Techniques d’étude en

Techniques d’étude en

biologieTECHNIQUES HISTOLOGIQUES ET CYTOLOGIQUES

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A) On considère que notre organisme est constitué de 4 grands types de tissus

B) Tous les types de prélèvement demandent une étape d’inclusion

C) La microscopie photonique permet une observation du nucléole

D) La fixation est l’étape de préparation la plus longue car elle permet la préservation des tissus

E) Certaines colorations utilisées en microscopie électronique révèlent les structures conjonctives

1. PARMI LES PROPOSITIONS SUIVANTES, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

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On distingue ainsi :

• Les épithéliums (glandulaires ; de revêtement)

• Les tissus conjonctifs (communs et spécialisés)

• Les tissus nerveux

• Les tissus musculaires



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Seuls les prélèvements solides, donc les tissus, nécessitent une étaped’inclusion, ce qui n’est pas le cas des prélèvements liquides.

L’inclusion :

→ Sert à rendre un tissu dur afin de le couper

→ Demande une résine qui va varier selon la microscopie

→ Est l’étape de préparation qui demande le plus de temps (séchage).



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La microscopie photonique permet d’observer :

→ La structure du tissu

→ La morphologie globale d’une cellule

→ Le noyau

→ Le cytoplasme

→ Le nucléole



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L’étape de préparation le plus longue est l’inclusion desprélèvements tissulaires. Au contraire, la fixation doit êtrefaite très rapidement afin de limiter la mort cellulaire et lanécrose des tissus à observer. Ainsi, plus la fixation estréalisée vite et plus la qualité de l’image sera bonne.

Cette étape est à réaliser pour tous les types deprélèvements, qu’ils soient solides comme liquides.



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Les colorations ne sont utilisées que pour la microscopiephotonique. La microscopie électronique, elle, ne donnerades images qu’en niveaux de gris. Cependant, de lacouleur peut être ajoutée aux observations en post-traitement, mais donc après observation, ce qui resteartificiel.







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Préparation cytologique

1 : Recueil

sur lame de

verre

Étalement

• Frottis ou brossages

• Se fait avec deux lames

• Il ne faut aucune superposition cellulaire

Empreinte

• Prélèvement tissulaire

• Attachement de cellules à la lame par application du prélèvement

dessus

Centrifugation• Séparation d’un prélèvement liquide en plusieurs phases

• Prélèvement du culot pour étalement sur lame de verre

Cytocentrifugation• Centrifugation + étalement simultané

• Un filtre arrête les liquides mais laisse passer les cellules vers la lame

2 : Fixation

🡪 Prévient l’autolyse cellulaire et la nécrose tissulaire

🡪 Conserve les constituants tissulaire et cellulaires

🡪 Immobilise les molécules in situ (arrêt sur image)

🡪 Immobilise les protéines in vivo

🡪 Évite la macération (arrêt des réactions enzymatiques)

• Rapport de 1/5 entre échantillon et fixateur

• Différents fixateurs selon le prélèvement

• Plus le prélèvement est gros, plus la fixation est rapide

→ Fixation des frottis par séchage à l’air libre

3 : Coloration

• Méthode manuelle par trempage dans des bacs successifs

• Méthode automatique (frottis vaginaux +) par un automate de coloration

MGG = frottis sanguins avec les noyaux en violet, le cytoplasme en bleu

(pH basique) ou rose (pH acide)

Papanicolaou = frottis vaginaux avec 3 colorants vert, orange et bleu

1

7

6

5

4

3

2 8

9

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1 : Recueil

sur lame de

verre

Étalement




Empreinte



dessus





2 : Fixation










3 : Coloration






7

6

5

4

3

8

9

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1 : Recueil

sur lame de

verre

Étalement




Empreinte



dessus





2 : Fixation










3 : Coloration






7

8

9

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1 : Recueil

sur lame de

verre

Étalement




Empreinte



dessus





2 : Fixation

→ Prévient l’autolyse cellulaire et la nécrose tissulaire

→ Conserve les constituants tissulaire et cellulaires

→ Immobilise les molécules in situ (arrêt sur image)

→ Immobilise les protéines in vivo

→ Évite la macération (arrêt des réactions enzymatiques)





3 : Coloration






8

9

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1 : Recueil

sur lame de

verre

Étalement




Empreinte



dessus





2 : Fixation

→ Prévient l’autolyse cellulaire et la nécrose tissulaire

→ Conserve les constituants tissulaire et cellulaires

→ Immobilise les molécules in situ (arrêt sur image)

→ Immobilise les protéines in vivo

→ Évite la macération (arrêt des réactions enzymatiques)





3 : Coloration






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Préparation Histologique1 : Fixation

• 2 à 5h pour les petits prélèvements et 24 à 48h pour les gros

• 60% d’eau 🡪 60% de fixateur

→ Formol = réticule les protéines (modifie leur forme)

→ Éthanol = coagule les protéines (pour les petits éléments)

→ Acide acétique / Acide picrique

2 : Préparation

à la coupe

a : Déshydratation

• 60% de fixateur (aqueux) 🡪 60% d’alcool

• But : retirer toute l’eau

→ Éthanol ++ / Acétone

b : Infiltration

• 60% d’alcool 🡪 60 % de xylène

• But : solubiliser (retirer) les graisses donc agit sur les adipocytes

→ Xylène

c : Imprégnation

• 60% de xylène 🡪 60% de paraffine

• But : durcissement du prélèvement

→ Paraffine ++ (liquide à 50°C) / Résine plastique (tissus durs ; os)

d : Inclusion• Suite de l’imprégnation = solidification de la paraffine à

• À T° ambiante dans des moules pour former un bloc d’inclusion

3 : Coupe • Microtome (épaisseur de 3 à 5m) avec plusieurs angles

4 : Montage et collage• Collage sur lame de verre avec une solution de gélatine

• Séchage sur une plaque chauffante ou une étuve

5 : Déparaffinage• Paraffine 🡪 Xylène 🡪 Éthanol 🡪 Eau = sens inverse

• But : réhydrater car les colorants sont hydrophiles

6 : Coloration

🡪 Coloration topographique = différenciation des couches

tissulaires

🡪 Coloration fonctionnelle = fonction et produits d’une cellule

3

7

4

5

6

2

1

8

9

10

11

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2 : Préparation

à la coupe

a : Déshydratation




b : Infiltration



→ Xylène

c : Imprégnation











6 : Coloration


tissulaires

🡪 Coloration fonctionnelle = fonction et produits d’une cellule

7

8

9

10

11

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2 : Préparation

à la coupe

a : Déshydratation




b : Infiltration



→ Xylène

c : Imprégnation











6 : Coloration


tissulaires

🡪 Coloration fonctionnelle = fonction et produits d’une cellule11

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• 60% d’eau → 60% de fixateur




2 : Préparation

à la coupe

a : Déshydratation

• 60% de fixateur (aqueux) → 60% d’alcool



b : Infiltration

• 60% d’alcool → 60 % de xylène


→ Xylène

c : Imprégnation

• 60% de xylène → 60% de paraffine








5 : Déparaffinage• Paraffine → Xylène → Éthanol → Eau = sens inverse


6 : Coloration→ Coloration topographique = différenciation des couches tissulaires

→ Coloration fonctionnelle = fonction et produits d’une cellule

Biologie cellulaire-

Échanges cellulairesTRANSPORT SANS MOUVEMENT DE MEMBRANE

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Diffusion simple

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Quels sont les 5 facteurs régulant la diffusion simple ?

1) ________________

2) ________________

3) ________________

4) ________________

5) ________________

Diffusion simple

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Quels sont les 5 facteurs régulant la diffusion simple ?

1) La liposolubilité (= hydrophobicité).

2) Le poids moléculaire : la molécule doit avoir un PM < 1 kDa.

3) L’ionisation : la MP est imperméable aux molécules chargées, qui par définition sont des molécules hydrophiles alors que les molécules lipophiles sont neutres.

4) La surface d’échange : beaucoup de cellules utilisent des structures spécialisées pour augmenter les échanges, notamment au niveau intestinal (microvillosités, plateau strié…) et rénal (bordure en brosse) mais vous verrez ça en histologie.

5) L’épaisseur de la membrane : mais cela ne différencie pasvraiment les types cellulaires, la couche lipidique ayant une épaisseur plus ou moins égale.

Diffusion simple

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Acides aminésCO2

ÉthanolHCO3

-

H2OAnesthésiques volatiles

Glucose

Diffusion simple

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Molécules de

faible poids

moléculaire

Les ions étant

chargés, aucun

ne passe par

diffusion simpleMolécules

liposolubles

Ce n’est

pas le

mécanisme

principal

Molécules de

trop haut poids

moléculaire

voire chargées

A) Le transport des ions se fait grâce à la combinaison d’une force électrique et chimique

B) Le transport par diffusion facilitée s’effectue dans les deux sens, on dit que c’est un transport de type biport

C) Le canal chlore est une protéine canal

D) Les canaux ioniques ont une durée d’ouverture similaire

E) On distingue deux types de canaux ioniques selon leur mode d’activation

2. PARMI LES PROPOSITIONS SUIVANTES, CONCERNANT LES TRANSPORTS PASSIFS, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

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C’est plus simplement ce qu’on désigne par le gradientélectrochimique. Ce gradient permet qu’aucun apportd’énergie, type ATP, ne soit utilisé pour le transport des ionsà travers les canaux ioniques.

B) Le transport s’effectue dans les deux sens, on dit que c’est un transport de type biport


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Le transport par diffusion facilitée se fait bien dans les deuxsens. Cependant, c’est un transport dit uniport car lesprotéines transporteuses impliquées sont spécifiques d’union ou d’une molécule et elles ne laissent passer qu’un seulélément à la fois.



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Cette protéine à bien le nom de canal, mais elle utilise un transport actif. En effet, c’est un transporteur ABC qu’on retrouve notamment au niveau du pôle apical des cellules bronchiques et qui sert à l’hydratation du mucus.



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Leur durée d’ouverture est très variable, souvent dépendante de la durée du stimulus qui les a déclenché.



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Les canaux ioniques voltage dépendant sont sensibles auxdifférences de potentiel transmembranaire. Ils servent notamment àla dépolarisation lors de la transmission de l’influx nerveux,puisque leur ouverture transmet la variation de potentiel auxcanaux voisins.

→ Canaux K+, Na+ et Ca2+

Les canaux ioniques activés par un ligand s’ouvrent lorsqu’ils sontstimulés par un ligand (neurotransmetteurs, nucléotides…).

→ Récepteur canal de l’acétylcholine (dit nicotiniques)


B) Le transport par diffusion facilitée s’effectue dans les deux sens, on dit que c’est un transport de type biport





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Diffusion facilitéeLes propriétés des canaux ioniques sont :

• ______________

• ______________

• ______________

• ______________

Les différents rôles des canaux ioniques sont :

• ______________

• ______________

• ______________

• ______________

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• Rapidité de transport

• Sélectivité

• Durée d’ouverture variable

• Participation à la polarité membranaire


• ______________

• ______________

• ______________

• ______________

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• Rapidité de transport

• Sélectivité

• Durée d’ouverture variable

• Participation à la polarité membranaire


• Conduction nerveuse

• Contraction cellulaire

• Sensibilité sensoriel

• Sensibilité aux molécules messagères (neurotransmetteurs, hormones…)

A) Le transport actif est un phénomène ubiquitaire

B) Un défaut de d’expression des transporteurs MDR1 peut être à l’origine de la mucoviscidose

C) Le transporteur SGLT1 est très utilisé au niveau de l’intestin pour le passage du glucose au pôle basal des entérocytes

D) Les transporteurs peuvent utiliser, selon leur spécificité, deux sources d’énergie différentes

E) L’énergie fournie aux cotransporteurs repose le plus souvent sur la dissolution d’un gradient de protons

3. PARMI LES PROPOSITIONS SUIVANTES, CONCERNANT LES TRANSPORTS ACTIFS, LAQUELLE (LESQUELLES) EST (SONT) EXACTE(S) ?

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Le transport actif est utilisé par toutes les cellules de

l’organisme puisqu’il est nécessaire au maintien de la

physiologie et donc de l’homéostasie cellulaire. Bien sûr,

selon la spécialisation cellulaire, on retrouvera différentes

catégories de transporteurs selon les besoins et les rôles des

cellules.



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Un défaut des canaux Cl- sera à l’origine de la

mucoviscidose, tandis que les transporteurs MDR1, eux,

interviennent dans l’excrétion de substances toxiques

internalisées par la cellule. Ils représentent donc un

processus majeur de la résistance tumorale aux

traitements cytotoxiques.



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En effet, il est très

utilisé par les

entérocytes pour

l’absorption du

glucose, mais ils sont

présents au pôle

apical de ces cellules.

Le pôle basal verra la

présence de

transporteurs assurant

une diffusion facilitée,

et notamment GLUT2.



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On distingue en effet les transporteurs utilisant l’ATP qui

sont considérés comme des perméases ayant un rôle dit de

pompes ATPase, et les transporteurs utilisant un gradient de

dissolution, compensant activement la diffusion passive.



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L’énergie fournie provient généralement de la dissolution

d’un gradient de Na+, très utilisé par le transporteur Na+/H+

entre-autre, ou encore par le transporteur SGLT1







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Transport actif

Les ATPase de type P, aussi appelées [1], sont des protéines [2] quiont des sites de fixation spécifiques à l’[3]. Cette molécule leurapporte l’énergie nécessaire au transport par une réaction d’[4],énergie servant à transporter les composés [5]. Par exemple, la NaKATPase rejette [6] Na+ et fait entrer [7] K+, ce qui créé une asymétriede répartition à l’origine de plusieurs de ses rôles fondamentauxcomme une [8], un [9] ou encore d’un [10]. Ces ATPase de type P ontpour la plupart une structure similaire, elles sont formés de [11]hélices transmembranaires. Cependant, la plus grande familled’ATPases est représentée par les [12], très utilisés par nos cellulescar permettant une détoxification par relargage en EC de composéstoxiques, à la base du processus [13].

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Transport actif

Les ATPase de type P, aussi appelées pompes cationiques, sont desprotéines transmembranaires qui ont des sites de fixationspécifiques à l’ATP. Cette molécule leur apporte l’énergie nécessaireau transport par une réaction d’hydrolyse, énergie servant àtransporter les composés contre le sens du gradient. Par exemple, laNaK ATPase rejette 3 Na+ et fait entrer 2 K+, ce qui créé uneasymétrie de répartition à l’origine de plusieurs de ses rôlesfondamentaux comme une propagation du signal nerveux, untransport actif d’autres molécules en parallèle ou encore d’unmaintient de l’homéostasie cellulaire. Ces ATPase de type P ontpour la plupart une structure similaire, elles sont formés de 10 hélicestransmembranaires. Cependant, la plus grande famille d’ATPases estreprésentée par les ATPases ABC, très utilisés par nos cellules carpermettant une détoxification via le relargage en EC de composéstoxiques, à la base du processus ADME.

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Les différents canaux

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Les différents canaux

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Résumé des canaux

Type de

transport

Famille de canaux • Exemples

Transport passif

Perméases transporteuses • GLUT1

Protéines canal

• Aquaporines

• Canaux ioniques (Na+ ; K+ ;

récepteurs à l’acétylcholine…)

• Jonctions gap

Transport actif

ATPase de type P

• Ca2+ ATPase

• Pompe NaK (NaK ATPase)

• Pompe à proton (H+ ATPase)

Transporteurs ABC • MDR1

• Canal Cl- (CFTR)

ATPase F0-F1

Cotransporteurs

(transport couplé à la

dissolution d’un

gradient)

Symport

• Famille des SLC5a avec les SGLT

dont SGLT1 (2Na+/glucose)

• Transporteur H+/saccharose

Antiport • Transporteur Na+/H+

Biologie cellulaire-

Échanges cellulairesTRANSPORT AVEC MOUVEMENT DE MEMBRANE

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endocytose

D) Reconnaissance du ligand par le récepteur

A) Formation d’une vésicule recouverte

F) Invagination de la membrane

E) Formation d’une vésicule lisse

H) Formation d’un endosome secondaire

G) Dissociation dans le CULR

B) Fusion avec un lysosome

C) Recyclage des récepteurs

Replacez les étapes de

l’endocytose dans l’ordre

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Endocytose

1. (D) Reconnaissance du ligand par le récepteur

2. (F) Invagination de la membrane

3. (A) Formation d’une vésicule recouverte

Le récepteur change de conformation pour recruter l’adaptine 2.Cette dernière fait le lien entre récepteur et clathrine, ce qui permetla polymérisation de la clathrine qui forme alors un manteau donnant,lors de l’invagination, un coated pit ou puit recouvert de clathrine.

Après invagination de la membrane, la dynamine, une GTPase, vaexercer une constriction au niveau du lien entre membrane etvésicule pour permettre le détachement de cette dernière.

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Endocytose

4. (E) Formation d’une vésicule lisse ou endosome primaire

5. (H) Formation d’un endosome secondaire

6. (G) Dissociation dans le CULR

La vésicule recouverte devient une vésicule lisse grâce à l’action duCa2+ et de l’HSP70 utilisant de l’énergie via l’hydrolyse de l’ATP.

Ensuite, l’utilisation de pompes à protons va modifier le pH de cettevésicule qui devient alors un endosome secondaire. Le pH descend à6 dans l’endosome, ce qui permet la séparation des ligands et desrécepteurs dans le CULR, le nom que prend dès lors la vésicule

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Endocytose

7. (B) Fusion avec un lysosome

8. (C) Recyclage des récepteurs

Ces deux étapes sont distinctes car le recyclage ne concerne que lesrécepteurs et la fusion avec les lysosomes que les ligands, mais cesont en fait deux étapes simultanées, la cellule va réutiliser sesrécepteurs pour capter à nouveau le ligand en même temps qu’elleutilisera ceux déjà capturés en les consommant dans ses lysosomes.

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Endocytose

1. (D) Reconnaissance du ligand par le récepteur

2. (F) Invagination de la membrane

3. (A) Formation d’une vésicule recouverte

4. (E) Formation d’une vésicule lisse ou endosome primaire

5. (H) Formation d’un endosome secondaire

6. (G) Dissociation dans le CULR

7. (B) Fusion avec un lysosome

8. (C) Recyclage des récepteurs

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Endocytose

A) Les particules inertes ne sont pas capables de déclencher une phagocytose, elle est dédiée aux microorganismes et aux anticorps

B) L’exocytose est un phénomène consommateur d’énergie

C) L’endocytose permet une hyperstimulation de la cellule

D) L’endocytose représente une perte de matériel membranaire pour la cellule

E) Aucune des propositions ci-dessus n’est correct


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Les particules citées dans le cours et pouvant déclencher la

phagocytose sont :

→ Les particules inertes (verre, latex…)

→ Les molécules de surface des microorganismes

(oligosaccharides, protéines…)

→ Les cellules mortes

→ Les anticorps (les plus efficients)



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Au même titre que l’endocytose, l’exocytose demande pour

fonctionner de l’énergie, des protéines spécifiques et

l’intervention du cytosquelette, notamment pour le transport

des vésicules dans la cellule.



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Au contraire, elle empêche une hyperstimulation de par

l’internalisation des récepteurs et dans beaucoup de cas

leur destruction, ce qui arrête la stimulation cellulaire par

les ligands.



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En effet, une partie de la membrane cellulaire servant à la

formation de la vésicule d’endocytose. À l’inverse donc,

l’exocytose assure un apport de matériel membranaire puisque

les vésicules d’exocytoses rapportent du matériel en fusionnant

avec les membranes.

Ces deux mécanismes se compensent, si bien que l’apport

comme la perte de matériel est constante et donc que la taille

cellulaire ne varie pas





E) Aucune des propositions ci-dessus n’est correct


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