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Synthèse et caractérisation d’analogues de peptides
antimicrobiens riches en arginines
Mémoire
Nicolas Poulin
Maîtrise en chimie
Maître ès science (M. Sc.)
Québec, Canada
© Nicolas Poulin, 2017
II
Synthèse et caractérisation d’analogues de peptides
antimicrobiens riches en arginines
Mémoire
Nicolas Poulin
Sous la direction de :
Normand voyer, directeur de recherche
Michèle Auger, codirectrice de recherche
III
Résumé
La résistance antimicrobienne est un problème de santé publique de plus en plus inquiétant.
En effet, si ce problème n’est pas contrôlé dès maintenant, dans les prochaines années, nous
pourrions arriver dans une ère post-antibiotique où de simples infections pourraient
recommencer à tuer. Afin d’éviter de tels enjeux, il est primordial que de nouveaux
antibiotiques soient développés pour remplacer les médicaments contre lesquels les
bactéries se sont adaptées. De toutes nouvelles classes de médicaments seraient nécessaires
et l’une d’entre elles est la classe des peptides antimicrobiens. Ces segments protéiques sont
retrouvés dans une impressionnante variété d’organismes et sont utilisés comme première
ligne de défense contre les infections bactériennes. Le fonctionnement de ces molécules
n’est pas entièrement compris, mais il est présumé qu’elles créent des pores dans les
membranes bactériennes, causant ainsi la mort des cellules attaquées. Ces molécules ont un
énorme potentiel, mais de nombreux problèmes empêchent leur utilisation clinique. Dans le
laboratoire du Professeur Voyer, un peptide modèle, analogue des peptides antimicrobiens,
a été synthétisé. Ce peptide composé de 10 leucines et de quatre phénylalanines modifiées
par des éthers-couronnes a été modifié de façon systématique pour tenter de comprendre les
déterminants de l’activité et de la sélectivité des peptides antimicrobiens. Dans ce mémoire,
la synthèse et la caractérisation des analogues dans lesquels trois leucines ont été
substituées par des acides aminés cationiques seront discutées. Ces peptides ont été
caractérisés par des études biophysiques comme le dichroïsme circulaire, l’infrarouge à
transformée de Fourier et le relargage de la calcéine par fluorescence. De plus, des tests
d’activité biologique comme l’activité antimicrobienne et l’activité hémolytique ont aussi
été réalisés et sont présentés dans le présent mémoire.
IV
Table des matières
Résumé ................................................................................................................................................ II
Table des matières ............................................................................................................................. IV
Liste des tableaux ............................................................................................................................. VII
Liste des figures ............................................................................................................................. VIII
Liste des abréviations ......................................................................................................................... X
Remerciements ................................................................................................................................. XII
Chapitre 1 – Introduction .................................................................................................................... 1
1.1 - Antibiotiques ........................................................................................................................... 1
1.2 - Résistance aux antibiotiques ................................................................................................... 1
1.3 - Solutions envisageables .......................................................................................................... 5
1.4 - Peptides antimicrobiens .......................................................................................................... 7
1.4.1 - Classification.................................................................................................................... 8
1.4.2 - Peptides amphiphiles en hélice alpha ............................................................................... 9
1.4.3 - Mécanisme d’action ....................................................................................................... 10
1.4.4 - Potentiel comme médicament ........................................................................................ 11
1.4.5 - Peptides sur le marché ................................................................................................... 12
1.4.6 - Peptides antimicrobiens synthétiques ............................................................................ 13
Chapitre 2 - Projet ............................................................................................................................. 14
2.1 - Antécédents au laboratoire .................................................................................................... 14
2.2 - Objectifs du projet................................................................................................................. 17
Chapitre 3 - Synthèse et caractérisation ............................................................................................ 18
3.1 - Synthèse de l’acide aminé éther-couronne ............................................................................ 18
3.2 - Synthèse peptidique sur support solide ................................................................................. 20
3.3 - Purification et caractérisation ............................................................................................... 23
3.4 - Étude fluorimétrique du relargage de la calcéine .................................................................. 24
3.5 - Détermination de la structure secondaire par dichroïsme circulaire et dichroïsme circulaire
orienté ............................................................................................................................................ 26
3.6 - Détermination de la structure secondaire par spectroscopie infrarouge ............................... 27
3.7 - Test d’activité antibactérienne .............................................................................................. 29
3.8 - Test d’activité hémolytique ................................................................................................... 30
Chapitre 4 - Résultats et discussion ................................................................................................... 31
4.1 - Synthèse peptidique .............................................................................................................. 31
V
4.2 - Étude fluorimétrique du relargage de la calcéine .................................................................. 38
4.3 - Analyse de la structure secondaire par dichroïsme circulaire et dichroïsme circulaire orienté
....................................................................................................................................................... 42
4.3.1 - Dichroïsme circulaire ..................................................................................................... 42
4.3.2 - Dichroïsme circulaire orienté ......................................................................................... 46
4.4 - Analyse de la structure secondaire par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier . 49
4.5 - Activité antibactérienne ........................................................................................................ 51
4.6 - Activité hémolytique ............................................................................................................. 58
4.7 - Protection des extrémités ...................................................................................................... 62
Chapitre 5 – Conclusion et travaux futurs ......................................................................................... 67
5.1 - Conclusion ............................................................................................................................ 67
5.2 - Travaux futurs ....................................................................................................................... 69
Chapitre 6 - Partie expérimentale ...................................................................................................... 71
6.1 - Remarques générales ............................................................................................................ 71
6.2 - Synthèse de l’acide aminé éther-couronne ............................................................................ 72
6.2.1 - Bromation de l’hexaéthylène glycol .............................................................................. 72
6.2.2 - Estérification de la L-DOPA .......................................................................................... 73
6.2.3 - Protection de la L-DOPA méthylée avec le groupement BOC ...................................... 74
6.2.4 – Macrocyclisation ........................................................................................................... 75
6.2.5 - Saponification de l’éther-couronne ................................................................................ 76
6.2.6 - Déprotection du BOC .................................................................................................... 77
6.2.7 - Protection de l’acide aminé éther-couronne par un groupement Fmoc ......................... 77
6.3 - Synthèse peptidique sur support solide ................................................................................. 79
6.3.1 - Couplage du premier acide aminé .................................................................................. 79
6.3.2 - Détermination du taux de substitution ........................................................................... 80
6.3.3 - Acétylation des sites non-substitués .............................................................................. 80
6.3.4 - Déprotection de la fonction amine du dernier acide aminé fixé .................................... 80
6.3.5 - Couplage de l'acide aminé suivant ................................................................................. 81
6.3.6 - Test de Kaiser qualitatif ................................................................................................. 81
6.3.7 – Séparation et acétylation ............................................................................................... 81
6.3.8 - Clivage des analogues de la résine de Wang ................................................................. 81
6.4 - Purification HPLC ................................................................................................................ 82
6.5 - Caractérisation HPLC ........................................................................................................... 82
VI
6.6 - Étude fluorimétrique du relargage de la calcéine .................................................................. 83
6.6.1 - Préparation des vésicules ............................................................................................... 83
6.6.2 - Test de Bartlett ............................................................................................................... 83
6.6.3 - Test de perméabilité membranaire ................................................................................. 84
6.7 - Détermination de la structure secondaire par spectroscopie infrarouge ............................... 84
6.7.1 - Préparation des échantillons........................................................................................... 84
6.7.2 - Traitement des spectres .................................................................................................. 85
6.7.3 – Résultats ........................................................................................................................ 86
6.8 - Test d’activité antibactérienne .............................................................................................. 98
6.8.1 - Préparation des bactéries ................................................................................................ 98
6.8.2 - Préparation des solutions ............................................................................................... 98
6.8.3 - Test antimicrobien ......................................................................................................... 98
6.9 - Test d’activité hémolytique .................................................................................................. 99
6.9.1- Préparation des plaques ................................................................................................... 99
6.9.2 - Préparation du sang chez Héma-Québec ....................................................................... 99
6.9.3 – Test hémolytique ......................................................................................................... 100
Bibliographie ................................................................................................................................... 101
VII
Liste des tableaux
Tableau 1 – Structure secondaire et longueur d’onde associée ......................................................... 29
Tableau 2 – Rendement et caractérisation par HPLC et spectroscopie de masse des analogues non-
acétylés .............................................................................................................................................. 31
Tableau 3 – Rendement et caractérisation par HPLC et spectroscopie de masse des analogues
acétylés .............................................................................................................................................. 34
Tableau 4 – Structure secondaire majoritaire des séries R5R10 et R4R11 non-acétylés .................. 49
Tableau 5 – Structure secondaire majoritaire des séries R5R10 et R4R11 acétylés ......................... 50
Tableau 6 – CMI de tous les 14-mère trisubstitués ........................................................................... 52
Tableau 7 – CMI des peptides des séries R5R10 et R4R11 .............................................................. 54
Tableau 8 – Activité hémolytique des 14-mère trisubstitués ............................................................ 59
Tableau 9 – Activité hémolytique des peptides des séries R4R11 et R5R10 .................................... 61
Tableau 10 – Effet de la protection du N-terminal sur l’activité antimicrobienne et hémolytique ... 63
Tableau 11 – Effet de la protection du N-terminal sur la structure déterminée par FTIR ................. 63
Tableau 12 - Rendement et caractérisation par HPLC et spectroscopie de masse des analogues
protégés au C-terminal ...................................................................................................................... 64
Tableau 13 – Effet de la protection du C-terminal sur l’activité antimicrobienne et hémolytique ... 64
Tableau 14 – Effet de la protection du C-terminal sur la structure déterminée par FTIR ................. 65
VIII
Liste des figures
Figure 1 - Modes d’action de différents antibiotiques ........................................................................ 2
Figure 2 - Incidence des infections à Enterococcus résistant à la vancomycine pour 1 000
hospitalisations et pour 10 000 jours-patients12
................................................................................... 4
Figure 3 – Différents mécanismes de formation de pores des peptides antimicrobiens, adaptation de
l’article de Brogden36
. ....................................................................................................................... 10
Figure 4 – Structure des différents peptides antimicrobiens disponibles sur le marché. ................... 13
Figure 5 – Représentation schématique du 21-mère en hélice alpha 52
............................................. 14
Figure 6 – Relargage de la calcéine des analogues du 21-mère dans des vésicules de EYPC55
. ...... 15
Figure 7 – Structure du 14-mère ....................................................................................................... 15
Figure 8 – Rétrosynthèse de l’acide aminé éther-couronne .............................................................. 18
Figure 9 – Préparation du dibromure d’hexaéthylène glycol ............................................................ 18
Figure 10 – Protection de la L-DOPA ............................................................................................... 19
Figure 11 - Macrocyclisation de l’éther couronne ............................................................................ 19
Figure 12 – Préparation de la phénylalanine éther-couronne pour la synthèse peptidique ............... 20
Figure 13 – Couplage du premier acide aminé sur la résine de Wang .............................................. 21
Figure 14 – Déprotection de l’acide aminé ....................................................................................... 22
Figure 15 – Élongation du peptide .................................................................................................... 22
Figure 16 – Clivage du peptide de la résine ...................................................................................... 23
Figure 17 – Exemple de chromatogrammes MS et HPLC pour le peptide R3R12R14 .................... 24
Figure 18 – Exemple de graphique de fluorescence obtenu pour le peptide R1R4R11 dans des
vésicules de POPG ............................................................................................................................ 25
Figure 19 – Structure de POPC et POPG respectivement ................................................................. 25
Figure 20 – Schéma du fonctionnement du dichroïsme circulaire .................................................... 26
Figure 21 – Schéma du fonctionnement du dichroïsme circulaire orienté ........................................ 27
Figure 22 – Exemple de décomposition spectrale d’un spectre de FTIR67
....................................... 28
Figure 23 – Pourcentage de relargage de calcéine des vésicules de POPC par différents peptides
non-acétylés ....................................................................................................................................... 39
Figure 24 – Pourcentage de relargage de calcéine des vésicules de POPC par différents peptides
acétylés .............................................................................................................................................. 39
Figure 25 – Pourcentage de relargage de calcéine des vésicules de POPG par différents peptides
non-acétylés ....................................................................................................................................... 40
Figure 26 – Pourcentage de relargage de calcéine des vésicules de POPG par différents peptides
acétylés .............................................................................................................................................. 40
IX
Figure 27 – Représentation hélicoïdale du peptide 14-mère ............................................................. 42
Figure 28 – Spectres de dichroïsme circulaire dans des vésicules de POPC et POPG respectivement,
des analogues trisubstitués des séries R4R11 et R5R10 ................................................................... 43
Figure 29 – Spectre de SR-CD du peptide R1R5R10 ....................................................................... 44
Figure 30 – Spectre de SR-CD du peptide R4R10R11 ..................................................................... 44
Figure 31 – Spectre de SR-CD du peptide AcR5R10R12 ................................................................. 45
Figure 32 – Spectre de SR-CD du peptide R1R4R11 ....................................................................... 45
Figure 33 – Spectre de SR-OCD du peptide R1R5R10 .................................................................... 46
Figure 34 – Spectre de SR-OCD du peptide R4R10R11 .................................................................. 47
Figure 35 – Spectre de SR-OCD du peptide AcR5R10R12 .............................................................. 47
Figure 36 – Image des tests antimicrobiens pour S. epidermidis et E. coli, respectivement ............. 56
Figure 37 – Structure du peptide R1R5R14 ...................................................................................... 57
Figure 38 – Structure du peptide AcR5R10R12 ............................................................................... 57
Figure 39 – Spectre RMN 1H du Fmoc-21-C-7-L-Phe-OH .............................................................. 79
Figure 40 - Spectres infrarouge des séries R4R11 et R5R10 dans des vésicules de POPC .............. 86
Figure 41 - Spectres infrarouge des séries R4R11 et R5R10 dans des vésicules de POPG .............. 90
Figure 42 - Spectres infrarouge des analogues utilisés pour la protection des extrémités dans des
vésicules de POPC ............................................................................................................................ 94
Figure 43 - Spectres infrarouge des peptides utilisés pour la protection des extrémités dans des
vésicules de POPG ............................................................................................................................ 96
Figure 44 - Spectre infrarouge du peptide R1R5R14 et AcR1R5R14 dans les vésicules de POPG et
POPC ................................................................................................................................................. 97
X
Liste des abréviations
6Cl-HOBt : 1-hydroxy-6-chloro-benzotriazole
AcOH : Acide acétique
ATCC : « American Type Culture Collection »
Boc : tert-butoxycarbonyle
Boc2O : Carbonate de di-tert-butyl
BSA : Albumine de sérum bovin
CCM : Chromatographie sur couche mince
CMI : Concentration minimale inhibitrice
DBU : 1,8-diazabicyclo[5,4,0]undéc-7-ène
DCM : Dichlorométhane
DIC : Diisopropylcarbodiimide
DIEA : Diisopropyléthylamine
DMAP : Diméthylaminopyridine
DMF : Diméthylformamide
DMSO : Diméthylsulfoxide
EDTA : Acide éthylène diamine tétraacétique
ERV : Enterococcus résistant à la vancomycine
EYPC : « Egg Yolk Phosphatidyl Choline » Lécithine de jaunes d’oeufs
FDA : « Food and Drug Administration »
Fmoc : 9-fluorénylméthyloxycarbonyle
Fmoc-O-Su : N-(9-Fluorénylméthoxycarbonyloxy)succinimide
FTIR : Infrarouge à Transformé de Fourier
HCTU : O-(6-Chlorobenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tétraméthyluroniumhexafluoro
phosphate
HEPES : Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique
HOBt : Hydroxybenzotriazole
HPLC : Chromatographie liquide à haute pression
KIT : « Karlsruhe Institute of Technology »
LC : Chromatographie liquide
MHB : « Mueller Hinton Broth »
SM : Spectroscopie de masse
NMM : N-méthylmorpholine
OMS : Organisation mondiale de la santé
Pbf : Pentaméthyle-2,3-dihydrobenzofurane-5-sulfonyle
PBS : Tampon phosphate salin
PIB : Produit intérieur brut
POPC : 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
POPG : 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)
REDOR : « Rotational-Echo, Double Resonance NMR »
RMN : Résonance magnétique nucléaire
RPM : Révolution par minute
SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méthyciline
XI
SN2 : Substitution nucléophile de type 2
SR-CD : Dichroïsme circulaire à radiation synchrotron
SR-OCD : Dichroïsme circulaire orienté à radiation synchrotron
TFA : Acide trifluoroacétique
THF : Tétrahydrofurane
TIS : Triisopropylsilane
UV : Ultraviolet
XII
Remerciements
Les études présentées ici sont les plus récents développements d’un projet datant d’une
quinzaine d’années. Ainsi, une quantité impressionnante de personnes y ont été impliquées.
Bien que je ne puisse nommer tout le monde, je tiens à remercier tous ceux ayant travaillé
sur ce projet avant moi.
D’abord, je voudrais remercier les gens ayant travaillé à la synthèse des peptides à l’étude
dans ce mémoire; soit Rachelle Séguin et Laura-Lee Gosselin, deux stagiaires de premier
cycle, ainsi que Romain Martiny, stagiaire français.
Je tiens à remercier Pierre-Alexandre Paquet-Côté qui a fait son projet de maîtrise sur
d’autres analogues de notre peptide modèle. En plus de ses résultats qui ont beaucoup fait
avancer notre étude des peptides antimicrobiens, Pierre-Alexandre a contribué à ma
formation et sa connaissance du projet a toujours été pour moi un outil indispensable.
Ensuite, je voudrais remercier François Otis, professionnel de recherche dans notre
laboratoire. François trouve toujours une solution lorsqu’un problème surgit et se montre
toujours disponible pour nous aider.
Je veux aussi remercier l’ensemble des étudiants de mon groupe, soit Christopher, Jean-
Daniel, Gaëlle, Claudia, Sébastien et Corinne. Leur aide et leur soutien sont toujours
appréciés. Je voulais aussi les remercier d’avoir fait de notre bureau et du laboratoire un
endroit où il est agréable de travailler.
Je veux également remercier le professeur Normand Voyer qui m’a permis de travailler
dans son laboratoire. Son enseignement et son encadrement m’ont fait grandir énormément
tant sur les plans académique et professionnel que sur le plan personnel.
Finalement, je remercie les différents organismes subventionnaires; sans leur soutien
financier, rien de tout ceci n’aurait été possible. Je remercie particulièrement PROTEO qui
m’a accordé une bourse d’étude pour étudiant gradué.
1
Chapitre 1 – Introduction
1.1 - Antibiotiques
Depuis toujours, les infections bactériennes sont un véritable fléau pour la santé publique.
Un nombre incalculable d’individus sont morts de ces infections, certaines semblant
banales aujourd’hui. Ce qui a rendu ces infections si dangereuses était notre difficulté à les
traiter de façon efficace. Heureusement, en 1929, Alexander Fleming fit la découverte
fortuite de la pénicilline, le premier antibiotique, qui sera utilisé plus tard pour combattre
les infections bactériennes causées par certaines bactéries des genres Staphylococcus et
Streptococcus1. Suite à la réalisation que de tels médicaments pourraient éliminer le
problème des infections bactériennes, le nombre de classes d’antibiotiques sur le marché
explosa. En effet, entre les années 1930 et 1960, plus de 20 nouvelles classes
d’antibiotiques firent leur apparition sur les tablettes2,3
permettant ainsi de combattre et de
contrôler plusieurs maladies et ainsi sauver d’innombrables vies.
Par contre, le développement d’antibiotiques a grandement ralenti depuis. En effet, depuis
1960, seulement deux nouvelles classes d’antibiotiques se sont ajoutées4,5
. Il est devenu
trop coûteux et trop compliqué pour les compagnies pharmaceutiques de développer de
nouvelles classes d’antibiotiques6. Pour tenter de stimuler la production de nouvelles
classes d’antibiotiques, plusieurs mesures ont été suggérées, comme la simplification du
procédé de mise en marché des antibiotiques par la FDA, l’homologue de Santé Canada
aux États-Unis, ou de meilleures contrats d’exclusivité, mais aucune de ces mesures n’est
en place en ce moment5.
1.2 - Résistance aux antibiotiques
La résistance aux antibiotiques est un mécanisme de défense que les bactéries développent
en réponse à l’utilisation d’antibiotiques. Certaines bactéries sont intrinsèquement
résistantes à un antibiotique donné, mais d’autres vont développer cette résistance soit par
mutation ou par transfert horizontal de gènes7. Étant donné que les cibles des antibiotiques
sont très variées, les mécanismes de résistance des bactéries sont tout aussi variés.
2
Figure 1 - Modes d’action de différents antibiotiques8
Comme démontré dans la figure 1, les antibiotiques attaquent une très grande variété de
cibles importantes dans la cellule bactérienne. Par conséquent, plusieurs mécanismes sont
nécessaires pour contrer l’action des différentes molécules antibiotiques. La première
stratégie est d’empêcher que le médicament ne se rende à la cible. Pour ce faire, certaines
cellules vont diminuer la perméabilité de leur membrane, empêchant ainsi la molécule
d’entrer dans la cellule. D’autres bactéries peuvent synthétiser des pompes à efflux, qui
sont des protéines de transport spécialisées pour éjecter un antibiotique à l’extérieur de la
cellule. Une autre façon de générer la résistance consiste à modifier génétiquement la cible
de l’antibiotique à l’aide de mutations pour empêcher que le médicament ne reconnaisse
cette cible. La cible peut aussi être modifiée à l’aide d’enzymes pour obtenir le même
résultat. Par exemple, une simple phosphorylation ou une méthylation bien placée peut
modifier la structure de l’enzyme et empêcher l’action de l’antibiotique. Une troisième
stratégie peut être utilisée pour générer de la résistance. Cette stratégie consiste à modifier
directement l’antibiotique pour le rendre inactif. Ainsi, il est possible d’hydrolyser
directement la molécule antibiotique à l’aide d’enzymes. Le transfert de différents
groupements peut aussi suffire à inhiber l’activité. Si, par exemple, ce groupement vient
protéger le site de liaison avec l’enzyme, un groupement aussi simple qu’un méthyle est
suffisant7. En bref, il existe plusieurs modes d’action et les mécanismes de résistance
peuvent être très variés, et ce, même pour un seul antibiotique.
3
La résistance aux antibiotiques, produit de l’évolution, est un phénomène naturel, mais
notre utilisation des antibiotiques peut parfois accélérer la propagation de cette résistance.
En effet, la prescription empirique d’antibiotiques par les médecins expose les bactéries de
notre système au médicament, parfois sans qu’il n’y ait de besoin. Cette pratique peut donc
induire de la résistance à des bactéries ne causant pas d’infection à l’instant, mais qui
pourrait en causer éventuellement9,10
. Ensuite, la mauvaise utilisation des antibiotiques par
les patients peut aussi contribuer en réalisant une sélection des bactéries résistantes10
. Par
exemple, si le patient arrête de prendre ses médicaments avant la fin de son traitement, il est
possible que la totalité des pathogènes responsables de l’infection ne soit pas éliminée. Ces
bactéries résiduelles, ayant été exposées à l’antibiotique et ayant survécu, sont plus fortes et
pourront ensuite croitre. Les prochaines générations de bactéries issues de ces individus
seront plus fortes, plus enclines à la résistance aux antibiotiques11
. Ce type de sélection est
aussi causé par la quantité massive d’antibiotiques consommée par les animaux d’élevage.
En effet, environ la moitié des antibiotiques de notre environnement proviendraient de la
viande que l’on consomme11
.
La résistance aux antibiotiques, phénomène en croissance depuis quelques années12
, est un
problème très sérieux qui fut observé dès le début des premiers antibiotiques dans les
années 19409. En effet, une bactérie devenue résistante peut causer des dommages
considérables chez le patient et force l’utilisation d’antibiotiques différents ou à plus haute
dose pour traiter l’infection. Comme on peut le voir à la figure 2, le nombre de cas
d’infections reliées à Enterococcus résistant à la vancomycine (ERV) a augmenté de façon
drastique dans les dix dernières années.
4
Figure 2 - Incidence des infections à Enterococcus résistant à la vancomycine pour 1 000
hospitalisations et pour 10 000 jours-patients12
L’ERV n’est pas la seule bactérie qui connait une telle augmentation. En effet, on voit une
augmentation du taux d’infections par des bactéries résistantes chez les Canadiens pour une
grande variété d’organismes. Par exemple, le Staphyloccocus aureus résistant à la
méthyciline (SARM), le Streptococcus pneumoniae ou encore les bactéries résistantes du
genre Salmonella. Par contre, il est à noter que le problème est connu des autorités
gouvernementales depuis plusieurs années et que plusieurs actions de préventions ont été
prises. Ces actions, pouvant s’étendre de la sensibilisation au dépistage systématique dans
les hôpitaux, commencent à avoir un effet. Au Canada, on voit une légère baisse des
infections aux bactéries résistantes pour plusieurs organismes depuis le début des années
201012
. Ces mesures, bien qu’un pas dans la bonne direction, ne suffiront cependant pas à
éradiquer ce problème majeur. Malgré les mesures prises pour ralentir ce phénomène,
certaines études estiment que, d’ici quelques années, ce problème de santé seul pourrait
coûter à chaque pays entre 3 et 10 % de leur PIB pour traiter les individus affectés13
.
Finalement, l’Organisation mondiale de la santé, l’OMS, a émis en 2014 le rapport intitulé
« ANTIMICROBIAL RESISTANCE, Global Report on Surveillance ». Dans ce rapport,
l’OMS étudie l’évolution de ce problème et en vient à la conclusion que, si des actions
drastiques ne sont pas prises bientôt par l’ensemble de la planète, nous allons tomber dans
5
une ère post-antibiotique où les infections communes et les blessures mineures seront de
nouveau mortelles14
.
1.3 - Solutions envisageables
Pour tenter de contrôler l’évolution de la résistance aux antibiotiques, il faudra prendre des
actions concrètes et immédiates. En effet, nous devons agir avant que ce problème déjà très
grave ne prenne des proportions trop importantes. Pour ce faire, nous devrons
premièrement changer nos pratiques actuelles et ensuite explorer de nouvelles méthodes de
traitement.
La première étape pour ralentir l’évolution de la résistance aux antibiotiques est de
sensibiliser la population. Cette solution est de loin la plus facile et aurait un impact
significatif. En effet, si les gens prenaient leurs antibiotiques tel que prescrits, il serait
possible d’enrayer plusieurs problèmes. Ensuite, beaucoup de médicaments sont prescrits
par les médecins simplement pour rassurer les patients. Lorsqu’un patient se présente à
l’hôpital avec des symptômes, il a souvent comme attente de sortir avec un médicament ou
un traitement quelconque, et ce, même si aucun traitement n’est nécessaire. Ceci pourrait
encourager certains médecins à prescrire des antibiotiques simplement pour rassurer leurs
patients. Dans un tel cas, le patient peut se voir soulagé même si les antibiotiques n’étaient
pas nécessaires grâce à l’effet placébo ou à l’évolution naturelle de la maladie. Pour tenter
de régler ce problème, l’Association médicale canadienne à mis au point la campagne
« Choisir avec soin » qui vise à aider les médecins et les patients à communiquer sur la
nécessité des traitements et des examens15
. Par le fait même, si l’on désire ralentir le
développement de la résistance aux antibiotiques, les médecins doivent aussi être
sensibilisés à ce problème. Les antibiotiques doivent être prescrits seulement lorsqu’ils sont
vraiment nécessaires. L’Association médicale canadienne a émis un communiqué en mars
2016 confirmant le problème de surdiagnostic au Canada16
. De plus, l’utilisation
d’antibiotiques à spectre étroit peut aussi aider au problème en réduisant le nombre de
bactéries touchées par le traitement17
. Les médecins doivent comprendre que les impacts de
leurs actions peuvent être très importants pour la lutte contre la résistance aux antibiotiques.
6
Une autre avenue à entreprendre serait de bannir l’utilisation d’antibiotiques comme facteur
de croissance dans la nourriture des animaux de ferme. Cette mesure a déjà été adoptée par
plusieurs pays d’Europe et il fut prouvé que, non seulement la prévalence des infections
aux bactéries résistantes avait diminué, mais l’effet sur la croissance des animaux était
insignifiante18
. Cette mesure devrait donc être imposée partout sur la planète si nous
voulons ralentir le développement de la résistance, mais l’aspect économique de telles
décisions ralentit probablement son implantation.
Ensuite, il faudrait étudier les alternatives au traitement à l’aide d’antibiotiques. En effet,
avant que les antibiotiques ne soient découverts, certaines maladies infectieuses étaient
traitées à l’aide de bactériophages. Cette technique est appelé la phagothérapie19
. Les
bactériophages sont des virus n’infectant que les bactéries et leur utilisation en médecine
fut plus ou moins oubliée dans les années 1940, moment où les premiers antibiotiques
prirent le relai. Cette technique, loin d’être parfaite, présentait plusieurs inconvénients.
Mais le développement du génie génétique et de la médecine permettrait certainement le
design de nouveaux phages plus facile à utiliser et ayant une activité accrue20
. Par contre,
de telles études demandent un investissement considérable, ce qui ralentit son
développement par les compagnies pharmaceutiques.
Finalement, la dernière stratégie à explorer est le développement de nouveaux antibiotiques
contre lesquels les bactéries ne sont pas résistantes. Pour obtenir de nouveaux antibiotiques,
plusieurs approches peuvent être envisagées. En effet, l’approche à court terme consiste à
modifier légèrement un antibiotique connu. Une telle modification peut être suffisante pour
que le mécanisme de résistance de la bactérie cible ne reconnaisse plus l’antibiotique, ce
qui vient régénérer l’activité de l’antibiotique. Cette méthode est peu coûteuse et demande
peu de développement pour les compagnies pharmaceutiques21
. Par contre, la résistance
réapparaitra très rapidement après que ce nouvel antibiotique soit mis sur les tablettes,
puisque le changement que devra faire la bactérie pour s’adapter est souvent minime4. Bien
que cette technique soit efficace à très court terme, le problème ne sera jamais réglé de cette
façon. La stratégie la plus durable serait de développer plusieurs nouvelles classes
d’antibiotiques. Par contre, le développement de tels médicaments demande un
investissement de temps et d’argent considérable et les résultats au terme du projet ne sont
7
jamais garantis22
. Un nouveau candidat avec une activité prometteuse peut s’avérer avoir
des effets secondaires majeurs empêchant l’utilisation chez l’humain. De plus, lorsqu’un
nouvel antibiotique apparait sur le marché, les médecins ont tendance à le garder comme
dernier recours pour le traitement d’infections par des bactéries résistantes. Cette technique,
bien que très importante et pertinente pour le contrôle de la résistance, diminue les profits
des compagnies pharmaceutiques, ce qui ne les motive pas à investir dans les
antibiotiques3. Les antibiotiques ne sont pas non plus le marché le plus rentable. Comme
ces molécules guérissent l’infection, leur utilisation est souvent restreinte à quelques jours,
ce qui n’est pas très rentable pour les compagnies pharmaceutiques si on les compare aux
médicaments contre les maladies chroniques où un patient consommera le médicament
pour une très longue durée3,23
. Pour ces raisons, les compagnies pharmaceutiques en
général ne vont pas dans cette direction. Par contre, la mise en marché de nouvelles classes
d’antibiotiques serait une méthode efficace pour contrer les bactéries multirésistantes.
L’espoir pour le développement de telles classes de médicament retombe en ce moment sur
le milieu académique et sur les petites compagnies en biotechnologie. En effet, beaucoup
de recherche est faite dans ces milieux pour tenter de trouver de nouveaux antibiotiques21
.
Lorsque la viabilité d’une nouvelle molécule sera prouvée par le milieu académique, les
compagnies pharmaceutiques pourront optimiser la molécule, compléter les nombreux tests
nécessaires et mettre le nouveau médicament sur le marché. Ce procédé est très complexe
et coûteux, mais lorsque la preuve de concept est réalisée par l’académique, ceci décuple
les chances que la molécule se retrouve sur le marché. Un exemple de classe
d’antibiotiques présentement très étudiée est les peptides antimicrobiens.
1.4 - Peptides antimicrobiens
Les peptides antimicrobiens sont de courts segments protéiques retrouvés dans
virtuellement tout les organismes, responsables de la protection contre les bactéries24
.
L’humain aussi possède plusieurs peptides antimicrobiens, comme par exemple, l’histatine
que l’on retrouve dans la salive humaine25
. Ces peptides d’une longueur d’environ 20 à 40
acides aminés sont souvent sélectifs envers les bactéries, mais ont un spectre d’action plutôt
large25
. Ces molécules seraient des candidats très intéressants pour le développement
d’antibiotiques, car ils ont un mode d’action tout à fait unique. En effet, ces peptides
8
attaquent directement la membrane de la cellule, permettant ainsi un échange d’ions entre le
milieu intracellulaire et extracellulaire amenant la cellule à l’apoptose. Ce mécanisme
d’action est très intéressant puisque, en ayant une cible n’étant pas composée d’une seule
molécule, il serait plus difficile pour la cellule victime de l’agression de développer de la
résistance26
.
1.4.1 - Classification
Il est possible de classifier les peptides antimicrobiens de plusieurs façons, mais en 1999
Richard M. Epand et Hans J. Vogel proposèrent de classifier les peptides antimicrobiens en
fonction de leur structure. Cette méthode sépare les peptides antimicrobiens en six
catégories : les peptides amphiphiles en hélice alpha, les peptides en feuillet bêta, les
peptides ayant une composition en acide aminé inhabituelle, les peptides ayant des anneaux
thioéther, les peptaïbols et les peptides macrocycliques ayant des nœuds disulfures27
. La
classe des peptides amphiphiles en hélice alpha contient la majorité des peptides
antimicrobiens étudiés à ce jour. Ces peptides sont souvent chargés positivement et, comme
le titre de la classe le suggère, ils forment des hélices alpha amphiphiles28
. Cette classe
contient plusieurs peptides connus comme la gramicidine A et la magainine. Les peptides
en feuillets bêta ont une forte proportion de feuillet bêta et ont souvent tendance à adopter
des structures cycliques liées par le squelette ou par des ponts disulfures27
. La gramicidine
S et la polymixine B sont deux exemples bien connus de cette catégorie. Les peptides ayant
une composition en acide aminé inhabituelle ont une forte tendance à contenir plusieurs
répétitions d’un acide aminé que l’on ne retrouve normalement pas si souvent dans un
peptide, comme la proline, l’histidine ou le tryptophane 29
. Cette catégorie contient entre
autre l’histatine, un peptique que l’on retrouve dans la salive des mammifères. Les peptides
ayant des anneaux thioéther, aussi appelé « lantibiotiques », sont des peptides contenant les
acides aminés non-protéinogène lanthionine (molécule 1) et β-méthyllanthionine30
. Ces
acides aminés viennent se cycliser pour former un anneau thioéther.
9
1
Cette catégorie inclut la nisine, un peptide utilisé comme agent de conservation. Les
peptaïbols sont des peptides ayant souvent une conformation rigide en hélice alpha ou en
hélice 310, contenant l’acide aminé acide α-amino-isobutyrique (molécule 2)31
.
2
Finalement, les peptides macrocycliques ayant des nœuds disulfures sont des peptides dans
lesquels on retrouve le motif du nœud disulfure. Un nœud disulfure est un entrelacement de
plusieurs ponts disulfures qui forment un rotaxane, un anneau, autour d’un pont disulfure32
.
1.4.2 - Peptides amphiphiles en hélice alpha
Nous regarderons maintenant plus en profondeur les peptides amphiphiles en hélices alpha,
puisqu’ils sont les plus nombreux et les plus connus. Cette classe contient près de la moitié
des peptides antimicrobiens et la majorité de ceux-ci possède une charge globale entre +1 et
+6. Comme mentionné plus haut, les peptides de cette catégorie ont une longueur standard
pour des peptides antimicrobiens, soit entre 20 et 50 acides aminées de long33
. Plusieurs
peptides ont leur extrémité C-terminale protégée par un amide. Cette simple protection
vient remplir plusieurs fonctions; en plus d’augmenter la charge globale du peptide en
masquant la charge négative du C-terminal, on vient aussi protéger le peptide de l’action
des carboxypeptidases, des enzymes utilisant le C-terminal libre pour débuter l’hydrolyse
du peptide34
. Les peptides antimicrobiens amphiphiles en hélices alpha sont composés
environ d’une moitié d’acides aminés non-polaires et d’une moitié d’acides aminés polaires
organisés de façon à obtenir une face hydrophobe et une face hydrophile chargée
positivement33
. Cette caractéristique, que l’on désigne comme le caractère amphiphile d’un
peptide, aide le peptide dans ses interactions avec les membranes procaryotes qui sont
chargées globalement négativement.
10
1.4.3 - Mécanisme d’action
Le mécanisme exact par lequel les peptides antimicrobiens réussissent à tuer la cellule n’est
pas entièrement connu, mais plusieurs hypothèses ont été soulevées au cours des années. En
effet, il semble que tous les peptides antimicrobiens n’agissent pas de la même façon, bien
qu’ils tentent tous d’induire des pores dans la membrane des cellules bactériennes35
. Quatre
mécanismes principaux sont discutés aujourd’hui, soit la formation de pores toroïdaux, la
formation de « barrel-staves », le « sinking-raft » et le « carpet-like ». La figure 3 présente
ces différents mécanismes de façon schématisée.
Figure 3 – Différents mécanismes de formation de pores des peptides antimicrobiens,
adaptation de l’article de Brogden36
.
La formation d’un pore toroïdal par un peptide antimicrobien requiert premièrement que les
peptides se déposent parallèlement à la membrane, la face hydrophobe intercalée entre les
têtes polaires des lipides, dans l’environnement hydrophobe de la membrane. Lorsque la
concentration en peptides à un certain point de la membrane est assez élevée, les peptides
vont venir progressivement induire une courbure dans les lipides jusqu’à en former un pore.
Ce type de pore est particulier, puisque les lipides de la membrane font partie prenante du
pore en ayant des têtes polaires intercalées entre les peptides, induisant la courbure de la
Barrel-stave Pore toroïdal
Sinking-raft
Formation de poresCarpet-like
Micelles
11
membrane37
. Pour le modèle de la formation de « barrel-staves », la formation de pores
débute comme le modèle précédent, soit avec les peptides s’adsorbant à la membrane. Par
la suite, les peptides formeront des agrégats qui viendront ensuite s’insérer dans la
membrane pour former un tunnel transmembranaire. Dans ce mécanisme, les régions
hydrophobes du peptide se retrouvent à l’extérieur, en contact avec les chaines lipidiques.
Les régions hydrophiles se retrouvent à l’intérieur du tonneau, en contact avec l’eau38
. Tout
comme les deux autres mécanismes, le « sinking-raft » débute avec une accumulation de
peptides parallèlement à la surface de la membrane. Pour la suite, ce mécanisme est très
différent. Dans le « sinking-raft » les peptides resteront toujours parallèles à la membrane.
Le pore est formé lorsque le peptide change de face de membrane. Ce pore temporaire sera
induit grâce à la courbure de la membrane qu’induira le peptide pour « couler » dans la
membrane39
. Le dernier est le mécanisme de formation de pores « carpet-like ». Ce dernier
requiert une concentration très grande de peptides qui resteront tous parallèles à la
membrane. Les peptides vont ici faire un tapis de molécules qui va couvrir toute la
membrane, la solubilisant ainsi en formant des micelles. Tout comme les autres
mécanismes, cette technique requiert un peptide ayant une certaine amphiphilicité40
.
1.4.4 - Potentiel comme médicament
Comme expliqué plus haut, les peptides antimicrobiens sont d’excellents candidats pour le
développement de nouveaux antibiotiques. Ce sont des molécules naturelles très actives
contre lesquelles les bactéries ont peu de mécanismes de défense. Par contre, plusieurs
obstacles importants empêchent leur utilisation immédiate comme médicament.
Premièrement, la toxicité envers l’hôte de certains peptides empêche leur utilisation41
. En
effet, leur activité hémolytique, pouvant être assez importante, limite les utilisations
possibles de telles molécules. Comme ils lysent les globules rouges, les peptides ayant une
activité hémolytique sont restreints à des utilisations topiques, où ils ne peuvent pas faire de
dommages à l’organisme42
, ce qui n’est pas très optimal pour un antibiotique.
Deuxièmement, la synthèse et la purification de telles molécules peuvent être
problématiques. En effet, la synthèse sur support solide est une méthode standard pour la
production de peptides, mais elle peut être très coûteuse pour la production à grande
échelle43
. Ensuite, le peptide préparé par cette méthode nécessitera une purification pour
12
être utilisé comme antibiotique et celle-ci peut s’avérer extrêmement coûteuse
dépendamment du peptide à purifier. La solution à ce problème serait l’utilisation de la
biofermentation et des technologies de l’ADN recombinant pour générer les peptides
d’intérêt par biosynthèse44
. Cette technique a par contre le problème que, par définition, les
molécules synthétisées tueront les bactéries les synthétisant, apportant des problèmes de
rendement et de rentabilité. Troisièmement, les peptides antimicrobiens, étant des protéines,
tendent à être digérés lorsqu’utilisés de façon orale45
. Pour contourner ce problème, on peut
soit modifier la molécule en espérant la rendre invisible aux protéases, tout en gardant son
activité, soit l’utiliser de façon topique, où elle sera beaucoup moins exposée aux
protéases. Cette problématique complique grandement le développement de peptides
antimicrobiens et limite leur utilisation. Finalement, l’utilisation à long terme des peptides
antimicrobiens d’origine autre qu’humaine pourrait causer des allergies26
. Cette conclusion
fut tirée de l’étude des conséquences de l’utilisation de la polymixine B, un peptide
antimicrobien déjà sur le marché46
. Une option pour contrer ce problème serait de stimuler
notre production naturelle de peptides antimicrobiens plutôt que d’en injecter de nouveaux.
De cette façon, les peptides n’induiraient pas de réaction de l’organisme.
1.4.5 - Peptides sur le marché
L’étude des peptides antimicrobiens ne date pas d’hier. Pourtant, très peu de candidats se
rendent jusqu’aux études cliniques et encore moins se rendent sur les tablettes. En effet,
seulement une douzaine de peptides antimicrobiens sont actuellement dans le long
processus des études cliniques47
. Plusieurs centaines de peptides ont tentés de se rendre sur
le marché, mais ont été interrompus pour une raison ou une autre42
. On compte seulement
une poignée de peptides antimicrobiens sur les tablettes en 2016. Parmi ceux-ci, les plus
connus sont la nisine, qui est utilisée comme agent de conservation, la Gramicidine A,
utilisée pour traiter les infections topiques aux bactéries à Gram positif, la Gramicidine S,
utilisée topiquement pour le traitement de blessures et la polymyxine B, l’ingrédient
principal du Polysporin®. Plus récemment, la Food and Drug Administration, a approuvé un
nouveau peptide antimicrobien, la daptomycine, un peptide cyclique capable de tuer les
bactéries à Gram positif33
. Les structures de ces peptides sont présentées à la figure 4.
13
Figure 4 – Structure des différents peptides antimicrobiens disponibles sur le marché.
1.4.6 - Peptides antimicrobiens synthétiques
Bien que les peptides antimicrobiens aient un bon potentiel pour l’utilisation comme
antibiotiques, plusieurs inconvénients discutés plus tôt limitent leur utilisation. C’est
pourquoi plusieurs groupes de recherche partout autour du globe48
se concentrent sur le
développement de peptides synthétiques. Ces peptides sont construits pour imiter les
peptides antimicrobiens tout en évitant leurs problèmes, comme la toxicité ou la
susceptibilité aux protéases. Deux approches générales sont utilisées. Premièrement,
plusieurs vont modifier les peptides naturels pour tenter d’améliorer leur activité et atténuer
leurs problèmes49,50
. Cette approche est limitée par nos connaissances incomplètes des
déterminants de l’activité et de la sélectivité de telles molécules. Par conséquent, il peut être
difficile de faire un design rationnel du nouveau peptide. L’autre méthode consiste à créer
un nouveau peptide à partir de zéro en tentant d’imiter une caractéristique des peptides
antimicrobiens comme la structure, la charge ou la composition en acide aminé. Cette
méthode « carte blanche » peut prendre beaucoup plus de temps pour obtenir un peptide
efficace, mais on peut obtenir ainsi de nouvelles molécules pouvant avoir des
caractéristiques tout à fait uniques51
.
14
Chapitre 2 - Projet
2.1 - Antécédents au laboratoire
Le présent projet tire son origine des résultats obtenus dans des études précédentes visant à
faire le design et la synthèse d’un canal ionique artificiel. Pour remplir cet objectif, un
peptide de 21 acides aminés contenant 15 leucines et 6 phénylalanines, sur lesquelles ont
été greffés des éthers-couronnes, a été synthétisé52
. Nous l’appellerons 21-mère tout au long
de ce mémoire.
Figure 5 – Représentation schématique du 21-mère en hélice alpha 52
Les éthers-couronnes ont été savamment placés pour s’aligner lorsque le peptide est replié
en hélice alpha (figure 5). De cette façon, les éthers-couronnes peuvent créer un canal
permettant le passage des ions. La longueur de 21 acides aminés a aussi été calculée pour
obtenir un peptide capable de traverser la membrane à lui seul. La leucine a été choisie
comme acide aminé non-polaire puisque le peptide constitué majoritairement de leucines
devrait être assez hydrophobe pour s’incorporer aux membranes. De plus, la leucine est
connue pour favoriser la conformation en hélice alpha53
. Ensuite, les éthers-couronnes,
connus pour leur capacité à complexer certains ions54
, ont été choisis, car il serait
théoriquement facile de moduler la sélectivité du canal simplement en changeant la taille de
l’éther-couronne.
Pour faire un bon canal ionique, le 21-mère doit laisser les membranes intactes. La capacité
à perturber les membranes a donc été testée à l’aide du test de relargage de la calcéine qui
sera expliqué en détails plus tard dans ce mémoire. Les précurseurs de synthèse ont aussi
15
été testés, soit l’analogue à 7 acides aminés, le 7-mère, et l’analogue à 14 acides aminés, le
14-mère.
Figure 6 – Relargage de la calcéine des analogues du 21-mère dans des vésicules de
EYPC55
.
Comme démontré dans la figure 6, seul le 14-mère perturbe les membranes. C’est à la suite
de ces résultats que le 14-mère, dont la structure est présentée à la figure 7, a été considéré
comme modèle pour étudier les peptides antimicrobiens.
Figure 7 – Structure du 14-mère
Bien que ce peptide n’ait aucune activité antimicrobienne56
, sa capacité à perturber les
membranes en fait un candidat intéressant. En effet, il semble que ce peptide agisse comme
les peptides antimicrobiens et il comporte plusieurs caractéristiques communes avec ceux-
ci. Étant amphiphile et en hélice alpha, il ne manquerait que la charge globale positive pour
16
ressembler à un peptide antimicrobien. Une série de modifications débuta alors pour tenter
d’identifier les caractéristiques responsables de l’activité des peptides antimicrobiens en
utilisant comme modèle le 14-mère, un peptide facile à modifier et à synthétiser. Comme
les résultats des modifications suivantes ont déjà été décrits dans d’autres comptes
rendus56,57,58
, ils ne seront pas présentés en détails. L’effet de la modification de la taille
du peptide et de la modification de la taille des éthers-couronnes a été observé sans voir
d’améliorations majeures sur l’activité antimicrobienne, bien que les plus grands éthers-
couronnes semblent augmenter légèrement l’efficacité des peptides. Par la suite, une série
de modifications visant à augmenter la charge globale du peptide a été réalisée. Dans le but
de comprendre l’effet de nos modifications, une approche systématique des changements a
été adoptée. Tout d’abord, une leucine a été remplacée par les trois acides aminés positifs
(lysine, histidine et arginine). Toutes les mono-substitutions possibles ont été réalisées,
donnant un total de 30 peptides différents. Ensuite, les di-substitutions ont été réalisées de
la même façon, donnant 135 peptides. La totalité de ces peptides a été aussi synthétisée
avec l’extrémité N-terminale acétylée, pour voir l’effet de la protection du N-terminal.
L’ensemble de ces peptides a ensuite été testé et plusieurs conclusions ont été tirées de ces
résultats. Premièrement, il semblerait que les peptides comprenant l’arginine soient plus
actifs que ceux comprenant la lysine, qui sont eux-mêmes plus actifs que les peptides
comprenant l’histidine. Ensuite, il est évident que la position des charges est très importante
et il semblerait que des charges aux positions 5 et 10 génèrent des peptides ayant une forte
activité, mais une faible sélectivité, en attaquant autant les membranes bactériennes
qu’humaines. Par contre, les peptides ayant des charges aux positions 4 et 11 seraient très
sélectifs, bien que moins actifs. Finalement, les peptides ayant l’extrémité N-terminale
protégée seraient moins antimicrobiens, mais plus hémolytiques.
Par la suite, la synthèse des analogues tri-substitués débuta en n’utilisant que l’arginine, qui
présentait de meilleurs résultats, et ce, toujours en synthétisant les analogues non-protégés
et protégés au N-terminal. L’accent a été tout particulièrement mis sur les séries de peptides
ayant deux arginines fixes aux positions 4 et 11 (surnommés R4R11), puis 5 et 10
(surnommés R5R10), comme ces positions semblaient être particulièrement intéressantes.
Ce mémoire présente la synthèse et la caractérisation de ces peptides.
17
2.2 - Objectifs du projet
Les objectifs du projet présenté dans ce mémoire sont d’étudier les déterminants de
l’activité et de la sélectivité des peptides antimicrobiens. Par « activité », on parle ici du
potentiel des peptides à tuer les cellules. La « sélectivité » correspond à la différence entre
l’activité contre les cellules bactériennes et l’activité contre les cellules humaines. De plus,
un autre objectif est d’étudier la relation structure-activité d’un peptide antimicrobien à
l’aide d’un peptide modèle, le 14-mère. De façon plus spécifique, plusieurs objectifs
peuvent être décrits :
Terminer la synthèse des 240 analogues tri-substitués.
Déterminer l’activité hémolytique des tri-substitués.
Déterminer l’activité antimicrobienne des tri-substitués.
Déterminer la capacité de relargage de la calcéine des analogues des séries R4R11
et R5R10.
Déterminer la structure tridimensionnelle des analogues des séries R4R11 et
R5R10.
Déterminer l’effet de la protection du C et du N-terminal.
18
Chapitre 3 - Synthèse et caractérisation
3.1 - Synthèse de l’acide aminé éther-couronne
L’acide aminé éther-couronne, n’étant pas un acide aminé commercial, est synthétisé au
laboratoire59
. Pour réaliser cette synthèse, nous débutons avec la L-DOPA, un acide aminé
commercial, mais non-naturel et l’hexaéthylène glycol. L’idée derrière cette synthèse est de
cycliser l’hexaéthylène glycol, qui sera bromé, sur la L-DOPA en réalisant une double SN2
(figure 8).
Figure 8 – Rétrosynthèse de l’acide aminé éther-couronne
Le premier composé nécessaire est le dibromure d’hexaéthylène glycol. Celui-ci est formé
en bromant l’hexaéthylène glycol, les conditions utilisées sont présentées à la figure 9. La
triphénylphosphine se lie à un atome de brome, permettant de générer un premier bromure.
Ensuite, l’atome de brome sur le phosphore est remplacé par l’oxygène de l’alcool de
l’hexaéthylène glycol, générant un deuxième bromure. Celui-ci vient se substituer à
l’oxygène sur la phosphine, devenu un excellent groupe partant puisqu’elle se transforme
en oxyde de triphénylphosphine. Ce procédé sera répété pour le deuxième alcool de
l’hexaéthylène glycol.
Figure 9 – Préparation du dibromure d’hexaéthylène glycol
Par la suite, la L-DOPA, qui est commerciale, doit être protégée pour éviter les réactions
secondaires durant la macrocyclisation. Les deux protections sont illustrées à la figure 10.
L’acide est tout d’abord protégé en ester méthylique à l’aide du chlorure de thionyle dans le
19
méthanol. Ensuite, la fonction amine est protégée en utilisant le Boc2O pour former le tert-
butoxycarbamate (Boc). Au terme de ces deux étapes, l’acide aminé doublement protégé est
prêt pour la macrocyclisation.
Figure 10 – Protection de la L-DOPA
La macrocyclisation est ensuite réalisée dans le DMF (figure 11). Cette réaction de type
SN2 est facilitée par la base choisie soit le carbonate de césium. L’ion césium en solution
facilite la fermeture du cycle en se complexant avec l’éther couronne en formation.
Figure 11 - Macrocyclisation de l’éther couronne
Au terme de cette étape de macrocyclisation, l’acide aminé éther-couronne est obtenu, mais
protégé par un méthyle sur l’acide et par un Boc sur l’amine. Pour pouvoir l’utiliser dans la
synthèse peptidique sur support solide, l’acide devra être libre et l’amine devra être
protégée par un groupement 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc). Le procédé pour
arriver à ce but est décrit à la figure 12. En effet, la première étape est de retrouver l’acide
en réalisant une saponification dans le méthanol en milieu basique. Ensuite, le Boc est clivé
à l’aide de l’acide trifluoroacétique. Après cette étape, la phénylalanine éther-couronne se
retrouve non-protégée. Il ne reste seulement qu’à protéger l’amine par un groupement
Fmoc à l’aide du réactif Fmoc-O-Su pour pouvoir l’utiliser dans la synthèse peptidique.
20
Figure 12 – Préparation de la phénylalanine éther-couronne pour la synthèse peptidique
Au laboratoire Voyer, cette synthèse est réalisée sur plusieurs grammes étant donné la
quantité d’acide aminé consommée par les nombreux couplages de synthèse peptidique.
3.2 - Synthèse peptidique sur support solide
La synthèse peptidique sur support solide est une technique de synthèse de peptides très
facile et rapide. Cette technique révolutionnaire découverte en 196360
consiste à ajouter
séquentiellement des acides aminés ayant leur amine protégé à une résine. La synthèse se
fait du C-terminal au N-terminal. Le peptide étant lié de façon covalente à une résine, il est
possible de retirer les différentes solutions nécessaires à la synthèse par simple filtration. La
protection de l’acide aminé permet de contrôler la séquence du peptide en empêchant la
double addition d’un même acide aminé. En effet, il est nécessaire de déprotéger l’acide
aminé installé sur la résine avant d’ajouter le prochain. Cette technique a beaucoup
d’avantages et permet de créer rapidement de courts peptides synthétiques, mais elle a aussi
des inconvénients. Cette méthode peut rapidement devenir fastidieuse si le peptide à
synthétiser est trop long et le coût peut rapidement devenir élevé lorsqu’on rallonge le
peptide. En effet, au delà de 100 acides aminés on doit avoir recours à la condensation de
21
fragments, une technique où des fragments synthétisés par synthèse peptidique sur support
solide sont liés par des enzymes ou chimiquement, pour synthétiser des peptides d’une
telle longueur61
. Pour cette raison, cette technique n’est pas privilégié pour la production
industrielle de peptides, la biofermentation reste avantageuse pour la production en
masse44
.
Il existe plusieurs types de résines qui ont toutes des caractéristiques différentes. Certaines
résines utilisent la stratégie « Boc » qui consiste à protéger l’amine par un groupement Boc
qui est clivé à l’aide de TFA, tandis que le peptide est clivé à l’aide de HF. D’autres
utilisent la stratégie « Fmoc » selon laquelle l’amine est protégée par un groupement Fmoc,
labile en milieu basique, et le peptide est clivé en milieu acide. La résine utilisée pour la
synthèse des peptides antimicrobiens est la résine de Wang. Il s’agit d’une résine utilisant la
stratégie Fmoc et laissant l’extrémité C-terminale libre suite au clivage du peptide62
. Cette
résine a été choisie puisque le clivage final du peptide en milieu acide permet aussi de
déprotéger les chaînes latérales des arginines, protégées par des groupements Pbf.
Le couplage du premier acide aminé est souvent plus difficile. En effet, pour greffer le
premier acide aminé sur la résine plusieurs agents de couplages sont utilisés (figure 13). Le
DIC (diisopropylcarbodiimide), DMAP (4-diméthylaminopyridine) et 6Cl-HOBt (1-
hydroxy-6-chloro-benzotriazole) sont utilisés pour activer l’acide dans un milieu basique,
ce qui permet à l’estérification de se réaliser. Le rendement de cette réaction n’est pas de
100%, ce qui laisse nécessairement des sites non-substitués sur la résine. Ceux-ci doivent
être protégés avant de continuer l’élongation du peptide afin d’éviter les réactions
secondaires. L’anhydride acétique est utilisé pour acétyler ces sites non-utilisés.
Figure 13 – Couplage du premier acide aminé sur la résine de Wang
Suite au premier couplage, le taux de substitution, c'est-à-dire la charge de la résine, aura
changé par rapport à la valeur donnée par le fournisseur si le rendement du premier
couplage n’était pas de 100% et il est nécessaire de le redéterminer pour connaitre la
22
quantité de réactifs à utiliser pour les étapes suivantes. Ceci est réalisé en dosant par UV le
dibenzofulvène résultant de la déprotection du groupement protecteur Fmoc par le DBU
(1,8-Diazabicyclo[5,4,0]undéc-7-ène).
Lorsque le nouveau taux de substitution est déterminé, il est possible de poursuivre la
synthèse avec la déprotection du premier acide aminé. La déprotection se fait en milieu
basique à l’aide de la pipéridine (figure 14).
Figure 14 – Déprotection de l’acide aminé
Par la suite, le deuxième acide aminé est ajouté à l’aide d’agents de couplage standards, soit
le 6Cl-HOBt et le HCTU en présence de NMM (N-méthylmorpholine), une base, comme
on peut le voir à la figure 15.
Figure 15 – Élongation du peptide
Pour s’assurer que la réaction a été complétée, le test qualitatif de Kaiser63
est réalisé. Ce
test est utilisé pour détecter les amines primaires libres. La ninhydrine réagit avec les
amines primaires créant ainsi une intense coloration bleue. Donc, le test est réalisé sur une
infime partie de la résine et si une coloration bleue apparait, c’est signe qu’une portion de la
résine n’a pas été couplée et le précédent couplage doit être repris. Lorsque le test est
négatif, le peptide est allongé en répétant une séquence de déprotection, d’élongation et de
test de Kaiser.
Lorsque l’élongation du peptide est complétée, le peptide est encore lié à la résine par le C-
terminal ayant son N-terminal libre. Il est donc très facile à cette étape de modifier
l’extrémité N-terminale. Les modifications qui ont été réalisées dans ce mémoire sont des
23
acétylations du N-terminal à l’aide de l’anhydride acétique dans des conditions similaires à
l’acétylation de la résine au début de la synthèse.
Finalement, la dernière étape consiste à libérer le peptide de la résine en utilisant le TFA
(acide trifluoroacétique) (figure 16). Les arginines qui ont été installées sur le peptide sont
aussi déprotégées par le TFA. Par contre, il faut compter plus de temps pour réaliser cette
déprotection et le réactif TIS (triisopropylsilane) est nécessaire pour capter les carbocations
générés lors de la déprotection du guanidium.
Figure 16 – Clivage du peptide de la résine
Le peptide obtenu est alors trituré à l’éther pour le purifier, puis solubilisé et lyophilisé dans
l’acide acétique afin d’obtenir une poudre facile à manipuler.
Par contre, certains peptides n’ont pas été synthétisés sur la résine de Wang. En effet, nous
voulions avoir une série de peptides protégés en C-terminal et ce type de modifications
n’est pas possible en synthèse sur support solide avec la résine de Wang. Nous nous
sommes donc tournés vers une autre résine, soit la résine Rink amide. Cette résine s’utilise
dans les mêmes conditions que la résine de Wang, soit la déprotection avec la pipéridine et
le clivage du peptide au TFA62
. Par contre, le groupement liant le peptide à la résine est
différent, ce qui signifie que le mécanisme de clivage est légèrement différent et va laisser
l’extrémité C-terminale du peptide protégée en amide.
3.3 - Purification et caractérisation
Suite à la synthèse, tous les peptides ont été caractérisés par HPLC pour déterminer leur
pureté et par spectroscopie de masse pour confirmer la masse du peptide. Par contre, ces
techniques ne permettent pas de confirmer la séquence des peptides. Un appareil
LC/MS/MS est nécessaire pour obtenir cette information, malheureusement nous n’en
avons pas à notre disposition. Par contre, étant donné que les acides aminés sont ajoutés
l’un à la suite de l’autre lors de la synthèse peptidique, la séquence ne devrait pas être
24
[M+4H]4+
[M+NH4+4H]5+
[M+3H]3+
R3R12R14
différente de celle déterminée par l’expérimentateur. La masse obtenue par MS confirme
que le peptide est complet et il serait surprenant que l’ordre ait changé. L’appareil HPLC
utilisé est un chromatographe liquide 1260 Infinity d’Agilent Technologies et il a été utilisé
avec la colonne à phase inverse C18 Vydac 218TP54. L’appareil de spectroscopie de masse
utilisé est un MS Time-of-flight 6210 d’Agilent Technologies en paire avec un appareil LC
1200 series du même fournisseur.
La figure 17 présente un exemple de chromatogrammes obtenus grâce à ces deux
techniques.
Figure 17 – Exemple de chromatogrammes MS et HPLC pour le peptide R3R12R14
Dans le cas où la pureté déterminée par HPLC ne serait pas suffisante, ces peptides ont été
purifiés par HPLC semi-préparative. Cette technique permet d’injecter de plus grande
quantité de peptides dans l’appareil et de récolter l’éluant contenant notre échantillon en
temps réel. De cette façon, seul le pic correspondant à notre peptide est récolté et récupéré.
3.4 - Étude fluorimétrique du relargage de la calcéine
Le test de relargage de la calcéine est un test permettant d’observer l’effet d’un peptide sur
une membrane modèle. La calcéine est un fluorophore trop volumineux pour traverser les
membranes par lui-même. De plus, la calcéine ne fluoresce qu’à faible concentration, à
haute concentration ce fluorophore s’autoéteint. L’idée du test est donc d’encapsuler la
calcéine dans une vésicule de lipides modèles. À ce moment, aucune fluorescence n’est
détectable. Puis, lors de l’ajout du peptide, on détectera l’apparition de la fluorescence au
fur et à mesure que celui-ci fait des pores dans les membranes et permet à la calcéine de
25
quitter les vésicules. Pour pouvoir calculer un 100% de relargage de calcéine on ajoute, à la
fin de l’expérience, un détergent qui viendra complètement lyser les vésicules nous donnant
le 100% de fluorescence. Un exemple de spectre de fluorescence est présenté à la figure 18.
L’appareil utilisé est un spectromètre de fluorescence Varian Cary Eclipse, produit
d’Agilent Technologies.
Figure 18 – Exemple de graphique de fluorescence obtenu pour le peptide R1R4R11 dans
des vésicules de POPG
Les lipides modèles utilisés pour ce test, mais aussi pour les expériences de dichroïsme
circulaire et d’infrarouge, sont POPG et POPC (figure 19). Tout d’abord, les têtes polaires
PC et PG ont été choisies pour leur charge. PC est globalement zwitterionique et est utilisé
pour mimer les membranes des eucaryotes, qui sont aussi zwitterioniques. PG est chargé
négativement et est utilisé pour mimer les membranes des procaryotes. Les deux lipides
sont similaires en ce qui concerne leurs acides gras. Ils possèdent deux types d’acides gras,
soit une chaîne oléyl (18 : 1) et une chaîne palmitoyl (16 : 0). Ceux-ci ont été choisis pour
tenter d’imiter le plus possible les membranes biologiques. Leur longueur est idéale et
l’insaturation donne une certaine fluidité à notre système.
Figure 19 – Structure de POPC et POPG respectivement
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400 500 600
Re
larg
age
(%)
Temps (s)
Pourcentage de relargage de la calcéine en fonction
du temps
Ajout de peptide
Ajout de détergent
26
3.5 - Détermination de la structure secondaire par dichroïsme circulaire et dichroïsme
circulaire orienté
Le dichroïsme circulaire est une technique spectroscopique couramment utilisée pour la
détermination de structure de protéines. Cette technique détecte la différence d’absorption
de la lumière polarisée circulairement à gauche et à droite par une molécule chirale (figure
20)64
. Les différentes structures secondaires d’une protéine absorbent différemment cette
lumière incidente et un patron d’absorption caractéristique est détecté. En effet, les hélices
alpha ont typiquement deux minimums à 208 et 222 nm, les feuillets beta ont un minimum
à 215 nm et un maximum autour de 195 nm et les structures désordonnées ont un maximum
à 215 nm et un minimum à 195 nm. L’appareil utilisé pour ces analyses est le Jasco J-815
de Jasco Analytical Instrument. Cette technique a l’avantage de permettre d’étudier des
protéines en solution à de faibles concentrations. Pour étudier la structure secondaire des
peptides à l’intérieur de membranes, des vésicules de POPG et POPC incorporant les
peptides ont été utilisées. Par contre, il est important de noter que l’insaturation des lipides
peut compliquer l’expérience puisqu’elle absorbe dans l’étendue de longueurs d’onde
étudiées. En effet, dépendamment du nombre d’insaturation, les lipides absorbent à 240 nm
et plus65
.
Figure 20 – Schéma du fonctionnement du dichroïsme circulaire
Le dichroïsme circulaire orienté est une variante du dichroïsme circulaire utilisant des
échantillons uniformément orientés. Cette technique permet d’étudier l’orientation de
peptides en hélice alpha dans une membrane lipidique. La logique derrière cette technique
est que si les échantillons sont tous orientés, l’orientation des différents dipôles présents
dans une hélice sera alors synonyme de l’orientation de l’hélice dans la membrane et ces
dipôles absorbent différemment la lumière polarisée circulairement (figure 21).
27
Concrètement, la bande à 208 nm diminuera jusqu’à disparaitre plus l’échantillon est inséré
dans la membrane. En effet, lorsque le peptide est à la surface, le dipôle π-π* est parallèle à
la membrane et interagira fortement avec la lumière incidente, ce qui va permettre
d’observer une forte bande à 208 nm. Par contre, lorsque le peptide est inséré, ce même
dipôle se retrouve parallèle à la lumière polarisée et n’interagira pas avec celle-ci, ce qui
résultera en la disparition de la bande à 208 nm66
. Cette technique demande plus d’intensité
de signal et comme nous utilisons des lipides insaturés, un appareil standard est incapable
de réaliser ce type d’expérience. Donc, nous avons travaillé en collaboration avec les
chercheurs du Karlsruhe Institute of Technology, en Allemagne, qui ont à leur disposition
un appareil de dichroïsme circulaire orienté à radiation synchrotron. Comme la radiation
d’un tel appareil est plus intense et plus stable, il a été possible de réaliser ces expériences
avec nos peptides.
Figure 21 – Schéma du fonctionnement du dichroïsme circulaire orienté
3.6 - Détermination de la structure secondaire par spectroscopie infrarouge
L’infrarouge à Transformée de Fourier ou FTIR est une autre technique permettant la
détermination de structure secondaire de protéines ou de peptides. En infrarouge, la bande
amide I’ correspondant à l’élongation des carbonyles du squelette d’une protéine est
sensible aux liens hydrogènes. Par conséquent, si la structure secondaire change,
l’orientation des liens hydrogènes fait avec les carbonyles va changer et il sera possible de
l’observer dans la bande amide I’ 67
. Par rapport au dichroïsme circulaire, cette technique a
28
l’avantage de ne pas être sensible aux lipides utilisés, mais elle a aussi l’inconvénient de
demander une concentration d’échantillon beaucoup plus élevée. Les peptides sont encore
une fois étudiés dans des vésicules de POPC et de POPG pour tenter d’imiter leur structure
dans les membranes bactériennes et humaines. Cette technique est réalisée à priori pour
confirmer les résultats obtenus en dichroïsme circulaire. Le spectromètre infrarouge Nicolet
Magna 560 est utilisé pour ces analyses.
Le traitement des donnés peut être complexe en infrarouge à Transformée de Fourier. En
effet, une bande peut avoir plusieurs contributions correspondantes à différentes structures
secondaires. De plus, certains acides aminés peuvent absorber dans la zone de la bande
amide I’ pour des échantillons dans l’eau deutérée. La décomposition de cette bande
permettra de mettre en évidence la contribution relative de chaque structure secondaire
(figure 22).
Figure 22 – Exemple de décomposition spectrale d’un spectre de FTIR67
Pour réaliser cette décomposition, la location de chaque pic doit être connue et constante le
plus possible. Dans le tableau 1 se retrouvent les différents nombres d’onde et la structure
secondaire associée, utilisés pour réaliser la décomposition67
.
29
Tableau 1 – Structure secondaire et longueur d’onde associée
Structure secondaire Nombres d’onde (cm-1
)
Hélice alpha 1653±4
Feuillets beta intermoléculaires 1624±4 et 1675±5
Feuillets beta intramoléculaires 1631±3
Structure désordonnée 1645±4
Tournant beta 1671±3
Contribution des arginines 1606±2 et 1583±3
3.7 - Test d’activité antibactérienne
Le test d’activité antibactérienne est utilisé pour mesurer la capacité des peptides à tuer les
cellules bactériennes. Le terme CMI (concentration minimale inhibitrice) correspond à la
plus petite concentration de peptide inhibant la croissance bactérienne. Pour déterminer la
CMI, on incube le peptide en concentrations décroissantes en présence de 2 à 7 x105
bactéries par mL pour une période de 48 h. Au terme du 48 h, la plus faible concentration
de peptides ayant arrêté la croissance des bactéries sera la CMI. L’activité des peptides est
déterminée contre deux souches différentes soit Staphylococcus epidermidis et Escherichia
coli. Ces deux souches niveau 168
sont complètement inoffensives et ne requièrent aucune
mesure particulière pour les cultiver, en faisant ainsi d’excellents candidats pour ce type de
test préliminaire. De plus, S. epidermidis est une bactérie Gram positif et E. coli est une
bactérie Gram négatif. La coloration Gram est un test utilisé pour différencier le type de
membrane d’une bactérie69
. En effet, les Grams négatifs ont deux épaisseurs de membranes
séparées par une mince couche de peptidoglycane et les Grams positifs ont une seule
membrane recouverte d’une épaisse couche de peptidoglycane. Comme la configuration
des membranes est si différente d’un type à l’autre, il semble justifié de tester les molécules
sur les deux types.
Étant donné l’utilisation de matériel vivant s’avérant moins constant et la manipulation de
très petit volume, l’erreur sur les données peut être relativement importante. C’est pourquoi
les tests ont été réalisés au moins en duplicata pour les peptides inactifs et parfois plus pour
les peptides démontrant une activité.
30
3.8 - Test d’activité hémolytique
Le test d’activité hémolytique vise à déterminer la capacité des peptides à lyser les globules
rouges humains. Le peptide le plus antimicrobien n’est pas intéressant s’il tue autant l’hôte
que la bactérie. Bien entendu, comme les molécules testées ont une visée pharmaceutique,
ils ne doivent pas être hémolytiques chez l’humain. Par contre, il a été impossible de se
procurer du sang humain pour des raisons d’accessibilité. Par conséquent, les tests ont été
réalisés sur du sang de mouton, qui est considéré assez proche de l’humain pour pouvoir
transposer nos résultats à l’humain70
. Le test consiste à incuber 100 μM, 10 μM et 1 μM de
nos peptides en présence de 107 globules rouges par mL pendant une heure. Au terme de
cette heure, les peptides auront détruit les globules rouges selon leur capacité hémolytique
et les plaques sont centrifugées pour récupérer le surnageant. Le surnageant, qui contient
alors le contenu des globules rouges y compris l’hémoglobine, sera alors dosé par
spectrophotométrie à 414 nm, longueur d’onde d’absorbance de l’hème de l’hémoglobine.
À l’aide de puits de contrôle positif (contenant du détergeant) et de contrôle négatif (ne
contenant pas de peptide) nous pourrons alors calculer le pourcentage d’hémolyse de nos
analogues.
Comme ces tests requièrent un équipement et une formation spécialisée, ils ont été réalisés
en collaboration avec le laboratoire de Dre Renée Bazin, chercheuse en recherche et
développement chez Héma-Québec.
31
Chapitre 4 - Résultats et discussion
4.1 - Synthèse peptidique
L’ensemble des analogues pour lesquels trois leucines sur 10 ont été remplacées par des
arginines ont été synthétisés, ce qui donne un total de 120 peptides ayant chacun trois
arginines à une combinaison de positions différentes. De plus, ces mêmes peptides ont aussi
été synthétisés en version acétylée, où l’extrémité N-terminale est protégée par un
groupement acétyle. Finalement, quelques analogues ayant l’extrémité C-terminale
protégée en amide ont également été synthétisés. La somme de tous ces peptides donne un
total de 245 peptides. Toutefois, je n’ai pas synthétisé à moi seul cette énorme librairie de
peptides. En effet, plusieurs stagiaires dont Romain Martiny, Laura-Lee Gosselin et
Rachelle Séguin ont travaillé à la synthèse de ces molécules. Tous les peptides ont été
analysés par HPLC pour déterminer leur pureté et par MS pour confirmer la masse exacte.
Le rendement a aussi été calculé à partir de la masse de résine utilisée et du taux de
substitution calculé. Les différentes informations sur la synthèse et la caractérisation HPLC
et MS de la totalité des peptides sont aux tableaux 2 et 3.
Tableau 2 – Rendement et caractérisation par HPLC et spectroscopie de masse des
analogues non-acétylés
Peptide Rendement*
(%)
HPLC SM
Temps
retention
(min)
Pureté#
(%) [M+NH4+3H]
4+
R1R3R4 76 25,650 52 750,1943
R1R3R5 74 27,487 65 750,1948
R1R3R7 45 25,386 73 750,1934
R1R3R8 73 22,732 71 750,1886
R1R3R10 55 28,376 85 750,1962
R1R3R11 50 21,763 72 750,1935
R1R3R12 85 26,452 74 750,1722
R1R3R14 48 27,218 76 750,1864
R1R4R5 62 25,467 64 750,1954
R1R4R7 48 23,455 77 750,1949
R1R4R8 55 23,271 71 750,1927
R1R4R10 39 23,468 85 750,1965
R1R4R11 85 21,558 96 750,1958
R1R4R12 48 25,224 51 750,1701
R1R4R14 70 22,792 69 750,1873
32
R1R5R7 74 23,183 66 750,1951
R1R5R8 61 25,733 70 750,1929
R1R5R10 55 28,768 90 750,1961
R1R5R11 79 22,955 65 750,1764
R1R5R12 85 30,054 60 750,1677
R1R5R14 69 28,259 78 750,1865
R1R7R8 54 20,863 82 750,1949
R1R7R10 52 24,992 83 750,7222
R1R7R11 80 22,196 86 750,3089
R1R7R12 91 22,609 70 750,1826
R1R7R14 79 25,207 81 750,3016
R1R8R10 54 22,600 60 750,3117
R1R8R11 73 23,576 79 750,3127
R1R8R12 >100 27,360 65 750,4474
R1R8R14 86 24,663 96 750,1939
R1R10R11 56 24,088 63 750,3188
R1R10R12 41 25,485 84 750,3115
R1R10R14 29 28,726 81 750,1961
R1R11R12 51 26,161 83 750,1950
R1R11R14 26 31,574 78 750,1940
R1R12R14 63 28,623 76 750,1892
R3R4R5 57 24,185 63 750,1955
R3R4R7 66 22,984 76 750,1947
R3R4R8 55 23,385 76 750,1895
R3R4R10 50 22,916 79 750,1932
R3R4R11 86 20,359 81 750,1955
R3R4R12 71 23,290 82 750,1764
R3R4R14 55 21,837 72 750,1906
R3R5R7 45 22,991 67 750,1954
R3R5R8 69 22,954 73 750,1932
R3R5R10 62 26,892 97 750,1961
R3R5R11 78 21,115 74 750,1770
R3R5R14 53 25,386 75 750,1917
R3R7R8 57 20,335 81 750,1909
R3R7R10 23 25,021 79 750,5004
R3R7R11 78 21,833 81 750,3106
R3R7R12 87 22,543 81 750,1767
R3R7R14 92 25,230 79 750,3466
R3R8R10 67 20,607 79 750,3122
R3R8R11 72 21,635 70 750,3123
R3R8R12 >100 23,672 65 750,1873
R3R8R14 74 21,674 68 750,1934
R3R10R11 55 23,636 71 750,3198
R3R10R12 35 27,814 89 750,3144
R3R10R14 29 27,194 80 750,1954
33
R3R11R12 55 24,324 81 750,1957
R3R11R14 35 21,473 82 750,4448
R3R12R14 67 25,262 75 750,4396
R4R5R7 58 22,636 73 750,1949
R4R5R8 64 23,116 74 750,1951
R4R5R10 46 22,218 89 750,1975
R4R5R11 80 21,885 76 750,1783
R4R5R12 70 25,327 69 750,1814
R4R5R14 55 22,134 74 750,1945
R4R7R8 32 21,372 71 750,1931
R4R7R10 60 22,379 80 750,3493
R4R7R11 76 22,415 68 750,3179
R4R7R14 62 22,367 74 750,4469
R4R8R10 63 20,820 69 750,3372
R4R8R11 67 23,066 77 750,3233
R4R8R12 >100 25,220 67 750,1869
R4R8R14 58 22,680 71 750,1950
R4R10R11 71 21,892 88 750,4425
R4R10R12 37 21,794 91 750,3188
R4R10R14 30 21,490 82 750,1954
R4R11R12 45 25,604 86 750,1948
R4R11R14 42 20,022 79 750,5788
R4R12R14 88 23,643 77 750,4394
R5R7R8 6 21,066 71 750,2010
R5R7R10 40 22,439 77 750,4621
R5R7R11 33 21,308 63 750,3133
R5R7R12 87 21,290 74 750,1935
R5R7R14 75 22,088 75 750,3408
R5R8R10 49 23,122 73 750,3137
R5R8R11 59 24,003 82 750,3107
R5R8R12 57 28,058 76 750,1941
R5R8R14 84 25,220 87 750,1949
R5R10R11 72 21,936 82 750,3229
R5R10R12 45 27,950 86 750,3207
R5R10R14 25 27,453 90 750,3295
R5R11R12 34 26,845 81 750,1955
R5R11R14 65 20,315 93 750,4413
R5R12R14 80 28,655 77 750,4411
R7R8R10 71 20,512 66 750,1948
R7R8R11 57 21,332 67 750,3156
R7R8R12 >100 21,020 64 750,1940
R7R8R14 75 20,393 73 750,1963
R7R10R11 41 21,587 70 750,3149
R7R10R12 55 22,251 80 750,3179
R7R10R14 73 30,959 84 750,1965
34
R7R11R12 55 24,637 83 750,1959
R7R11R14 66 20,019 82 750,1928
R7R12R14 72 22,402 71 750,1919
R8R10R11 72 20,865 60 750,3153
R8R10R12 54 23,557 78 750,3056
R8R10R14 68 28,842 87 750,2031
R8R11R12 55 27,057 81 750,1960
R8R11R14 66 20,220 93 750,9197
R8R12R14 78 25,744 74 750,1937
R10R11R12 32 22,126 76 750,3505
R10R11R14 58 20,953 85 750,3110
R10R12R14 43 34,056 88 750,1959
R11R12R14 52 29,002 77 750,2157
R3R5R12 77 25,989 84 750,1700
R4R7R12 83 21,677 67 750,1624 * : Rendement estimé par calcul à l’aide du taux de substitution # : Pureté évaluée par HPLC et sous-estimée
Tableau 3 – Rendement et caractérisation par HPLC et spectroscopie de masse des
analogues acétylés
Peptide Rendement*
(%)
HPLC SM
Temps
retention
(min)
Pureté#
(%) [M+NH4+3H]
4+
AcR1R3R4 7 22,497 64 760,6958
AcR1R3R5 18 25,658 68 760,6953
AcR1R3R7 33 22,609 91 760,6935
AcR1R3R8 37 23,459 72 760,7011
AcR1R3R10 19 27,634 87 760,6989
AcR1R3R11 50 21,013 61 760,6959
AcR1R3R12 38 26,428 63 760,6626
AcR1R3R14 59 26,474 74 760,6855
AcR1R4R5 13 25,683 72 760,6965
AcR1R4R7 62 21,100 84 760,6935
AcR1R4R8 39 25,633 77 760,6944
AcR1R4R10 24 23,822 81 760,6979
AcR1R4R11 85 22,662 70 760,6982
AcR1R4R12 29 27,283 73 760,6701
AcR1R4R14 59 23,915 78 760,6845
AcR1R5R7 73 21,525 82 760,6939
AcR1R5R8 31 23,459 72 760,7035
AcR1R5R10 29 30,431 83 760,6964
AcR1R5R11 73 25,159 69 760,6790
AcR1R5R12 42 32,802 97 760,6636
AcR1R5R14 44 30,502 77 760,6868
35
AcR1R7R8 11 22,044 85 760,7016
AcR1R7R10 30 24,600 77 760,8312
AcR1R7R11 80 22,559 85 760,8197
AcR1R7R12 43 22,814 80 760,6766
AcR1R7R14 81 24,703 86 760,8080
AcR1R8R10 54 24,790 62 760,8203
AcR1R8R11 73 25,769 72 760,8210
AcR1R8R12 >100 30,109 58 760,7019
AcR1R8R14 74 27,129 92 760,6950
AcR1R10R11 56 24,863 64 760,8212
AcR1R10R12 46 29,271 82 760,8130
AcR1R10R14 28 29,443 86 760,6982
AcR1R11R12 67 27,900 83 760,6976
AcR1R11R14 26 22,746 86 760,6982
AcR1R12R14 52 30,565 81 760,6894
AcR3R4R5 19 21,874 97 760,6964
AcR3R4R7 64 21,790 63 760,6927
AcR3R4R8 82 23,246 83 760,7024
AcR3R4R10 25 24,061 88 760,6999
AcR3R4R11 86 21,238 71 760,6979
AcR3R4R12 41 23,572 59 760,6616
AcR3R4R14 44 22,982 75 760,6853
AcR3R5R7 54 22,806 84 760,6950
AcR3R5R8 83 25,114 63 760,6951
AcR3R5R10 33 29,411 86 760,6980
AcR3R5R11 78 22,817 74 760,6789
AcR3R5R12 31 28,416 67 760,6617
AcR3R5R14 22 28,254 79 760,6866
AcR3R7R8 69 22,494 79 760,7022
AcR3R7R10 34 29,296 83 760,8361
AcR3R7R11 78 25,213 70 760,8203
AcR3R7R12 20 25,534 68 760,6716
AcR3R7R14 56 29,420 83 760,3248
AcR3R8R10 67 22,978 87 760,8210
AcR3R8R11 72 23,802 73 760,8200
AcR3R8R12 63 25,717 81 760,6972
AcR3R8R14 60 24,215 81 760,6958
AcR3R10R11 55 27,398 72 760,8233
AcR3R10R12 41 28,819 81 760,8292
AcR3R10R14 44 22,351 79 760,6984
AcR3R11R12 67 26,793 80 760,6968
AcR3R11R14 35 25,317 91 760,6974
AcR3R12R14 24 28,790 86 760,6897
AcR4R5R7 76 20,821 66 760,6955
AcR4R5R8 43 25,534 75 760,6945
36
AcR4R5R10 36 23,020 80 760,7009
AcR4R5R11 80 22,895 62 760,6801
AcR4R5R12 37 27,052 77 760,6635
AcR4R5R14 58 23,338 77 760,6816
AcR4R7R8 81 22,125 83 760,6962
AcR4R7R10 43 23,699 81 760,8287
AcR4R7R11 76 22,929 82 760,8190
AcR4R7R12 31 22,342 52 760,6753
AcR4R7R14 49 23,682 83 760,3133
AcR4R8R10 63 22,124 85 760,8229
AcR4R8R11 67 24,033 88 760,8200
AcR4R8R12 >100 26,332 96 760,6851
AcR4R8R14 70 23,766 80 760,6956
AcR4R10R11 71 23,688 81 760,8238
AcR4R10R12 29 22,888 79 760,8258
AcR4R10R14 28 22,750 74 760,6982
AcR4R11R12 56 26,322 90 760,6972
AcR4R11R14 22 21,516 82 760,6975
AcR4R12R14 60 24,565 72 760,6904
AcR5R7R8 51 22,695 80 760,6972
AcR5R7R10 32 25,021 92 760,8337
AcR5R7R11 33 22,763 92 760,8197
AcR5R7R12 34 23,287 69 760,6802
AcR5R7R14 82 24,950 89 760,3306
AcR5R8R10 49 26,063 84 760,8220
AcR5R8R11 59 26,854 73 760,8185
AcR5R8R12 94 31,074 73 760,6992
AcR5R8R14 51 28,329 82 760,6950
AcR5R10R11 72 25,052 87 760,8228
AcR5R10R12 37 31,473 85 760,8104
AcR5R10R14 32 32,045 87 760,6987
AcR5R11R12 26 29,107 78 760,6977
AcR5R11R14 65 23,168 85 760,8161
AcR5R12R14 59 32,461 84 760,6998
AcR7R8R10 71 22,132 87 760,8247
AcR7R8R11 57 23,300 74 760,8200
AcR7R8R12 71 23,146 52 760,6906
AcR7R8R14 41 22,511 89 760,6950
AcR7R10R11 41 25,584 75 760,8208
AcR7R10R12 39 25,597 81 760,8268
AcR7R10R14 24 27,623 83 760,6986
AcR7R11R12 24 26,930 82 760,6970
AcR7R11R14 66 23,835 91 760,8158
AcR7R12R14 83 25,785 86 760,6912
AcR8R10R11 72 23,846 84 760,8216
37
AcR8R10R12 36 26,636 76 760,8202
AcR8R10R14 36 24,063 82 760,6987
AcR8R11R12 35 29,094 78 760,6990
AcR8R11R14 66 22,818 88 760,8152
AcR8R12R14 64 28,712 81 760,6913
AcR10R11R12 16 26,289 77 760,8400
AcR10R11R14 58 25,56 93 760,8157
AcR10R12R14 34 29,172 81 760,6991
AcR11R12R14 37 19,648 82 760,6983 * : Rendement estimé par calcul à l’aide du taux de substitution # : Pureté évaluée par HPLC et sous-estimée
Le rendement, qui varie entre 7% et 100%, varie considérablement d’un peptide à l’autre.
Les analogues non-acétylés ont, en moyenne, un rendement d’environ 60 % et les
analogues acétylés ont environ 50% de rendement moyen. Ces rendements sont acceptables
et normaux étant donné les petites pertes tout au long de la synthèse. En effet, à chaque test
de Kaiser les seringues sont ouvertes et une infime quantité de résine est perdue. De plus,
durant la purification par trituration suite au clivage du peptide, une petite quantité de
peptide est inévitablement perdue. Les peptides ayant un rendement au-dessus de 100%
n’étaient vraisemblablement pas purs. De plus, comme plusieurs peptides étaient
synthétisés dans une même seringue puis séparés au moment où les séquences différaient, il
est possible que les rendements ne soient pas tout à fait exacts. En effet, si la résine n’était
pas parfaitement divisée, le résultat serait un rendement légèrement surestimé pour un
peptide et sous-estimé pour sa contrepartie.
En ce qui concerne la pureté des peptides, encore une fois, il y a une grande variété de
résultats. La majorité des résultats sont entre 70% et 95%, ce qui est satisfaisant. Les
peptides dans cet intervalle de pureté sont majoritairement constitués que d’un composé
majoritaire et de quelques impuretés insignifiantes. Les peptides présentant plus d’un
composé majeur par HPLC ont étés purifiés pour retirer les composés ne correspondant pas
au peptide désiré. La pureté est déterminée par HPLC et par conséquent, les valeurs de
pureté correspondent à des valeurs sous-estimées. En effet, la pureté HPLC est directement
liée à l’intégration des pics donc, les paramètres d’intégration choisis sont ceux donnant
une valeur de pureté plutôt conservatrice.
38
Les temps de rétention étant différents d’un analogue à l’autre, cela confirme que les
peptides ont des séquences différentes qui résultent probablement en structures différentes.
Les temps de rétention varient peu (entre 20 min et 30 min), mais ces variations sont
suffisantes pour suggérer des structures, arrangements ou agrégats différents.
Les résultats de spectroscopie de masse concordent avec la masse attendue, qui est de
2978,7222 g/mol pour les analogues non-acétylés et 3020,7328 g/mol pour les analogues
acétylés, confirmant ainsi que les peptides ont la bonne masse. Les valeurs présentées dans
les tableaux 2 et 3 sont en fait les masses des fragments observés. Le fragment principal est
toujours celui d’environ 750,2 pour les analogues non-acétylés ou 760,7 pour les acétylés.
En multipliant la masse de ce fragment par sa charge, qui est de 4, puis en soustrayant les
ions NH4+ et H
+, on obtient la masse exacte attendue (M+H) qui est 2979,7377 ou
3021,7377 respectivement.
4.2 - Étude fluorimétrique du relargage de la calcéine
Les études du relargage de la calcéine ont été réalisées seulement sur les séries peptidiques
R5R10 et R4R11, car tester la totalité des peptides aurait été une tâche colossale et il aurait
été difficile de tirer une tendance claire des résultats obtenus. Comme les résultats des
analogues bisubstitués semblaient indiquer que les deux peptides R5R10 et R4R11 étaient
particulièrement prometteurs pour leur activité et sélectivité respectivement, nous
étudierons l’effet de l’ajout d’un troisième arginine dans les figures 23 à 26. Ces études
sont réalisées à un ratio peptide : lipide de 1 : 60.
39
Figure 23 – Pourcentage de relargage de calcéine des vésicules de POPC par différents
peptides non-acétylés
Figure 24 – Pourcentage de relargage de calcéine des vésicules de POPC par différents
peptides acétylés
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Po
urc
en
tage
de
lyse
de
s vé
sicu
les
(%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Po
urc
en
tage
de
lyse
de
s vé
sicu
les
(%)
40
Figure 25 – Pourcentage de relargage de calcéine des vésicules de POPG par différents
peptides non-acétylés
Figure 26 – Pourcentage de relargage de calcéine des vésicules de POPG par différents
peptides acétylés
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Po
urc
en
tage
de
lyse
de
s vé
sicu
les(
%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Po
urc
en
tage
de
lyse
de
s vé
sicu
les(
%)
41
Premièrement, l’axe des ordonnées correspond au pourcentage de lyse des vésicules et, par
conséquent, plus la barre est haute, plus le peptide est actif. On peut constater que la totalité
des analogues de ces séries ont une certaine sélectivité pour le POPG. En effet, ils sont tous
plus actifs contre les vésicules de POPG que les vésicules de POPC.
Deuxièmement, pour ce qui est de la différence entre les deux séries, on peut observer des
tendances identiques aux tendances des bisubstitués. La série R4R11 (première moitié des
figures) est presque sélective à 100% avec un pourcentage de lyse des vésicules de POPC
maximum d’environ 12%, ce qui est très faible. Par contre, son activité contre POPG est un
peu plus faible, ayant un peptide allant jusqu’à moins de 30%. Tant qu’à elle, la série
R5R10 (deuxième moitié des figures) est moins sélective avec une activité contre POPC de
plus de 60% pour certains peptides, mais plus active étant donné le plus grand nombre de
peptides à de très haut pourcentage de lyse.
Troisièmement, si on tente de comparer les analogues acétylés avec leur contrepartie non-
acétylé, il est difficile de tirer une tendance. Les peptides ayant une activité tendent à la
garder peu importe l’état de leur N-terminal, on ne peut pas tirer de conclusion sur l’effet
de l’acétylation dans le cas de l’étude du relargage de la calcéine.
Finalement, en ce qui concerne les peptides seuls, les peptides R5R10R12 et R5R10R14
sont les plus actifs contre POPC, suivis de près par les peptides R3R5R10 et R1R5R10 et
ce, en version non-acétylée ou acétylée. Il est intéressant de noter que, lorsque l’on regarde
le peptide en hélice alpha (figure 27), qui serait sa forme active71
, les positions 5 et 10 se
retrouvent le plus près des éthers-couronnes suivi par les positions 3 et 12 puis 1 et 14.
42
Figure 27 – Représentation hélicoïdale du peptide 14-mère
Donc, ces 4 peptides sont ceux ayant les arginines les plus près des éthers-couronnes et
donc le plus grand degré d’amphiphilicité. Dans le cas des peptides R4R11, qui ont
légèrement moins d’activité, leurs arginines sont placés du côté opposé du peptide, brisant
ainsi l’amphiphilicité et menant à une autre conformation que l’hélice alpha.
4.3 - Analyse de la structure secondaire par dichroïsme circulaire et dichroïsme
circulaire orienté
4.3.1 - Dichroïsme circulaire
La structure secondaire des différents analogues dans un environnement lipidique est très
importante pour comprendre le fonctionnement des molécules étudiées. Pour tenter
d’élucider cette structure, la première technique employée est le dichroïsme circulaire. Ces
tests ont été réalisés seulement sur les séries peptidiques R4R11 et R5R10. Plusieurs
conditions d’analyse et de préparation d’échantillons ont été testées, mais malgré nos
efforts, ce fut impossible d’obtenir un signal satisfaisant. L’insaturation des lipides utilisés
crée beaucoup de bruit, ce qui complique la tâche. Il est aussi probable qu’une portion des
peptides s’agrège en solution, ce qui diminue la concentration efficace. La figure 28
présente un exemple des spectres obtenus.
43
-5000
-4000
-3000
-2000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
190 200 210 220 230 240 250 260
Me
an R
esi
du
al E
lip
tici
ty (x
103
de
g. c
m2.
dm
ol-
1 )
Wavelenght (nm)
LLG43-1
ROMM24C
LLG37-1
LLG55-3
LLG43-2
LLG59-5
ROMM22B
ROMM33A
ROMM32B
ROMM32C
ROMM32A
LLG5-2
LLG15-3
LLG25-3
LLG31-2
-14000
-12000
-10000
-8000
-6000
-4000
-2000
0
2000
4000
190 200 210 220 230 240 250 260
Me
an R
esi
du
al E
lip
tici
ty (d
eg.
cm
2. d
mo
l-1
)
Wavelenght (nm)
LLG25-3
LLG5-2
LLG15-3
LLG15-4
LLG59-5
ROMM24C
ROMM33A
ROMM32A
LLG37-1
ROMM22B
LLG43-1
LLG55-3
ROMM32C
LLG31-2
LLG43-2
Figure 28 – Spectres de dichroïsme circulaire dans des vésicules de POPC et POPG
respectivement, des analogues trisubstitués des séries R4R11 et R5R10
De nombreuses conditions ont été essayées : différents protocoles de préparation de
vésicules, différents ratios peptide : lipide, différentes concentrations de peptide, différents
tampons, différents paramètres de lecture, ainsi que différents lipides, et bien que certains
paramètres aient amélioré légèrement les résultats, aucun n’a été satisfaisant.
Pour tenter d’obtenir des résultats de bonne qualité, nous nous sommes tournés vers nos
collaborateurs au Karlsruhe Institute of Technology qui ont accès à un appareil de
dichroïsme circulaire à radiation synchrotron (SR-CD). La radiation synchrotron, qui est
beaucoup plus intense, a permis d’obtenir de bons résultats, mais étant donné le coût élevé
de ces tests ainsi que la disponibilité de l’instrument, ils n’ont été effectués que sur
quelques peptides. Les peptides choisis sont R1R5R10, R4R10R11, AcR5R10R12 et
R1R4R11. Les tests au KIT ont été réalisés avec des vésicules multilamélaires de POPC et
de POPC/POPG 1 : 1 à un ratio peptide : lipide de 1 : 50. Ces conditions diffèrent des
conditions utilisées dans nos autres tests, mais ce sont celles utilisées de façon routinière au
KIT. De plus, le POPC/POPG est un mélange communément utilisé qui constituerait des
vésicules plus stables que des vésicules de POPG seul. Dans nos tests, nous utilisons le
POPG seul pour mieux voir la différence de sélectivité de nos peptides pour le POPC et le
POPG. Les résultats sont présentés dans les figures 29 à 32.
44
Figure 29 – Spectre de SR-CD du peptide R1R5R10
Figure 30 – Spectre de SR-CD du peptide R4R10R11
-40000
-20000
0
20000
40000
185 195 205 215 225 235 245 255
MR
E / d
eg
cm
2d
mo
l-1
Longueur d'onde (nm)
R1R5R10 dans le POPC
R1R5R10 dans le POPC/PG 1:1
-40000
-20000
0
20000
40000
185 195 205 215 225 235 245 255
MR
E / d
eg
cm
2d
mo
l-1
Longueur d'onde (nm)
R4R10R11 dans le POPC
R4R10R11 dans le POPC/PG 1:1
45
Figure 31 – Spectre de SR-CD du peptide AcR5R10R12
Figure 32 – Spectre de SR-CD du peptide R1R4R11
Les minimums autour de 208 et 222 nm des trois premiers spectres indiquent clairement
que ces peptides sont en hélice alpha dans les membranes, et ce, peu importe le lipide
utilisé. L’intensité du spectre R4R10R11 semble toutefois diminuer dans les vésicules de
-40000
-20000
0
20000
40000
185 195 205 215 225 235 245 255
MR
E / d
eg
cm
2d
mo
l-1
Longueur d'onde (nm)
Ac-R5R10R12 dans le POPC
Ac-R5R10R12 dans le POPC/PG 1:1
-40000
-20000
0
20000
40000
60000
80000
185 195 205 215 225 235 245 255
MR
E / d
eg
cm
2d
mo
l-1
Longueur d'onde (nm)
R1R4R11 dans le POPC
R1R4R11 dans le POPC/PG 1:1
46
POPC. Ceci est probablement attribuable à un plus grand degré d’agrégation qui serait
causé par l’adoption de la structure désordonnée par une portion des peptides. Finalement,
de par son minimum autour de 212 nm, on remarque que le peptide R1R4R11 est en feuillet
beta dans les deux lipides.
4.3.2 - Dichroïsme circulaire orienté
Pour ces mêmes peptides, des études de dichroïsme circulaire orienté à radiation
synchrotron (SR-OCD) ont été réalisées pour tenter de voir l’orientation des hélices alpha
dans les membranes. Cette expérience a été réalisée avec les mêmes compositions de
lipides que le SR-CD, mais à des ratios de 1 : 20 et 1 : 100, les figures 33 à 35 présentent
ces résultats. Étant donné sa structure en feuillet beta, il est impossible d’étudier le peptide
R1R4R11 avec cette technique : le spectre obtenu ne présenterait que de l’agrégation.
Figure 33 – Spectre de SR-OCD du peptide R1R5R10
-5
0
5
10
15
185 195 205 215 225 235 245 255
OC
D/C
D n
orm
alisé
(m
de
g)
Longueur d'onde (nm)
POPC, P/L 1:20
POPC, P/L 1:100
isotropic: POPC, P/L 1:50
POPC/PG 1:1, P/L 1:20
POPC/PG 1:1, P:L 1:100
isotropic: POPC/POPG 1:1, P/L 1:50
47
Figure 34 – Spectre de SR-OCD du peptide R4R10R11
Figure 35 – Spectre de SR-OCD du peptide AcR5R10R12
-5
0
5
10
15
185 195 205 215 225 235 245 255
OC
D/C
D n
orm
alisé
(m
de
g)
Longueur d'onde (nm)
POPC, P/L 1:20
POPC, P/L 1:100
isotropic: POPC, P/L 1:50
POPC/PG 1:1, P/L 1:20
POPC/PG 1:1, P/L 1:100
isotropic: POPC/POPG 1:1, P/L 1:50
-8
-4
0
4
8
12
185 195 205 215 225 235 245 255
OC
D/C
D n
orm
alisé
(m
de
g)
Longueur d'onde (nm)
POPC, P/L 1:20
POPC, P/L 1:100
isotropic CD: POPC, P/L 1:50
POPC/PG 1:1, P/L 1:20
POPC/PG 1:1, P/L 1:100
isotropic CD: POPC/POPG 1:1, P/L 1:50
48
Dans le cas du premier peptide, R1R5R10, la bande à 208 nm atteint 0, ce qui indique que
le peptide est à un état inséré (I-state) dans la membrane pour tous les essais sauf le spectre
à 1 : 100 dans le POPC/POPG. Ce dernier possède une bande positive très importante
légèrement au-dessus de 208 nm. Selon le Dr. Jochen Buerck, expert du KIT ayant réalisé
ces tests, cette bande ne serait pas un artéfact, mais bien l’empreinte d’une conformation ou
d’une orientation particulière du peptide qu’il ne peut expliquer. Le peptide R4R10R11
présente différentes orientations dépendamment des conditions utilisées. À un ratio de
1 : 100 dans le POPC, le peptide semble majoritairement inséré. Lorsqu’il est dans une
membrane de POPC/POPG, il semble toutefois être dans un état incliné ou « T-state ». Cet
état incliné peut soit représenter une moyenne d’états insérés et en surfaces ou bien, le
peptide est littéralement incliné dans la membrane. À un ratio peptide : lipide de 1 : 20, le
peptide semble s’agréger et le spectre obtenu serait alors un mélange de feuillets beta et
d’hélices alpha insérés dans la membrane. Le dernier peptide reste principalement inchangé
d’un spectre à l’autre, ce qui signifie que le peptide serait principalement à l’état surface (S-
state) avec l’apparition d’un léger angle à 1 : 20. Dans la totalité des spectres, la bande
visible autour de 240-245 nm serait causée par l’acide aminé synthétique présent dans les
peptides, la phénylalanine éther-couronne.
Si l’on compare les résultats de fluorescence et de SR-OCD, on peut remarquer plusieurs
détails intéressants. Premièrement, le peptide AcR5R10R12 a une bonne activité de
perturbation membranaire sur les vésicules de POPC d’environ 25% malgré son état
surface. Deuxièmement, le peptide R1R5R10 a un pourcentage de lyse de vésicules
semblable au précédent, mais il se trouve à l’état inséré. Troisièmement, le peptide
R4R10R11, qui est aussi inséré dans certaines conditions, est incapable de lyser les
vésicules de POPC. Finalement, le peptide R1R4R11 est en feuillet beta et est incapable de
briser les vésicules de POPC. Il obtient à peine plus de 25% de lyse sur POPG.
En résumé, en ce qui concerne la section SR-OCD, on voit rapidement que les peptides
adoptent plusieurs conformations et même plusieurs orientations dans les membranes. Un
simple changement de concentration des analogues peut modifier grandement leur
structure. Il est difficile de dire quelles orientations correspondent aux structures actives,
mais il semblerait que l’hélice alpha soit clé.
49
4.4 - Analyse de la structure secondaire par spectroscopie infrarouge à transformée de
Fourier
Bien que le dichroïsme circulaire à radiation synchrotron ait donné des résultats intéressants
pour quelques peptides, cette technique ne nous informe pas sur la structure des analogues
des séries peptidiques R5R10 et R4R11. Pour déterminer la structure secondaire de ces
séries, l’infrarouge à Transformée de Fourier a été utilisé. Seulement ces séries ont été
testées étant donné le coût important d’une analyse. Les spectres ont tous été traités pour
retirer l’influence du tampon et des lipides. Pour retirer la contribution des lipides, une
ligne de base exponentielle a été utilisée. L’avantage de cette technique est que l’on obtient
un spectre plus facile à analyser pour la décomposition. En effet, il est important que la
zone du spectre à analyser se situe entre deux minimums et soit plane. Cette technique le
permet. Enfin, le pourcentage de la structure secondaire principale a été déterminé par
décomposition spectrale et est présenté dans les tableaux 4 et 5. Seulement la structure
principale a été déterminée pour ne pas encombrer l’analyse des résultats de données
inutiles.
Tableau 4 – Structure secondaire majoritaire des séries R5R10 et R4R11 non-acétylés
Peptide
POPG (%)* POPC (%)*
Hélice
α
Feuillet
β
Feuillet
β
Structure
désordonnée
Tournant
β
Hélice
α
Feuillet
β
Feuillet
β
Structure
désordonnée
Tournant
β
1553
± 4 cm-1
1631
± 3 cm-1
1624± 4 et
1675±5 cm-1
1645
± 4 cm-1
1671
± 3 cm-1
1553
± 4 cm-1
1631
± 3 cm-1
1624± 4 et
1675±5 cm-1
1645
± 4 cm-1
1671
± 3 cm-1
R1R4R11 50 - - 39 - - - 72 - -
R3R4R11 84 - - - - 25 35 - - 36
R4R5R11 79 - - - - 64 - - - -
R4R7R11 80 - - - - 33 - 38 - -
R4R8R11 68 - - - - 31 28 - - 41
R4R10R11 76 - - - - 33 23 - - 26
R4R11R12 57 - - - - 29 37 - 34 -
R4R11R14 54 - 46 - - - - 88 - -
R1R5R10 87 - - - - 64 - - - -
R3R5R10 82 - - - - 77 - - - -
R4R5R10 86 - - - - 69 - - - -
R5R7R10 80 - - - - - - 69 - -
R5R8R10 84 - - - - 40 - 59 - -
R5R10R11 85 - - - - 73 - - - -
R5R10R12 89 - - - - 72 - - - -
R5R10R14 71 - - - - 59 - - - -
*Estimé par décomposition spectrale
50
Tableau 5 – Structure secondaire majoritaire des séries R5R10 et R4R11 acétylés
Peptide
POPG (%)* POPC (%)*
Hélice
α
Feuillet
β
Feuillet
β
Structure
désordonnée
Tournant
β
Hélice
α
Feuillet
β
Feuillet
β
Structure
désordonnée
Tournant
β
1553
± 4 cm-
1
1631
± 3 cm-1
1624± 4 et
1675±5 cm-1
1645
± 4 cm-1
1671
± 3 cm-1
1553
± 4 cm-1
1631
± 3 cm-1
1624± 4 et
1675±5 cm-1
1645
± 4 cm-1
1671
± 3 cm-1
AcR1R4R11 76 - - - - 46 - 43 - -
AcR3R4R11 86 - - - - - - 73 - -
AcR4R5R11 89 - - - - 40 34 - - -
AcR4R7R11 79 - - - - - - 55 - -
AcR4R8R11 69 - - - - - - 53 - -
AcR4R10R11 79 - - - - 52 - - - -
AcR4R11R12 71 - - - - 59 - - - -
AcR4R11R14 71 - - - - - - 60 - -
AcR1R5R10 91 - - - - 77 - - - -
AcR3R5R10 79 - - - - 69 - - - -
AcR4R5R10 68 - - - - 73 - - - -
AcR5R7R10 85 - - - - 75 - - - -
AcR5R8R10 75 - - - - 65 - - - -
AcR5R10R11 86 - - - - 87 - - - -
AcR5R10R12 90 - - - - 46 - 43 - -
AcR5R10R14 76 - - - - 77 - - - -
*Estimé par décomposition spectrale
En regardant sommairement les résultats, la conclusion que l’on peut tirer est que la grande
majorité des peptides sont en hélice alpha. En effet, 100% des peptides sont en hélice alpha
dans les vésicules de POPG, et près de la moitié le sont dans les vésicules de POPC, et ce,
autant pour les peptides acétylés que non-acétylés. La deuxième structure la plus souvent
rencontrée est le feuillet beta que l’on retrouve dans près de la moitié des peptides dans les
vésicules de POPC. Les structures désordonnées et les tournants beta ne sont presque
jamais la structure principale, bien qu’ils aient des contributions mineures dans presque
tous les spectres. Ces résultats n’ont pas été ajoutés au tableau pour simplifier l’analyse. De
plus, il ne semble pas y avoir de différence marquée entre les peptides acétylés et non-
acétylés au niveau de la structure secondaire.
Les résultats d’infrarouge et de dichroïsme circulaire ne sont pas réalisés aux mêmes
conditions, mais comme ces techniques tentent toutes les deux de prédire la structure
secondaire, il reste pertinent de comparer les résultats. Tout d’abord, les peptides R1R5R10
et AcR5R10R12 seraient en hélice alpha selon les deux techniques. Le peptide R4R10R11
présente de l’agrégation dans les vésicules de POPC, mais tout de même une structure
alpha dominante tout de même en dichroïsme circulaire. Ceci est corroboré par l’infrarouge
où ce peptide présente seulement 33% d’hélice alpha. Finalement, le peptide R1R4R11 est
51
prédit en feuillet beta par le dichroïsme circulaire. Par infrarouge, le feuillet beta domine
dans les vésicules de POPC, mais l’hélice alpha reste dominante dans les vésicules de
POPG. On peut donc conclure que ces deux techniques sont fiables puisque les résultats
sont reproductibles. Les différences entre les résultats des différentes techniques peuvent
facilement être expliquées par les différences de conditions utilisées.
Ensuite, si l’on compare les résultats obtenus par infrarouge avec ceux obtenus par
fluorescence, on peut tirer plusieurs conclusions intéressantes. Premièrement, les peptides
ont tous une activité de près de 100 % contre les vésicules de POPG et ils ont tous une
haute proportion d’hélice alpha. Ceci semble confirmer que l’hélice alpha est la structure
active permettant la plus grande activité lytique. Ensuite, on peut remarquer que la série
peptidique R5R10 est aussi principalement en hélice alpha même dans les vésicules de
POPC. Ceci peut expliquer l’activité plus élevée de ces analogues dans ces peptides mimant
les cellules eucaryotes. La série R4R11, qui a une amphiphilicité réduite de par la
disposition de ses arginines semble avoir de la difficulté à maintenir sa structure en hélice
alpha. Il semblerait donc que l’amphiphilicité dicte principalement la structure des peptides.
Pour terminer, je crois qu’il est important de garder en tête que la décomposition spectrale
n’est pas à toute épreuve. En effet, ce type d’analyse reste légèrement subjectif malgré les
nombreuses barrières et restrictions qui sont mises en place durant l’analyse. Par
conséquent, il est possible que les pourcentages ne soient pas exacts, mais les tendances
devraient rester les mêmes. Les spectres traités se retrouvent à la section 6.7.3.
4.5 - Activité antibactérienne
Bien entendu, l’activité antimicrobienne est un test très important pour l’étude de peptides
antimicrobiens. Avec ce test, on s’éloigne des modèles pour commencer à étudier l’activité
des peptides dans un environnement plus proche de la réalité. Les bactéries utilisées ne sont
évidemment pas les cibles d’un tel peptide puisque l’utilisation de bactéries pathogènes
résistantes compliquerait significativement un tel test.
L’ensemble des 240 peptides a été testé en duplicata (tableaux 6 et 7), mais étant donné la
quantité extraordinaire de données, l’analyse des résultats sera concentrée principalement
sur les séries peptidiques analysées plus haut.
52
Tableau 6 – CMI de tous les 14-mère trisubstitués
Peptide
CMI
E. coli
(μM)
CMI
S. epidermidis
(μM)
Peptide
CMI
E. coli
(μM)
CMI
S. epidermidis
(μM)
R1R3R4 >86 >86 AcR1R3R4 >85 >85
R1R3R5 32±11 >86 AcR1R3R5 >85 >85
R1R3R7 >86 >86 AcR1R3R7 >85 >85
R1R3R8 32±11 43±64 AcR1R3R8 >85 >85
R1R3R10 29±7 86±29 AcR1R3R10 42±0 >85
R1R3R11 >86 >86 AcR1R3R11 >85 >85
R1R3R12 11±0 >86 AcR1R3R12 16±5 >85
R1R3R14 21±0 >86 AcR1R3R14 21±0 >85
R1R4R5 32±11 >86 AcR1R4R5 >85 >85
R1R4R7 >86 >86 AcR1R4R7 >85 >85
R1R4R8 21±0 >86 AcR1R4R8 32±11 >85
R1R4R10 29±7 57±14 AcR1R4R10 42±0 >85
R1R4R11 >86 >86 AcR1R4R11 >85 >85
R1R4R12 32±11 >86 AcR1R4R12 21±0 >85
R1R4R14 54±32 >86 AcR1R4R14 42±0 >85
R1R5R7 >86 >86 AcR1R5R7 >85 >85
R1R5R8 11±0 >86 AcR1R5R8 5±0 >85
R1R5R10 21±50 86±29 AcR1R5R10 42±46 >85
R1R5R11 43±0 >86 AcR1R5R11 85±0 >85
R1R5R12 11±0 >86 AcR1R5R12 21±0 >85
R1R5R14 4±1 >86 AcR1R5R14 6±1 >85
R1R7R8 >86 >86 AcR1R7R8 >85 >85
R1R7R10 21±0 43±0 AcR1R7R10 42±0 >85
R1R7R11 64±38 >86 AcR1R7R11 >85 >85
R1R7R12 43±64 43±64 AcR1R7R12 21±74 >85
R1R7R14 >86 >86 AcR1R7R14 >85 >85
R1R8R10 43±43 43±21 AcR1R8R10 85±0 >85
R1R8R11 >86±29 >86 AcR1R8R11 >85 >85
R1R8R12 11±0 >86 AcR1R8R12 11±0 >85
R1R8R14 >86 >86 AcR1R8R14 21±0 >85
R1R10R11 57±14 36±7 AcR1R10R11 42±0 85±42
R1R10R12 21±0 43±50 AcR1R10R12 42±0 32±11
R1R10R14 14±4 >86 AcR1R10R14 21±0 >85
R1R11R12 >86±32 86±43 AcR1R11R12 >85±56 >85
R1R11R14 >86 >86 AcR1R11R14 >85 >85
R1R12R14 >86 >86 AcR1R12R14 53±32 >85
R3R4R5 >86 >86 AcR3R4R5 >85 >85
R3R4R7 >86 >86 AcR3R4R7 >85 >85
R3R4R8 43±0 86±0 AcR3R4R8 64±21 >85
R3R4R10 43±0 86±29 AcR3R4R10 42±0 >85
R3R4R11 86±37 >86 AcR3R4R11 85±40 >85
R3R4R12 32±11 86±0 AcR3R4R12 32±11 >85
R3R4R14 21±0 43±64 AcR3R4R14 16±5 >85
R3R5R7 >86 >86 AcR3R5R7 >85 >85
53
R3R5R8 32±11 43±0 AcR3R5R8 42±0 >85
R3R5R10 86±43 >86 AcR3R5R10 35±7 >85
R3R5R11 36±7 >86±29 AcR3R5R11 85±0 >85
R3R5R12 11±0 >86 AcR3R5R12 21±0 >85
R3R5R14 16±5 >86 AcR3R5R14 16±5 >85
R3R7R8 64±21 43±0 AcR3R7R8 >85 >85
R3R7R10 21±0 86±0 AcR3R7R10 32±11 >85
R3R7R11 43±0 86±0 AcR3R7R11 21±0 85±0
R3R7R12 21±0 43±0 AcR3R7R12 21±0 >85
R3R7R14 11±0 >86 AcR3R7R14 48±37 >85
R3R8R10 43±43 64±38 AcR3R8R10 85±0 >85
R3R8R11 86±0 86±29 AcR3R8R11 >85 >85
R3R8R12 32±11 >86 AcR3R8R12 42±0 >85
R3R8R14 >86 86±43 AcR3R8R14 42±64 >85
R3R10R11 36±7 86±29 AcR3R10R11 85±42 >85
R3R10R12 39±14 27±29 AcR3R10R12 42±0 85±0
R3R10R14 50±19 >86 AcR3R10R14 64±37 >85
R3R11R12 43±0 86±0 AcR3R11R12 32±11 64±21
R3R11R14 57±14 86±0 AcR3R11R14 21±0 85±28
R3R12R14 11±0 >86 AcR3R12R14 11±0 >85
R4R5R7 >86 >86 AcR4R5R7 >85 >85
R4R5R8 32±11 >86 AcR4R5R8 42±0 >85
R4R5R10 86±43 86±29 AcR4R5R10 56±13 >85
R4R5R11 54±11 86±21 AcR4R5R11 >85 >85
R4R5R12 43±64 >86 AcR4R5R12 42±0 >85
R4R5R14 16±5 43±0 AcR4R5R14 16±5 >85
R4R7R8 >86 >86 AcR4R7R8 >85 >85
R4R7R10 21±0 43±0 AcR4R7R10 42±0 >85
R4R7R11 54±11 >86 AcR4R7R11 >85 >85
R4R7R12 >86 86±43 AcR4R7R12 >85 >85
R4R7R14 >86 >86 AcR4R7R14 >85 >85
R4R8R10 29±7 57±14 AcR4R8R10 85±0 >85
R4R8R11 64±12 >86 AcR4R8R11 >85 >85
R4R8R12 43±0 >86 AcR4R8R12 64±21 >85
R4R8R14 >86 64±21 AcR4R8R14 >85 >85
R4R10R11 43±21 86±29 AcR4R10R11 85±26 >85
R4R10R12 21±3 39±13 AcR4R10R12 85±0 85±42
R4R10R14 72±14 86±43 AcR4R10R14 85±42 >85
R4R11R12 57±14 86±0 AcR4R11R12 >85 >85
R4R11R14 >86 >86 AcR4R11R14 >85 >85
R4R12R14 >86 >86 AcR4R12R14 >85 >85
R5R7R8 >86 >86 AcR5R7R8 >85 >85
R5R7R10 43±21 86±0 AcR5R7R10 85±35 >85
R5R7R11 86±43 57±14 AcR5R7R11 >85 >85
R5R7R12 43±0 43±0 AcR5R7R12 >85 >85
R5R7R14 >86 32±11 AcR5R7R14 >85 >85
R5R8R10 86±43 86±43 AcR5R8R10 85±26 >85
R5R8R11 57±14 >86 AcR5R8R11 >85 42±0
R5R8R12 21±0 >86 AcR5R8R12 21±0 >85
54
R5R8R14 32±11 >86 AcR5R8R14 16±5 32±11
R5R10R11 86±43 86±29 AcR5R10R11 42±0 85±26
R5R10R12 43±0 57±14 AcR5R10R12 35±7 18±3
R5R10R14 11±0 21±0 AcR5R10R14 19±2 42±40
R5R11R12 77±0 86±25 AcR5R11R12 42±0 21±0
R5R11R14 57±14 43±0 AcR5R11R14 21±0 42±0
R5R12R14 21±0 43±0 AcR5R12R14 11±0 >85
R7R8R10 43±43 43±44 AcR7R8R10 >85 >85
R7R8R11 >86 >86 AcR7R8R11 >85 >85
R7R8R12 >86 64±21 AcR7R8R12 >85 >85
R7R8R14 >86 >86 AcR7R8R14 >85 >85
R7R10R11 57±14 57±14 AcR7R10R11 42±0 85±42
R7R10R12 43±43 43±50 AcR7R10R12 85±0 85±42
R7R10R14 >86±29 >86 AcR7R10R14 >85±28 >85
R7R11R12 54±29 86±0 AcR7R11R12 85±0 >85
R7R11R14 >86 86±29 AcR7R11R14 42±0 >85
R7R12R14 >86 >86 AcR7R12R14 64±21 >85
R8R10R11 43±43 43±50 AcR8R10R11 >85 >85
R8R10R12 21±43 21±38 AcR8R10R12 >85 >85
R8R10R14 >86 >86 AcR8R10R14 >85 >85
R8R11R12 86±29 86±21 AcR8R11R12 >85 >85
R8R11R14 >86 >86 AcR8R11R14 >85 >85
R8R12R14 >86 >86 AcR8R12R14 42±0 >85
R10R11R12 43±43 43±50 AcR10R11R12 64±21 >85
R10R11R14 29±7 29±7 AcR10R11R14 18±4 42±42
R10R12R14 >86 >86 AcR10R12R14 11±0 42±40
R11R12R14 >86 >86 AcR11R12R14 85±42 >85
Tableau 7 – CMI des peptides des séries R5R10 et R4R11
Peptide
CMI
E. coli
(μM)
CMI
S. epidermidis
(μM)
Peptide
CMI
E. coli
(μM)
CMI
S. epidermidis
(μM)
R1R4R11 >86 >86 AcR1R4R11 >85 >85
R3R4R11 86±37 >86 AcR3R4R11 85±40 >85
R4R5R11 54±11 86±21 AcR4R5R11 >85 >85
R4R7R11 54±11 >86 AcR4R7R11 >85 >85
R4R8R11 64±12 >86 AcR4R8R11 >85 >85
R4R10R11 43±21 86±29 AcR4R10R11 85±26 >85
R4R11R12 57±14 86±0 AcR4R11R12 >85 >85
R4R11R14 >86 >86 AcR4R11R14 >85 >85
R1R5R10 21±50 86±29 AcR1R5R10 42±46 >85
R3R5R10 86±43 >86 AcR3R5R10 35±7 >85
R4R5R10 86±43 86±29 AcR4R5R10 56±13 >85
R5R7R10 43±21 86±0 AcR5R7R10 85±35 >85
R5R8R10 86±43 86±43 AcR5R8R10 85±26 >85
R5R10R11 86±43 86±29 AcR5R10R11 42±0 85±26
R5R10R12 43±0 57±14 AcR5R10R12 35±7 18±3
R5R10R14 11±0 21±0 AcR5R10R14 19±2 42±40
55
On peut débuter l’analyse de ces résultats en comparant les peptides ayant une extrémité N-
terminale libre avec ceux ayant cette même extrémité acétylée. La tendance semble
indiquer que les peptides acétylés ont une CMI plus élevée, donc une activité plus faible.
Par contre, il est important de noter que cette tendance n’est pas absolue. Plusieurs
analogues acétylés ont une meilleure activité que leur contrepartie. Comme l’acétylation
retire une charge positive au peptide, il est difficile de comprendre comment un peptide
acétylé aurait une meilleure activité que sa version non-acétylée. L’hypothèse la plus
plausible serait simplement que le groupement acétyle stabilise l’hélice alpha, dans ces
rares cas, assurant ainsi l’activité du peptide.
Ensuite, si l’on compare les deux séries peptidiques, on peut remarquer qu’encore une fois,
la série R5R10 présente une activité significativement plus élevée que la série R4R11, ce
qui appuie les résultats de fluorescence. La différence entre les deux séries peptidiques
n’est par contre pas si importante.
Pour ce qui est de leur structure secondaire, les peptides des séries R5R10 et R4R11 sont
tous majoritairement sous conformation d’hélice alpha dans les vésicules de POPG, qui
miment les membranes procaryotes. Par conséquent, il est difficile de faire un lien entre
l’activité antimicrobienne et la structure secondaire.
On peut aussi remarquer que la majorité des peptides sont plus actifs contre Escherichia
coli que contre Staphylococcus epidermidis. Ceci est certainement attribuable aux
différences de composition des membranes des deux bactéries. Visiblement, la majorité des
peptides ont plus de facilité à briser les membranes d’E. coli que celle de S. epidermidis,
bien que E. coli soit une bactérie Gram négatif. Étant une bactérie Gram négatif, cette
bactérie a une membrane constituée de deux couches lipidiques séparées par une mince
couche de peptidoglycane. L’épaisse couche de peptidoglycane entourant la membrane
unique de S. epidermidis semble la protéger contre l’action des peptides antimicrobiens. Ce
phénomène est visible dans les essais antimicrobiens.
56
Figure 36 – Image des tests antimicrobiens pour S. epidermidis et E. coli, respectivement
En effet, comme on peut le constater à la figure 36, lorsque le peptide atteint sa CMI, E.
coli meurt immédiatement, laissant le puits complètement clair. Par contre, lorsque les
peptides atteignent une concentration plus faible que leur CMI dans l’essai avec S.
epidermidis, les cellules semblent éclater, laissant le puits couvert de débris. Une
concentration plus élevée est nécessaire pour nettoyer complètement le puits et ainsi
atteindre la CMI. Il serait possible de tenter d’expliquer ce phénomène à l’aide de la
configuration des membranes de ces deux bactéries. Comme la membrane d’E. coli est
principalement lipidique, lorsque le peptide atteint la concentration requise pour briser les
membranes, la cellule n’a plus aucun moyen de défense et elle sera détruite très rapidement.
Par contre, une membrane épaisse de peptidoglycane protège S. epidermidis. Lorsque le
peptide atteint une concentration efficace contre cette bactérie, il semblerait que la barrière
de peptidoglycane réussisse à bloquer l’action d’une portion des peptides, réduisant ainsi la
quantité de peptides atteignant la membrane. Le résultat serait alors le patron de lyse partiel
observé dans l’essai. Un test antimicrobien avec une souche de S. epidermidis modifiée où
la couche de peptidoglycane serait amincie ou absente permettrait de confirmer cette
théorie. Il est aussi possible qu’une concentration sous la CMI puisse faire des pores dans la
membrane, mais que la couche de peptidoglycane maintienne l’intégrité de la cellule.
Finalement, si l’on regarde l’entièreté des peptides, on peut observer une très grande
variation des valeurs de CMI. Le peptide le plus actif est l’analogue R1R5R14 (figure 37)
qui a une activité de 4 μM contre E. coli, mais aucune activité détectable contre S.
epidermidis.
57
Figure 37 – Structure du peptide R1R5R14
Ce peptide a été analysé par infrarouge pour connaitre sa structure secondaire dans des
membranes. Le résultat de ces analyses montre une conformation en hélice alpha à 80%
dans POPG et à 56% dans POPC. Si l’on regarde l’amphiphilicité du peptide, on remarque
que l’arginine R5 est du côté des éthers-couronnes et que les deux autres arginines sont aux
deux extrémités. Malgré que les extrémités ne soient pas directement du côté polaire de
l’hélice, l’hypothèse de l’amphiphilicité ne doit pas être réfutée directement puisque les
résidus des extrémités ont beaucoup plus de flexibilité que les autres résidus et pourraient
facilement se décaler légèrement vers la face polaire de l’hélice. Le peptide ayant la
meilleure activité contre S. epidermidis est AcR5R10R12 (figure 38), qui possède une
activité de 35 μM contre E. coli et de 18 μM contre S. epidermidis.
Figure 38 – Structure du peptide AcR5R10R12
Ce peptide est sensiblement moins actif que le R1R5R14, illustrant parfaitement la
sélectivité de nos peptides contre la bactérie Gram négatif. La structure de AcR5R10R12
58
par infrarouge est majoritairement en hélice alpha avec un pourcentage de 90% dans POPG
et de 88% dans POPC. Cette information est confirmée par les résultats de dichroïsme
circulaire du KIT. Encore une fois, l’hélice alpha est liée à l’activité élevée de nos
analogues. Pour ce qui est de l’amphiphilicité, les trois arginines se retrouvent près des
éthers-couronnes résultant en un peptide très amphiphile. Par contre, il est surprenant que le
peptide le plus actif soit acétylé. Sa contrepartie non-acétylée a une activité sensiblement
plus faible semblant indiquer que l’acétylation est importante dans cette situation. Il est
difficile d’expliquer ce résultat autrement qu’en répétant que le groupement acétyle
stabilise sans doute l’hélice alpha.
4.6 - Activité hémolytique
Le test d’activité hémolytique agit comme la contrepartie du test d’activité antimicrobienne.
Ce test a une visée semblable, mais avec un type de cellules totalement différent. En effet,
dans cet essai, on désire avoir le moins possible d’activité puisque les cellules visées sont
les globules rouges humaines. Encore une fois, la totalité des peptides ont été testés en
duplicata (tableaux 8, et 9), mais pour alléger l’analyse, seulement deux séries sont
regardées plus en profondeur.
59
Tableau 8 – Activité hémolytique des 14-mère trisubstitués
Peptide Activité hémolytique (%)
Peptide Activité hémolytique (%)
100 μM 10 μM 1 μM 100 μM 10 μM 1 μM
R1R3R4 1,9±0,5 1±3 2±3 AcR1R3R4 5,3±0,3 4±1 5±3
R1R3R5 0±4 -1±2 -1±1 AcR1R3R5 2±2 4±2 4±4
R1R3R7 6±3 2±1 -1±3 AcR1R3R7 1±1 3±2 2±1
R1R3R8 -2±1 -2,0±0,3 -2±2 AcR1R3R8 -2±1 -2±1 -3±1
R1R3R10 9±3 0,3±0,3 -1±1 AcR1R3R10 6±4 4±3 -1,4±0,4
R1R3R11 -1±1 -0,99±0,02 -0,96±0,02 AcR1R3R11 1±1 -1,1±0,4 -1,1±0,4
R1R3R12 -1±1 -2±2 -1±4 AcR1R3R12 3±7 1±3 -2±2
R1R3R14 0,8±0,1 -0,8±0,5 -0,3±0,5 AcR1R3R14 -3±4 -5±5 -5±4
R1R4R5 -0,4±0,4 3±2 4±1 AcR1R4R5 5±2 5±2 5±1
R1R4R7 0±1 -1,5±0,1 -2,5±0,3 AcR1R4R7 1±1 7±7 1±2
R1R4R8 -2±1 -2±2 -3±2 AcR1R4R8 -2±2 -2±2 -3±1
R1R4R10 1±1 1±1 0,4±0,2 AcR1R4R10 1,2±0,1 0±0,5 -0,9±0,4
R1R4R11 2±2 -1,3±0,5 -1,3±0,5 AcR1R4R11 0,3±0,3 -1,3±0,4 -1,3±0,4
R1R4R12 0±2 -3±2 -3±2 AcR1R4R12 0±2 -2±3 -2±3
R1R4R14 0,9±0,3 -2±1 -1±1 AcR1R4R14 -1±1 -2,7±0,3 -4±1
R1R5R7 2±4 1±2 1±2 AcR1R5R7 -2±2 -1±2 -1±2
R1R5R8 -1±2 -2±1 -3±2 AcR1R5R8 17,9±0,3 -1±2 -1,5±0,2
R1R5R10 6±1 1±2 0,5±0,3 AcR1R5R10 47±14 29±4 3±3
R1R5R11 0,7±0,2 -1,0±0,4 -1,0±0,4 AcR1R5R11 7±2 0±1 0±1
R1R5R12 17±16 2±3 -3±1 AcR1R5R12 61±13 37,7±0,1 22±16
R1R5R14 12±2 1±3 -1±1 AcR1R5R14 52±2 28±13 3±3
R1R7R8 -1±1 -2±1 -1±2 AcR1R7R8 -1,6±0,4 2±4 -1±2
R1R7R10 -0,1±0,4 -0,3±0,5 -1,6±0,2 AcR1R7R10 19±6 0±1 -1±1
R1R7R11 3±3 -1,0±0,4 -1,0±0,4 AcR1R7R11 0,0±0,5 -0,4±0,1 -0,4±0,1
R1R7R12 0±1 -2±2 -2±1 AcR1R7R12 -2±2 -3±2 -3±2
R1R7R14 0±3 -4±4 -5±4 AcR1R7R14 0,4±0,4 5±4 0±1
R1R8R10 -2±1 -1,8±0,4 -2±1 AcR1R8R10 -1±1 -1,9±0,4 -2,2±0,3
R1R8R11 -1,2±0,2 -1±1 -1±1 AcR1R8R11 -0,9±0,4 -1,2±0,2 -1,2±0,2
R1R8R12 5±4 -1±2 0±4 AcR1R8R12 23±11 1±2 -3±2
R1R8R14 -4±4 -5±4 -4±4 AcR1R8R14 0±3 3±10 -4±3
R1R10R11 -1,4±0,5 0±1 -1±1 AcR1R10R11 12±3 -2±1 -1,9±0,3
R1R10R12 11±1 3,6±0,5 1±1 AcR1R10R12 31±6 9±4 -1,2±0,4
R1R10R14 10±3 1±1 2±2 AcR1R10R14 18±3 9±1 2,1±0,1
R1R11R12 -1±1 -0,1±0,5 -0,4±0,3 AcR1R11R12 0,2±0,2 -0,5±0,3 -1±1
R1R11R14 4±2 1,1±0,1 0±1 AcR1R11R14 4±6 2±2 0±1
R1R12R14 -3±4 -3±3 -5±4 AcR1R12R14 -2±4 -4±5 -4±4
R3R4R5 -1±1 0±1 0,2±0,5 AcR3R4R5 4±2 1±2 -1±3
R3R4R7 2±2 1,6±0,2 0±1 AcR3R4R7 6±2 1±3 1±3
R3R4R8 -1,9±0,5 -2±1 -3±2 AcR3R4R8 -2±1 -2±2 -3±1
R3R4R10 1,3±0,1 -0,5±0,1 1±2 AcR3R4R10 9±4 0±1 0±2
R3R4R11 -0,2±0,3 -1,2±0,1 -1,2±0,1 AcR3R4R11 -1±1 -1,3±0,6 -1±1
R3R4R12 1±3 1±3 3±3 AcR3R4R12 -1±3 -1±3 -1±3
R3R4R14 -1±1 -2±1 -1,1±0,3 AcR3R4R14 0±1 0±1 -1,6±0,4
R3R5R7 2±2 2±3 0±3 AcR3R5R7 3±3 2±2 0±3
R3R5R8 -1±2 -1±2 -3±1 AcR3R5R8 -2±2 -2±1 -3±1
60
R3R5R10 2,6±0,4 -0,2±0,3 -0,33±0,01 AcR3R5R10 5±2 2±1 -0,3±0,1
R3R5R11 -0,8±0,4 -1,2±0,5 -1,2±0,5 AcR3R5R11 -0,8±0,6 -1,3±0,3 -1,3±0,3
R3R5R12 35±16 0±3 -3±1 AcR3R5R12 1±3 2±1 -2±2
R3R5R14 1±1 0±1 -1,7±0,4 AcR3R5R14 2±2 -2±1 -1,58±0,01
R3R7R8 2±2 -3±1 -2±1 AcR3R7R8 -2±1 -3±1 -3±1
R3R7R10 7,4±0,8 0,2±0,2 -1±1 AcR3R7R10 14±4 2,7±0,3 -0,6±0,4
R3R7R11 8±2 -1,6±0,4 -1,6±0,4 AcR3R7R11 6,9±0,9 -0,9±0,2 -0,9±0,2
R3R7R12 -1±2 -2±2 -2±3 AcR3R7R12 33±18 -1±3 -3±2
R3R7R14 4±4 -4±4 -6±4 AcR3R7R14 50±4 -3±4 -5±4
R3R8R10 0±1 -2,0±0,4 -2,2±0,4 AcR3R8R10 8±4 -1,7±0,4 -1,9±0,4
R3R8R11 -1±1 -1,5±0,4 -1,5±0,4 AcR3R8R11 4±2 -1,1±0,3 -1,1±0,3
R3R8R12 14±8 0±1 0±4 AcR3R8R12 3±1 3±1 2±3
R3R8R14 0±3 -3±4 -5±4 AcR3R8R14 0±8 -3±2 -5±4
R3R10R11 42±6 -1,9±0,5 -2,3±0,3 AcR3R10R11 42±4 -2,1±0,4 -2,2±0,3
R3R10R12 1,0±0,1 -0,2±0,4 -0,9±0,4 AcR3R10R12 20±9 7±3 -1,5±0,5
R3R10R14 11±3 5±1 0,9±0,2 AcR3R10R14 21±4 2,1±0,1 1±1
R3R11R12 3±1 -0,4±0,3 -1±1 AcR3R11R12 28±7 0±1 0±1
R3R11R14 5,0±0,2 0,5±0,2 0±2 AcR3R11R14 4,8±0,2 0±1 -1±2
R3R12R14 2±3 -3±5 -5±4 AcR3R12R14 9,6±0,3 -1±3 -4±4
R4R5R7 -3,2±0,3 0±2 5±4 AcR4R5R7 -3±3 -3±2 -4±1
R4R5R8 10±11 -2±1 -2±3 AcR4R5R8 -2±1 -3±2 -3±1
R4R5R10 4±1 0±1 0±1 AcR4R5R10 20±7 0±1 -1±1
R4R5R11 -0,6±0,1 -1,3±0,4 -1,3±0,4 AcR4R5R11 -1,0±0,2 -1,4±0,4 -1,4±0,4
R4R5R12 -1±3 -3±2 -3±2 AcR4R5R12 -1±2 -2±3 -2±2
R4R5R14 0±1 -1,6±0,4 -1,1±0,4 AcR4R5R14 -1±2 -2±1 -2±1
R4R7R8 -1±1 -1±2 -3±1 AcR4R7R8 -1±1 -2±1 -3±2
R4R7R10 0,6±0,1 1±1 -0,7±0,1 AcR4R7R10 6±3 0±1 -1,5±0,3
R4R7R11 -1±1 -1,4±0,4 -1,4±0,4 AcR4R7R11 -1,5±0,3 -1,3±0,3 -1,3±0,3
R4R7R12 -1±3 -3±2 -3±2 AcR4R7R12 -1±3 -2±3 -3±2
R4R7R14 2±3 -4±4 -4±4 AcR4R7R14 -2±4 -4±5 -7±4
R4R8R10 -1±1 -2,0±0,4 -2,1±0,3 AcR4R8R10 3±3 -2,3±0,4 -2,4±0,4
R4R8R11 0±1 -1,3±0,4 -1,3±0,4 AcR4R8R11 5±4 -1,4±0,3 -1,4±0,3
R4R8R12 6±3 3±6 -2±3 AcR4R8R12 0±2 -1±2 -2±3
R4R8R14 1±4 -3±4 -4±4 AcR4R8R14 0±4 -4±4 -5±4
R4R10R11 -2±1 -2±1 -2,4±0,3 AcR4R10R11 -1±1 -2,0±0,3 -2,0±0,4
R4R10R12 1,4±0,5 1±1 0±0,3 AcR4R10R12 0±1 -0,9±0,4 -1,1±0,4
R4R10R14 5±1 7±3 0,5±0,2 AcR4R10R14 4±1 0±1 0±1
R4R11R12 -0,4±0,4 -0,2±0,4 -0,4±0,2 AcR4R11R12 -0,5±0,3 -0,9±0,3 -0,8±0,3
R4R11R14 4,0±0,3 0±1 2±2 AcR4R11R14 3,1±0,1 -0,3±0,4 -0,6±0,5
R4R12R14 0±4 -4±4 -5±4 AcR4R12R14 -1±4 -4±4 -5±4
R5R7R8 -1±2 1,3±0,3 -2±1 AcR5R7R8 8±10 -2±3 -3±1
R5R7R10 7±4 -1±1 -2,0±0,4 AcR5R7R10 36±6 -1±1 8±10
R5R7R11 -0,6±0,4 -1,3±0,4 -1,3±0,4 AcR5R7R11 -0,7±0,2 -1,3±0,3 -1,3±0,3
R5R7R12 -2±1 -3±3 -1±4 AcR5R7R12 -2±2 -2±2 -2±2
R5R7R14 0±2 -4±3 -1±2 AcR5R7R14 39±19 -0,2±0,2 -4±3
R5R8R10 19±5 -2±1 -2±0,5 AcR5R8R10 74±12 -1±1 -1,9±0,3
R5R8R11 -0,3±0,3 -1,3±0,3 -1,3±0,3 AcR5R8R11 89±18 -1,4±0,3 -1,4±0,3
R5R8R12 35±11 2±2 -2±3 AcR5R8R12 53±14 9±10 -2±3
R5R8R14 7±5 -4±4 -3±4 AcR5R8R14 12±2 -3±5 -4±4
61
R5R10R11 28±6 -2,2±0,4 -2,4±0,3 AcR5R10R11 66±6 -1±1 -1,4±0,3
R5R10R12 44±13 11±5 -2±1 AcR5R10R12 54±12 15±3 -1,4±0,3
R5R10R14 1±2 4±1 0±1 AcR5R10R14 34±8 11±3 1,49±0,01
R5R11R12 41±2 1,5±0,4 0±1 AcR5R11R12 77±1 5,0±0,3 -0,9±0,3
R5R11R14 1±1 0±1 2±1 AcR5R11R14 3±1 0,5±0,1 -0,9±0,1
R5R12R14 10,3±0,1 -3±5 -4±4 AcR5R12R14 23±1 0±4 -5±5
R7R8R10 -1±1 -1±1 -1,9±0,5 AcR7R8R10 -1±1 -1,9±0,4 -2,1±0,4
R7R8R11 -0,7±0,1 -0,7±0,2 -0,7±0,2 AcR7R8R11 0,4±0,2 -2,0±0,1 -2,0±0,1
R7R8R12 1±2 -2±3 -3±2 AcR7R8R12 0±2 -2±3 -2±3
R7R8R14 1±6 -4±5 -5±4 AcR7R8R14 1±3 -2±3 -3±3
R7R10R11 18±6 -2,1±0,3 -2,2±0,3 AcR7R10R11 12±3 0±1 -1,3±0,4
R7R10R12 0,5±0,5 0±1 -1±1 AcR7R10R12 0,0±0,1 -0,4±0,5 -1,5±0,4
R7R10R14 102±5 75 19±12 AcR7R10R14 67±2 0±1 -0,1±0,1
R7R11R12 0,4±0,2 -0,2±0,2 0±2 AcR7R11R12 -0,5±0,4 -0,9±0,5 -1,96±0,05
R7R11R14 1±1 1±1 0±1 AcR7R11R14 2±1 0±1 0±1
R7R12R14 10±15 -4±4 -5±4 AcR7R12R14 8±13 4±12 0±9
R8R10R11 -2±1 -1,8±0,4 -2,0±0,4 AcR8R10R11 -1±1 -1,7±0,4 -1±1
R8R10R12 1,2±0,1 1±1 -0,2±0,1 AcR8R10R12 -0,5±0,4 -1±1 0±1
R8R10R14 6±4 0±1 0±1 AcR8R10R14 4±3 1±1 0±1
R8R11R12 2±1 -0,3±0,5 -0,65±0,03 AcR8R11R12 -0,2±0,3 0±1 -1,2±0,5
R8R11R14 0±1 1±2 0±1 AcR8R11R14 0±1 1±1 0±2
R8R12R14 3±3 -3±3 -5±4 AcR8R12R14 -4±1 -2±3 -3±3
R10R11R12 1±1 -0,2±0,2 -1,1±0,2 AcR10R11R12 5±2 1±1 -1,2±0,3
R10R11R14 1±1 0±1 -1±1 AcR10R11R14 5±2 0,9±0,5 0±1
R10R12R14 109±1 62±3 9±4 AcR10R12R14 39±8 5±1 0,2±0,4
R11R12R14 5±1 1±1 0,7±0,2 AcR11R12R14 8±7 0±1 -1±1
Tableau 9 – Activité hémolytique des peptides des séries R4R11 et R5R10
Peptide Activité hémolytique (%)
Peptide Activité hémolytique (%)
100μM 10μM 1μM 100μM 10μM 1μM
R1R4R11 2±2 -1,3±0,5 -1,3±0,5 AcR1R4R11 0,3±0,3 -1,3±0,4 -1,3±0,4
R3R4R11 -0,2±0,3 -1,2±0,1 -1,2±0,1 AcR3R4R11 -1±1 -1,3±0,6 -1±1
R4R5R11 -0,6±0,1 -1,3±0,4 -1,3±0,4 AcR4R5R11 -1±0,2 -1,4±0,4 -1,4±0,4
R4R7R11 -1±1 -1,4±0,4 -1,4±0,4 AcR4R7R11 -1,5±0,3 -1,3±0,3 -1,3±0,3
R4R8R11 0±1 -1,3±0,4 -1,3±0,4 AcR4R8R11 5±4 -1,4±0,3 -1,4±0,3
R4R10R11 -2±1 -2±1 -2,4±0,3 AcR4R10R11 -1±1 -2±0,3 -2±0,4
R4R11R12 -0,4±0,4 -0,2±0,4 -0,4±0 AcR4R11R12 -0,5±0,3 -0,9±0,3 -0,8±0,3
R4R11R14 4±0,3 0±1 2±2 AcR4R11R14 3,1±0,1 -0,3±0,4 -0,6±0,5
R1R5R10 6±1 1±2 0,5±0,3 AcR1R5R10 47±14 29±4 3±3
R3R5R10 2,6±0,4 -0,2±0,3 -0,33±0,01 AcR3R5R10 5±2 2±1 -0,3±0,1
R4R5R10 4±1 0±1 0±1 AcR4R5R10 20±7 0±1 -1±1
R5R7R10 7±4 -1±1 -2±0,4 AcR5R7R10 36±6 -1±1 8±10
R5R8R10 19±5 -2±1 -2±0,5 AcR5R8R10 74±12 -1±1 -1,9±0,3
R5R10R11 28±6 -2,2±0,4 -2,4±0,3 AcR5R10R11 66±6 -1±1 -1,4±0,3
R5R10R12 44±13 11±5 -2±1 AcR5R10R12 54±12 15±3 -1,4±0,3
R5R10R14 1±2 4±1 0±1 AcR5R10R14 34±8 11±3 1,49±0,01
62
Avant de commencer à comparer les résultats, il est important de parler de la marge
d’erreur des résultats. En effet, on retrouve une erreur moyenne d’environ 4% pour
l’ensemble des peptides. Par conséquent, les résultats légèrement négatifs devraient être
considérés comme étant une activité nulle.
Maintenant, si l’on compare les analogues acétylés et les non-acétylés, on remarque tout de
suite que les analogues acétylés sont sensiblement plus hémolytiques. Augmenter
l’hydrophobicité du peptide semble affecter grandement son activité contre les globules
rouges. Ensuite, il est intéressant de noter que la série R4R11 n’a aucune activité même
avec ses analogues acétylés. La série R5R10 contient quelques peptides hémolytiques,
principalement à 100 μM. L’amphiphilicité semble donc être un facteur contribuant autant
à l’activité antimicrobienne que l’activité hémolytique, mais l’augmentation de
l’hydrophobicité du peptide du peptide semble augmenter l’activité hémolytique plus
qu’elle augmente l’activité antimicrobienne.
Les deux peptides qui avaient la meilleure activité antimicrobienne : R1R5R14 et
AcR5R10R12, ont respectivement 12% et 54% d’activité hémolytique à 100 μM. Ces deux
peptides étaient tous les deux plutôt amphiphiles. Il n’est donc pas surprenant qu’ils aient
une activité hémolytique significative. De plus, l’analogue AcR5R10R12 étant acétylé, il
n’est pas surprenant qu’il ait une activité hémolytique importante.
Finalement, il est important de mettre en perspective les résultats obtenus. La majorité des
peptides ne sont hémolytiques qu’à 100 μM. Par contre, ces mêmes peptides sont souvent
antimicrobiens à des concentrations beaucoup plus faibles que 100 μM. Si l’on prend
l’exemple du peptide R1R5R14, ce peptide est actif à 4 μM et hémolytique à 12% à 100
μM. Si ce peptide est utilisé à sa valeur de CMI soit 4 μM, il ne sera presque pas
hémolytique.
4.7 - Protection des extrémités
Finalement, le rôle des charges aux extrémités du peptide a été étudié en protégeant les
deux extrémités l’une après l’autre. La protection du N-terminal est plutôt simple. Il suffit
d’acétyler le peptide tandis qu’il est encore sur la résine. Quatre peptides ont été choisis
63
pour leur activité antimicrobienne et hémolytique différente. Comme indiqué dans le
tableau 10, certains sont actifs, sélectifs ou hémolytiques et certains n’ont aucune activité.
Tableau 10 – Effet de la protection du N-terminal sur l’activité antimicrobienne et
hémolytique
Peptide
N-terminal libre N-terminal acétylé
CMI
E. coli
(μM)
CMI
S. epidermidis
(μM)
Activité
Hémolytique
à 100 mM (%)
CMI
E. coli
(μM)
CMI
S. epidermidis
(μM)
Activité
Hémolytique
à 100 mM (%)
R1R4R11 >86 >86 2±2 >85 >85 0,3±0,3
R1R5R14 4±1 >86 12±2 6±1 >85 52±2
R5R10R12 43±0 57±14 44±13 35±7 18±3 54±12
R5R10R14 11±0 21±0 1±2 19±2 42±40 34±8
La protection du N-terminal a déjà été abordée dans d’autres sections et ne sera donc que
résumée ici. Dans la très grande majorité des cas, cette protection n’améliore pas l’activité
antimicrobienne, mais augmente l’activité hémolytique. Bien sûr, comme mentionné plus
haut, des exceptions existent. Cette modification vient masquer la charge positive se
retrouvant sur l’amine terminale, ce qui diminue l’hydrophilicité globale du peptide.
Tableau 11 – Effet de la protection du N-terminal sur la structure déterminée par FTIR
Peptide POPG (%) POPC (%)
Structure majoritaire Pourcentage* (%) Structure majoritaire Pourcentage* (%)
R1R4R11 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
50
Feuillet β
1624± 4 et 1675 ± 5 cm-1
72
R1R5R14 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
80
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
54
R5R10R12 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
89
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
72
R5R10R14 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
71
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
59
AcR1R4R11 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
76
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
46
AcR1R5R14 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
72
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
72
AcR5R10R12 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
90
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
88
AcR5R10R14 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
65
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
81
*Estimé par décomposition spectrale
L’effet de la protection du N-terminal sur la structure secondaire a aussi été analysé par
infrarouge (tableau 11). Comme indiqué dans le tableau précédent, cette modification ne
64
semble pas affecter la structure. Un seul peptide change de structure majoritaire avec la
modification et le faible pourcentage d’hélice du peptide acétylé laisse entendre que
beaucoup de structures sont présentes donc, il est possible que la structure ne change pas
énormément.
La protection du C-terminal est beaucoup plus difficile que la protection du N-terminal. En
effet, comme l’extrémité C-terminale est jointe à la résine, les options de protection sont
limitées. Ces options sont de réaliser la protection en solution après le clivage ou bien
d’utiliser une résine différente qui laisserait l’extrémité C-terminale protégée après le
clivage. La deuxième option a été choisie et la résine Rink amide a été utilisée. Cette résine
laisse l’acide carboxylique protégé en amide après le clivage. Comme cette méthode
nécessite la resynthèse des peptides, seulement les quatre peptides présentés dans le tableau
précédent ont été synthétisés (tableau 12).
Tableau 12 - Rendement et caractérisation par HPLC et spectroscopie de masse des
analogues protégés au C-terminal
Peptide Rendement*
(%)
HPLC SM
Temps
rétention (min)
Pureté#
(%) [M+NH4+3H]
4+
R1R4R11NH2 70 21,969 72 749,9490
R1R5R14NH2 44 28,118 73 749,9453
R5R10R12NH2 61 27,220 70 749,9500
R5R10R14NH2 45 28,656 89 749,9508
* : Rendement estimé par calcul à l’aide du taux de substitution # : Pureté évaluée par HPLC et sous-estimée
Tableau 13 – Effet de la protection du C-terminal sur l’activité antimicrobienne et
hémolytique
Peptide
C-terminal libre C-terminal amide CMI
E. coli
(μM)
CMI
S. epidermidis
(μM)
Activité
Hémolytique
à 100 mM (%)
CMI
E. coli
(μM)
CMI
S. epidermidis
(μM)
Activité
Hémolytique
à 100 mM (%)
R1R4R11 >86 >86 2±2 11±0 21±0 -4±3
R1R5R14 4±1 >86 12±2 5±0 11±0 5±5
R5R10R12 43±0 57±14 44±13 16±5 8±3 1±2
R5R10R14 11±0 21±0 1±2 16±0 5±0 7±5
65
La protection au C-terminal s’est avérée une modification très intéressante comme on peut
le voir au tableau 13. En effet, l’ajout d’un seul groupement a amélioré l’activité
antimicrobienne de tous les peptides. Le peptide R1R4R11, qui n’avait aucune activité
détectable, s’avère un candidat très prometteur lorsque l’extrémité C-terminal est protégée.
De plus, l’activité hémolytique de l’ensemble des peptides a diminué jusqu’à être presque
nulle après l’ajout du groupement protecteur. Cette modification masque la charge négative
naturellement présente au C-terminal et ainsi la charge globale du peptide augmente.
Augmenter la charge nette du peptide améliore l’attraction électrostatique entre le peptide
et la membrane procaryotes, ce qui augmente l’activité antimicrobienne.
Tableau 14 – Effet de la protection du C-terminal sur la structure déterminée par FTIR
Peptide POPG (%) POPC (%)
Structure majoritaire Pourcentage* (%) Structure majoritaire Pourcentage* (%)
R1R4R11 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
50
Feuillet β
1624± 4 et 1675 ± 5 cm-1
72
R1R5R14 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
80
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
54
R5R10R12 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
89
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
72
R5R10R14 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
71
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
59
R1R4R11NH2 Feuillet β
1624± 4 et 1675± 5 cm-1
48
Feuillet β
1624± 4 et 1675± 5 cm-1
68
R1R5R14NH2 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
76
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
58
R5R10R12NH2 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
89
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
69
R5R10R14NH2 Hélice α
1553 ± 4 cm-1
76
Hélice α
1553 ± 4 cm-1
75
*Estimé par décomposition spectrale
Encore une fois, le changement de structure dû à la protection est étudié par FTIR (tableau
14). Le peptide R1R4R11 est toujours le seul à changer de structure, mais il change dans les
vésicules de POPG plutôt que POPC qui changeait avec la modification du N-terminal. Les
changements de structure restent mineurs.
En conclusion, les deux modifications sont très importantes et ont un impact certain. La
modification du N-terminal n’est pas favorable puisqu’elle augmente l’activité hémolytique
en diminuant la charge globale du peptide. La modification au C-terminal est très favorable
66
puisqu’elle augmente l’activité antimicrobienne et diminue l’activité hémolytique. Les deux
modifications ont un impact très léger sur la structure du peptide.
67
Chapitre 5 – Conclusion et travaux futurs
5.1 - Conclusion
En conclusion, plus de 240 analogues du 14-mère ont été synthétisés, caractérisés et
purifiés. Nous avons donc créé une grande librairie contenant toutes les modifications
possibles de trois leucines par des arginines. De plus, l’effet de l’acétylation au N-terminal
a été étudié en synthétisant ces mêmes analogues avec l’extrémité protégée. Plusieurs de
ces peptides ont été caractérisés avec différentes techniques pour tenter d’expliquer la
relation structure-activité et d’étudier les déterminants de l’activité et de la sélectivité. Nous
en avons tiré plusieurs conclusions.
Premièrement, il est important de noter que tous les analogues sont sélectifs. Ceci est
particulièrement visible dans l’étude du relargage de la calcéine par fluorescence où tous
les analogues sont très actifs contre POPG et l’activité contre POPC est de faible à nulle.
Ce même phénomène est aussi visible lorsque l’on compare l’activité antimicrobienne et
l’activité hémolytique, bien que moins flagrant. En effet, les peptides sont en moyenne plus
antimicrobiens qu’hémolytiques. La majorité des peptides ne sont pas hémolytiques du
tout, et ce, même à des concentrations aussi hautes que 100 μM. Maintenant, lorsque l’on
compare les séries peptidiques R5R10 et R4R11, qui sont réputées pour être active et
sélective respectivement, il est important de relativiser. Les analogues des deux séries sont
sélectifs, mais comme la série R5R10 est plus active, elle parait moins sélective. En réalité,
les peptides de ces deux séries sont également sélectifs, mais les peptides R5R10 sont plus
actifs que les peptides R4R11.
Deuxièmement, en comparant les résultats des deux séries R4R11 et R5R10 pour les études
de fluorescence et d’activité antimicrobienne principalement, on peut remarquer que
l’amphiphilicité semble avoir un rôle très important. La série R5R10 est beaucoup plus
amphiphile que la série R4R11, qui a au moins deux résidus à l’opposé des éthers-
couronnes et semble sensiblement plus active. Une amphiphilicité élevée peut favoriser
l’approche et l’incorporation du peptide à la membrane procaryotes chargée négativement.
Ce qui viendra augmenter l’activité.
68
Troisièmement, les modifications des extrémités ont un impact important sur l’activité. La
tendance semble être que les changements augmentant la charge globale du peptide sont
favorisés. Cette conclusion est appuyée par les résultats de mes prédécesseurs qui
indiquaient que les trisusbstitués seraient plus actifs que les mono et les bisubstitués. Par
conséquent, la protection du C-terminal est favorable et la protection du N-terminal est
défavorable pour l’activité du peptide.
Quatrièmement, notre approche de modifications systématiques a produit beaucoup
d’analogues ne différant que par la position d’un acide aminé. Il est très difficile de prédire
quel sera l’impact du changement de la position d’un seul acide aminé. L’amphiphilicité est
le seul indice que nous possédons. Selon cet indice, nous pouvons conclure que les
positions 3, 5, 10 et 12 seraient des positions favorables pour y placer des acides aminés
positifs. Les positions 4, 7, 8 et 11 seraient, quant à elles, des positions idéales pour un
acide aminé hydrophobe. Finalement, les positions 1 et 14 seraient des positions plus
flexibles pouvant être un ou l’autre des acides aminés. Par contre, il semblerait que d’autres
facteurs inconnus entrent en compte puisque tous les peptides ne respectent pas ces règles.
Cinquièmement, à la lumière des résultats présentés dans ce mémoire, il est très difficile de
proposer un mécanisme d’action pour nos molécules. En effet, les études de SR-OCD de
seulement quatre analogues tentent pointer vers des orientations, et incidemment, des
mécanismes différents. Il est probable que la structure secondaire et peut-être même
l’amphiphilicité influencent grandement le mécanisme d’action du peptide.
En conclusion, beaucoup de peptides ont des activités prometteuses, mais deux analogues
se distinguent du lot. Le peptide AcR5R10R12 a une activité de 35 μM contre E. coli, mais
seulement 18 μM contre S. epidermidis. Le peptide R1R5R14 n’a aucune activité détectable
contre S. epidermidis et une activité record de 4 μM contre E. coli. L’activité de ce dernier
est très prometteuse et rivalise même avec certaines molécules sur le marché. Ces deux
analogues ont une activité très intéressante et plus d’études sur ces analogues nous
donneraient plus d’information sur leur fonctionnement.
69
5.2 - Travaux futurs
Malgré la grande quantité de peptides synthétisés et d’analyses réalisées, beaucoup
d’expériences restent à faire. En effet, beaucoup d’analyses supplémentaires peuvent être
menées sur les peptides discutés dans ce mémoire pour approfondir nos connaissances de la
relation structure-activité de ces analogues. Sinon, d’autres analogues peuvent toujours être
synthétisés pour obtenir plus d’information sur les peptides antimicrobiens.
Premièrement, comme ces peptides sont des analogues de peptides antimicrobiens, il serait
intéressant de tester l’activité antimicrobienne des meilleurs analogues contre des bactéries
pathogènes résistantes. Par définition, ces bactéries ont développé des mécanismes de
défense leur permettant de survivre à l’agression de plusieurs molécules disponibles sur le
marché. Les pathogènes que nous pourrions tester seraient E. coli O157H7, SARM, ERV,
C. difficile, pour en nommer quelques-uns. Si les peptides sont actifs contre ces pathogènes,
soit dans les conditions où les peptides antimicrobiens sont réellement utilisés, ceci
ajouterait beaucoup de crédibilité aux résultats faits avec les bactéries modèles.
Deuxièmement, il serait intéressant de vérifier l’activité des analogues contre d’autres
pathogènes que des bactéries. Par exemple, certains peptides antimicrobiens ont une
activité antifongique, antivirale ou encore une activité contre les biofilms. Si nos peptides
avaient une de ces activités, ceci leur donnerait une valeur ajoutée.
Troisièmement, étant donné la piètre qualité de nos spectres de dichroïsme circulaire, il
serait pertinent de reprendre ces analyses pour réussir à déterminer la structure secondaire
de nos molécules dans un environnement moins concentré.
Quatrièmement, les études qui ont été réalisées nous donnent peu d’information sur le
mécanisme d’action de nos peptides. Il serait intéressant d’analyser au minimum les deux
séries peptidiques R4R11 et R5R10 par dichroïsme circulaire orienté pour obtenir
l’orientation de nos peptides dans les membranes et tenter d’expliquer le mécanisme
d’action. D’autres études comme le REDOR ou la RMN du 31
P pourraient aussi fournir de
l’information intéressante sur les membranes en contact avec les peptides.
70
Cinquièmement, un des avantages probables qu’aurait un peptide antimicrobien basé sur
nos molécules serait la stabilité. En effet, il est fort probable que les acides aminés éthers-
couronnes bloquent l’action des protéases, protégeant ainsi le peptide de la protéolyse. Par
contre, ceci n’est qu’une hypothèse, il serait pertinent de confirmer cette théorie pour
donner plus de valeur à notre modèle de peptide antimicrobien.
Finalement, toujours plus d’analogues peuvent être synthétisés. Les analogues ayant
l’extrémité C-terminale protégée semblent être très prometteurs et il serait intéressant d’en
synthétiser une plus grande librairie. Sinon, des peptides ayant quatre leucines substituées
par des arginines pourraient avoir une meilleure activité, si celles-ci sont placées de façon à
maintenir l’amphiphilicité du peptide. Il serait aussi intéressant de tester l’effet qu’aurait la
substitution des leucines par un autre acide aminé hydrophobe comme la glycine,
l’isoleucine ou même la phénylalanine.
71
Chapitre 6 - Partie expérimentale
6.1 - Remarques générales
Les réactifs utilisés pour la synthèse peptidique, soit les acides aminés, la résine de Wang,
la résine rink-amide le 6Cl-HOBT, le DMF, le HCTU, le TFA ainsi que certains réactifs
utilisés dans la synthèse de l’acide aminé éther-couronne comme le Boc2O et le Fmoc-OSu
proviennent de chez Matrix Innovation (Québec, QC). L’hexaéthylène glycol, aussi utilisé
dans la synthèse de l’acide aminé éther-couronne, provient de chez Alfa Aesar (Ward Hill,
MA) et la L-DOPA provient de chez Laboratoire Mat (Québec, QC). Les phospholipides
utilisés en infrarouge, fluorescence et en dichroïsme circulaire proviennent de Avanti Polar
Lipids (Alabaster, AL). Les autres solvants ou réactifs proviennent de fournisseurs
généraux comme Sigma-Aldrich (Oakville, ON) ou VWR (Mississauga, ON).
Les différents solvants utilisés dans les synthèses sont tous traités ou purifiés. Le
dichlorométhane est distillé, le diméthylformamide est dégazé à l’azote, l’eau est déionisée
et distillée, le tétrahydrofurane anhydre est distillé sur sodium/benzophénone et finalement
le méthanol anhydre est distillé sur CaH2.
Les spectres RMN 1H ont été enregistrés avec un appareil Varian Inova 400 de Agilent
Technologies (Mississauga, ON). Le standard interne est le pic résiduel du solvant et les
solvants utilisés proviennent de C/D/N Isotopes (Pointe-Claire, QC). Les abréviations
utilisées pour la caractérisation des spectres RMN sont : s = singulet, d = doublet,
t = triplet, bs = large singulet et m = multiplet. Les spectres infrarouge utilisés pour la
caractérisation des précurseurs de l’acide aminé éther-couronnes ont été enregistrés avec un
appareil Bomen Arid-Zone MB-Series de ABB Bomem (Québec, QC) avec des cellules de
NaCl. Les abréviations utilisées pour la caractérisation des spectres FTIR sont : s = forte,
m = moyenne. Les mesures du pouvoir rotatoire sont enregistrées avec un appareil Jasco
DIP-360 de Jasco Analytical Instruments (Easton, MD).
Les spectres de masse ont été enregistrés sur un appareil LC-MS-TOF constitué d’un HPLC
LC 1200 series en pair avec un MS Time-of-flight 6210, tous deux d’Agilent Technologies.
L’injection directe est réalisée sans séparation avec un mélange de solvant H2O/MeOH
72
25% contenant 0,1% de formate d’ammonium à un débit de 0,2 mL/min. La source
d’ionisation est un électronébuliseur « Dual ESI ».
Les analyses HPLC ont été effectuées sur un appareil de chromatographie liquide 1260
Infinity d’Agilent Technologies avec une colonne à phase inverse C18 Vydac 218TP54. Le
débit est de 1 mL/min et un gradient de solvants sur 45 minutes est utilisé. Trois éluants
sont employés soit l’eau qui passe de 90% à 5% au cours de l’analyse, l’isopropanol qui
passe de 5% à 50% et l’acétonitrile qui passe de 5% à 50%. Tous les éluants contiennent
0,1% de TFA.
Les analyses de dichroïsme circulaire, faites par notre groupe, ont été réalisées sur un
appareil Jasco J-815 de Jasco Analytical Instrument. Les analyses de fluorescence ont été
réalisées avec un appareil Varian Cary Eclipse de Agilent Technologies. Pour les
expériences de détermination de structure secondaire par spectroscopie infrarouge, le
spectromètre Nicolet Magna 560 de Thermo Scientifics a été employé.
Les solutions mères de peptides ont été conservées au congélateur. Pour les analyses de
fluorescence, d’infrarouge, les tests hémolytiques et les tests antimicrobiens, les solvants
utilisés sont de grade HPLC et l’eau utilisée est nanopure (eau déionisée et purifiée avec un
appareil Barnsted Nanopure II et les filtres OS1801, MB1801, SB1801 et CO1801).
6.2 - Synthèse de l’acide aminé éther-couronne
6.2.1 - Bromation de l’hexaéthylène glycol
Deux équivalents de triphénylphosphine sont dissous dans environ 300 mL d’acétonitrile
anhydre sous atmosphère d’azote. Le mélange réactionnel est refroidi à 0 °C puis, deux
équivalents de dibrome sont ajoutés goutte à goutte sur une période de 45 minutes. Par la
suite, un équivalent d’hexaéthylène glycol dissous dans environ 50 mL d’acétonitrile est
ajouté goutte à goutte. La solution est ensuite ramenée à température pièce et agitée
pendant 48 h. La réaction est suivie par chromatographie sur couche mince pendant ce 48 h.
Lorsque la réaction est complétée, un précipité devrait s’être formé, celui-ci devra être filtré
sous vide. Évaporer le filtrat jusqu’à l’obtention d’une huile. Par la suite, il faudra extraire
73
le dibromure d’hexaéthylène glycol avec plusieurs fractions d’hexanes. Les extractions sont
ensuite répétées tant qu’une quantité appréciable d’huile est récupérée. Chaque extrait sera
caractérisé par RMN 1H et spectroscopie infrarouge et les fractions les plus pures seront
conservées et combinées. La synthèse a été effectuée avec 25 g d’hexaéthylène glycol.
Masse obtenue : 27,14 g
Rendement : 75 %
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ 3,43 (t, J = 6,4 Hz, 4H, OCH2CH2Br), 3,62 (m, 16H, OCH2),
3,76 (t, J = 6,4 Hz, 4H, CH2Br) ppm.
IR (NaCl): 2870 (s, élongation CH), 1440 (m, déformation CH), 1350 (m, déformation
CH), 1275 (m, déformation CH), 1120 (s, élongation CO) cm-1
Caractérisation complète : Voyer 199172
6.2.2 - Estérification de la L-DOPA
Le méthanol en préparé en le distillant sur CaH2 et 250 mL de méthanol sont placés dans un
ballon de 500 mL surmonté d’une ampoule à additionner et une sortie de CaCl2. Le ballon
est alors refroidi à 0 °C et 2,5 équivalents de SOCl2 sont ajoutés goutte à goutte à l’aide de
l’ampoule à additionner. Toujours à 0 °C, 1 équivalent de L-DOPA est ajouté par petites
fractions. Le mélange réactionnel est ensuite agité à température pièce pour 24 h. Lorsque
la réaction est complétée, le méthanol est évaporé puis, le solide obtenu est trituré à l’éther
froid jusqu’à ce que l’éther soit incolore. Ensuite, le solide est séché sur la rampe à vide et
caractérisé par RMN 1H et sont pouvoir rotatoire est déterminé. La synthèse a été effectuée
sur 60 g de L-DOPA.
Masse obtenue : 75,9 g
Rendement : déterminé à la prochaine étape
: + 9,11 (c 1,04, MeOH)
74
RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2,86-2,92 (m, 2H, CH2β), 3,65 (s, 3H, OCH3), 4,10 (bs,
1H, CHα), 6,39 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H6 aromatique), 6,54 (s, 1H, H2 aromatique), 6,63 (d,
J = 8,3 Hz, 1H, H5 aromatique), 8,44 (s, 3H, NH3+), 8,90 (bs, 2H, OH) ppm.
Caractérisation complète : Lemaire 200773
6.2.3 - Protection de la L-DOPA méthylée avec le groupement BOC
La L-DOPA-OMe non purifiée obtenue de l’étape précédente est dissoute dans la quantité
nécessaire de THF anhydre. La solution est ensuite refroidie à 0 °C et 1 équivalent de
triéthylamine est ajouté sur 15 minutes en agitant. L’agitation est poursuivie cinq minutes
avant de passer à l’addition goutte à goutte de 1 équivalent de Boc2O dilué dans le THF. La
solution est agitée pendant 24 h à température pièce en suivant la réaction par CCM.
Lorsque la réaction est terminée, le précipité est filtré, le THF est évaporé et le produit est
dissous dans le DCM. Par la suite, plusieurs lavages sont effectués, soit deux lavages à
l’acide chlorhydrique 0,5 N et deux lavages à l’eau. La phase organique est séchée sur
MgSO4 et le solvant est évaporé. Le produit solide est alors trituré à l’éther de pétrole et à
l’éther de pétrole/éther 1 : 1. Finalement, le produit est caractérisé par RMN 1H et sont
pouvoir rotatoire est déterminé.
Masse obtenue : 58,5 g
Rendement pour les étapes 6.2.2 et 6.2.3 : 62 %
: +5,94° (c = 1,02 g/100 mL, MeOH)
RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 1,29 (s, 9H, (CH3)3C-), 2,62-2,71 (m, 2H, CH2β), 3,54
(s, 3H, OCH3), 4,00 (m, 1H, CHα), 6,40 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H6 aromatique), 6,53-6,57 (m,
2H, H2 et H5 aromatique), 7,11 (d, J = 7,9 Hz, 1H, NH), 8,69 (bs, 2H, OH) ppm.
Caractérisation complète : Lemaire 200773
75
6.2.4 – Macrocyclisation
Une quantité de 21,0 g de Boc-L-DOPA-OMe et un équivalent de Cs2CO3 sont dissous
dans 1 L de DMF bullé sous atmosphère d’azote. Un équivalent de dibromure
d’hexaéthylène glycol dissout dans 200 mL de DCM est ajouté goutte à goutte sur 2 h. Le
mélange est agité pendant 24 h avec agitation mécanique sous atmosphère d’azote à 60 °C.
La progression de la réaction est suivie par CCM. Lorsqu’elle est terminée, de l’eau et du
DCM sont ajoutés pour faire une extraction avec un mélange eau/DCM/DMF (1 : 1 : 1). La
phase organique, contenant le produit, est lavée à l’eau pour se débarrasser du DMF puis,
séchée sur MgSO4. Cette même phase est ensuite évaporée puis dissoute dans 300 mL de
DCM. Trois lavages avec une solution de NaCl saturée sont ensuite effectués et sont suivis
d’un autre lavage à l’eau. La phase organique est ensuite séchée sur MgSO4. Le DCM est
ensuite évaporé jusqu’à avoir une huile brune. Celle-ci sera purifiée par chromatographie
sur colonne de silice avec un éluant de méthanol dans le chloroforme de 1 à 10%. Les
fractions contenant le produit seront ensuite évaporées et caractérisées par RMN 1H.
Masse obtenue : 24,3 g
Rendement : 66 %
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ 1,28 (m, 9H, (CH3)3C-), 3,12 (m, 2H, CH2β), 3,47- 3,71 (m,
24H, -OCH2), 4,00 (t, J = 4,8 Hz, 4H, -PhOCH2CH2), 4,08 (t, J = 4,8 Hz, 4H, -PhOCH2),
6,67-6,79 (m, 3H, H aromatique) ppm.
Caractérisation complète : Voyer 199172
76
6.2.5 - Saponification de l’éther-couronne
La Boc-21-C-7-L-Phe-OMe est dissoute dans un minimum de méthanol puis, refroidie à
0 °C. Par la suite, le bain de glace sera retiré et 2,4 équivalents de NaOH 1 M seront
ajoutés. La solution sera agitée 2 à 3 heures à température pièce. Au terme de cette période,
la solution aqueuse sera lavée avec de l’éther diéthylique. Le pH de la phase aqueuse sera
ensuite amené à environ 4, un précipité devrait apparaitre. Le produit est ensuite extrait
avec du DCM et la phase organique est séchée avec du MgSO4. Le solvant est finalement
évaporé et le produit est caractérisé par RMN H1 et sont pouvoir rotatoire est déterminé.
Masse obtenue : 16,3 g
Rendement : 67 %
: + 11,46 (c 1,70, MeOH)
RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 1,28 (s, 9H, (CH3)3C-), 2,85-2,89 (m, 2H, CH2β), 3,46-
3,71 (m, 17H, -OCH2), 3,96-4,00 (m, 4H, -PhOCH2CH2), 6,68-6,98 (m, 3H, H aromatique)
ppm.
Caractérisation complète : Voyer 199172
77
6.2.6 - Déprotection du BOC
La Boc-21-C-7-L-Phe-OH est dissoute dans un minimum de DCM, soit environ 200 mL.
La solution est refroidie à 0 °C avant d’ajouter un mélange 50 : 50 V/V de DCM/TFA
environ en même quantité que le DCM. La réaction sera agitée pendant 2 h à température
pièce et suivie par CCM. Lorsque la réaction est complétée, le solvant est évaporé. Des
coévaporation à l’éther diéthylique peuvent s’avérer nécessaires. Le produit est trituré à
l’éther froid puis séché sur la rampe à vide avant d’être caractérisé par RMN 1H.
Masse obtenue : 13,9 g
Rendement : 83 %
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ 3,45-3,71 (m, 20H, -OCH2), 4,01-4,12 (m, 1H, CHα) 6,68-
6,91 (m, 3H, H aromatique) ppm.
Caractérisation complète : Voyer 200759
6.2.7 - Protection de l’acide aminé éther-couronne par un groupement Fmoc
Le H-21-C-7-L-Phe-OH est dissout dans environ 100 mL d’acétonitrile/eau 9 : 1. Ensuite,
1,2 équivalents de Fmoc-O-Su et 3 équivalents de DIEA sont ajoutés. La réaction est agitée
2 à 3 heures et suivie par CCM. À la fin de la réaction, le solvant est évaporé et le produit
78
est dissous dans du DCM. La phase organique est lavée deux fois au HCl 1N et deux fois à
l’eau, ces lavages sont repris deux autres fois. La phase organique est séchée sur MgSO4 et
évaporée. Finalement, le produit est purifié en triturant à l’éther diéthylique et séché sur la
rampe à vide avant d’être caractérisé par RMN 1H et de prendre le pouvoir rotatoire.
Masse obtenue : 14,8 g
Rendement : 91 %
Rendement total de la synthèse de l’acide aminé éther-couronne: 26 %
: - 2,26 (c 1,16, MeOH)
RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2,94 (d, J = 5,0 Hz, 1H, CH2β), 3,44-3,67 (m, 25H,
OCH2), 3,98 (m, 4H, -PhOCH2CH2), 4,17 (m, 4H, -PhOCH2), 4,60-4,65 (m, 1H, CHα),
6,70-6,88 (m, 3H, H aromatique EC), 7,25-7,89 (m, 6H, H aromatique du Fmoc) ppm.
Caractérisation complète : Voyer 200759
79
Figure 39 – Spectre RMN 1H du Fmoc-21-C-7-L-Phe-OH
6.3 - Synthèse peptidique sur support solide
6.3.1 - Couplage du premier acide aminé
Comme le premier couplage demande un peu plus de temps, cette étape est souvent faite
sur une grande quantité de résine puis, l’excédent de résine est conservé pour une prochaine
utilisation.
La quantité voulue de résine est placée dans une seringue à synthèse peptidique et gonflée
dans du DCM puis, placée au congélateur pendant que la résine refroidit, trois équivalents
du premier acide aminé et trois équivalents de HOBt seront placés dans un ballon, dissous
dans du DMF, puis amené à 0 °C. Trois équivalents de DIC, 0,1 équivalent de DMAP et 4
80
équivalents de DIEA sont ensuite ajoutés au ballon. Le DCM de la seringue est ensuite vidé
et la solution activée est ajoutée. La seringue est agitée mécaniquement à température
ambiante pendant trois heures. Par la suite, la résine est lavée trois fois au DMF, trois fois
au MeOH, trois fois au DMF et finalement trois fois au MeOH. La résine est ensuite séchée
sous vide.
6.3.2 - Détermination du taux de substitution
Dans une fiole jaugée de 50 mL, 25 mg de résine et 10 mL d'une solution 2% DBU/DMF.
Ensuite, il suffit de laisser agir la suspension de résine pendant 30 minutes en agitant de
temps à autre. Après ce délai, la fiole jaugée est complétée à 50 mL avec de l’acétonitrile.
Puis, 1 mL de cette solution est transféré dans une fiole jaugée de 10 mL qui est ensuite
complété à la ligne de jauge avec de l'acétonitrile. Pour assurer la validité des résultats,
cette analyse est effectuée en duplicata, et une solution de référence est préparée en absence
de résine. Pour déterminer le taux de substitution, il suffit de lire l’absorbance à 294 nm et
304 nm dans une cellule de quartz et de faire les calculs suivants :
Taux de substitution (mmol/g) = Absorbance à 294 nm x 2,2742
Taux de substitution (mmol/g) = Absorbance à 304 nm x 2,6234
Le taux de substitution de la résine est calculé en faisant la moyenne des deux valeurs et
des duplicatas.
6.3.3 - Acétylation des sites non-substitués
Pour acétyler les sites non-substitués de la résine, celle-ci est gonflée au DMF puis, une
solution 50:50 V/V d'anhydride acétique : DMF et trois équivalents de DIEA sont ajoutés à
la seringue. La seringue est agitée pendant une heure avant de filtrer pour retirer la solution
de la seringue puis réaliser les lavages d’usages soit trois fois au DMF, trois fois au MeOH,
trois fois au DMF et quatre fois au MeOH avant de sécher la résine sur la rampe à vide.
6.3.4 - Déprotection de la fonction amine du dernier acide aminé fixé
La résine est gonflée au DMF et une solution 20% V/V pipéridine : DMF est ajoutée à la
seringue. La seringue est agitée mécaniquement pendant dix minutes. Filtrer pour retirer la
solution puis reprendre la déprotection. Au terme du deuxième dix minutes, filtrer pour
81
enlever la solution puis laver la résine trois fois au DMF, trois fois au MeOH et trois fois au
DMF.
6.3.5 - Couplage de l'acide aminé suivant
La résine est gonflée au DMF si elle ne l’est pas déjà. Peser trois équivalents de l’acide
aminé à coupler, trois équivalents de 6Cl-HOBt et trois équivalents de HCTU puis,
dissoudre le tout dans du DMF. Quatre équivalents de NMM sont ajoutés au mélange. La
solution activée est ensuite placée dans la seringue. La seringue est alors agitée
mécaniquement à température ambiante pendant une heure. Au terme de l’heure de
couplage, la solution est retirée par filtration puis, la résine est lavée trois fois au DMF,
trois fois au MeOH, trois fois au DMF et trois fois au MeOH avant d’être séchée sous vide.
6.3.6 - Test de Kaiser qualitatif
Pour vérifier que le couplage soit bien complet, quelques grains de résine lavés et séchés
après un couplage sont placés dans une éprouvette. Trois solutions sont ensuite ajoutées :
40 µL d'une solution 5% V/V ninhydrine/éthanol, 50 µL d'une solution 25% V/V
butanol/phénol et 100 µL d'une solution 50% V/V KCN/pyridine. Par la suite, il suffit de
chauffer dix minutes à 100 °C et d’observer s'il y a apparition d'une coloration bleue. Si la
solution tourne au bleu, le couplage devra être repris comme indiqué à la section 6.3.5. Si la
solution reste jaunâtre, on pourra alors procéder à la prochaine déprotection (6.3.4) puis au
couplage suivant (6.3.5).
6.3.7 – Séparation et acétylation
À la fin de la synthèse, avant de procéder au clivage, il faut séparer la résine sèche en deux
parties égales. Une des moitiés est déprotégée (6.3.4) puis clivée (6.3.8). L’autre portion de
la résine est déprotégée (6.3.4), acétylée (6.3.3) et finalement clivée (6.3.8). De cette façon,
deux versions du peptide sont obtenues, une avec une extrémité N-terminale libre et l’autre
avec une extrémité N-terminale acétylée.
6.3.8 - Clivage des analogues de la résine de Wang
La résine est gonflée au DMF puis le peptide est déprotégé (6.3.4) une dernière fois. La
résine est gonflée au CH2CI2. Une solution 95:2,5:2,5 TFA:H2O:TIS est ajouté à la seringue
82
et la solution est agitée pendant quatre heures pour permettre la déprotection des chaînes
latérales des arginines. La solution est récupérée dans un ballon de 50 mL puis, le plus de
TFA possible est évaporé, il peut être nécessaire de coévaporer à l’éther. Le produit obtenu
est purifié en triturant au moins trois fois à l'éther. Sécher les produits et lyophiliser le
peptide dans l’acide acétique.
6.4 - Purification HPLC
Certains peptides sont purifiés par chromatographie liquide. Pour ce faire, environ 15 mg
du peptide à purifier sont dissous dans le minimum de méthanol, soit environ 300 μL. La
solution est placée dans un vial avec un insert. La solution est injectée en trois injections de
100 μL chacun. Le pic correspondant au peptide d’intérêt est récolté manuellement. Pour
récupérer le peptide l’éluant est évaporé et le peptide est lyophilisé dans l’acide acétique.
Les paramètres utilisés sont les suivants :
HPLC : 1260 infinity d’Agilent Technologies
Colonne : Vydac C18 218TP152022
Éluant : A : Eau 0,1% TFA; B : isopropanol 0,1% TFA; C : acétonitrile 0,1% TFA
Gradient : 90% A, 5% B et 5% C vers 0% A, 50% B et 50% C en 50 minutes puis,
étape isocratique pour 20 minutes (cycle complet 72 minutes).
Débit : 5 mL/min
Volume d’injection : 100 μL
6.5 - Caractérisation HPLC
La caractérisation HPLC est réalisée en dissolvant 0,5 mg de peptide dans environ 1 mL de
méthanol. La solution est injectée et la pureté est évaluée en regardant l’aire sous la courbe
du pic correspondant au peptide. Les paramètres utilisés sont les suivants :
HPLC : 1260 Infinity d’Agilent Technologies
Colonne : Phase inverse C18 Vydac 218TP54
Éluant : A : Eau 0,1% TFA; B : isopropanol 0,1% TFA; C : acétonitrile 0,1% TFA
Gradient : 90% A, 5% B et 5% C vers 0% A, 50% B et 50% C en 45 minutes puis,
étape isocratique pour 5 minutes (cycle complet 52 minutes).
Débit : 1 mL/min
83
Volume d’injection : 20 μL
6.6 - Étude fluorimétrique du relargage de la calcéine
6.6.1 - Préparation des vésicules
Deux tampons sont nécessaires pour préparer les vésicules pour les essais de fluorescence.
Premièrement, 500 mL de « tampon externe » contenant 100 mM d’HEPES, 5 mM
d’EDTA et 200 mM de NaCl sont préparés. Ensuite, 5 mL de « tampon interne » contenant
100 mM d’HEPES, 5 mM d’EDTA et 80 mM de calcéine ont aussi été préparés. Les lipides
(POPC ou POPG) sont pesés et 15 mg de lipide sont mélangés à 1 mL de « tampon
interne ». La solution est vortexée, puis cinq cycles gel-dégel sont réalisés. L’extrudeur
d’Avanti Polar Lipids est utilisé pour uniformiser la taille des vésicules, 15 passages
d’extrudeur sur un filtre 0,4 μM sont nécessaires. Les vésicules sont ensuite purifiées
réalisant une chromatographie d’extrusion, Sephadex G-25, en utilisant le « tampon
externe » comme éluant.
6.6.2 - Test de Bartlett
Le test de Bartlett est utilisé pour déterminer la concentration de nos vésicules.
Premièrement, les standards sont préparés en ajoutant 0, 10, 20, 35, 50, et 70 μL
respectivement dans des éprouvettes 16 mm par 100 mm. Les éprouvettes sont complétées
avec le volume nécessaire pour obtenir un volume total de 100 μL. Tant qu’à eux, les
échantillons sont préparés en ajoutant 50 μL de vésicules et 50 μL d’eau à des éprouvettes
de 16 mm par 100 mm. Les échantillons sont réalisés en triplicata. 0,45 mL d’une solution
de H2SO4 (3,25 mM de H2SO4 sec dans du HCl 0,05 N) est ajouté à toutes les éprouvettes.
Ensuite, tous les tubes sont chauffés sous la hotte à 200 °C pour une période de 25 minutes.
Après avoir laissé les tubes refroidir cinq minutes, ajouter 50 μL de peroxyde d’hydrogène
à l’ensemble des tubes. Un deuxième chauffage à 200 °C pour 30 minutes est ensuite
requis. Si les solutions sont encore brunes, ajouter 50 μL de peroxyde d’hydrogène puis
chauffer de nouveau. Par la suite, ajouter 3,9 mL d’eau et 0,5 mL de la solution de
molybdate d’ammonium (2,5% m/V dans l’eau) et vortexer les tubes. Ajouter 0,5 mL de la
solution d’acide ascorbique (10% m/V dans l’eau) vortexer de nouveau. Les tubes sont
84
chauffés une dernière fois pendant 7 minutes à 100 °C. Finalement, l’absorbance UV est lue
à 820 nm et la concentration des vésicules est calculée en créant une courbe d’étalonnage.
6.6.3 - Test de perméabilité membranaire
Le tampon externe (6.6.1) est utilisé pour faire le zéro du spectromètre. Chaque échantillon
est préparé en mettant 3 mL de tampon externe et 180 μL de vésicules. Attendre une minute
que la solution se stabilise et débuter l’expérience. Au t = 50 s, la quantité de peptides
nécessaire pour obtenir un ratio peptide : lipide de 1 : 60 est ajoutée au tube. Au t = 550 s,
ajouter 10 μL de Triton X-100 10% pour lyser les vésicules encore intactes en solution. Le
spectre obtenu est finalement enregistré. Les paramètres utilisés sont les suivants :
Spectromètre : Variant Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer
Programme : Kinetics
Temps : 600 secondes
Longueur d’onde d’excitation : 490 nm
Longueur d’onde d’émission : 513 nm
Fente : 5 mm
Température : 25 oC
Sensibilité : 435 V pour POPG, 440 V pour POPC
6.7 - Détermination de la structure secondaire par spectroscopie infrarouge
6.7.1 - Préparation des échantillons
Le TFA peut nuire aux lectures, donc les manipulations débutent en lyophilisant les
peptides cinq fois dans une solution de HCl 10 mM pour éliminer le TFA résiduel. Ensuite,
7 mg de phospholipides (POPC ou POPG) sont prélevés et l’entièreté des peptides est
solubilisée dans un mélange 50% V/V CHCl3/MeOH. La quantité de peptides requise pour
obtenir un ratio peptide : lipide 1 : 60 est ensuite prélevée et mélangée aux lipides. Le
solvant est finalement évaporé sous jet d’azote et les échantillons sont lyophilisés pendant
12 heures pour éliminer les dernières traces de solvant. Au moment de l’analyse, les
échantillons sont hydratés avec un tampon deutéré de manière à obtenir un taux
d’hydratation de 80 ou 90 % m/m sous atmosphère inerte (argon). Les échantillons
subissent ensuite cinq cycles gel-dégel (vortex-gel-chauffage 37 ºC) se terminant avec un
85
gel plus retour à la température ambiante. Du scellant (une part de CHCl3 pour une part
d’huile minérale) est ensuite appliqué sur le pourtour de la cellule. L’échantillon est prélevé
avec une pipette volumétrique et déposé sur la fenêtre de CaF2. Le spectre peut maintenant
être enregistré en suivant les recommandations du fabriquant.
6.7.2 - Traitement des spectres
Une fois les spectres enregistrés, le traitement se fait de la façon suivante. Premièrement, il
faut soustraire un spectre de vapeur d’eau au spectre brut à l’aide de la fonction « Spectral
Substract ». Par la suite, soustraire un spectre de tampon au spectre obtenu, toujours avec la
fonction « Spectral Substract ». La taille du spectre doit être réduite à l’aide de la fonction
« Interpolate », la portion entre 1700 cm-1
et 1540 cm-1
est conservée. Une ligne de base
exponentielle est faite pour éliminer la contribution des lipides avec la fonction « Baseline
Correction ». Finalement, la décomposition du spectre résultant permettra de faire ressortir
les contributions des différentes structures secondaires en utilisant l’onglet « Peak Fitting ».
Placer des bandes correspondant aux structures secondaires et utiliser le bouton « Iterate-
Run » pour ajuster la courbe résultante. Le pourcentage de structure majoritaire est calculé
avec les aires sous la courbe des différents pics.
86
6.7.3 – Résultats
Figure 40 - Spectres infrarouge des séries R4R11 et R5R10 dans des vésicules de POPC
87
88
89
90
Figure 41 - Spectres infrarouge des séries R4R11 et R5R10 dans des vésicules de POPG
91
92
93
94
Figure 42 - Spectres infrarouge des analogues utilisés pour la protection des extrémités
dans des vésicules de POPC
95
96
Figure 43 - Spectres infrarouge des peptides utilisés pour la protection des extrémités dans
des vésicules de POPG
97
Figure 44 - Spectre infrarouge du peptide R1R5R14 et AcR1R5R14 dans les vésicules de
POPG et POPC
Il est pertinent de noter que certains spectres ont été coupés à 1600 cm-1
plutôt que
1530 cm-1
pour faciliter le traitement des spectres. Ces quelques spectres contenaient un
artéfact dans les bas nombres d’ondes augmentant significativement l’intensité. Toutefois,
aucune information n’a été perdue par cette opération.
98
6.8 - Test d’activité antibactérienne
6.8.1 - Préparation des bactéries
Les bactéries utilisées dans le test sont E. coli ATCC 11303 et S. epidermidis ATCC 155.
La première journée du test, une colonie provenant d’une culture sur pétri récente ou d’une
souche congelée est inoculée dans 10 mL de MHB stérile dans un erlenmeyer de 50 mL
sous champ stérile. Les solutions sont incubées dans un bain-marie à agitation latérale à
37 °C / 100 RPM pour une période de 18 à 24 h. Au jour 2, prélever 100 μL des solutions
incubées et inoculer un nouveau 10 mL de MHB stérile dans un erlenmeyer de 50 mL
stérile. Les deux solutions retournent ensuite au bain-marie dans les mêmes conditions que
la veille. Avec une anse, inoculer deux boites de Pétri par étalement avec les solutions des
erlenmeyers de la veille et incuber ces pétri de 24 h à 37 °C. Au jour 3, vérifier s’il y a
contamination dans les boites de Pétri et conserver à 4 °C. Si les cultures sont contaminées,
reprendre la culture. À partir des solutions de la deuxième incubation, faire les dilutions
suivantes : pour E. coli, faire trois dilutions 1/100 dans du MHB (50 μl/5 mL; 50 μL/5 mL;
450 μL/45 mL) et pour S. epidermidis, faire une dilution 1/50 et deux dilutions 1/100 (100
μL/5 mL; 50 μL/5 mL; 450 μL/45 mL). Refaire la vérification de la contamination pour les
solutions de la deuxième incubation. Au jour 4, vérifier s’il y a contamination dans les
boites de Pétri et conserver à 4 °C.
6.8.2 - Préparation des solutions
Deux solutions sont nécessaires aux tests et sont préparées de la façon suivante :
Solution 1 (10 mL) : 0,4% BSA, 0,02% AcOH
Solution 2 (25 mL) : 0,2% BSA, 0,01% AcOH, 10% DMSO
Les solutions sont ensuite filtrées avec une seringue et un filtre 0,2 μm pour stériliser les
solutions. Ces manipulations sont réalisées sous champ stérile.
6.8.3 - Test antimicrobien
Dans des plaques 96 puits de polypropylène, remplir la rangée A avec 50 μL de la solution
1 et les rangées B à F avec 50 μL de la solution 2. Selon les plans de plaques, mettre 50 μL
de la solution-mère de l’extrait à tester (à 5,12 mg/mL dans 20% DMSO et 80 % eau) dans
le puits A et faire des dilutions successives avec 50 μL jusqu’à la rangée F. Dans d’autres
99
plaques 96 puits (Numérotées E# pour E. coli et S# pour S. epidermidis), mettre 100 μL de
solution bactérienne diluée dans les rangées A à G. Dans la rangée H, mettre 100 μL de
MHB Stérile. À partir des plaques de dilution, mettre 11 μL des solutions peptidiques dans
les puits correspondants des plaques de bactéries. Ensuite, mettre 11 μL de la solution 2
dans les rangées G et H. Finalement, mettre deux bandes de parafilm autour des plaques et
incuber à 37 °C pour 48 heures. Après 24 heures d’incubation, vérifier les plaques pour
avoir des résultats préliminaires et prendre des photos. Après 48 heures d’incubation,
prendre des photos des plaques et évaluer visuellement la culture et l’activité
antimicrobienne. On nomme CMI la plus petite concentration à laquelle l’on ne voit pas la
croissance de bactéries.
6.9 - Test d’activité hémolytique
6.9.1- Préparation des plaques
Un milligramme de peptide est dissous dans du DMSO pour avoir une solution de 2 mM.
Dans une première plaque, mettre 170 µL de PBS dans chacun des puits, sauf les puits
correspondant au 100%, y mettre 168 µL. Mettre 2 µl de Triton X-100 10% dans les puits
correspondant au 100%. Dans la seconde plaque, mettre 90 µL de DMSO dans les puits
correspondants aux 10 µM et 1 µM, soit les colonnes 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 et 12. Pour chaque
peptide, mettre 10 µL de solution concentrée dans le puits correspondant au 10 µM de la
seconde plaque et mélanger le puits. De ce même puits, prendre 10 µL et le mettre dans le
puits adjacent, soit le 1 µM de la seconde plaque et mélanger. De ce même puits, prendre
10 µL et le mettre dans le puits correspondant de la première plaque (1 µM). Prendre 10 µL
du puits 10 µM de la seconde plaque et mettre dans le puits correspondant de la première
plaque. Prendre 10 µL de la solution concentrée et mettre dans le puits 100 µM de la
première plaque. Répéter ces manipulations pour chaque peptide en suivant le plan des
plaques. Finalement, refermer les plaques complétées avec des autocollants pour
l’étanchéité.
6.9.2 - Préparation du sang chez Héma-Québec
Le sang est reçu chez Héma-Québec et les globules rouges sont séparés du plasma et des
autres cellules indésirables en centrifugeant à 3000 RPM pour 15 minutes. La concentration
100
en globules rouges du culot est déterminée à l’aide d’un hémacymètre puis, le culot est
resuspendu dans une solution d’anticoagulants pour obtenir la concentration désirée.
6.9.3 – Test hémolytique
La solution de globules rouges est diluée avec du PBS pour avoir un volume de 100 μL à
une concentration d’environ 1x108 globules rouges/mL puis lavée avec du PBS froid et
centrifugée à 1000 g pendant cinq minutes. Ajouter 20 µL de solution de globules rouges à
chacun des puits des plaques pour une concentration finale de globules rouges/mL. Les
plaques sont ensuite incubées à 37 °C pendant 1h. Les plaques sont centrifugées à 1000g
pendant cinq minutes, quatre à la fois. Transférer 50 µL du surnageant dans une autre
plaque et lire l’absorbance à 414 nm. Calculer le pourcentage d’hémolyse à partir de ces
données.
101
Bibliographie
1. Fleming, A. Br. J. Exp. Pathol. 1929, 10, 226-236.
2. Coates, A.; Hu, Y.; Bax, R.; Page, C. Nat. Rev. Drug Discovery 2002, 1, 895-910.
3. Powers, J. H. Clin. Microbiol. Infect. 2004, 10 Suppl 4, 23-31.
4. Coates, A. R. M.; Halls,G.; Hu, Y. Br. J. Pharmacol. 2011, 163, 184-194.
5. Sinha, M. S. A.; Kesselheim, S. Bioorg. Med. Chem. 2016, 24, 6446-6451.
6. Projan, S. J. Curr. Opin. Microbiol. 2003, 6, 427-430.
7. Blair, J. M. A.; Webber, M. A.; Baylay, A. J.; Ogbolu, D. O.; Piddock, L. J. V. Nat.
Rev. Micro. 2015, 13, 42-51 10.
8. Walsh, C. Nat. Rev. Micro. 2003, 1, 65-70.
9. Hawkey, P. M. J. Antimicrob. Chemother. 2008, 62 Suppl 1, i1-9.
10. Guillemot, D. Curr. Opin. Microbiol. 1999, 2, 494-498.
11. Monroe,S.; Polk, R. Curr. Opin. Microbiol. 2000, 3, 496-501.
12. Gouvernement du Canada, Canadian Antimicrobial Resistance Surveillance System
Report 2015, 2015, Ottawa, 118 p.
13. Taylor, J.; Hafner, M.; Yerushalmi, E.; Smith, R.; Bellasio, J.; Vardavas, R.;
Bienkowska-Gibbs, T.; Rubin, J.; Estimating the Economic Costs of Antimicrobial
Resistance, 2014, 113 p.
14. World Health Organization, Antimicrobial resistance: global report on surveillance
2014, 2014, 256 p.
15. Association médicale canadienne, Choisir avec soin. [en ligne].
http://www.choisiravecsoin.org/ (Page consulté le 11 septembre 2016).
16. Association médicale canadienne, Des études pancanadiennes confirment
l'existence d'un problème de surdiagnostic, http://www.amq.ca/fr/amq-en-
action/nouvelles/item/876?platform=hootsuite (Page consulté le 11 septembre
2016).
17. Davies, J.; Davies, D. Microbiol. Mol. Bio. Rev. 2010, 74, 417-433.
18. Wegener, H. C. Curr. Opin. Microbiol. 2003, 6, 439-445.
19. Dublanchet, A.; Fruciano, E. Med. Mal. Infec. 2008, 38, 415-420.
20. Krylov, V. N. Genetika 2001, 37, 869-87.
21. Overbye, K. M.; Barrett, J. F. Drug Discovery Today 2005, 10, 45-52.
22. Hamad, B. Nat. Rev. Drug Discovery 2010, 9, 675-676.
23. Leeb, M. Nature 2004, 431, 892-893.
24. Hancock, R. E. W.; Chapple, D. S. Antimicrob. Agents Chemother. 1999, 43, 1317-
1323.
25. Hancock, R. E. W.; Sahl, H.-G. Nat. Biotech. 2006, 24, 1551-1557.
26. Bradshaw, J. BioDrugs 2003, 17, 233-240.
27. Epand, R. M. H.; Vogel, J. BBA - Biomembranes 1999, 1462, 11-28.
28. Mikut, R. S.; Ruden, M.; Reischl, F.; Breitling,; R. Volkmer,; K. Hilpert, BBA -
Biomembranes 2015, 1858, 915-1070.
29. Brewer, D.; Hunter, H.; Lajoie, G. Biochem. Cell Biol. 1998, 76, 247-256.
30. Sahl, H. G.; Bierbaum, G. Annu. Rev. Microbiol. 1998, 52, 41-79.
31. Locardi, E.; Mammi, S.; Peggion, E.; Monaco, V.; Formaggio, F.; Crisma, M.;
Toniolo, C.; Bodo, B.; Rebuffat, S.; Kamphuis, J.; Broxterman, Q. B. J. Pept. Sci.
1998, 4, 389-399.
102
32. Tam, J. P.; Lu, Y. A.; Yang, J. L.; Chiu, K. W. Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, 96,
8913-8918.
33. University of Nebraska Medical Center, The Antimicrobial Peptide Database,
http://aps.unmc.edu/AP/main.php (Page consulté le 27 septembre 2016) .
34. Tossi, A.; Sandri, L.; Giangaspero, A. J. Pept. Sci. 2000, 55, 4-30.
35. Yeaman, M. R.; Yount, N. Y. Pharmacol. Rev. 2003, 55, 27-55.
36. Brogden, K. A. Nat. Rev. Microbiol. 2005, 3, 238-250.
37. Matsuzaki, K.; Murase, O.; Fujii, N.; Miyajima, K. Biochemistry, 1996, 35, 11361-
11368.
38. Yang, L.; Harroun, T. A.; Weiss, T. M.; Ding, L.; Huang, H. W. Biophys. J. 2001,
81, 1475-1485.
39. Pokorny, A.; Almeida, P. F. Biochemistry, 2004, 43, 8846-8857.
40. Ladokhin, A. S.; White, S. H. Biochim. Biophys. Acta. 2001, 1514, 253-260.
41. Harrison, P. L.; Abdel-Rahman, M. A.; Miller, K.; Strong, P. N. Toxicon 2014, 88,
115-137.
42. Reddy, K. V. R.; Yedery, R. D.; Aranha, C. Int. J. Antimicrob. Agents 2004, 24,
536-547.
43. Paradis-Bas, M.; Tulla-Puche, J.; Albericio, F. Chem. Soc. Rev. 2016, 45, 631-654.
44. Stanbury, P. F.; Whitaker, A.; Hall, S. J. Principles of fermentation technology, 2nd
ed.; Butterworth-Heinemann, Elsevier, 2013.
45. Tomita, M.; Bellamy, W.; Takase, M.; Yamauchi, K.; Wakabayashi, H.; Kawase, K.
J. Dairy Sci. 1991, 74, 4137-4142.46
46. Michalopoulos, A.; Falagas, M. E.; Crit. Care Clin. 2008, 24, 377-391.
47. BACHEM, Antimicrobial peptides in clinical development,
http://www.bachem.com/service-support/newsletter/peptide-trends-june-2016/
(Page consulté le 27 septembre 2016) .
48. Hicks, R. P.; Clark, T. D.; Drug Discov. 2014, 2, 86-158.
49. Haney, E. F.; Nguyen, L. T.; Schibli, D. J.; Vogel, H. J.; Beilstein J. Org. Chem.
2012, 8, 1172-1184.
50. Wang, Y.; Chen, J.; Zheng, X.; Yang, X.; Ma, P.; Cai, Y.; Zhang, B.; Chen, Y.; J.
Pept. Sci. 2014, 20, 945-951.
51. Ma, Q.; Jiao, W.; Lv, Y.; Dong, N.; Zhu, X.; Shan, A. Chem. Biol. Drug Des. 2014,
84, 348-353.
52. Voyer, N.; Robitaille, M. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 6599-6600.
53. Shulz, G.; Schirmer R. H. Principles of protein structure, Springer-Verlag, New
York, 1979.
54. Inokuchi, Y.; Ebata, T.; Ikeda, T.; Haino, T.; Kimura, T.; Guo, H.; Furutani, Y.;
New J. Chem. 2015, 39, 8673-8680.
55. Vandenburg, Y. R.; Smith, B. D.; Biron, E.; Voyer, N. Chem. Commun. 2002, 1694-
1695.
56. Lorin, A.; Noël, M.; Provencher, M.-È.; Turcotte, V.; Masson, C.; Cardinal, S.;
Lagüe,P.; Voyer, N.; Auger, M.; Biochemistry 2011, 50, 9409-9420.
57. Provencher, M.-È. Design, synthèse et caractérisation de nanostructures
peptidiques à visée antimicrobienne (Mémoire de maîtrise, Université Laval), 2011.
58. Paquet-Côté, P.-A. Design, synthèse et caractérisation de nanostructures
peptidiques bioactives (Mémoire de maîtrise, Université Laval), 2014.
103
59. Boutin, J.; Richer, J.; Tremblay, M.; Bissonette, V.; Voyer, N.; New J. Chem. 2007,
31, 741-747.
60. Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154.
61. Haridas, V.; Sadanandan, S.; Dheepthi, N. U. ChemBioChem 2014, 15, 1857-1867.
62. Guillier, F.; Orain, D.; Bradley, M. Chem. Rev. 2000, 100, 2091-2157.
63. Kaiser, E.; Colescott, R. L.; Bossinger, C. D.; Cook, P. I. Anal. Biochem. 1970, 34,
595-598.
64. Micsonai, A.;Wien, F.; Kernya, L.; Lee, Y.-H.; Goto, Y.; Refregiers, M.; Kardos, J.
Proc. Natl. Acad. Sci. 2015, 112, E3095-E3103.
65. Anton, P. R. Plant Sci. 1999, 148, 91.
66. Wu, Y.; Huang, H. W.; Olah, G. A. Biophys. J. 1990, 57, 797-806.
67. Kong, J.; Yu, S. Acta Biochim. Biophys. Sinica 2007, 39, 549-559.
68. McLoed, V. Biosafety Levels 1,2,3 and 4, http://www.labmanager.com/lab-health-
and-safety/2010/12/biosafety-levels-1-2-3-4?fw1pk=2#.WBuIdy3hDIU (Page
consulté le 3 novembre 2016).
69. Gram, H. C. J.; Friedlaender, C. Ueber die isolirte Färbung der Schizomyceten: in
Schnitt-und Trockenpräparaten. Theodor Fischer's medicinischer Buchhandlung,
1884.
70. Byrom, M. J.; Bannon, P. G.; White, G. H.; Ng, M. K. C. J. Vasc. Surg. 2010, 52,
176-95.
71. Fillion, M.; Noël, M.; Lorin, A.; Voyer, N.; Auger, M. BBA - Biomembranes 2014,
1838, 2173-2179.
72. Voyer, N.; J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 1818-21.
73. Aubry, S.; Pellet-Rostaing, S.; Lemaire, M.; Eur. J. Org. Chem. 2007, 5212-5225.
