenodesoxycholate . . . . . 14 p. cent

glycocholate de sodium

glycodi OH ! glycodesoxycholate . . . . . . . . . . 35 p. cent t glycochenodesoxycholate . . . . . 39 p. cent

pour la bile de boeuf :

taurocholate de sodium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 p. cent taurodesoxycholate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 p. cent glycocholate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 p. cent glycodesoxycholate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 p. cent cholate libre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . traces

tauroconjugu~ On n0tera un rappor t beaucoup

glycoconjugu6 plus ~lev6 chez le bceuf que chez l 'homme. D'autre

part, la bile de b.oeuf ne poss~de pas de d6riv6s chenodesoxy.

Le cholest~rol.

I1 est pr6par6 "~ par t i r d 'un produi t commerc ia l par trois reeris tal l isat ions successives dans du m6thanol anhydre. Le point de fusion est de 147°C.

Prdparation des m~langes.

Des solutions des trois produi ts 6tudi6s ont 6t6 pr6par6es dans le m6thanol et leurs concentra- t ions d6termin6es par exirai t sec. En pr61evant des volumes en propor t ions eonvenahles de ces solutions, on pr6pare d 'abord diff6rents m61anges binaires de 16cithine et de sels biliaires. A par t i r de chacun de ces m~langes binaires, contenant une propor t ion fixe de 16cithine par rappor t aux sels biliaires, on pr6pare des s6ries de m61anges ternai res contenant des quantit6s croissantes de cholest6rol. Aprbs 6vaporat ion complete de l 'alcool, un 6chantil lon de chacun de ces m61anges ternaires est addi l ionn6 d 'une quantit6 d 'ean (tampon phosphate 0,05 M pH 7,0) telle que le m6~ange final contienne toujours 10 p. cent en poids de solide total, condi t ion proche de la bile v6siculaire humaine. Les tubes soni scell6s sons azote, puts agit6s pendant 24 heures "~ 37°C. On laisse les m61anges s '6qui l ibrer pendant 48 heures. Chaque m61ange est examin6 ensuite au micro- scope en lumi~re normale e t c n lumibre polaris6e.

En comparant les tubes qui cont iennent des quantit6s croissantes de cholest6rot, on peut ainsi appr6cier les l imites de solubilisation pour chaque propor t ion relative de 16cithine et de sels bi- liaires. Les propor t ions de 16cithine dans le m6- lange 16cithine-sels bi l iaires ont 6t6 6chelonn6es entre 0 et 40 p. cent (mole p. cent) de manibre h couvr i r largement le domaine des concentra t ions trouv6es dans la bile humaine.

RI~SULTATS.

Limi te de solubilisation du cholesterol par le mdlange des sels biliaires conjugu~s el des l~cithines biliaires.

(R~sultats exprim6s en mole p. cent).

Sels biliaires de L6cithines Cholest6rol la bile humaine solubilis6

97,1 88,2 77 74,7 70,4 62,8 57,5 54,5

0 6,4

14,3 16,4 20,2 26,9 33 36,3

2,9 5,4 8,7 8,9 9,4

I0,3 9,5 9,2

BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 6-7.

S o l u b i l i s a t i o n m i c e l l a i r e d u ch o l e s td r o l . 753

DISCUSSION.

On voit que l ' incorpora t ion du cholest6rol est maxinmm pour un rappor t molaire sels bi l iaires 16eithine = 7/3.

La m6me s6rie d 'exp6riences a 6t6 r6alis6e avee des sels bi l ia ires conjugu6s de bile de b~uf . Des r6sultats identiques ont 6t6 obtenus.

On peut done conelure qu 'en ce qui eoncerne les sels biliaires, leur nature ch imique n'a prati- quement aueune influence sur la capaeit6 de d issoudre lc ehc~lest6rol en pr6senee de 16eithine. Sur ce point, NEIDERHISER [10] et ADMIBAND et SMALL I l l ] , 6talent arriv6s /i la m(.me conclusion.

En ce qui concerne l ' influence de la nature des acides gras des 16cithines, il appara i t aussi qu ' i l n 'y a pas de diff6rence impor tante entre le pou- voir solubil isant des 16cithines extraites de la bile humaine et de celles extraites du jaune d'teuf. C'est ce qui appara i t sur la figure 1 off sont com- par6s les r6sultats du pr6sent t ravai l avec ceux obtenus par SMALL [ l l l qui avait d6termin6 les limites de solubilisation du cholest6rol en pr6- sence de 16cithine d'~euf.

C H O L E S T E R O L

J Mole %

1 0 . -~" ~ .

5 . / • • 1,6cithlne d'ceuf

• . . . . . • b i l ia i re

L E C I T H I N E

o , b 2'o 35 4'o Mo, . ",,

FIG. I. -- Limites de solubilisation du cholest~ro] en pr6senee de sels biliaires conjugu6s et de 16eithine.

Ainsi, ces deux 16cithines naturelles, bien qu 'ayant des profils en acides gras tr6s distincts, assurent une incorpora t ion 6quivalente du cho- lest6rol au sein des micelles mixtes. Ce dern ie r r6sultat peut faci lement s 'expl iquer en invoquant le m6eanisme d 'associat ion du cholest6rol avec ta 16eithine.

BIOCHIMIE, 1971, 53, n o 6-7.

On salt que la 16cithine, h elle seule, ne peut gonfler dans l 'eau que si les chaines grasses qui la consti tuent sont dans l '6tat fondu. Cette condi- tion ne peut 6tre r6alis6e & la temp6rature ordi- naire ou m6me & 37°C avec une 16cithine consti- tu6e d 'ac ide gras fi chaines longues et satur6es. Par contre, la pr6sence, ne serait-ce qu 'en partie, de chaines insatur6es abaisse la temp6rature de fusion des chaines et permet h la 16eithine de gonfler dans l 'eau d6s la temp6rature ordinaire .

Ainsi que cela a 6t6 soulign6 par DERVICHrAN [12, 13], l ' incorpora t ion du cholest6rot darts la 16cithine dolt ~tre consid6r6e comme une v6ri- table dissolution du noyau paraff inique du cho- test6rot clans les chaines paraff iniques de la 16ci- thine. Cette dissolution exige aussi que les part ies paraffiniques soient dans l'6tat fondu.

Or, aussi bien la 16cithine extraite du jaune d'~euf que celle extraite de la bile humaine, r6ali- sent cette condi t ion h la temp6rature ordinaire , et ~ plus forte raison h 37% Ceci s 'expl ique par le fair que bien que les pourcentages en acides pal- mitique, st6arique, ol6ique et l inol6ique ne soient pas les m6mes dans le d6tail, le pourcentage global des chaines insatur6es est ~ peu pr6s le m~me :

55 p. cent environ de chaines insatur6es pour la 16cithine d'oeuf,

52 p. cent environ de chalnes insatur6es pour la 16cithine biliaire.

I1 appara i t ainsi clue seul l '6tat physique des chaines condi t ionne l ' incorpora t ion dn cholest6- rol et que la quantit6 m a x im u m incorpor6e est ind6pendante de la composi t ion des chaines hydrocarbon6es.

R~sum~.

Les limites de solubitisation in vitro du cholest6rot out dt6 examin6es dans les conditions les plus proches de celles du milieu biliaire.

L'incorporation du cholestdrol est maximum pour un rapport sels biliaires/l~eithines de 7/3.

Les solubilisations obtenues avec des sels biliaires de diff6rentes compositions sont pratiquement iden- tiques, qu'il s'agisse de cholate seul, de sels biliaires eonjugu6s d'origine humaine ou bovine.

La nature des 16cithines (extraites de la bile ou du jaune d'oeuf) est aussi sans influence. Seule intervient la presence d ' une eertaine proportion de eba~nes grasses non satur6es.

Z U S A M M E N F A S S U N G ,

Die Grenzen der in vitro L6sliehkeit des Cholesterols sind unter Bedingungen, die sich am meisten denje- nigen des Gallenmediums ann~ihern, untersucht wor- den.

52

7 5 4 J. C. M o n t e t e t D. G. D e r v i c h i a n .

Der E i n b a u des Cho les t e ro l s i s t m a x i m a l fiir e in Verh~il tnis G a l l e n s a l z e / L e z i t h i n e : 7/3.

Die m i t G a l l e n s a t z e n v e r s c h i e d e n e r Z u s a m m e n s e t - z u n g e r h a l t e n e n L S s u n g e n s ind p r a k t i s e h iden t i seh , ob es .~ich u m Chola t a l l e in , oder u m Gal l ensa lze , die a u s d e m Menschen oder a u s d e m Rind s t a m m e n t , h a n d e l t .

Die Art tier L ez i t h i ne (ob a u s de r Gal le oder au s d e m Eigelb e x t r a h i e r t ) i s t ebenso o h n e Einf luss . Al le in wich t ig i s t das V o r h a u d e n s e i n e ines g e w i s s e n Geha l t s an unges t i t t i g t en Fe t t s f iu reke t t en .

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