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GENETIQUE MEDICALE – Techniques d'études en cytogénétique

04/11/15GONCALVES Salomé L2CR : Nyl CHEMLIGénétique médicaleH ZATTARA12 pages

Techniques d'études en cytogénétique

A. Introduction

Rappel : la cytogénétique est l’étude morphologique du matériel génétique se présentant sous forme de chromosomes.

Le Chromosome: khroma (couleur) et soma (élément) est constitué d’une molécule d’ADN et de protéines. Il est le support de l’information génétique et permet une modalité d’organisation de l’ADN dans la cellule en division (mitotique ou méiotique) par la condensation de la chromatine et l’association avec des protéines structurales.

Le nombre de chromosomes est caractéristique de l’espèce étudiée . Dans l’espèce humaine on retrouve 46 chromosomes dans des cellules diploïdes à l’exception des gamètes.

Le caryotype consiste à réaliser une analyse globale du génome, qui va permettre de détecter les anomalies de nombre de chromosome et les anomalies de structures.

En cytogénétique on distingue 2 grands groupes :– La cytogénétique conventionnelle qui est le caryotype standard ou le caryotype à haute résolution.– La cytogénétique moléculaire qui représente toutes les techniques d’hybridation in situ (FISH) ainsi que

le caryotype moléculaire ou CGH microarray (=ACPA).

ATTENTION: Dans tous les cas, lorsque l’on veut faire un caryotype ou une étude en biologie moléculaire sur de l’ADN constitutionnel, il est absolument nécessaire d’avoir une attestation de consultation et un consentement éclairé du patient, car on peut tomber sur des anomalies qu’on ne recherche pas forcément (notamment avec la CGH micro-arrays).

Même si les techniques visent toutes à étudier le chromosome, la cytogénétique conventionnelle et la FISH se font après une culture cellulaire pour obtenir des chromosomes dans le noyau alors que les techniques de CGH array ne nécessite pas cette mise en culture et il va falloir faire une extraction de l’ADN.

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Plan: A. Introduction B. La cytogénétique conventionnelle

I. Les différentes étapes II. Les techniques de marquage III. Caryotype standard

C. La cytogénétique moléculaire I. FISH II. CGH array III. Puces à ADN IV. Indications post natal


La cytogénétique conventionnelle et la FISH détectent des anomalies de nombre et de structure équilibrées ou déséquilibrées

La CGH array ne détectera pas les anomalies équilibrées parce qu’il faut qu’il y ait une variation du nombre de copie pour qu’on puisse mettre en évidence l’anomalie. Par contre en CGH array la résolution va être bien meilleure.

On travaille sur tous les types de cellules:– Lymphocytes T (sang)– fibroblastes (peau, gonades) – amniocytes (liquide amniotique) – cellules trophoblastiques (villosités choriales) – autres: tumeurs, moelle osseuse

B. La cytogénétique conventionnelle

Pour le caryotype on doit avoir des cellules en métaphase (c'est le seul moment où les chromosomes vont être individualisables). Soit on va avoir des cellules en division spontanée, soit on va avoir à passer par une culture cellulaire. La culture cellulaire va avoir un temps extrêmement variable en fonction du types de cellules.

I. Les différentes étapes :

Soit les cellules sont en division spontanée soit on réalise des cultures cellulaires (stérile) :la durée est variable en fonction du tissu:

– sang: 72-96 h– amniocytes: 10 jours – fibroblastes: 3 semaines – cellules trophoblastiques: spontanée ou 10 jours

Lorsque l’on observe un nombre suffisant de mitose on va arrêter le cycle cellulaire au stade métaphasique: on utilise la colchicine (poison du fuseau: les cellules qui sont en mitose vont rester en mitose. Cela permet une accumulation de cellules en mitose).

Les chromosomes sont alors contenus dans la membrane cytoplasmique, ils sont les uns sur les autres. Pour faciliter l’analyse on réalise un choc hypotonique afin de faire éclater la membrane cytoplasmique, ce quipermet un étalement optimal des chromosomes.Le choc hypotonique entraîne une fragilisation des membranes cytoplasmiques et nucléaires et un gonflement des cellules qui conduit à la dispersion des chromosomes.

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Ensuite on va fixer par des fixations successives, puis étaler les chromosomes sur des lames. L’étalement des chromosomes est très condition-dépendant. Il faut une température de la pièce constante, etsurtout une hygrométrie constante. Ces données sont très contrôlées (enceintes).

On réalise la coloration des chromosomes au Giemsa (très forte affinité des chromosomes) et on réalise un marquage chromosomique c’est à dire une dénaturation qui font apparaître des bandes sur les chromosomes. Il y a une complémentarité des différentes techniques.Une fois que les chromosomes ont été coloré et dénaturé on peut alors les analyser au microscope (microscope à contraste de phase).C’est au technicien de faire le caryotype.

II. Les techniques de marquage

Les techniques de marquage sont la base de la cytogénétique. Cela consiste à voir apparaître sur des chromosomes une succession de bandes claires et de bande sombres (longitudinales et caractéristiques de chaque paire chromosomique). Le nombre de bandes est variable en fonction de la condensation de la chromatine.En général on obtient une résolution entre 300-550 bandes par lot haploïde de chromosomes.

Il y a 4 types de bandes utilisées en routine:– Bandes G: dénaturation enzymatique (trypsine) + coloration Giemsa (GTG)– Bandes R: dénaturation thermique ménagée + coloration Giemsa (RHG) – Bandes C: baryum + coloration Giemsa (hétérochromatine constitutive) – (Autres: coloration à Ag (NORs), bandes T, bandes Q (microscope à fluorescence))

a. Coloration au Giemsa

C’est un colorant ayant une forte affinité pour l’ADN, il permet l'observation des chromosomes. Cela permet de classer les chromosomes par taille et de regarder l’index centromérique. On identifie des anomaliesde nombre.Si on recherche une anomalie de nombre type Trisomie 21, cela permet de ne pas dénaturer et voir très vite l’anomalie de nombre. (une dénaturation sera quand même réalisée après).

Les chromosomes sont séparés en 3 groupes :

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Sur les bras court des acrocentriques, il n’y a que des gènes qui codent pour l’ARN ribosomal ce qui explique qu’il y a des variants, des chromosomes avec des bras plus courts que d’autres.

b. Bandes G

C’est une digestion enzymatique ménagée et une coloration auGiemsa. Ces bandes G font apparaître des régions d’ADN riches enséquences A-T, correspondant à des régions condensées précocementlors du cycle cellulaire, à réplication tardive, pauvres en gènes actifs.

Un inconvénient majeur est que les extrémités télomériques sont trèsclaires. Or ces régions la sont très riches en gènes et lorsqu’il y a perted’une bande claire c’est beaucoup plus difficile de le voir.

c. Bandes R (reverse band des bandes G)

Tout ce qui apparaît clair en bande R apparaît foncé en bande G .Il s’agit d’une dénaturation thermique ménagée suivie également d’une coloration au Giemsa. Elles colorent des régions d’ADN riches en bases G-C, condensées tardivement au cours du cycle cellulaire, correspondant à des régions à réplication précoce, riches en gènes actifs.

Quand on regarde la même paire chromosomique en bande R et en bande G on voit qu’elles sont à peuprès complémentaires.

d. Bandes C :

Il s’agit d’une coloration de l’hétérochromatine constitutive. Il y en a beaucoup sur les centromères, sur les constrictions secondaires (1-9-16), sur les bras courts des acrocentriques (13-14-15-21-22) , et l’hétérochromatine du Y.

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e. Colorations des organisateurs nucléolaires

Cela colore des régions des gènes qui codent pour l’ADNribosomique que l’on retrouve sur les bras courts des chromosomesacrocentriques. Cela permet de vérifier quand il y a une anomalie detaille des bras courts du chromosome X qu’il s’agit bien de gèneribosomique.

III. Caryotype standard

Le classement se fait en taille décroissante (1 étant le plus grand), en fonction de l’indicecentromérique et des données des bandes R ou G (complémentarité des informations).Dans unecellule somatique humaine: 46 chromosomes dont 22 paires d’autosomes: 1-22 et 1 paire degonosome: XX, XY. La numérotation se fait selon la distance par rapport au centromère:région, bandes, sous bandes. (schéma du chromosome).

Comment décrire une anomalie ?La nomenclature utilisée est totalement internationale. La localisation sur le chromosome estindiquée par le numéro du chromosome, le bras (p ou q), le numéro de la région, le numéro dela bande et le numéro de sous bande.

Exemple:

Résolution de l’analyse

Un caryotype standard à une résolution de 300-500 bandes par lot haploïde de chromosomes .Ce qui veut dire qu’une bande chromosomique correspond à 2.107 pb. On va identifier les remaniements de 10 Mb mais on ne détecte pas les petits remaniements.

On a mis au point des techniques de haute résolution qui vont permettre d’avoir une résolution 2 fois meilleure soit 600-1000 bandes par lot haploïde de chromosome. En sachant qu’une sous bande chromosomique c’est 1 à 5.106 pb. On va identifier des micro remaniement de 4 à 5 Mb.

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Exemple du Chromosome 7 :

Une dé-spiralisation permet une augmentation dunombre de bandes c'est à dire une augmentation dela résolution .

Un étirement complet deschromosomes est plus long à réaliser.Il n'est pas utile pour trouver uneTrisomie 21.

C. La cytogénétique moléculaire

C’est ce qui permet de faire le lien entre le chromosome et l’ADN.

I. FISH

Cela consiste à une hybridation de séquences spécifiques marquées sur un génome entier : centromères, régions sub-télomériques, loci spécifiques et peintures. Cela permet la détection de délétions, identification de translocations ou d’autres réarrangements chromosomiques.

Il y a 2 approches :– une approche ciblée orienté vers quelque chose– une approche globale, essentiellement les techniques de CGH

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a. Principe :

Le principe de la technique d’hybridation in situ en fluorescence avec des sondes froides (FISH) est basé sur le fait que l’ADN est une molécule double hélice formée de deux brins complémentaires.

1. Étape de dénaturation : Ces deux brins peuvent être séparés par la chaleur et/ou par un traitement acide ou alcalin

2. Étape d'hybridation : Une sonde d’acide nucléique contenant une séquence complémentaire au simplebrin d’ADN, peut alors former un hybride spécifique avec l’ADN simple brin

3. Étape de révélation: Cette sonde est marquée directement ou indirectement avec un ou plusieurs fluorochromes, l’hybridation des séquences nucléiques complémentaires peut être visualisée en fluorescence après contre coloration du support (chromosomes ou noyaux). La cible peut être soit un noyau soit des chromosomes.

b. Les différents types de sondes:

– sondes centromériques (séquences répétées) → Ce sont des grosses sondes, très rapides à lire.– sondes de peinture chromosomique (spécifique d’un chromosome entier ou d’un bras court ou d’un bras

long) – sondes subtélomériques (photo)– sondes spécifique d’un locus donné

Exemple : le chromosome 9 marqué en rouge, le chromosome 22 en vert Il y a une translocation on voit 1 rouge (Chr9 normal) 1 vert (Chr22 normal) et puis 2 chromosomes où l’on voit à la fois 1 tache rouge et verte côte à côte, c’est une translocation réciproque.

– sonde Multiplex FISH/SKY

– sonde mBand FISH– Sondes break-apart : Sur des régions chromosomiques très proche, une sonde verte une sonde rouge, à

certains locus, notamment dans les leucémie de l’enfant : locus très fréquemment impliqué dans des translocations. Cela permet de détecter si le gène est réarrangé.

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c. Applications cliniques

Il faut un accord entre le clinicien et le biologiste. Se pose la question du domaine de la recherche clinique et du diagnostic en routine. Il y a certaines anomalies ou le caryotype parait normal mais on peut suspecter la présence d’anomalies cryptiques : anomalies trop petites pour être vu au caryotype .Ex : leucémie, il y a une anomalie qui est la translocation 12-21, qui ne se voit absolument pas au caryotype mais en utilisant une sonde sur le chromosome 12 et sur le chromosome 21 on arrive à montrer des réarrangement indétectable au caryotype.

Hybridation in situ La résolution d’une hybridation in situ est de 40-100kb mais c’est une analyse ciblée, si on a pas d’orientationclinique on ne peut pas utiliser cette technique. Soit il y a une orientation clinique sur un gène précis soit une orientation cytogénétique. Il est nécessaire de développer d’autres techniques d’identification d’anomalies chromosomiques de petite taille.

→ Le syndrome de Digeorge est une malformation cardiaque avec une anomalie du palais, une mauvaise régulation de la calcémie et une perturbation du système immunitaire. Le locus est situé en 22q11. Lors de l'utilisation de sonde on n'hybride pas que la région cherchée, on fait toujours une deuxième sonde sur le chromosome pour être sur que ce n’est pas le chromosome qui a été perdu pendant la métaphase, une sonde témoin.

→ Le syndrome de Williams-Beuren est un retard psychomoteur dysmorphique avec faciès d’Elfe et sténose aortique. Le gène est situé sur 7q11.23.

Avantages de la FISH Inconvénients de la FISH

Technique sensible (noyaux et métaphases)

Grand choix de sondes (commerciales ou « maison »)

Technique lourde nécessitant des traitements différentsselon la nature de l’échantillon à analyser

(métaphases, noyaux, tissus)

Analyse ciblée : Nécessité d’avoir une idée préalablede la région chromosomique ou du gène à étudier

3 cibles maximum par test

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Il y a 2 techniques qui permettent de faire une étude complète. D'abord, une technique de FISH multiplex. On va utiliser différents fluorochromes pour identifier tous les chromosomes, ce qui permet de faire un caryotype avec des chromosomes de toutes les couleurs. Mais cela n'a pas une résolution très importante. L' autre technique, moins utilisée, est la même mais sur un seul chromosome.

II. CGH array

C'est une technique mise en place dans les années 1995-2000.L'objectif est de détecter des anomalies de nombre et de structures.Le principe de la première technique (technique obsolète) de CGHarray consistait à:

– prendre, de l'ADN du patient que l'on marque en vert,– prendre un ADN témoin (normal) marqué en rouge, – mélange des 2 sondes sur des préparations

métaphasiques d'un individu normal.Si la quantité est égale on va avoir un aspect jaune/orange.Si une région est délétée chez le malade, il n'y aura plus de rouge.Si une région a été dupliqué, cela apparaîtra en vert.

La résolution de cette technique n'a pas été assez bonne. On nevoyait pas de remaniement équilibrés.

Si on fait la comparaison FISH – CGH :La FISH a une meilleure résolution, le caryotype et la CGH ont une résolution assez faible :résolution de la CGH : 5-10 Mb >3 Mb

Comment réaliser une analyse globale du génome et augmenter la résolution ?→ hybrider de nombreuses sondes sur un échantillon

III. Puces à ADN

a. Définitions

Ce sont des petites surfaces solides sur lesquelles un grand nombre de sondes ont été fixées . Il y a différents noms (DNA arrays, DNA chips, DNA micro-arrays ou micro-arrays)

- BAC-array = sondes de BACs - DNA-array = faible densité (quelques centaines à quelques milliers de sondes) - DNA micro-array = haute densité (plusieurs milliers de sondes) - puces « pangénomiques » = ensemble du génome - puces « à façon » = ciblant une fonction biologique ou une pathologie : exemple : en cancérologie, on cherche à utiliser des puces qui vont sur des régions très spécifiques (gènes suppresseurs de tumeurs…)

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b. Principe:

C’est un principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN (ou ARN/ARN). On réalise une Co-Hybridation compétitive de séquences d’ADN (ou ARN) test et témoin marqués par fluorescence sur un grand nombre de loci spécifiques présents sur un support solide (lame de verre) . Cela va permettre l’Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau de loci spécifiques et connus sur un génome entier .Le patient est en vert (en haut), la référence en rouge (en bas) on va dénaturer puis l’appliquer sur une plaque recouverte de sonde.

S’il y a un défaut de vert c’est que le patient est délété de cette régionS’il y a un excès de vert c’est qu’il y a une duplication de cette région

On a des logiciels qui nous permettent d’analyser ces scanners et on a des courbes qui permettent de détecter quand ça va trop dans le vert ou dans le rouge.

c. Les sondes utilisées :

–BACs/PACs •80-200 kb •puces ciblées, 3200 à 3500 clones (résolution 1 Mb), ~26600 clones (tiling path array)

– Oligonucléotides •20-60 pb •densités élevée: 44K -> 2,1M; résolution jusqu’à 1 kb •puces ciblées ou pangénomiques

d. Les plateformes :

Il y a 2 types de plateforme,

– plateforme aCGH•marquage double couleur (Cy3-Cy5)

•comparaison de 2 ADN (patient et référence) et identification de changement du nombre de copies (CNV)

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– plateforme SNP•marquage simple couleur

•absence d’ADN de référence

•identification de région de perte d’hétérozygotie (délétion) ou d’absence d’hétérozygotie (DUP, consanguinité)

Il y a 4-5 grands fournisseurs, chacun a ses caractéristiques.Dans son labo, ils utilisent en routine une plateforme de résolution 13kb qui comportent 170 000 sondes.

e. Analyse

L’analyse se fait sur un support bioinformatique qui va faire un calcul ratio de fluorescence (différents algorithmes) . On a une visualisation graphique des résultats, on observe les variations du nombre de copies (CNV) .CNV: segment d’ADN >1 kb dont le nombre de copies varie par rapport à un ADN de référence, sans préjuger du caractère pathogène ou pas. Une anomalie n’est pas forcément pathologique, on parle de variant.(de novo ne veut pas dire pathogène)

f. Intérêts et applications

Il n’ y a pas de mise en culture des cellules à analyser. Cela permet une analyse de l’ADN de tout type de tissus. C’est une technique hautement résolutive (< 150 Kb). On réalise des analyses pangénomiques qui ne nécessite pas d’avoir une idée préalable de chromosomes impliqués (contrairement à la FISH).Chaque fois qu’on détecte une anomalie en CGH on vérifie en FISH.

On va pouvoir faire une corrélation du nombre de copies en fonction des conséquences biologiques, comprendre des maladies (Couplée à une puce à ARN ), de Comparer tumeur par rapport aux tissus sains. Et de faire l’étude du génome des patients atteints d’une même pathologie et compréhension des mécanismes géniques.

Il y a quelques inconvénients :Ce sont des techniques longues, l’analyse est très longue. Ça ne détecte pas les anomalies chromosomiques équilibrées. Il y a beaucoup d’interrogations au sujet des polymorphismes. Cette technique a du mal à détecter les mosaïque faibles. Enfin c’est une technique très coûteuse, un plateau technique très onéreux etc.

IV. Induction post natal

On utilise le caryotype conventionnel avec la FISH pour:–Infertilité masculine –FCS répétées

–Aménorrhée primaire, ménopause précoce –Retard de croissance chez fille

–Retard pubertaire –Ambiguïté sexuelle

–Enquête familiale –Maladies cassantes

–Caractérisation d’un CNV (variation d’un nombre de copie)

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On réserve les ACPA pour:–Retard mental avec ou sans malformation, +/-dysmorphie faciale

–Malformations sans retard mental (cardiaque, rénales, squelettiques….)

–TED, troubles neuropsychiatriques

–Indications cytogénétiques /après , pour identifier•remaniement chromosomique apparemment équilibré de novo

•chromosomes surnuméraires euchromatiques

•caractérisation d’anomalies chromosomiques

C. Conclusion:

La prof a mentionné que ce tableau pourrait être un bon sujet de QCM. Le diapo sera sur l'ENT prochainement. Jetez un coup d'oeil surtout pour les couleurs sur les photos.Merci à Cyril qui m'a sauvé quand m'a clé USB ne marchait pas !

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