Stratégies d’identification de gènes responsables de maladies

A) Stratégies d’identification indépendantes de la position du gène

- en connaissant la protéine responsable

- en connaisant un modèle animal qui a la maladie

- s’il s’agit d’une pathologie par anticipation (maladie à triplet)

B) Stratégies d’identification dépendantes de la position du gène

Stratégies d’identification indépendantes de la position du gène

• A) On ne connaît pas même partiellement la protéine: ex: gène de globine (à partir de polysomes)

• B) On connaît partiellement la protéine: ex: facteur de coagulation

• C) si on a pu générer (à partir de quantités très petites de la protéine un anticorps spécifique ex: phénylalanine hydroxylase( à partir de polysome

• D) amplification de triplets

Clonage positionnel(I)• Localisation chromosomique du gène morbide• Définir la région candidate sur le chromosome• Définir les frontières de la région candidate:

utilisation du déséquilibre de liaison• Etablir un contig c’et à dire la répartition de

clones chevauchant• Etablir la conservation dans les espèces des

clones potentiels (Zoo blot)• Etablir une carte transcriptionnelle• Identifier des ilôts CpG dans la région (régions à

proximité des gènes sont hypométhylées)

Clonage positionnel(II)

Vérifier pour le gène candidat:

a) qu’il s’exprime dans les bons tissus

b) qu’il est muté chez les malades

c) qu’il a la fonction appropriée

Notions de génétique• Liaison et association:

- La liaison concerne la position des loci sur le chromosome; lorsque 2 loci sont liés, des combinaisons spécifiques des allèles de ces loci seront transmis simultanément( sur le même chromosome au sein des familles)

- L’association concerne la relation statistique entre deux caractères au sein de la population générale

• Equilibre de liaison: un allèle pathologique et un allèle marqueur peuvent être associés à l’ intérieur d’une famille mais pas entre familles; ainsi s’il n’existe dans un grand nombre de famille aucune association préférentielle entre le gène pathologique et un allèle spécifique à un locus marqueur lié, les deux loci sont en équilibre de liaison

• Déséquilibre de liaison: association non aléatoire d’allèles à des loci liés; cela se calcule par la fréquence de l’ haplotype contenant l’allèle pathologique et l’allèle marqueur. Ainsi deux loci liés peuvent, s’il y a déséquilibre de liaison montrer une association allélique et peuvent servir pour cartographier un gène candidat de maladie.

Carte de contig

Clonage du gène responsable de la myopathie de Duchenne

A) localisation chromosomique: - présence de la pathologie chez les hommes avec une incidence de 1/3000 sans variation ethnique d’où locus sur le chromosome X

B) quelque femmes malades- par cytogénétique on a pu montrer que ces femmes portaient une translocation entre le chromosome X et un autosome et que quelque soit l’autosome c’était toujours la région Xp qui était impliquée- de plus que les frontières de la région contenant le gène morbide devait se situer entre xp21.1 et Xp21.3

Localisation en XP21 entre Xp21.1 et xp21.3

Utilisation de sondes anonymes• Le gène codant l’OTC se situe en Xp21 et constitue donc un

marqueur pour localiser le gène candidat• Identification de RFLP à partir d’ADN de familles de malades• Localisation de ces RFLP par Southern blot grâce aux sondes

anonymes générées dans d’autres laboratoires: les sondes RC8 et L1.28

• Dans les familles à Duchenne, ces deux marqueurs ségrègent avec le gène candidat appelé DMD mais avec une fréquence de recombinaison de 20% plaçant le gène DMD à environ 20cmorgan de distance de ces deux sondes

• Les deux sondes sont situées à 40cM l’une de l’autre plaçant le gène DMD à peu près au milieu de la distance qui sépare ces deux sondes

Quelques malades complexes aident à l’identification plus précise du locus

• Il y a quelque malades atteints de DMD qui ont en plus soit un déficit en glycerol phosphate (GK), soit une rétinite pigmentaire ( RP), soit une hypoplasie adrénale (AHC), soit une granulomatose chronique (CGD) soit une maladie de Mc Leod (XK)

• Il y a un malade BB qui a en plus de DMD: CGD, XK et RP• L’analyse cytogénétique de malade BB a révélé une délétion dans

la région entre XP21.1 et XP21.2• la sonde 824 qui ségrège avec le gène DMD s’est révélée

particulièrement utile pour localiser les délétions que l’on pouvait trouver chez le malade BB et chez un petit nombre d’autres malades qui en plus de DMD avaient l’un des symptômes ci-dessus

• D’après les résultats de Southern chez ces différents malades on pouvait attribuer l’ordre suivant pour les gènes sur le chromosome XP21: AHC, GK,DMD,XK,CGD,RP

Tout est donc en place pour utiliser les diverses stratégies de clonage du gène responsable de la maladie de Duchenne

(DMD)• Le chromosome X contient environ 150 000 kb et la

sonde la plus proche dont on disposait se trouvait à 10cmorgan du gène DMD

• 1ère stratégie: isoler à partir d’une banque de cDNA de muscle des ARNm candidats. Le gène isolé par cette technique se trouvait sur le chromosome 12!!

• 2ème stratégie; clonage de la région PERT• 3ème stratégie: clonage de la région transloquée( du

chromosome X) d’une femme malade qui emportait sur le chromosome21 une série de gènes codant des ARNr

Du locus au gène (I)

- Isolement dans le locus DXS164 d’un sous clone: pERT87-25- Ce clone pERT87-25 hybride dans un zoo blot avec l’ADN

de singe, bœuf; souris hamster et poulet- Ce clone contient une ORF conservée chez la souris - Ce clone donne en Northern(ARNm de muscle)- Ce clone donne un message de 16kb-Ce cDNA donne un ARNm de 8 exons qui couvrirait 130Kb d’ADN

Du locus au gène (II)

• Recriblage d’une banque de cDNA pour identifier un ARNm plus grand: on obtient un cDNA de 14Kb

• Utilisation de ce cDNA pour identifier en Southern les fragments d’ADN coupés par HindIII: on trouve 33 fragments d’hybridation couvrant environ 1000Kb!!!

• Ces 33 exons ne représentent qu’une partie du gène donnant ainsi une estimation pour la taille du gène DMD de 2000Kb environ!!!