THESE DE DOCTORAT - univ-oran1.dz

UNIVERSITE ORAN 1 AHMED BEN BALLA

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

Laboratoire de Biotechnologie des Rhizobiums et Amélioration

des plantes

THESE DE DOCTORAT

Filière : Biologie

Spécialité : Amélioration des plantes

Intitulé :

Recherche de marqueurs génétiques liés à la tolérance à la salinité chez des écotypes

d’espèces annuelles de Medicago

Présenté par : Mr MOULAI DJILALI

Le 12 /09 / 2019

Devant la commission du jury :

Année Universitaire : 2019 - 2020

تــت الشعبيــت الديمقراطيــت الجسائريــلجمهىريا

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

يــــــــــــــــمـــــــلـــــعـــــث الـــــــــــــــــحــــبــــو ال يـــــــــــــالــــعــــال ــــــــــــــميــلـــتعـوزارة ال

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Président : Mr. Bekki Abdelkader Professeur Université Oran1 Ahmed ben balla

Rapporteur: Mme

Fyad-Lameche F.Z Professeur Université Oran1 Ahmed ben balla

Examinateur : Mr. Aoues Abdelkader Professeur Université Oran1 Ahmed ben balla

Examinateur : Mr. Bencheikh Mohamed Professeur Université de Chlef Hassiba Ben bouali

Examinateur : Mr. Miloudi Ali Professeur Université de Mascara Mustapha stambouli

Examinateur : Mr. Belhadi Abdelkader Professeur Université de Saida Dr.Moulay Tahar

N° d'ordre:……………

Série:……………..……

Recherche de marqueurs génétiques liés à la tolérance à la salinité chez des

écotypes d’espèces annuelles de Medicago

Remerciements

Au nom de Dieu le Clément le Miséricordieux.

Les recherches qui font l’objet de cette thèse ont été menées au sein du

Laboratoire de génétique et d’amélioration de plantes, dirigé par Mme

Pr. Fyad-

Lamèche. F/Z., je suis heureux de pouvoir lui exprimer ici toute ma gratitude.

Je tiens à remercier monsieur Pr. Bekki Abdelkader Professeur à l’université

d’Oran1 Ahmed benballa, qui m’a fait l’honneur de présider ce jury.

A monsieur Pr. Aoues Abdelkader Professeur à l’université d’Oran1Ahmed

benballa d’avoir accepté d’examiner ce travail.

A monsieur Pr. Bencheikh Mohamed, Professeur à l’université Université de

Chlef Hassiba Benbouali, d’avoir accepté d’examiner ce travail.

A monsieur Pr. Miloudi Ali, Professeur à l’université de Mascara Mustapha

stambouli, d’avoir accepté d’examiner ce travail.

A monsieur Pr. Belhadi Abdelkader, Professeur à Université de Saïda

Dr.Moulay Tahar, d’avoir accepté d’examiner ce travail.

Mes sincères respects à toute l’équipe de recherche du laboratoire de

Génétique et d’Amélioration des Plantes .Spécialement à monsieur Yahia N ;

Mr Sàadallah M ; Mr Touati A ; Mr Bakhti A ; MR Ayadi M et Melle LachhebF.

Je remercie toute personne qui m’a aidé de près ou de loin afin de réaliser cette

thèse, surtout Mr. Benyoucef Madani et Mr.Farahi Arbi Maitres de conférences

à l’université de Mascara.

Dédicace

A vous mes chers parents, trouvez dans ce modeste travail mes sincères

gratitudes, reconnaissances et remerciements, pour votre aide et soutien durant

toutes mes études.

A vous également :

Ma femme et mes enfants

Mes chers frères et chères sœurs

A tous mes professeurs de collège, de CEM, de Lycée et d’Université ; qui

m’ont soutenu de loin .Et de peur d’oublier quelqu’un je ne citerai personne.

Mais je veux que vous sachiez que vous m’avez tous apporté quelque chose pour

la réalisation de ce parcours scientifique.

Liste des abréviations

AFLP Amplified fragment length polymorphism

ANOVA Analysis of variance

Cvg coefficient of genetic variation

Cvp coefficient of phenotypic variation

ds/m decisimens par mètre

EST Expressed Sequence Tag

GLM General linear model

IBPGR International Board for Plant Genetic Resources

IT Indice de tolérance

kDa Kilo Dalton

LRC Longueur de la racine

LT Longueur totale

LTG Longueur de la tige

NaCl Chlorure de sodium

PCR Polymerase Chain Reaction

PFRC Poids frais de la racine

PFT Poids frais total

PFTG Poids frais de la tige

PQL Protein quantity loci

QTL Quantitative trai loci

RAPD Random amplified polymorphic DNA

Rf Relative mobility

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

SAM Sélection assistée par marqueurs

SDS-PAGE Sodium Dodécyl Sulfate- PolyAcrylamid Gel Electrophoresis

UPGMA Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic Averages

USDA United States Department of Agriculture

Vg genotypic variance

Vp phenotypic variance

i

Liste des figures

Figure1.1 : Distribution mondiale du genre Medicago ………………………………...……... 5

Figure1.2: Différents organes végétatifs chez Accessions 74 de M.ciliaris…………………... 6

Figure 1.3 : Carte de répartition des taxons M.ciliaris…………………………..…….……… 7

Figure 1.4 : Optimum écologique de M.ciliaris…………………………………...…….…………. 8

Figure 1.5 : Graine de M.ciliaris…………………………………………………...…………...…….. 9

Figure 2.1 : Localisation de la grande Sebkha d’Oran............................................................... 16

Figure 2.2: Représentation schématique de deux différentes formes d’application du sel

utilisée dans des expériences avec des plantes……………….………………..……………….

17

Figure 3.1: Les trois aspects de la tolérance au sel dans les végétaux (Homéostasie,

détoxification et l’influence de la croissance) et les liens qui les interconnectent……..……....

27

Fugure 3.2: Production de biomasse de différents groupes de plantes suivant la

salinité……………………………………………………………………………………..……

27

Fugure 3.3: Un résumé schématique des stress que les plantes souffrent dans un état de

croissance à haute salinité et les réponses correspondantes que les plantes utilisent pour

survivre à ces effets nuisibles…………………………………………………………………

35

Fugure 3.4: Schéma de la réponse de croissance en deux phases à la salinité………………... 35

Figure 4.1: Schéma représentant les diverses étapes de la réaction en chaîne de

polymérisation de L’ADN (PCR)………………..…………………….……………………….

44

Figure 4.2: Croisement de deux lignées pures (P1 et P2) suivi d’un back-cross sur P1, afin

de détecter un QTL…………………...…………………………..……………..……………...

48

Figure 4.3: Structure théorique des globulines………………….…………………..………… 54

Figure 4.4: Protein quantity loci (PQLs) abandants des globulines sur la carte LR4 de

Medicago truncatula…………………………….……………………………………………...

56

Figure 5.1 : Illustration distinguant les deux taxa M.intertexta et M.ciliaris……….………… 66

Figure 5.2: Profils SDS-PAGE de protéines de réserve à partir de graines matures………….. 68

Figure 5.3 : Tracé de moyennes et écart-types du taux de germination (TG) groupés par

populations et catégorisés par traitement………………………….……………………..……..

69

Figure 5.4 : Réduction de la tige et l’allongement de la racine en fonction de la concentration

du Na……………………………………………………………………………………..……..

72

Figure 5.5 : Tracé de moyennes et écart-types de la longueur totale (LT) groupés par

populations et catégorisés par traitement……………………………………………………….

71

Figure 5.6: Tracé de moyennes et écart-types de la longueur des tiges (LTG) groupés par

ii

populations et catégorisés par traitement ………………………………………………............ 74

Figure 5.7: Tracé de moyennes et écart-types de la longueur des racines (LRC) groupés par

populations et catégorisés par traitements……………….……………………………………..

75

Figure 5.8 : Tracé de moyennes et écart-types poids frais totale (PFT) groupés par

populations et catégorisés par traitement. ………...……………………………………………

76

Figure 5.9: Tracé de moyennes et écart-types de poids frais des tiges (PFTG) groupés par

populations et catégorisés par traitement. ……………………………………….....

77

Figure 5.10 : Tracé de moyennes et écart-types de poids frais des racines (PFRC) groupés

par populations et catégorisés par traitement. ………………………………………………….

78

Figure 5.11 : UPGMA dendrogramme des 11 populations étudiées regroupés en utilisant des

indices de tolérance au sel ITs avec logiciel DendroUPGMA………........................................

82

Figure 6.1: Profils SDS-PAGE des protéines totales de graines matures 11 populations

étudiées 10% acrylamide gels conditions dénaturantes………………….………………...

90

Figure 6.2: Profils SDS-PAGE des protéines totales de graines matures 11 populations

étudiées 13.5% acrylamide gels conditions dénaturantes………………………….…………...

90

Figure 7.1 : Profil windows basé sur le logiciel Gelanalyserr v.2010a du génotype de

référence P10 (M.intertexta.ciliaris IG54229)…………….……………………………….…

100

Figure 7.2 : SDS-PAGE des protéines solubles dans le sel des graines de populations P1, P2,

P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10 et P11……………………………………...........................….

100

Figure 7.3 : UPGMA dendrogram a basé sur la matrice binaire de graine les bandes de

protéine solubles de sel de populations M.ciliaris……………………………………………

101

Figure 7.4 : SDS-PAGE des protéines solubles dans le sel des graines de populations P1 et

P4……………………………………………………………………………………………….

104

iii

Liste des tableaux

Tableau 2.1: Protéines majeures identifiées chez les plantes cultivées sous un stress salin

en utilisant la protéomique…………………………………………………………………...

20

Tableau 2.2: Effet de la salinité sur la croissance des plantes à différentes échelles de

temps et événemenyts métaboliques impliqués….…………………………………………....

22

Tableau 3.1: Techniques utilisées pour dépister un grand nombre de génotypes pour la

tolérance à la salinité dans des serres ou des environnements contrôlés…………………….

25

Tableau 3.2: Espèces et gènes utilisés dans la transformation des plants pour

l’amélioration de la tolérance au sel…………………………………………………………

32

Tableau 3.3: Différentes approches pour identifier les gènes pour la tolérance à la

salinité........................................................................................................................................

33

Tableau 4.1: Les marqueurs génétiques en génétique et biotechnologie végétales…………. 40

Tableau 4.2 : Valeurs phénotypiques moyennes dans le cas du croisement de deux lignées

pures suivi d’un back-cross…………………………………………………………………...

48

Tableau 4.3: Teneur en globulines dans diverses graines de plantes dicotylédones et

monocotylédones (% de protéines totales)…………………………………………………...

51

Tableau 4.4 : Structure et fonction des globulines dans la graine…………………………… 54

Tableau 5.1. Nom, origine, code et génotype de différentes populations étudiées de

M.ciliaris ……………………………………………………………………………………..

59

Tableau 5.2: Taux de germination(TG) moyennes par population des jeunes plants sous

différentes doses de NaCl…………………………………………………………………….

69

Tableau 5.3: Analyse de la variance (ANOVA) de l’effet aléatoire (A) des populations et

l’effet fixe (F) concentration de NaCl sur le taux de germination…………………………

70

Tableau 5.4: Longueurs totales (LT) moyennes par population des jeunes plants sous

différentes doses de NaCl…………………………………………………………………….

71

Tableau 5.5 : Longueurs moyennes des tiges (LTG) par population des jeunes plants sous

différentes doses de NaCl…………………………………………………………………...

74

Tableau 5.6 : Longueurs des racines(LRC) moyennes par population des jeunes plants

sous différentes doses de NaCl……………………………………………………………...

75

Tableau 5.7 : Poids frais totales (PFT) moyennes par population des jeunes plants sous

différentes doses de NaCl…………………………………………………………………..…

76

Tableau 5.8 : Poids frais des tiges (PFTG) moyennes par population des jeunes plants sous

différentes doses de NaCl………………….………………………………………………….

77

iv

Tableau 5.9 : Poids frais des racines (PFRC) moyennes par population des jeunes plants

sous différentes doses de NaCl……………………………..………………………………..

78


l’effet fixe (F) concentration de NaCl sur les paramètres étudiés…………………………….

80

Tableau 5.11 : Indices de tolérance au sel des paramètres étudiés dans 11 populations sous

différents niveaux de concentration NaCl………………………………………….…………

81

Tableau 6.1: ANOVA à un facteur pour tous les traits morphologiques…………………… 87

Tableau 6.2:Évaluation des paramètres génétiques dans trois groupes de populations

étudiées……………………………………………………………………………………….

88

Tableau 6.3: Matrice des coefficients de corrélation entre les différents caractères………... 89

Table 6.4: Nombre de bands des protéines totales obtenues par gel 10% acrylamide avec la

gamme du poids moléculaire (MW), mobilité relative Rf et bandes spécifiques selon le

software Gel Analyser10a…………………………………………………………………….

91

Table 6.5: Nombre de bands des protéines totales obtenues par gel 13,5% acrylamide avec

la gamme du poids moléculaire (MW), mobilité relative Rf et bandes spécifiques selon le

software Gelnalyser10a……………………………………………………………………….

91

Tableau 7.1 : Matrice de similitude calculée avec coefficient Jaccard pour les protéines

solubles dans le sel des graines des populations étudiées….....................................................

102

Tableau 7.2 : Matrice de distance basée sur coefficient Jaccard…………………………… 102

Résumé

Dans le but de mettre en évidence de marqueurs génétiques liés à la tolérance à

la salinité chez l’espèce M.ciliaris, des prospections ont été faites, dans un premier

temps, proche et loin d’une zone saline nommée la grande Sebkha d’Oran afin de

trouver une variabilité génétique vis-à-vis la tolérance au sel. Dans un deuxième temps,

des génotypes connus de laboratoire de génétique et d’amélioration des plantes ont été

choisis pour enrichir et consolider cette recherche. Le présent travail a porté sur un

total de 11 populations dont quatre sont des références et des sept populations

prospectées, et a commencé, par l’identification morphologique et biochimique des

populations étudiées. Ensuite, une étude de la tolérance au stress salin basée sur la

biométrie de la germination et la croissance au stade de neuf jours, a été réalisée pour

classer les populations étudiées.

Les résultats de l’identification permettent de grouper les populations en deux

taxa M.ciliaris et M.intertexta génétiquement très proches. Les populations P1, P2 et P7

appartiennent au taxon M. intertaxta et P3, P4, P5 et P6 appartinnent au taxon

M.ciliaris. Les résultats de l’étude qui porte sur la réponse des plantules de 11

populations de Medicago annuel, P1,P2, P3P,P4,P5,P6,P7,P8,P9,P10 et P11 au stress

salin, mettent en relief l’effet négatif de la salinité sur le taux de la germination et

indiquent la sensibilité de M.intertexa comparativement à M.ciliaris. Le stress salin

réduit significativement la longueur des racines et des tiges des deux taxa. Les

populations appartenant à M.intertexta accusent une plus grande réduction de la

longueur des deux caractères que M. ciliaris. La réduction au niveau de la biomasse

aérienne est plus importante que la réduction de la biomasse racinaire. Sous stress salin

de 136,7 mM, les populations proches de la sebkha enregistrent les meilleures valeurs

des ITs pour le poids frais racinaire. L’indice de tolérance ITs confirme l’existence de

la variabilité génétique de la tolérance inter taxa et intra pour la longueur et le poids

frais racinaire. Les résultats de l’expression des protéines de réserve des graines

solubles dans le sel comme les globulines par SDS-PAGE montrent la présence d’une

bande de 80 kD spécifique au groupe de populations proches de la Sebkha. Cette

information peut être utile pour la sélection du matériel végétal dans les programmes

d’amélioration des légumineuses en milieu perturbé par une contrainte saline.

Mots-clés: Medicago annuel - stress salin - tolérance - protéines de réserve des

graines - germination - analyse biométrique - protéines solubles dans le sel - globulines

- marqueurs SDS-PAGE.

Abstract

In order to demonstrate genetic markers related to salinity tolerance in M.

ciliaris species, surveys were carried out in the first place near and far from a saline

zone called the Great Sebkha of Oran in order to find a genetic variability to salt

tolerance. In a second step, known genotypes of the genetics and plant breeding

laboratory were chosen to enrich and solidify this research.

The work is carried out on a total of 11 populations, four of which are

references and seven populations are prospected. Starting with the morphological and

biochemical identification of the populations studied. After a study of the evaluation of

the salt stress tolerance based on the biometry of germination and the growth at the

nine-day stage, was made to classify the populations studied. The results of the

identification make it possible to group the populations into two taxa M.ciliaris and

M.intertexta which are two taxa genetically very close. The populations P1, P2 and P7

belong to the taxa M. intertaxta and P3, P4, P5 and P6 belongs to the M. ciliaris taxa.

The results of the study, which examined the response of seedlings of 11

annual Medicago populations, P1, P2, P3P, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10 and P11 to

saline stress, The negative effect of salinity on the germination rate and indicate the

sensitivity of M.intertexa compared to M. ciliaris. Saline stress significantly reduces

the length of roots and stems of both taxa. The populations belonging to the

M.intertexta show a greater reduction in the length of the two characters than M.

ciliaris. Reduction in aboveground biomass is greater than reduction in root biomass.

Under saline stress of 136.7 mM, populations close to the Sebkha recorded the best IT

values for fresh root weight. The IT tolerance index confirms the existence of the

genetic variability of the inter taxa and intra taxa tolerance with respect to length and

fresh root weight. The results of the study of the analysis of the expression of seed

soluble salt reserve proteins such as globulins by SDS-PAGE shows the presence of a

band of 80 kD specific to the group of populations close to the Sebkha. This

information is useful for the selection of plant material in legume improvement

programs in salt-disturbed environments.

Keywords: annual Medicago - salt stress- - tolerance - seed storage proteins-

germination - biometric analysis – salt soluble proteins- globulins- SDS-PAGE

markers.

ممخص

م الؽراثية السختبطة بتحسل السمؽحة لأنؽاع الفرة امؼ أجل تحجيج الأوسة بالقخب والبعج عؼ مشطقة مالحة اليجبية، أجخيت في السخة الاولى دراسات استقرائي

تدسى سبخة وىخان الكبيخة ، وذلغ لمعثؽر عمى التبايؼ الؽراثي السختبط بتحسل السمؽحة مؼ أجل مداعجة وتدييل الجراسة. في وقت لاحق قج تػ اختيار التخاكيب الؽراثية

.البحث الشباتية السعخوف مؼ مختبخ عمػ الؽراثة وتحديؼ الشباتات لإثخاء وتخسيخ ىحا

، 1P ،P2 ،P3 ،P4 ،P5،6P،P7مجسؽعة 11تخكد العسل عمى P8،P9 ،P10 11وP مؼ بيشيػ أربعة مخجعية، وشسمت الجراسة أيزا سبعة أنؽاع

تحجيج اليؽية للأنؽاع سسحت بتختيب السجسؽعات الى مشتقات مؼ الطبيعة . نتائجىسا مؼ M. ciliaris ىجبيةو فرة M.intertexta صشفيؼ اثشيؼ فرة أنتا رتاكدتا

يشتسي إلى أنتا 7Pو 1P ،2Pالأصشاف الستذابو ججا وراثيا حيث أن الأنؽاع التالية إلى الفرة اليجبية. 6Pو 3P ،4P ،5Pرتاكدتا و تشتسي الأصشاف

نؽعا 11سمطت الزؽء نتائج الجراسة عمى الذتلات بالإجياد السمحي عمى ي لمسمؽحة عمى ندبة الإنبات و الشسؽ، و تذيخ إلى سشؽيا لمفرة عمى التأثيخ الدمب

عمى. أثخ الإجياد بالسمح كثيخا مع الفرة اليجبية مقارنة حداسية فرة أنتارتاكدتاطؽل الجحور و الديقان. يعيخ انخفاض كبيخ بالشدبة لمسقياسيؼ السجروسيؼ حيث أن

ت السجسؽعة القخيبة مؼ الكتمة الحيؽية لمديقان تأثخت كثيخا مقارنة مع الجحور. أظيخ بالشدبة لكتمة الجحور التحسلممسؽل، مؤشخات 13637الدبخة تحت الزغط السمح

يؤكج وجؽد اختلاف جيشي داخل الأصشاف التحسلمع السمؽحة قيػ عجدية جيجة. مؤشخ وبيؼ الأصشاف بالشدبة لطؽل الجحور و الؽزن. أظيخت نتائج دراسة تحميل الكيخبائي

SDS-PAGE بيخ في البخوتيشات السخدنة في البحور القابمة لمحوبان في السمح مثل التعكيمؽ دالتؽن تسيد السجسؽعة القخيبة مؼ 88الجمؽبيؽليؼ وجؽد شخيطة بخوتيشية تقجر ب

الدبخة. ىحه السعمؽمات مفيجة لاختيار الشباتات في بخامج لتحديؼ بيئة البقؽليات التي تمفت بدبب الإجياد السمحي.

البروتينات المخزنة في -التدامح -الإجهاد الملحي -: الفصة الدنويةمفتاحية كمساتالهجرة –البروتينات القابلة للذوبان في الملح –التحليل البيومتري –الإنتاش -البذور

. SDS-PAGE الكهربائية بالأسدياس

Sommaire

Dédicace

Remerciements

Liste des abréviations i

Liste des figures ii

Liste des tableaux iii

Résumé

Sommaire

INTRODUCTION GENERALE…….…………...………………………………..... 1

I- REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre 1 : Présentation du genre Medicago …………………………………......... 4

1.1. Taxonomie et génétique……………………………………………………………. 4

1.2. Culture et répartition géographique……...........………………………….……… 4

1.3. Point sur l’espèce étudiée dans cette thèse ………..……………………………… 5

1.3.1. Description de la plante….……………………………………………..…… 6

1.3.2. Caractéristiques climatiques et édaphiques de l’espèce M.ciliaris ……..….. 7

1.3.3. Germination et croissance de la plante………………………………….…… 9

1.3.4. Contraintes de la plante………………………………………………………. 10

1.3.5. Confusion avec les taxa M. intertexta…………………………..…………… 10

1.4. Intérêt du genre Medicago………………………………………….……………… 12

1.4.1. Dans l’agronomie…………………………………………………….………. 12

1.4.2. Dans l’industrie pharmaceutique et médicale………………………………………… 12

1.4.3. Dans les recherches fondamentales…………..…..………………..….……. 12

1.5. Principaux travaux réalisés sur le genre Medicago………………………..……… 12

Chapitre 2: Salinité et stress salin …………………………..…………………...…… 14

2.1. Salinité stress abiotique majeur en agriculture ………….……………….………… 14

2.2. Mesure de la salinité et concentration critique Cs en sels …………….…………… 14

2.3. Classification des sols salés ………………………………………………………… 15

2.3.1. Sols salins…………………….……………………………….……………… 15

2.3.1. Sols salins à alcalins ……………….………………………....……………… 15

2.3.3. Sols alcalins …..……………………………………………………….…… 15

2.4. Cas de la grande sebkha d’Oran ………………..……………………..…………… 16

2.5. Stress salin des plantes …………………………………..…………...…………….. 17

2.5.1. Termes scientifiques……………………………………………………….. 17

2.5.1. Effet du stress salin sur la germination…………………………………...… 18

2.5.2. Effet du stress salin sur la croissance ………………………………..……… 19

2.5.3. Effet sur la teneur les protéines et les enzymes…………………….………… 19

2.5.3. Effet sur la teneur les protéines et les enzymes…………………….………… 19

2.5.4. Protéines et enzymes impliqués en réponse au stress salin…………………. 20

2.5.5. Gènes impliqués aux différents niveaux de salinité……………….….……. 21

2.5.6. Processus de croissance des plantes à différentes échelles de temps

en présence du stress salin………………………………………………………… 21

2.6. Stratégies pour minimiser le problème de la salinité………………………...…… 22

Chapitre 3: Tolérance et adaptation des plantes au stress salin…………………….. 23

3.1. Tolérance des plantes au stress salin ……………………………………..………… 23

3.1.1. Evaluation de la tolérance …………………………………………………… 23

3.1.2. Méthodes de mesure de la tolérance au sel………………………………… 24

3.1.3. Aspect de la tolérance au stress salin …………………………………….… 26

3.1.4. Diversité de la tolérance entre les espèces………………………….……… 26

3.1.5. Complexité du contrôle génétique de la tolérance ……………………….… 28

3.1.6. Héritabilité de la tolérance………………………………………….…….... 29

3.1.7. Approches pour améliorer la tolérance à la salinité……………………...… 31

3.1.8. Différentes approches pour identifier les gènes important de la tolérance

à la salinité…………………………………………………………………………. 33

3.2. Adaptation et acclimatation des plantes au stress salin …………..……..………… 34

3.2.1. Mécanisme de l’adaptation chez les plantes………………..……………… 34

3.2.2. Les formes de l’adaptation des plantes selon Levitt……………..………… 36

3.2.3. La sélection pour améliorer l’adaptation des plantes…………………..….. 37

Chapitre 4: Marqueurs génétiques……………………………………………………. 38

4.1. Le concept biologique d’un marqueur…………………………………………..… 38

4.1.1. Caractéristique des marqueurs génétiques………………………………...... 38

4.1.2. Utilisation des marqueurs génétiques……………………………………….. 38

4.1.3. Principaux types de marqueurs génétiques utilisés…………………………. 39

4.2. Les marqueurs génétiques comme moyens d'étude de la diversité génétique……... 39

4.3. Marqueurs génétiques et méthodes d’études de polymorphisme………………..… 41

4.3.1. Marqueurs morphologique…………………………………………………… 41

4.3.2. Marqueurs biochimiques………………………………….…………………. 41

4.3.3. Marqueurs moléculaires………………………………….………………..… 43

4.4. Marqueurs génétiques et sélection pour la tolérance aux stress salin….………….. 45

4.4.1. Stratégies d’intégration des marqueurs dans les programmes de sélection

des plantes annuelles …………………………………………………………….…….. 46

4.4.2. Exemple de la mise en évidence d’un QTL au moyen des marqueurs

moléculaires………………………………………………………………………...…. 47

4.5. Protéines de réserves des graines comme marqueurs génétiques…….…………… 50

4.5.1. Globulines principales protéines de réserves accumulées dans la graine

chez les légumineuses…………………………………………………….…………….. 50

4.5.2. Nomenclatures structures et fonctions des globulines ……………….…….. 52

4.5.3. Régions PQL (Protein Quantity Loci) pour les globulines 7S et 11S

chez Medicago truncatula…………………………………………………………..….. 55

4.5.4. Globuline 11S comme marqueur d'imbibition au cours de la germination… 56

4.6. Séparation et caractérisation structurelle des globulines chez la luzerne……..…… 57

II-MATERIEL ET METHODES

II.1. Matériel végétal……………………………………………………………………… 59

II.1.1. Zones prospectées et méthodologie de collecte…………………………………… 59

II.1.2. Génotypes fournis………………………………………………………………… 60

II.1.3. Multiplication du matériel végétal et entretien des plantes………………………… 60

II.2. Méthodes utilisées……………………………………………………………………… 60

III-RESULTATS ET DISCUSSION

Chapitre 5: Identification des populations locale de Medicago ciliaris

et évaluation de la tolérance au stress salin au stade de germination…………..….. 61

5.1. Introduction……………………………………………………………………..….. 61

5.2. Matériel et méthodes………………………………………………………..……… 62

5.2. 1.Matériel végétal…………………………..………………………………… 62

5.2.2. Méthodes utilisées……………………………………………………….... 62

5.2. 2.1. Analyse biochimique par SDS-PAGE……………………………………..… 62

5.2. 2.2. Paramètres mesurés…………………………………………………………... 62

5.2. 2.3. Dispositif expérimental………………………………………………………. 63

5.2. 2.4. Mesures et analyses statistiques……………………………………………… 63

5.2. 2.5. Calcul des indices de tolérance……………………………………………… 64

5.2. 2.6. Principe du test ANOVA…………………………………………………… 64

5.3. Résultats et discussion…………………………………………………………..... 66

5.3.1. Identification des populations prospectées……………………………….. 66

5.3. 1.1. Etude de l’herbier…………………………………………………………….... 66

5.3. 1.2. Analyse biochimique par SDS-PAGE……………………………………….. 67

5.3.2. Evaluation de la tolérance au stress salin au stade de germination……….. 68

5.3. 2.1. Effet de la salinité sur la germination………………………………………... 68

5.3. 2.2. Effet de la salinité sur la croissance………………………………………….. 72

5.3. 2.3. Indices de tolérance………………………………………………………….. 80

5.3. 2.4. Analyse de cluster basée sur les valeurs ITs………………………………… 81

5.4. Conclusion………………………………………………………………………... 82

Chapitre 6 : Comparaison de la diversité génétique des populations de M. ciliaris

par l’utilisation des descripteurs IBPGR morphologique de la gousse et des

marqueurs SDS-PAGE……………………………………………………………….. 83

6.1. Introduction……………………………………………………………………….. 83

6.2. Matériel et méthodes……………………………………………………………… 85

6.2.1. Matériel végétal…………………………………………………………… 85

Zone d'enquête………………………………………………………………………… 85

6.2.2. Méthodes utilisées………………………………………………………… 85

6.2. 2.1. Collecte des données et analyse statistique des traits morphologiques…….... 85

6.2. 2.2. Extraction des protéines de réserves des graines…………………………….. 86

6.2. 2.3. Électrophorèse 1-D SDS-PAGE……………………………………………... 86

6.3. Résultats…………………………………………………………………………... 87

6.3.1. Analyse des traits morphologiques des gousses………………………….. 87

6.3.2. Analyse par SDS-PAGE des protéines de réserve des graines …………... 89

6.4. Discussion………………………………………………………………………… 92

6.5. Conclusion………………………………………………………………………... 95

Chapitre 7: L’expression des protéines de réserves des graines solubles dans le

sel comme marqueur pour des populations locales de M.ciliaris adaptées à la

région fortement salées en Algérie (la grande Sebkha d’Oran)………………..… 96

7.1. Introduction…………………………………………………………………….…. 96

7.2. Matériel et méthodes……………………………………………………………… 98

7.2.1. Matériel végétal…………………………………………………………... 98

7.2.2. Méthodes utilisées………………………………………………………… 98

7.2. 2.1. Extractions des protéines solubles dans le sel………………………………... 98

7.2. 2.2. Electrophorèse SDS-PAGE………………………………………………….. 98

7.2. 2.3. Analyse statistique et cluster………………………………………………… 98

7.3. Résultats et discussion……………………………………………………………. 99

7.4. Conclusion………………………………………………………………………... 105

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES................................................ 106

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES…………………………………………… 108

ANNEXES

Introduction générale

1

INTRODUCTION GENERALE

Dans les régions arides et semi arides, la salinité constitue une contrainte

majeure à la productivité et au développement agricole (Rozema et Flowers, 2008 ;

Abdellatef, 2010). En Algérie, les sols agricoles sont dans leur majorité, affectés ou

susceptible de l’être par le problème de salinité. Il est défini comme un processus

d’accumulation et d’enrichissement du sol en sels solubles qui mène à la formation des

sols salins. Ces sols salins sont très répandus dans les basses plaines de l’Oranie, dans la

vallée de Mina près de Relizane, sur les hautes plaines au sud de Sétif et de Constantine,

aux bords de certains chotts et sebkhas. Ils ont aussi une grande extension dans les

régions sahariennes au sud de Biskra jusqu’au Touggourt, Ouargla et au-delà (Durand,

1958, Aubert, 1976). Cette forte charge saline des eaux et des sols présente une

contrainte pour le développement de la plupart des espèces végétales. Cette situation est

aggravée par la raréfaction des réserves en eau douce. Ainsi, la gestion commune des

sols et des eaux est incontournable ou couteuses.

Le genre Medicago bien représenté en Algérie, constitue un patrimoine

génétique extrêmement riche et diversifié pour supporter les changements climatiques et

édaphiques. Ces plantes sont de bons candidats pour l'amélioration des terres marginales

ou dégradées avec une faible fertilité et/ou salinité élevée tels que les bords de Sebkhas

(Merabet et al., 2006 ; Baha et Bekki, 2015). Dans ces zones, plusieurs espèces de

médics vivent en association avec des halophytes et peuvent produire, dans les années

pluvieuses, 40% de la couverture végétale (Abdelly et al., 1999). Ces plantes favorisent

la croissance des halophytes en améliorant la qualité du sol, résultant de leur aptitude à

enrichir le sol en composés azotés. Parmi ces médics, Medicago ciliarisis est l’espèce la

plus tolérante au sel. Dans des conditions contrôlées et en présence de l'azote minéral et

100 mM de NaCl, cette espèce a maintenu sa production de la biomasse par rapport à

Medicago polymorpha, M .truncatula et M. minima (Abdelly et al., 1995).

Par ailleurs, de nombreux chercheurs ont axé leurs travaux notamment sur la

sélection des espèces tolérantes ou adaptées aux conditions de stress soit par une

amélioration génétique qui reste, sans doute, le moyen le plus efficace ou par une étude

approfondie des différents mécanismes d’adaptation qui sont dépendants des

potentialités génétiques de l’espèce (Demarly,1984).D’ailleurs, les possibilités actuelles

permettent d’envisager l'utilisation des marqueurs moléculaires comme caractères

associés au phénotype pour améliorer l'efficacité de la sélection (Lande et Thompson,

1990) en réduisant significativement les programmes d’amélioration.

Introduction générale

2

C’est la raison pour laquelle, il est très important d’avoir, par avance, une variabilité

intra espèces pour la tolérance aux stress salin, qui va permettre, ensuite, de rechercher

les écotypes de M.ciliaris bien adaptées aux conditions de stress puis on sélectionne les

potentiels génétiques souhaités en utilisant des marqueurs. Parmi les marqueurs qui sont

exprimés au stade graine, les globulines sont majoritaires dans les conditions normales

et représentent 50-90% des protéines de réserves des graines de légumes (Rashidah et

al., 2007). Par conséquent, la capacité des génotypes à maintenir des niveaux élevés des

globulines dans les tissus de la graine aux conditions salines, est l'un des mécanismes

clés contribuant à l'expression de la tolérance au sel.

Ce travail a pour objectif la recherche de marqueurs génétiques (globulines) liés

à la tolérance à la salinité susceptibles de permettre la sélection d’un matériel végétal

adapté à des sols à haute teneur en NaCl. Pour cela, des prospections, concernant

l’espèce M.ciliaris, ont été faites à côté et loin de la Grande Sebkha d’Oran d’une part,

suivies d’une identification et une évaluation de la tolérance au stade de germination de

ces populations locales. D’autres parts, une étude biochimique a porté sur

l’électrophorèse des globulines de réserves pour mettre en évidence des marqueurs

biochimiques liés à la tolérance, qui nous permettrait plus tard de cibler les écotypes

résistants ou tolérants au stade graine.

Le présent travail est scindé en deux parties :

- La 1ère

partie : Aperçue général sur l’espèce étudiée M.ciliaris, salinité et stress salin

et les marqueurs génétiques.

- La 2eme

partie : Présentation de l’expérimentation ainsi que les résultats et discussions

et enfin une conclusion générale incluant des perspectives.

I- REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre 1: Présentation du genre Medicago

Chapitre 2: Salinité et stress salin

Chapitre 3:Tolérance et adaptation des plantes au stress salin

Chapitre 4: Marqueurs génétiques

Partie I : Revue bibliographique Chapitre 1

4

Chapitre1: Pre sentation du genre Medicago

1.1. Taxonomie et génétique

Le genre Medicago appartient à la famille des Fabacea, sous famille des

papilionideae. Il comporte 20 espèces herbacées pérennes, 34 herbacées annuelles et

une arbustive (M.arborea), (Lesins et Lesins, 1979). Quiros et Bauchan en 1988

signalent que ce genre est le plus important, représente plus de 60 espèces différentes,

dont 2/3 d’entre elles sont annuelles et 1/3 sont pérennes. Dans une étude taxonomique

plus récente et complète du genre, Small et Jomphe (1989) décrivent 83 espèces de

Medicago. Environ les deux tiers de ces espèces sont annuelles, tandis que les autres,

dont M.sativa, sont vivaces. Il existe au sein de ce genre des espèces allogames et

autogames, diploïdes avec 2n= 16 chromosomes (le nombre de base X=8 et rarement

X=7) et d’autre sont tétraploïdes avec 2n= 4X=32 chromosomes (Lesins et Lesins,

1979).

1.2. Culture et répartition géographique

La plus vieille référence connue de culture de la luzerne cultivée (Medicago

sativa L) date de 1300 ans avant J.C en Turquie. La luzerne cultivée comprend deux

espèces différentes et leurs hybrides, la luzerne faucille (Medicago falcata, L), la

luzerne commune (Medicago sativa,L), la luzerne intermédiaire (Medicago media,

Pers.ou Medicago varia Martyr), hybride de Medicago sativa x Medicago falcata

(Camille,1980). Medicago falcata est originaire de Serbie occidentale, ce qui explique

sa remarquable résistance au froid, l’origine de Medicago sativa est signalée par Soltner

(1999) comme étant méditerranéenne, ce qui confère à cette espèce une adaptation à la

sécheresse. Cette double origine géographique et génétique fait que la luzerne cultivée

soit une des espèces les plus répandues du globe.

Prosperi et al (1995) signalent les aires d’origine de toutes les espèces du genre

Medicago comme étant «le croissant fertile » recouvrant les pays ou régions actuelles de

Turquie, d’Iran, d’Irak, du Sud du Caucase et du pourtour méditerranéen. Ces espèces

ont ensuite conquis l’ensemble de la zone méditerranéenne et les steppes avoisinantes

au cours du XIXéme

siècle, elles ont ensuite envahi d’autres parties du monde

(figure1.1), en particulier les continents américains et australiens à l’occasion des

différents courants de la colonisation humaine ou souvent involontairement, grâce aux

gousses épineuses accrochées à la laine des moutons. Parmi les 55 espèces de Medicago


5

recensées, une dizaine sont cultivées, la plupart sont présentes dans les pâturages ou

parcours, notamment méditerranéens (Lesins et lesins, 1979). Les espèces annuelles de

médics grandissent sur une grande gamme de sols avec des régimes de température, et

longueur de saison croissante (Ewing, 1983).

1.3. Point sur l’espèce étudiée dans cette thèse

La flore algérienne est extrêmement riche en légumineuses spontanées et

particulièrement en Medicago. Ces espèces, se développant vigoureusement dans les

zones arides et semi-arides. Elles constituent un patrimoine génétique riche et diversifié.

Parmi les espèces de ce genre M. ciliaris, M. plymorpha et M.truncatula sont

omniprésentes dans les régions arides et soutiennent l’activité pastorale. L’espèce

M.ciliaris apparut comme espèce la plus prometteuse, elle favorise les sols alcalins et a

une biomasse plus importante (Abdelly et al, 1995). Cette espèce est considérée comme

une bonne plante candidate pour améliorer les terres marginales dégradées avec peu de

fertilité ou de haute teneur de salinité comme les sebkhas et les chotts…etc (Bekki,

1987; Abdelly et al., 1999 ; Abdelguerfi, 1995).

Figure1.1: Distribution mondiale du genre Medicago (Delalande et al, 2007).

Medicago annuel (medics) Medicago pérenne (alfalfa)


6

1.3.1. Description de la plante

M. ciliaris est une luzerne caractérisée par ses fruits sbsphériques densément

couverts de longs poils. C’est une espèce des prairies humides, des cultures et des bors

de chemins. C’est une plante annuelle pouvant mesurée de 20-50 cm de hauteur et voir

plus, d’une couleur est presque glabre. Ses feuilles ont trois folioles qui sont obovales,

dentées dans le haut. Ces fleurs ont de couleur jaunes, assez petites (5-7 mm), 1-3 fleurs

regroupées sur des pédoncules aristés plus courts que la feuille. Les fruits sont des

gousses pubescente, glanduleuse, grande, subglobuleuse, arrondie aux deux bouts, à

faces planes, à 6-10 tours de spire peu serrés, à bords plans et épais, hérissés d'épines

rapprochées, étalées et entrecroisées. Ces graines sont grandes, oblongues en rein et de

couleur noir (figure 1.2).

Figure 1.2: Différents organes végétatifs chez l’accession 74 de M. ciliaris (USDA,

2015 modifié).


7

1.3.2 Caractéristiques climatiques et édaphiques de l’espèce M.ciliaris

La connaissance de l'écologie et de la distribution naturelle de ce complexe

d'espèces permet, d'une part, de définir leurs exigences édapho-climatiques et

d'apprécier leurs adaptations écologiques et, d'autre part, de préciser les limites

naturelles de leur dispersion. Ces deux points constituent l'aspect clé pour l’utilisation et

la sélection de variétés adaptées en vue de l’amélioration des parcours et des pâturages

naturels (Abdelguerfi-Laouar et al., 2003).

Les études sur les exigences écologiques de M.ciliaris ont été comparées à plusieurs

autres taxons du genre Medicago. Ces études sont restées générales, comme celles

menées en Italie (Piano et al., 1991), en Espagne et Portugal (Prosperi et al., 1989), au

Maroc (Bounejmate et al., 1992), en Algerie (Bekki et al., 1987 ; Abdelguerfi et al.,

1988; Adem, 1989; Abdelguerfi, 1995) et en Mediterranee occidentale (Prosperi et al.,

1991 ). Mais les travaux de Abdelguerfi-Laouar et al.,2003 sur l’autoécologie d’un

complexe Medicago ciliaris- M.intertexta montrent que M.ciliaris pousse dans les

régions moyennement à fortement arrosées, à sols alcalins, riches en limons et en

calcaire, En plus elle a été trouvée dans les parcours et les jachères des régions

moyennement humides (> 500 mm), sur des sols lourds et très riches en sodium (Na

supérieur à 170 ppm).

La figure 1.3 représente les 162 sites prospectés. L’ensemble des sites visites balaye les

étages bioclimatiques humide, subhumide, semi-aride et aride.

Figure1.3: Carte de répartition des taxons M.ciliaris (Abdelguerfi-Laouar et al.,2003)


8

Les données de la figure 1.4 proviennent de la base "baseflor" de Philippe

JULVE, 2015, expliquant les caractéristiques climatiques et du sol où se développent les

taxas de M.ciliaris.

Lumière 1 : hypersciaphiles 2 : sciaphiles 3 : intermédiaires 4 : hémisciaphiles 5 : intermédiaires 6 : hémihéliophiles 7 : intermédiaires 8 : héliophiles 9 : hyperhéliophiles

Température

1 : alpines à nivales, altiméditerranéennes 2 : subalpines, oroméditerranéennes 3 : montagnardes 4 : collinéennes, psychroatlantiques 5 : planitiaires à montagnardes 6 : planitiaires thermophiles, thermoatlantiques, thermocontinentales, subméditerranéennes, supraméditerranéennes 7 : euryméditerranéennes, méditerranéo-atlantiques 8 : mésoméditerranéennes 9 : thermoméditerranéennes à subdésertiques

Humidité atmosphérique

1 : aéroxérophiles 2 : intermédiaires 3 : aéromésoxérophiles 4 : intermédiaires 5 : aéromésohydriques 6 : intermédiaires 7 : aéromésohygrophiles 8 : intermédiaires 9 : aérohydrophiles

Continentalité 1 : marines à maritimes 2 : hyperocéaniques 3 : océaniques 4 : subocéaniques 5 : intermédiaires 6 : précontinentales 7 : subcontinentales 8 : continentales 9 : hypercontinentales

Réaction (pH) 1 : hyperacidophiles 2 : acidophiles 3 : intermédiaires 4 : acidoclines 5 : intermédiaires 6 : neutroclines 7 : neutrophiles 8 : basophiles 9 : hyperbasophiles

Humidité 1 : hyperxérophiles 10 : amphibies permanentes 11 : aquatiques superficielles 12 : aquatiques profondes 2 : perxérophiles 3 : xérophiles 4 : mésoxérophiles 5 : mésohydriques 6 : mésohygrophiles 7 : hygrophiles 8 : hydrophiles 9 : amphibies saisonnières

Texture 1 : argile 2 : intermédiaire 3 : limon 4 : sable fin 5 : sable grossier 6 : graviers 7 : galets 8 : blocs, fentes des parois 9 : dalle

Nutriments 1 : hyperoligotrophiles 2 : oligotrophiles 3 : intermédiaires 4 : mésooligotrophiles 5 : mésotrophiles 6 : mésoeutrophiles 7 : intermédiaires 8 : eutrophiles 9 : polytrophiles

Salinité

0 : ne supportant pas le sel 1 : hyperoligohalines, [0-0,1% Cl-] 2 : peroligohalines, [0,1-0,3% Cl-] 3 : oligohalines, [0,3-0,5% Cl-] 4 : mesooligohalines, [0,5-0,7% Cl-] 5 : mesohalines, [0,7-0,9% Cl-] 6 : mesoeuhalines, [0,9-1,2% Cl-] 7 : euhalines, [1,2-1,6% Cl-] 8 : polyhalines, [1,6-2,3% Cl-] 9 : hyperhalines, [>2,3% Cl-]

Matière Organique 1 : lithosol, arénosol 2 : mull carbonaté 3 : mull actif 4 : mull acide 5 : moder 6 : mor, hydromor, xéromor 7 : ranker, tangel 8 : anmoor, gyttja 9 : tourbe

Figure 1.4 : Optimum écologique de M.ciliaris (Julve, 2015 modifié).


9

1.3.3. Germination de la graine et croissance de la plante

La germination des graines débute par une intense absorption d’eau, dont la plus

grande partie va à l’embryon (figure1.5) et une reprise de l’activité métabolique traduite

par une reprise de l’activité respiratoire, elle requiert une activité enzymatique très

importante pour la mobilisation des réserves et le développement de l’embryon. Selon

l’espèce, ces réserves peuvent être majoritairement de nature glucidique, lipidique et/ ou

protéiques. Les réserves de l’albumen ou des cotylédons sont mobilisées. Les enzymes

nécessaires à cette mobilisation tels que ; les hydrolases, les lipases et/ou protéases,

sont alors synthétisées en abondance et parallèlement à une synthèse de gibbérellines

(Heller et al., 1993a).

Figure 1.5 : Graine de M.ciliaris. A : graine ; B : embryon in situ ; C :

transsection de la graine de Medicago ciliaris (Gunn et Ritchie, 1988)

Selon Heller et al (1993b), il y a trois phases importantes durant le processus

germinatif : la première phase commence par l’imbibition avec une forte hydratation des

tissus et une élévation de l’intensité respiratoire, brève (6-12 heures). La deuxième

phase dite ; germination stricto sensu, caractérisée par une stabilisation de l’hydratation

et de l’activité respiratoire à un niveau élevé, brève (12 - 48h), la graine peut être

réversiblement déshydratée et réhydratée sans dommage apparent pour sa viabilité.

Cette phase s’achève avec l’émergence de la radicule hors des téguments séminaux.

Tandis que la dernière phase est caractérisée par la reprise de l’absorption d’eau et une


10

élévation de consommation d’oxygène, correspondant en fait à un processus de

croissance affectant la radicule puis la tigelle. A ce niveau, on doit distinguer l’activité

métabolique de la jeune plantule qui se développe à partir de l’embryon, qui a tendance

à s’exalter de celle du tissu de réserve (albumen, cotylédons), qui a tendance à décroître

par suite de l’épuisement des réserves, à ce stade la déshydratation des tissus cause la

mort de la semence.

Comme beaucoup d’espèces légumineuses, l’une des spécificités de la

croissance de la plante M.ciliaris est le modèle indéterminé de leur développement : la

plante peut produire des organes végétatifs et reproducteurs simultanément. En

conséquence, des organes de nature différente (feuilles, fleurs et gousses) peuvent se

développer simultanément avec les différents âges physiologiques sur une plante

donnée. La partie souterraine qui se compose d’un pivot racinaire et de plusieurs

ramifications, héberge des bactéries fixatrices qui rendent ces espèces symbiotiques.

1.3.4. Contraintes de la plante

Les contraintes de l'environnement représentent les facteurs limitant pour la

productivité agricole et jouent un rôle majeur dans la distribution d'espèces de la plante

à travers différents types d'environnements. À part les stress biotiques causés par les

pathogènes de la plante, il y a une variété distincte de stress abiotiques, tel que la

disponibilité d'eau (sécheresse, flooding), la température extrême (chilling, freezing et

chaleur), la salinité, les métaux lourds (toxicité de l'ion), l’irradiation par les photons

(UV-B), la disponibilité des éléments nutritifs, et la structure du sol. Les stress abiotique

ont, séparément ou en combinaison, des effets nuisible à la fois généraux ou spécifiques

sur la croissance et le développement de la plante, et finalement sur le rendement de la

récolte (limmami et al., 2007).

1.3.5. Confusion avec les taxa M. intertexta

Généralement les taxa spontanés sont les plus confrontés aux problèmes de

systématique. Dans le cas des espèces Medicago ciliaris (L.) Krocker et M.intertexta

(L.) Miller, elles sont très proches et posent des problèmes de classification (Laouar,

1998). L’étude de la variabilité au niveau de différentes populations de ces deux taxa

permet de mettre en évidence certains caractères qui peuvent mieux les distinguer.

L’étude de Cherifi et al 1993 trouve que la distinction entre les deux taxa repose

particulièrement sur le nombre de fleurs par inflorescence et les dimensions de la

gousse.


11

L’étude du polymorphisme isoenzymatique de deux populations naturelles sympatriques

de Medicago ciliaris et Medicago intertexta, révélée par électrophorèse sur gel

d‘amidon, a permis aussi d‘établir le contrôle génétique de quatre systèmes

enzymatiques : GOT, 6PGD, PGI et PGM. Les cinq loci polymorphes mis en évidence,

montrent que ces deux taxa botaniques sont fortement apparentés. Ils semblent

constituer un complexe d‘espèces subdivisé en deux compartiments, l‘un à régime

préférentiellement autogame (M. ciliaris) et l‘autre à tendance allogame (M. intertexta)

(Adelkafi et al., 2001). Dans le souci de clarifier aussi la classification des deux taxa

M.ciliaris et M.intertexta plusieurs études ont été réalisées. Parmi ces études, les travaux

réalisés par Laouar (1998) et Laouar et al. (1999), ont pour objectif de comparer d'une

part, l'influence du milieu d'origine sur le comportement et d'autre part, la relation entre

l'ensemble des caractères biologiques (phénologiques et morphologiques) des deux taxa.

Des matrices de corrélations ont été réalisées sur 9 populations de chaque taxon (origine

algérienne). Les couples de corrélation les plus importants ont fait l'objet de régression

linaire. Les caractères étudiés sont de l'ordre de 45 dont 36 sont phénologiques et

morphologiques et 9 climatiques (pluviométries, températures et étage

bioclimatique…etc) et géographique (altitude). Des relations similaires et d'autre

différentes ont été remarquées pour les deux taxa.

Abdelguerfi et Laouar (2000) ont effectué une recherche sur la caractérisation des

différents types d’infructescences chez le complexe d’espèce M. ciliaris-M. intertexta.

Les résultats montrent que plus le nombre de gousse/infructescence est augmenté, plus

le poids des gousses, le nombre de graines/gousses et le poids des graines sont diminués

chez M. ciliaris. Par contre chez M. intertexta, les plants produisant surtout les

infructescences à trois gousses. L’analyse des populations des deux espèces prises

simultanément souligne l’existence de deux compartiments spécifiques M.intertexta et

M. ciliaris. Abdelguerfi et Laouar (2000), ont étudié aussi l’effet des conditions

bioclimatiques d’origine sur le comportement et la floraison des 63 populations de

Medicago ciliaris (L.) Krocker. Les résultats montrent que le gradient de précocité de la

floraison des populations de M.ciliaris est en relation avec les étages bioclimatiques

(semi-aride, subhumide et humide).


12

1.4. Intérêt du genre Medicago

1.4.1. Dans l’agronomie

De point de vue agronomique, la luzerne est l’une des plantes les plus cultivées

au monde, elle constitue un précieux aliment pour le bétail, limite les pertes de nitrate

par lessivage, améliore la structure des sols et protège contre l’érosion (Le Gall, 1993 ;

Broderick, 2001). Elle est très riche en acides aminés (éléments de base des protéines

végétales), mais aussi en minéraux dont le calcium, le fer, le phosphore, le zinc ou le

cuivre. De plus elle constitue une source importante de chlorophylle.

1.4.2. Dans l’industrie pharmaceutique et médicale

En raison de sa composition chimique exceptionnelle, la luzerne constitue une

plante médicinale de choix, elle est tonique et reminéralisante, luttant contre

l’acidification, elle a des effets purifiants et désintoxiquant pour les tissus, elle contient

des vitamines A et K, elle contient également une substance qui agit de la même

manière qu’une hormone féminine. Ainsi, la rubisco est une protéine utilisée tant dans

le secteur agro-alimentaire que dans l’industrie des cosmétiques et des détergents. Celle-

ci pourrait avantageusement remplacer les protéines de soja dans la nutrition humaine

car elle est beaucoup plus riche en acides aminés essentiels et se rapproche davantage

des protéines laitières. Enfin, elle prévient et combat l’excès de cholestérol. Elle entre

aussi dans la composition d’une boisson diététique appréciée par les athlètes.

1.4.3. Dans les recherches fondamentales

Les chercheurs ont modifié génétiquement la bactérie rhizobium qu'elle héberge

en lui transférant des gènes pour la rendre plus productive en aliments minéraux, et il

semble que la luzerne soit une plante inégalable pour les opérations de transgénèse

visant à lui faire produire des protéines médicamenteuses pour les humains. Il suffit

pour cela de lui transférer le gène humain nécessaire ; des essais avaient été faits avec

des bactéries, le maïs ou le tabac mais les protéines fabriquées par la luzerne sont

beaucoup plus compatibles avec l'organisme humain. Il suffit, à partir de la plante

modifiée, d'extraire régulièrement de ses feuilles le " médicament " qu'elle a fabriqué.

Un champ d'expérimentation immense s'ouvre donc avec l'utilisation de la luzerne

transgénique (Schoutteten, 2004).

1.5. Principaux travaux réalisés sur le genre Medicago

Beaucoup de travaux de recherches ont été réalisés sur les différentes espèces du

genre Medicago. Nous présentons quelques-uns d’entre eux. Les recherches de Chakass

(1984) constituent une contribution biosystématique à l'étude d'espèces annuelles de


13

quatre sections du genre Medicago (L.) sous genre Spirocarpos et d'une espèce

vivace du sous-genre Medicago, section Marinae. Il a notamment tenté de dégager des

nouveaux critères de classification basés sur la corrélation entre divers caractères

foliaires et polliniques. Dans le travail de Classen et al.(1992), les auteurs se sont

intéressés à l’étude des substances phénoliques de 47 espèces de Medicago. Les extraits

des tissus foliaires séchés ont été examinés par chromatographie bidimensionnelle sur

plaques de polyamide ensuite ces données phénoliques sont soumises à une analyse

taxonomico–numérique. Biroljk (1993) a donné un aperçu sur les connaissances

acquises sur la variabilité génétique des espèces pérennes et annuelles du genre

Medicago au Maroc. L’étude concerne 15 espèces annuelles et spontanées. Leur

classification basée sur les données enzymatiques s’accorde partiellement avec la

classification botanique. Néanmoins, l’utilisation des iso enzymes a permis de lever

la difficulté d’identification entre des espèces morphologiquement très proches. Une

étude comparative de la production des gousses de plusieurs populations de

M.orbicularis (L.)Bart et la relation avec les milieux d’origine a été faite par Chebouti

et al.(1995). Les résultats montrent que le poids total des gousses est fortement lié au

nombre de gousses et au poids moyen d’une gousse.


14

Chapitre 2: Salinite et stress salin

2.1. Salinité: stress abiotique majeur en agriculture

La salinité peut être naturelle ou induite par les activités agricoles comme

l’irrigation (avec de l’eau de faible qualité) ou l’utilisation de certains types d’engrais

(Bartels et Nelson, 1994 ; Rubio et al.,1995).La conséquence générale de la présence de

sels dans les sols par les deux phénomènes précédentes est une limitation de la

croissance qui provoque une baisse de rendement. Dans les régions arides et semi

arides, la concentration en sel de la solution du sol peut atteindre 100mM, condition qui

inhibe la croissance de la quasi-totalité des plantes. Pour des concentrations en sel plus

fortes, même la germination peut devenir impossible (Jabnoune, 2008). La salinité est

un problème parmi les problèmes graves qui frappe les terres agricoles. Il est définit

comme un processus d'accumulation et d'enrichissement du sol en sels solubles qui

mène à la formation du sol salin. Elle constitue une contrainte majeure à la productivité

et au développement agricole (Flowers et al., 2005; Abdellatef, 2010).

Actuellement, sur1.5milliard d’hectares de terre cultivée dans le monde, environ

77 millions d’hectares (5%) sont affectés par la teneur excessive en sel (Sheng et al.,

2008).Ainsi, chaque année près de 10 millions d’ha de terres cultivables sont perdus

dans le monde du fait de l’accumulation, au cours du temps, de petites quantités de sel

contenues dans l’eau d’irrigation. Tout agriculteur en système irrigué des zones arides et

semi-arides doit veiller tout particulièrement à ce phénomène. L’académie Nationale

des Sciences de l’USA considère la salinisation des sols et des eaux comme des facteurs

principaux pour des futures catastrophes biologiques.

2.2. Mesure de la salinité et concentration critique Cs en sels

La salinité se mesure par la conductivité électrique en siemens (S) ou mhoms/m.

Sachant que 1S/m=1mhoms/m et 1mhos=1/ohm unité de résistance électrique. La

conductivité de l'eau peut être convertie en mg de sel par litre par la formule suivante:

1dS/m=mS/cm=640mg/l de sels (Marc, 2001).

La concentration critique en sels pour différentes cultures selon Mermoud (2006) est

appelée Cs, c’est le seuil critique au-dessus duquel une chute de rendement significative

se manifeste (mesuré sur un extrait de pâte saturée) (C (g.L-1

)=~0.64 CE (mS.cm-1

).

Pour les cultures sensibles, la concentration critique en sels Cs =2 mS.cm-1 (1.3 g.l-1

).

Elle rassemble la plupart des fruits et des arbres fruitiers ; quelques légumes (carotte,


15

haricot, salade, radis…). Pour les cultures à tolérance moyenne, la Cs = 4 mS.cm-1

(2.5

g.l-1

). On trouve les légumes, les grandes cultures et quelques fruits (olive, raisin, figue,

grenade…). Pour les cultures tolérantes, la Cs = 8 mS.cm-1(5 g.l-1

). Elle favorise le

développement des prairies, coton, orge, colza, betterave à sucre, dattier, cocotier…

Les sols salés de l’Algérie sont caractérisés en général par une conductivité électrique

supérieure à 7 dS/m et un pourcentage de sodium échangeable qui varie de 5 à 60% de

CEC (capacité d’échange cationique) (Aubert, 1976).

2.3. Classification des sols salés

Il existe plusieurs classifications des sols dans le monde ; la classification

américaine, française, russe et celle de la FAO. Parmi ces classifications, celle proposée

par Cherbuy en 1991 qui voit en ces sols, trois grandes classes : sols salins, sols salins à

alcalins et sols alcalins.

2.3.1. Sols salins

Ces sols sont caractérisés par une conductivité électrique de l’extrait de

saturation supérieur à 4 dS/m, un pH inférieur à 8,5 et un pourcentage de sodium

échangeable inférieur à 15%. Selon Hullin, 1983, ce sont des sols qui contiennent des

sels solubles en quantités, telle que la croissance de la plupart des plantes y est freinée.

Ces sols présentent aussi une perméabilité égale ou supérieure à celle des sols similaire

non salés. Ils sont pauvres en Na, mais riches en sels blancs (Chlorures, sulfates,

carbonates de Ca ou Mg).

2.3.2. Sols salins à alcalins

Ils sont caractérisés par une conductivité électrique de l’extrait de saturation

supérieur à 4 dS/m et un pH supérieur à 8,5. Par définition ce sont des sols qui

contiennent suffisamment de sels solubles et de sodium échangeable supérieur à 15%

(Hullin, 1983). La structure de ces sols généralement bonne mais pouvant se dégrader,

leur perméabilité dépend de la teneur et de la nature de la fraction argileuse des sols

(Daoud, 1993).

2.3.3. Sols alcalins

Ces sols sont caractérisés par une conductivité électrique de l’extrait de

saturation inférieur à 4 dS/m, un pH compris entre 8,5 et 10, un pourcentage de sodium

échangeable supérieur à 15%. Selon Hullin (1983) ces sols contiennent suffisamment de

sodium échangeable mais ils ne contiennent pas des quantités excessives de sels

solubles. D’après Daoud (1993), ces sols présentent une faible perméabilité. Ils sont

foncés grâce à la forte concentration de Na.


16

2.4. Cas de la grande sebkha d’Oran

Le bassin de la Grande Sebkha d’Oran est situé dans le Nord-Ouest de l’Algérie

où domine un climat semi-aride à aride (Benziane et al., 2012).

La Sebkha d’Oran s’étend au Sud de la ville d’Oran (figure 2.1). Il s’agit d’une

dépression fermée occupant une superficie de 56870 ha, limitée au Nord par le massif

du Mordjadjo dont l’altitude maximale est de 589 m, et au Sud, par le massif de Tessala

dont l’altitude maximale est de 106 m. Alimentée par les eaux de ruissellement du

bassin hydrographique, l’eau de la sebkha est toutefois salée. La grande Sebkha est

formée par une mince pellicule d’eau dont l’intérieur est dépourvu de végétation.

Autour de la Sebkha subsiste une végétation halophile composée de Sueda sp., de

Juncus sp.,et de petites touffes de Chamaerops humilis, quelques rares spécimens de

tamaris se trouvent près des rives (voir annexe1 ; carte 1). Ainsi les eaux de la bordure

Nord de la sebkha correspondant au couloir Misserghin-Brédéah (annexe1;carte 2)

s’avèrent les plus salées avec une mauvaise qualité (annexe6). La zone, située à

l’extrême Est du lac, présente des valeurs moins élevées. Les sols du pourtour du lac

sont dominés par une classe de salinité comprise entre 1,47 et 23,73 dS/m de CE

(conductivité électrique). La vaste plaine du couloir Misserghin-Brédéah située à côté

de la grande sebkha d'Oran a connu une dégradation importante au fil des temps et

continue à subir cette dégradation jusqu'à nos jours. Plusieurs causes sont à l'origine de

sa dégradation et la salinité désigne un des majeurs processus de destruction. Dans ce

cas-là, la gestion des terres salinisées exige des pratiques agronomiques spécifiques.

Figure 2.1 : Localisation de la grande Sebkha d’Oran (Moussa, 2007).


17

2.5. Stress salin chez les plantes

2.5.1. Termes scientifiques

Il est nécessaire de définir plusieurs termes scientifiques importants utilisés ici.

Le stress au sel est l'exposition des plantes à la salinité, dont le composant principal est

le NaCl. Le stress au sel peut être sous l'une des deux formes: (1) une exposition

progressive aux niveaux croissants de NaCl ou (2) l'exposition des plantes à de faibles

niveaux de salinité ou cela peut être une combinaison des deux.

Le choc de sel est une forme extrême de stress salin, où les plantes sont soudainement

exposées à un niveau élevé de salinité. Le choc de sel survient rarement dans la pratique

agricole ou dans les écosystèmes naturels, car l'augmentation de la concentration de

NaCl dans les sols se produit progressivement, par l'augmentation de la nappe

phréatique, la pénétration profonde des racines, ou le séchage lent du profil du sol et

l'élimination de l'eau du sol par évaporation et transpiration (Shavrukov, 2013).Une

représentation graphique des méthodes courantes d'application de sel utilisées dans les

expérimentations, et une comparaison avec des augmentations naturelles de la salinité

du sol, est présentée dans la figure 2.2 où l’application soudaine (en une seule étape) de

NaCl (ligne continue) et une application progressive de sel (ligne pointillée) par rapport

aux changements de salinité dans le profil supérieur du sol pendant le séchage du sol

(ligne pointillée)

Il existe deux composantes principales du (stress salin / choc salin:): composants

osmotiques et ionoc.

Figure 2.2: Représentation schématique de deux différentes formes d’application du sel

utilisée dans des expériences avec des plantes (Shavrukov, 2013)


18

Le choc de sel induit immédiatement un choc osmotique, lorsque les plantes sont

soudainement exposées à de grandes différences d'osmolarité (pression osmotique) entre

des solutés externes avec une forte concentration de NaCl et des solutés internes dans le

cytoplasme cellulaire. Le stress osmotique en tant que premier composant du stress salin

est caractérisé par des différences relativement faibles dans la pression osmotique à

l'intérieur et à l'extérieur des cellules et se produit plusieurs temps consécutifs si les

plantes sont exposées à une augmentation progressive des concentrations de NaCl.

L'ajustement osmotique se réfère à l'ajustement de la pression osmotique à l'intérieur

des cellules végétales en réponse au stress osmotique et doit être beaucoup plus fort si

les plantes doivent survivre aux effets du choc de sel (osmotique). Le composant

ionique du stress / choc du sel suit la réponse osmotique, avec un retard de temps car la

concentration d'ions Na+ doit atteindre un niveau toxique dans le cytoplasme des

cellules végétales (Shavrukov, 2013). Pour la plupart des plantes agricoles, la sensibilité

à l’excès du sel est communément (mais pas exclusivement) dû à l'abondance de sodium

(Na+) dans le sol, ce dernier en excès est toxique aux plantes indépendamment d’anion

compagnon (Munns et al., 1993; Ashraf, 1994). Les Plantes qui sont capables de

compléter leurs cycles de vie dans les environnements salins, montrent ou non une

réduction de la croissance à fortes concentrations en sodium (Na+) dépassant les 200

mM se sont des " halophytes". Par contraste," les glycophytes" montrent une croissance

dramatiquement réduite (Flowers, 1977; Greenway et al., 1980). Pour les glycophytes

qui se développent dans les environnements salins, le stress par les ions sodium (Na+)

peut affecter plusieurs processus physiologiques, de la germination de la graine au

développement de la plante.

2.5.1. Effet du stress salin sur la germination

La germination de la graine et la croissance précoce de la plante sont les stades

critiques de la vie de la plante, souvent représentant les hauts taux de mortalité. Les

graines et les jeunes plants peuvent être moins stress-résistants que la plante adulte ou

peuvent être exposés aux variations environnementales plus extrêmes. La salinité peut

être le facteur limitant le succès de la germination et l’établissement de la croissance.

Quand les graines sont exposés aux conditions salines, la germination est affectée de

deux manière ; premièrement, le haut potentiel osmotique du milieu empêche l’embryon

de prendre l’eau, et deuxièmement, l’effet toxique des ions spécifiques cause

l’empoisonnement de l’embryon (Pollack et Waisel, 1972). La germination de plusieurs

espèces est affectée par un potentiel osmotique réduit plus que par l’effet spécifique des


19

ions. Néanmoins, la croissance de la radicule est inhibée fortement par les ions

spécifiques.

2.5.2. Effet du stress salin sur la croissance

Généralement, La salinité entraîne une réduction considérable de la croissance et

de la production des plantes (Rengasamy, 2006; Katerji et al., 2009). Les milieux riches

en chlorure de sodium sont caractérisés par une abondance des ions Na+ et Cl

-. Les ions

Na+ perturbent l’absorption des cations (K

+, Ca

2+). Alors que l’accumulation excessive

du chlorure diminue l’absorption des anions indispensables à la croissance et au

développement des végétaux en particulier les nitrates et les sulfates (Mezni et al.,

2002). Pour les plantes de la famille des légumineuses, la salinité peut limiter la

croissance, en causant les deux effets de stress ; effet hyper ionique et hyper osmotique

et ainsi une dépression de la performance symbiotique, elle induit aussi une diminution

de l’efficacité de la photosynthèse, la fixation de nitrogène et le métabolisme du carbone

(Garg et Singla, 2004). D’une façon générale, les stress extrêmes conduisent au nanisme

de la partie aérienne et à l’inhibition de la croissance racinaire. Les feuilles deviennent

sclérosées avant même d’avoir fini leur croissance et l’organisme tout entier risque de

dépérir assez vite.

2.5.3. Effet du stress salin sur les protéines et les enzymes

Durant le début et le développement d’un stress causé par la salinité, tous les

processus majeurs tels que les osmolytes compatibles, la synthèse des protéines,

l’activité des enzymes et le métabolisme de lipides, sont affectés (Mohamed et al.,

2007). Les essais in vitro sur les enzymes et les protéines à des concentrations

moyennes de NaCl, montrent qu’ils sont sensibles par rapport à ceux qui présentent en

totalité dans les tissus (in vivo) de la plante entière (Flowers, 1977). L’étude des

protéines et des enzymes en condition de stress par l’électrophorèse, permet de mettre

en évidence des variations de taille ou de charge pour un même système enzymatique,

ces dernières appelées iso enzymes (Yahia et al., 2014, Saadelah et Fyad-Lamèche,

2015). Ces marqueurs protéiques sont les plus souvent utilisés précédemment en

amélioration des plantes et en génétique appliquée (Tanksley, et Ortan, 1983;

Sandemeier et al., 1981).


20

2.5.4. Protéines et enzymes impliqués en réponse au stress salin

Les cellules végétales peuvent modifier leur expression des gènes afin de tolérer

le stress salin, ce qui entraîne une augmentation, une diminution, une induction ou

suppression totale de certaines protéines sensibles au stress telles que malate

déshydrogénase (NADP+) et pyruvate phosphate dikinase (Ngara et al., 2012).

Différentes familles de protéines qui ont été récemment synthétisées, accumulées ou

diminuées sont connues pour être associées à la réponse des plantes au stress salin

(tableau 2.1). Ces protéines peuvent être impliquées dans la signalisation, la traduction,

les mécanismes de défense des plantes, le métabolisme des glucides et le métabolisme

des acides aminés. D'autres protéines telles que les enzymes antioxydantes et les

chaperonines peuvent rencontrer directement des facteurs de stress salin et d'autres

groupes de protéines comme l'enzyme clé dans la synthèse d'osmolyte rencontrent

indirectement le stress salin (Wang et al., 2004).

Tableau 2.1 : Protéines majeures identifiées chez les plantes cultivées sous un stress

salin en utilisant la protéomique (Aghaei et Komatsu, 2013 modifié).


21

2.5.5. Gènes impliqués aux différents niveaux de salinité

Beaucoup de gènes identifiés dans des expériences impliquant un stress salin

sont directement liés aux réponses des plantes aux chocs osmotiques. Laturgence

cellulaire; maintenance, accumulation de sucres solubles, autres osmolytes et le bilan

hydrique sont les processus les plus importants de l’ajustement de l'osmose et ils sont

contrôlés par des gènes avec fonction osmotique (Munns, 2005).

Un certain nombre d'études signalées utilisant le sel soudain (en une seule étape). Ces

études sont représentatives de la majorité des recherches publiées, ainsi ceux qui ont

mené par Munns (2005) aboutissent à conclure que toutes les études d'expression des

gènes étaient des études sur le choc du sel. Cependant, Shavrukov (2013) est suggéré

que de faibles niveaux d'application de NaCl (25-50 mM de NaCl) peuvent être décrits

comme un stress salin doux parce que ces concentrations ne provoquent pas de

plasmolyse dans les cellules des racines. Les niveaux intermédiaires de sel (80-100 mM

de NaCl) peuvent ou non induire un choc osmotique, et des niveaux élevés de salinité

(NaCl 150-300mM) provoquent un choc salin et une plasmolyse dans les cellules des

racines (tableau 2.2). En dépit de la variabilité de l’application de NaCl, toutes les

études énumérées dans le (tableau 2.2) ont initialement été rapportées comme des

expériences de choc salin.

2.5.6. Processus de croissance des plantes à différentes échelles de temps en

présence du stress salin

Le tableau 2.2 résume la séquence d'événements dans une plante sensible

lorsqu’elle est exposée à la salinité. Dans les premières secondes ou minutes, les

cellules perdent l'eau et le rétrécissement s’installe. Au cours des heures, les cellules

retrouvent leur turgence et leur volume originaux, mais les taux d'allongement cellulaire

dans les tissus en croissance sont réduits, ce qui entraîne des taux plus faibles de

croissance des feuilles et des racines. Au cours des jours, des taux plus faibles de

croissance des feuilles et des racines peuvent être observés. Au cours des semaines, des

changements bruts dans le développement végétatif sont évidents, comme la réduction

de la formation des pousses latérales et durant de mois les changements dans le

développement reproductif. Dans les espèces sensibles au sel, qui sont souvent moins

capables de contrôler l'absorption et le transport interne du sel, les feuilles meurent

prématurément et la plante ne peut pas pouvoir produire suffisamment de photosynthèse

pour compléter son cycle de vie (Munns, 2010).


22

Tableau 2.2 : Effet de la salinité sur la croissance des plantes à différentes échelles de

temps et événements métaboliques impliqués (Munns, 2010 modifié).

2.6. Stratégies pour minimiser le problème de la salinité

Généralement, il y a deux approches/stratégies majeurs pour minimiser les effets

délétères de la salinité élevée des sols et des eaux et les deux doivent être appliqués pour

obtenir une production durable en présence excessive du sel (Epstein et al., 1980).

L’une des approches technologiques, qui mettre en place une large ingénierie de plans

pour sa réclamation ; tel que le drainage de sols et l’irrigation par l’eau de haute qualité.

Mais parce que ces méthodes sont chères et ne sont pas toujours pratiquées. De plus ils

ont fourni souvent des solutions temporaires pour ce problème. L’étude de la tolérance

de la plante au sel, visant à identifier et manipuler éventuellement les gènes impliqués

dans la perception et la réponse au sel, paraît une autre approche plus prometteuse

(Quesada et al., 2002). Il peut être nécessaire de sélectionner des variétés qui ont une

plus grande tolérance au sel. Les plantes tolérantes aux sels peuvent, donc, être une

alternative raisonnable pour beaucoup de pays en voie de développement. La sélection

des génotypes tolérants au sel est une approche fondamentale que l'on considère

économiquement faisable (Blum, 1988, Ashraf et al., 2008).


23

Chapitre 3: Tole rance et adaptation des plantes au stress salin

3.1. Tolérance des plantes au stress salin

Le terme tolérance au stress chez les plantes n’est pas utilisé uniformément dans

la littérature. En premier, la tolérance désigne seulement un caractère, le maintien des

fonctions de la vie contre une agression environnementale et la survivance contre un

stress (Dingkuhn, 1985).

La tolérance au sel est définie comme la capacité d’une plante de grandir et

compléter son cycle de vie sur des substrats salins qui contiennent des hautes

concentrations de sel, principalement le NaCl, mais quelquefois aussi autres sels y

compris le sel du calcium et sulfates (Jeschke, 1984 cité par Howat, 2000)

Du point de vue de l’améliorateur, la tolérance au stress peut être décrite comme

l’aptitude à maintenir constamment une production élevée, à l’égard des différentes

agressions environnementales limites ou létales pour les plantes sensibles ; ce concept

est connu comme étant la stabilité du rendement (Cattivelli et al., 2002). Certaines

phases du cycle de développement des plantes (germination, floraison) sont

particulièrement sensibles.

3.1.1. Evaluation de la tolérance

L’évaluation de la tolérance au NaCl porte sur la production de matière fraîche,

la teneur en protéines solubles, les activités phosphoénolpyruvate carboxylase et

enzyme malique à NADP des organes aériens de différents mils (Bouraïma et al., 1986).

L’indice de tolérance à la salinité permet aussi d’évaluer la tolérance. Ce dernier est le

rapport entre la matière sèche de la plante entière (pousse + racine) obtenue en condition

de stress et celle obtenue par le témoin (Garg et Singla, 2004) selon l’équation suivante :

STI = (TDW at Sx / TDW at Si) x 100

ou: TDW: total dry weight

Si: control treatment

Sx: x treatment


24

3.1.2. Méthodes de mesure de la tolérance au sel

La tolérance au sel est habituellement considérée comme le pourcentage de

production de biomasse dans la solution saline par rapport aux conditions de contrôle

pendant une période prolongée. Les méthodes de dépistage qui évitent le besoin de

contrôles croissants sont souhaitables, car une grande quantité d'espace est nécessaire

pour pousser les contrôles sous des niveaux lumineux optimaux et obtenir une

croissance suffisante car les influences environnementales sur le taux de croissance sont

importantes (Munns et James, 2003). Lors de la comparaison des espèces locales par

rapport aux cultivars, ou des types sauvages par rapport aux mutants, il est probable

qu'il y ait de grandes différences génotypiques dans la hauteur ou la surface foliaire, et

l'espace est nécessaire pour éviter l'ombrage des génotypes plus petits par les plus

grands.

Des méthodes de dépistage spécifiques qui évitent le besoin de comparaison

avec les plantes dans des conditions de contrôle sont résumées dans le tableau 3.1. Ces

méthodes ont été utilisées pour filtrer les variations naturelles, mais peuvent également

être utiles pour le dépistage de populations mutantes si les nombres peuvent être réduits

à un niveau réalisable. Les récoltes destructrices peuvent être remplacées par des

récoltes non destructives si un système d'imagerie automatisé est disponible (Rajendran

et al., 2008).

La survie est parfois utilisée comme indice de tolérance au sel, lorsqu'il s'agit

d'un grand nombre de génotypes. La survie peut être mesurée comme pourcentage de

plantes vivantes après une période de temps donnée à une salinité donnée.

Alternativement, s'il existe une gamme de salinités, la survie peut être mesurée comme

la salinité à laquelle 50% des plantes sont mortes. L'inconvénient de cet indice est qu'il

ne donne guère d'idée de la façon dont une plante peut effectivement croître dans des

conditions salines (Munns, 2010).

Une conception expérimentale réaliste devrait éviter de grands chocs

osmotiques, éviter la carence en Ca induite par le sel, optimiser les conditions

ambiantes, en particulier si les contrôles sont cultivés et s'assurer que les racines ne sont

pas contraintes par de petits pots qui sont engloutis à la base.

Il n'est pas possible d'être prescriptif de la durée pendant laquelle les plantes

devraient être cultivées avant que les différences génotypiques de tolérance au sel ne

soient observées. La deuxième phase commencera plus tôt dans les plantes qui sont des


25

exclusions pauvres de Na+, comme les lupins ou les haricots, et lorsque les salinités sont

plus élevées.

Il commencera également plus tôt lorsque les températures des racines sont plus

élevées. Pour les plantes telles que le riz cultivé à des températures élevées, 10 à 15

jours de salinité sont suffisants pour générer des différences génotypiques dans la

biomasse qui correspondent bien aux différences de rendement (Aslam et al., 1993).

Tableau 3.1: Techniques utilisées pour dépister un grand nombre de génotypes pour la

tolérance à la salinité dans des serres ou des environnements contrôlés (Munns, 2010).


26

3.1.3 Aspects de la tolérance au stress salin

Trois aspects de la tolérance au sel sont retenus dans l’étude du stress salin :

l’homéostasie, la détoxication et l’influence de la croissance. Ces trois voies de

réaction des plantes au stress salin se composent d’une cascade d’événements

physiologiques et biochimiques (voir figure 3.1).

L’homéostasie est garantie par différents processus, en cas de stress salin, toute

une série de gènes sont particulièrement activés, codant pour des protéines

responsables du maintien de l’homéostasie. Ce sont les gènes SOS (Salt Overly

Sensative). La protéine SOS3 interagit avec SOS2 qui est une sérine/ thréonine

protéine kinase.

Les mécanismes de détoxication peuvent être divisés en 2 catégories selon qu’ils

impliquent des enzymes de façon directe ou indirecte. La détoxification indirecte met

en jeu des molécules et peptides permettant à la cellule de maintenir son équilibre

oxydo-réducteur, principalement l’ascorbate et le glutathion, mais aussi le tocophérol,

les flavonoïdes, les alcaloïdes et les carotenoïdes. Plusieurs enzymes sont impliquées

dans la détoxication directe, ce sont principalement les superoxydes dismatases (SOD),

les ascorbate péroxydases (APX), les glutathion péroxidases (GPX) et les catalases

(CAT). Les SOD constituent la première forme de défense en catalysant la génération

d’H2O2 à partir d’O-2. Les CAT, GPX, et APX agissent ensuite en éliminant le

peroxyde d’hydrogène (Roeder, 2006).

Le troisième aspect de la tolérance c’est le contrôle dans la croissance de la plante. Il

peut se baser sur des études comparatives de l’état de la plante à différentes jours de

croissances dans des milieux riches en sel. Des études menées dans ce but prouvent que

T. halophila a une résistance accrue face au sel, supportant une accumulation de sel

dans ses feuilles sans dommages physiologiques (M’rah et al., 2006).

3.1.4. Diversité de la tolérance entre les espèces

Hagemyer (1996) signale que les plantes ne sont pas égales face au stress salin.

Suivant leur production de biomasse en présence de sel, quatre grandes tendances ont

été discernées (figure 3.2):

Les halophytes vraies, dont la production de biomasse est stimulée par la

présence de sel. Ces plantes présentes des adaptations poussées et sont

naturellement favorisées par ces conditions : Salicornea europaea, Suaeda

maritima ….


27

Figure 3.1: Les trois aspects de la tolérance au sel dans les végétaux (Homéostasie,

détoxification et l’influence de la croissance) et les liens qui les interconnectent (Zhu, 2001).

Fugure 3.2: Production de biomasse de différents groupes de plantes suivant la salinité.

(1) : Halophytes vraies, (2) halophytes facultatives, (3) : Non-Halophytes résistantes, (4)

Glycophytes (d’après Hagemeyer, 1996).


28

Les halophytes facultatives, montrant une légère augmentation de la biomasse

à des teneurs faibles en sels : Plantago maritima…

Les Non-halophytes résistantes, supportant de faibles concentrations en sel :

Hordeum sp…Les Glycophytes ou Halophobes, sensibles à la présence de sel :

Phaseolus vulgaris, Glycine max…

3.1.5. Complexité du contrôle génétique de la tolérance

Probablement la première tentative à évaluer l'hérédité de la tolérance au sel a

été faite par Lyon (1941). Un croisement interspécifique entre Lycopersicon

esculentum et L. pimpinellifolium ont montré que le rendement du fruit de l'hybride

était plus sensible à la concentration croissante de sel (sulfate du sodium) que celui de

l'un et l'autre plante mère. D’autres croisements de variétés sauvages et cultivées de la

tomate ont suggéré une génétique complexe. Pour l’élongation de tiges sous les

conditions saline (NaCl), l’hétérosis des hybrides de L. esculentum apparait productif

avec trois espèces sauvages (L. cheesmanii, L. peruvianum, et L. pennellii = Solanum

pennellii) (Tal et Shannon, 1983). L'élongation de la tige était un trait dominant dans

les hybrides avec S. pennellii, mais pas avec L. cheesmanii comme parent. Sous les

conditions salines, la production de la matière sèche totale d'un autre hybride F1, entre

L., esculentum et L. pennellii, a montré une vigueur hybride (Saranga et al., 1991).

L'analyse d'autres espèces a aussi suggéré que la génétique de tolérance du sel est

complexe.

Chez le riz, la stérilité est un facteur important sous les conditions saline, elle est

déterminée par au moins trois gènes (Akbar et al, 1972; Akbar et Yabuno, 1977). Dans

l’analyse du diallèle, les effets de la salinité sur les stades de la plante et sur la stérilité,

ont suggéré les deux effets l’additivité et la dominance, avec une héritabilité élevée

(Moeljopawiro et Ikehashi, 1981; Akbar et al., 1986). La mise en évidence de la

dominance de la tolérance a été réalisée sur Pigenopea (cajanus cajan), où le

croisement avec Atylosia albicans (l’un des parents les plus tolérants au sel relatif à

Pigenopea) donne des hybrides interspécifiques qui se comportent comme le parent

sauvage, en indiquant que la production du poids de la matière sèche est déterminée par

un facteur génétique dominant (Subbarao et al., 1990). Il y a également la dominance

de la tolérance du sel chez le sorgho. L’analyse du diallèle basée sur l’évaluation de la

tolérance à NaCl (la longueur relative de racines traitées comparés avec les témoins),

montre qu’il y avait des effets additifs et de dominance (Azhar et McNeilly, 1988).


29

Ces exemples suggèrent que l’estimation de la tolérance est compliquée par les

changements qui se produisent pendant l’ontogénie d’une plante. Et elle peut être

techniquement difficile dans les conditions de champs. Il est évident qu’un trait

génétiquement complexe (Shannon, 1985) montre des effets d’hétérosis, de la

dominance et des effets additifs.

La tolérance des plantes au sel est un trait complexe qui est considéré

polygénique par beaucoup d'auteurs et d'où la difficulté à le disséquer et à étudier. Cela

peut expliquer le peu de succès des programmes développés dans le but d'obtenir des

variétés capables de tolérer le stress salin en restant productives dans les conditions

salines (Flowers et Yeo, 1995). De plus, la série de croisements nécessaires pour

compléter un programme de sélection et viser l'introgression de gènes responsables

pour des traits désirables, consomme beaucoup de temps, et il n'est pas toujours

possible de trouver les parents sauvages d’une espèce cultivée donnée qui affichent les

traits d'intérêt (Barkla et al., 1999).

3.1.6. Héritabilité de la tolérance

La tolérance au sel est un caractère complexe, quantitatif et génétique contrôlé

par de nombreux gènes. Le contrôle génétique de la tolérance au sel chez les plantes n'a

pas été entièrement compris en raison de sa complexité. Il existe de nombreux gènes

contrôlant la tolérance à la salinité dans les différentes espèces végétales (Nazima et al.,

2014). Beaucoup de travaux confirment que la tolérance des plantes au sel est

déterminée par de multiples loci. Par exemple dans un croisement inter générique chez

Lycopersicon. esculentum et L.pimpinellifolium ; des Qtlst sont trouvés associés avec le

rendement en fruits chez les plants qui grandissent sous les conditions salines (Breto et

al., 1994). Bien que quelques-uns de ces Qtls identifiés, se soient montrés plus tard

dépendants des lignées parentales utilisées pour le croisement (Monforte et al., 1997a).

Plusieurs Qtls associés aux aspects du rendement en fruits, ont été trouvés même

si les plantes grandissent avec ou sans sel. D’autres Qtls ont été détectés seulement sous

conditions salines ou non salines (Monforte et al., 1997b). Ces travaux montrent que les

Qtls sont sensibles au traitement.

D’autres croisements ont aussi identifié des Qtls non-spécifiques et des Qtls spécifiques

pour les deux stress (salin et froid): généralement, les Qtls de stress non- spécifiques

montrent des effets individuels plus grands et expliquent une plus large portion de la

variation phénotypique totale sous chaque condition, que les Qtls de stress spécifiques

(Foolad et al.,1999).Comme les Qtls identifiés pour le rendement des fruits, les Qtls


30

associés avec la germination dépendent des conditions sous lesquelles cette germination

s’établit (Foolad et al.,1999). Une situation similaire existe chez le Citrus, où environ la

moitié des Qtls identifiés dépendent de la présence ou de l’absence de la salinité (Tozlu

et al., 1999a), et chez le riz (Gong et al., 1999, 2001) où moins de 10% de Qtls ont été

détectés à la fois en présence et l’absence de sel. En clair, les déterminants majeurs du

rendement varient avec les conditions environnementales et les traits quantitatifs

présentent typiquement une large interaction (environnement x génotype).

L’utilisation de la tomate a été aussi importante pour établir que les Qtls

associés avec la tolérance varient avec les stades de développement de la plante. Les

Qtls associés avec la tolérance au stade de germination (Foolad et al., 1997, 1998 ;

Foolad, 1999) et à la croissance végétative (Foolad and Chen, 1999; Foolad et al., 2001)

diffèrent. Les telles différences ne sont pas restreintes à la tomate, elles ont été

démontrées chez Arabidopsis (Quesada et al., 2002), les céréales à la fois l’orge (Mano

et Takeda, 1997) et le riz (Prasad et al., 2000). Des Qtls associés avec les aspects de

transports ioniques ont aussi été rapporté chez le Citrus (Tozlu et al., 1999b) et chez le

riz (Koyama et al., 2001).

Probablement, les traits liés à la tolérance au sel les mieux étudiés sont ceux

associés au contenu en ions de la plante qui grandit en présence de sels. Bien que la

capacité d'exclure le chlorure chez le genre Glycine montre une hérédité mendélienne

simple (Abel, 1969), elle prouve des complications introduites par les interactions avec

le phosphate (Grattan et Maas, 1984, 1988). Chez la vigne, l'exclusion du chlorure

parait être héritée comme un trait qualitatif ou bien quantitatif, selon les parents (Sykes,

1992), tandis que dans les croisements interspécifiques de Citrus, l'accumulation du

chlorure a montré une variation continue parmi les descendances ce qui suggère que

c'est un trait polygénique, quoique la base héritable est forte (Sykes, 1992).

Chez Trifolium repens, l’héritabilité de l'accumulation du chlorure estimée par la

régression parent-descendant, est seulement modérée (Rogers et al., 1997), mais elle est

suffisante pour une accumulation nette de chlorure et est utile dans la sélection de

génotypes tolérants au sel. Enfin, on peut dire que chez les plantes, le déterminisme de

la tolérance à des stress abiotiques est extrêmement compliqué et la résistance est un

trait quantitatif qui est contrôlé par plusieurs gènes ( Zou Wang- hao et al., 2007).


31

3.1.7. Approches pour améliorer la tolérance à la salinité

Flowers et Yeo (1995) ont suggéré cinq voies possibles appropriées au

développement de variétés tolérantes au sel :

(1) développer les halophytes comme des variétés alternatives;

(2) utiliser l'hybridation interspécifique pour élever la tolérance de variétés courantes;

(3) utiliser la variation présente déjà dans les espèces existantes ;

(4) produire la variation dans les espèces existantes en utilisant la sélection récurrente,

la mutagenèse ou la culture de tissus, et (5) reproduire les espèces pour le rendement

plutôt que la tolérance.

Bohnert et Jensen (1996) réclament une approche importante qui avait été

manquée par Flowers et les Yeo, ils écrivent que; «la sélection de la tolérance doit être

accompagné par la transformation» et que « les transferts réussis des espèces tolérantes

exigeront une ingénierie métabolique à grande échelle, ce qui doit inclure le transfert

de beaucoup de gènes». Tandis qu'une telle approche n'était pas faisable dans le début

des années 1990s (Flowers et Yeo, 1996); cette approche est maintenant largement

recommandée. Quelques 13 espèces ont été transformées avec presque 40 gènes dans

des expériences rapportées entre 1993 et 2003 (tableau 3.2). La majorité des

expériences ont utilisé le riz, le tabac et l’arabette; les transformations qui impliquent la

synthèse de solutés compatibles, ont été plus populaires que toutes les autres, le plus

communément avec celles impliquant la bétaïne de la glycine (Flowers, 2004). Il y a un

nombre croissant de réclamation que la tolérance peut être manipulée à travers des

modifications dans l'activité d'un ou deux gènes. Pour un trait aussi complexe que la

tolérance au sel cela paraît improbable intuitivement. La clef fondamentale c’est

l’importance de composants individuels ou les sous traits de la tolérance au sel et si le

changement d’un seul gène ou de plusieurs gènes peut modifier la tolérance, cela

suggère soit que le changement de la concentration de quelques composants clefs a un

effet essentiel sur une grande gamme d’autres processus, soit cette tolérance au sel

n’est pas aussi complexe qu’il paraît ou qu’une composante clef de la tolérance peut

être changée dans n’importe quelles espèces données(ou génotype). Les essais sur le

changement de la tolérance par la transformation sont clairement d’importance majeure

pour notre compréhension des traits complexe et pour les sens pratiques de leur

manipulation (Flowers, 2004).


32

Tableau 3.2: Espèces et gènes utilisés dans la transformation des plants pour

l’amélioration de la tolérance au sel (Flowers, 2004).


33

3.1.8. Différentes approches pour identifier les gènes important de la tolérance à

la salinité

Les gènes identifiés jusqu'ici comme importants dans la tolérance au sel relèvent

des catégories de transporteurs d'ions, de solutés ou d'osmolytes compatibles et des

facteurs de transcription impliqués dans la régulation de la croissance. Les gènes qui

régulent le transport d'ions dans les plantes affectées par le sel sont énumérés par Munns

(2005) et résumés ensuite par Munns and Tester (2008). Les gènes qui synthétisent les

osmoprotecteurs sont listés par Chinnusamy et al. (2005) et par Munns (2005). Les

voies de signalisation impliquées dans la transduction hormonale et susceptibles de

réguler la croissance cellulaire sous le stress abiotique sont examinées par Xiong et al

(2002). Diverses approches ont été utilisées avec succès pour identifier des gènes

candidats pour la tolérance à la salinité (tableau 3.3):

La première approche est basée sur la compréhension physiologique et mécanistique, les

deux suivantes ne prennent pas de connaissances physiologiques antérieures. Les gènes

candidats utilisés dans la dernière approche sont basés sur la connaissance préalable de

la fonction du gène dans d'autres organismes ou les résultats des approches 1, 2 et

3(Munns, 2010).

Tableau 3.3: Différentes approches pour identifier les gènes pour la tolérance à la

salinité (Munns, 2010).


34

3.2. Adaptation et acclimatation des plantes au stress salin

Les deux stratégies s’appliquent à une façon de tolérer un stress particulier.

L’adaptation se rapporte à des modifications de structure ou de fonction héritables, qui

augment l’adéquation de l’organisme dans un environnement stressant. Les

modifications morphologiques et physiologiques associées aux métabolismes acides

des plantes crassulacée sont des exemples d’adaptation. L’acclimatation, par ailleurs se

rapporte à des modifications physiologiques non héritables, qui interviennent au cours

de la vie d’un individu. Ces modifications se reproduisent lors d’une exposition

graduée à un stress, comme des températures froides ou un dessèchement lent, elles

permettent à l’individu de vivre et de se reproduire dans un environnement stressant.

La capacité de s’acclimater est bien sûr un caractère génétique, mais les modifications

produites en réponse au stress ne sont pas transmises à la génération suivante. La

capacité des plantes bisannuelles et des lignées de céréales à survivre à l’hiver est un

exemple d’acclimatation aux basses températures.

3.2.1. Mécanisme de l’adaptation chez les plantes

L’adaptation de la plante à la présence du sel dans le sol et au stress salin

implique des processus très variés, intervenant à des différents niveaux, de la cellule à

l’organisme entier, comme par exemple des modifications de l’activité métabolique

(Ghars et al., 2008) ou des modifications morphologiques et développementales des

feuilles (Munns et Tester, 2008) et des racines (figure 3.3).

La salinité élevée affecte les plantes de deux manières principales: les concentrations

élevées de sels dans le sol perturbent la capacité des racines à extraire l'eau, et les

concentrations élevées de sels dans la plante elle-même peuvent être toxiques,

entraînant une inhibition de nombreux processus physiologiques et biochimiques tels

que L'absorption et l'assimilation des nutriments (Hasegawa et al., 2000, Munns, 2002,

Munns, Schachtman et Condon, 1995). Dans les deux cas ensembles, ces effets

réduisent la croissance, le développement et la survie des plantes. Un modèle en deux

phases décrivant les effets osmotiques et ioniques du stress salin a été proposé par

Munns (1995) (figure 3.4). Les plantes sensibles ou tolérantes à la salinité diffèrent dans

la vitesse à laquelle le sel atteint des niveaux toxiques dans les feuilles. La durée est de

jours, semaines ou mois, selon l'espèce et le niveau de salinité. Au cours de la phase 1,

la croissance des deux types de plantes est réduite en raison de l'effet osmotique de la

solution saline à l'extérieur des racines. Pendant la phase 2, les vieilles feuilles de la


35

plante sensible meurent et réduisent la capacité photosynthétique de la plante. Cela a un

effet supplémentaire sur la croissance.

Figure 3.3: Un résumé schématique des stress que les plantes souffrent dans un état de

croissance à haute salinité et les réponses correspondantes que les plantes utilisent pour

survivre à ces effets nuisibles (Munns, 1993).

Figue. 3.4: Schéma de la réponse de croissance en deux phases à la salinité. Réalisé

par Munns et al (1995).


36

Dans la première, la phase osmotique, qui commence immédiatement après que la

concentration de sel autour des racines augmente à un niveau de seuil rendant plus

difficile les racines d'extraire l'eau, le taux de croissance des pousses diminue

significativement. Une réponse immédiate à cet effet, qui atténue également le flux

d'ions à la tige, est la fermeture stomatique. Toutefois, en raison de la différence de

potentiel hydrique entre l'atmosphère et les cellules foliaires et le besoin de fixation du

carbone, il s'agit d'une stratégie de tolérance à long terme intenable (Hasegawa et al.,

2000). La croissance des bourgeons est plus sensible que la croissance des racines au

stress osmotique induit par le sel, probablement parce qu'une réduction du

développement de la surface foliaire par rapport à la croissance des racines qui

diminuerait l'utilisation de l'eau par la plante, ce qui lui permettrait d'économiser

l'humidité du sol et de prévenir la concentration du sel dans le sol (Munns & Tester,

2008). La réduction de la croissance des bourgeons due à la salinité est communément

exprimée par une zone foliaire réduite et des pousses rabougries (Läuchli & Epstein,

1990). L'inhibition de la croissance des feuilles sensibles au stress salin semble

également être une conséquence de l'inhibition par le sel du chargement symétrique du

xylème du Ca2+

dans la racine (Läuchli & Grattan, 2007). Différents mécanismes

d'adaptation peuvent être impliqués dans l'acclimatation progressive de la salinité par

rapport à l'ajustement et à un choc soudain. La sensibilité à la salinité d'une espèce

donnée peut changer pendant l'ontogenèse. Les tolérances de salinité peuvent augmenter

ou diminuer selon les espèces végétales et / ou les facteurs environnementaux. Pour

certaines espèces, la sensibilité au sel peut être la plus élevée à la germination, tandis

que pour les autres espèces, la sensibilité peut augmenter pendant la reproduction

(Howat, 2000, Marschner, 1986). Les plantes ont développé plusieurs mécanismes pour

s'acclimater à la salinité. Il est possible de distinguer trois types de réponses ou de

tolérances : a) la tolérance au stress osmotique ; b) l'exclusion de Na+ des lames

foliaires ; c) la tolérance tissulaire (Munns & Tester, 2008).

3.2.2. Les formes de l’adaptation des plantes selon Levitt

L’adaptation se définit comme la capacité d’une plante à croître et à donner des

rendements satisfaisants dans des zones sujettes à des stress de périodicités connues.

La notion d’adaptation est liée à celles de résistance et de tolérance aux stress (Kadi,

2012). Pour Levitt (1980), l’adaptation prend trois formes distinctes :

L’esquive, qui est la situation où la plante grâce à un rythme de développement

spécifique, réussit à s’harmoniser à l’environnement de production, en échappant


37

partiellement ou complètement au stress. L’évitement prend forme grâce au maintien,

par divers mécanismes, d’un état interne satisfaisant. Cet état permet à la plante de

continuer ses activités métaboliques sans être fortement perturbée par le milieu

extérieur qui peut être très stressant (Kadi, 2012). La tolérance du stress qui s’installe

dans les tissus de la plante est la capacité de maintenir une activité métabolique. Cette

activité assure l'intégrité fonctionnelle aux structures cellulaires et autorise la reprise

des activités de la plante dès que les conditions de croissance redeviennent plus

normales (Kadi, 2012). Les termes résistance, tolérance et adaptation sont

indifféremment utilisés dans la littérature. Reprenant les formes d’adaptation aux stress

abiotiques définies par Levitt (1980), Belhassen et al., (1996) se classifient en trois

grands types d'adaptation aux stress et qui sont : (1) l’échappement ou esquive qui

consiste à réaliser le cycle pendant la période favorable ; (2) l’évitement de la

déshydratation (ou résistance) qui permet le maintien d’un potentiel hydrique élevé

dans la plante ; (3) la tolérance à la déshydratation qui consiste en un ensemble

d’aptitudes à résister aux effets d’un faible potentiel hydrique.

3.2.3. La sélection pour améliorer l’adaptation des plantes

L’adaptation fait suite à l'action modificatrice des facteurs extérieurs qui

influencent le comportement et la structure de la plante (Kadi, 2012). L'adaptation est

définie aussi comme la capacité d’une plante à croître et à donner des rendements

satisfaisants dans des zones sujettes à des stress de périodicités connues (Monneveux,

1991 in Kadi, 2012). La notion d’adaptation se confond parfois avec celles de

résistance et de tolérance au stress. En fait l’adaptation n’est que la résultante de la

tolérance aux contraintes. Une plante adaptée est donc celle qui tolère ou résiste à un

stress donné et réussit à produire à un niveau satisfaisant par rapport à une autre plante

qui sera dite non adaptée (Ceccarelli, 1987). La sélection pour l'adaptation ou pour la

tolérance aux stresses abiotiques comme la salinité suit plusieurs voies dont entre

l'utilisation de la phénologie (Acevedo et al., 1991), la morphologique (Hanson et

al.,1985; Sharma et Smith,1986) et la physiologique ( Farquhar et al.,1994, Richards

et al.,1997, Araus et al.,1998), ainsi que le comportement global de la plante vis-à-vis

de la variation environnementale, telle que mesurée par les indices (Benmahammed et

al., 2010).


38

Chapitre 4: Marqueurs ge ne tiques

4.1. Le concept biologique d’un marqueur

En biologie végétale, le terme marqueur s'applique à plusieurs concepts, parfois

très différents. Il est, par exemple, possible de définir des marqueurs physiologiques et

des marqueurs génétiques. Les premiers correspondent à tout type de molécules,

facilement repérables, dont la présence renseigne sur un stade de développement ou un

état physiologique, situations complexes faisant intervenir de nombreux paramètres en

interaction. Les marqueurs génétiques sont, quant à eux, toujours synonymes de locus

marqueurs. Un locus marqueur est un locus polymorphe qui renseigne sur le génotype

de l'individu qui le porte et/ou sur les génotypes des locus voisins. Les marqueurs

génétiques sont par définition des caractères héritables (Santoni et al., 2000).

4.1.1. Caractéristique des marqueurs génétiques

D'après Bretting et Widrlechner 1995, les marqueurs moléculaires doivent réunir

les caractéristiques idéales suivantes : être des caractères mendéliens à hérédité simple ;

avoir plusieurs allèles ; être codominants ; ne pas avoir d'effet pléiotropique ou

épistatique ; être dispersés le long du génome ; ne pas être liés entre eux ; être

insensibles au milieu ; être stables à tous les stades du développement ; ne pas avoir

d'effet sur la croissance ou la reproduction sexuée ; être sélectivement neutres ; être

facilement observables et sans ambiguïté.

Les marqueurs des génomes chloroplastiques et mitochondriaux ont des propriétés

idéales sensiblement différentes du fait de la transmission et de l'organisation des

génomes cytoplasmiques. Aucun de ces marqueurs n'a une hérédité mendélienne et tous

les marqueurs d'un même génome chloroplastique ou mitochondrial sont liés, puisque

portés par la même molécule d'ADN. La codominance, pas plus que la dominance, ne

s'applique à ces génomes dont toutes les copies sont identiques (Santoni et al., 2000).

4.1.2. Utilisation des marqueurs génétiques

Grâce aux marqueurs génétiques, il devient possible:

- d'établir l'empreinte génétique d'un individu, c'est-à-dire de décrire et définir des

individus et des variétés en vue de leur inscription, de leur protection et de leur

classification,

- de mettre en évidence et suivre les gènes impliqués dans l'expression de caractères

d'intérêt agronomique ou technologique.


39

- de décrire la variabilité génétique et sa répartition au sein de populations et d'espèces,

ils servent aussi à préciser les mécanismes évolutifs des populations qui rendent compte

de cette description.

4.1.3. Principaux types de marqueurs génétiques utilisés

La recherche de polymorphisme d’un génome est une approche en plein essor

qui voit chaque année de nouvelles techniques se développer. Chacune d’elle présente

des avantages et des inconvénients et le choix d’utilisation dépend essentiellement de la

nature du problème génétique à traiter (De Vienne, 1998).

Les marqueurs biochimiques d'une cellule végétale peuvent facilement être

extraites et analysées. Les marqueurs biochimiques les plus utilisés sont les isozymes

(Tableau 4.1). Ils correspondent aux différentes formes d'une même enzyme et

permettent de déterminer la présence de l'allèle correspondant à chacune de ces formes.

Dans ce sens, ce sont des révélateurs du polymorphisme entre individus pour les

séquences codantes du génome. Les marqueurs moléculaires d'ADN sont les plus

étudiés. Ces marqueurs sont des séquences codantes ou non, présentant un

polymorphisme selon les individus. Par les techniques de biologie moléculaire,

plusieurs outils ont été développés, permettant d'obtenir directement à partir des

marqueurs polymorphes de l'ADN des plantes (tableau 4.1). Les plus utilisés sont les

marqueurs RFLP, RAPD, AFLP, et les microsatellites. Leurs utilisation, aujourd'hui

largement répandue, intervient dans divers programmes axés sur l'amélioration de la

résistance aux stress biotiques et abiotiques.

4.2. Les marqueurs génétiques comme moyens d'étude de la diversité génétique

L'évaluation de la diversité des ressources génétiques est un préalable

indispensable à la définition des stratégies de leur gestion ou leur amélioration. Les

informations obtenues au niveau phénotypique sont souvent difficiles à interpréter, car,

il s'agit de variations continues où de nombreux gènes peuvent y être impliqués. Les

marqueurs génétiques de types protéique, enzymatique ou nucléiques, dont l'expression

est indépendante de l'environnement peuvent être utilisés pour caractériser les

populations et évaluer leur diversité génétique aux niveaux intra- et inter-populations.

Un marqueur biochimique et moléculaire est une protéine ou une séquence de DNA

facilement détectable et transmissible génétiquement. Il résulte d'un polymorphisme

pouvant être utilisé dans l'étude de la diversité génétique.


40

Tableau 4.1: Les marqueurs génétiques en génétique et biotechnologie végétales (Tagu et Moussard, 2003)

1. Dans cette colonne, on distingue les techniques qui révèlent les loci marqueurs individuellement de celles qui les révèlent en masse.

2. Marqueurs liés au stade de développement ou à l’organe étudié.

3. Surtout pour ce qui est des étapes nécessaires au développement des microsatellites.

Marqueurs neutralité nombre codominance Spécificité

de locus1

polymorphisme Stade,

Organe2

technicité coût Séquence

codante

morphologiques Non limité rare oui faible oui faible faible ?

Isozymes Oui 40 oui oui faible oui faible faible oui

Protéines (2D) Oui 100 oui oui faible oui moyenne moyen oui

RFLP Oui illimité oui oui élevé non élevée moyen oui /non

MAAP Oui illimité non non très élevé non faible faible oui /non

AFLP Oui illimité non non très élevé non moyenne moyen oui /non

microsatellites Oui quelques oui oui très élevé non élevée très élevé3 oui /non

IMA Oui illimité oui non très élevé non faible faible non

STS Oui quelques oui oui moyen non élevée moyen oui

41

4.3. Marqueurs génétiques et méthodes d’études de polymorphisme

4.3.1. Marqueurs morphologique

Les caractères morphologiques sont très importants et révèlent de la

caractérisation. Ils sont généralement quantitatifs et ont un déterminisme mono

et polygénique. Toutefois, ils peuvent être influencés par des facteurs

environnementaux et comprennent d’une part des mesures biométriques portant

sur la plante (taille et forme des gousses, des feuilles, longueur d’inflorescence,

nombre de fleurs, etc.) et d’autre part des données qualitatives comme la

couleur des gousses, le taux de graines (Batlle et Tous, 1998; Gharnit et al.,

2004).

Les caractères agronomiques, à immense intérêt, sont généralement quantitatifs,

à contrôle oligo ou polygénique et à «manipulation» complexe. Ils sont souvent

soumis aux besoins et choix commerciaux et peuvent être regroupés en

plusieurs catégories: caractère lié à la production (précocité, rendement),

vigueur de plante, qualité de fruit, résistance aux stress biotiques (maladies et

parasites) et abiotiques (stress hydrique, thermique, salinité).

4.3.2. Marqueurs biochimiques

Un marqueur biochimique est un produit original du métabolisme de la

plante. Il peut caractériser un état physiologique particulier (juvénilité, maturité

sexuelle, sénescence, réactions à des agressions physiques ou biotiques : stress,

maladies ou attaques d'insectes), on parle de marqueur physiologique. Il peut

aussi constituer la signature biochimique permettant d'identifier sans erreur

possible un individu ou une population (race, écotype), on parle alors de

marqueur génétique (Arbez, 1988).

Les protéines, enzymes en occurrence, restent très informatives du fait qu’elles

constituent des produits de l’information génétique portée par l’ADN d’un

individu. L’ADN, bien qu’il code pour un même produit, peut porter des

variations (mutations) significatives d’un individu (ou d’un groupe) à un autre.

L’ensemble des enzymes synthétisées dans l’organisme peut être caractéristique

pour un individu donné.

L’utilisation de ces marqueurs est fréquente dans la recherche de

génotypes notamment résistants à de conditions de stress. Ainsi, différentes

méthodes sont utilisées selon les produits recherchés. On peut citer en premier

lieu, la recherche des composés synthétisés lors d’un stress (Rejeb et al., 1991;


42

Ledoigh et Courdert, 1992). De composés de métabolisme secondaire (flavone,

polyphénol, terpène) ont été trouvés chez Triticum, Aegilops et Ceratonia

(Cooper et al., 1994; Makris et Kefalas, 2004). En second lieu, il y a des

protéines possédant des propriétés amphotères, qui peuvent être séparées par

électrophorèse sur gel. Différentes méthodes d’électrophorèse sont utilisées

selon l’espèce: les protéines de réserve, les isozymes ou les empreintes

protéiques (Fyad-Lameche, 1998; Weber et Wirke, 1994). Les protéines de

réserve de la graine sont facilement séparées par électrophorèse

monodimensionnelle sur gel de polyacrylamide. Souvent polymorphes, elles se

sont avérées un moyen rapide d’identification de diverses espèces ou cultivars,

en particulier chez les plantes céréalières (Branlard et al., 1989; Metakovsky et

Baboer, 1992) et chez les légumineuses comme le medicago annuel (Fyad-

Lameche, 1998). Une autre technique, permettant de séparer les protéines

totales par électrophorèse bidimensionnelle après dénaturation, a été mise au

point par O’Farell (1975). La première migration s’effectue sur un gradient de

pH (électro focalisation) induisant la séparation des protéines selon leur point

isoélectrique et la seconde favorise la séparation des protéines selon leur poids

moléculaire en présence d’agents dénaturants (SDS et β-mercaptoéthanol)

(Gorg et al., 1980; Pernès, 1984). Cette dernière méthode est lourde et coûteuse

d’où rarement utilisée pour les études de diversité; mais plutôt complément des

techniques moléculaires pour cartographier des gènes de structure exprimés et

traduits dans un organe donné (De Vienne et al., 1995).

Les isozymes sont l’ensemble de multiformes, d’une même enzyme

résultant génétiquement de différences dans la structure primaire, issues de

même organisme. Les échantillons sont déposés sur un gel d’amidon (support

poreux) et grâce à un tampon chimique, la migration s’effectue sous l’action

d’un champ électrique, et les enzymes, étant chargées négativement, vont

migrer vers le pôle positif. Ainsi, les différentes molécules sont séparées selon

leur charge et secondairement selon leur poids moléculaire. Ces isozymes ont

les mêmes propriétés catalytiques induisant, après l’addition d’un substrat

spécifique naturel ou artificiel, l’apparition d’un produit terminal coloré

(visible) et insoluble (Westman et Kresovich, 1997). Ces marqueurs, bien qu’ils

soient co-dominant, sont accusés d’une sous-estimation du polymorphisme réel,

seule la partie codant est détectable (Gotteib, 1977).


43

Les marqueurs enzymatiques ont été utilisés afin de caractériser et comparer les

espèces de médics de types sauvages et cultivars issus de différentes ou de

mêmes origines (Fyad-Lamèche, 1998).

Vu le faible niveau du polymorphisme révélé par les marqueurs biochimiques et

sa variabilité en fonction des conditions environnementales, il est souvent

nécessaire d’utiliser les marqueurs moléculaires pour compléter l’évaluation et

l’étiquetage des ressources génétiques.

4.3.3. Marqueurs moléculaires

Un marqueur moléculaire est un locus polymorphe qui renseigne sur le

génotype de l’individu qui le porte. Les marqueurs moléculaires permettent à la

fois un diagnostic extrêmement fin de la variabilité et la mise en place de

stratégies très rapides de création et de sélection variétale (Adam et Dron,

1993). Ces marqueurs constitués des acides nucléiques sont utilisés, il y a une

vingtaine d’année, dans le domaine de la connaissance des génomes végétaux et

leur application à l’amélioration des plantes (De Vienne, 1990). Ils présentent

également différents avantages comparés aux marqueurs morphologiques et

protéiques; très nombreux, neutres vis à vis de la sélection, couvrent le génome

entier, indépendants de la partie de la plante prélevée et de son stade de

développement et indépendants des influences environnementales (FAO, 1996

dans Belkadi, 2003). Les marqueurs moléculaires correspondent donc au

polymorphisme révélé au niveau de l’ADN. L’analyse de ce polymorphisme par

les techniques de biologie moléculaire s’adresse à l’ensemble du génome, qu’il

soit ou non traduit en protéines. Il existe plusieurs types de marqueurs

moléculaires.

De nombreuses techniques de marquages moléculaires sont aujourd’hui

disponibles, et de nouvelles sont régulièrement publiées (Price et al., 2000;

Gupta et al., 2001, Langridge et al.,2001; Rafalski, 2002; AL-Chaarani et al.,

2004; Moullet et al., 2008). Selon Nouri (2011) les caractéristiques de chacune

de ces techniques, en termes de domaine d’application, de principe et coût sont

largement détaillés dans plusieurs articles de synthèses (Gupta et al., 1999 ;

Santoni et al.,2000 ; Langridge et al.,2001 ;Sarrafi et Gentzbittel, 2004).

Ces méthodes peuvent être regroupées en deux grandes catégories: les

marqueurs de types RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) et les

marqueurs basés sur la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction) (figure 4.1).


44

Le choix du système de marquage dépend de l’objectif précis fixé, des moyens

et des compétences disponibles au laboratoire (Nouri, 2011).

Figure 4.1: Schéma représentant les diverses étapes de la réaction en chaîne de

polymérisation (PCR) de L’ADN (Moullet et al., 2008).

Chez les légumineuses, des marqueurs microsatellites ont été massivement mis

au point chez Medicago truncatula et Lotus japonicus, deux espèces modèles

des légumineuses, en utilisant des données de séquences produites dans des

programmes de séquençage d’EST (fragment de gènes exprimés) ou d’ADN

génomique. Chez Medicago truncatula, le nombre de marqueurs microsatellites

disponibles dépasse le millier (Eujayl et al., 2004 ; Huguet et al., 2004 ;

Baquerizo-Audiot et al., 2001 ; Diwan et al., 2000) et 288 marqueurs gènes-

spécifiques sont décrits (Choi et al., 2004a).

Du fait de la proximité phylogénétique entre espèces de la tribu des trifoliées

(luzernes et trèfles), entre 50 et 80% des marqueurs microsatellites développés


45

chez M. truncatula et issus de séquences d’ADN exprimées donnent des

amplifications et du polymorphisme chez la luzerne (Julier et al., 2003) et

d’autres espèces du genre Medicago (Eujayl et al., 2004 ; Laouar, 2005).

Cependant, des marqueurs ont aussi été développés chez chaque espèce. Chez la

luzerne diploïde, 216 marqueurs RFLP ont été décrits (Kaló et al., 2000 ; Echt

et al., 1993 ; Brummer et al., 1993). Chez le trèfle blanc, plus de 600 marqueurs

microsatellites ont été obtenus (Jones et al., 2003 ; Barrett et al., 2004 ; Kölliker

et al., 2001), une partie seulement étant publiée. Chez Lotus japonicus, 107

microsatellites sont décrits, ainsi que 24 RFLP et 39 marqueurs gènes-

spécifiques (Sandal et al., 2002). Sur le lotier corniculé, 23 RFLP sont décrits

(Fjellstrom et al., 2003), alors que 13 marqueurs gènes-spécifiques sont publiés

chez la gesse (Skiba et al., 2004). Enfin, des marqueurs gènes-spécifiques ont

été testés pour un ensemble de légumineuses (Choi et al., 2004b). Désormais,

un grand nombre de marqueurs codominants sont disponibles chez les espèces

fourragères. Selon la distance phylogénétique entre espèces modèles et espèces

cultivées et selon le type de marqueurs, l’acquisition de nouveaux marqueurs

consiste soit à transférer des marqueurs depuis les espèces modèles vers les

espèces cultivées, soit à mettre au point des marqueurs directement sur les

espèces cultivées.

4.4. Marqueurs génétiques et sélection pour la tolérance aux stress salin

L’objectif de la sélection est l'identification de nouvelles lignées qui

portent un ensemble de caractéristiques désirables leur permettant d’être

adoptées comme variétés agricoles, sans de grands risques pour les

producteurs. Elles doivent produire plus pour réduire les coûts de

production au niveau de l'exploitation et surtout doivent se distinguer par une

meilleure régularité des rendements et une nette amélioration de la qualité du

produit récolté (Lecomte, 2005). La diminution des coûts de production, en

zones sèches et variables, passe par l’adoption de variétés relativement plus

flexibles et plus adaptées qui valorisent des itinéraires techniques moins

intensifs, et tolèrent un climat de nature variable (Benmahammed et al., 2010).

Le stress salin a retardé de manière coordonnée la croissance des semis et la

mobilisation des réserves cotylédonaires.

La fraction de globuline représentait les protéines de réserves les plus

importantes des cotylédons, et sa mobilisation a été considérablement retardée


46

par le NaCl le long de l'établissement de semis. Selon Luiz Voigta et al (2009),

il convient de noter que l'inhibition de la croissance des semis par la salinité est

étroitement coordonnée avec le retard de la mobilisation de la réserve et

l'accumulation de produits d'hydrolyse dans les cotylédons.

4.4.1. Stratégies d’intégration des marqueurs dans les programmes de

sélection des plantes annuelles

L’utilisation des marqueurs moléculaires en sélection repose sur

l’exploitation des déséquilibres de liaison entre marqueurs et gènes ou QTL

(quantitative trait loci) impliqués dans la variation des caractères quantitatifs.

Deux stratégies d’intégration des marqueurs dans les programmes de sélection

des plantes annuelles ont été envisagées (Plomion et al., 1996)

La première vise à exploiter le déséquilibre de liaison dû à des liaisons

physiques pour fabriquer un « idiotype », individu cumulant le maximum

d’allèles favorables pour des caractères d’intérêt économique. La stratégie

consiste à cartographier des QTL sur une carte génétique (Paterson et al., 1988)

et à utiliser les marqueurs bordant pour contrôler le transfert des zones

chromosomiques intéressantes. La construction d’un tel génotype peut être

réalisée par backcross lorsqu’il s’agit d’intégrer dans un fond génétique

préexistant un ou quelques gènes. Les marqueurs moléculaires permettent

notamment de repérer les individus ayant recombiné le plus près du gène à

transférer dans le parent récurrent et qui portent le moins possible d’ADN du

parent donneur (Young et Tanksley, 1989 ; Ragot et al., 1995). Ils permettent

également un retour plus rapide vers le génome du parent récurrent par rapport à

une simple sélection basée sur l’information phénotypique (Hospital et al.,

1992). Les bons allèles peuvent aussi être accumulés dans un génotype nouveau

par croisement d’individus complémentaires aux QTL (Stuber et Sisco, 1993).

Le nombre de croisements nécessaires pour obtenir le génotype transgressif

intéressant dépendra du nombre et de la répartition des QTL dans le génome des

géniteurs. Par ailleurs, plus le nombre de descendants d’un croisement donné

sera important plus la probabilité de trouver le génotype idéal sera élevée. La

deuxième stratégie vise à exploiter tous les types de déséquilibre de liaison entre

marqueurs et QTL (qu’ils soient ou non dus à une liaison physique) pour

évaluer la valeur génétique des individus candidats à la sélection. Dans ce cas,

la position des QTL sur une carte génétique n’a pas à être connue. Les


47

marqueurs sont traités comme des caractères associés au phénotype et en tant

que tels ils doivent permettre d’augmenter l’efficacité de la sélection. Stuber et

al (1982) ont montré que cette approche était possible chez le maïs et qu’en

dépit du nombre important de générations de panmixie qu’avaient subi les

populations un déséquilibre de liaison subsistait et permettait d’obtenir des

associations significatives entre marqueurs et QTL de caractères agronomiques.

Lande et Thompson (1990) ont posé les bases théoriques de la sélection assistée

par marqueurs (SAM) en intégrant les données moléculaires dans un index de

sélection.

4.4.2. Exemple de la mise en évidence d’un QTL au moyen des marqueurs

moléculaires

La mise en évidence de QTL au moyen des marqueurs moléculaires a été

développée initialement chez des plantes : en effet, chez les plantes, où l’on

manipule aisément des populations en ségrégation avec des effectifs importants,

il a été facile d’établir des cartes génétiques. La méthode la plus simple pour

mettre en évidence la liaison entre un marqueur moléculaire et un QTL consiste

à croiser entre elles des lignées pures (au sens homozygotes à tous les locus) et à

analyser les ségrégations à la génération suivante ou dans les générations

ultérieures.

Verrier et al (1997) ont développé un exemple illustrant cette mise en

évidence : Soit un marqueur dont un allèle M est fixé dans une première lignée

pure (P1) et un allèle m est fixé dans la seconde lignée pure (P2). Soit un QTL

dont on présume l’existence, avec un allèle B fixé dans la première lignée et un

allèle b dans la seconde. Les individus de la F1 ont tous le même génotype

(doubles hétérozygotes):il faut une deuxième génération de croisement pour

voir apparaître un polymorphisme. En cas de back-cross sur une des deux

lignées, nous avons 4 génotypes possibles, avec des probabilités dépendant du

taux de recombinaison (r) entre le marqueur et le QTL supposé (figure 4.2).

Dans ce protocole, pour chaque individu, on peut observer le génotype au

marqueur, d’une part, et la valeur phénotypique, d’autre part. On peut donc

calculer la valeur phénotypique moyenne des homozygotes MM et celle des

hétérozygotes Mm. Soit D la différence entre ces deux moyennes ; un test

statistique simple permet de dire si cette différence est significative ou pas. Si

elle ne l’est pas, il faut conclure que l’analyse effectuée ne permet pas de mettre


48

en évidence un QTL associé au marqueur ; cela ne signifie pas qu’il n’y en pas,

mais que l’on n’a pas les moyens de le voir (par exemple, les effectifs mesurés

sont insuffisants).Si D est significative, on peut alors mettre en relation cette

différence observée avec la différence que l’on attendrait si un QTL était

associé au marqueur. Pour ce faire, nous employons les notations qui sont

rassemblées au tableau 4.2.

Figure 4.2: Croisement de deux lignées pures (P1 et P2) suivi d’un back-cross

sur P1, afin de détecter un QTL.

M, m= allèles au marqueur. B, b= allèles au QTL. r= taux de recombinaison

entre le marqueur et le QTL (Verrier et al., 1997).

Tableau 4.2.Valeurs phénotypiques moyennes dans le cas du croisement de

deux lignées pures suivi d’un back-cross. Les moyennes relatives au marqueur

(M/m) correspondent à des valeurs observées, celles relatives au QTL (B/b)

sont des inconnues (Verrier et al., 1997).


49

D’après la figure 4.2, on établit la structure génotypique attendue au QTL pour

les individus homozygotes au marqueur et les individus hétérozygotes au

marqueur : Les individus MM sont de génotype BB en proportion 1-r et Bb en

proportion r ; les individus Mm sont de génotype BB en proportion r et Bb en

proportion 1-r.

On en déduit l’expression de l’espérance des moyennes observées en

fonction des paramètres inconnus :

L’espérance de la différence observée entre génotypes au marqueur vaut donc :

Si les deux locus (marqueur et QTL) sont physiquement indépendants (r = 1/2),

quel que soit l’effet du QTL, la différence phénotypique attendue entre les deux

génotypes au marqueur est nulle (il y a autant de BB et de Bb parmi les MM et

parmi les Mm). De même, si les deux lignées parentales possédaient le même

allèle au QTL, la différence attendue est nulle, car tous les individus ont le

même génotype. Dans ces deux situations, on s’attend donc à ce que la

différence observée (D) soit non significative.En cas contraire, la différence

attendue est d’autant plus grande que ∆ est grand et que r est faible. A ce stade,

on constate donc que l’on ne peut pas faire la différence entre un QTL induisant

de grosses différences phénotypiques et physiquement loin du marqueur, d’une

part, et un QTL proche du marqueur et induisant de faibles différences, d’autre

part [on ne peut pas résoudre une équation à deux inconnues (∆ et r)]. Il faut

donc soit réaliser d’autres croisements, comme, par exemple, les deux types de

back-cross ou une F2 obtenue de façon panmictique à partir de la F1, soit

analysé les données en fonction du génotype à deux marqueurs encadrant sur le

chromosome le QTL supposé. Si, de la sorte, on peut estimer le taux de

recombinaison (r), on déduit un estimateur de l’écart (∆) entre la valeur

moyenne des homozygotes BB et celle des hétérozygotes Bb:

On raisonne de la même manière pour déterminer l’écart entre la valeur de

l’hétérozygote Bb et celle de l’homozygote bb.


50

4.5. Protéines de réserves des graines comme marqueurs génétiques

La disponibilité de la variation génétique est importante pour

l'amélioration génétique de la culture de la luzerne. Les marqueurs de protéines

peuvent agir efficacement pour étudier la variation génétique du matériel

génétique pour son utilisation dans les programmes de sélection des cultures. De

nombreux chercheurs ont utilisé l’électrophorèse des protéines de réserves pour

la caractérisation d'espèces cultivées et sauvages (Ory et Cherry, 1972; Dawson

et McIntosh, 1973; Cherry, 1975; Savoy et al., 1978; Klozova et al., 1983;

Chiou et al. , 1988, Krishna et Mitra, 1988; Singh et al., 1993, Fyad-

lameche,1998). D’autres ont montrées que la diversité existée pour les profils de

protéines et les protéines de réserves des graines ont le potentiel d'aider à la

classification des espèces et de servir comme marqueurs pour des études

d'hybridation intra et interspécifiques et la cherche des relations avec leurs

répartitions géographiques (Lanham et al., 1994 ; Bertozo et Valls, 2001).

4.5.1. Globulines principales protéines de réserves accumulées dans la

graine chez les légumineuses

Les légumineuses sont utiles pour l’agriculture et l’élevage car, elles

peuvent fixer jusqu’à 100-400 kg d’azote/ha/an et fournir 40 à 200 kg/ha/an à la

culture suivante (Hardarson, 1994). Pendant leur développement, les graines de

plantes accumulent de grandes quantités de protéines de réserves qui servent de

sources d'azote, de soufre et de composés de carbone pendant la germination

des semences (Shotwell et Larkins, 1988). Les protéines de réserves

s'accumulent dans les organites délimités par la membrane, les corps protéiques

(Briarty et al., 1970, Pernollet, 1978). Les protéines des graines de

légumineuses ont été largement étudiées par plusieurs auteurs ces 20 dernières

années à cause de leur importances (Nwaga et al., 2000).

Comme le montre Osborne (1924), les principales protéines de graines peuvent

être classées en quatre classes de solubilité: albumine (hydrosoluble), globuline

(soluble dans le sel), prolamine (soluble dans l'alcool) et gluteline (acides ou

alcalin). Les graines végétales de différents taxons contiennent des proportions

assez différentes d'albumines, de globulines, de prolamines et de glutelines

(Higgins, 1984, Bewley et Black, 1985). Dans la plupart des graines

monocotylédones étudiées jusqu'à présent, les prolamines sont les principales

protéines de graines (Bewley et Black, 1985), tandis que dans les dicotylédones


51

(Higgins, 1984; Bewley et Black, 1985) et les gymnospermes (Misra et Green,

1990) les globulines sont les prédominant. Leurs teneurs par rapport à la totalité

des protéines de la graine sont rapportés dans le tableau 4.3 leurs compositions

en acides aminées, leurs poids moléculaires et ainsi leurs sous unités

composantes se varient selon l’espèce (voir annexe 5) (Marcone et al., 1998).

Tableau4.3:Teneur en globulines dans diverses graines de plantes

dicotylédones et monocotylédones (% de protéines totales) (Marcone et al.,

1998).

Les globulines sont les protéines de réserve dominantes dans les graines de

légumineuses et constituent de 50 à 90% des protéines des graines. Les

globulines sont classées en fonction de leur coefficient de sédimentation en

deux types les 7S et les 11S (Osborne, 1924). Le contenu en acides aminés

soufrés des 11S est plus élevé que celui des 7S. Le ratio 11S/7S varie entre les

cultivars de 0,5 à 1,7 dans le soja, 0,2 à 1,5 dans le pois, 0,3 à 0,5 dans le

haricot. La caractérisation détaillée de 21 globulines de graines provenant de

plantes monocotylédones et dicotylédones (voir annexe5) a indiqué que les

globulines sont de deux types de classe (ainsi que dans le même type de classe)

se situent dans une gamme de poids moléculaire étroite comprise entre 300 000-

370 000 Da et ils sont composées de multiples sous-unités (Marcone et al.,

1998).


52

4.5.2. Nomenclatures structures et fonctions des globulines

Dans les graines matures de légumineuses, ce sont les globulines qui

déterminent majoritairement la composition en acides aminés puisqu’elles

représentent jusqu'à 70% des protéines totales (annexe 5). Communément

appelées protéines de réserve, elles sont codées par une grande famille

multigénique et ont été classées en deux sous-groupes les 7S et 11S. Leur nom

varie entre les espèces. Par exemple, les globulines 7S sont nommées vicilines

et convicilines chez le pois, phaséolines chez le haricot, β-conglycinines chez le

soja et les 11S sont nommées légumines chez le pois et glycinines chez le soja,

phaséolines chez le haricot, et β-conglycinines chez le soja (Gallardo et al.,

2017). La plupart des références portent sur certains aspects de la caractérisation

physico-chimique des protéines de réserves. D'autre part, l'utilisation de

différentes méthodes, longues et parfois inadéquates pour purifier, isoler et

analyser les globulines individuelles a produit des données qui sont soit

incomplètes, soit variées dans la littérature. Les différents auteurs ayant des

différents nombres de globulines ou différents nombres de sous-unités de

globulines. L'absence d'une nomenclature universellement acceptée pour les

globulines de graines de légumineuses, ainsi que pour leurs sous-unités et leurs

chaînes polypeptidiques a entraîné une certaine confusion dans la littérature.

Ainsi, par exemple, dans le cas des lupins, les diverses globulines,

correspondant à des espèces moléculaires distinctes qui diffèrent en charge

électrique, masse moléculaire, ou en taille de sous-unités et leurs distributions.

Elles ont été nommées α-, β-, γ- conglutine; les globulines 1, 4, 5, 6, 71,

72 et 9; les globulines 1,2,3,4,5,6,7,8, 9a 9 b, 10 et 11; la légumine et la viciline;

légumin-like et vicilin-like proteins et les conglutins α, β1, β2 ,γ et δ. Plusieurs

systèmes ont été également utilisés pour la nomenclature des sous-unités de

globulines et des chaînes polypeptidiques. Ainsi, par exemple, (αx, βx et γx )

pour les globulines de Lupinus angustifolius, où x représente un nombre de 1 à 6

(α- et β- conglutins) ou l-2 ( γ -conglutin) correspondant aux polypeptides

détectés par SDS-PAGE ; lettres A-J pour les sous-unités de légumines de

Pisum Satiuum ; α, α’, β et β’ pour les sous-unités de β-conglycinine de Glycine

max ; de α1 à α6 pour les sous-unités alfin de Medicogo sativa ; de L1, à L3, pour

sous-unités des legumin-like de Fagus sylvatica (Teresa et al., 1994).


53

En général, sur la base de leurs séquences d'acides aminés, des

compositions de sous-unités et du traitement des précurseurs de polypeptides

correspondants, les études de globulines peuvent être attribuées à deux familles

de protéines majeures: les légumines (hexamères de 11-12S) et les vicilines

(trimères de 7-8S) (Galili et al., 1993 ). La figure 4.3 représente la structure

théorique d'un hexamère de globuline. En condition de réduction dans la

séparation SDS-PAGE, la sous-unité individuelle, un monomère sous forme

native, donne des sous-unités α et β avec des poids moléculaires d'environ 32 et

22 kDa; Ces deux sous-unités sont reliées par une seule liaison disulfure

(Shewry, 1995; Lásztity, 1996; Jung et al., 1998 ; Sánchez-Vioque et al., 1999 ;

Adachi et al., 2003). Les globulines sont des protéines oligomériques,

globulaires et compactes et de poids moléculaire assez élevé. On distingue deux

principales familles structurales en fonction de leur cœfficient de sédimentation

: les protéines de type 11-12S, hexamériques (300-360 kDa) et les protéines de

type 7S, trimériques (150-180 kDa). Les protéines 11-12S sont présentes

majoritairement dans la plupart des graines de dicotylédones (légumineuses,

oléagineux) tandis que les protéines 7S sont principalement représentées dans

les graines de légumineuses (pois, soja, haricot, fève…etc.). Ces protéines

possèdent des appellations différentes suivant les espèces mais présentent au

sein de chaque famille de grandes similarités de structure et de propriétés

physicochimiques. Les homologies de séquence et de structure au sein d’une

même classe de protéines (12S, 7S, 2S, prolamines…) expliquent certaines

similitudes de propriétés physicochimiques (agrégation, dissociation,

température de dénaturation thermique, interactions...), fonctionnelles

(gélification, propriétés tensioactives, filmogènes…) ou nutritionnelles entre les

protéines homologues de différentes espèces botaniques. Toutefois, même si ces

similitudes de comportement existent, il ne faut pas minimiser les différences

entre protéines homologues issues d’espèces botaniques différentes. Elles sont

dues à des singularités structurales comme des différences de charges,

d’hydrophobicité de surface et de glycosylation. Les exemples sont nombreux

qui montrent des différences de propriétés entre les prolamines de différentes

céréales, entre globulines 2S ou 7S de différentes légumineuses ou

d’oléagineux. Ces différences expliquent en grande partie les spécificités

d’usage (Guéguen et al.,.2016). Ils sont des protéines de réserve, qui ont pour


54

fonction de stocker dans la graine le carbone et surtout l’azote mobilisable au

moment de la germination.

Figure 4.3: Structure théorique des globulines. (A) structure théorique d'un

hexamère à partir de protéines de globuline et de gluteline, (B) leurs sous-unités

α et β d'un monomère individuel (Rehm, 2006; Sánchez-Vioque et al., 1999 in

Yu-Wei Chang, 2010).

Tableau 4.4 : Structure et fonction des globulines dans la graine (Perrot, 1995).

Cette fonction leur confère des caractéristiques très particulières de

composition en acides aminés, avec des teneurs anormalement élevées en

amides (glutamine, asparagine). Ainsi, dans les prolamines du blé appelées

Nom Structure Teneur Rôle Germination

Légumine Hexamère de 360kDa

Compacte, riche en

feuillets β

1 pont S-S

23 à 41% Réserve Dégradée

Viciline Trimère de 150 kDa

Compacte, riche en

feuillets β

Pas depont S-S

24 à 37% Réserve Dégradée


55

gliadines, les résidus glutamine représentent plus du tiers des résidus d’acides

aminés de ces protéines. On note dans les globulines une forte teneur en

arginine. Les albumines, en général mieux équilibrée en acides aminés, ont

principalement un rôle métabolique (enzymes, transporteurs, protéines de

stress…), ou un rôle de défense (inhibiteurs d’enzymes, lectines, protéines

entomotoxiques, antifongiques, antimicrobiennes…). Cependant, on trouve

aussi dans cette famille, et pour certaines espèces végétales (crucifères, noix…)

des protéines majeures, de type 2S, qui ont également une fonction de réserve.

4.5.3. Régions PQL (Protein Quantity Loci) pour les globulines 7S et 11S chez

Medicago truncatula

La variabilité génétique a été exploitée pour identifier les régions des

génomes du pois et de la légumineuse modèle Medicago truncatula qui

contrôlent l'accumulation des différentes globulines (Bourgeois et al., 2011 ; Le

Signor et al., 2017 ; Gallardo et al., 2017) (figure 4.4). Pour mettre en évidence

les régions du génome contrôlant l’accumulation des différentes protéines de

réserve, l’approche PQL développée par Damerval et al. (1994) a été appliquée

aux graines d’une population de plantes issues d’un croisement entre deux

génotypes contrastés pour la composition protéique de la graine. L’approche

consiste à séparer les protéines des graines en gels d’électrophorèse

bidimensionnelle, puis à utiliser les données quantitatives obtenues pour chaque

protéine afin d’identifier (ou cartographier), via une recherche de QTL, les

régions du génome responsables des variations de leur abondance. La carte

génétique présentée dans la figure 4.4, a été obtenue à partir de la population de

lignées recombinantes issue du croisement entre les génotypes parentaux

Jemalong6 et DZA 315.16 (carte initialement développée par Thierry Huguet,

ENSAT Toulouse; puis complétée par Vandecasteele et al., 2011). Les ovales

montrent les régions de génome (groupes de PQLs) qui contrôlent

l’accumulation des protéines de réserve majeures des graines (légumines,

vicilines et convicilines).Ces régions PQLs sont réparties sur les 8 chromosomes

(Chrom.) de Medicago truncatula. Les ovales colorés montrent les régions

PQLs conservées avec le pois pour les vicilines (vert), convicilines (kaki) et

légumines (rouge). Les ovales gris montrent les régions PQLs uniquement

détectées chez M.truncatula. La position de deux gènes codant les facteurs de


56

transcription FUSCA3 et ABA-insensitive 5 (ABI5) est indiquée (Le Signor et

al., 2017).

Figure 4.4: Protein quantity loci (PQLs) abandants des globulines sur la carte

LR4 de Medicago truncatula (Le Signor et al., 2017; Gallardo et al., 2017).

4.5.4. Globuline 11S comme marqueur d'imbibition au cours de la germination

La globuline protéine 11S est utilisable comme marqueur d'imprégnation

de graines pendant la germination. La présente invention a fait l’objet d’un

Brevet scientifique (Claudette et al., 2000). Elle repose sur la révélation de la

solubilisation d'une protéine d'origine végétale qui est induite au cours


57

d’imbibition des graines, provient d'une espèce de plante végétale, comprenant

au moins une unité de 18 à 25 kDa, est exprimée dans les graines et dans tout

autre organe végétal et qui apparaît en grande quantité pendant les processus de

pré-germination qui utilisent une absorption contrôlée d'eau par les graines.

Utilisable en agriculture comme marqueur moléculaire pour la détermination du

stade de germination de semences et pour suivre en continu le déroulement des

procédés de traitements de semences (pré-germination).

4.6. Séparation et caractérisation structurelle des globulines chez la luzerne

Il s'agit du premier rapport de la séparation et la caractérisation des

protéines majeures de graines de luzerne fait par Nelsen (1988). Les graines de

luzerne ont été extraites à une variété de pH ou de sel faible et élevée. Les

principales protéines de graines extraites ont des coefficients de sédimentation

de 7S et 11S. La protéine 7S est soluble à faible teneur en sel alors que la

protéine 11S soluble à pH 3 ou 9 à faible teneur en sel ou à pH 7 à 1 M de NaCl.

La protéine 7S est composée de peptides de 52, 36, 32 et 20 kDa. La protéine

11S est composée d'un triplé peptides de 49, 47 et 45 kDa, ainsi que des

peptides de 39, 22 et 20 kDa. D’autres chercheurs trouvent que les principales

protéines de réserves dans les graines de la luzerne sont les 7S vicilin-like

globulin (alfin) et les 11S legumin-like globulin (medicagin) et 2S albumine

(LMW) (Krochko et Bewley, 1990 ; Coulter et Bewley, 1990). Ces protéines

comprennent 10%, 30% et 20% respectivement, de la protéine totale accumulée

dans des graines matures de luzerne M.sativa (Krochko et al., 1994). Ils ont

rapporté que les graines de Medicago sativa contiennent deux globulines de

réserves : l'alfine est facile à solubiliser et on la retrouve de façon prédominante

dans l'extrait soluble dans le tampon initial de faible salinité. Cependant, lorsque

l'on augmente la concentration en sels dans le tampon, il en résulte un

accroissement progressif de la quantité de médicagine solubilisée. La globuline

7S est une protéine trimère composée de polypeptides de taille variée, produite

par une protéolyse post-traductionnelle d'une famille de précurseurs de sous-

unités de 50 kDa (α1-α6 ; 50, 38, 34, 20, 16, 14 kDa). Les sous-unités de la

globuline 11S (60-70 kDa) consistent en des polypeptides acides (A1, A2, A3

A5 :9’, A6 :10’ ; 49-39 kDa) et basiques (B1 :2’, B3’ ; 24-20 kDa) liés aux pont-

disulfures. Ces sous-unités (A et B) sont classées comme appartenant à la sous-

famille I ou II sur la base du polypeptide B (basique) et de la présence (ou de


58

l'absence) d'une liaison disulfure supplémentaire. Les sous-unités de la sous-

famille (I) ont une liaison disulfure intramoléculaire supplémentaire et

présentent une variabilité de taille inférieure à celle des sous-unités de la sous-

famille II (Krochko et Bewly, 1990 ; Krochko et al., 1992). Les sous-unités de

la sous-famille I (A5B1 :2, A6 B1 :2 A9 B1 :2 A10 B1 :2 ) ont une liaison disulfure

intramoléculaire supplémentaire et présentent une variabilité de taille inférieure

à celle des sous-unités de la sous-famille II ( A1B3, A2B3, A3B3, A4B3, A7B3)

(Krochko et Bewly, 1990 ). L'albumine 2S comprend une famille beaucoup plus

petite de polypeptides acides à liaison disulfures. Une étude approfondie a

confirmé que la protéine de réserve 2S de la luzerne est distincte de la plupart

des autres protéines de réserve de graines 2S bien caractérisées (Coulter et

Bewley, 1990). L'électrophorèse en gel unidimensionnelle et bidimensionnelle

n'a révélé que des différences mineures dans la composition de polypeptide dans

chacune des trois principales classes de protéines de réserve (globuline 7S,

globuline 11S, albumine 2S). Les légères variations qui ont été trouvées n'ont

fourni aucune information sur l'une ou l'autre parenté ou les relations

d'évolution entre ces taxons particuliers. Néanmoins, une hétérogénéité

persistante et reproductible de certains polypeptides mineurs de la globuline 11S

(medicagin) peut être utile dans d'autres circonstances pour l'identification des

cultivars dans la luzerne. Les deux sous-familles (I et II) de la globuline 11S ont

été fortement exprimées dans tous les cultivars et sous-espèces examinés. On a

conclu que cette divergence structurelle au sein de la famille de protéines de

réserve 11S était antérieure à l'évolution du complexe d'espèces M.sativa. La

plus grande partie de la variabilité des protéines de réserve était quantitative.

Cependant, même cette variabilité a été réduite lorsque les données ont été

normalisées par rapport aux poids secs. Parmi tous ces taxons, les similitudes

sont constantes dans l'expression qualitative et quantitative des protéines de

réserve des graines. Ils suggèrent un degré élevé d'uniformité dans la

physiologie et la génétique des graines dans le complexe des espèces de luzerne

(Krochko et Bewly, 2000).

II- MATERIEL ET METHODES

II- Matériel et méthodes

59

II. MATERIEL ET METHODES

II.1. Matériel végétal

Le matériel végétal utilisé dans cette étude est constitué des différentes

populations de M.Ciliaris qui sont fournis soit par l’ICARDA ou l’ITGC, soit

collectées à l’aide des prospections (tableau 5.1) et (annexe 1).

Tableau 5.1. Nom, origine, code et génotype de différentes populations

étudiées de M.ciliaris

Populations Code, nom et

génotype

Province

et

origine

Latitude Longitude Altitude

(m)

Pop éloignées P1: inconnu

P2: inconnu

P3: inconnu

P7: inconnu

Mascara

Mascara

Bredeah

Ain-

Tassa

35°33’24.29’’N

35°24’0.64’’N

35°34’60’’N

35°37’22.00’’N

0°72’.86E

0°7’10.06E

0°51’0’’W

0°55’36.25’’W

689

600

110

300

Pop proches

P4: inconnu

P5: inconnu

P6: inconnu

Sebkha

d’Oran

35°33’28.88’’N

35°33’26.83’’N

35°33’58.73’’N

0°50’33.95’’W

0°50’32.63’’W

0°50’28.00’’W

81

84

83

Pop réference P8:M.ciliaris 252

P9:M.ciliaris 255

P10:M.intertexta.

IG54229

P11:M.intertexta.

IG54230

ITGC

ITGC

Lebanon

ICARDA

Syria

3501N

-

33 52N

-

0018W

-

3601E

-

470

-

1000

-

II.1.2. Zones prospectées et méthodologie de collecte

Pour les populations adaptées à un environnement salin, les collectes ont

été conduites depuis les rives de la grande Sebkha d’Oran jusqu’à la route

nationale N°2 de côte Nord du Sebkha (voir annexe 1).

Pour les populations non adaptées, les collectes ont été faites à deux villages

loin de Sebkha situés dans la montagne du Mardjardjo qui sont Brédéah et Ain-

tassa. Une autre collecte a été réalisée à la Wilaya de Mascara dans les terres

agricoles à côtés des montagnes de Beni-Chougrane. Des fiches descriptives des

populations et des échantillons de sol ont été prélevés sur chaque site et ainsi

II- Matériel et méthodes

60

l’analyse de l’eau. Les coordonnées géographiques et altitudes ont été

enregistrées dans le tableau 5.1.

II.1.3. Génotypes fournis

Nous sommes reconnaissants envers le centre international de recherche

agricole dans les zones aride (ICARDA) de la Syrie et l’institut technologique

de grandes cultures (ITGC) de l'Algérie d'avoir bien voulu nous fournir des

semences de M. Ciliaris annuelle.

II.1.4. Multiplication du matériel végétal et entretien des plantes

Les essais de la multiplication du matériel végétal ont été réalisés en

serre du complexe Taleb Ibrahim ex-IGMO au cours de deux campagnes

successives, 2011-2012 et 2012-2013. Les semis ont été faits dans un dispositif

en blocs complètement randomisés. D’autres méthodes ont été utilisées pour

augmenter le stock du matériel végétal comme la culture in vitro et la

multiplication végétative en utilisant les boutures.

II.2. Méthodes utilisées

Les méthodes et les logiciels utilisés dans cette recherche sont bien

détaillés dans les chapitres ultirieures de la partie résultats et discussion car on

traite chque volet comme un article scientifique. On peut résumer les méthodes

utilisées :

- Toutes les données sont soumises à l’analyse de la variance à un facteur et

les moyennes sont comparées par la méthode de Newman et Keuls.

- Logiciels utilisés sont: Statistica v.10.0 ; Gelanalyser v.2010a ; Excel

2010 et logiciel DendroUPGMA.

- Pour déterminer la tolérance des différentes populations vis-à-vis du stress

salin, un indice de tolérance a été calculé. (exp: IT1 = MT1/MT0).

- La variance génétique est estimée par la formule utilisée par Kaul et Bahn

(1974).

- L’analyse des protéines totales et les globulines de réserve des graines est

faite par électrophorèse SDS-PAGE.

III- RESULTATS ET DISCUSSION

Chapitre 5: Identification des populations locales de M.ciliaris et

évaluation de la tolérance au stress salin au stade de germination

Chapitre 6: Comparaison de la diversité génétique des populations

de M.Ciliaris par l’utilisation des descripteurs IBPGR de la

morphologie de la gousse et des marqueurs SDS-PAGE

Chapitre 7: L'expression des protéines de réserves des graines

solubles dans le sel comme marqueur des populations locales de

M.ciliaris adaptées à la région fortement salée en Algérie (la grande

Sebkha d’Oran)

III-Résultats et Discussion Chapitre 5

61

Chapitre 5: Identification des populations locale de Medicago ciliaris et e valuation de la tole rance au stress salin au stade de germination

5.1. Introduction

Les espèces annuelles du genre Medicago jouent un rôle important dans

l’amélioration de la production fourragère en Algérie. Elles permettent le maintien de la

fertilité du sol grâce à leur capacité fixatrice d’azote atmosphérique. Mais Les fortes

teneurs en sels de l’eau du sol salin diminuent considérablement leurs productivités.

Dans les régions semi-arides, la concentration en sel de la solution du sol peut atteindre

100 mM, condition qui inhibe la croissance de la plus part des plantes. Pour des

concentrations en sel plus fortes, même la germination peut devenir impossible

(Jabnoune, 2008). De nombreux auteurs (Chartzoulakis et Klapaki, 2000 ; Zribi, 2009)

ont remarqué que les doses de NaCl supérieures à 150mM réduisent fortement la

croissance végétative et causent des symptômes de brulures et de toxicité. En effet, la

salinité est susceptible de perturber la nutrition minérale des graines en phase de

germination en interférant avec le prélèvement de certains éléments essentiels. Par

conséquent, la capacité des génotypes à survivre au stade de germination à des niveaux

de sel élevé est l'un des mécanismes clés contribuant à l'expression de la tolérance au

stress salin. Le criblage préalablement des génotypes tolérants en vue de leur utilisation

dans les zones salines, arides et semi-arides, est basé sur le choix des vigueurs graines

qui vont servir en suite pour sélectionner des génotypes tolérants chez le Medicago. Car

à ce stade, la germination devient un facteur déterminant pour le développement de la

plante sous l’action de la salinité. La survie des graines au milieu salin, dépend du

génotype. Cependant, La germination des graines est une des phases les plus

importantes du cycle de vie de la plante, est très sensible à l'environnement existant

(Saritha et Kuriakose, 2007). De plus, il est clair que la connaissance de la

physiologie et de la qualité germinative des graines en général, serait un moyen

d’améliorer et de développer de nouvelles variétés capables de résister

globalement au stress abiotique en basant sur la variabilité génétique existante dans une

collection donnée. Pour cela, on a construit et identifié une collection en premier temps

et ensuite on a mesuré, au stade de germination, le taux de germination des graines et la


62

croissance des jeunes plantules âgées de 9 jours sous différentes concentrations de

salinité afin d’évaluer la tolérance au sel de ces populations étudiées.

5.2. Matériel et méthodes

5.2.1. Matériel végétal

Le matériel végétal utilisé dans cette étude est constitué des différentes

populations de M.Ciliaris qui sont fournis soit par l’ICARDA ou l’ITGC, soit collectées

à l’aide des prospections (tableau 5.1) et (annexe 1).

5.2.2. Méthodes utilisées

5.2.2.1. Analyse biochimique par SDS-PAGE

L'extraction des protéines a été effectuée en utilisant dix graines matures pour

chaque population. Plusieurs électrophorèses des protéines totales ont été réalisées sur

gel de polyacrylamide SDS 10% et un gel d’empilement de 4,5% d'acrylamide selon

Laemmli (1970). Trois répétions ont été choisisses et le meilleur gel est photographié,

scanné et analysé. Le marqueur de protéine VI est utilisé comme poids moléculaire; Il

s'agit d'un étalon de protéine à trois couleurs avec 12 protéines colorées préalablement

couvrant une large gamme de poids moléculaires de 11 à 245 kDa. Les protéines sont

couplées de manière covalente à un chromophore bleu, à l'exception de deux bandes de

référence (une bande verte et une bande rouge à 25 kDa et 75 kDa respectivement)

lorsqu'elles sont séparées sur SDS-PAGE (tampon Tris-glycine). Cette échelle de

protéines est conçue pour surveiller la séparation des protéines lors de l'électrophorèse

sur gel de SDS-polyacrylamide.

5.2.2.2. Paramètres mesurés

L’évaluation de la tolérance au sel de ces populations a porté sur le pourcentage

de germination totale. Une graine a été considérée comme germée lorsque la radicule est

visiblement sortie de l’enveloppe de la graine et mesure au moins 2 mm (Kim et al.,

2006). Le pourcentage de germination est déterminé par la formule suivante (Ghoulam

et Fares, 2001 ; Farissi et al., 2011) :

Germination (%) = (Nx/Ni) x100 ; avec Nx, le nombre de semences germées au temps

x, et Ni, le nombre de semences mises à germer.

Au bout de 9 jours de germination d’autres mesures ont été réalisées sur les jeunes

plantules : Longueur de la tige et de la racine en centimètre ; Poids frais des parties

aériennes et racinaires en gramme.


63

5.2.2.3. Dispositif expérimental

Pour déterminer le taux de germination des graines, la longueur et le poids frais

des jeunes plantules âgées de 9 jours, les semis ont été effectués au laboratoire de

génétique et d’amélioration des plantes, Université d’Oran1. Le dispositif expérimental

est un dispositif blocs (cinq semis), échelonnés dans le temps, complètement aléatoire,

avec cinq répétitions. Dans chaque répétition, chaque écotype est représenté par dix

individus, soit un effectif de 40 graines par écotype et par répétition, ce qui équivaut

pour l’ensemble de l’essai (5 répétitions) 200 graines par écotype. Par semis, pour

chaque écotype les quarante graines sont stérilisées par une solution de hypoclorite de

sodium (3%) pendant 4 minutes, elles sont ensuite rincées plusieurs fois à l'eau distillée

stérile et scarifiées, puis sont réparties en quatre lots déjà testés par Amouri et Fyad-

Lameche (2012) : le lot témoin (0 % NaCl) et les trois lots traités à différentes

concentrations de NaCl (0.4 %, 0.6 % et 0.8 %), et mises à germer sur de l'eau solidifiée

avec de l'agar (0,7 %) avec une solution nutritive Knop (voir annexe 2), préalablement

autoclavé pendant 20 minutes à 120°C et coulée en boîtes de Pétri. Les boîtes

ensemencées sont maintenues pendant 3 jours à 25 ± 1°C à l’obscurité, puis elles sont

transférées dans une pièce de culture où elles reçoivent, en plus de la lumière du jour, 12

heures d'éclairement d'appoint fourni par des tubes fluorescents (environ 500 lux) ou la

direction principale d’émission est parallèle à la normale à la surface (voir annexe 3),

sous une intensité d’éclairage mesurée de 6762 lux par la formule suivante :

(Voir annexe 3)

E : l’éclairement en Lux (lx).

𝚽 reçu : Le flux reçu en Lumen (ln).

d2 : surface éclairée en m

2.

5.2.2.4. Mesures et analyses statistiques

Les longueurs totales sont mesurées sur les 10 plantules par écotype et par

traitement. Quatre lectures (T0, T1, T2 et T3) par semis et par écotype du taux de

germination et de la longueur ainsi le poids frais des jeunes plantules ont fait le

neuvième jour. Les plantules qui ne sont pas détruites pendant les mesures, sont

repiquées dans la tourbe pour continuer leur cycle de croissance.

Les données relatives aux pourcentages de germination sont transformées en √

avant d’être soumises à une analyse de variance à deux critères de classification

(population et traitement [NaCl]).Concernant les paramètres de l’émergence et la


64

croissance, chaque donnée constitue la moyenne d’au moins 10 mesures. Les valeurs

enregistrées ont été aussi soumises à une analyse de la variance à deux facteurs et à une

comparaison multiple des moyennes en utilisant le test de Newman Keuls au seuil de

5%. Toutes les analyses sont faites selon un modèle linéaire général par le programme

Stastica vr.10 et Excel vr.10. Les deux données précédentes sont exploitées ainsi pour

calculer les indices de tolérance.

5.2.2.5. Calcul des indices de tolérance

Pour déterminer la tolérance relative de différentes populations vis-à-vis du

stress salin, un indice de tolérance (IT) a été calculé. Il est égal au rapport entre la valeur

moyenne notée sous stress sur celle du témoin (exemple: IT1 = T1/T0), de cette façon,

il est possible de comparer les écotypes entres eux en calculant les trois ITs pour tous

les paramètres étudiés. Cet indice est compris entre 0 et 1. Il a été considéré que les

plantes tolérantes ont un indice de tolérance plus élevé que les plantes sensibles. Toutes

les données ont été converties en indices de tolérance au sel avant l'analyse du cluster,

pour permettre des comparaisons en utilisant les mesures des paramètres de croissance

(Zeng et al. 2002).

5.2.2.6. Principe du test ANOVA

On considère les échantillons comme des groupes d’individus (Ancelle, 2002).

Le principe du test ANOVA consiste à scinder la variation totale de l’ensemble des

observations en deux termes.

- La variation entre les groupes. Cette variation est mesurée par l’écart moyen entre

chaque moyenne et la moyenne générale. On l’appelle variance entre groupes (Sg2).

- La variation moyenne des individus à l’intérieur des groupes. Elle est mesurée par la

moyenne pondérée des variances de chaque groupe. Cette variance est appelée variance

résiduelle (Sr2).

Sous l’hypothèse nulle H0, les moyennes des échantillons sont identiques. La variation

entre les groupes est proche de zéro.

La variation totale observée est donc due principalement à la variation des individus

indépendamment du groupe auquel ils appartiennent. La variance entre groupe est

inférieure à la variance résiduelle.

Sous H1, les moyennes des échantillons sont différentes : la variation totale est due

principalement à la variation des groupes entre eux. La variance entre groupes est

supérieure à la variance résiduelle. Il s’agit donc d’une hypothèse H1 unilatérale.


65

Le test consiste à comparer la variation entre les groupes et la variation résiduelle en

calculant le rapport des 2 variances correspondantes F0 = Sg2/Sr

2.

On se retrouve donc dans la situation d’une comparaison de deux variances par leur

rapport.

- Lorsque la valeur observée F0 est inférieure à F 5 %, la différence entre les variances

n’est pas significative. Cela signifie que les moyennes ne diffèrent pas

significativement.

- Si la valeur observée F0 est supérieure à F 5 % on rejette H0 et on accepte

l’hypothèse H1. Cela signifie que les moyennes des groupes étudiés diffèrent entre elles

de façon significative. On recherche le degré de signification p (utilisation de la table F,

H1 unilatérale). Lorsque H0 a été rejetée, et seulement dans ce cas, on peut réaliser des

comparaisons de moyennes 2 à 2 par des tests T en utilisant la variance résiduelle Sr2

comme variance commune. Les distributions des populations d’où proviennent les

échantillons doivent être normales et de même variance.

Toutes les données obtenues sont soumises à l’analyse de la variance à un ou deux

facteurs et les moyennes sont comparées par la méthode de Newman et Keuls, basée sur

la plus petite différence significative (ppas), cette dernière est calculée selon la formule

suivante : √

(Dagnelie, 1975)

ppas: la plus petite amplitude significative, pour un niveau de signification et un ddl

donné ; qα-1 : La probabilité de dépasser la plus petite amplitude significative (table des

valeurs critique de Newmen et Keuls) ; CMr : le carré moyen résiduel de l’analyse de

la variance ;

n : correspond au nombre d’observations pour chaque échantillon ;


66

5.3. Résultats et discussion

5.3.1. Identification des populations prospectées

5.3.1.1. Etude de l’herbier

M.ciliaris et M.intertexta sont deux taxa très proches morphologiquement et leur

classification a été souvent contradictoire selon les auteurs (Laouar et Abdelguerfi,

1999). D’après des études de certaines chercheurs, il a été mentionné que les caractères

morphologiques et phénologiques permettent de différencier entre les deux taxa (Small

et Jomphe, 1989 ; Cherifi et al., 1993 ; Laouar, 1998 ; Laouar et al., 1999).

On s’est basé sur les planches illustrées par Small et Jomphe 1989 (figure5.1 et

annexe 4). Ces planches renferment l’herbier des plantes qui est basé sur la foliole et le

stipule d’une part et d’autre part sur les fleurs, les fruits (gousses) et enfin sur la

semence (graines).Une similitude importante a été remarquée entre les populations

prospectés car les graines de ces populations sont déjà entièrement noirs. Cette

confusion a été enlevée au niveau de la gousse. On a trouvé que les populations P1 P2 et

P7 appartiennent probablement au taxa M.intertexra et P3, P4, P5 et P6 appartient au

texa M.ciliaris.

Figure 5.1 : Illustration distinguant les deux taxa M.intertexta et M.ciliaris (Small et

Jomphe, 1989 modifié).

Les analyses statistiques faites par Laouar et Abdelguerfi (2000) ont révélées des

différences importantes entre Medicago ciliaris et M.intertexta. Deux différentes

stratégies de développement ont été remarquées chez ces taxa. Il apparaît que M.ciliaris

soit plus précoce et produit plus de gousses/plant mais à nombre de graines/gousse

faible, contrairement à M.intertexta.


67

5.3.1.2. Analyse biochimique par SDS-PAGE

Pour avoir le maximum d’arguments, on a aussi comparé les profils électro-

phorétique de la SDS-PAGE des populations prospectées avec ceux des populations de

référence .Cette technique est pratiquement une méthode simple et fiable car les

protéines de réserves des graines sont largement indépendantes des fluctuations

environnementales (Hameed et al., 2009 ; Nisar et al.,2007). La figure 5.2 présente le

gel obtenu par électrophorèse SDS-PAGE uni dimensionnelle de l’ensemble du matériel

cité dans le tableau 5.1. Les résultats montrent que les profils sont presque similaires

entre les différentes populations étudiées, mais une seule différence a été remarquée au

niveau de la bande mineure marquée par la flèche noire sur le gel. Elle se trouve

uniquement chez les deux populations de références P10 et P11 qui représentent

M.intertexta. Cette dernière se trouve entre les valeurs 63 et 75 kDa du marqueur de

taille (MW). Elle est absente chez les deux populations de référence qui représentent le

taxa M.ciliaris. Donc en basant sur la lumière de ses résultats on peut classer les

populations prospectées : les populations P1, P2 et P7 appartiennent au taxa M.

intertexta et les populations P3, P4, P5 et P6 sont des M.ciliaris. Néanmoins, une

hétérogénéité persistante et reproductible de certains polypeptides mineurs de protéines

peut être utile dans d'autres circonstances pour l'identification des espèces de médics

(Krochko et Bewley, 2000). Ces résultats biochimiques et en accord avec cels trouvés

dans l’étude de l’herbier en basant sur les traits morphologiques. Sur le plan

taxonomique, on peut dire que ces deux taxa son plus proche.

Par ailleurs, Laouar et Abdelguerfi (1999) confirment dans une étude pour ces

deux taxas que généralement, ils sont placées dans les mêmes conditions de milieu, le

comportement et la morphologie des populations de la même espèce varient, mais

gardent une certaine limite qui permet de les regrouper dans la même unité taxinomique.


68

5.3.2. Evaluation de la tolérance au stress salin au stade de germination

5.3.2.1. Effet de la salinité sur la germination

La réponse de la germination au sel (NaCl) a été étudiée chez les 11 populations

de Medicago (tableaux 5.1). A partir de leur capacité germinative à 136,7, mM de NaCl,

l’espèce de M.ciliaris s'est avérée tolérante que celle de M.intertexta (figure 5.3).

Les résultats portés dans le tableau 5.2 présentent la réponse génotypique de la

germination au stress salin. On remarque que dans les conditions (0 mM), certaines

populations peuvent atteindre un taux de germination très élevé 100%. Pour le milieu

contenant 68 mM de chlorure de sodium la capacité germinative pour la plupart des

génotypes n’est pas affectée et les valeurs enregistrées sont statistiquement peu proches

des valeurs obtenus chez les plantes témoins. Cependant avec la même concentration

(68 mM), le taux de germination des trois génotypes P5, P10 et P11, se montre affecté

par le sel. En effet, à ce niveau de traitement, les pourcentages de germination

correspondant ont diminué par rapport au témoin de 30%, 22% et 26% respectivement

pour P5, P10 et P11.

MW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 KDa

245 100 75 63 25 17 11

Figure 5.2: Profils SDS-PAGE de protéines de réserve à partir de graines matures. Dans 10%

de gels d'acrylamide dans des conditions de dénaturation. MW: poids moléculaire; les chiffres

1, 2 ... 11; représentent les populations P1, P2, …P11 respectivement.


69

Tableau 5.2: Taux de germination(TG) moyennes par population des jeunes plants sous

différentes doses de NaCl.

Traitements T0 T1 T2 T3

Taux de germination (%) TG m ± σ m ± σ m ± σ m ± σ

Populations P1 0.96± 0.05 0.84± 0.11 0.36± 0.13 0.56± 0.34

P2 0.96± 0.09 0.62± 0.22 0.50± 0.28 0.34± 0.34

P3 0.82± 0.40 0.82± 0.40 0.22± 0.29 0.12± 0.11

P4 1.00± 0.00 0.86± 0.13 0.50± 0.12 0.26± 0.42

P5 0.82± 0.20 0.30± 0.14 0.14± 0.13 0.16± 0.25

P6 1.00± 0.00 0.56± 0.29 0.52± 0.32 0.42± 0.40

P7 0.98± 0.04 0.72± 0.36 0.40± 0.42 0.28± 0.30

P8 1.00± 0.00 0.86± 0.21 0.60± 0.46 0.56± 0.43

P9 1.00± 0.00 0.80± 0.35 0.48± 0.38 0.36± 0.33

P10 0.68± 0.40 0.22± 0.23 0.10± 0.12 0.14± 0.19

P11 0.72± 0.31 0.26± 0.18 0.26± 0.15 0.22± 0.29

Figure 5.3 : Tracé de moyennes et écart-types du taux de germination (TG) groupés par

population et catégorisés par traitement.

A la concentration de 102,6 mM de NaCl, seul le génotype P8 a gardé un taux de

germination final relativement élevé qui est en moyenne de 60%. Pour les autres

TG

Moyenne

Moyenne±Ecart-Type

Traitement: T0

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T1

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T2

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T3

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11


70

génotypes, le pourcentage des graines germées baisse au niveau du traitement 68 mM et

devient encore plus faible et différente à la concentration 102,8 mM. A cette

concentration, les valeurs les plus faibles sont aussi celles des trois génotypes P5 (14%),

P10 (10%) et P11 (26%) qui garde la même valeur enregistrée au T1. Pour la

concentration 136,7 mM, Les deux populations P1 et P8 enregistrent des valeurs

similaires 56,34% et 56,43% respectivement.

La comparaison entre les écarts-types des populations étudiées (figure 5.3) montre que

chez certains populations ont des valeurs nulles, c’est-à-dire que la population est

presque homogène cela expliquer par la multiplication successive du matériel végétal

pendant deux compagnes aboutissant à la création des populations pures comme le cas

des populations suivantes P4, P6 et P8. Mais pour certaines populations ont des valeurs

des écarts-types élevés ce qui permet de dire que ces populations ont des aplatissements

pour leur distributions. Comme le cas des populations P3, P5, P10 et P11. Ces

variations peuvent être expliquées par l’existence d’une variabilité intra-populations en

condition normale, mais ces variations sont devenues très important en condition de

stress.L’influence de la salinité sur le pouvoir germinatif des graines des populations

étudiées s’est manifestée par la réduction du taux de germination par rapport aux

témoins respectifs (0 mM de NaCl). Cette réduction est d’autant plus importante que la

concentration en sel est élevée (tableau 5.2). Cependant, cette réduction diffère selon les

populations étudiées.

Après transformation des valeurs enregistrées, La comparaison de la tolérance à

la salinité des différentes populations a été réalisée à l’aide du modèle GLM sur-

paramétrie de l’ANOVA à double entrée (tableau 5.3) qui montre une différence très

hautement significative entre les populations étudiées pour toutes les concentrations

utilisées P <0,001).


l’effet fixe (F) concentration de NaCl sur le taux de germination.

Effet (F/A) ddl MC ddlr MCr F p

Populations (A) 10 0,988803 202 0,082610 11,9695 ***

Traitement(F) 3 8,475027 202 0,082610 102,5906 ***

Erreur 202 0,082610 - - - -

*** : très hautement significatif (P <0,001) ;

** : hautement significatif ; (P < 0,01) ;

* : significatif (P < 0,05) ;

NS : non significatif


71

La plus grande variabilité a été observée entre les populations originaires de la

grande Sebkha d’Oran, sans doute parce que ces populations ont été sélectionnées selon

un gradient de stress salin qui s’étale de l’amont à l’aval des bords de la Sebkha P6, P4

et P5 respectivement. Le test de Newman-Kleus permet de classer les différentes

populations en 4 groupes homogènes : le premier groupe rassemble P7, P2, P6, P4, P1,

P9 et P8, le deuxième groupe : P10, P5 et P11, le troisième groupe : P5, P11 et P3, dans

le quatrième groupe on trouve : P3, P7 et P2. Ces quatre groupes chevauchent le

classement préalable du matériel végétal selon leurs provenance donc on peut dire qu’il

n’y a pas une relation entre la tolérance à la salinité au moment de la germination et

l’écologie de chaque provenance. Ceci corrobore les résultats de Neffati et al. (1993).

Selon Prado et al. (2000), la diminution du taux de germination des graines

soumises à un stress salin serait due à un processus de dormance osmotique développé

sous ces conditions de stress, représentant ainsi une stratégie d’adaptation à l’égard des

contraintes environnementales. En plus de la réduction du taux de germination, le sel

retarde également la germination et ralentit sa vitesse. Ce retard pourrait être causé par

l’altération des enzymes et des hormones qui se trouvent dans la graine (Botia et al.,

1998). Il pourrait s’agir également d’une difficulté d’hydratation des graines suite à un

potentiel osmotique élevé entrainant une certaine inhibition des mécanismes aboutissant

à la sortie de la radicule hors des téguments et par conséquent un retard de germination

des graines (Gill et al., 2003). Les tests de germination des graines peuvent fournir une

analyse rapide de réponse à la salinité mais doivent être interprétés avec prudence. Un

taux élevé de germination sous l'effet du stress salin n'est pas forcément corrélé avec la

tolérance à la salinité à des étapes de développement plus tardives (Saleki et al., 1993 ;

Almansouri, 2001). La germination est une phase qui nécessite un minimum d’eau pour

se déclencher. Ainsi, dans notre essai, les effets de la salinité n’apparaissent qu’après

l’émergence de l’axe embryonnaire (Droui et al., 2012). Dans le même contexte, Maas

et Poss (1989) et Maas et Grattan (1999), signalent que la plupart des plantes sont plus

tolérantes au sel à la germination qu’à l’émergence et qu’aux premiers stades de

croissance. De ce fait, l’étude de la germination sous contrainte saline ne paraît pas

suffisante pour détecter des génotypes tolérants au sel. Il serait important de la

compléter par des travaux aux stades de croissance et on peut aller jusqu’à la

fructification ou les plants sont à l’état entière.


72

5.3.2.2. Effet de la salinité sur la croissance

Les paramètres de croissance des 11 populations étudiées ont montré des

réponses différentielles à différents niveaux de concentration de NaCl. Généralement, la

taille de jeunes plantules (LT)(tableau 5.4 et figure 5.5), la longueur de la tige (LTG)

(tableau 5.5 et figure 5.6)et de la racine(LRC) )(tableau 5.6 et figure 5.7), le poids frais

des jeunes plantules (PFT) )(tableau 5.7 et figure 5.8), poids frais de la tige (PFTG)

(tableau5.8 et figure 5.9) et racines (PFRC) )(tableau 5.9 et figure 5.10) ont diminué au

fur et à mesure que la concentration de sel augmente.

Les résultats obtenus ont montré que la population P8 et P9 gardent toujours les

meilleurs valeurs pour tous les paramètres de la croissance dans les lots témoins et les

lots traités. Alors que dans les mêmes niveaux de stress salin les populations P5, P10 et

P11 enregistrent des faibles valeurs. On constate que la biomasse de la partie aérienne

est touchée beaucoup plus que la partie racinaire. Cependant, la réduction de la longueur

et le poids frais des tiges et des racines sont dues à la diminution des activités

physiologiques résultant du stress de l'eau et des nutriments causé par le stress à haute

salinité. Ces processus peuvent faire en sorte que la tige reste petite et la racine

s’allonge (voir figure 5.4). La salinité a entraîné des perturbations dans le métabolisme

des plantes, ce qui a entraîné une réduction de la croissance et de la productivité des

plantes (Sharma & Hall, 1991, Shafi et al., 2009).

Figure 5.4 : Réduction de la tige et l’allongement de la racine en fonction de la concentration

du NaCl.

T0 T1 T2 T3

Tige

Racine


73

Tableau 5.4: Longueurs totales (LT) moyennes par population des jeunes plants sous



Longueur total moyenne (cm) LT m ± σ m ± σ m ± σ m ± σ

Populations P1 9.83± 3.33 6.45± 3.72 2.32± 3.33 3.74± 3.97

P2 11.32± 3.45 4.87± 4.23 3.17± 3.93 2.41± 3.65

P3 15.24± 3.31 5.78± 5.29 1.97± 3.95 0.78± 2.89

P4 13.95± 2.98 7.59± 4.91 3.67± 4.11 2.64± 4.83

P5 8.70± 5.56 2.35± 3.97 0.75± 2.19 0.81± 2.36

P6 13.58± 2.70 4.68± 5.11 4.24± 5.09 2.34± 3.82

P7 12.54± 5.13 3.75± 3.42 2.35± 3.42 1.41± 2.76

P8 14.19± 3.50 10.13± 5.59 7.50± 6.46 4.16± 4.67

P9 16.18± 2.48 8.71± 5.80 3.98± 4.80 3.30± 5.23

P10 7.13± 5.85 1.99± 4.23 0.58± 2.04 0.63± 2.50

P11 9.35± 6.61 1.56± 3.45 1.52± 3.04 1.48± 2.95

Figure 5.5 : Tracé de moyennes et écart-types de la longueur totale (LT) groupés par

populations et catégorisés par traitement.

LT

Moyenne

Moyenne±Ecart-Type

Traitement: T0 Traitement: T1

Traitement: T2 Traitement: T3


74

Tableau 5.5 : Longueurs moyennes des tiges (LTG) par population des jeunes plants sous



Longueur moyenne des tiges (cm) LTG m ± σ m ± σ m ± σ m ± σ

Populations P1 4.75± 2.08 2.91± 2.09 1.24± 2.03 2.04± 2.38

P2 6.12± 2.18 2.40± 2.40 1.34± 1.77 1.12±1.93

P3 7.60± 3.25 2.21± 2.71 0.71± 1.74 0.23± 0.86

P4 7.16± 3.70 3.31± 3.34 1.82± 2.56 0.80± 1.49

P5 4.89± 3.89 1.32± 2.48 0.44± 1.24 0. 59± 1.99

P6 6.48± 2.53 2.16± 2.69 2.03± 2.84 1.07± 1.77

P7 6.90± 3.81 1.91± 1.71 1.45± 2.15 0.82± 1.60

P8 7.10± 3.34 4.94± 4.24 3.98± 4.13 2.29± 2.74

P9 8.13± 3.74 4.13± 3.19 2.38± 3.27 1.22± 1.90

P10 4.70± 4.26 0.98± 2.29 0.31± 1.06 0.23± 0.85

P11 5.38± 4.78 0.83± 2.16 0.98± 2.20 1.05± 2.26

Figure 5.6: Tracé de moyennes et écart-types de la longueur des tiges (LTG) groupés par


LT

G

Moyenne

Moyenne±Ecart-Type

Traitement: T0

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T1

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T2

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T3

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11


75

Tableau 5.6 : Longueurs des racines(LRC) moyennes par population des jeunes plants sous



Longueur des racines moyenne (cm) LRC m ± σ m ± σ m ± σ m ± σ

Populations P1 5.12± 1.98 3.55± 2.49 1.08± 1.92 1.72± 2.05

P2 5.15± 1.78 2.45±2.47 1.83± 2.45 1.31± 2.12

P3 7.64± 3.08 3.75± 3.53 1.24± 2.73 0.55± 2.04

P4 6.77± 2.96 4.28± 3.45 1.85± 2.43 1.84± 3.39

P5 3.83± 3.01 1.03± 2.10 0.31± 1.10 0.22± 0.61

P6 7.14± 3.33 2.52± 3.40 2.21± 3.43 1.26± 2.35

P7 5.64± 3.30 1.84± 2.19 0.90± 1.50 0.59± 1.30

P8 7.09± 2.93 5.15± 4.09 3.52± 4.08 1.87± 2.70

P9 8.03± 2.88 4.62± 4.56 1.60± 2.40 2.07± 3.47

P10 2.43± 2.15 0.99± 2.12 0.27± 1.03 0.42± 1.72

P11 3.98± 3.14 0.73± 1.72 0.54± 1.02 0.44± 0.93

Figure 5.7: Tracé de moyennes et écart-types de la longueur des racines (LRC) groupés par

populations et catégorisés par traitements.

LR

C

Moyenne

Moyenne±Ecart-Type

Traitement: T0

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T1

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T2

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T3

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11


76

Tableau 5.7 : Poids frais totales (PFT) moyennes par population des jeunes plants sous



Poids frais total moyenne (g) PFT m ± σ m ± σ m ± σ m ± σ

Populations P1 0.14± 0.05 0.08± 0.04 0.02± 0.03 0.08± 0.04

P2 0.13± 0.05 0.06± 0.05 0.05± 0.08 0.03± 0.05

P3 0.18± 0.04 0.07± 0.06 0.02± 0.04 0.01± 0.05

P4 0.16± 0.05 0.08± 0.06 0.04± 0.05 0.03± 0.07

P5 0.09± 0.06 0.03± 0.04 0.008± 0.02 0.009± 0.02

P6 0.16± 0.04 0.05± 0.05 0.05± 0.06 0.03± 0.06

P7 0.21± 0.09 0.08± 0.07 0.04± 0.06 0.03± 0.06

P8 0.22± 0.06 0.14± 0.08 0.10± 0.09 0.06± 0.08

P9 0.20± 0.06 0.11± 0.08 0.06± 0.07 0.05± 0.08

P10 0.07± 0.06 0.02± 0.04 0.007± 0.02 0.013± 0.05

P11 0.10± 0.07 0.02± 0.04 0.019± 0.03 0.021± 0.04

Figure 5.8 : Tracé de moyennes et écart-types poids frais totale (PFT) groupés par populations

et catégorisés par traitement.

PF

T

Moyenne

Moyenne±Ecart-Type

Traitement: T0

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T1

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T2

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T3

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11


77

Tableau 5.8 : Poids frais des tiges (PFTG) moyennes par population des jeunes plants sous



Poids frais des tiges moyenne (g) PFTG m ± σ m ± σ m ± σ m ± σ

Populations P1 0.11± 0.04 0.06± 0.03 0.02± 0.02 0.04± 0.03

P2 0.10± 0.04 0.05± 0.04 0.03± 0.04 0.02± 0.04

P3 0.15± 0.04 0.06± 0.05 0.02± 0.04 0.01± 0.04

P4 0.14± 0.05 0.07± 0.05 0.03± 0.04 0.03± 0.05

P5 0.08± 0.05 0.04± 0.13 0.006± 0.02 0.006± 0.01

P6 0.13± 0.04 0.04± 0.04 0.04± 0.05 0.02± 0.04

P7 0.17± 0.08 0.06± 0.06 0.03± 0.05 0.03± 0.05

P8 0.18± 0.06 0.12± 0.07 0.08± 0.08 0.05± 0.08

P9 0.16± 0.05 0.08± 0.06 0.05± 0.06 0.04± 0.07

P10 0.05± 0.05 0.02± 0.04 0.006± 0.02 0.011± 0.05

P11 0.08± 0.06 0.015± 0.03 0.015± 0.03 0.02± 0.04

Figure 5.9: Tracé de moyennes et écart-types de poids frais des tiges (PFTG) groupés par


PF

TG

Moyenne

Moyenne±Ecart-Type

Traitement: T0

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T1

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T2

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T3

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11


78

Tableau 5.9 : Poids frais des racines (PFRC) moyennes par population des jeunes plants sous



Poids frais des racines moyenne (g) PFRC m ± σ m ± σ m ± σ m ± σ

Populations P1 0.03± 0.01 0.02± 0.01 0.01± 0.01 0.01± 0.01

P2 0.02± 0.01 0.01± 0.01 0.01± 0.01 0.01± 0.01

P3 0.03± 0.02 0.02± 0.01 0.003±0.01 0.003± 0.01

P4 0.02± 0.01 0.02± 0.03 0.01± 0.02 0.01± 0.01

P5 0.01± 0.01 0.01± 0.01 0.002± 0.01 0.003± 0.01

P6 0.03± 0.02 0.01± 0.01 0.01± 0.01 0.01± 0.01

P7 0.04± 0.02 0.02± 0.02 0.009± 0.014 0.006± 0.012

P8 0.04± 0.02 0.025± 0.016 0.021± 0.03 0.014± 0.014

P9 0.04± 0.04 0.03± 0.03 0.013± 0.02 0.007± 0.01

P10 0.015± 0.01 0.003± 0.01 0.001± 0.005 0.001± 0.01

P11 0.02± 0.02 0.01± 0.01 0.0032± 0.01 0.003± 0.03

Figure 5.10 : Tracé de moyennes et écart-types de poids frais des racines (PFRC) groupés par


PF

RC

Moyenne

Moyenne±Ecart-Type

Traitement: T0

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T1

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T2

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

Traitement: T3

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11


79

Ainsi, dans des autres études, les concentrations élevées du NaCl entraînent

aussi la diminution du poids sec des parties aériennes et améliorent celui des racines ou

la biomasse aérienne passe de 42 à 26,66 mg de matière sèche respectivement pour le

témoin et la concentration de 5 g.l-1 soit une réduction de 36,5% par rapport au témoin ;

la matière sèche racinaire passe de 8,76 à 12,5 mg correspondant à une augmentation de

42,61% par rapport au témoin; pour la production de matière sèche totale, elle est passée

de 50,76 à 39,16 mg soit une réduction de 22,85% par rapport au témoin (Droui et al.,

2012).

Les résultats rapportés dans cette étude laissent supposer que les populations de

Medicago annuel est une plante sensible à l’action du NaCl, au stade de germination. A

des concentrations de sel qui dépassent 68 mM la capacité germinative ainsi que la

biomasse est fortement touchée.

Les réponses des deux lignes de M.ciliaris à la salinité a été étudiée dans autres

expériences préliminaires. Les données obtenues ont montré que le génotype TN8.7 a

bien progressé en présence de NaCl 75 mM dans la solution nutritive par rapport au

génotype TN11.11 (M’sehli et al., 2011). Il a été bien documenté que les paramètres de

croissance peuvent être utilisés comme critères de sélection pour la tolérance au sel

(Qureshi et al., 1990; Ashraf, 1994).

Au niveau de la production des biomasses aériennes et racinaires, les écart-types

calculés en fonction de la concentration du sel, ont des valeurs importantes cela peut

révéler la présence d’une variabilité inter- et intra populations vis-à-vis de la tolérance à

la salinité. Cette variabilité est évaluée par l’analyse de variance ANOVA à l’aide d’un

modèle linéaire général sur-paramétré (GLM) avec la décomposition de type III par

logiciel Statisica 10.vr. Les résultats de l’ANOVA pour tous les paramètres de la

croissance sont trés hautement significatifs (tableau 5.10). Ces résultats confirment les

valeurs des écart-types enregistrés précédemment. Des différents groupes homogènes

ont été issus par le test de comparaison des moyennes de Newmann-Keuls, dont

souvent, on trouve les population P10, P5 et P11 dans un groupe, les population P1,P2,

P3,P4, P6,P7 dans groupe et les populations P8 et P9 dans un groupe. Des études

précédentes sur la tolérance à la salinité chez les plantes n’ont utilisé que les paramètres

de la croissance pour les convertir en indice de tolérance (Zeng et al., 2002 ; Thuzar

Win et al., 2011). Les indices relatifs de tolérance au sel (ITs) pour tous les paramètres

de la croissance mesurés (tableau 5.10) varient aussi en fonction de la concentration du


80

NaCl et de populations. Seulement, les valeurs des ITs de la longueur et le poids frais

total des plantules sont informatifs. À faible concentration de salinité les valeurs de

l'indice de tolérance au sel de la hauteur des plantules varient de 0,71 à 0,16, et de 0,35

à 0,05 à la concentration la plus élevée. À la même concentration, la réduction des

autres paramètres n'ont pas été démontrée de manière significative, mais elle varie

significativement si on les compare selon la partie tigelle et racinaire. Par exemple les

populations P4 et P5 marquent des valeurs les plus élevées (1,00) pour le poids frais des

racines en comparaison avec le poids frais de la tige 0,50. D’une manière générale, les

populations prospectées à côté de la grande Sebkha d’Oran marquent des valeurs

importantes des ITs par rapport des autres populations.

Tableau 5.10: Analyse de la variance (ANOVA) de l’effet aléatoire (A) des populations

et l’effet fixe (F) concentration de NaCl sur les paramètres étudiés.

Paramètres ddl MC ddlr MCr F p

LT 10 796,08 2182,000 16,4493 48,3958 ***

LTG 10 156,90 2182,000 5,6520 27,7610 ***

LRC 10 257,94 2182,000 6,2677 41,1544 ***

PFT 10 0,18619 2182,000 0,003039 61,2779 ***

PFTG 10 0,119577 2182,000 0,002495 47,9237 ***

PFRC 10 0,007647 2182,000 0,000236 32,3359 ***

*** : très hautement significatif (P <0,001) ;

** : hautement significatif ; (P < 0,01) ;

* : significatif (P < 0,05) ;

NS : non significatif

5.3.2.3. Indices de tolérance

Les valeurs des indices de tolérance calculés par génotype et par traitement sont

présentées dans le tableau 5.11, indiquent qu’après une durée de traitement de neuf

jours les taux de germination (TG) des graines diminuent considérablement au fur et à

mesure que la concentration en sel augmente. À la concentration 68 mM, la population

P3 enregistre l’indice le plus élevé (1,00), suivi par les populations P1, (P8, P4), P9 et

P7 qui ont les valeurs 0,87 ; 0,86 ; 0,80 et 0,73 respectivement. Le reste des populations

ont des valeurs entre 0,64 et 0,32 (tableau 5.11). Ce classement est changé quand la

concentration de NaCl augmente.


81

Tableau 5.11 : Indices de tolérance au sel des paramètres étudiés dans 11 populations

sous différents niveaux de concentration NaCl.

5.3.2.4. Analyse de cluster basée sur les valeurs ITs

La technique de regroupement d’UPGMA a clairement défini le cluster en

fonction des 7 paramètres de mesure à différents niveaux de salinité. L'analyse par

cluster pour 11 populations est basée sur les valeurs ITs à différents niveaux de salinité

a été illustrée par le dendrogramme (figure 5.11). Toutes les populations étudiées ont été

regroupées principalement en deux groupes; A et B, sur la base des gammes de distance

euclidien effectuées par le logiciel DendroUPGMA (Garcia et al., 1999) . Ces deux

derniers étaient divisés en des sous-clusters. Selon la réduction dans les paramètres de

croissance, Le groupe B était composé de P3, P5, P7, P10 et P11. Le groupe A était

composé de 6 populations qui sont : P1, P2, P4, P6, P8 et P9. L’analyse de

regroupement a montré que les populations groupées dans les sous-clusters de B

avaient une réduction de certains paramètres suite au stress salin tandis que les

Populations [Na Cl] mM TG LT LTG LRC PFT PFTG PFRC

P1 IT1 : 68

IT2 : 102,6

IT3 : 136,7

0.87

0.37

0.58

0.65

0.23

0.35

0.61

0.26

0.43

0.69

0.21

0.33

0.57

0.14

0.57

0.54

0.18

0.36

0.66

0.33

0.33

P2 IT1 : 68

IT2 : 102,6

IT3 : 136,7

0.64

0.52

0.35

0.43

0.28

0.21

0.39

0.22

0.18

0.47

0.35

0.25

0.46

0.35

0.21

0.50

0.30

0.20

0.50

0.50

0.50

P3 IT1 : 68

IT2 : 102,6

IT3 : 136,7

1.00

0.26

0.14

0.38

0.13

0.05

0.29

0.09

0.03

0.49

0.16

0.07

0.38

0.11

0.05

0.40

0.13

0.06

0.66

0.10

0.10

P4 IT1 : 68

IT2 : 102,6

IT3 : 136,7

0.86

0.50

0.26

0.54

0.26

0.19

0.46

0.25

0.11

0.63

0.27

0.27

0.50

0.25

0.18

0.50

0.21

0.21

1.00

0.50

0.50

P5 IT1 : 68

IT2 : 102,6

IT3 : 136,7

0.36

0.17

0.19

0.27

0.08

0.09

0.27

0.09

0.12

0.26

0.08

0.05

0.33

0.08

0.10

0.50

0.07

0.07

1.00

0.20

0.30

P6 IT1 : 68

IT2 : 102,6

IT3 : 136,7

0.56

0.52

0.42

0.34

0.31

0.17

0.33

0.31

0.16

0.35

0.31

0.17

0.31

0.31

0.18

0.30

0.30

0.15

0.33

0.33

0.33

P7 IT1 : 68

IT2 : 102,6

IT3 : 136,7

0.73

0.40

0.82

0.30

0.18

0.11

0.27

0.21

0.12

0.32

0.16

0.10

0.38

0.19

0.14

0.35

0.17

0.17

0.50

0.22

0.15

P8 IT1 : 68

IT2 : 102,6

IT3 : 136,7

0.86

0.60

0.56

0.71

0.52

0.29

0.69

0.56

0.32

0.72

0.49

0.26

0.63

0.45

0.27

0.66

0.44

0.27

0.62

0.52

0.35

P9 IT1 : 68

IT2 : 102,6

IT3 : 136,7

0.80

0.48

0.36

0.53

0.24

0.20

0.50

0.29

0.15

0.57

0.20

0.25

0.55

0.30

0.25

0.50

0.31

0.25

0.75

0.32

0.17

P10 IT1 : 68

IT2 : 102,6

IT3 : 136,7

0.32

0.14

0.20

0.28

0.08

0.08

0.20

0.06

0.04

0.40

0.11

0 .17

0.28

0.10

0.18

0.40

0.12

0.22

0.20

0.06

0.06

P11 IT1 : 68

IT2 : 102,6

IT3 : 136,7

0.36

0.36

0.30

0.16

0.16

0.15

0.15

0.18

0.19

0.18

0.13

0.11

0.20

0.19

0.21

0.18

0.18

0.25

0.50

0.16

0.15


82

populations du groupe A ont montré les valeurs les plus élevées de tous les paramètres

mesurés à différents niveaux de salinité. Dans le groupe B, la population P5 appartient

de la sebkha avait un niveau faible de résistance, alors que P4 et P6 sont modérément

résistants, ce qui permet de révéler une variabilité intra-inter populations vis-à-vis de la

tolérance au stress salin.

Figure 5.11 : UPGMA dendrogramme des 11 populations étudiées regroupés en

utilisant des indices de tolérance au sel ITs avec logiciel DendroUPGMA.

5.4. Conclusion

Ce travail a mis en évidence l’effet dépressif de la contrainte saline sur la

germination et la croissance des semences de luzerne annuelle par la réduction du taux

de germination et la biomasse des jeunes plantules. Une grande variabilité vis-à-vis de

la tolérance au sel a été notée. Cette tolérance a été associée à l’origine de la population.

En outre, nos résultats ont montré que les populations de taxa M.ciliaris ont la tolérance

la plus élevée, tandis que la population taxa M.intertexta a la plus faible tolérance dans

le même état de stress salin. La tolérance montrée par certaines populations sous des

seuils élevés en NaCl (136,7 mM) constitue un atout intéressant qui peut être utilisé

aussi bien pour améliorer la tolérance de la luzerne annuelle au stress salin que pour

limiter l’ampleur prise par la salinisation des sols et des eaux dans les écosystèmes

touchés par cette contrainte comme les marges des Sebkha et chott…etc. De plus, une

variabilité intraspécifque, assez importante vis-à-vis du sel, est observée entre les

populations proches du Sebkha étudiés. Une telle variabilité peut servir ultérieurement

pour faire des croisements et par la suite trouver la meilleure recombinaison dans les

descendants. En absence comme en présence de sel, le génotype des populations P8 et

P9 possède le meilleur comportement germinatif. Cependant, les populations P5, P10 et

P11 se montrent les plus sensibles.

B

A


83

Chapitre 6 : Comparaison de la diversite ge ne tique des populations de M. ciliaris par l’utilisation des descripteurs IBPGR morphologique de la gousse et des marqueurs SDS-PAGE

6.1. Introduction

Le médic est reconnu comme l'un des plus importants genres de plantes de

pâturage dans le monde. Le bassin méditerranéen est le centre de l'origine des espèces

de Medicago et comprend la plus grande variabilité du monde (Heyn, 1963). Conscient

de la valeur de ces plantes, de nombreux chercheurs entreprennent de vastes

programmes de recherche afin de les introduire dans les jachères et les marginaux

pastoraux. Grâce à leur intégration dans ley-farming, ils peuvent jouer un rôle important

dans l'augmentation de la production végétale. Ils sont également en mesure d'améliorer

la production pastorale dans les zones semi-arides (Salhi Hannachi et al., 1998).

En Algérie, dans les zones de terres arides et semi-arides, en particulier les terres

agricoles proches de la grande Sebkha d'Oran, le problème de la salinité est l'un des

facteurs limitant la productivité végétale et le rendement agricole (Moulai et Fyad-

lameche, 2014). En général, l'établissement de la germination est un processus critique

pour la productivité des cultures, en particulier dans des conditions salines. Cependant,

la germination et la croissance de certaines espèces végétales sont inhibées par des eaux

saumâtres ou par des sols qui contiennent une forte charge de chlorure de sodium

(NaCl).

L'introduction des variétés étrangères dans les pays du Maghreb depuis 1970,

dans le but d'améliorer leurs cultures fourragères, a révélé une mauvaise adaptation aux

conditions locales des cultivars introduits (Seklani et al., 1995). D'autre part, le genre

Medicago bien présenté, notamment en Algérie, constitue un patrimoine phytogénétique

extrêmement riche et diversifié (Abdelguerfi et al., 1988). Parmi les espèces de ce

genre, M.ciliaris est une plante annuelle majoritairement auto fécondante de la région

méditerranéenne (Heyn, 1963, Lisens, 1979), elle est omniprésente dans les régions

semi-arides et soutient l'activité pastorale. Leurs biomasses remarquables permettent

d'être plus tolérantes au sel (Abdelly et al., 1995). Ces espèces ont récemment fait

l'objet de plusieurs études mettant en évidence leurs avantages et leurs réponses à la


84

culture en milieu salin (Abdelly et al., 2011). Ils auraient un fort potentiel pour être

utilisés dans la remise en état des zones, comme les bords de Sebkha. Parce qu'ils

étaient l'une des plantes glycophyte qui ont la possibilité de croître dans cette condition

de sel et étaient compétents pour améliorer la qualité et la quantité de pâturage.

En outre, le fruit de cette espèce, reconnu comme la gousse, est la partie la plus

caractéristique de la plante (Jabri et al., 2012). C'est aussi l'organe de propagation de

cette espèce. Près de la moitié des espèces du genre Medicago peuvent être identifiées et

caractérisées uniquement en fonction de leur apparence morphologique de la gousse

(Lesins et Gillies, 1972). En outre, l'évaluation de la diversité génétique fondée sur des

caractères morphologiques est souvent moins efficace et biaisée en raison d'une

interaction environnementale élevée (Tripathy et al., 2015). Cependant, la SDS-PAGE

des protéines de réserve des graines (protéines totales ou fractionnées) est considérée

comme une méthode pratique, rentable et fiable car elle est largement indépendante des

fluctuations de l'environnement comparativement à l'analyse des traits morphologiques

seulement (Iqbal et al., 2005; Dutta et Malik, 2012). Selon Krochko et Bewley (2000),

les principales protéines de réserve des graines de Medicago sont des globulines de type

viciline (alfin) 7S, des globulines de type légumineuse 11S (medicagin) et des

albumines 2S (LMW) (voir chapitre 4). Ces protéines représentent respectivement 10%,

30% et 20% de la protéine totale accumulée dans les graines mûres de M. sativa

(Krochko et al., 1994). Ainsi, les protéines de réserve des globulines fournissent un

excellent modèle pour l'étude des mécanismes de régulation des gènes des plantes

(Milisavljevic et al., 2004).

En revanche, l'utilisation de ces marqueurs protéiques en combinaison avec des

caractères morphologiques des gousses peut constituer une alternative importante pour

caractériser et évaluer les populations prospectées de M.ciliaris qui ont une bonne

adaptation aux contraintes telles que les bords de Sebkha.

Le présent travail suggère d'explorer la variation génétique des protéines de réserve des

graines et les caractéristiques morphologiques des gousses pour décrire et comparer la

variabilité génétique d'un ensemble de populations prospectées de M. ciliaris.


85


6.2.1. Matériel végétal

Onze populations d'espèces auto-pollinisantes de M. ciliaris ont été choisies en

fonction de leurs différences géographiques (voir le tableau 5.1) du chapitre 5. Ils sont

formés de trois groupes de populations; La population la plus éloignée (pop FA), la

population la plus proche (pop NE) à la grande Sebkha d’Oran et la population de

référence (pop Ref).

Zone d'enquête

Sept de ces populations ont été recueillies à partir de différentes régions proches

et loin de la grande Sebkha d’Oran. Cette région salée est située au nord de l'Algérie.

Avec latitude: 35 ° 31'9.65 "et Longitude: 0 ° 49'11.75". L'augmentation du terrain au-

dessus du niveau de la mer est de 83 mètres. Moussa et al. (2014) ont reconnu que les

espèces végétales du groupe majeur prolifèrent dans les régions périphériques de

Sebkha (voir annexe 1).Outre les parties élevées comme Murdjadjo et Tessala, d'autres

parties du bassin Sebkha d’Oran sont occupés par des espèces tolérantes au sel. La

plaine de Sabkha elle-même est complètement dépourvue de plantes.

6.2.2. Méthodes utilisées

6.2.2.1. Collecte des données et analyse statistique des traits morphologiques

Les données ont été enregistrées pour les caractères morphologiques en utilisant

les normes internationales d’IBPGR (1991) concernant le genre Medicago. Ces

paramètres ont été mesurés sur chaque gousse individuellement sur un échantillon de 10

gousses prises au hasard de chaque population.

Huit paramètres ont été notés sur les gousses des populations de M.ciliaris: PW

poids de la gousse (mg); NC Nombre d’épines par gousse (nombre); D diamètre de la

gousse (mm); Hauteur de la gousse H (mm); PTL longueur totale de la gousse (mm); Ns

nombre spire par gousse (nombre); NS nombre de graines par gousse et le rapport

D / H. Pour PTL est ajouté comme un nouveau paramètre mesuré.

Les données des divers paramètres étudiés ont été traitées à partir des logiciels

Statistica 10.0 et Microsoft Office Excel 2010. L'analyse de la variance et les

comparaisons des moyennes ont été effectuées respectivement par (ANOVA

unidirectionnelle) et Newman-keuls. La variance génotypique absolue est estimée par la

formule utilisée par Kaul et Bahn (1974).


86

Et la variance phénotypique est égale à la somme de la variance génotypique et de la

variance résiduelle. Vp = Vg + Ve

Les coefficients de variation génétique (Cvg) sont obtenus en divisant le carré racine de

la variance génotypique (Vg) par la moyenne de la population (μ) et exprimée en

pourcentage: √

Les coefficients des variations phénotypiques (Cvp) sont le rapport de l'écart-type S à la

moyenne. Plus la valeur du coefficient de variation est élevée, plus la dispersion autour

de la moyenne est grande. Il est généralement exprimé en pourcentage et sans unité.

6.2.2.2. Extraction des protéines de réserves des graines

L’extraction a été réalisée à partir d’environ 10 graines sèches matures pour

chaque population. L'extraction est faite par deux méthodes différentes. La première

concerne les protéines totales, elles ont été extraites selon la méthode de Leammli

(1976) en utilisant du SDS à 2% de détergent. La deuxième extraction est spécifique

pour les globulines à l’aide de la cryo précipitation selon le protocole (Anisimova et al.,

1991 modifié par Fyad-lameche, 1998). Pour chaque méthode, trois répétitions sont

effectuées séparément. Cela fait un total de 60 graines par population.

6.2.2.3. Électrophorèse 1-D SDS-PAGE

Les mêmes groupes de population utilisés dans l'analyse biométrique ont fait

l'objet d'une électrophorèse 1-D avec la grande cuve. Les gels sont soumis à un courant

de 25 mA pendant 30 minutes et une tension de 150 V et 30 mA jusqu'à la sortie du bleu

de bromophénol. Pour les protéines totales et les globulines, les gels de séparation

étaient de 10% et 13,5% respectivement avec le même gel d'empilage de 4,5%

d'acrylamide. Les gels sont ensuite colorés en bleu dans une solution contenant du

Coomassie R250, du méthanol, de l'acide acétique et de l'eau distillée. La décoloration a

la même composition sans le bleu de Coomassie. Le même marqueur de taille utilisé

dans le chapitre 5, est conçu pour surveiller la séparation des protéines lors de

l'électrophorèse. Une comparaison des bandes d'électrophorèse a été effectuée à l'aide

du logiciel Gel Analyzer v.2010a. Seules les bandes majeures et clairement dans les gels

ont été considérées pour l'enregistrement des données.


87

6.3. Résultats

6.3. 1. Analyse des traits morphologiques des gousses

L'analyse de variance avec ANOVA à un facteur appliquée sur les caractères

morphologiques a montré un effet population très hautement significatif à (p <0,001)

pour presque tous les caractères (tableau 6.1). A l'exception des paramètres NC et NS

suivants, ils correspondent respectivement au nombre de spires par gousse et au nombre

de graines par gousse qui ne sont pas significatifs à (p> 0,05) pour cette étude.

Cependant, il n'existe aucune différence entre les trois groupes de populations pour ces

deux paramètres (tableau 6.1). En outre, le test de Newman-Keuls à (p <0,05) de ces

paramètres fait que tous les groupes de population se composent d'un groupe homogène.

Mais le même test fait souvent (P4, P5 et P6) pour presque tous les paramètres dans le

même groupe homogène popNe.

Tableau 6.1: ANOVA à un facteur pour tous les traits morphologiques.

Morphological traits of pods d.f. MC d.f. erreur MC erreur F p

PW*(mg) 2 0.026 107 0.00462 5.65086 ***

NC*(number) 2 1.111 107 0.71534 1.55308 NS

D*(mm) 2 25.709 107 2.00399 12.82877 ***

H*(mm) 2 4.679 107 0.85796 5.45320 ***

PTL(mm) 2 83.657 107 4.38281 19.08760 ***

Ns(number) 2 2766.279 107 72.61160 38.09693 ***

NS*(number) 2 1.601 107 2.09829 0.76289 NS

D/H ratio 2 0.089 107 0.02103 4.24885 **

Dans le tableau 6.2, les valeurs moyennes (μ) de tous les traits morphologiques

du groupe popNE semblent plus faibles que celles des groupes popFA et pop Ref. Par

exemple, la valeur moyenne du caractère H pour popNE; 10,7 mm est inférieure à celle

des deux autres groupes ensemble 11,4 mm et la valeur de la longueur totale de la

gousse (PTL) pour le groupe popNE représente 18,7 mm qui est inférieure aux groupes

popFA et popRef, respectivement 21,8 et 20 mm. Pour les trois groupes de population,

le poids des caractères de la gousse (PW) et le rapport D / H de la variance génotypique

sont presque nuls.

d.f: Degré de liberté, MC: moyen carré, F: ratio de la variance, p: p-value.

NS: non significatif à (p >0.05), ***: très hautement significatif (p <0.001),

*: paramètres quantitative selon IBPGR (Jabri et al., 2012).


88

Tableau 6.2: Évaluation des paramètres génétiques dans trois groupes de populations

étudiées.

PG MT Vp Vg Ve Cvg (%) Cvp (%) µ

pop FA PW*(mg) 0.004 0.003 0.0013 17.8052 21.7389 0.294 mg

NC*(number) 0.687 0.549 0.1371 9.3533 10.4552 7.925

D*(mm) 1.362 0.900 0.4622 8.0801 9.9400 11.743 mm

H*(mm) 0.590 0.237 0.3536 4.2657 6.7354 11.409 mm

PTL(mm) 2.749 1.828 0.9205 6.1914 7.5919 21.837 mm

Ns(number) 64.035 3.097 60.9381 1.4265 6.4861 123.375

NS*(number) 1.717 0.031 1.6863 1.9500 14.5203 9.025

D/H ratio 0.034 0.002 0.0322 4.4594 18.4515 1.003

pop NE PW*(mg) 0.002 0.000 0.0020 0.0000 18.5035 0.243 mg

NC*(number) 0.944 0.375 0.5689 8.0910 12.8383 7.567

D*(mm) 1.229 0.132 1.0969 3.5538 10.8287 10.239 mm

H*(mm) 1.233 0.114 1.1185 3.1449 10.3266 10.752 mm

PTL(mm) 4.116 0.665 3.4510 4.3456 10.8107 18.767 mm

Ns(number) 35.206 4.235 30.9709 1.8874 5.4419 109.033

NS*(number) 3.316 0.088 3.2283 3.3540 20.6153 8.833

D/H ratio 0.013 0.006 0.0075 8.0087 12.0659 0.958

pop Ref PW*(mg) 0.007 0.006 0.0011 30.1436 32.9248 0.256 mg

NC*(number) 0.574 0.075 0.4994 3.5110 9.7162 7.800

D*(mm) 3.222 3.370 -0.1483 17.6616 17.2687 10.394 mm

H*(mm) 0.847 0.553 0.2940 6.5187 8.0682 11.405 mm

PTL(mm) 6.215 4.686 1.5298 10.7961 12.4343 20.050 mm

Ns(number) 109.003 106.639 2.3632 9.5308 9.6358 108.350

NS*(number) 1.574 1.118 0.4559 12.2580 14.5447 8.625

D/H ratio 0.014 0.010 0.0030 10.6919 12.8028 0.958

PG: groupe de population; MT: traits morphologique; Vp: phenotypic variance; Vg genotypic variance;

Ve: variance résiduelle; Cvg: coefficient de variation génétique; Cvp: coefficient de variation

phénotypique.


89

Les corrélations entre les 8 caractères morphologiques étudiés pour presque

toutes les populations sont très significatives (tableau 6.3), mais seulement quelques

valeurs ne seront pas significatives. La corrélation du poids des gousses avec le nombre

de spires par gousse, le diamètre et la taille de la gousse, la longueur totale de la gousse,

le nombre d'épines par gousse et le rapport D / H était significativement positif. Le

diamètre et la hauteur ont été fortement corrélés avec le poids des gousses de 0,83 et de

0,68 respectivement.

Tableau 6.3: Matrice des coefficients de corrélation entre les différents caractères.

PW NC D H PTL Ns NS D/H

PW +0.33** +0.83** +0.68** +0.73** +0.56** +0.14NS +0.38**

NC +0.21* +0.06NS +0.58** +0.08NS +0.09NS +0.13NS

D +0.51** +0.67** +0.68** +0.33** +0.58**

H +0.52** +0.44** -0.13NS -0.06NS

PTL +0.61** +0.24* +0.33**

Ns +0.28** +0.37**

NS +0.31**

D/H

6.3.2. Analyse par SDS-PAGE des protéines de réserve des graines

Les profils de protéines de graines analysés dans la présente étude ont montré en

général un degré élevé de similarité entre les différents groupes de populations étudiées

donc l'expression qualitative et quantitative de protéines de graines suggère un degré

élevé d'uniformité dans la physiologie des graines et la génétique de la plante. Trois

zones distinctes à droite de chaque gel étaient visibles; (C), intermédiaire (I) et anodique

(A) (figure 6.2 et figure 6.3). En comparaison avec le marqueur de protéine à large

bande VI appliqué avec les échantillons (à gauche de chaque gel), leurs poids

moléculaires variaient entre 245-100, 100- 25 et 25-11 kDa, respectivement pour le gel

de protéines totales. Mais pour les globulines gel, ils ont varié entre 245-63, 63-25 et

20-11 kDa.

Abréviations de caractères référés au tableau précédant.

*: significatif à p=0.05

**: significatif à p=0.01

NS: non significatif à p=0.05


90

MW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

C

I

A

KDa

245 100 75 63 25 17 11

Figure 6.1: Profils SDS-PAGE des protéines totales de graines matures 11

populations étudiées 10% acrylamide gels conditions dénaturantes. MW: poids

moléculaires; 1, 2…11; correspondent les populations P1, P2….P11 respectivement.

C

KDa

245 100 75 63 25 20 17 11

MW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

I

A

Figure 6.2: Profils SDS-PAGE des protéines totales de graines matures 11

populations étudiées 13.5% acrylamide gels conditions dénaturantes. MW: poids

moléculaires; 1, 2…11; correspondent les populations P1, P2….P11

respectivement.


91

Table 6.4: Nombre de bands des protéines totales obtenues par gel 10% acrylamide avec la

gamme du poids moléculaire (MW), mobilité relative Rf et bandes spécifiques selon le software

Gel Analyser10a.

Table 6.5: Nombre de bands des protéines totales obtenues par gel 13,5% acrylamide avec la

gamme du poids moléculaire (MW), mobilité relative Rf et bandes spécifiques selon le software

Gel Analyser10a.

échantillons Nbr de bandes gamme de MW

(kDa)

gamme de Rfs bandes

spécifique (kDa)

Marqueur VI 12 11-245 0.062-0.969 75 et 25

P1 44 22-307 0.01-0.986 ~68

P2 46 11-307 0.01-0.976 ~68

P3 45 11-305 0.014-0.976 ~68

P4 35 11-305 0.014-0.976 non

P5 34 11-324 0.003-0.976 non

P6 36 11-324 0.003-0.976 non

P7 37 11-317 0.007-0.976 ~68

P8 37 11-324 0.003-0.976 ~68

P9 37 11-324 0.003-0.976 ~68

P10 36 11-312 0.01-0.976 ~68

P11 37 11-317 0.007-0.976 ~68

Echantillons Number of all

bands

Range of MW

(kDa)

Range of Rfs Bandes

spécifiques

(kDa)

Marqueur VI 12 11-245 0.029-0.908 75 and 25

P1 15 7-144 0.034-0.975 no

P2 15 12-113 0.112-0.813 no

P3 15 12-110 0.119-0.816 no

P4 18 8-135 0.054-0.953 ~80

P5 17 11-109 0.121-0.861 ~80

P6 18 12-134 0.056-0.822 ~80

P7 18 7-157 0.007-0.987 no

P8 17 11-157 0.007-0.856 no

P9 16 10-156 0.009-0.885 no

P10 16 11-156 0.009-0.856 no

P11 17 12-155 0.011-0.816 no


92

Il existe de nombreuses bandes communes dans les deux gels parmi les groupes de

population. Pour les protéines totales, le plus grand nombre de bandes appartenait à P2

et le moins de P5 avec respectivement 46 et 35 bandes (tableau 6.4). Mais dans le

tableau 6.5, le plus grand nombre et le moindre des bande de globulines sont 15 et 18

respectivement. Pour les deux gels, deux bandes spécifiques ont également été

observées et elles sont indiquées par une flèche noire (figure 6.1 et Figure 6.2).Les

différences dans les bandes polypeptidiques mineures indiquent la présence de

variabilité génétique variabilité entre les groupes de population étudiés.

6.4. Discussion

Les différences significatives d'ANOVA indiquent la présence d'une variabilité

génétique importante pour les populations étudiées. Ce résultat est partiellement

corroboré avec celui rapporté par Heyn (1963) dans les dernières décennies, et

actuellement avec ceux qui ont été faits par Jabri et al. (2012). Ces auteurs ont

mentionné que la distinction entre les espèces du genre Medicago était principalement

basée sur la morphologie des gousses. Cependant, les études taxonomiques sur le genre

Medicago en Égypte rapportées par Ahmed et Atia (1994) démontrent que l'apparition

de formes intermédiaires et la variation considérable des caractères des gousses rendent

difficile l'identification et la classification de ce genre. Des travaux antérieurs ont

montré que d'autres paramètres tels que la précocité, le développement végétatif et la

production de semences contribuent à la répartition de la diversité phénotypique (Salhi,

1996) dans le genre Medicago et que l’environnement a un haut niveau dans la diversité

phénotypique existée parmi les populations. On peut donc conclure que les deux

paramètres précédents NC et NS n'influencent pas sur la diversité entre les groupes de

population. Contrairement à Graziano et al. (2010) qui ont rapporté que la variabilité

dans les caractères de gousse comme la taille, la largeur et le nombre de spires étaient

élevée parmi les populations siciliennes de M. truncatula.

La présence d'homogénéisation entre les populations P4, P5 et P6 peut être expliquée

par leur origine géographique. Ils sont prospectés dans différents bords de grande

Sebkha d'Oran. Mais ils peuvent être appartenus par une population unique au début de

leur évolution et ils sont dispersés par les mouvements de bétail le long des prairies près

des bords de Sebkha. La gamme de variabilité semble être discontinue sur cette zone

salée prospective. L'étude récente de Jabri et al (2016) a révélé une variation

considérable parmi les populations étudiées. Pour la majorité des caractères enregistrés,

la variation intra-population était moins significative.


93

Les valeurs moyennes (μ) pour tous les traits morphologiques indiquent que la popNE a

un aspect nain en comparaison avec la pop FA et la pop Ref.

Les coefficients de variation phénotypique sont plus élevés que les coefficients de

variation génotypique pour tous les caractères analysés, mais la faible déviation de la

différence entre ces deux coefficients indique que ces caractères sont très peu influencés

par l'environnement comme il a été indiqué par plusieurs auteurs dans le millet perlé

(Béninga et al., 2011 ; Lakshmana et al., 2009). La comparaison des valeurs moyennes

des paramètres indique qu'il y a une légère réduction dans la morphologie de la

population popNE par rapport à ceux de la popFA et popRf. Cette plus faible valeur

observée dans la population popNE pourrait être liée à ses conditions

environnementales (zone salée près d’Oran Great Sebkha). En outre, l’augmentation

des coefficients génétique (Cvg) et des coefficients de variation phénotypique (Cvp)

pour le poids des gousses, le nombre de graines par gousse et le (Rapport: diamètre sur

la hauteur de la gousse) a suggéré que l'efficacité de la sélection de ces traits

morphologiques. Ce résultat est parallèle à l'étude de Badri et al (2008), qui a établi une

faible différenciation aux traits quantitatifs chez quatre populations de M.ciliaris. En

conséquence, Gitzendanner et Soltis (2000) ont montré que l'aire géographique était un

bon prédicteur des niveaux de variation génétique dans les plantes. Le diamètre et la

hauteur ont été fortement corrélés avec le poids des gousses de 0,83 et de 0,68

respectivement. Ce résultat est en parallèle avec celui de Graziano et al. (2010) et Jabri

et al (2012) qui ont rapporté que la taille des gousses était corrélée positivement et

significativement au poids des gousses. La taille des gousses joue un rôle important

dans la dispersion des graines, par exemple Medicago lupulinahas petites gousses

indehiscentes qui facilitent la dispersion des semences à longue distance par des agents

biotiques et abiotiques, tandis que M. ruthenica a des gousses déhiscentes et manque de

mécanismes efficaces pour la dispersion des graines (Yan et al., 2009). Une corrélation

aussi positive et significative entre les traits suivants; Le poids des gousses, le nombre

de spires par gousse, la hauteur des gousses, la longueur totale de la gousse, le nombre

d'épines par gousse, le nombre de graines par gousse, le rapport D / H et le diamètre des

gousses. Une forte association (r = 0,68, p <0,0001) a été observée entre le diamètre de

la gousse et le nombre de graines par gousse. Il peut être avantageux d'avoir plus de

semis dans les environnements où le risque de mort des semis est élevé, comme les

bords de Sebkha.


94

Parce que les traits morphologiques ne représentent qu'une partie de la variabilité

génétique, et parce que l'organisation de cette diversité est fortement soumise à la

sélection naturelle et aux facteurs environnementaux, la connaissance de l'évaluation

génétique des populations nécessite l'analyse de marqueurs neutres comme les protéines

de réserve des graines. Les analyses comparatives des profils protéiques ont permis

d'identifier et de caractériser les espèces, de clarifier les problèmes taxonomiques et

évolutifs et d'étudier la diversité génétique (Ladizinsky , Hymowitz, 1979). La diversité

génétique des protéines de graines a été étudiée chez les espèces de la population

naturelle de Medicago (Fyad-Lameche, 1998), chez medicago sativa (Krochko et

Bewley. 2000) et chez la légumineuse modèle M.truncatula (Le Signo et al., 2005) en

utilisant une électrophorèse 1-D.

En général, la variation génétique des profils protéiques des graines joue un rôle

important dans l'identification des variétés (Tripathy, 2015). Cette méthode est un outil

utile à cette fin. Les résultats obtenus sont en accord avec les conclusions de Krochko et

Bewley (2000) dans Medicago sativa. Les résultats sont trop parallèles à l'étude

précédente avec mini- gel (Moulai et Fyad-Lameche, 2014). Ces auteurs ont rapporté

que chaque zone après migration contenait des bandes majeures et mineures avec une

faible variation en nombre et en intensité. Selon logiciel Gelanalyser10a v.r, le nombre

de bandes des protéines totales détectées dans les groupes poNE, popFA et Refpop est

d'environ 34, 45 et 36 respectivement. Les profils globaux de la protéine totale étaient

semblables dans tous les groupes de population en utilisant un gel à 10% d'acrylamide

mais la bande polypeptidique spécifique est résolue uniquement dans pop FA et pop Ref

avec une masse moléculaire ~ 68 kDa et elle est absente dans la popNE, cette bande a

été discutée dans le chapitre 5.

Les résultats obtenus par le gel d'acrylamide à 13,5% pour les globulines

révèlent également un aspect général commun des profils électro phorétiques entre

différentes populations avec une bande spécifique ~ 80 kDa qui est sprésente seulement

pour le groupe pop NE. Ces résultats sont cohérents avec ceux obtenus par les mini-gels

de la même espèce (Moulai et Fyad-Lameche, 2014). Auparavant, Faraghi et al (2007)

ont étudié la variabilité des protéines de réserve pour 18 génotypes de M.sativa de

luzerne pérenne basés sur SDS-PAGE. Ils ont signalé un total de 61 bandes, dont 16

sont des globulines. Habibi et al (2012), travaillant sur 18 génotype de M.sativa L; Ils

ont détecté 24 bandes. Récemment, d'autres auteurs ont montré que les protéines totales

chez les espèces de Medicago produisaient des profils avec des variations de bandes de


95

masse moléculaire (97 à 20 kDa) et en nombre (11 à 20 bandes par profil). Chaque

espèce est caractérisée par des bandes spécifiques. Mais pour la fraction globuline, les

profils étaient relativement simples (3 à 6 bandes) pour certaines espèces et plus

complexes (9 à 12 bandes) pour le reste des espèces (Fyad-Lameche et al., 2016). Enfin,

la variabilité génétique basée sur les marqueurs SDS-PAGE peut jouer un rôle clé dans

les programmes de sélection des génotypes d'intérêt. En général, les résultats de cette

étude montrent une légère modification des protéines totales et des globulines dans les

mêmes populations de M.ciliaris. En revanche, des variations significatives ont été

observées dans la morphologie des gousses.

6.5. Conclusion

Sur la base des résultats biométriques, les 11 populations de Medicago qui

diffèrent dans leur texture de gousses morphologiques ont été sélectionnées également

pour l'analyse SDS-PAGE pour vérifier la présence de la diversité des protéines de

réserve des graines. Lors de l'évaluation génétique et du fractionnement du SDS-PAGE,

le groupe de population popNE apparaît comme population différenciée par rapport aux

autres groupes de population par leurs aspects morphologiques nains et la présence ou

l'absence de bandes de polypeptides spécifiques dans des conditions dénaturantes.

En utilisant cette information, nous avons pu identifier des génotypes de M.

ciliaris appropriés comme parents pour la génération de populations ségrégatives utiles

pour la détermination génétique des traits de graines de légumineuses qui tolèrent le

stress salin. En fin on peut utiliser cette espèce prometteuse pour valoriser et améliorer

les ressources génétiques. Des études plus approfondies sur M. ciliaris sont nécessaires

pour étudier les besoins en germination à un niveau plus élevé que le degré de salinité

des bords de Sebkha et pour clarifier la variabilité génétique inter et intra-population, il

faut tenir en compte d'un plus grand nombre de populations prospectées et pouvant

s'étendre aux populations de l'Algérie du Nord.


96

Chapitre 7: L’expression des prote ines de re serves des graines solubles dans le sel comme marqueur pour des populations locales de M.ciliaris adapte es a la re gion fortement sale es en Alge rie (la grande Sebkha d’Oran)

7.1. Introduction

La grande sebkha d’Oran est formée par une couche mince d'eau dépourvue de

végétation à l'intérieur. Les terres bordant ce site, sont occupées par des terrains privés,

utilisés pour l'agriculture. Les bords de ce lac salé sont utilisés par des éleveurs pour le

pâturage. Auparavant, Sebkha qui n'était pas l'objet d'étude sur la végétation ne semble

contenir une flore remarquable. Cela reste une enceinte de végétation halophile

contenant de Sueada sp, Juncus sp et les petits lots de Chamaeropsis humilis, quelques

spécimens rares de tamaris au niveau de ces bords (Moussa et Martin Saint, 2011).

Mais, jusqu'au présent, l'observation sur l'espèce végétale permet de tracer une carte de

végétation grandissant autour du Sebkha et voir la relation avec la fluctuation de salinité

(voir annexe 1).

Le médics annuels (Medicago spp.) est principalement l’un des plantes annuelles

spontanées de la région méditerranéenne (Lesins et Lesins, 1979). Elles sont des

légumineuses annuelles d'hiver qui indiquent une capacité forte de s'adapter aux

environnements locaux. Ces espèces ont un intérêt important, puisqu'elles forment des

symbioses avec des bactéries fixatrices d’azote et elles sont donc des candidats

excellents à l'amélioration de faible apport de sols marginaux ou dégradés avec une

fertilité basse. Elles sont des composantes essentielles des écosystèmes naturels et de

l'agriculture et récemment, elles ont fait l'objet de plusieurs études mettant en évidence

leurs avantages et leurs réponses à la culture en milieu salin (Abdelly et al., 2011).

L'espèce M.ciliaris a le fort potentiel à être utilisé dans la récupération des zones

dégradées, comme les bords de Sebkha…etc.

Parce qu'ils sont les unes des plantes glycophytes qui ont la possibilité de grandir sous

ce conditionnent en sel et sont compétent d'améliorer la qualité et la quantité de

pâturage. M.ciliaris est une espèce diploïde (2n=16) appartenant à la

section Spirocarpos; subdivision d'Intertextae comme délimité par Heyn (1963). La


97

connaissance de la variation génotypique pour l'adaptation au sel est une clé pour le

développement de la sélection et les stratégies d’hybridation. La stratégie principale

utilisée au cours des dernières années pour améliorer la tolérance au sel dans des

légumineuses a été le dépistage des génotypes et la sélection (Cordovilla et al., 1995).

Ainsi, l'objectif de beaucoup d'études était d'explorer la variation génotypique pour la

tolérance au sel en utilisant beaucoup d'indicateurs de la santé de la plante. Néanmoins,

les protéines de réserve de graines associées aux données écologiques de cette espèce

pourraient être très prometteuses. Ils sont des outils utiles pour une enquête préliminaire

de la diversité génétique des populations locales de M.cilaris. Dans les légumineuses,

les protéines de réserves incluent principalement des globulines. Elles sont dominantes

dans les graines de légumineuses et représentent 50-90 % de protéines de la graine

(Rashidah et al., 2007). L'expression de protéines de réserves de graine est

conformément lié à la régulation strict du développement et représente un système de

modèle puissant pour étudier la régulation de l’expression du gènes durant la

germination et développement de la plante (Mehrotra et al., 2009).

La présente étude traite la comparaison de trois populations de M. ciliaris

prospectées près de la grande Sebkha d’Oran et quatre d'autres loin de là. De cette

façon, nous avons examiné l'expression des protéines solubles de sel de graine de

différentes populations de M. ciliaris par l’utilisation de la technique de cryo-

précipitation pour l'extraction et la technique SDS-PAGE pour la séparation. Ces

informations pourraient alors être utilisées pour définir des critères de sélection et

fournir un cadre pour choisir le grand nombre des populations qui grandissent dans sur

tous les côtés de bords Sebkha.


98


7.2.1 Matériel végétal

Le matériel végétal inclus onze populations de M.ciliaris (voir chapitre

précédent : tableau 5.1) forme trois groupe qui sont : une population (pop FA), une

population (pop NE) et une population de référence (pop Réf).

7.2.2 Méthodes utilisées

7.2.2.1. Extractions des protéines solubles dans le sel

Des graines mûres ont été utilisées pour l'isolement des protéines solubles dans

sel. Pour éliminer les lipides, dix graines regroupées de chaque population ont été

moulues dans quatre volumes de 1-butanol avec le mortier et le pilon. La fraction de

protéine a été extraite par la cryo-précipitation (Anisimova et al., 1991 modifié par

Fyad-lameche, 1998). Des extractions individuelles ont été faites ensuite pour chaque

populations avec la même procédure en utilisant 12 graines séparées.

7.2.2.2. Electrophorèse SDS-PAGE

L'analyse d’électrophorèse par SDS-PAGE unidimensionnelle (4.5% gel

d’empilement et 13.5 % le gel de séparation) (voir annexe 2). L’électrophorèse a été

réalisée avec une mini-cuve pendant 4 heures à 150V constant pour les extraits

regroupés. Mais pour l’électrophorèse des extrais individuelles, on a utilisé la grande

cuve avec peigne de 28 puits. Après migration, les gels ont été colorés avec le bleu de

Coomasie R250 brillant et ensuite décolorés dans le méthanol/l'acide acétique. Le

marqueur de taille de protéine Biolabs a été utilisé comme marqueur de poids

moléculaire. Ce dernier est un mélange de 12 bandes, des protéines hautement purifiées,

qui résolvent dans des bandes clairement identifiables de 10-250 kDa (Laemmli, 1970;

Sambrook et Maniatis, 2001). Les bandes 25 et 80 kDa ont été triplées d'intensité par

rapport des autres protéines et sert d'indicateurs de référence.

7.2.2.3. Analyse statistique et cluster

La comparaison des bandes majeures a été basée sur leur épaisseur, leur nombre

et leur mobilité. L’expérience des extraits regroupés et individuels ont été répétée 4 fois

et les gels ont été analysés par logiciel Gelanalyser v.2010a.Les données ont été

enregistrées comme la présence (1) ou l'absence (0) de bandes, ensuite entrées dans une

matrice binaire. L'analyse de la similitude et la matrice de distance ont été conduites en

utilisant DendroUPGMA avec l'application du coefficient de Jaccard (Garcia et

al.,1999) (http://genomes.urv.cat/UPGMA/). Pour les extraits individuels le meilleur gel

http://genomes.urv.cat/UPGMA/


99

d’électrophorèse qui a été retenu, c’est celui qui compare la population P1 et la

population P4.

7.3. Résultats et discussion

Les protéines de réserve des graines extraites par cryoprécipitation et la

séparation de la fraction globulines de onze populations annuelles de Medicago sur gel

de polyacrylamide 13,5% en présence de SDS a donné les profils suivants (figure 7.2).

Tous les profils ont été analysés à l’aide de logiciel (Gelanalyser 2010a v.r) en basant

sur les courbes d'intensité de bandes. En utilisant le profil de la population de référence

P10 : M. intertexta vr.ciliaris (figure 7.1) comme support d’interprétation ; trois zones

différentes ont été détectées (figure 7.1 et figure 7.2); on a la zone cathodique (C), la

deuxième zone est intermédiaire (I) et la dernière c’est la zone anodique (A). Chaque

zone a des bandes majeures et mineures. Selon le marqueur de taille, leurs poids

moléculaires s'étendent entre [60-250 kDa], [15-50 kDa] et [10-15k Da] respectivement.

De plus, il a été observé que les profils de protéine de la plupart des populations sont les

mêmes pour les bandes majeures. Il y a beaucoup de bandes majeures communes parmi

les populations étudiées. Mais des bandes spécifiques ont été aussi observées, ils ont été

indiqués par une flèche noire sur le gel (figure 7.2). Un nombre important de bandes a

été remarqués aux populations (popNE) avec intensité importante et un faible nombre

de bandes avec l'intensité basse ont été remarqués à ceux de populations éloignées

(popFA) à la grande Sebkha d'Oran. Ils ont présenté 15 et 13 bandes respectivement.

Cela peut signifier que les populations de groupe popNe contiennent plus de globulines

que les autres groupes étudiées. Fareghi et al (2007) a étudié la variabilité entre 18

génotypes de Luzerne utilisant la SDS-PAGE. Ils ont rapporté 16 bandes liées aux

protéines solubles dans le sel. On constate également que la bande spécifique est

mesurée de 80 kDa avec le une mobilité relative Rf 0.162. Elle se trouve dans la zone C.

Elle est présente dans toutes les populations les plus proches (popNE) et elle est absente

chez les populations éloignées (popFA) et ainsi chez les populations de référence

(popRéf). Néanmoins, le nombre des populations proches à la grande Sebkha d’ Oran

est limité à trois populations et les résultats à prendre avec beaucoup de réserve. Les

résultats de cette étude doivent être poursuivis et répétés en augmentant le nombre de

populations jusqu’à la confirmation que cette bande spécifique est vraiment un

marqueur génétique. Précédemment, Hedrick et al, (1976) ont démontré, que l'on

considère la variation génétique inter et intra populations est le résultat de l'action de

l'hétérogénéité environnementale et de la sélection naturelle.


100

10 kDa

25 kDa

80 kDa

MW P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

C

I

A

Figure 7.1 : Profil windows basé sur le logiciel Gelanalyser v.2010a du génotype de

référence P10 (M.intertexta.ciliaris IG54229) avec les trois zones : C, zone cathodique; I,

zone intermédiaire et A, la zone anodique. 1, 2, 3…14 : nombre de bandes indiquées

Figure 7.2 : SDS-PAGE des protéines solubles dans sel des graines de

populations P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11 avec: MW, Marqueur

de poids moléculaire et les trois zones de migration: C, zone cathodique; moi,

zone intermédiaire; A, zone anodique.


101

De plus, Lazrek et al., (2009) a examiné la diversité génétique d'une collection d'espèce

de Medicago annuelle et ont constaté qu'avait une corrélation avec l'environnement

salin. En basant sur l'analyse de groupe par la méthode UPGMA. Le dendrogramme de

la figure 7.3 est constitué de trois groupes bien formés et bien séparé. Le premier groupe

constitue de 3 populations (P1, P2, P7), le deuxième groupe a inclus cinq populations

(P3, P8, P9, P10 et P11) et le troisième groupe constitue de trois populations (P4, P5,

P6). Toutes les populations de ce dernier groupe sont originaires de la grande Sebkha.

De plus, on a observé que les populations éloignées à la grande Sebkha d’Oran (P1, P2

et P3) ont été différées de deux écotypes modérément sensibles M.ciliaris 252 et 255

par une basse intensité de bandes. Bien que la variation a été observée dans la densité ou

la netteté de quelques bandes. Ceci indique que, les protéines solubles dans le sel,

comme les globulines, devraient être utilisées pour étudier la relation des graines et leur

origine environnementale.

La matrice de similitude et de distance basée sur le coefficient de Jaccard ont été

présentées dans le tableau 7.1 et tableau 7.2. La similitude la plus élevée et la distance

génétique minimale ont appartenu pour chaque intra groupes avec le coefficient de

similitude 1. La similitude la plus basse et la distance génétique la plus élevée ont été

observé entre le premier groupe et le troisième groupe avec le coefficient de similitude

0.867. Ils sont les populations éloignées et les plus proches de la grande Sebkha d’Oran

respectivement. Ces deux derniers groupes ont la similitude importante avec le groupe

de référence avec une distance génétique modérée et de coefficient de similitude 0.933

et 0.929 respectivement.

Figure 7.3 : UPGMA dendrogram a basé sur la matrice binaire de graine les

bandes de protéine solubles de sel de populations M.ciliaris


102

Tableau 7.1 : Matrice de similitude calculée avec coefficient Jaccard pour les protéines

solubles dans le sel des graines des populations étudiées.

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

P1 1 1.000 0.929 0.867 0.867 0.867 1.000 0.929 0.929 0.929 0.929

P2 1 0.929 0.867 0.867 0.867 1.000 0.929 0.929 0.929 0.929

P3 1 0.933 0.933 0.933 0.929 1.000 1.000 1.000 1.000

P4 1 1.000 1.000 0.867 0.933 0.933 0.933 0.933

P5 1 1.000 0.867 0.933 0.933 0.933 0.933

P6 1 0.867 0.933 0.933 0.933 0.933

P7 1 0.929 0.929 0.929 0.929

P8 1 1.000 1.000 1.000

P9 1 1.000 1.000

P10 1 1.000

P11 1

Tableau 7.2 : Matrice de distance basée sur coefficient Jaccard.

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11

P1 0 0.000 0.071 0.133 0.133 0.133 0.000 0.071 0.071 0.071 0.071

P2 0 0.071 0.133 0.133 0.133 0.000 0.071 0.071 0.071 0.071

P3 0 0.067 0.067 0.067 0.071 0.000 0.000 0.000 0.000

P4 0 0.000 0.000 0.133 0.067 0.067 0.067 0.067

P5 0 0.000 0.133 0.067 0.067 0.067 0.067

P6 0 0.133 0.067 0.067 0.067 0.067

P7 0 0.071 0.071 0.071 0.071

P8 0 0.000 0.000 0.000

P9 0 0.000 0.000

P10 0 0.000

P11 0


103

A travers ces résultats, on a conclu que le matériel prospecté près et loin de la

grande Sebkha d’Oran expose une diversité génétique modérée révélé par une SDS-

PAGE unidimensionnelle. Donc l’utilisation de l'électrophorèse 2-D est nécessaire pour

séparer les diverses parties du gel. Cette dernière technique a déjà été utilisée par Li et

al., (1998) et ils ont rapporté leur utilité. Ces techniques peuvent être appliquées aux

études de protéines de réserve dans d'autres graines aussi bien que des protéines de

réserve de non-graine. Krochko et Bewley (1998) a utilisé l'électrophorèse

bidimensionnelle pour déterminer la composition de fractions de protéine de réserve de

graine dans la luzerne. Ils ont constaté que les protéines de réserve de graine majeures

dans la luzerne sont des medicagin (legumin-like globulin), des alfin (une vicilin-like

globulin) et une famille de poids moléculaire inférieur (des albumines). Ils comprennent

30 %, 10% et 20% respectivement.

En général, les profils des protéines de réserve de graine basés sur la SDS-PAGE

peuvent être employés pour des buts divers comme l'identification variétale, l'analyse

bio systématique, la détermination de relation phylogénétique entre les différentes

espèces, produisant des informations pertinentes pour compléter l'évaluation et le

transfert des données (Sammour, 1991). Nos résultats ont corroboré ces objectifs parce

qu’on a constaté que les fractions de protéine de graine sont l'outil puissant pour

identifier les populations adaptées aux bords de Sebkha et on peut utiliser cette

substantielle fraction protéique comme des marqueurs génétiques ou bien des

révélateurs de polymorphisme.

En outre, les protéines de graine sont principalement des protéines de réserve et

ne sont pas probables pour être changé dans la graine mûre sèche; leur composition est

fortement stable et peuvent être affectée seulement légèrement par des conditions

environnementales ou des fluctuations saisonnières (Ladizinsky et hymowitz, 1979).

Précédemment, de nombreuses études de la dernière décennie ont montré que des

changements intrinsèques à la plante comme des réarrangements chromosomiques ou

même le doublement de nombres de chromosome n'a pas, ou très petit effet sur le profil

de protéine de la graine.

Les protéines de réserve de graine sont codées par une petite fraction des gènes

exprimés dans les graines et leur expression est réglée à des niveaux transcriptionnels,

post-transcriptionnels, traductionnel et post--traductionnel (Mehrotra et al., 2009). Une

connaissance précise de gènes de protéine de graine, leurs mécanismes régulateurs et les


104

approches de la protéomique peuvent nous aider à résoudre une partie de relation entre

les protéines solubles dans le sel des graines et l'adaptation aux conditions salines.

Pour cette raison, on a effectué plusieurs SDS-PAGE unidimensionnelles avec des

extraits individuels (Figure 7.4). On constate que les profils d’électrophorèses des

extraits individuels pour chaque population sont similaires. Les individus appartiennent

à la population P4 présentent une bandes en plus que les individus de la population P1,

ceux qui permettent de confirmer les résultats précédents. Les globulines séparées par

SDS-PAGE avec la grande cuve d’électrophorèse, différent par le nombre et l’intensité

des bandes entre ces deux populations qui appartiennent à des groupes différents. Ces

résultats peuvent constituer un bon moyen d’identification lors de prospection ou

d’évaluation de matériel végétal.

MW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 WM 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

C

I

A

Figure 7.4 : SDS-PAGE des protéines solubles dans le sel des graines de

populations P1 et P4 avec: MW, Marqueur de poids moléculaire et les trois

zones de migration: C, zone cathodique; moi, zone intermédiaire; A, zone

anodique.

Les 1, 2,3…12 des individus de la population P1.

Les 13, 14…24 des individus de la population P4.


105

7.4. Conclusion

Cette étude démontrée que les populations prélevées aux bords de la Grande

Sebkha d’Oran semblent exprimer un niveau plus haut de production de protéine que

des populations éloignées par plus d'expression des protéines solubles dans sel.

On peut conclure que l'hybridation entre des populations des deux groupes est

suggérée d'être conduite avec l'espérance que la bande de 80 kDa et d'autres bandes

mineures pourraient être liés avec l'adaptation de au stress salin. Ceci aiderait dans la

planification d'expériences pour les marqueurs assistés à l’hybridation des populations

de M.ciliaris. Les résultats obtenus permettent aussi de diriger le choix des sites de

collections pour l'avenir des prospections et le choix de parents selon les objectifs fixes

(le croisement, la sélection, des candidats gènes …etc.).

Conclusion générale

106

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

La conséquence générale de la présence du sel dans les sols par l'utilisation de

l'eau salée dans l'agriculture ou l’utilisation intensive de certains types d’engrais sont

deux phénomènes qui limitent la croissance de certaines plantes glycophytes comme le

médic annuel et qui provoquent par la suite une baisse de rendement. Les mécanismes

de réponse aux stress, font intervenir un certain nombre de réactions au sein de ce

processus physiologique. En général chez les plantes, des différentes étapes

correspondent à la perception et la reconnaissance du stress, la transduction du signal

qui en résulte à l’intérieur de la cellule, l’amplification de ce signal, la modification de

l’expression de certains gènes et la production de molécules impliquées dans le

rétablissement de l’homéostasie cellulaire. La chlorophylle, les molécules de

l’osmorégulation et les enzymes impliquées dans cette cascade de réactions peuvent être

considérées comme des marqueurs de la réponse au stress salin.

L’essentiel de cette recherche a porté sur l'étude des possibilités existantes pour

améliorer la tolérance de ces plants qui ont un intérêt dans la fertilité des sols dégradés.

Pour autant que cet effort de recherche doive être encore poursuivi, la recherche de

marqueurs génétiques liés à la tolérance des plantes au stress salin constitue une bonne

alternative. Des résultats notables ont déjà été atteints, en particulier l'identification des

espèces de M. ciliaris tolérantes. Le choix de site pour faire les prospections est très

important dans cette recherche car il nous a fourni la population d’étude et la possibilité

de trouver une variabilité génétique inter ou intra population vis-à-vis de la tolérance à

la salinité.

Notre travail de recherche a porté sur la recherche de ces marqueurs chez les

espèces de M.ciliaris en ciblant le stade de germination. Car à ce stade la graine c’est

telle qui permet de définir l’avenir plant aux conditions environnementales.

Cette approche a permis d’obtenir beaucoup d’informations sur la germination de la

plante en condition de stress salin induit par l’application de différentes doses de NaCl.

De plus une telle stratégie était employée avec succès dans plusieurs travaux. La

comparaison entre la réponse de chaque espèce en absence et en présence du sel nous a

permis de constater que les différences enregistrées sont d’origines génétiques ; même

s’il existe des similitudes de comportement, chaque espèce possède ces propres

caractères dans certaines étapes des mécanismes de la réponse au stress. Par conséquent,

Conclusion générale

107

ces observations valident le choix de ces espèces pour la réhabilitation des milieux

pastorales salins comme les terres proches au Sebkha et Schott...

Nous avons supposé que la germination des graines de ces espèces vers la mobilisation

de leurs réserves qui sont dans la grande majorité de protéines pour assurer le meilleur

métabolisme et la synthèse de molécules nécessaires qui conduit la graine à se germer

afin de répondre aux conditions du stress salin. Sachant que ces protéines sont à la

majorité des globulines qu’elles ont un rôle très important dans l’imbibition. On s’est

basé sur ce point pour étudier ces espèces à ce stade de développement.

Enfin, la recherche des marqueurs globulines liés à la tolérance à la salinité peut être

exploitée dans la sélection de nouvelles lignées tolérantes au stress salin. En repérant

ces marqueurs de tolérance, il est possible de remonter au niveau des gènes

correspondant afin de localiser les zones du génome impliquées dans la variation de ce

caractère de tolérance au stress salin et de rechercher les QTLs en question.

Perspectives

Bien que ce travail a tenté d’évaluer la tolérance de quelques populations locales

de M.ciliaris vis-à-vis du stress salin, en se basant sur des critères physiologiques et

biochimiques au stade de germination, rendant compte de l’aptitude des populations

étudiées à supporter le sel et sur la base de quelques critères physiologiques dans des

conditions semi -contrôlées, plusieurs autres questions restent encore posées et

nécessitent d’être approfondies à savoir:

-l’étude de ces paramètres en fonction de stade de germination et l’état physiologique de

la graine afin de déterminer le stade le plus sensible et celui à partir duquel le sel n’a

plus d’effet sur la germination.

-L’identification des protéines de réserve et les gènes contrôlant autre que la proline et

les sucres solubles, car il est connu que, l’ajustement osmotique est l’un des plus

efficaces mécanismes utilisés par les plantes, en conditions de stress salin.

-L’approfondissement de l’étude de l’action des sels sur les microstructures et

l’ultrastructure de l’axe embryonnaire et les cotylédons en relation avec la teneur en

protéines de réserve, telles que l’intégrité des membranes cytoplasmiques et celles des

chloroplastes dans leur capacité dynamique d’adaptation;

-Ainsi qu’une étude génétique et protéomique pour identifier les gènes candidat les,

QTL et les PQls responsables de la tolérance à la salinité.

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ANNEXES

Annexes

Annexe1:

CARTE1 : végétale du bassin de la grande sebkha d’Oran (Moussa, 2014).

CARTE 2: Vegetation map of the area Bredeah – Bou Tlelis – Missergin (Moussa,

2014)

Annexes

Annexe1:(suite)

Planche I: Géomorphologie-couverture végétale (Moussa, 2012, modifié)

Annexes

Annexe1:(suite)

Planche II: Zone végétale actuelle à la périphérie de la Grande Sebkha d’Oran avec

l’échantillonnage des gousses de M.ciliaris.

Photo .1 : Paysage Est –Ouest de la Sebkha coté Brédéah dont S ; Sebkha, B ;

Bordure

Photo.2 : Paysage Ouest– Est de la Sebkha détail des bordures de la

photo.1dont S ; Sebkha et B’ ; Bordure B en détail qui représente la zone

végétale à la périphérie de la Sebkha

Photo.3 et Photo.4 : Echantillonnages des M.Ciliaris aux bordures de la

Sebkha.

Ouest

2

S

S

1

Ouest Est

Est

4 3

B

B’

Annexes

Annexe 2:Protocol d’electrophorèse SDS- PAGE des protéines

totales à partir des graines de M.ciliaris

1- Prépartion des tampons d’extraction des protéines totales pour 50 ml ( pH= 6,8)

Tris ……………………………………………0,4g

Glycérol……………………………………….5 ml

Β-Mercatoehanol………………………………2,5 ml

SDS……………………………………………1g

Qsp H2O……………………………………….50 ml

2- Préparation des gels d’électrophorèse

Selon le Protocole de laboratoire d'enseignement bio 6031 méthodologie biochimique bia3020

Université du Québec à Montréal Département des sciences biologiques (2013) professeurs:

Normand chevrier François dragon Mario et Houde françois ouellet pp : 1-30.

Annexes

3- Prépartion du tampon cuve (tampon de migration) : On prépare 100 ml le tampon tris-

glycine à pH= 8, 3 constitue de :

Tris …………………………………………….3, 28 g

Glycine…………………………………………14,425g

SDS……………………………………………...1 g

Qsp H2O……………………………………….100 ml

Puis faire une dilution de 10 fois pour ce tanpon.

NB : on fait la dilution selon la capacité de la cuve d’électrophorèse utilisée.

4- Révélation

La révélation se fait pendant une nuit dans un tampon de coloration constitue de :

Methanol……………………………………..50 ml

Acide acétique………………………………..40 ml

H2O bidistillée………………………………..10 ml

Bleu de coumassie R………………………….0, 1 %

Puis on réalise une décoloration pendant 30 minutes avec un tampon composé de :

Methanol……………………………………….40 ml

Acide acétique………………………………….10 ml

H2O bidistillée…………………………………..50 ml

En fin les gels sont plongés dans une solution de fixation constituée de :

Methanol……………………………………….50 ml

Acide acétique………………………………….10 ml

H2O bidistillée…………………………………..40 ml

Composition du milieu Knop (source : http://www.ac-versailles.fr).

Eléments Forme chimique Quantité dans un litre

Nitrate de calcium Ca(NO3)2…………………………………………… 0,25g

- Nitrate de Potassium KNO3………………………………………………..0,25g

- Sulfate de magnésium MgSO4……………………………….....................0,25g

- Phosphate mono potassique ou dihydrogénphosphate KH2 PO4.............………0,25g

-Sulfate de fer FeSO4 …………………………………………... .0,001g

- L’eau distillée H2O D .........................................................................1L

Annexes

Annexe 3:

L’éclairement E : une surface S placée à une distance d donnée de la source reçoit u

éclairement E. C’est le flux reçu par unité de surface éclairée. Il s’exprime en Lux (lx).

Annexes

Annexe 4:

Illustrations distinguant les 83 espèces décrites par Small et Jomphe (1989).

Annexes

Annexe 5:

Masses moléculaires de globulines de réserve de graines purifiées à partir de diverses

espèces obtenues par chromatographie par filtration sur gel (Marcone et al., 1998)

Annexes

Annexe 5 suite:

Une comparaison de la composition d'acides aminés de diverses globulines de stockage de graines purifiées à partir de plantes dicotylédones et

monocotylédones (Marcone et al., 1998)

Annexes

Annexes

Annexe 6: Analyse d’eau Sebkha coté sud de Bredeah (source SEOR, 2012)

Résumé

Le présent travail a porté sur un total de 11 populations dont quatre sont des références et des sept

populations prospectées proche et loin de la grande Sebkha d’Oran.Les résultats obtenus permettent de

grouper les populations en deux taxa M.ciliaris et M.intertexta génétiquement très proches. Les populations

P1, P2 et P7 appartiennent au taxon M. intertaxta et P3, P4, P5 et P6 appartiennent au taxon M.ciliaris. Les

résultats de l’étude porteée sur la réponse des plantules de 11 populations de Medicago annuel, P1,P2,

P3P,P4,P5,P6,P7,P8,P9,P10 et P11 au stress salin, mettent en relief l’effet négatif de la salinité sur le taux de

la germination et indiquent la sensibilité de M.intertexa comparativement à M.ciliaris. Le stress salin réduit

significativement la longueur des racines et des tiges des deux taxa. Les populations appartenant à

M.intertexta accusent une plus grande réduction de la longueur des deux caractères que M. ciliaris. La

réduction au niveau de la biomasse aérienne est plus importante que la réduction de la biomasse racinaire.

Sous stress salin de 136,7 mM, les populations proches de la sebkha enregistrent les meilleures valeurs des

ITs pour le poids frais racinaire. L’indice de tolérance ITs confirme l’existence de la variabilité génétique de

la tolérance inter taxa et intra pour la longueur et le poids frais racinaire. Les résultats de l’expression des

protéines de réserve des graines solubles dans le sel comme les globulines par SDS-PAGE montrent la

présence d’une bande de 80 kD spécifique au groupe de populations proches de la Sebkha. Cette information

peut être utile pour la sélection du matériel végétal dans les programmes d’amélioration des légumineuses en

milieu perturbé par une contrainte saline.

Mots-clés:

Medicago annuel; Stress salin; Tolérance; Protéines de réserve des graines; Germination; Analyse

biométrique; Protéines solubles dans le sel; Globulines; Marqueurs SDS-PAGE; Sebkha.

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THESE DE DOCTORAT - univ-oran1.dz