THÈSE - thesesupsthesesups.ups-tlse.fr/510/1/Rey_Laurie.pdfLE MECANISME DE REPLICATION DE L’ADN ... L’HOMOLOGUE DE DINB CHEZ E. COLI..... 94 a- Description du gène et de la protéine

TTHHÈÈSSEE

En vue de l'obtention du

DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE

Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Cancérologie

JURY

Agnès CORDONNIER Chargé de Recherche, ESBS, Illkirch Rapporteur Filippo ROSSELLI Directeur de Recherche, IGR, Villejuif Rapporteur Philippe PASERO Directeur de Recherche, IGH, Montpellier Examinateur Bernard DUCOMMUN Professeur de l'Université de Toulouse Président Jean-Sébastien HOFFMANN Directeur de Recherche, IPBS, Toulouse Directeur de thèse

Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies de Toulouse Unité de recherche : Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale,

Equipe "Instabilité Génétique et cancer", UMR5089 CNRS/UPS Directeur(s) de Thèse : Jean-Sébastien Hoffmann

Co-directrice de Thèse : Nadine Puget Rapporteurs : Agnès Cordonnier, Filippo Rosselli

Présentée et soutenue par Laurie REY Le 19 Juin 2009

Titre :

L'ADN Polymérase eta humaine est requise pour la stabilité des séquences particulières de l'ADN en absence de stress exogène : rôle dans la réplication et/ou dans la réparation par

recombinaison homologue ?

1

Je voudrais tout d’abord remercier le Dr. Agnès Cordonnier et le Dr. Filippo Rosselli

pour avoir accepté de juger mon travail de thèse. Je voudrais aussi remercier sincèrement le

Dr. Philippe Pasero et le Pr. Bernard Ducommun pour avoir accepté de siéger à mon jury de

thèse. Je remercie particulièrement Philippe pour ses conseils (et ceux d’Hélène Tourrière) au

niveau des expériences de ChIP. Je vous remercie pour les discussions enrichissantes que

nous avons pu avoir lors de ma soutenance de thèse.

Je voudrais ensuite remercier les personnes qui se sont succédées à la direction de ma

thèse. Tout d’abord, Nadine merci de m’avoir fait confiance, d’avoir initié ce projet et de

m’avoir suivi au cours de la première année. Christophe et Jean-Sébastien, merci de m’avoir

laissé autant d’autonomie, de m’avoir considérée plus comme un chercheur que comme une

étudiante et surtout merci de m’avoir donné l’opportunité de partir en congrès international

toute seule. C’était pour moi une expérience très riche et qui m’a beaucoup apporté aussi bien

pour la suite de ma thèse que pour la suite de ma carrière.

Un grand merci à toute l’équipe IGC : merci Marie et Anne pour avoir répondu à

toutes mes questions scientifiques et de vie pratique du laboratoire, merci Valérie de

reprendre le sujet et de faire vivre ce que je n’ai pas eu le temps de finir, merci Eddy de

m’avoir supportée dans le bureau avec mes moments de détresse face à un ordinateur parfois

incompréhensible, merci Anne de redonner un peu de vie au labo que j’ai (un peu) déserté

pendant la rédaction. Merci Fanny, on a su se serrer les coudes aussi bien pour les manips,

pour les coups durs, mais aussi lors de la rédaction… Bonne chance pour la suite !

Je voudrais aussi dire un grand merci aux personnes qui ont quitté l’équipe : Dennis,

François et Yvan pour avoir continué à m’aider et à me soutenir dans les moments difficiles.

Un grand merci à Oriane : je suis déçue que le « destin » nous ait séparées, j’aurais vraiment

aimé travailler avec toi, cela aurait été très stimulant. Mais je suis sûre que l’avenir va te

sourire car tu le mérites vraiment ! Continues de te battre et surtout restes positive.

Cette thèse m’a amenée à travailler dans le laboratoire dirigé par Martine Yerle à

l’INRA d’Auzeville. Je voudrais particulièrement remercier Martine pour m’avoir autorisée à

faire des manips dans son laboratoire et à Florence Mompart pour son aide et tous ses

conseils. J’ai réussi à mettre en place la manip de FISH à l’IPBS mais sans vos compétences

la tâche aurait été beaucoup plus difficile. Par la suite, j’ai aussi eu la chance de travailler en

collaboration avec Julia Sidorova et Raymond Monnat de l’université de Washington à

Seattle. Les conseils inépuisables de Julia aussi bien techniques que scientifiques et l’aide de

2

Raymond Monnat en terme de réflexion sur l’article m’ont permis d’envisager mes résultats

sous un autre angle. Je vous en suis très reconnaissante. Je remercie aussi Denis Biard,

Patricia Kannouche et Karen Vasquez pour leur contribution au cours de ma thèse.

Je voudrais aussi dire un grand merci à mes amis : Amandine, Céline et Claire pour

m’avoir sorti de ma thèse de temps en temps, pour m’avoir permis de passer de bonnes

soirées, pour m’avoir remonté le moral quand ça n’allait pas et tout simplement pour votre

présence. Merci aussi à Aline, Fanny, Marielle et Sébastien pour avoir supporté mes plaintes !

Un merci tout spécial à Claude pour tes innombrables conseils, pour ton aide dans mes

moments de doute au cours de ma thèse, pour ton écoute et ton soutien, mais aussi merci de

croire en moi.

Un merci tout particulier à François : sans toi, je ne sais pas si je serais encore dans le

monde de la recherche, sans ta passion communicative pour la science, je ne sais pas si

j’aurais pu continuer. Merci d’avoir rempli ma vie de bonheur, de m’avoir ouvert les yeux sur

tant de choses, de m’avoir permis de retrouver un tant soit peu ma confiance en moi et mon

équilibre, de m’avoir redonner envie de me battre pour ce que je crois juste et utile et merci

tout simplement pour ta présence au quotidien à mes côtés et pour m’avoir permis de

retrouver le calme de mon enfance à la campagne.

Je voudrais terminer en disant un grand merci à ma famille : tout particulièrement à

mes parents, Marie-Claude et Christian, sans qui je n’aurais jamais pu arriver à réaliser mon

rêve et à mon frère, Frédéric. Merci de m’avoir fait confiance, de m’avoir toujours laissée

faire mes propres choix sans parfois vraiment comprendre pourquoi, d’avoir cru en moi et tout

simplement pour votre amour et votre soutien au quotidien. Merci à mes grands parents

Paulette et René, pour votre amour et pour m’avoir permis de trouver toujours une porte

ouverte quand j’avais besoin de me ressourcer. J’ai enfin une pensée toute particulière pour

mes grands parents, Eliette et Edmond, et mon oncle, Benoit, qui sont décédés au cours de ma

thèse et je les remercie du fond du cœur de m’avoir montré à quel point le courage était

important dans la vie ! J’espère un jour arriver à comprendre pourquoi une maladie comme le

cancer peut être si injuste et si terrible et surtout comment chaque patient qui souffre peut être

soigné efficacement. J’espère que l’avenir me permettra d’y consacrer au moins une partie de

ma vie.

3

TABLE DES MATIERES

Table des matières

4

TABLE DES MATIERES …………………………………………………………………3

ABREVIATIONS …………………………………………………...………………………7

RESUME ……………………………………………………………………………………..9

INTRODUCTION…………………………………………………………………………....12

CHAPITRE I : LA REPLICATION DE L’ADN............................................................................................................................................. 16 A. IMPORTANCE D’UNE REPLICATION COMPLETE ET FIDELE .................................................................................................... 16

1. LE MECANISME DE REPLICATION DE L’ADN............................................................................................ 17 a- L’initiation ......................................................................................................................................... 17 b- L’élongation....................................................................................................................................... 18

2. LES ADN POLYMERASES REPLICATIVES.................................................................................................. 19 a- Pol α : l’ADN polymérase de l’initiation........................................................................................... 20 b- Pol δ et Pol ε : les ADN polymérases de l’élongation ....................................................................... 21

3. LES POINTS DE CONTROLE DU CYCLE CELLULAIRE .................................................................................. 22 a- ATR et Chk1 signalent les fourches de réplication bloquées ............................................................. 22 b- ATM et Chk2 signalent les cassures de l’ADN................................................................................... 25

B. OBSTACLES RENCONTRES LORS DE LA REPLICATION DE L’ADN.......................................................................................... 27 1. LES LESIONS EXOGENES DE L’ADN......................................................................................................... 28 2. LES LESIONS ENDOGENES DE L’ADN DUES AU METABOLISME CELLULAIRE ............................................ 29 3. LES OBSTACLES NATURELS DE LA REPLICATION DE L’ADN .................................................................... 30

a- Les collisions transcription/réplication ............................................................................................. 30 b- Les structures secondaires de l’ADN................................................................................................. 31

4. LES SITES FRAGILES, REGIONS DU GENOME DIFFICILES A REPLIQUER....................................................... 34 a- Les SFC sont instables en culture et dans les cellules cancéreuses................................................... 36 b- Les SFC sont répliqués tardivement .................................................................................................. 36 c- L’origine de l’instabilité au niveau des SFC ..................................................................................... 37 d- Les protéines des points de contrôle régulent l’expression des SFC ................................................. 38 e- Les mécanismes de réparation de l’ADN impliqués aux SFC............................................................ 40

C. REPONSES AUX BLOCAGES DE FOURCHES DE REPLICATION.................................................................................................. 42 1. LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE DE L’ADN ......................................................................................... 42

a- Un pré-requis pour la HR : la dégradation de l’extrémité 5’ ............................................................ 43 b- La formation d’une D-loop et l’échange de brin ............................................................................... 46 c- Les mécanismes de HR avec et sans cross-over................................................................................. 48 i) Hybridation de brin dépendante de la synthèse (SDSA) ..................................................................... 50 ii) Réparation des cassures double-brin (DSBR).................................................................................... 50 iii) Le mécanisme BIR (Break-induced replication) ............................................................................... 51 iv) L’appariement simple-brin d’ADN (SSA).......................................................................................... 53 v) Le mécanisme de « damage avoidance » ou de « template switching » (TS) ..................................... 54

2. LA SYNTHESE TRANSLESIONNELLE.......................................................................................................... 55 a- Les ADN polymérases translésionnelles de la famille Y .................................................................... 55 b- Le changement d’ADN polymérase lors de la TLS ............................................................................ 57 i) La poly-ubiquitination de PCNA et le « Template switching » ........................................................... 59 ii) La mono-ubiquitination de PCNA...................................................................................................... 60 iii) Le contrôle de la mono-ubiquitination de PCNA.............................................................................. 61 iv) Changement d’une ADN polymérase pour la TLS ............................................................................ 66 c- Le rôle important de Rev1 lors de la TLS au cours de la réplication ................................................ 69 d- Le choix des ADN polymérases.......................................................................................................... 70

CHAPITRE II : LES ADN POLYMERASES TRANSLESIONNELLES ET LES ADN HELICASES SPECIALISEES..................... 72 A. LES ADN POLYMERASES TRANSLESIONNELLES DE LA FAMILLE Y ...................................................................................... 72

1. REV1 : LA PROTEINE PLATE-FORME ........................................................................................................ 72 a- Description du gène et de la protéine ................................................................................................ 72 b- Son activité déoxycytidyl-transferase au travers de nombreuses lésions........................................... 73

Table des matières

5

c- Ses partenaires, rôles particuliers des domaines BRCT et PBM ....................................................... 74 2. POL η : LA PROTEINE DEFICIENTE DANS LE SYNDROME DU XERODERMA PIGMENTOSUM VARIANT ............. 76

a- Description du gène et de la protéine ................................................................................................ 76 b- Son rôle majeur dans la TLS des adduits UV..................................................................................... 78 c- Son rôle potentiel dans la TLS des pontages de l’ADN ..................................................................... 81 d- Son rôle controversé dans la recombinaison homologue................................................................... 83 e- Son rôle dans l’hypermutation somatique dans les cellules B ........................................................... 86

3. POL ι : LE PARALOGUE DE POL η ............................................................................................................. 88 a- Le rôle de Pol ι au niveau des dommages oxydatifs de l’ADN .......................................................... 89 b- Le rôle de Pol ι en hypoxie ................................................................................................................ 91 c- Le rôle de Pol ι au niveau des lésions de l’ADN induites par les UV................................................ 92 d- Les protéines partenaires de Pol ι .................................................................................................... 93

4. POL κ : L’HOMOLOGUE DE DINB CHEZ E. COLI ........................................................................................ 94 a- Description du gène et de la protéine ................................................................................................ 94 b- Son rôle établi dans la TLS ................................................................................................................ 96 c- Son rôle dans le mécanisme de réparation par excision de nucléotide.............................................. 98 d- Son rôle dans le point de contrôle de phase S.................................................................................... 99 e- Les conséquences de sa dérégulation sur l’instabilité génétique..................................................... 100

B. DES ADN HELICASES SPECIALISEES................................................................................................................................................. 102 1. LES ADN HELICASES DE LA FAMILLE RECQ : BLM ET WRN................................................................ 103

a- Les syndromes d’instabilité génétique associés à l’absence de ces ADN hélicases......................... 103 b- Leurs rôles au niveau de la recombinaison homologue de l’ADN................................................... 104 c- Leurs rôles dans le déroulement des structures G-quadruplex........................................................ 106

2. L’ADN HELICASE BACH1, IMPLIQUEE DANS L’ANEMIE DE FANCONI .................................................. 108 a- L’Anémie de Fanconi ....................................................................................................................... 108 b- Le rôle de BACH1 dans le déroulement des structures G-quadruplex ............................................ 112

CHAPITRE III : PROBLEMATIQUES POSEES ........................................................................................................................................ 115

RESULTATS……………………………………………………………………….…......118

A. ROLE DES ADN POLYMERASES TLS SUR LES ADN NON-B ........................................................................................................ 119 1. UTILISATION DE SHRNA EPISOMAUX POUR DIMINUER LE NIVEAU D’EXPRESSION DE POL η ................. 119

a- L’interférence ARN et les shRNA épisomaux................................................................................... 119 b- Validation des clones shRNA et des siRNA utilisés en termes d’extinction ..................................... 121 c- Analyse fonctionnelle des clones shRNA et conséquences des siRNA.............................................. 123

2. IDENTIFICATION D’UN NOUVEAU ROLE POUR LES ADN POLYMERASES DE LA FAMILLE Y..................... 126 a- La télomestatine : un agent stabilisant les G-quadruplex................................................................ 126 b- Différentes lignées cellulaires contenant des séquences particulières de l’ADN ............................ 126 c- Article I : “Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells” ............................................................................................................... 127

3. PERSPECTIVES ET RESULTATS PRELIMINAIRES CONCERNANT LE ROLE DE POL η SUR L’ADN NON-B.... 138 a- Analyse du recrutement spécifique de Pol η sur les G4 par ChIP on chip ...................................... 138 b- Recherche des partenaires de Pol η au niveau de l’ADN non-B par fractionnement cellulaire ..... 140

4. DISCUSSION ET PERSPECTIVES DES RESULTATS PUBLIES DANS L’ARTICLE I........................................... 141 a- Pourquoi Pol κ est-elle impliquée indépendamment de la séquence particulière d’ADN étudiée ? 143 b- Existe-t-il une coopération fonctionnelle entre ADN polymérases et ADN hélicases spécialisées ?144 c- Peut-on envisager un rôle de Pol η au niveau des télomères ? ....................................................... 145

B. IDENTIFICATION D’UN NOUVEAU ROLE POUR POL η DANS LE MAINTIEN DE LA STABILITE DU GENOME......... 147 1. MISE EN EVIDENCE D’UN DEFAUT DE PROLIFERATION DANS LES CELLULES DEFICIENTES EN POL η ..... 147 2. OBSERVATION D’UNE AUGMENTATION D’INSTABILITE GENOMIQUE EN ABSENCE DE POL η .................. 148 3. DEMONSTRATION D’UNE PERTURBATION DE LA PHASE S EN ABSENCE DE POL η .................................. 151 4. ARTICLE II : “HUMAN DNA POLYMERASE ETA IS REQUIRED FOR COMMON FRAGILE SITE STABILITY DURING UNPERTURBED DNA REPLICATION”................................................................................................... 153 5. DISCUSSION DES RESULTATS PUBLIES DANS L’ARTICLE II ..................................................................... 167

a- Quel est précisément le rôle de Pol η lors de la réplication des SFC ?........................................... 167 b- Existe-t-il un rôle de Pol η au niveau des séquences répétées ?...................................................... 168

Table des matières

6

C. ETUDE DU ROLE DE POL η DANS LA HR DE L’ADN...................................................................................................................... 171 1. ANALYSE D’UN MUTANT CATALYTIQUEMENT INACTIF DE POL η .......................................................... 171

a- Validation biochimique du mutant Pol η Dead................................................................................ 171 b- Localisation nucléaire de la protéine mutée Pol η Dead................................................................. 172 c- Co-localisation de Pol η Dead avec des protéines de la HR........................................................... 172

2. AUGMENTATION DE L’EXPRESSION DES PROTEINES DE LA HR DANS LES CELLULES XP-V..................... 175 3. ETUDE DE LA HR DANS DEUX MODELES CELLULAIRES DIFFERENTS ...................................................... 177

a- Analyse des évènements de conversion génique dans les cellules U2OS......................................... 177 b- Analyse des évènements de conversion génique dans les cellules XP-V.......................................... 181

4. DISCUSSION DES RESULTATS PRELIMINAIRES OBTENUS......................................................................... 183 a- Etude des échanges entre chromatides sœurs .................................................................................. 184 b- Existe-t-il différents complexes impliquant Pol η WT et Pol η Dead ? ........................................... 184 c- Quel serait le rôle de Pol η dans le redémarrage des fourches de réplication bloquées ?.............. 184

DISCUSSION GENERALE………………………………………………………….......188

A. UN NOUVEAU ROLE INATTENDU POUR POL η .............................................................................................................................. 189 1. RECRUTEMENT DE POL η AU NIVEAU DES SEQUENCES PARTICULIERES DE L’ADN................................ 190

a- La mono-ubiquitination de PCNA.................................................................................................... 190 b- L’interaction avec REV1.................................................................................................................. 190 c- L’interaction avec des ADN hélicases spécialisées ......................................................................... 191 d- Le recrutement par des protéines du point de contrôle de phase S.................................................. 191 e- Le recrutement par un facteur de chargement de PCNA ................................................................. 192

2. MODELE EXPLIQUANT LE ROLE DE POL η AU NIVEAU DES SEQUENCES PARTICULIERES DE L’ADN....... 193 3. EMERGENCE D’UN NOUVEAU CONCEPT ................................................................................................. 196

B. L’IMPACT DU NOUVEAU ROLE DE POL η SUR LA MALADIE DU XERODERMA PIGMENTOSUM VARIANT ................ 197 1. NOUVELLES ETUDES ENVISAGEES SUR LES CELLULES DE PATIENTS XP-V ............................................. 197 2. EXCES DE RECOMBINAISON HOMOLOGUE CHEZ LES PATIENTS XP-V ..................................................... 198

C. L’IMPACT DE LA DEREGULATION DE POL η AU NIVEAU DE LA PROGRESSION TUMORALE..................................... 199 1. LA REGULATION DE L’EXPRESSION DE POL η ........................................................................................ 199 2. L’EFFET DELETERE D’UN EXCES DE RECOMBINAISON HOMOLOGUE....................................................... 200

CONCLUSION GENERALE…………………………………………………………......202

REFERENCES……………………………………………………………………………205

ANNEXES DE MATERIEL ET METHODES………………………………………..243

ANNEXE 1 : DIFFERENTES SEQUENCES UTILISEES FORMANT DES STRUCTURES SECONDAIRES DE L’ADN................................................................................................................................................................................... 244

ANNEXE 2 : PROTOCOLE DE L’IMMUNO-PRÉCIPITATION DE CHROMATINE (CHIP) COUPLÉE À LA PCR QUANTITATIVE (Q-PCR) ................................................................................................................................................ 246

ANNEXE 3 : PROTOCOLE DE FRACTIONNEMENT CELLULAIRE ...................................................................... 249

ANNEXE 4 : PROTOCOLE D’ANALYSE DE LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE........................................... 250

ANNEXE 5 : TISSUE MICRO-ARRAY (TMA) ............................................................................................................... 251

7

ABREVIATIONS

Abréviations

8

AAF : N-2-Acetyl-Amino-Fluorène ADN(c) : Acide Désoxyribo-Nucléique (complémentaire) AF : Anémie de Fanconi AID : Activation-Induced deoxycytidine Deaminase ARN(m) : Acide Ribo-Nucléique (messager) ATM : Ataxia Telangiectasia mutated ATR : ATM Rad3-related ATRIP : ATR Interacting Protein BER : Base Excision Repair BIR : Break-Induced Replication BLM : hélicase Bloom BPDE : Benzo(a)Pyrène-Dihydrodiol-Epoxide BRCA1 : BReast CAncer 1 Chk1 : Checkpoint Kinase 1 Chk2 : Checkpoint Kinase 2 CDB : Cassure Double-Brin de l’ADN CG : Conversion Génique CGH array : Hybridation Génomique Comparative sur puce CisPt : Cisplatine CPD : Cyclobutane Pyrimidine Dimer CRE : Cyclic AMP Responsive Elements CSB : Cassure Simple-Brin de l’ADN Ctf18 : Chromosome Transmission Fidelity protein 18 dNTP : désoxy-ribonucléotides dRP-lyase : 5’-déoxyRibose Phosphate lyase DSBR : Double Strand Break Repair DUB : enzyme de déubiquitination EBV : Virus d’Epstein Barr E. coli : Escherichia coli ELG1 : Enhanced Level of Genome instability gene 1 FEN1 : Flap Endo-Nucléase I FISH : Fluorescence In Situ Hybridization GFP : Green Fluorescent Protein G4 : G-quartet, G-quadruplex HhH : motif boucle-hélice-boucle HIF-1 : Hypoxia-Inducible Factor 1 HLTF : Helicase Like Transcription Factor HR : Homologous Recombination HU : Hydroxyurée H2O2 : peroxyde d’hydrogène Ig : Immunoglobuline JH : Jonction de Holliday kDa : kilo Dalton kb : kilobases KO : Knock Out LOH : Loss Of Heterozygosity MAT : Mutation Associée à la Transcription MCM : Mini-Chromosome Maintenance MDC1 : Mediator DNA-Damage-Checkpoint protein 1 MMC : Mitomycine C MMR : MisMatch Repair MRN : Mre11-Rad50-Nbs1 NER : Nucleic Excision Repair NHEJ : Non Homologous End Joining NLS : Nuclear Localisation Signal

NSCLC : Non-Small Cell Lung Cancer ORC : Origin Recognition Complex PBM : Polymerase Binding Motif PCNA : Proliferating Cell Nuclear Antigen PCR : Polymerase Chain Reaction PIM : PCNA Interacting Motif Pol α : ADN Polymérase alpha Pol β : ADN Polymérase beta Pol δ : ADN Polymérase delta Pol ε : ADN Polymérase epsilon Pol η : ADN Polymérase eta Pol κ : ADN Polymérase kappa Pol λ : ADN Polymérase lamda Pol ι : ADN Polymérase iota Pol μ : ADN Polymérase mu Pol ν : ADN Polymérse nu Pol θ : ADN polymérase théta Pol ζ : ADN Polymérase zeta RAT : Recombinaison Associée à la Transcription RD : Répétitions Directes RFC : Replication Factor C RI : Répétitions Inversées RISC : RNA-Induced Silencing Complex RM : Répétitions en Miroir RPA : Replication Protein A ROS : Reactive Oxygen Species S. cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae S. pombe : Schizosaccharomyces pombe SB : Syndrome de Bloom SCE : Sister Chromatid Exchange SDSA : Synthesis-Dependant-Strand Annealing SFC : Site Fragile Commun SFR : Site Fragile Rare SHPRH : SNF2 Histone Linker PHD Ring Helicase siRNA : small interfering RNA shRNA : short hairpin RNA SP1 : Stimulating protein 1 SSA : Single Strand Annealing SV40 : Simian virus 40 SW : Syndrome de Werner TLS : Synthèse translésionnelle TOPBP1 : TOPoisomerase-Binding-Protein-1 TOPO : Topoisomérase TS : Template Switching UBM : Ubiquitin binding motif UBZ : Ubiquitin binding Zinc finger UNG : Uracil-N-Glycosylase USP1 : Ubiquitin Specif Protease 1 UTR : Unstranslated region UV : Ultra-Violet WRN : hélicase WRN XP(-V) : Xeroderma Pigmentosum (Variant) 6-4PP : 6-4 Pyrimidine-Pyrimidone 8-oxoG : O Oxo-Guanine 9-1-1 : coplexe Rad9-Rad1-Hus1

Remarque. Les protéines et les gènes humains seront écrits en majuscules alors que ceux de levure ou

de souris seront écrits en minuscules pour les distinguer des protéines ou gènes humains. Les gènes sont toujours écrits en italique.

9

RESUME

Résumé français

10

La réplication du génome eucaryote nécessite la coopération d’un grand nombre d’ADN polymérases. Les ADN polymérases réplicatives, fidèles, sont responsables de la majorité de la synthèse d’ADN mais sont ralenties ou bloquées par des lésions exogènes (par exemple les radiations UV) ou par des barrières naturelles de fourches de réplication telles que les structures secondaires de l’ADN. Le rôle des ADN polymérases translésionnelles a été clairement démontré dans le processus de synthèse translésionnelle des lésions exogènes. Ceci est notamment illustré dans le syndrome du Xeroderma pigmentosum Variant (XP-V) qui est dû à la perte de fonction de l’ADN polymérase eta (Pol η). En effet, Pol η permet la synthèse translésionnelle des dimères de thymines induits par les UV et en son absence, les individus sont prédisposés au cancer de la peau. Par contre, le rôle des ADN polymérases TLS dans le maintien de la stabilité du génome en absence de stress exogène n’a été que très peu exploré.

En 2002, il a été proposé dans le modèle C. elegans que l’homologue de Pol η chez le

nématode puisse maintenir les séquences riches en G susceptibles de former des structures G-quadruplex (G4), et ceci en coopération avec l’ADN hélicase Dog1 (BACH1). Afin d’analyser l’implication de Pol η au niveau des G4 dans les cellules humaines, nous avons construit des clones cellulaires exprimant deux séquences de shRNA indépendantes dirigées contre Pol η, ou son homologue Pol iota (Pol ι) ou l’ADN hélicase BACH1. Nous avons montré que l’absence de Pol η sensibilise ces cellules à la télomestatine, un composé stabilisant les G4. De plus, la déplétion de Pol η par siRNA augmente le pourcentage de cassures double-brin de l’ADN (CDB) dans des cellules présentant des copies multiples de séquences riches en G intégrées dans le génome. Une telle augmentation des CDB n’a pas été observée dans d’autres lignées cellulaires contenant différentes séquences particulières de l’ADN. Ces données suggèrent donc que Pol η pourrait intervenir spécifiquement au niveau des G4 dans les cellules humaines.

D’autre part, nous avons aussi démontré dans nos clones cellulaires que l’absence de

Pol η conduit à une augmentation de la fréquence des CDB entrainant l’activation du point de contrôle de phase G2/M. Nous avons aussi observé un retard de transition G2/M corrélé avec une diminution de la prolifération. En outre, nous avons observé une augmentation du nombre des cassures de chromatides en absence de Pol η dans trois lignées cellulaires indépendantes. De manière intéressante, l’expression du site fragile commun FRA7H est augmentée dans les cellules déplétées en Pol η, c’est-à-dire que les évènements de translocations, de délétions et d’amplifications sont plus fréquents. Nous avons aussi analysé la réplication de l’ADN en absence de Pol η, et avons observé que ces cellules présentaient plus fréquemment des foyers de réplication de début de phase S tandis que la vitesse de réplication globale de l’ADN mesurée par peignage moléculaire n’est pas modifiée. Des analyses d’hybridation in situ couplées à du peignage moléculaire de l’ADN sont en cours afin de déterminer si, en absence de Pol η, la vitesse de réplication de l’ADN est modifiée au niveau de FRA7H. De plus, l’activité catalytique de Pol η serait nécessaire pour maintenir une répartition normale des cellules en phase S. Aucun des phénotypes décrits ci-dessus ne sont présents dans les cellules déficientes en Pol ι, suggérant qu’ils sont spécifiques de Pol η.

L’ensemble de ces résultats révèlent un nouveau rôle de Pol η, outre son rôle

dans la TLS des lésions CPD induites par les UV, dans le maintien de la stabilité du génome au cours de la phase S non perturbée, qui l’implique notamment au niveau des sites fragiles communs. Le mécanisme impliqué, pouvant faire intervenir soit la recombinaison homologue, soit la réplication directe de l’ADN est en cours d’étude.

Résumé anglais

11

Replication of the eukaryotic genome requires the cooperation of a large number of DNA polymerases. The accurate replicative DNA polymerases are responsible for the majority of DNA synthesis but are slowed down or blocked when they encounter a DNA lesion induced by exogenous agents such as UV radiations or following endogenous causes such as secondary structures in DNA. Specialised DNA polymerases are then recruited to bypass these lesions by Translesion Synthesis, or are involved in later repair mechanisms. The importance of the ability of these specialised polymerases to maintain genomic stability is illustrated by the human disorder Xeroderma Pigmentosum Variant, which arises in consequence of mutations in DNA polymerase eta (Pol η). Pol η prevents skin cancer susceptibility by promoting accurate TLS past sunlight-induced cyclobutane pyrimidine dimers.

Despite the established requirement for Pol η in processing DNA damage, its role in maintaining genome stability in absence of external damage has not been extensively explored. In 2002, it has been proposed that Pol η could act in cooperation with the DNA helicase Dog1 (BACH1) to process particular G-rich sequences susceptible to form G-quadruplex (G4). In order to analyse a potential role of Pol η in G4 processing in human cells, we have constructed clonal derivates of the U2OS cell line that stably express two independent sequences of shRNA directed against Pol η, or its homologue Pol iota (Pol ι) or the DNA helicase BACH1. We have shown that Pol η depletion sensitises U2OS cells to treatment with the G4-stabilising compound telomestatin. Furthermore Pol η depletion increases the frequency of double-strand-breaks (DSBs) in HeLa cells containing multiple, chromosomally integrated copies of a G-rich and G4-prone sequence. Such an increase in DSB was not observed in cell lines containing transgenes consisting of other types of non-B DNA. These data suggest that Pol η could function to process the G4 structures in human cells.

On another hand, we have also demonstrated that shRNA-mediated depletion of Pol η leads to a delayed G2/M transition that is correlated with a decrease in proliferation. The frequency of DSB was increased in these U2OS cell clones and the G2/M DNA damage checkpoint was activated. We also observed an increase in spontaneous chromosomal abnormalities such as chromatid breaks in absence of Pol η in three human cell lines. Importantly, the absence of Pol η is able to induce expression of FRA7H common fragile site (increase of translocation, deletion and amplification events). We also analyzed global DNA replication in absence of Pol η. We found that Pol η-depleted cells contained predominantly early replication factories with fewer cells displaying late replication factories without any significant defect in DNA replication fork progression at the genome wide level, assessed by DNA combing experiments. However, if replication in Pol η depleted cells is only impaired at a subset of specific loci, our assay may not reveal it. We are currently analysing replication at FRA7H loci by combining FISH and DNA combing experiments. None of these phenotypes was observed in cells depleted for Pol ι suggesting that they are specific to Pol η. Moreover, we also have demonstrated that the DNA polymerization activity of Pol η is required to maintain normal replication foci pattern.

Together, these results reveal a new role of Pol η in maintaining genomic stability

during unperturbed S-phase and in preventing breakage at common fragile sites. They challenge the current concept of the unique involvement of Pol η in tolerance and repair pathways after external stress.

12

INTRODUCTION

Introduction

13

Le cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormale au

sein d'un tissu normal de l'organisme. Au cours de l'évolution de la maladie, certaines cellules

peuvent migrer de leur lieu de production et former des métastases qui constituent la cause

du décès dans la grande majorité des cas. Par conséquent, le dépistage du cancer doit être le

plus précoce possible.

En France, les cancers constituent la première cause de mortalité. Le nombre total des

décès par cancer était, en 2004, de 152 708, soit environ 241 décès pour 100 000 habitants.

Les 3 cancers les plus fréquents chez l’homme sont le cancer de la prostate, du poumon et du

colon et chez la femme, le cancer du sein, du colon et du poumon (données publiées par

l’Institut de veille sanitaire en février 2008).

Malgré les efforts de recherche effectués depuis de nombreuses années, le nombre de

cancers est toujours en augmentation. Les cancers du poumon, du sein, de l'ovaire, du

testicule, de la prostate et de la thyroïde ainsi que les tumeurs cérébrales sont en augmentation

très significative depuis les années 1980. En outre, de 1980 à 2005, le taux de cancers s'est

élevé de 35 % pour les hommes et de 43 % pour les femmes (Belot et al, 2008). L’exposition

aux cancérigènes de l'environnement (la pollution et les produits chimiques par exemple),

ainsi que les facteurs de risque tels que l’alimentation, le tabac et l’alcool sont considérés

comme les principales causes de développement des cancers.

La prolifération anarchique des cellules constitue la caractéristique principale des

stades précoces du développement tumoral. Afin d’éviter cette dérégulation, une cellule doit

maintenir son génome intact au cours des différentes divisions cellulaires. Pour ce faire, la

cellule dispose d’un mécanisme fidèle appelé la réplication de l’ADN. Cependant, de

nombreux agents externes, tels que les radiations ultraviolettes, ou des causes endogènes,

telles que les espèces oxygénées réactives, endommagent fortement l’ADN. La cellule a donc

développé divers mécanismes en réponse aux lésions de l’ADN : les mécanismes de

tolérance des lésions dont la synthèse translésionnelle et les mécanismes de réparation

des dommages.

Ce travail de thèse s’inscrit dans une perspective de recherche des mécanismes initiaux

conduisant au développement des cancers. L’équipe « Instabilité Génétique et Cancer » dans

laquelle j’ai effectué ce doctorat s’est intéressée aux ADN polymérases translésionnelles, des

Introduction

14

protéines impliquées dans la réplication des lésions et dans différents mécanismes de

réparation de l’ADN. Il est important de noter que ces ADN polymérases sont mutagènes

lorsqu’elles sont dérégulées ou mal utilisées. Il apparaît donc important que leur niveau

d’expression et leur activité soient fortement contrôlés. Dans notre équipe, nous avons pu

démontrer que l’ADN polymérase translésionnelle eta (Pol η) était sous-exprimée dans les

cancers colorectaux. Le rôle admis jusqu’à ce jour pour Pol η est son intervention fidèle

dans la synthèse translésionnelle des dimères de thymines, un dommage induit par les

radiations UV (Johnson et al, 2000b; Masutani et al, 2000). Pol η pourrait aussi être

impliquée dans la réparation des cassures de l’ADN par recombinaison homologue, mais ce

rôle reste encore à être analysé dans les cellules humaines (Kawamoto et al, 2005; McIlwraith

et al, 2005; McIlwraith & West, 2008). Déterminer plus précisément les rôles physiologiques

de Pol η était donc d’un intérêt majeur, notamment puisqu’aucune étude n’a été réalisée à ce

jour en absence de dommage exogène. Dans ce but, nous avons construit des clones

cellulaires stables déficients en Pol η, mimant ainsi la situation observée dans les cancers

colorectaux concernant Pol η. Via l’utilisation de ce modèle cellulaire, nous avons mis en

évidence un nouveau rôle de Pol η au cours de la phase S du cycle cellulaire, notamment

au niveau des sites fragiles communs et des G-quadruplex, deux types de séquences

difficiles à répliquer. Nous nous sommes aussi intéressés aux ADN hélicases et à la

coopération fonctionnelle pouvant exister entre ces protéines et les ADN polymérases

translésionnelles.

Avant de détailler plus précisément les résultats obtenus, différents thèmes seront

abordés au cours de cette introduction bibliographique qui seront importants pour la suite du

manuscrit. Nous allons donc voir dans une première partie, le mécanisme de la réplication

fidèle de l’ADN en insistant sur les ADN polymérases réplicatives et sur les points de

contrôle du cycle cellulaire. Le génome étant soumis aux stress exogènes ou endogènes, nous

aborderons, également, les différents types de lésions pouvant faire obstacle à la réplication de

l’ADN. Dans ce chapitre, nous détaillerons plus particulièrement les sites fragiles communs,

des séquences fragiles fréquemment impliquées dans des réarrangements chromosomiques

dans les tumeurs. Les cellules disposent de plusieurs mécanismes de réparation ou de

réplication des lésions de l’ADN afin de pallier à ces stress endogènes ou exogènes du

génome. Nous analyserons deux de ces mécanismes : la recombinaison homologue et la

synthèse translésionnelle, qui permettent notamment de redémarrer les fourches de réplication

Introduction

15

bloquées. Une deuxième partie sera consacrée aux différentes ADN polymérases de la famille

Y et à leurs fonctions dans les mécanismes de translésion et de rcombinaison homologue. Les

ADN polymérases spécialisées ne possèdent pas d’activité hélicase permettant de dérouler les

structures secondaires de l’ADN qui peuvent se former à divers endroits du génome. Par

conséquent, une coopération entre ADN polymérase et ADN hélicase semble donc nécessaire.

Ainsi, nous aborderons, également, le rôle de trois ADN hélicases (BLM, WRN, BACH1),

dont la perte de fonction est responsable de maladies génétiques rares, et qui pourraient agir

en coopération avec les ADN polymérases translésionnelles afin de dérouler les structures

secondaires de l’ADN. Enfin, nous concluerons cette introduction bibliographique en

identifiant les questions posées au cours de ce travail de doctorat.

Chapitre 1 A. Importance d’une réplication complète et fidèle

16

CHAPITRE I : LA REPLICATION DE L’ADN

A. Importance d’une réplication complète et fidèle

Le génome des organismes doit être copié de manière fidèle pour assurer un

transfert d’informations génétiques au cours des générations. Une machinerie cellulaire

complexe, impliquant plus de 200 polypeptides a évolué de manière à permettre cette

transmission. Cette machinerie réplicative comprend les protéines qui copient fidèlement

l’ADN telles que les ADN polymérases réplicatives et d’autres protéines qui assurent le

maintien de l’intégrité génomique (Fig 1). La réplication de l’ADN dans une cellule unique

doit être coordonnée avec les autres étapes du cycle cellulaire tels que la mitose mais aussi

avec la réplication de l’ADN dans les autres cellules du tissu. Cette régulation intervient

majoritairement au niveau de l’initiation de la réplication de l’ADN via des interactions avec

les mécanismes contrôlant la progression du cycle cellulaire (Waga & Stillman, 1998).

Le cycle cellulaire des eucaryotes supérieurs comprend quatre phases. Durant deux

d’entre elles, phase S et phase M, les cellules exécutent les deux événements fondamentaux

du cycle cellulaire à savoir la réplication de l’ADN (phase S, pour synthèse) et le partage

rigoureusement équivalent des chromosomes entre les 2 cellules filles (phase M, pour

mitose). Les deux autres phases du cycle cellulaire, G1 et G2, représentent des intervalles

(Gap) au cours desquels la cellule se prépare à effectuer correctement les deux étapes

fondamentales citées ci-dessus.

Figure 1. Modèle simplifié de la réplication eucaryote. Le complexe MCM2-7, le facteur de processivité PCNA et la protéine RPA ayant une forte affinité pour le simple-brin d’ADN sont représentés au niveau de la fourche de réplication mais de nombreuses autres protéines sont présentes, dont ORC, MCM10, Cdc6, Cdt1 et Cdc25. La division du travail entre les ADN polymérases réplicatives est présentée : Pol α synthétise l’amorce ARN-ADN, Pol δ synthétise le brin discontinu alors que Pol ε synthétise le brin continu. La maturation des fragments d’Okazaki implique l’endonucléase FEN1 ainsi que l’ADN ligase I. (Nick McElhinny et al, 2008)

MCM

Pol ε PCNA

FEN1

ADN ligase Pol δ

ARN

RPA


17

1. Le mécanisme de réplication de l’ADN

a- L’initiation

L’initiation de la réplication nécessite un grand nombre de facteurs. Les origines de

réplication sont tout d’abord reconnues par le complexe ORC (Origin Recognition Complex)

composé de six sous-unités distinctes. Cette étape est essentielle pour permettre le

recrutement des ADN hélicases MCM (Mini-Chromosome Maintenance) (pour revue,

(Aladjem, 2007)), et donc le déroulement de l’ADN au niveau des origines de réplication

(Bell & Stillman, 1992; Bell et al, 1993). Jusqu’en 2006, le mécanisme communément admis

faisait intervenir cinq sous-unités du complexe ORC pour la reconnaissance des origines de

réplication et pour la liaison du complexe in vitro (Lee & Bell, 1997). Cependant, il a été

démontré en 2006, chez la levure, que Orc6 était nécessaire pour l’initiation de la réplication

et pour le maintien des MCM au niveau de la chromatine (Semple et al, 2006). De plus, la

déplétion de cette protéine réduit l’efficacité d’activation des origines de réplication (Semple

et al, 2006).

Les protéines MCM ont tout d’abord été identifiées via des études génétiques chez la

levure comme des protéines requises pour la réplication de plasmides d’ADN contenant des

origines de réplication cellulaire (pour revue, (Kelly & Brown, 2000)). Depuis, il a été établi

que ces protéines sont des composants majeurs du complexe de pré-réplication formé avant le

début de la phase S au niveau des origines de réplication de l’ADN (pour revue, (Maiorano et

al, 2006)). La liaison des protéines Cdc6 et Cdt1 à la chromatine est essentielle pour la

formation du complexe MCM2-7 au niveau des origines de réplication (pour revue,

(Maiorano et al, 2006)). Dans les cellules humaines, Cdt1 semble jouer un rôle majeur dans

l’initiation puisqu’une forte expression de Cdt1 suffit à induire la re-réplication (Vaziri et al,

2003). Ainsi, au cours du cycle cellulaire, le niveau d’expression de Cdt1 doit être finement

régulé de manière à ce que cette protéine s’accumule à la fin de la mitose et au début de la

phase G1 (Nishitani et al, 2001; Wohlschlegel et al, 2000) ; cette protéine étant dégradée au

cours de la phase S par protéolyse dépendante de l’ubiquitination (Li et al, 2003; Nishitani et

al, 2006; Tada et al, 2001). De plus, au cours des phases S et M du cycle cellulaire, la

Géminine, un inhibiteur de Cdt1, est présente de manière à ce que l’activité de Cdt1 soit

restreinte à la phase G1 du cycle cellulaire (Ballabeni et al, 2004; Tada et al, 2001;

Wohlschlegel et al, 2000). En outre, la protéine MCM9 s’associerait avec Cdt1 afin d’éviter

que le rapport Géminine/Cdt1 ne soit trop élevé puisqu’il inhiberait alors l’initiation de la

réplication. Ainsi, MCM9, contrairement à la Géminine, servirait de régulateur positif de Cdt1


18

et permettrait donc le chargement du complexe MCM2-7 (Lutzmann & Mechali, 2008). Les

protéines MCM2-7 sont des ATPases qui permettent d’ouvrir l’ADN au niveau des origines

de réplication mais aussi de coordonner la réplication. La protéine MCM10 assure la liaison

du complexe MCM2-7 au niveau des origines de réplication lors de l’initiation. En outre, ce

complexe permet de prévenir la réplication d’un ADN nouvellement dupliqué au cours du

même cycle cellulaire (Chong et al, 1995). En effet, au cours de la phase S, les protéines

MCM2-7 se dissocient de la chromatine et l’ADN répliqué perd alors sa capacité à se

dupliquer à nouveau (Labib et al, 1999). Pour cela, la protéine MCM10 doit être dégradée.

Les fonctions de ces six protéines MCM2-7 ne sont pas redondantes puisqu’une délétion ou

une mutation dans l’une d’entre elle est délétère à la cellule (Tye, 1999). L’ADN, alors

déroulé, est ensuite protégé de l’action des nucléases par la protéine de réplication A (RPA)

qui a une forte affinité pour l’ADN simple-brin (Iftode & Borowiec, 1998). La Topoisomérase

I relâche alors la tension créée au niveau de la fourche de réplication (Forterre et al, 2007).

Les deux brins d’ADN composant la double hélice ont une polarité opposée. Or les

ADN polymérases utilisent le 3’-OH d’un nucléoside comme amorce et synthétise l’ADN de

5’ vers 3’. Les deux brins d’ADN sont donc copiés de manière différente, l’un est synthétisé

de manière continue (brin continu), l’autre de manière discontinue en générant des

fragments d’Okazaki d’environ 200 paires de bases (brin discontinu), ces fragments étant

par la suite reliés ensemble. La synthèse du brin continu ainsi que celle de chaque fragment

d’Okazaki est initiée par une amorce ARN, de 10 nucléotides environ, synthétisée de novo par

une primase appelée ADN polymérase alpha (Pol α) chez les eucaryotes. Cette ADN

polymérase allonge ensuite l’amorce d’ARN par polymérisation pour produire un fragment

court d’ADN de 30 nucléotides et donc constituer une amorce ARN-ADN. Il est important de

noter que la protéine RPA stimulerait l’activité et augmenterait la fidélité de l’ADN

polymérase α (Maga et al, 2001). La processivité (capacité à répliquer plusieurs bases

successives) de Pol α sur l’ADN étant faible, elle se dissocie de l’ADN matrice après avoir

synthétisé l’amorce. Deux autres ADN polymérases réplicatives delta (Pol δ) et epsilon

(Pol ε) se fixent alors pour continuer la synthèse d’ADN.

b- L’élongation

Le changement d’ADN polymérases est catalysé par la fixation du facteur de

réplication C (RFC) qui permet de dissocier Pol α des amorces ARN-ADN nouvellement

synthétisées en masquant l’extrémité 3’OH (Maga et al, 2000). RFC favorise aussi le

chargement du facteur de processivité PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) sur cette


19

amorce. PCNA s’assemble en homo-trimères autour de l’ADN et interagit avec Pol δ et Pol ε

(pour revue, (Hubscher et al, 2000)). PCNA augmente ainsi la processivité de Pol δ en évitant

sa dissociation de l’ADN. Les interactions de PCNA avec divers facteurs du métabolisme de

l’ADN impliquent un rôle central de cette protéine dans la coordination de la réplication de

l’ADN, de la réparation de l’ADN et du contrôle du cycle cellulaire (Waga & Stillman, 1998).

Ce changement d’ADN polymérases se reproduit plusieurs fois au niveau de chaque fragment

d’Okazaki. En effet, le nombre d’évènements d’initiation de la réplication est estimé à 4.104

sur le brin continu et à 4.107 sur le brin discontinu dans les cellules de mammifères (pour

revue, (Hubscher et al, 2002)).

Le déroulement de l’ADN tout au long de l’étape d’élongation est nécessaire. Alors

que le complexe MCM2-7 est essentiel au cours de l’initiation, l’hélicase MCM8 prendrait le

relais au cours de l’élongation. En effet, MCM8 ne se lierait à l’ADN qu’après l’étape

d’initiation, serait co-localisée avec les foyers de réplication et interagirait avec RPA

(Maiorano et al, 2005). Cependant, ce rôle au niveau de l’élongation n’est pas complètement

admis puisque certains groupes suggèrent plutôt un rôle de MCM8 au niveau de l’initiation de

la réplication (Kinoshita et al, 2008; Volkening & Hoffmann, 2005).

Enfin, les fragments d’Okazaki doivent être maturés et reliés entre eux. FEN1

(Flap Endo-Nuclease I) est une 5’-3’ exo/endonucléase requise pour la maturation des

fragments d’Okazaki puisqu’elle permet d’éliminer l’amorce ARN synthétisée par Pol α

(Bambara et al, 1997). Pol δ permet de combler les brèches ainsi créées et l’ADN ligase I relie

les fragments entre eux (Nick McElhinny et al, 2008; Turchi et al, 1994).

2. Les ADN polymérases réplicatives

Les ADN polymérases humaines, actrices majeures de la réplication de l’ADN, ont été

classées en différentes familles (A, B, X et Y) en fonction de leur homologie de séquence et

de leur similarités structurales (Tableau 1). Les ADN polymérases réplicatives (Pol α, Pol δ et

Pol ε) font partie de la famille B. Une fois repliée, ces protéines adoptent une forme de main

droite avec trois domaines distincts : la paume qui contient le site catalytique, le pouce qui

est important pour la liaison à l’ADN et la processivité de la protéine et les doigts qui

permettent de positionner correctement la matrice et le nucléotide à incorporer (Steitz, 1998).


20

Tableau 1. Classification des ADN polymérases en familles suivant leur homologie de séquence ou de structure. Les ADN polymérases bactériennes et eucaryotes sont inscrites en gras, les autres noms utilisés sont indiqués entre parenthèses.

Familles A B C X Y

Bactéries Pol I Pol II Pol III Pol IV (DinB)

Pol V (UmuD’2C)

S. cerevisiae

gamma (MIP1)

alpha (Pol1, Pol12, Pri1,Pri2), delta (CDC2, HYS2, Pol32) epsilon (DPB2, 3, 4, Pol2) zeta (Rev3, rev7)

Pol4 sigma (Trf4, 5)

Rad30 Rev1

S. pombe gamma (SPCC24BIO.22)

alpha (Pol1, spb70, spp1,spp2) delta (cdc6, cdc1, cdc27, cdm1) epsilon (dpb2, 3, 4, cdc20) zeta (Rev3, SPAC12D12.09)

lambda (SpaC2F7.06c) sigma (cid14)

eta (Eso1) Rev1 kappa

Eucaryotes

Homo sapiens

gamma (1,2), theta, nu

alpha (alphaA, B, pri1, 2) delta (delta1, 2, 3, 4) epsilon (epsilon1, 2, 3, 4) zeta (Rev3, Rev7)

beta mu sigma (Trf4, 5) lambda TdT

eta (Rad30A) iota (Rad30B) kappa Rev1

a- Pol α : l’ADN polymérase de l’initiation

Chez tous les organismes eucaryotes, Pol α est une enzyme composée de 4

sous-unités : p180, p68, p55, p48. La sous-unité catalytique p180 contient le domaine de

liaison à l’ADN et au nucléotide entrant ainsi qu’un domaine essentiel pour son interaction

avec les autres sous-unités. Pol α est unique parmi les ADN polymérases eucaryotes puisque

deux des petites sous-unités (p48 et p55) contiennent l’activité ADN primase, spécifique

de Pol α. La dernière sous-unité ne possède pas d’activité catalytique définie mais semble

essentielle au maintien d’un complexe hétéro-tétramérique fonctionnel (pour revue,

(Hubscher et al, 2002)). De plus, la sous-unité p180 est hyper-phosphorylée majoritairement

en fin de phase G2 et en phase M (Nasheuer et al, 1991). Cette modification

post-traductionnelle diminuerait l’affinité de Pol α pour l’ADN simple-brin et pourrait aussi

affecter son intéraction avec les autres protéines de la réplication.


21

b- Pol δ et Pol ε : les ADN polymérases de l’élongation

Dans les cellules humaines, Pol δ et Pol ε sont composées de 4 sous-unités (p125, p66,

p50, p12 et p261, p59, p17, p12 respectivement). Les plus grosses sous-unités comportent

l’activité catalytique ainsi que l’activité 3’-5’ exonucléase de correction d’erreur

(Burgers, 1998). Le taux d’erreur pour les ADN polymérases réplicatives au cours de la

synthèse d’ADN est compris entre 10-6 et 10-8 (pour revue, (Bebenek & Kunkel, 2004)). Ces

enzymes sont donc extrêmement fidèles contrairement aux ADN polymérases dites

spécialisées, que nous verrons par la suite, et qui ne possèdent pas cette activité de correction

d’erreur (pour revue, (Bebenek & Kunkel, 2004)). La plus grosse sous-unité de Pol ε pourrait

aussi jouer un rôle de « senseur » des dommages de l’ADN au cours de la phase S et recruter

les protéines impliquées dans la mise en place des points de contrôle (Dua et al, 1998).

La séparation des rôles de Pol δ et de Pol ε au niveau de l’élongation des deux brins

d’ADN est restée floue pendant de nombreuses années. Cependant, en 2007, des expériences

chez la levure ont permis de proposer un rôle pour Pol δ au niveau du brin discontinu et

un rôle pour Pol ε sur le brin continu (Nick McElhinny et al, 2007; Pursell et al, 2007).

Pour cela, un gène rapporteur a été placé proche d’une origine de réplication. Suivant

l’orientation du gène rapporteur, un brin d’ADN donné est répliqué comme le brin continu ou

discontinu. En utilisant des mutants spécifiques des deux ADN polymérases, qui présentent

une fidélité réduite, les mutations accumulées permettent de connaître la nature du brin

matrice et donc de déterminer quelle ADN polymérase intervient au niveau du brin continu et

du brin discontinu. Les résultats obtenus sont en accord avec des études précédentes suggérant

un rôle de Pol δ au niveau de la maturation des fragments d’Okazaki. En effet, chez la levure,

Pol α interagirait avec Pol δ (Huang et al, 1999a) et l’activité de synthèse de Pol δ serait

fortement couplée à l’activité exonucléase de FEN1 (Garg et al, 2004). En outre, Pol δ

pourrait corriger les erreurs introduites par Pol α contrairement à Pol ε (Pavlov et al, 2006).

Cette répartition du travail entre Pol δ et Pol ε représente une avancée considérable

pour la compréhension de la duplication de l’ADN. Cependant, la contribution de Pol δ et

Pol ε au cours de la réplication de l’ADN reste à être déterminée dans les cellules humaines,

ainsi qu’au niveau du génome global et notamment aux régions d’hétéro-chromatine. D’autre

part, il serait aussi important de savoir s’il existe des différences au niveau des origines de


22

réplication précoces et tardives. Enfin, comment ces ADN polymérases gèrent un blocage de

fourche de réplication et comment elles sont chargées à nouveau sur l’ADN après un tel

blocage sont deux questions qui restent encore à être étudiées.

3. Les points de contrôle du cycle cellulaire

Comme nous l’avons vu précédemment, la réplication de l’ADN doit être précisément

coordonnée avec le cycle cellulaire.

Les cellules sont constamment soumises à diverses formes de dommages. Ainsi,

maintenir un génome complet et non endommagé est un processus vital pour les cellules et

leurs futures générations. Afin d’assurer le bon déroulement de l’étape de réplication, des

points de contrôle ont été mis en place tout au long du cycle cellulaire qui permettent aux

cellules d’arrêter leur progression soit à la transition G1/S, soit à la transition G2/M ou de

ralentir la progression de la phase S.

Les mécanismes des points de contrôle impliquent trois grands groupes de protéines :

- les protéines senseurs, telles que RFC et RPA, qui permettent de signaler la présence

d’anormalités et d’initier la cascade d’activation du mécanisme,

- les protéines transductrices du signal telles qu’ATM et ATR (Ataxia Telangiectasia

Mutated ou Rad3-related) ou Chk1 et Chk2 (Checkpoint-kinase-1 ou 2), qui propagent

et amplifient la cascade de signalisation

- et enfin les protéines effectrices telles que Cdc25 et p53, qui, lorsqu’elles sont

phosphorylées par les protéines transductrices, permettent d’arrêter le cycle cellulaire.

Les régulateurs majeurs de la réponse aux dommages de l’ADN sont les protéines de

la famille des phosphoinositide 3-kinases (PI3Ks), incluant ATR et ATM.

a- ATR et Chk1 signalent les fourches de réplication bloquées

ATR est une protéine essentielle pour la viabilité des cellules humaines ou murines

(Brown & Baltimore, 2000; de Klein et al, 2000). ATR est activée au cours de chaque phase S

du cycle cellulaire pour réguler l’activation des origines de réplication, la réparation des

fourches de réplication endommagées, pour redémarrer les fourches de réplications bloquées

mais aussi pour éviter un passage précoce en mitose (Nyberg et al, 2002; Shechter et al,

2004a; Shechter et al, 2004b; Tourriere et al, 2005). Ainsi, l’inactivation du mécanisme médié


23

par ATR conduit à une forte instabilité génétique. De plus, des mutations du gène ATR

peuvent induire le syndrome de Seckel, maladie rare associant nanisme et retard mental

(O'Driscoll et al, 2003).

ATR est activée en réponse à de nombreux traitements endommageant l’ADN mais

l’élément initial déclenchant son activation est médié par la présence d’ADN simple-brin

couvert de RPA (Fig 2) (Zou & Elledge, 2003; Zou et al, 2003). Ce filament nucléoprotéique

peut, par exemple, être créé au cours de la réplication de l’ADN sur le brin discontinu ou

lorsqu’une ADN polymérase est bloquée et que survient un découplage entre ADN hélicase et

ADN polymérase (Byun et al, 2005). La reconnaissance de l’ADN simple-brin par ATR

dépend de la protéine ATRIP (ATR-interacting protein) qui s’associerait directement avec

RPA (Ball et al, 2007). D’autre part, la signalisation via ATR dépend de la co-localisation de

ATR-ATRIP et de l’anneau hétéro-trimérique 9-1-1 (complexe RAD9-RAD1-HUS1)

(Parrilla-Castellar et al, 2004) qui reconnaît une extrémité d’ADN proche d’une région

simple-brin d’ADN couverte par RPA (Zou et al, 2003). Ce complexe 9-1-1 permet de

recruter un activateur crucial d’ATR : TOPBP1 (Topoisomerase-binding protein-1) (Kumagai

et al, 2006).

Une fois le complexe ATR assemblé au niveau d’une fourche de réplication bloquée,

de nombreuses protéines impliquées dans le maintien de la fourche de réplication ou dans des

mécanismes de réparation de l’ADN sont phosphorylées. Dans cette partie, nous allons

seulement nous intéresser à la protéine Chk1 (Checkpoint-kinase-1) qui est activée par

phosphorylation sur la sérine 317 et la sérine 345. Il a été montré que, la Claspin sert de

médiateur entre ATR et Chk1 et sa phosphorylation est nécessaire pour se lier à Chk1

(Kumagai & Dunphy, 2000; Kumagai & Dunphy, 2003). Un autre complexe formé autour de

la protéine Timeless permet aussi de médier l’activation de Chk1 par ATR (Errico et al, 2007;

Unsal-Kacmaz et al, 2007). Une fois activée par phosphorylation, Chk1 se détache de la

chromatine pour phosphoryler ses substrats (Smits et al, 2006). Les cibles clés de Chk1 sont

entre autres les protéines CDC25 (Schmitt et al, 2006). La phosphorylation de ces protéines

par Chk1 inhibe leur activité et permet d’éviter l’entrée en mitose tant qu’un problème

subsiste sur une fourche de réplication (Furnari et al, 1997; Peng et al, 1997; Sanchez et al,

1997). La signalisation d’ATR via Chk1 permet aussi de ralentir les fourches de réplication

en présence d’un stress réplicatif et d’inhiber partiellement l’activation des origines de

réplication situées dans la même zone (Unsal-Kacmaz et al, 2007). Le mécanisme précis

n’est pas encore connu à ce jour.


24

Figure 2. Modèle simplifié d’activation d’ATR. Deux complexes ATR-ATRIP et 9-1-1 sont

recrutés indépendamment au niveau d’un ADN simple-brin recouvert de RPA. Le complexe 9-1-1 est chargé sur l’ADN par Rad17. L’activité kinase du complexe ATR-ATRIP est augmentée par le 9-1-1 permettant ainsi la phosphorylation de Rad17 et de Rad9. Ces protéines phosphorylées facilitent ensuite le recrutement de TOPBP1 et de la Claspin. Ces deux protéines sont ensuite phosphorylées à leur tour par ATR. D’une part, la phosphorylation de TOPBP1 augmente l’activité d’ATR. D’autre part, la phosphorylation de la Claspin permet le recrutement de Chk1 qui est phosphorylé par ATR. Cette voie de signalisation permet d’inhiber l’activation des origines de réplication, d’arrêter le cycle cellulaire mais aussi de stabiliser et redémarrer les fourches de réplication suite à un stress réplicatif. (Adapté de (Cimprich & Cortez, 2008; Zou, 2007))

Rad17

Rad17

Rad17

RPA

ATRIP

ATR 9-1-1

ATRIP ATR

P

9-1-1

5’ 3’

3’ 5’

5’

3’

3’ 3’

Rad17

P

P

9-1-1

5’ 3’ 3’

TOPBP1 P

TOPBP1 Claspin

Claspin P P

Stabiliser pour réparer et/ou redémarrer les

fourches de réplication

Arrêter le cycle cellulaire

Inhiber l’activation des origines de

réplication

Chk1

P

9-1-1

5’ 3’ 3’

TOPBP1 P

Claspin P PP

Chk1

RPA

RPA RPA

RPA RPA

RPA RPA

RPA RPA

ATRIP

ATR

ATRIP

ATR

ATRIP

ATR

ATRIP ATR

ATRIP ATR

5’ 3’


25

b- ATM et Chk2 signalent les cassures de l’ADN

L’ataxia telangiectasia (AT) est un syndrome récesssif très rare qui associe des

atteintes neurologique, immunitaire et pulmonaire sévères à un risque élevé de cancers. Cette

maladie est due à l’inactivation par mutation du gène ATM (Lavin, 2008). La protéine kinase

ATM est cruciale pour l’initiation des mécanismes de signalisation des dommages causés par

des agents introduisant des cassures double-brin de l’ADN, tels que les radiations ionisantes

(Kastan & Lim, 2000; Shiloh & Kastan, 2001). ATM serait présente sous forme de dimères

inactifs dans la cellule. Après irradiations ionisantes, la structure de la chromatine serait

modifiée entrainant la phosphorylation des dimères d’ATM. Cette phosphorylation ne

régulerait pas directement l’activité d’ATM, mais séparerait les dimères d’ATM. Les

monomères actifs d’ATM pourraient alors interagir avec leurs substrats afin de les

phosphoryler (Fig 3) (Bakkenist & Kastan, 2003). Un autre mécanisme d’activation d’ATM

faisant intervenir le complexe MRN (Mre11-Rad50-Nbs1) a été proposé (Jazayeri et al,

2008). Ce complexe est essentiel pour l’activation complète d’ATM (Costanzo et al, 2004).

L’activité nucléase du complexe MRN permettrait de transformer les cassures double-brin de

l’ADN en oligonucléotides simple-brin couverts de RPA, ce qui activerait ATM (Jazayeri et

al, 2006; Jazayeri et al, 2008; Myers & Cortez, 2006). Les deux voies de signalisation

impliquant d’une part ATM et d’autre part ATR ont longtemps été considérées comme

indépendantes. Cependant, la présence d’ADN simple-brin suite à la reconnaissance de la

cassure double-brin par MRN permettrait alors d’activer non seulement ATM, mais aussi

l’autre protéine kinase majeure ATR (Adams et al, 2006; Shiotani & Zou, 2009). L’activation

d’ATR conduit, dans ce cas là, à la phosphorylation de Chk1 seulement dans les cellules en

fin de phase S ou en phase G2 du cycle cellulaire (Cuadrado et al, 2006). Par conséquent,

l’activation en premier lieu d’ATM, suivie de l’activation d’ATR permettrait aux deux

protéines kinases de cibler des effecteurs différents afin de réguler et de coordonner la

réponse aux dommages de l’ADN (Shiotani & Zou, 2009).

Une fois activée, ATM va phosphoryler de nombreuses protéines et une des premières

cibles est le variant d’histone H2AX. Cette protéine phosphorylée (γ-H2AX) recrute alors la

protéine MDC1 (Mediator of DNA damage checkpoint protein 1), conduisant au recrutement

d’autres complexes MRN-ATM et donc à l’amplification du signal par phosphorylation

d’autres protéines H2AX (Fig 3). ATM activée phosphoryle aussi d’autres cibles dont la

protéine kinase Chk2 au niveau de la thréonine 68 (Matsuoka et al, 2000). Dans les cellules


26

non traitées, Chk2 existe sous forme de monomère et c’est après dommages de l’ADN, que

Chk2 alors phosphorylée se dimérise (Xu et al, 2002). Des phosphorylations sur d’autres

résidus (thréonines 383 et 387, sérine 516) ont lieu permettant une activation complète de

Chk2 (Ahn et al, 2002; Schwarz et al, 2003b; Wu & Chen, 2003).

Figure 3. Modèle simplifié d’activation d’ATM. La formation d’une cassure double-brin de

l’ADN conduit au recrutement du complexe MRN (Mre11-Rad50-Nbs1). Les dimères d’ATM se dissocient et les monomères phosphorylés se lient à MRN. Une fois activée, ATM phosphoryle les variants d’histone H2AX qui se lient aux protéines MDC1, recrutant de cette manière d’autres complexes ATM-MRN. ATM phosphoryle de nombreux substrats dont Chk2. Cette voie de signalisation permet également d’inhiber l’activation des origines de réplication, d’arrêter le cycle cellulaire (via CDC25 A et C et p53) et permet la réparation des cassures double-brin (via BRCA1). (Adapté de (Cimprich & Cortez, 2008; Zou, 2007))

Chk2

Inhiber l’activation des origines de

réplication

Arrêter le cycle cellulaire

(CDC25 A et C, p53)

Réparation des cassures double-brin de l’ADN

(BRCA1)

H2AX H2AX H2AX

ATM ATM

MRN

P

P

P MDC1

PMDC1

P

P

P P

MRN

MRN

MRN MRN

ATM

ATM

ATM ATM


27

Chk2 va ensuite phosphoryler d’autres substrats, mais nous allons seulement nous

intéresser à certains d’entre eux qui sont importants pour la suite de ce travail. Les plus décrits

à ce jour sont les protéines Cdc25A et C. Leur phosphorylation permet d’éviter l’entrée en

mitose tant que les dommages de l’ADN ne sont pas réparés (Matsuoka et al, 1998; Zhou

et al, 2000). La phosphroylation de Chk2 permettrait aussi d’arrêter les cellules en phase

G1 du cycle cellulaire en agissant d’une part au niveau de la protéine p53 (Ekholm & Reed,

2000; Sherr & Roberts, 1999) et d’autre part au niveau de la protéine Cdc25A (Mailand et al,

2000). En outre, la phosphorylation de Chk2 permettrait de contrôler la réparation des

cassures double-brin de l’ADN. En effet, après phosphorylation de Chk2 sur la thréonine 988,

la protéine BRCA1 (Breast cancer 1) est re-localisée pour intervenir dans le mécanisme de

réparation fidèle par recombinaison homologue de l’ADN (HR) (Lee et al, 2000; Zhang et

al, 2004) et réprime le mécanisme de réparation par jonction d’extrémités non

homologues (NHEJ) (Wang et al, 2006b; Zhuang et al, 2006). Enfin, Chk2 participerait aussi

à l’activation de la voie d’apoptose lorsque les dommages sont trop importants (Stevens et al,

2003).

Par conséquent, l’activation du point de contrôle médiée par ATM permet entre autres

d’arrêter le cycle cellulaire avant l’entrée en mitose mais aussi de favoriser la réparation des

cassures de l’ADN.

B. Obstacles rencontrés lors de la réplication de l’ADN

Les mécanismes responsables du maintien de l'intégrité du génome sont essentiels

pour la survie des espèces. L'existence même de tels processus vitaux relève du fait que

l'ADN de toute cellule est sans cesse menacé dans sa structure par des stress exogènes

(radiations ultraviolettes solaires, par exemple) et par des stress endogènes tels que les

espèces activées de l'oxygène issues du métabolisme cellulaire ou les erreurs ou arrêts lors de

la réplication. Un schéma non exhaustif représentant plusieurs agents endommageant l’ADN,

les différentes lésions en résultant et les nombreux mécanismes de réparation utilisés est

présenté sur la figure 4.

Chapitre I B. Obstacles rencontrés lors de la réplication

28

Figure 4. Agents endommageant l’ADN, lésions résultantes et mécanismes de réparation

associés. Certains agents endommageant l’ADN sont cités en rouge, les lésions résultantes sont représentées sur la molécule d’ADN et citées en dessous en noir, les mécanismes de réparation associés sont inscrits en bleu et les ADN polymérases spécialisées intervenant dans ces processus sont en rouge. (Adapté de (Hoeijmakers, 2001))

1. Les lésions exogènes de l’ADN

Les organismes vivants sont exposés à des rayonnements divers depuis leur apparition

sur terre. Parmi ces rayonnements, nous pouvons citer les rayonnements ionisants provenant

des rayonnements cosmiques, les rayons X ainsi que les rayonnements produits par les

composés radioactifs. Ces deux derniers sont couramment utilisés en médecine. Ces types de

rayonnements sont très toxiques pour la cellule puisqu’ils induisent de nombreux dommages à

l’ADN tels que des cassures simple-brin ou double-brin de l’ADN.

Un autre type de rayonnement endommageant l’ADN est appelé rayonnement

ultra-violet (UV). La gamme des rayons UV est souvent subdivisée en trois catégories : UVA

(400-315 nm), UVB (315-280 nm) et UVC (280-10 nm). Les UVA représentent environ 95%

du rayonnement UV qui atteint la surface de la terre ; les autres radiations étant absorbées

par la couche d’ozone. Ces radiations sont responsables du vieillissement de la peau

puisqu’elles perturbent la production de certaines protéines telles que le collagène. Elles

induisent aussi la formation de radicaux libres extrêmement nocifs au sein des cellules (pour

revue (McMillan et al, 2008)). Les UVB et UVC génèrent des photo-produits sur l’ADN

(Fig 4) tels que les dimères de pyrimidines cyclobutanes (CPD) et les 6-4 pyrimidines-

Rayons-X Radicaux oxygénés

Agents alkylants Rayons-UV Agents anti-tumoraux

(Cisplatine, Mytomycine C) Erreurs de réplication

Uracil Site abasique 8-Oxoguanine

Cassure simple-brin

6-4 PP CPD

Pontage inter-brin Cassure double-brin

Mésappariement Insertion Délétion

Réparation par excision de base

(BER) Pol β, Pol θ, Pol λ, Pol ι

Réparation par excision de

nucléotides (NER) Pol κ

Recombinaison homologue (HR) ou par

jonction d’extrémités non homologues (NHEJ)

Pol η, Pol δ, Pol λ, Pol μ

Réparation des Mismatch (MMR)


29

pyrimidones (6-4PP) (pour revue (Cleaver, 2000)). Ces dommages sont normalement réparés

via le système de réparation par excision de nucléotides (NER). La majorité des patients

atteints du syndrome rare Xeroderma pigmentosum (XP), présente un défaut de réparation par

NER (Berneburg & Lehmann, 2001) dû à des mutations dans les protéines XPA, XPB, XPC,

XPD, XPE, XPF et XPG. Ces patients présentent alors une très forte sensibilité aux radiations

UV et sont fortement prédisposés au cancer de la peau (Kraemer et al, 1987). Par contre, 20 %

des patients XP ne présentent aucun défaut de NER mais ont des mutations dans le gène

POLH codant pour l’ADN polymérase spécialisée eta (Pol η). Cette inactivation de Pol η

caractérise les patients atteints du syndrome du Xeroderma pigmentosum variant ou XP-V

(Johnson et al, 1999a; Lehmann et al, 1975; Masutani et al, 1999b). Pol η est capable de

répliquer un dimère de thymines par un mécanisme de synthèse translésionnelle en

incorporant deux adénines en face de la lésion (Johnson et al, 1999b; Masutani et al, 1999a;

Masutani et al, 2000). Ce mécanisme ainsi que le rôle de Pol η seront détaillés ultérieurement

dans ce manuscrit (p.74).

Enfin, les agents chimiques environnementaux, tels que la fumée de cigarette ou

encore les chlorophénols présents dans de nombreux pesticides et herbicides, ainsi que les

agents utilisés en chimiothérapie peuvent endommager le génome en créant des adduits sur

l’ADN, des bases oxydées ou des pontages inter ou intra-brin.

2. Les lésions endogènes de l’ADN dues au métabolisme cellulaire

Le stress oxydatif est un type d'agression des constituants de la cellule dû aux espèces

réactives oxygénées (ROS) oxydantes. Ces espèces sont, par définition, des radicaux libres.

Ils sont produits de manière endogène par le métabolisme oxydatif de la mitochondrie, par les

mécanismes de cycle redox, mais aussi de manière exogène via les rayonnements ionisants

par exemple (pour revue (Galli et al, 2005)). Environ 10000 bases sont endommagées et

hydrolysées par cellule et par jour (Fortini et al, 2003). La production de ROS est normale

pour tous les organismes vivants et ne constitue pas en soit une situation de stress oxydant

puisque la cellule dispose d'un système complexe de détoxification contre les ROS

comprenant des enzymes (superoxyde dismutase, catalase, glutathion peroxydase,…) et

d’autres petites molécules (vitamine E, vitamine C…).


30

Le stress oxydant devient une situation pathologique dès que le système de

protection est submergé par les ROS. Ceci peut être dû par exemple à :

- l'introduction dans la cellule de radicaux libres ou d'espèces réactives oxygénées

(polluants photochimiques pénétrant l'organisme via le système respiratoire, l'alimentation ou

les muqueuses)

- un défaut du système de protection, par exemple une mutation inactivant une des

enzymes du système de protection ou une carence en une des vitamines essentielles.

Le stress oxydant est un facteur d'inflammation et de mutagenèse, mais il est aussi

considéré comme une des principales causes de cancer et jouerait un rôle dans la maladie

d'Alzheimer, comme dans plusieurs pathologies plus courantes telles que les maladies

cardio-vasculaires, les accidents cérébraux-vasculaires, l’arthrite rhumatoïde ou les cataractes

(Guyton & Kensler, 1993).

Au niveau de l’ADN, les bases modifiées par l’action des ROS, sont réparées par

excision de base (BER). Ce mécanisme de réparation est constitué d’une première étape de

reconnaissance et d’excision de la base endommagée par des ADN glycosylases. Ensuite, le

site abasique est éliminé par l’action d’une endonucléase entraînant la formation d’une

cassure simple-brin de l’ADN. L’ADN polymérase beta (Pol β) va ensuite dégrader le sucre

mono-phosphate restant via son activité dRP-lyase et ajouter le nucléotide manquant. Enfin, le

complexe XRCC1-Ligase III permet de refermer la brèche (pour revue, (Hoeijmakers, 2001)).

3. Les obstacles naturels de la réplication de l’ADN

De plus en plus de données suggèrent que les barrières naturelles de fourches, telles

que les collisions entre les machineries de réplication et de transcription ou les structures

secondaires de l’ADN, pourraient être impliquées dans l’instabilité génomique (Lambert et al,

2005; Mirkin, 2006; Prado & Aguilera, 2005).

a- Les collisions transcription/réplication

La transcription permet, au niveau d’un gène, de copier un brin d’ADN matrice en

ARN dit messager qui sera par la suite traduit en protéine. Ainsi, les ADN polymérases et les

ARN polymérases utilisent la même matrice. Des collisions occasionnelles entre ces deux

machineries peuvent donc avoir lieu et interférer avec la progression de la réplication

(Brewer, 1988). D’autre part, la transcription stimulerait la recombinaison, un phénomène

appelé recombinaison associée à la transcription (RAT) (Aguilera, 2002). Ce phénomène,

étudié essentiellement chez la levure, serait en fait la conséquence de la collision entre l’ARN


31

Pol II et la machinerie de réplication (Prado & Aguilera, 2005). En outre, la transcription

pourrait introduire des changements locaux dans la topologie ou dans la structure de la

chromatine entrainant l’accumulation transitoire d’ADN simple-brin (Gangloff et al, 1994).

La présence de cet ADN simple-brin serait importante pour induire la recombinaison associée

à la transcription (Huertas & Aguilera, 2003). Cette recombinaison entre séquences

homologues ectopiques conduirait à de l’instabilité génomique (Thomas & Rothstein, 1989).

Enfin, la transcription augmente la fréquence des mutations sur l’ADN

complémentaire à l’ADN matrice, un phénomène appelé mutation associée à la transcription

(MAT). En effet, au cours de la transcription, l’ADN complémentaire se retrouve

transitoirement sous forme d’ADN simple-brin et devient alors plus sensible aux dommages

internes ou externes (Mirkin & Mirkin, 2007).

b- Les structures secondaires de l’ADN

Les molécules d’ADN adoptent généralement une structure en hélice droite appelée

ADN-B. Cependant, des structures alternatives peuvent se former telles que les structures en

cruciformes, en épingle à cheveux, en triple-hélice (ADN-H), en G-quartet, en hélice gauche

(ADN-Z) (Figure 5).

ADN-B

CCAACGTTGG GGTTGCTTCC

ADN-Z

CGCGCG GCGCGC

ADN-H

CCCCTCCCCA TGGGGAGGGG TGGGGAGGGG

5’

3’ 5’

3’ 5’ 26 Å

22 Å

22 Å

G-quadruplex

(TTGGGG)4

5’

3’

16 Å

3’

5’

Figure 5. Les différentes conformations d’ADN. Les images des structures ont été générées avec le logiciel Pymol (http://www.pymol.org) à partir des structures publiées (Cervi et al, 1993; Lipanov et al, 1993; van Dongen et al, 1999; Wang & Patel, 1994) et de la revue (Wells, 2007). Les diamètres des hélices d’ADN sont inscrits à côté des flèches en pointillés.


32

Cette capacité à adopter des structures particulières est déterminée par la composition

en base et la symétrie de la séquence mais aussi par l’état d’enroulement de l’ADN. Basé sur

l’arrangement et la symétrie de la séquence, trois types majeurs de répétition d’ADN sont

généralement considérés :

- les répétitions inversées (RI) : les bases équidistantes du centre de symétrie de la

molécule sur un brin d’ADN sont associées aux bases complémentaires en respectant

la structure Watson-Crick. Ces séquences sont capables d’adopter des structures en

cruciformes lorsque l’ADN est sous forme double-brin, ou en épingle à cheveux

lorsque l’ADN est sous forme simple-brin (pour revue, (Murchie & Lilley, 1992)).

- les répétitions en miroir (RM) : dans ces séquences symétriques, les bases de part et

d’autre de l’axe de symétrie sont identiques. Les séquences miroirs

d’homopurine-homopyrimidines sont capables d’adopter des structures en triple

hélice ADN-H (pour revue, (Mirkin & Mirkin, 2007)). Dans ce cas là, un des brins de

la moitié de la répétition se dissocie pour former un simple-brin d’ADN qui peut alors

pivoter et se placer parallèlement à la structure centrale du brin riche en purine dans le

duplex restant (Htun & Dahlberg, 1988; Voloshin et al, 1988). Les bases du troisième

brin s’associent aux bases du duplex via des liaisons Hoogsteen (pour revue (Frank-

Kamenetskii & Mirkin, 1995)) et sont plus perpendiculaires à l’axe de la double hélice

(Rhee et al, 1999). De plus, le troisième brin est placé dans le grand sillon du duplex,

ce qui conduit à la formation de deux petits sillons supplémentaires (Johnston, 1988;

Voloshin et al, 1988). D’autre part, le duplex au sein d’un triplex est plus déroulé

puisque l’angle de torsion est plus faible (30° au lieu de 36° pour l’ADN-B) et l’angle

d’ouverture plus grand (2,7° au lieu de -0,5° pour l’ADN-B) (Radhakrishnan & Patel,

1994a; Radhakrishnan & Patel, 1994b; Rhee et al, 1999; Tarkoy et al, 1998). Ce type

de séquences capables d’adopter des structures en ADN-H sont abondantes dans le

génome humain puisqu’elles sont retrouvées environ toutes les 50 000 pb (Schroth &

Ho, 1995). En outre, elles sont majoritairement présentes au niveau des promoteurs et

des exons et peuvent réguler de ce fait l’expression de certains gènes liés à des

maladies (Kinniburgh, 1989; Pestov et al, 1991). Par exemple, le gène c-MYC, souvent

transloqué dans les tumeurs et alors surexprimé, contient une séquence capable de

former une triple hélice au niveau de son promoteur (Kinniburgh, 1989; Mirkin et al,

1987). Il est important de souligner que la formation d’ADN-H serait source

d’instabilité génétique (Wang & Vasquez, 2004). En effet, des cassures double-brin

seraient formées à leur niveau et réparées majoritairement par le mécanisme NHEJ qui


33

n’est pas forcément fidèle, conduisant par conséquent à des mutations et des

translocations.

- les répétitions directes (RD) : les séquences répétées sont continues le long d’un brin

d’ADN. Une structure appelée G-quartet ou G-quadruplex (G4) peut être facilitée

par des répétitions directes riches en G (pour revue, (Gilbert & Feigon, 1999)). Les

structures G4 forment des plateaux de quatre guanines empilées, qui sont stabilisés par

des ions monovalents et reliés entre eux par des boucles latérales (Williamson et al,

1989). Ces structures peuvent exister en différentes formes dépendantes de

l’orientation, de la séquence et de la longueur des brins mais aussi en fonction de la

disponibilité des cations stabilisant ces structures (Gilbert & Feigon, 1999). Les

séquences télomériques (TTAGGG)n étant riches en G peuvent former

spontanément une structure en G4 in vitro mais aussi in vivo (Duquette et al, 2004;

Paeschke et al, 2005). D’autre part, les séquences répétées présentant une alternance

régulière entre purines et pyrimidines peuvent adopter une structure en hélice gauche

avec un arrangement en zigzag de la structure centrale de la molécule d’ADN

(ADN-Z) (Rich et al, 1984). Par ailleurs, les séquences susceptibles d’adopter des

structures en ADN-Z sont abondantes dans le génome humain puisqu’elles seraient

présentes toutes les 3000 pb (Hamada & Kakunaga, 1982; Schroth et al, 1992). En

outre, ces séquences peuvent induire dans les cellules humaines de larges délétions

indépendamment de la réplication (Wang et al, 2006a). Par conséquent, il est possible

que ce type de structure en ADN-Z soit clivé par des nucléases spécifiques, conduisant

à la formation de cassures double-brin de l’ADN qui pourraient être réparées par

NHEJ (Wang et al, 2006a). Ces données permettent notamment d’expliquer la

co-localisation entre les séquences capables d’adopter des structures en ADN-Z et les

points de cassures sur des gènes importants dans le développement de certaines

maladies (Adachi & Tsujimoto, 1990; Rimokh et al, 1990; Seite et al, 1993; Wolfl et

al, 1995).

L’ADN, particulièrement chez les eucaryotes supérieurs, est naturellement riche en

séquences répétées (Cox & Mirkin, 1997; Schroth & Ho, 1995). Ces séquences répétées ont

été fortement étudiées ces dernières années. Ces recherches ont permis de mettre en évidence

une douzaine de maladies héréditaires causées par une expansion de séquences répétées telles

que la maladie de Huntington, la Dystrophie myotonique et le retard mental associé au

chromosome X ((Pearson et al, 2005), et pour revue, (Mirkin & Mirkin, 2007)). C’est

pourquoi la réplication et la stabilité de ces séquences particulières ont attiré l’attention de


34

nombreux scientifiques et ont remis au goût du jour l’étude des structures secondaires de

l’ADN.

De nombreuses évidences, à la fois in vitro et in vivo, indiquent que la formation de

structures secondaires d’ADN telles que les épingles à cheveux, les triplex et les G4 pourrait

perturber la réplication. In vitro, de nombreuses ADN polymérases sont inhibées par des

séquences RI, (Bedinger et al, 1989; Sherman & Gefter, 1976; Weaver & DePamphilis,

1982), par des G4 (Usdin & Woodford, 1995; Weitzmann et al, 1997; Woodford et al, 1994),

par des séquences RM (Baran et al, 1991; Dayn et al, 1992; Krasilnikov et al, 1997). Bien que

les structures secondaires de l’ADN puissent se former facilement sans contrainte lorsque

l’ADN est sous forme simple-brin, elles ne sont pas favorisées lorsque l’ADN est sous forme

double-brin. Il s’avère donc peu probable d’observer ce genre de structures in vivo.

Cependant, au cours de la réplication, le brin discontinu se trouve transitoirement sous forme

d’ADN simple-brin, permettant la formation de telles structures secondaires. Ces structures

peuvent ensuite perturber l’ADN polymérase répliquant le brin discontinu et par la suite

bloquer toute la fourche de réplication puisque les brins continu et discontinu sont liés. Des

délétions de séquences répétées chez E. coli ont été observées sur le brin discontinu

supportant le fait que des structures secondaires soient formées sur ce brin (Trinh & Sinden,

1991). In vivo, la formation de structures secondaires au niveau de séquences répétées induit

une inhibition de la réplication que ce soit chez la bactérie, chez la levure ou dans les cellules

de mammifères (Brinton et al, 1991; Samadashwily et al, 1997; Voineagu et al, 2008). En

accord avec ces données, la localisation et l’orientation des séquences répétées par rapport

aux origines de réplication ont des effets importants sur la fréquence et le type d’instabilité

(Miret et al, 1998; Samadashwily et al, 1997; Trinh & Sinden, 1991). De plus, la stabilité des

séquences répétées est fortement compromise suite à des mutations au niveau de gènes de la

réplication (Iyer et al, 2000; Spiro et al, 1999). Enfin, le déroulement de telles structures

feraient intervenir différentes ADN hélicases spécialisées telles que BLM, WRN ou BACH1

que nous étudierons plus tard dans ce manuscrit (p.99).

4. Les sites fragiles, régions du génome difficiles à répliquer

Les sites fragiles sont des régions du génome difficiles à répliquer et où se produisent

préférentiellement des cassures. De ce fait, ils constituent des obstacles à la réplication de

l’ADN. Ces sites fragiles sont classés en deux grands groupes : les sites fragiles rares (SFR)

qui sont présents dans moins de 5 % de la population et les sites fragiles communs (SFC)

qui sont présents chez tous les individus (Kremer et al, 1991; Sutherland et al, 1998).


35

Les SFR sont dus à des expansions d’éléments répétés tels que des di- ou

tri-nucléotides. Ces expansions sont anormales et peuvent être responsables de nombreuses

maladies. Par exemple, le premier SFR a été découvert chez des patients atteints d’un retard

mental associé au chromosome X. Ce syndrome rare dit de l’X-fragile est dû à une expansion

supérieure à 200 répétitions (CGG)n/(CCG)n dans la région 5’ non codante du gène FMR1

empêchant ainsi l’expression de la protéine FMRP et son rôle majeur dans le contrôle de la

traduction (Kremer et al, 1991). Le premier mécanisme moléculaire proposant comment ces

expansions de répétitions pouvaient se produire était basé sur le glissement des ADN

polymérases au cours de la réplication de telles séquences répétées (Kunkel, 1993).

Cependant, cette idée ne permet pas d’expliquer la taille des expansions. Il est important de

noter que toutes les répétitions sujettes à des amplifications sont capables d’adopter des

structures secondaires de l’ADN (McMurray, 1999), telles que des épingles à cheveux ou des

G4, qui pourraient bloquer la réplication. L’inhibition de la réplication ne peut cependant pas

être la seule cause de cette fragilité chromosomique. La méthylation de l’ADN et

l’hétérochromatinisation résultante sur une large région d’ADN autour de l’expansion de

tri-nucléotides retardent la réplication sur des kilobases et contribuent de cette manière à la

fragilité observée dans des cellules dérivées de patients atteints de maladies à expansion de

triplets (Hansen et al, 1993; Subramanian et al, 1996). Les mécanismes possibles de

réplication, de réparation et de recombinaison de ces expansions de répétitions sont présentées

dans une revue de Sergei Mirkin (Mirkin, 2007). Ils ne seront pas détaillés dans ce manuscrit

par souci de clarté.

Il existe environ une centaine de SFC connus à ce jour dont la taille varie entre

plusieurs centaines et plusieurs milliers de kilobases. Contrairement aux sites fragiles rares,

les SFC sont des constituants normaux des chromosomes et ne sont pas le résultat d’une

expansion de répétitions de nucléotides. Dans les cellules en culture, les cassures au niveau de

nombreux SFC sont induites spécifiquement et de manière reproductible par de faibles doses

d’aphidicoline, un inhibiteur des ADN polymérases réplicatives (Glover et al, 1984). D’autres

SFC sont fragilisés après traitement des cellules avec différents inhibiteurs de la réplication,

tel que l’hydroxyurée (HU) ou avec des inhibiteurs du mécanisme du folate, ces deux

traitements déséquilibrant le pool de dNTP. A présent, il existe 76 SFC fragilisés par

l’aphidicoline. Le premier à avoir été cloné est le plus « fragile » du génome : FRA3B situé

en 3p14 .2 (Boldog et al, 1994; Ohta et al, 1996; Wilke et al, 1994). D’autres sites fragiles

communs sont aussi très fréquemment cassés, notamment dans les cancers, comme FRA16D

(16q23), FRA6E (6q26), FRA7H (7q32.3) (pour revue, (Durkin & Glover, 2007)). Les


36

paragraphes suivants traitent des SFC, de leurs caractéristiques et des mécanismes

d’expression et de réparation associés.

a- Les SFC sont instables en culture et dans les cellules cancéreuses

L’expression d’un site fragile représente la fréquence avec laquelle il est observé sur

des métaphases étalées : il peut être amplifié, délété ou transloqué (Coquelle et al, 1997). Les

cassures au niveau de ces sites étant induites par différents inhibiteurs de la réplication,

ceci suggère donc qu’une inhibition de la réplication puisse être une source de la fragilité

chromosomique. En fait, la fragilité chromosomique est un terme cytogénétique utilisé pour

décrire des chromosomes humains en métaphase présentant des cassures ou des trous (gaps)

qui se produisent dans des conditions de stress réplicatif.

En plus des cassures chromosomiques observées sur chromosomes étalés en

métaphases, les SFC présentent d’autres caractéristiques : après induction par l’aphidicoline,

ce sont des points chauds d’échange entre chromatide sœurs, révélant des évènements de

recombinaison homologue entre chromatides dus aux cassures de l’ADN. Ainsi les SFC

seraient des régions hyper-recombinogènes, ce qui expliquerait qu’ils peuvent conduire

à des amplifications, des délétions ou des translocations (Glover & Stein, 1987).

De nombreuses études ont montré que les SFC étaient des régions fréquemment

réarrangées dans les cellules cancéreuses. Les réarrangements les plus fréquents sont une

ou des délétions importantes de dix à cent kilobases dans les régions contenant les SFC,

conduisant ainsi à l’inactivation des gènes associés. Par exemple, les deux SFC les plus

étudiés et les mieux caractérisés sont FRA3B et FRA16D qui sont situés sur de grands gènes

suppresseurs de tumeurs, FHIT et WWOX, respectivement.

b- Les SFC sont répliqués tardivement

Une des caractéristiques majeures des SFC est leur réplication tardive comme cela a

pu être montré pour FRA3B (Le Beau et al, 1998), FRA16D (Palakodeti et al, 2004) et

FRA7H (Hellman et al, 2000). Le modèle proposé est que la réplication soit initiée

correctement au niveau des SFC mais que le processus de réplication soit plus long dans

ces régions, laissant des régions d’ADN non répliquées et favorisant de ce fait les cassures. Il

est possible que les SFC, comme les SFR, adoptent des structures secondaires qui pourraient

inhiber la progression des fourches de réplication. En effet, il a récemment été décrit que le

site FRA16D pouvait former une structure en cruciforme (Zhang & Freudenreich, 2007).


37

D’autres facteurs influençant la dynamique de réplication tels que l’organisation ou le choix

des origines de réplication pourraient être responsables de la réplication tardive des SFC.

La réplication du site fragile FRA7H est particulière puisqu’elle a lieu à différents

moments de la phase S : le centre de ce site étant répliqué en premier. Cette observation

suggère que la réplication soit initiée au centre de ce site de manière bi-directionnelle

(Hellman et al, 2000). D’autre part, les allèles de FRA7H sont répliqués de manière

asynchrone. Ce résultat pourrait être expliqué par la formation de structures secondaires sur

l’un ou l’autre des allèles de manière aléatoire, retardant par conséquent la réplication

(Hellman et al, 2000).

Enfin, le groupe de Michelle Debatisse a proposé que les SFC puissent faire partie

intégrante du point de contrôle de phase G2/M. En effet, leur réplication signalerait que toute

la réplication a eu lieue et que l’entrée en mitose peut avoir lieue (Debatisse et al, 2006).

Des études complémentaires sont nécessaires pour comprendre le mécanisme à

l’origine du délai de réplication observé.

c- L’origine de l’instabilité au niveau des SFC

Nous avons vu que les SFC sont induits par des inhibiteurs de la réplication.

L’hypothèse la plus simple est donc que les cassures observées au niveau des SFC soient dues

à une inhibition de la réplication au niveau de ces séquences. Le mécanisme moléculaire

expliquant cette situation n’est pas encore complètement connu mais elle est certainement due

à la séquence d’ADN composant ces SFC et à leur réplication tardive.

Les SFC contiennent des séquences relativement riches en AT (Arlt et al, 2002;

Boldog et al, 1994; Mishmar et al, 1998; Ried et al, 2000). Un programme informatique,

FlexStab (Mishmar et al, 1998) permet de mesurer la variation de l’angle de rotation entre des

nucléotides appariés et permet de ce fait d’identifier des zones de haute flexibilité appelé pics

de flexibilité. Différents SFC ont été étudiés via cet algorithme et ils contiennent tous un

grand nombre de pics de flexibilité (Arlt et al, 2002; Ferber et al, 2004; Limongi et al, 2003;

Mishmar et al, 1998; Ried et al, 2000; Zlotorynski et al, 2003). Il est important de souligner

que ces études ont été faites uniquement à partir d’un programme informatique et que de plus

amples investigations sont nécessaires pour les valider. Plus récemment, il a été montré

qu’une petite région, riche en AT et de haute flexibilité, située dans le SFC FRA16D


38

augmenterait la fragilité chromosomique contrairement à d’autres séquences de haute

flexibilité ou proches de pics de flexibilité (Zhang & Freudenreich, 2007). En outre,

l’accumulation des fourches de réplication bloquées au niveau de cette séquence serait

dépendante de la longueur en AT. Il est important de noter que de telles séquences riches en

AT sont susceptibles d’adopter des structures secondaires en épingle à cheveux ou en

cruciforme capables de bloquer la réplication (Zhang & Freudenreich, 2007). En accord avec

ces données, de larges délétions de 200 à 600 kb dans le site FRA3B, éliminant différents pics

majeurs de flexibilité, réduisent la fragilité de ce site, mais toutefois ne l’abolissent pas

complètement (Durkin & Glover, 2007). L’ensemble de ces résultats indiquent donc que

l’expression des SFC serait due à certaines séquences situées dans ces régions particulières du

génome.

L’aphidicoline est un moyen efficace pour induire l’expression des SFC et il est connu

que cette drogue induit un découplage entre ADN polymérases et ADN hélicases dans des

extraits d’œufs de xénope in vitro (Byun et al, 2005; Cortez, 2005; Walter & Newport, 2000).

Ainsi, une hypothèse serait qu’après inhibition partielle des ADN polymérases réplicatives au

niveau des SFC, le découplage entre ADN polymérases et hélicases induirait la formation

de longs segments d’ADN simple-brin, riches en AT, susceptibles de former des structures

secondaires. Ces conformations d’ADN non-B pourraient par la suite bloquer le complexe de

réplication, le destabiliser et donc induire les cassures d’ADN et les évènements de

recombinaison observés au niveau des SFC. Cependant, des études démontrant cette

hypothèse doivent encore être menées.

d- Les protéines des points de contrôle régulent l’expression des SFC

La régulation des sites fragiles communs est encore mal connue. Cependant, ces

dernières années, de nombreuses études ont permis d’impliquer les protéines intervenant au

niveau des points de contrôle du cycle cellulaire dans la régulation des SFC.

D’une part, ATR jouerait un rôle dans la stabilité des SFC (Casper et al, 2002). En

effet, l’expression des SFC est augmentée dans des cellules déficientes en ATR traitées par de

faibles doses d’aphidicoline. De plus, l’inhibition seule d’ATR, dans des conditions normales

de croissance, est capable d’induire des cassures au niveau des SFC. Ces résultats démontrent

qu’ATR est donc nécessaire pour la stabilité des SFC et suggèrent qu’un certain nombre de

fourches de réplication sont normalement bloquées au niveau des SFC et reconnues par ATR.


39

Il est important de souligner que l’hélicase WRN que nous étudierons plus en détails dans le

manuscrit, agirait dans la même voie qu’ATR pour maintenir la stabilité des sites fragiles

communs (Pirzio et al, 2008). L’activité hélicase de WRN pourrait notamment permettre de

dérouler les structures secondaires de l’ADN formées au niveau des SFC (Pirzio et al, 2008).

Par contre, des cellules déficientes en ATM ne présentent pas d’augmentation

d’expression des SFC dans des conditions normales de croissance ou après traitement à

l’aphidicoline (Casper et al, 2002). Cependant, une étude récente démontre qu’ATM est

activée, de manière indépendante de la présence d’ATR, dans des conditions qui permettent

d’exprimer les SFC. En revanche, le rôle d’ATM au niveau des SFC n’est révélé qu’en

absence d’ATR (Ozeri-Galai et al, 2008). Ce résultat peut s’expliquer par le rôle d’ATM

dans la signalisation des CDB générées au niveau des SFC en absence d’ATR mais aussi par

le fait qu’ATM puisse compenser la fonction d’ATR en son absence. Cette dernière hypothèse

est supportée par une étude démontrant, qu’après arrêt de la réplication suite à un traitement

hydroxyurée (HU), l’absence d’ATR induit un recrutement plus important d’ATM à la

chromatine (Cuadrado et al, 2006). D’autre part, les deux kinases, ATR et ATM, sont

capables de phosphoryler et donc d’activer la protéine Chk1 dans des conditions d’expression

des SFC (Ozeri-Galai et al, 2008). Or, l’inhibition de Chk1 augmente l’expression des SFC

(Durkin et al, 2006) et ainsi, l’effet d’ATM sur l’activation de Chk1 est certainement un

élément important pouvant expliquer le rôle indirect d’ATM au niveau des SFC. Un autre

argument allant dans ce sens concerne le fait que Chk2, phosphorylé par ATM en réponse aux

CDB, n’a pas d’influence sur la stabilité des SFC, que ce soit en présence ou en absence de

Chk1 (Durkin et al, 2006). Cependant, il faut noter que Chk2 est tout de même phosphorylé

dans des conditions qui permettent l’expression des SFC (Durkin et al, 2006). Ces résultats

suggèrent donc que Chk2 ne joue pas un rôle dans la régulation des SFC. En revanche, il

pourrait intervenir après leur expression pour stabiliser les fourches de réplication et permettre

la réparation des cassures.

Un autre substrat d’ATR, le suppresseur de tumeur BRCA1, a été impliqué dans le

maintien de la stabilité des SFC via son rôle au niveau du point de contrôle G2/M (Arlt et al,

2004). La protéine FANCD2, dont l’inactivation est impliquée dans l’anémie de Fanconi que

nous verrons plus en détails plus tard dans ce manuscrit, est aussi phosphorylée par ATR

(Andreassen et al, 2004). Lorsque FANCD2 est inactivée par interférence ARN, la stabilité

des SFC est compromise puisqu’une augmentation des cassures de trois à cinq fois au niveau


40

des SFC est observée (Howlett et al, 2005). Ces résultats soulignent donc l’importance de la

voie de l’anémie de Fanconi dans la réponse à un stress réplicatif dépendante d’ATR, et

démontrent aussi son rôle dans le maintien de la stabilité des SFC.

SMC1, une protéine impliquée dans le maintien de la structure des chromosomes, est

aussi phosphorylée par ATR et cette forme phosphorylée joue un rôle au niveau de la stabilité

des SFC (Musio et al, 2005).

La protéine Hus1 fait partie du complexe 9-1-1, lequel forme un anneau semblable à

PCNA qui est chargé sur l’ADN au niveau des sites de dommages et qui permet la

phosphorylation des substrats d’ATR (Parrilla-Castellar et al, 2004). L’absence de cette

protéine chez la souris induit une augmentation des cassures spontanées et induites par

l’aphidicoline au niveau des SFC (Zhu & Weiss, 2007).

Tous ces résultats démontrent bien l’importance de la protéine ATR pour le maintien

des sites fragiles communs.

e- Les mécanismes de réparation de l’ADN impliqués aux SFC

Nous venons de voir que les SFC sont des régions génomiques qui sont fréquemment

cassées et réarrangées suite à un stress réplicatif et que la voie de signalisation dépendante

d’ATR intacte est requise pour le maintien de leur stabilité. Toutes ces découvertes ont permis

de formuler l’hypothèse que les séquences fragiles présenteraient des difficultés au cours de la

réplication et que les cassures observées au niveau des SFC résulteraient de la réplication

tardive ou incomplète de ces régions qui laisserait des zones d’ADN simple-brin sur le brin

néo-synthétisé (Fig 6).


41

Figure 6. Modèle pour l’expression des sites fragiles communs. Lorsque la réplication est bloquée ou ralentie par traitement à l’aphidicoline par exemple, un découplage entre ADN polymérases et hélicases induit la formation de longs segments d’ADN simple-brin. Ces régions d’ADN simple-brin sont reconnues par la protéine du point de contrôle de phase S ATR qui va phosphoryler différents substrats (Chk1, BRCA1, FANCD2, SMC1, Hus1). D’autre part, les sites fragiles étant des séquences riches en AT, il est possible que, sous forme d’ADN simple-brin, ils adoptent une structure secondaire en cruciforme. Suite à l’effondrement des fourches de réplication bloquées sur cet ADN non-B, la réparation de ces régions est ensuite assurée soit par recombinaison homologue (HR) soit par jonction d’extrémités non-homologues (NHEJ). Ces mécanismes permettent alors de redémarrer les fourches de réplication. Cependant, ces régions peuvent parfois échapper aux points de contrôle du cycle cellulaire ou ne pas être réparées correctement, conduisant à des délétions ou des translocations. (Adapté de (Durkin & Glover, 2007; Zhang & Freudenreich, 2007))

La présence de délétions et/ou de réarrangements chromosomiques dans les cellules en

culture soumises à un stress réplicatif, ou dans les cellules tumorales, suggère fortement que

des CDB puissent se produire au niveau des SFC. Il est connu que le mécanisme de

recombinaison homologue (HR) joue un rôle majeur dans la résolution des CDB au cours des

phases S et G2, lorsque la chromatide sœur est présente. En moyenne, 70% des cassures

observées au niveau du site fragile FRA3B après traitement à l’aphidicoline, conduisent à des

échanges entre chromatides sœurs (Glover & Stein, 1987). Ces derniers reflètent des

Pol α

Inhibition de la réplication - Découplage Polymérases/Hélicases - Présence de simple-brin d’ADN

Pol ε

RPA

ATR

P-Chk1

- Redémarrage de la réplication - Réparation par HR ou NHEJ Délétions ou translocations

Pol α

Pol ε Pol α

Pol ε

P

Hélicases

FANCD2

Hélicases Cassure simple-brin d’ADN

Cassure double-brin d’ADN

- Effondrement de la fourche de réplication - Réparation ou signalisation déficiente

- Formation d’une structure secondaire de l’ADN - Activation des protéines des points de contrôle - Blocage de la fourche de réplication P

P P SMC1

BRCA1

Hus1

Chapitre I C. Réponses aux blocages des fourches de réplication

42

évènements de HR entre chromatides sœurs avec crossing-over. Ce résultat suggère que la

HR soit impliquée pour réparer les cassures survenant aux SFC. Plus récemment, il a été

montré qu’après traitement à l’aphidicoline, la protéine majeure de la HR, la recombinase

RAD51, se localise en foyers et que la protéine majeure du mécanisme de recombinaison par

NHEJ, la kinase DNA-PKcs, est phosphorylée (Schwartz et al, 2005). La diminution de

l’expression de RAD51 ou de DNA-PKcs, par interférence ARN, favorise l’expression des

SFC dans des conditions de stress réplicatif (Schwartz et al, 2005). D’autre part, ce stress

réplicatif induit la formation de foyers γ-H2AX, une protéine marqueur des CDB, foyers qui

co-localisent avec RAD51 et DNA-PKcs. Il est intéressant de noter que γ-H2AX et la

DNA-PKcs sont localisés au niveau des SFC cassés sur les chromosomes en métaphases

(Schwartz et al, 2005). En outre, dans des conditions normales de croissance sans stress

réplicatif, seule la déficience en RAD51 induit l’expression des SFC contrairement à la

déficience en DNA-PKcs (Schwartz et al, 2005). Ce résultat suggère que la HR assiste la

réplication sur des régions difficiles à répliquer comme les SFC.

C. Réponses aux blocages de fourches de réplication

Nous venons de voir que les fourches de réplication pouvaient être bloquées par de

nombreux obstacles, tels que les lésions de l’ADN ou les zones difficiles à répliquer. Les

points de contrôle, que nous avons vu précedemment, arrêtent le cycle cellulaire afin de

permettre à la cellule de réparer ou de répliquer ces lésions. Parmi les nombreux mécanismes

de réparation et de réplication par tolérance des lésions, nous allons en détailler deux, la

recombinaison homologue et la synthèse translésionnelle, qui permettent de redémarrer les

fourches de réplication bloquées.

1. La recombinaison homologue de l’ADN

Deux mécanismes majeurs permettent de réparer les cassures double-brin de l’ADN

(CDB) : i) le mécanisme de jonction d’extrémités non-homologues (NHEJ) qui relie deux

extrémités ne présentant pas forcément d’homologie entre elles et qui intervenant

majoritairement en phase G1 ; ii) le mécanisme de recombinaison homologue (HR) qui

lui nécessite une séquence homologue intacte et qui a lieu en phase S/G2 en présence de la

chromatide sœur (pour revue, (Delacote & Lopez, 2008)). Dans ce manuscrit, nous allons


43

nous intéresser particulièrement à la HR. Ce procédé est conservé de la bactérie à l’homme

(Helleday, 2003). Les cellules déficientes pour la HR ont premièrement été découvertes via

leur sensibilité aux radiations ionisantes, suggérant que les CDB laissant deux terminaisons

libres (Fig 7A) sont des substrats de la HR (Fuller & Painter, 1988; Jones et al, 1987; Liang et

al, 1998; Thacker & Zdzienicka, 2003). En outre, une CDB peut être la conséquence d’une

collision entre une fourche de réplication et une cassure simple-brin de l’ADN (CSB) non

réparée (Fig 7B) (Arnaudeau et al, 2001). Le mécanisme de HR est aussi impliqué dans la

réparation des fourches de réplication bloquées, même en absence de CDB détectables

(Lundin et al, 2002). Dans ce cas, le substrat de la HR n’est pas vraiment connu. Cependant,

chez la bactérie les brins néo-synthétisés au cours de la réplication peuvent s’apparier et

conduire à une réversion de fourche formant une structure en « Chicken foot » (Fig 7C)

qui pourrait être utilisée comme substrat de HR (McGlynn & Lloyd, 2002).

Figure 7. Les différents substrats de recombinaison homologue. (A) Cassure double-brin

de l’ADN laissant deux extrémités libres pouvant toutes deux initier la HR. Il s’agit du substrat classique de la HR. (B) Cassure simple-brin de l’ADN non réparée avant la réplication et donc convertie en cassure double-brin pouvant initier la HR à partir d’une extrémité libre. (C) Fourche de réplication bloquée par une lésion non réparée avant la réplication, une régression de fourche formant une structure en « Chicken foot » peut alors initier la HR. (Adapté de (Helleday, 2003))

a- Un pré-requis pour la HR : la dégradation de l’extrémité 5’

La première étape des réactions de HR au niveau d’une CDB nécessite une

dégradation nucléolytique de l’extrémité 5’ de l’ADN (Sun et al, 1991; White & Haber,

1990).

5’

5’

3’

3’

5’

3’

3’ 5’

3’

3’

5’

3’

3’

5’

5’

5’

A/ Cassure double-brin

B/ Fourche de réplication rencontrant une cassure simple-brin

C/ Fourche de réplication bloquée, régression de fourche


44

Figure 8. Modèle du mécanisme de recombinaison homologue au niveau d’une cassure

double-brin de l’ADN. Les deux extrémités de la cassure double-brin sont reconnues et maintenues ensemble par le complexe MRN. La dégradation des extrémités 5’ nécessite l’activité de MRN et d’autres nucléases. Les extrémités 3’ sortantes sont alors recouvertes par RPA et deviennent alors des substrats pour la formation de nucléo-filaments de Rad51, impliquant Rad52, Rad54, Rad55, Rad57. La recherche d’homologie et l’invasion de brin conduisant à la formation d’une D-loop peut alors avoir lieu. (Adapté de (Pardo et al, 2009))

Les données accumulées au cours des dernières années ont permis de mettre en

évidence que toutes les protéines du complexe MRX chez la levure (MRN dans les cellules

humaines) sont impliquées au niveau des CDB (Bressan et al, 1999; Johzuka & Ogawa, 1995;

Lee et al, 1998). La nucléase Mre11 pourrait réaliser l’étape de dégradation du simple-brin

MRN MRN

MRN MRN

Nucléase

RPA RPA

Rad51

Rad55/Rad57 Rad54

Rad51

Rad55/Rad57 Rad54

Reconnaissance de la cassure double-brin

Dégradation de l’extrémité 5’

Liaison de RPA sur l’ADN simple-brin

Formation du nucléo-filament RAD51

Invasion du brin homologue et formation de la D-Loop

Rad52

Rad52

5’

RPA RPA

RPA RPA

CDB 5’

3’

3’


45

d’ADN en 5’ (Moreau et al, 1999; Trujillo et al, 1998). Cependant, Mre11 présente une

activité exonucléase de polarité 3’-5’ in vitro contrairement à l’activité 5’-3’ nécessaire pour

dégrader les extrémités des CDB. De plus, la dégradation des CDB non modifiées est ralentie

mais non abolie dans les cellules déficientes en MRN (Ivanov et al, 1994). L’activité nucléase

de Mre11 serait tout de même nécessaire pour la réparation des CDB induites par des agents

endommageant l’ADN (Bressan et al, 1999; Johzuka & Ogawa, 1995; Moreau et al, 1999;

Moreau et al, 2001). Il a donc été proposé que Mre11 soit impliquée au niveau des CDB

présentant des extrémités modifiées non clivées par les autres nucléases (Llorente &

Symington, 2004). Ceci pourrait être le cas au niveau des CDB induites par les radiations

ionisantes, dont les extrémités peuvent contenir des bases modifiées. De plus, l’absence de

Nbs1 (une des protéines du complexe MRN chez les vertébrés) induit une baisse de

conversion génique suite à une CDB (Tauchi et al, 2002), indiquant que MRN serait essentiel

pour la HR. La fonction du complexe MRX pourrait aussi être structurale puisque la protéine

Rad50 faisant partie de ce complexe est capable de lier les deux extrémités d’ADN (Fig 8)

(Lisby et al, 2003; Lobachev et al, 2004). Cette liaison permettrait alors de maintenir les deux

extrémités proches l’une de l’autre ou proches de la séquence homologue afin de faciliter la

réparation par HR (Hopfner et al, 2002). Ainsi, le complexe MRN serait important lors des

premières étapes de la HR même s’il n’est pas directement impliqué dans l’étape de

dégradation des extrémités 5’. La protéine Sae2 chez la levure S. cerevisiae (CtIP dans les

cellules humaines ou Ctp1 chez S. pombe) est aussi impliquée avec le complexe MRN au

niveau des CDB (McKee & Kleckner, 1997; Sartori et al, 2007). Sae2 présente une activité

endonucléase sur l’ADN simple-brin mais joue aussi un rôle au niveau des transitions

simple-brin/double-brin in vitro (Lengsfeld et al, 2007). Comme pour Mre11, Sae2 ne

réaliserait pas directement la dégradation en 5’. Une possibilité serait que Mre11-Sae2

prépare le substrat puis active ou recrute une autre nucléase qui dégrade à son tour

l’extrémité 5’ (Moreau et al, 2001). La protéine Exo1, possédant une activité exonucléase

5’-3’ pourrait intervenir dans ce processus (Llorente & Symington, 2004; Tsubouchi &

Ogawa, 2000). En effet, la surexpression de Exo1 supprime les défauts de réparation des CDB

observés dans les cellules déficientes en MRX (Moreau et al, 2001). En conclusion, les

protéines du complexe MRN mais aussi les protéines Sae2 et Exo1 sont importantes pour la

dégradation des extrémités 5’ des CDB, conduisant à la formation d’une extrémité 3’.

Il est important de souligner que la dégradation des extrémités des CDB est régulée au

cours du cycle cellulaire. En effet, elle est inefficace en phase G1 alors qu’elle est active en

phase S et G2, moment où la chromatide sœur est présente (Aylon et al, 2004; Ferreira &


46

Cooper, 2004; Ira et al, 2004). La chromatide sœur est la matrice la plus adéquate pour la

HR puisqu’elle permet une réparation fidèle alors que l’utilisation du chromosome

homologue ou d’une région ectopique compromet la stabilité du génome. En outre, un

rôle des CDK dans la régulation de la dégradation des extrémités des CDB au cours du cycle

cellulaire est bien établi (Aylon et al, 2004; Ferreira & Cooper, 2004; Ira et al, 2004). En

effet, Cdc28, chez la levure, est active en phases S et G2 et permet la dégradation des

extrémités induisant de ce fait un processus de HR (Aylon et al, 2004; Ferreira & Cooper,

2004; Ira et al, 2004). Plus récemment, une nouvelle protéine CtIP semble être un

régulateur clé du choix entre les différents mécanismes de recombinaison. En effet, la

quantité de CtIP est faible en phase G1 alors qu’elle est beaucoup plus forte en phase S que ce

soit chez l’homme ou chez la levure (Limbo et al, 2007; Yu & Baer, 2000). Comme nous

venons de le voir, la protéine CtIP interagit avec le complexe MRN et participe à la

dégradation des extrémités des CDB (Sartori et al, 2007). En outre, CtIP est aussi la cible de

kinases transductrices des points de contrôles (Li et al, 2000). La phosphorylation de CtIP sur

la thréonine 847 est importante pour la dégradation des extrémités 5’ mais aussi pour la

réparation des CDB (Huertas & Jackson, 2009). En outre, CtIP phosphorylée peut interagir

avec de nombreux facteurs cellulaires parmi lesquels BRCA1 (Wong et al, 1998). BRCA1 est

une grosse protéine qui contient plusieurs domaines d’interaction avec d’autres protéines et

qui est impliquée dans de nombreux mécanismes cellulaires comme la réponse aux dommages

de l’ADN. En outre, BRCA1 est recrutée aux sites de dommages de l’ADN par le complexe

MRN et peut former un complexe avec MRN et CtIP en phase S et G2 (Chen et al, 2008).

Ceci a été confirmé récemment puisque la phosphorylation de CtIP sur la sérine 327 au

moment où les cellules entrent en phase S permet de recruter BRCA1 et donc d’induire une

augmentation de la recombinaison homologue au détriment du NHEJ (Yun & Hiom, 2009).

b- La formation d’une D-loop et l’échange de brin

L’invasion du duplex homologue pour permettre l’appariement de l’extrémité 3’

sortante avec un brin du duplex nécessite le déplacement du deuxième brin d’ADN du duplex,

une réaction appelée échange de brin. L’appariement ainsi formé avec le brin envahissant

constitue une D-loop (Fig 8). Ces réactions sont majoritairement réalisées par un filament

nucléo-protéique composé de l’extrémité 3’ sortante couverte de la protéine recombinase

RAD51 (McIlwraith et al, 2000). L’assemblage de RAD51 nécessite que l’extrémité

simple-brin soit dans un premier temps recouverte par RPA (Song & Sung, 2000). En effet,

RPA se lie au niveau de l’ADN simple-brin juste après la dégradation des extrémités 5’ et


47

interagit directement avec RAD52 (Lisby et al., 2004 ; Hays et al., 1998). La protéine Rad52

chez la levure, interagit aussi avec Rad51 et permet de faciliter le chargement de Rad51 sur

l’ADN simple-brin en déplaçant RPA (Song & Sung, 2000). Or, la protéine RAD52 humaine

peut lier directement les CDB, les protèger contre l’action d’exonucléases et faciliterait

seulement les interactions entre les extrémités de la CDB (Van Dyck et al, 1999). Ainsi, chez

les vertébrés, ce serait plutôt BRCA2 qui remplirait ce rôle dans l’invasion et l’échange de

brin (Davies & Pellegrini, 2007; Esashi et al, 2007). Les paralogues de Rad51 chez la levure,

Rad55 et Rad57, mais aussi Rad54, sont aussi des médiateurs de la formation du

nucléo-filament de Rad51, mais leurs rôles précis restent encore flous. Les protéines Rad55 et

Rad57 formeraient un hétérodimère qui stabiliserait le filament et de ce fait faciliterait

l’échange de brin (Sugawara et al, 2003; Sung, 1997). Rad54 participerait en fait à toutes les

étapes de la HR telles que le chargement de Rad51 sur l’ADN, la recherche d’homologie,

l’appariement avec la séquence homologue et la maturation des intermédiaires de

recombinaison formés après la D-loop (Bugreev et al, 2007b; Heyer et al, 2006; Sugawara et

al, 2003). Il est important de souligner que les souris déficientes en Rad51 ne sont pas viables

(Lim & Hasty, 1996; Tsuzuki et al, 1996). De plus, les patients déficients en BRCA2 sont

prédisposés aux cancers (Venkitaraman, 2000), indiquant que la HR est un processus vital

dans le contrôle de ces maladies.

Les réactions d’invasion et d’échange de brin ne sont pas très bien caractérisées.

Cependant, des études récentes à l’échelle de la molécule unique ont permis de mieux

détailler ces réactions. En effet, l’homologie de recherche aurait lieu par des collisions

aléatoires des deux molécules d’ADN (Ristic et al, 2005). Le filament RAD51 est une

structure dynamique et les étapes d’association et de dissociation de RAD51 sur l’ADN

pourraient avoir un rôle prépondérant dans la réaction d’échange de brin (Ristic et al, 2005). Il

a été estimé qu’un filament de Rad51 de 100 pb est requis pour que l’échange de brin soit

efficace (Ira & Haber, 2002). De plus, Rad54 a aussi été décrit comme un complexe de

remodelage de la chromatine et pourrait déplacer les nucléosomes afin de faciliter l’invasion

du duplex par le filament Rad51 (Amitani et al, 2006). L’appariement serait finalement

facilité par les fonctions d’appariement de Rad52 (Mortensen et al, 1996).

A partir de cette étape, plusieurs mécanismes de HR peuvent terminer la réparation. Ils

résulteront tous en un remplacement de la séquence cassée par une copie de la séquence

homologue utilisée pour la réparation. En fonction du mécanisme de HR utilisé, des échanges


48

réciproques ou cross-over peuvent se produire entre la séquence contenant la cassure et la

séquence homologue. Etant donné que la séquence homologue peut se trouver sur le

chromosome homologue ou sur une autre région chromosomique présentant suffisamment

d’homologie, les cross-over peuvent induire des pertes d’hétérozygotie (LOH) ainsi que des

réarrangements tels que des translocations, des duplications ou des inversions.

c- Les mécanismes de HR avec et sans cross-over

Lorsque les deux extrémités de la CDB présentent une homologie avec la matrice

utilisée pour la réparation, la cassure est généralement réparée par conversion génique

(CG). Les deux extrémités 5’ vont être dégradées et les ADN simple-brin résultant couverts

par RAD51. Comme nous venons de le voir, d’autres facteurs de la HR vont engager les deux

séquences homologues avec la matrice de manière indépendante. Ainsi, une des extrémités

envahira le brin homologue et formera une D-loop avant la deuxième extrémité (Fig 9). La

synthèse d’ADN va alors permettre d’étendre la D-loop et permettre de reconstituer les

séquences perdues lors de la cassure.

Il est intéressant de noter que la surexpression de RAD51 suffit à stimuler les CG dans

les cellules humaines (Arnaudeau et al, 1999; Huang et al, 1999b; Lambert & Lopez, 2000;

Vispe et al, 1998). En revanche, l’expression de formes dominantes négatives de RAD51

inhibe quasiment complètement les CG (Lambert & Lopez, 2000). Ces données confirment

donc que RAD51 joue un rôle clé dans la régulation des CG. D’autre part, l’inhibition

prolongée de l’élongation de la réplication, contrairement à l’inhibition de l’initiation de la

réplication, induit des CDB qui stimulent la HR dépendante de RAD51 (Saintigny et al,

2001). Par ailleurs, le suppresseur de tumeur p53 stabiliserait les fourches de réplication et

ainsi inhiberait la HR dépendante de RAD51 après inhibition de l’élongation de la réplication,

afin de prévenir d’éventuels évènements de HR délétères (Saintigny & Lopez, 2002). En

outre, ce rôle serait indépendant du rôle de p53 dans l’arrêt du cycle cellulaire à la transition

G1/S (Boehden et al, 2003; Dudenhoffer et al, 1999; Saintigny et al, 1999; Willers et al,

2000). La HR serait donc importante pour redémarrer les fourches de réplication. En effet, il a

également été observé que la vitesse de réplication est ralentie dans différents mutants de la

HR dans des cellules d’ovaires d’hamster (CHO) (Daboussi et al, 2008).


49

Figure 9. Mécanisme de réparation des cassures double-brin par SDSA et DSBR.

(A) Dégradation des extrémités 5’. (B) Recherche d’homologie avec le duplex homologue en gris. (C) Invasion de brin et formation de la D-loop. (D) Mécanisme SDSA (Synthesis-dependant strand annealing). (E) Après élongation du brin néo-synthétisé (pointillé gris), déplacement du brin envahissant et hybridation avec l’autre extrémité de la CDB. (F) Clivage des séquences non homologues, remplissage de la brèche et ligation afin de former un produit sans cross-over. (G) Mécanismes DSBR (Double strand break repair). (H) Elongation (flèches en pointillés noirs et gris) et ligation des brins envahissants : formation de la double Jonction de Holliday. (I) Résolution de la JH. (J) Les différents clivages possibles sont indiqués I, II, III, IV. Les clivages I+II ou III+IV ne produisent pas de cross-over. Par contre les clivages I+IV ou II+III produisent des cross-over. (K) Dissolution des JH. (L) Migration de branche. (M) Décaténation. (Pardo et al, 2009)

CDB

Double JH

Pas de cross-over

I + IV Cross-over Pas de cross-over

JH résolution JH dissolution

I + II Pas Cross-over


50

i) Hybridation de brin dépendante de la synthèse (SDSA)

Le déplacement du brin néo-synthétisé hors de la D-loop offre la possibilité de

ré-hybrider les deux extrémités de la cassure ensemble via la nouvelle séquence

complémentaire synthétisée (Fig 9). Les séquences non impliquées dans cette hybridation sont

clivées et réparées, permettant à d’autres facteurs de compléter la brèche et de réaliser la

ligation des deux extrémités. Ce mécanisme est appelé hybridation de brin dépendante de

la synthèse (SDSA, Synthesis-dependent strand annealing) (Nassif et al, 1994). Le SDSA

n’induisant pas de cross-over participe au maintien de la stabilité du génome. Ce

mécanisme semble facilité par les ADN hélicases Sgs1 et Srs2 chez la levure et par des

hélicases de la famille RecQ telles que Bloom (BLM) dans les cellules humaines (Ira et al,

2003; Robert et al, 2006; Wu & Hickson, 2003). En effet, Srs2 et BLM sont capables de

déstabiliser les filaments de RAD51 (Bugreev et al, 2007b; Veaute et al, 2003). De plus, Srs2,

BLM mais aussi RAD54 peuvent déstabiliser les D-loop in vitro en facilitant la migration de

branche qui permet de rejeter le brin nouvellement synthétisé du duplex homologue (Bugreev

et al, 2007a; Bugreev et al, 2007b; Dupaigne et al, 2008).

ii) Réparation des cassures double-brin (DSBR)

Alternativement, l’élongation du brin nouvellement synthétisé et le déplacement du

duplex homologue conduisent à étendre la D-loop et permettent de cette façon la capture

de la deuxième extrémité de la cassure par appariement des séquences homologues

(Fig 9). La deuxième extrémité de la cassure peut aussi être allongée par synthèse d’ADN. De

plus, la remplissage complet de la brèche et la ligation vont créer une double structure à

quatre branches appelée Jonction de Holliday (JH). Les divers clivages possibles de ces JH

permettent d’obtenir des évènements de réparation des CDB (DSBR, Double Strand Break

Repair) avec ou sans cross-over (Szostak et al, 1983). La résolvase permettant de cliver les

JH a finalement été identifiée, il s’agit de la protéine appelée GEN1 dans les cellules

humaines ou Yen1 chez la levure (Ip et al, 2008). Ces nucléases permettent la résolution des

JH de manière analogue à la résolvase RuvC chez E. coli (West, 1997) en les clivant

symétriquement aux points de jonction afin de produire deux duplex dans lesquels les

extrémités clivées peuvent ensuite être liguées (Fig 10).


51

Figure 10. Résolution d’une jonction d’Holliday par la protéine RuvC. Les brins continus

d’ADN de la structure en X (A) qui forment de larges angles dans le complexe RuvC-Jonction non structuré (B) sont marqués par une étoile. Les sites de coupure sont indiqués par des ciseaux (B). Les produits de clivage (C) peuvent être réparés pas une ADN ligase. (West, 1997)

En outre, il a récemment été démontré que les JH pouvaient être « dissoutes » sous

l’action combinée d’une ADN hélicase et d’une ADN Topoisomérase (Fig 9). Cette

dissolution implique l’ADN hélicase humaine BLM qui facilite la migration de branche

formant une structure en hémi-caténane. Cette structure peut à son tour être résolue par

l’action de la topoisomérase TOPO III α (Wu & Hickson, 2003). Dans ce cas là, aucun

cross-over n’est observable. Une troisième protéine, BLAP75, pourrait permettre le

recrutement de BLM-TOPO III α au niveau des JH (Wu et al, 2006). Toutes ces protéines

sont conservées chez la levure (Sgs1, Top3, Rmi1) et les mutants individuels présentent les

mêmes phénotypes, suggérant que le mécanisme est similaire chez la levure (Kaliraman et al,

2001; Mullen et al, 2005).

Enfin, les D-loops peuvent aussi être clivées par les nucléases Mus81-Mms4 qui ont

une préférence pour les structures branchées (Fricke et al, 2005). Dans ce cas là, le produit

final présente toujours un cross-over dû au clivage spécifique de Mus81 (Osman et al, 2003).

Il est important de noter que ce mécanisme nécessite la présence du facteur de

processivité PCNA ainsi que les ADN polymérases Pol δ ou Pol ε (Holmes & Haber, 1999;

Wang et al, 2004b).

iii) Le mécanisme BIR (Break-induced replication)

Dans certaines circonstances, seule une extrémité de la CDB peut être utilisée pour la

réparation. Ceci se produit lorsqu’une seule extrémité de la CDB présente une homologie de

séquence avec une autre partie du génome ou lorsqu’une extrémité des CDB est perdue

(Fig 11). Les télomères qui ont perdu leurs séquences répétées télomériques peuvent aussi

générer des CDB avec une seule extrémité (Lundblad & Blackburn, 1993). Il est important de

Hybridation Clivage

B C A B


52

noter que les CDB avec une seule extrémité peuvent aussi être la résultante d’une fourche de

réplication effondrée. Par exemple, une fourche de réplication rencontrant une cassure

simple-brin va la convertir en CDB avec une seule extrémité sur une seule chromatide

(Helleday, 2003). Il n’est pas encore connu dans les cellules eucaryotes si ce type de CDB est

réparé immédiatement afin de permettre un redémarrage des fourches de réplication.

Dans le cas d’une CDB avec une seule extrémité disponible, la réparation peut

avoir lieu via le mécanisme BIR (Break-Induced Replication) (Morrow et al, 1997;

Voelkel-Meiman & Roeder, 1990). L’extrémité de la CDB envahit le brin homologue

(Fig 11A), initie la synthèse unidirectionnelle à partir du site d’invasion (Fig 11B) et réplique

le chromosome homologue jusqu’au télomère. Un des modèles de BIR implique la formation

d’une JH et son clivage résulterait en la réparation de la CDB associée avec une duplication

complète du bras du chromosome ayant servi de matrice (Fig 11D). Par conséquent, le BIR

induirait de large perte d’hétérozygotie s’il se produit entre chromosomes homologues.

En outre, de plus complexes réarrangements peuvent avoir lieu suite à des invasions de brins

et des dissociations au niveau de plusieurs séquences lors de mécanismes de BIR successifs

(Smith et al, 2007). Ceci pourrait notamment expliquer le fait que les D-loop soient

déstabilisées afin de faciliter le SDSA dans le cas d’une CDB avec deux extrémités, comme

nous l’avons vu précédemment.

Le BIR est largement dépendant de Rad51 (Davis & Symington, 2004; Malkova et

al, 2005). Ceci semble logique puisque la première étape du BIR consiste à envahir le brin

homologue et à former une D-Loop. De ce fait, les protéines Rad52, Rad54, Rad55 et Rad57

sont aussi requises pour le BIR (Davis & Symington, 2004; Malkova et al, 2005). Il a

récemment été montré que le BIR interviendrait aussi bien sur le brin continu que sur le brin

discontinu et que Pol δ et Pol ε mais aussi PCNA et Pol α seraient nécessaires (Lydeard et al,

2007). Ceci suggère donc que les divers facteurs cités ci-dessus aident à établir une fourche de

réplication complète au niveau du site d’invasion. Le BIR pourrait aussi être indépendant de

Rad51 dans des cas particuliers tels que les séquences répétées ou les répétitions inversées

(Bai & Symington, 1996; Kang & Symington, 2000; Malagon & Aguilera, 2001; Malkova et

al, 1996). Bien que le mécanisme d’invasion de brin en absence de Rad51 ne soit pas clair, il

est possible qu’un relâchement de l’ADN proche de la lésion permette de rares occasions

d’invasion de brin indépendantes de Rad51 (Aguilera, 2001).


53

iv) L’appariement simple-brin d’ADN (SSA)

Il semblerait que tant qu’une matrice homologue n’est pas trouvée pour la réparation

d’une CDB, la dégradation de 5’ vers 3’ peut se poursuivre sur des kilobases (pour revue,

(Pardo et al, 2009)). Dans le cas où la dégradation « découvre » des séquences répétées

directes, celles-ci peuvent s’hybrider afin de réparer la cassure (Fig 12A). Les séquences

simple-brin non impliquées dans l’hybridation sont dégradées par des nucléases (Fig 12B).

Les « discontinuités » qui en résultent sont complétées par synthèse d’ADN, puis les brins

sont liés entre eux par l’action d’ADN ligases (Fig 12C-D). Ce mécanisme de réparation des

CDB est appelé « appariement simple-brin d’ADN » (SSA, Single Strand Annealing) (Lin

et al, 1984). En outre, l’apparition de séquences répétées lors de la dégradation en 5’

impliquerait Rad52 qui est recruté par RPA (Fishman-Lobell et al, 1992; Hays et al, 1998;

Mortensen et al, 1996). Ce mécanisme nécessiterait aussi l’action de l’homologue de Rad52,

Rad59, qui interviendrait plutôt lorsque les régions d’homologie sont courtes ou interrompues

CDB : une seule extrémité

D-Loop

Figure 11. Mécanisme BIR pour réparer les cassures double-brin de l’ADN.

(A) Invasion de brin par une seule extrémité de la CDB et formation d’une D-loop

(B) Formation d’une fourche de réplication complète et élongation des brins (pointillés gris)

(C) Réplication complète du brin homologue et ligation : formation d’une Jonction de Holliday

(D) Résolution de la Jonction de Holliday (Pardo et al, 2009)


54

par des zones hétérologues (Bai & Symington, 1996). Les clivages nucléolytiques impliquent

les 3’ flap-endonucléases Rad1-Rad10 ainsi que Msh2, Msh3 et Slx4 (Fishman-Lobell &

Haber, 1992; Flott et al, 2007; Saparbaev et al, 1996). Finalement, les machineries de

réplication prendraient en charge les dernières étapes de synthèse d’ADN et de ligation (pour

revue, (Pardo et al, 2009)).

Le SSA est un mécanisme mutagène puisqu’il induit des délétions au niveau des

séquences répétées impliquées, mais surtout des délétions plus ou moins grandes des

séquences hétérologues comprises entre les répétitions. Cependant, le SSA n’est

probablement pas un mécanisme minoritaire de réparation des CDB vu le nombre important

de séquences répétées présentes dans les génomes eucaryotes.

v) Le mécanisme de « damage avoidance » ou de « template switching » (TS)

Comme nous l’avons analysé précédemment, de nombreux dommages peuvent être

présents sur l’ADN. En raison du site actif des ADN polymérases réplicatives plutôt « fermé »

et de leur activité de correction d’erreur, les lésions résiduelles n’ayant pas été réparées avant

la phase S, bloquent la réplication. Un des mécanismes permettant de débloquer la réplication

est le contournement du dommage (damage avoidance or template switching) qui utilise la

recombinaison homologue pour copier l’information génétique sur la chromatide sœur non

endommagée (Zhang and Lawrence, 2005). Une alternative est d’incorporer un nucléotide en

face du dommage, un processus appelé synthèse translésionnelle (TLS). Ces deux

mécanismes seront détaillés dans la partie suivante puisqu’ils nécessitent une modification

CDB

A

B

C

D

Figure 12. Mécanisme SSA pour réparer les cassures double-brin de l’ADN.

(A) Dégradation de 5’ vers 3’ et appariement intra-chromatide des séquences répétées (flèches grises)

(B) Clivages des séquences intermédiaires entres les deux régions homologues

(C) Remplissage des brèches (pointillés noirs) (D) Ligation

Ce mécanisme conduit à de larges délétions. (Pardo et al, 2009)


55

post-traductionnelle de l’anneau de processivité PCNA. Sans ces mécanismes, les risques

d’effondrement de fourches, d’aberrations chromosomiques et de mort cellulaire seraient

beaucoup plus dramatiques. Conceptuellement, les mécanismes de tolérance des dommages

de l’ADN sont différents des mécanismes de réparation de l’ADN puisque la lésion est

toujours présente après le passage des mécanismes de tolérance. Ainsi, ces mécanismes ont

été optimisés afin de permettre la survie cellulaire en privilégiant le redémarrage des fourches

de réplication au prix d’une information génétique moins fidèle.

2. La synthèse translésionnelle

La TLS est certainement le mécanisme de tolérance des lésions le plus utilisé par les

systèmes mammifères. La découverte dans les années 2000 d’une nouvelle famille d’ADN

polymérases (la famille Y) a profondément changé la perception de la TLS. En effet, il avait

été envisagé qu’en réponse aux dommages de l’ADN, les caractéristiques des ADN

polymérases réplicatives soient quelque peu compromises pour qu’elles puissent répliquer les

dommages (pour revue (Lehmann et al, 2007)). Il est maintenant évident que cette hypothèse

est fausse et que la TLS est réalisée par les ADN polymérases dites « spécialisées » qui sont

moins fidèles et qui sont plus ou moins spécifiques d’une lésion.

Dans les cellules de mammifères, ces ADN polymérases sont Pol eta (Pol η), Pol iota

(Pol ι), Pol kappa (Pol κ) et Rev1 pour la famille Y mais aussi Pol ζ pour la famille B.

D’autres ADN polymérases récemment découvertes (Pol θ, Pol μ, Pol ν, Pol λ) pourraient

aussi jouer un rôle dans la TLS mais leurs implications n’ont pas été fermement démontrées

(pour revue (Lehmann et al, 2007)).

En utilisant une ou plusieurs de ces ADN polymérases spécialisées, la cellule est donc

capable de répliquer la majorité des lésions de l’ADN.

a- Les ADN polymérases translésionnelles de la famille Y

Tous les membres de la famille Y contiennent cinq motifs conservés représentés en

couleur sur la figure 13. Ces domaines forment les différentes parties de la structure en main

droite des ADN polymérases : la paume, les doigts et le pouce comme nous l’avons vu pour

les ADN polymérases réplicatives. Les ADN polymérases TLS possèdent en plus un

domaine appelé « petit doigt » qui permet un contact supplémentaire avec l’ADN (Yang,

2005). La similarité structurale du domaine de la paume (en rouge sur la figure 13) entre les

ADN polymérases de la famille Y et les ADN polymérases réplicatives est remarquable

malgré une divergence importante en terme de séquence. Cette similarité démontre que le


56

mécanisme catalytique utilisé par toutes les ADN polymérases est conservé (Delarue et al,

1990; Doublie et al, 1998; Ollis et al, 1985). Par contre le domaine des doigts (en bleu sur la

figure 13) et du pouce (en vert sur la figure 13) sont très différents de ceux des ADN

polymérases des familles A et B (pour revue, (Prakash et al, 2005)). Le site actif des ADN

polymérases de la famille Y est plus ouvert que celui des ADN polymérases réplicatives et

l’encombrement stérique est moindre comparé aux ADN polymérases réplicatives (Ling et al,

2001). Cette caractéristique permet aux ADN polymérases translésionnelles de répliquer plus

facilement une lésion modifiant la structure de la double hélice d’ADN. De plus, les ADN

polymérases de la famille Y ne possèdent pas d’activité exonucléase 3’-5’ de correction

d’erreur contrairement aux ADN polymérases réplicatives (Jansen et al, 2007; Ling et al,

2001). Elles sont donc moins fidèles, mais cette caractéristique leur permet d’utiliser une

variété d’ADN endommagés comme matrices.

Figure 13. Schéma des différents domaines présents dans les ADN polymérases de la famille Y et modèle de leur structure tridimensionnelle. Sur le modèle des quatre ADN polymérases de la famille Y (Rev1, Pol κ, Pol η, Pol ι) sont représentés, en couleur, les domaines constituant la forme de main droite : la paume en rouge, le pouce en vert, les doigts en bleu et le petit doigt en violet. Les domaines d’interaction avec l’ubiquitine (UBM ou UBZ) sont identifiés en gris, les signaux de localisation nucléaire (NLS) et les domaines d’interaction avec PCNA (PIM) en noir. Enfin, Rev1 peut interagir avec les autres ADN polymérases de la famille Y via le domaine PBM (Polymerase binding motif). Sur la partie droite de la figure, les structures tridimensionnelles des domaines N-terminaux des ADN polymérases humaines de la famille Y (ou de levure pour Pol η) sont représentées à partir des données publiées (Alt et al, 2007; Nair et al, 2004; Nair et al, 2005a; Uljon et al, 2004). (Réalisée par F. Boudsocq)

Rev1

710

C 35 99 414 225 289

Iota

870

N C 101 110 40 51170 33

Kappa

Eta 713

N C 239 310 88 17 426

N

1250 N C

4 12 46 82

BRCT

UBM UBM

C2HC

UBZ UBZ

C2HC

PIM

UBM UBM PIM

ZnC2H2

UBZ PIM

PIM PBM

NLS

NLS

paume

pouce

petit-doigt

doigts


57

Le domaine C-terminal quant à lui contient souvent un motif de localisation

nucléaire (NLS) (Kannouche et al, 2001) et un motif d’interaction avec l’anneau de

processivité PCNA (PIM) (Kannouche et al, 2001; Vidal et al, 2004; Wagner et al, 2000). De

nouveaux domaines d’interaction avec l’ubiquitine (UBM ou UBZ) ont été découverts

récemment. Ces domaines sont très importants pour la fonction et la localisation des ADN

polymérases de la famille Y ainsi que pour leur interaction avec PCNA (Bienko et al, 2005).

Il est important de souligner que les ADN polymérases translésionnelles peuvent aussi être

modifiées post-traductionnellement (Guo et al, 2006b). En effet, les ADN polymérases de la

famille Y peuvent être mono-ubiquitinylées au niveau des motifs UBM (Bienko et al, 2005)

mais aussi phosphorylées comme cela a été observé pour Pol η et Rev1 (Chen et al, 2008;

Sabbioneda et al, 2007). Le rôle précis de ces modifications restent encore à élucider, bien

qu’il soit envisagé qu’elles puissent contribuer à la localisation des ADN polymérases

translésionnelles au niveau des machineries de réplication (Chen et al, 2008). Les diverses

fonctions des ADN polymérases de la famille Y seront détaillées ultérieurement dans le

manuscrit (p.69).

b- Le changement d’ADN polymérase lors de la TLS

Afin que les ADN polymérases de la famille Y interviennent dans le mécanisme de

TLS, les ADN polymérases réplicatives doivent dans un premier temps être déplacées pour

être remplacées par les ADN polymérases translésionnelles. Des travaux réalisés chez E. coli

ont mis en évidence le rôle central de la sous-unité β de Pol III au cours de la TLS (Wagner et

al, 2000). De manière similaire, dans les cellules eucaryotes, l’anneau de processivité PCNA

joue un rôle majeur dans le changement d’ADN polymérases. Ce changement est activé par

la modification post-traductionnelle de PCNA par ubiquitination. Le mécanisme

d’ubiquitination implique 3 types de protéines : les enzymes E1 qui permettent d’activer

l’ubiquitine, les enzymes E2 qui dirigent l’ubiquitine vers l’enzyme E3-ubiquitine ligase qui à

son tour lie l’ubiquitine à un substrat spécifique.

Chez S. cerevisiae, en absence de dommage, PCNA est sumoylé sur la lysine 164,

permettant ainsi le recrutement de l’anti-recombinase Srs2 afin d’éviter la recombinaison au

cours de la réplication. De plus, les fourches de réplication bloquées sont résolues soit par

TLS, soit par recombinaison fidèle (Template Switching, TS) (Moldovan et al, 2007). Le


58

choix entre ces deux mécanismes est effectué par des modifications post-traductionnelles

différentes de PCNA (Fig 14) (Stelter & Ulrich, 2003).

Figure 14. Mécanismes de tolérance des dommages et modifications post-traductionnelles

de PCNA. Les lésions de l’ADN (triangle jaune) bloquent la réplication processive de l’ADN. Des mécanismes de tolérance des dommages (synthèse translésionelle, TLS, ou template switching, TS) permettent de contourner ce blocage de la fourche de réplication. Deux mécanismes sont proposés pour le TS : la réversion de fourche ou la recombinaison. Les matrices servant à contourner les lésions ainsi que leurs complémentaires sont encadrés en bleu dans le cas de la TLS et en rouge dans le cas du TS. La nature mutagène ou fidèle des différents mécanismes est indiquée.

En absence de dommage, chez S. cerevisiae, PCNA est sumoylé sur la lysine 164 (étoile jaune). Cette modification inhibe la recombinaison homologue au cours de la réplication. Bien que la sumoylation soit un mécanisme réversible, l’enzyme responsable de la réversion de cette modification n’a pas encore été caractérisée. Après dommages de l’ADN, PCNA est ubiquitinylé sur la lysine 164 afin de permettre la mise en place des mécanismes de tolérance des dommages. La mono-ubiquitination de PCNA facilite la TLS en permettant le recrutement des ADN polymérases TLS. Par contre la poly-ubiquitination de PCNA sur le même résidu permet le TS, en utilisant certainement l’activité hélicase de Rad5. Ces modifications sont médiées par différentes enzymes : Rad6, Ubc13 et Mms2 sont des enzymes de conjugaison E2 alors que Rad18 et Rad5 sont des E3-ubiquitine ligases. Usp1 est l’enzyme de dé-ubiquitination de PCNA. (Adapté de (Chang & Cimprich, 2009))

Ub Ub

Ub Ub

Blocage de la réplication

TLS TS

Mutagène Recombinaison

Mutagène

S

Sumoylation

?

Lys164

Réplication

Mono-ubiquitinationDé-ubiquitintaion

Rad6 Rad18

USP1

Poly-ubiquitination

Rad5 Mms2

Ubc13

Synthèse translésionnelle

Stress génotoxique Réplication normale

Fidèle Réversion de fourche

Fidèle

Ub

Template switching Recombinaison homologue


59

i) La poly-ubiquitination de PCNA et le « Template switching »

Chez la levure, suite à la mono-ubiquitination de PCNA sur la lysine 164 (K164), ce

même résidu peut subir une nouvelle modification post-traductionnelle pour orienter la

réponse en présence d’une lésion sur l’ADN vers un mécanisme de TS : il s’agit d’une

poly-ubiquitination de PCNA via la lysine 63 de l’ubiquitine. Cette réaction est catalysée

par les protéines E2, Ubc13-Mms2, et par l’enzyme E3, Rad5 (Fig 15) (Sun & Chen, 2004).

Figure 15. Mécanisme fidèle de contournement de la lésion (Template switching, TS). Les

ADN polymérases réplicatives sont bloquées face à une lésion de l’ADN (triangle rouge). PCNA est alors mono-ubiquitinylé par Rad6-Rad18, puis poly-ubiquitinylé par Ubc13-Mms2 et Rad5. (Adapté de (Myung & Smith, 2008)

Malgré la présence des homologues d’Ubc13 et Mms2 dans les cellules humaines,

l’importance du mécanisme de TS est moins clair chez les mammifères puisque la

poly-ubiquitination de PCNA via la lysine 63 de l’ubiquitine n’a été décrite que très

récemment (Brun et al, 2008; Chiu et al, 2006; Motegi et al, 2006). D’autre part, HLTF

(Helicase Like Transcription Factor) et SHPRH (SNF2 Histone Linker PHD Ring Helicase)

seraient deux homologues fonctionnels de Rad5 dans les cellules humaines (Motegi et al,

2008). En effet, ces protéines peuvent augmenter la poly-ubiquitination de PCNA in vitro

(Unk et al, 2006) et l’expression ectopique de ces protéines augmente également la

poly-ubiquitination de PCNA in vivo (Motegi et al, 2008). A l’inverse, la sous-expression de

ces protéines diminue la fraction de PCNA poly-ubiquitinylé sur la chromatine (Motegi et al,

2008). De plus, HLTF et SHPRH interagissent ensemble, suggérant une coopération ou une

Ub

Pol ε

PCNA

Rad6 Rad18

Rad5 Mms2

Ubc13

TS

Ub Ub

Ub


60

redondance fonctionnelle de ces deux protéines lors de la modification post-traductionnelle de

PCNA (Motegi et al, 2008).

Le mécanisme moléculaire impliqué dans le coutournement de la lésion n’est pas

encore véritablement connu. Certaines données de la littérature suggèrent que la chromatide

sœur nouvellement synthétisée puisse être utilisée comme matrice (Branzei et al, 2008; Zhang

& Lawrence, 2005). D’autres données suggèrent que Rad5 puisse promouvoir la régression

des fourches de réplication (Chicken foot) via son activité hélicase (Blastyak et al, 2007;

Myung & Smith, 2008). En effet, si la lésion est localisée au niveau du brin continu, la

synthèse du brin continu et celle du brin discontinu deviennent découplées. L’activité hélicase

de Rad5 permettrait de dissocier les brins naissants de leur matrice et d’hybrider les brins

naissants entre eux et les brins matrice entre eux. La fourche serait alors regréssée pour

former une jonction à quatre branches, similaire à une jonction d’Holliday. Ainsi, le brin

complémentaire à la région endommagée est synthétisé à partir du brin naissant continu en

utilisant le brin naissant discontinu comme matrice. La réplication peut alors reprendre à

partir du point d’endommagement de l’ADN (Blastyak et al, 2007).

Le rôle précis de cette modification post-traductionnelle de PCNA n’est donc pas

vraiment défini à ce jour. Deux hypothèses sont envisageables : i) d’une part, la

poly-ubiquitination de PCNA pourrait être un signal permettant « d’éliminer » les protéines

intervenant dans le mécanisme non fidèle de TLS et de recruter les protéines du mécanisme

fidèle de TS, ii) d’autre part, cette modification de PCNA pourrait provoquer le départ de

toutes les protéines du réplisome et « marquer » le dommage de l’ADN jusqu’à ce que la

machinerie de réparation de l’ADN puisse le réparer (Motegi et al, 2008).

ii) La mono-ubiquitination de PCNA

Nous avons vu que le mécanisme de TLS est initié par la mono-ubiquitination de

PCNA sur la lysine 164 (K164). Cette modification post-traductionnelle nécessite les

protéines RAD6 et RAD18, respectivement une E2 et une E3-ubiquitine ligase, que ce soit

chez la levure ou dans les cellules humaines (Bailly et al, 1997; Kannouche & Lehmann,

2004; Kannouche et al, 2004). De nombreux agents génotoxiques qui entrainent un blocage

des fourches de réplication, tels que les radiations UV, le méthyl-méthane-sulfonate, la

mitomycine C ou le cisplatine, induisent la mono-ubiquitination de PCNA (Kannouche &

Lehmann, 2004; Kannouche et al, 2004; Solomon et al, 2004; Soria et al, 2006). En outre, un

traitement à l’hydroxyurée, qui inhibe la réplication de l’ADN en diminuant le pool de dNTP,

entraîne lui aussi la mono-ubiquitination de PCNA (Kannouche & Lehmann, 2004). D’autre


61

part, dans les cellules de poulet DT40, la mono-ubiquitination de PCNA n’est que

partiellement dépendante de Rad18 (Simpson et al, 2006). Ce dernier résultat suggère qu’une

autre E3-ubiquitine ligase pourrait mono-ubiquitinyler PCNA. Les raisons de telles

différences entre organismes restent encore à élucider ainsi que les autres éventuelles

E3-ubiquitine ligases capables de modifier PCNA.

iii) Le contrôle de la mono-ubiquitination de PCNA

D’après ce que nous venons de voir, la mono-ubiquitination de PCNA dépendante de

RAD18 a lieu suite à un blocage de fourche de réplication. Il est important de noter que les

cellules embryonnaires de souris déplétées en Rad18 présentent un taux de croissance normal

mais sont hyper-sensibles à de nombreux agents génotoxiques capables d’induire la

mono-ubiquitination de PCNA (Tateishi et al, 2003). En outre, RAD18 se lie

préférentiellement au niveau de l’ADN simple-brin (Tsuji et al, 2008). Le domaine de RAD18

comprenant les résidus 248-282 est crucial pour la liaison à l’ADN simple-brin ainsi que pour

la mono-ubiquitination de PCNA (Notenboom et al, 2007; Tsuji et al, 2008). Il est maintenant

important de déterminer comment RAD18 distingue une fourche de réplication normale d’une

fourche de réplication bloquée.

D’une part, la présence d’une longue séquence d’ADN simple-brin recouvert par

RPA suite à un blocage de fourche pourrait être le signal de recrutement de RAD18. En effet,

la déplétion de RPA dans les cellules de levure (S. cerevisiae) mais aussi dans les cellules

humaines induit la réduction de la mono-ubiquitination de PCNA suite à un traitement UV,

suggérant que RPA contribue au recrutement de RAD18 in vivo (Davies et al, 2008; Niimi et

al, 2008). Il est important de souligner que RPA s’associe directement avec Rad18 et stimule

sa liaison à l’ADN simple-brin (Davies et al, 2008). De plus, PCNA et Rad18 co-localisent au

niveau de foyers nucléaires après traitement UV, suggérant que l’accumulation de Rad18 au

niveau des fourches de réplication perturbées puisse être une étape importante pour

l’induction de la mono-ubiquitination de PCNA (Watanabe et al, 2004). Cependant, la

présence d’ADN simple-brin ne serait pas suffisante pour induire la mono-ubiquitination de

PCNA (Schmutz et al, 2007). En effet, la présence d’un complexe de réplication complet et

actif serait nécessaire (Schmutz et al, 2007). En outre, l’arrêt de ce réplisome serait requis

pour induire la mono-ubiquitination de PCNA (Schmutz et al, 2007).


62

D’autre part, l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire suite à un

blocage des fourches de réplication pourrait jouer un rôle important dans le recrutement de

Rad18. En effet, dans les cellules humaines, la mono-ubiquitination de PCNA dépendante de

Rad18 nécessiterait l’activation du point de contrôle de phase S via ATR et Chk1 (Bi et al,

2006). Cependant, une étude récente a démontré que l’absence des médiateurs de ce point de

contrôle, ATRIP et Rad1, n’empêchait pas la mono-ubiquitination de PCNA dans des extraits

d’œufs de xénope (Chang et al, 2006). Pareillement, la modification post-traductionnelle de

PCNA ne dépend pas de Rad3, l’homologue d’ATR chez S. pombe (Frampton et al, 2006). De

plus, l’inhibition d’ATR par interférence ARN dans des cellules humaines n’a aucun effet sur

le niveau de PCNA mono-ubiquitinylé (Niimi et al, 2008). Bien que ces résultats

contradictoires puissent être dus aux différences existantes entre espèces (levure, xénope,

mammifère), d’autres études sont nécessaires pour mieux comprendre l’implication des

protéines des points de contrôle du cycle cellulaire dans le mécanisme de mono-ubiquitination

de PCNA. Bien que le rôle d’ATR soit de plus en plus exclu du mécanisme conduisant à la

mono-ubiquitination de PCNA, Chk1, la cible majeure d’ATR, semble jouer un rôle

important (Yang et al, 2008). En effet, lorsque le niveau d’expression de Chk1 est diminué

par interférence ARN dans les cellules humaines, la mono-ubiquitination de PCNA est

diminuée (Yang et al, 2008). En outre, l’activité kinase de Chk1 ne serait pas nécessaire pour

la mono-ubiquitination de PCNA. Par contre, son rôle dans la stabilisation de la protéine de

réplication Claspin serait essentiel (Yang et al, 2008). En effet, la déplétion de la Claspin

mais aussi de Timeless, une protéine associée à la Claspin, diminue la mono-ubiquitination de

PCNA alors que la surexpression de la Claspin complémente partiellement le défaut de mono-

ubiquitination observé dans les cellules déficientes en Chk1 (Yang et al, 2008). Il est

important de souligner que la déplétion de la Claspin réduit de manière significative la

quantité de Rad18 lié à la chromatine (Yang et al, 2008). De plus, la Claspin et Timeless sont

associés avec PCNA dans les cellules humaines (pour revue, (Yang & Zou, 2009)). Ces

résultats suggèrent donc que les protéines Chk1, Claspin et Timeless pourraient s’associer

avec PCNA afin de faciliter le recrutement de Rad18 sur PCNA. Enfin, Tipin, une protéine

associée à Timeless, interagit avec RPA (Gotter et al, 2007; Unsal-Kacmaz et al, 2007). Ainsi

l’interaction Tipin-RPA-simple-brin d’ADN pourrait permettre au complexe

Chk1-Claspin-Timeless de recruter Rad18 au niveau du simple-brin d’ADN recouvert

de RPA. De plus amples études permettront sûrement de valider ou d’infirmer ce modèle.


63

Des études récentes montrent que le blocage de fourche de réplication ne serait pas le

seul signal conduisant à la mono-ubiquitination de PCNA. En effet, PCNA est

mono-ubiquitinylé dans des cellules humaines, ainsi que dans des cellules de S. pombe, en

phase G1 ou G2 après irradiation par des UVC (Frampton et al, 2006; Soria et al, 2006).

D’autre part, PCNA serait mono-ubiquitinylé, au cours de la phase S, même en absence

de dommage exogène de l’ADN (Frampton et al, 2006). Ainsi les blocages de fourches de

réplication au niveau des sites naturels de pauses tels que les structures secondaires de l’ADN

pourraient induire la mono-ubiquitination de PCNA. Néanmoins, il faut noter que certaines

méthodes de synchronisation peuvent induire des cassures de l’ADN, les résultats sont donc à

nuancer.

Il est important de souligner que la mono-ubiquitination des protéines est une

modification post-traductionnelle réversible qui est influencée par les activités opposées des

E3-ubiquitine ligases et des enzymes de déubiquitination (DUB). En 2006, il a été montré

in vivo et in vitro que la DUB USP1 (Ubiquitin Specific Protease 1) régulait négativement

la mono-ubiquitination de PCNA (Huang et al, 2006). De surcroit, les radiations UV

induisent la dégradation d’USP1 afin d’activer la mono-ubiquitination de PCNA pour recruter

Pol η et permettre la TLS (Huang et al, 2006). La dégradation d’USP1 implique un

mécanisme en deux étapes : le clivage interne d’USP1, générant un fragment de 75 kDa

inactif, suivi de la dégradation de ce fragment par le protéasome (Huang et al, 2006). Ainsi,

en absence de dommage de l’ADN, PCNA éventuellement mono-ubiquitinylé serait

déubiquitinylé par USP1 de manière constitutive, ce qui permettrait de maintenir un niveau

basal de la forme modifiée de PCNA. En revanche, lorsque les cellules sont exposées à des

agents endommageant l’ADN, USP1 s’autodégrade, augmentant de ce fait le niveau de la

forme modifiée de PCNA et facilitant ainsi la TLS (Fig 16) (Huang et al, 2006). Il reste

maintenant à déterminer quel élément permet à USP1 de passer de l’activité de

déubiquitination à l’activité d’autodégradation. D’autre part, l’extinction d’USP1 par

interférence ARN augmente la mutagénèse après irradiations UV (Huang et al, 2006),

démontrant l’importance de cette protéine.


64

Figure 16. Régulation du mécanisme réversible de mono-ubiquitination de PCNA. (A) En

absence de dommage de l’ADN, un état d’équilibre entre la forme mono-ubiquitinylée de PCNA et la forme non-modifiée de PCNA est maintenu par les actions opposées du complexe E2-E3 ubiquitine ligase Rad6-Rad18 et de l’enzyme de déubiquitination USP1. (B) Lorsque les cellules sont soumises à des agents endommageant l’ADN tels que les radiations UV, l’autodégradation d’USP1 augmente le niveau d’expression de PCNA mono-ubiquitinylé et induit la synthèse translésionnelle. L’autodégradation d’USP1 génère un fragment de 75 kDa (p75) qui est par la suite dégradé par le protéasome. (Adapté de (Friedberg, 2006; Huang et al, 2006))

Le niveau cellulaire de PCNA mono-ubiquitinylé est donc régulé par deux

mécanismes opposés : la mono-ubiquitination par RAD6-RAD18 et la déubiquitination par

USP1.

Une autre protéine importante pour le contrôle de la mono-ubiquitination de

PCNA est la protéine ELG1. Cette protéine s’associe aux quatre petites sous-unités de RFC

pour former un facteur de chargement de PCNA (pour revue, (Aroya & Kupiec, 2005)).

L’absence de la protéine ELG1 induit une forte augmentation des réarrangements

chromosomiques ainsi que des pertes ou des cassures de chromosomes (pour revue, (Aroya &

Kupiec, 2005) et communication personnelle de K. Myung, Keystone « Genome instability

and DNA repair », 2009). Cette protéine serait donc importante pour le maintien de la stabilité

du génome dans des conditions normales de croissance. D’autre part, cette protéine interagit

avec PCNA mono-ubiquitinylé, avec Pol η mais aussi avec la protéine USP1 (communication

personnelle de K. Myung, Keystone « Genome instability and DNA repair », 2009). En

USP1

Ub Rad6 Rad18

A) Sans dommage équilibre entre PCNA et PCNA-Ub

PCNA

B) Après dommages augmentation de PCNA-Ub

Ub Rad6 Rad18 PCNA

Ub

Ub

p75

Dégradation par le protéasome



65

absence de la protéine ELG1, le niveau de protéines PCNA-Ub sur la chromatine augmente,

suggérant qu’ELG1 contrôle la mono-ubiquitination de PCNA, probablement après la TLS.

D’autres expériences sont nécessaires pour mieux comprendre comment ELG1 régule la

mono-ubiquitination de PCNA.

D’ailleurs, la mono-ubiquitination de PCNA persiste pendant au moins 72h après

irradiations UV et la forme modifiée de PCNA reste fixée à la chromatine durant cet

intervalle de temps (Niimi et al, 2008). Ce résultat semble très surprenant puisqu’il existe,

comme nous venons de le voir, un mécanisme de déubiquitination de PCNA médié par USP1.

Cependant, le niveau d’expression d’USP1 reste très faible pendant que le niveau de PCNA

ubiquitinylé est fort (Niimi et al, 2008). Nous pouvons donc nous demander pourquoi la

mono-ubiquitination de PCNA persiste alors que la réplication est redémarrée. Chez E. coli,

les cellules irradiées présentent des brèches en face des lésions UV, lesquelles sont

complétées par la suite (Rupp & Howard-Flanders, 1968). Ce modèle appelé « gap filling »

implique donc que la synthèse translésionnelle serait indépendante de la progression de

la fourche de réplication. Dans ce cas là, le but de la TLS ne serait pas de redémarrer les

fourches de réplication mais de compléter les brèches résultantes de la réinitition de la

réplication en aval des dommages de l’ADN. Plusieurs évidences chez la levure notamment

suggèrent que le modèle présent chez la bactérie serait conservé (Lopes et al, 2006; Waters &

Walker, 2006). De plus, des études in vitro ont permis de démontrer que la réplication pouvait

être ré-initiée après un blocage de fourche (Heller & Marians, 2006). Le groupe d’Alan

Lehmann a donc utilisé ce modèle pour expliquer la persistance de la mono-ubiquitination de

PCNA (Fig 17) (Niimi et al, 2008). Lorsque la réplication est bloquée au niveau d’une lésion

de l’ADN, PCNA est mono-ubiquitinylé et peu après une nouvelle machinerie de réplication

serait assemblée en amont de la fourche, au-delà de la lésion. La réplication continue ainsi

jusqu’à une éventuelle prochaine lésion de l’ADN où PCNA serait à nouveau mono-

ubiquitinylé et une nouvelle machinerie de réplication assemblée après cette deuxième lésion

de l’ADN. Par la suite, les brèches laissées proches des lésions sont complétées par une ADN

polymérase translésionnelle, et les molécules de PCNA ubiquitinylées resteraient fixées sur

l’ADN. Il est possible que RFC ne se situant peut-être pas à proximité de la lésion ne puisse

pas décrocher PCNA ubiquitinylé. De ce fait, les molécules de PCNA restent fixées au niveau

de la lésion jusqu’à la prochaine phase S ou jusqu’à ce que le niveau d’USP1 soit restauré afin

de déubiquitinyler PCNA. Ce modèle reste tout de même à être vérifié et détaillé.


66

Figure 17. Modèle pouvant expliquer la persistance de la mono-ubiquitination de PCNA.

(A) La réplication est bloquée au niveau d’une lésion de l’ADN ( ), PCNA est alors mono-ubiquitinylé. (B) Une nouvelle machinerie de réplication est assemblée au-delà de cette lésion. (C) Le mécanisme se répète lorsque la fourche de réplication rencontre une prochaine lésion de l’ADN. (D) La brèche serait ensuite complétée par une ADN polymérase translésionnelle, Pol η dans le cas où la lésion est d’un dimère de thymines. Par simplicité, seul le brin continu est représenté et une seule molécule d’ubiquitine a été dessinée. Mais bien entendu, le même mécanisme est possible au niveau du brin discontinu et les trois sous-unités de PCNA sont ubiquitinylées. (Adapaté de (Niimi et al, 2008))

iv) Changement d’une ADN polymérase pour la TLS

Nous venons de voir que le signal initiateur de la TLS était la mono-ubiquitination de

PCNA. Nous allons maintenant étudier le mécanisme qui conduit au changement d’ADN

polymérases.

Les ADN polymérases translésionnelles telles que Pol η chez la levure ou Pol η, Pol ι

et Pol κ dans les cellules humaines, interagissent physiquement et fonctionnellement avec

PCNA via leur domaine PIM (Haracska et al, 2001a; Haracska et al, 2001b; Haracska et al,

2001c). La liaison de ces ADN polymérases à PCNA permet d’augmenter l’activité

catalytique de ces protéines que ce soit sur un ADN endommagé ou non (Haracska et al,

2002b). En outre, l’affinité pour PCNA des ADN polymérases de la famille Y, Pol η, Pol ι,

Pol κ et Rev1, serait augmentée par la mono-ubiquitination de PCNA (Bi et al, 2006;

Bienko et al, 2005; Guo et al, 2006a; Kannouche et al, 2004; Watanabe et al, 2004).

Ub

Ub

Ub

Ub

Ub Ub

A)

B)

C)

D) Pol η

Pol ε

Pol ε

Pol ε

Ub


67

Cependant, il est important de noter qu’aucune mesure quantitative d’affinité entre PCNA ou

PCNA ubiquitinylé et les ADN polymérases TLS n’a été réalisée à ce jour, excepté à partir de

peptides (domaines PIM ou UBZ) qui ne prennent pas en compte la conformation des

protéines entières qui pourraient masquer ces sites et donc géner les interactions mises en

évidence lors de ces études (Bomar et al, 2007; Hishiki et al, 2009). Nous avons vu

précédemment que ces ADN polymérases TLS possèdent des motifs de liaison à l’ubiquitine

(UBM ou UBZ), et ceux-ci sont importants pour la survie cellulaire et la relocalisation des

ADN polymérases en foyers après dommages de l’ADN (Bienko et al, 2005). Il est donc

possible que ces domaines jouent un rôle dans l’augmentation d’affinité des ADN

polymérases pour PCNA ubiquitinylé. In vitro, la capacité de Pol η et de Rev1 à répliquer un

site abasique est augmentée par l’ubiquitination de PCNA alors que leur capacité à répliquer

un oligonucléotide non endommagé ne varie pas (Garg & Burgers, 2005). Ces différentes

données ont permis d’imaginer le modèle représenté sur la figure 18.

Ces résultats ont été récemment très controversés dans le monde scientifique. En

effet, une étude montre que l’ubiquitination de PCNA sur la lysine K164 ne serait pas

nécessaire pour le recrutement de Pol η au niveau du complexe de réplication bloqué par une

lésion CPD, ni pour catalyser la TLS de ce dommage in vitro (Nikolaishvili-Feinberg et al,

2008). De plus, des mutations du domaine UBZ de Pol η chez la levure ne perturberait pas sa

fonction dans la TLS au cours de la réplication (Acharya et al, 2007). La liaison de Pol η à

l’ubiquitine sur PCNA via son domaine UBZ ne serait pas non plus requise pour sa fonction

dans la TLS (Acharya et al, 2008). Enfin, l’échange ultérieur de Pol η pour Pol δ nécessiterait

la déubiquitination de PCNA (Zhuang et al, 2008). Or ce dernier résultat rend peu probable un

rôle de PCNA ubiquitynilé dans la TLS au cours de la phase S. En effet, nous avons vu que la

mono-ubiquitination de PCNA persistait dans le temps. Si les ADN polymérases réplicatives

ne peuvent reprendre leur rôle que lorsque PCNA n’est plus modifié, alors les ADN

polymérases translésionnelles, en continuant la réplication, seraient beaucoup trop mutagènes

pour la cellule. Ces arguments supportent donc, à nouveau, un rôle de la TLS après la

réplication, au niveau des mécanismes de réparation post-réplicatifs, en accord avec le

modèle présenté sur la figure 17.


68

Figure 18. Modèle de la synthèse translésionnelle (exemple d’une lésion CPD).

(A) La réplication est bloquée au niveau de la lésion CPD de l’ADN (TT). (B) Le complexe Rad6-Rad18 est alors recruté permettant l’ubiquitination de PCNA. USP1 a été dégradé par les UV et ne peut plus enlever l’ubiquitine de PCNA. (C) L’augmentation d’affinité de PCNA ubiquitinylé pour Pol η permet de recruter cette dernière pour réaliser la synthèse translésionnelle du dommage. (D) La déubiquitination de PCNA permet alors d’échanger à nouveau les polymérases et de reprendre la réplication normale. Par simplicité, seul le brin continu est représenté et une seule molécule d’ubiquitine a été dessinée. Mais bien entendu, le même mécanisme est possible au niveau du brin discontinu et les trois sous-unités de PCNA sont ubiquitinylées. (Adapaté de (Lehmann et al, 2007; Zhuang et al, 2008))

Un article récent démontre que Rad18 et PCNA-ubiquitinylé seraient essentiels pour

permettre la TLS après la réplication dans les cellules de poulet DT40 (Edmunds et al, 2008).

Par ailleurs, un mutant de Rad18 ou un mutant sur la lysine 164 de PCNA ne montre aucune

différence en termes de blocage de fourche de réplication après dommages de l’ADN comparé

aux cellules sauvages (Edmunds et al, 2008). Ces résultats tendent à impliquer la

mono-ubiquitination de PCNA dans la TLS après que la réplication soit terminée. Il faudrait

confirmer ces données sur un autre modèle cellulaire.

Rad6 Rad18 Ub

TT ^

Pol ε

Rad6 Rad18 USP1

TT ^

Rad6 Rad18 Ub TT ^

US P1

Pol η

Pol η

TT ^

Rad6 Rad18 USP1

Pol η

A)

B)

C)

D)

Pol ε

Pol ε

Pol ε

US P1


69

c- Le rôle important de Rev1 lors de la TLS au cours de la réplication

Puisque PCNA-ubiquitinylé n’interviendrait dans la TLS qu’après la fin de la

réplication, quelle protéine permet d’initier la TLS au cours de la réplication ? Le groupe de

Julian Sale a récemment montré que Rev1 aurait un rôle prépondérant dans la TLS au

cours de la phase S (Fig 19) (Edmunds et al, 2008).

Figure 19. Modèle simplifié du contrôle de la TLS. (A) Lorsque les ADN polymérases réplicatives rencontrent une lésion de l’ADN, Rev1 est recrutée. Le domaine C-terminal de Rev1 pourrait servir de plateforme pour les autres ADN polymérases translésionnelles, illustré ici par Pol η. Une fois la lésion passée, un autre échange d’ADN polymérase permettrait de redémarrer la réplication. (B) Une discontinuité laissée au cours de la réplication peut être détecté par Rad18 grâce à son affinité pour le simple-brin. Rad6 et Rad18 ubiquitinyle alors PCNA et Pol η est recrutée au niveau de la lésion. Ainsi la brèche peut être comblée. (Adapté de (Edmunds et al, 2008))

En effet, l’absence de Rev1 dans les cellules de poulet DT40 conduit à des blocages de

fourches de réplication plus fréquents après endommagement de l’ADN, induits par les UV

ou par traitement avec du 4-nitroquinoline-1-oxyde (NQO, un agent formant des adduits sur

l’ADN) (Edmunds et al, 2008). Ce phénotype est complémenté par réintroduction de la forme

sauvage de la protéine humaine REV1, mais aussi par la forme catalytiquement inactive ou

par une protéine Rev1 tronquée ne possédant pas le domaine N-terminal (Edmunds et al,

2008). Ainsi, ni l’activité catalytique de REV1, ni son domaine BRCT, capable d’interagir

avec PCNA (Guo et al, 2006a) ou avec des protéines phosphorylées présentes sur la

Pol ε C

N

C

N Pol η

Rev1 PCNA

Pol η

Ub Pol η

Rad6-Rad18

Ub

Rad6-Rad18

TLS au niveau d’une fourche de réplication bloquée contrôlée par Rev1

A B

Pol ε

Pol ε

Pol ε

TLS au niveau d’une discontinuité laissé au cours de la réplication contrôlée par PCNA-Ub


70

chromatine (Hirano & Sugimoto, 2006; Sabbioneda et al, 2007), ne seraient importants pour

le maintien des fourches de réplication après dommages de l’ADN. Par contre, le domaine

C-terminal de REV1, important pour cette protéine dans la tolérance aux dommages de

l’ADN (Ross et al, 2005), est nécessaire pour la progression des fourches de réplication sur un

ADN endommagé (Edmunds et al, 2008). Il est important de noter que le domaine C-terminal

de REV1 contient deux UBM ainsi qu’un domaine de liaison aux autres ADN polymérases de

la famille Y (PBM) (Bienko et al, 2005; Guo et al, 2003). La complémentation des cellules

déficientes en Rev1 par un mutant délété du domaine PBM, ou par un mutant délété des

UBM, ne restaure pas une progression des fourches de réplication normale après dommages

de l’ADN (Edmunds et al, 2008). Par conséquent, les intéractions de REV1 avec les autres

ADN polymérases et avec de potentielles cibles ubiquitinylées semblent cruciales dans ce

processus. Etant donné que REV1 peut interagir avec les autres ADN polymérases, cette

protéine pourrait servir « d’adaptateur » entre les ADN polymérases et PCNA comme le fait

l’ubiquitine.

Par ailleurs, Rev1 ne servirait pas seulement à recruter les ADN polymérases

translésionnelles au niveau d’une fourche de réplication mais leur permettrait aussi d’être plus

fidèles. En effet, l’absence de Rev1 conduit à l’insertion d’une troisième base, une adénine, en

face d’un photoproduit 6-4PP et augmente aussi le taux de délétions (Szuts et al, 2008). En

outre, la partie C-terminale de Rev1 serait requise pour assurer le maintien du cadre de lecture

en face d’un photoproduit 6-4PP (Szuts et al, 2008).

d- Le choix des ADN polymérases

Enfin, il est important de noter que le mécanisme déterminant le choix de l’ADN

polymérase recrutée pour telle ou telle lésion de l’ADN n’est pas encore connu. Plusieurs

hypothèses sont possibles : i) d’une part, les ADN polymérases translésionnelles peuvent

avoir une affinité différente pour la lésion rencontrée et ainsi avoir une lésion

préférentielle ; ii) d’autre part, l’affinité pour certains facteurs de la réplication tels que

PCNA, PCNA-ubiquitinylé, les ADN polymérases réplicatives ou le complexe 9-1-1, qui sont

recrutés différemment suivant les lésions, peut être différente suivant l’ADN polymérase

considérée ; iii) enfin, un dernier modèle serait que chacune des ADN polymérases à son

tour essaie de se lier à l’ADN au niveau de la lésion jusqu’à ce que l’ADN polymérase

requise reste « fixée ». Plusieurs éléments sont en faveur de cette dernière proposition. En

effet, la forme trimérique de PCNA permet de lier trois ADN polymérases simultanément si

l’encombrement stérique n’est pas trop important. Par ailleurs, le temps de « résidence » de


71

Pol η et Pol ι au niveau des foyers de réplication est très court (Sabbioneda et al, 2008). Ces

résultats suggèrent donc un mécanisme dynamique au cours duquel les ADN polymérases

lient brièvement PCNA ou un peu plus longuement PCNA-ubiquitinylé. Lorsque PCNA est

bloqué au niveau d’un dommage, l’ADN polymérase associée va essayer de répliquer cette

lésion. Si celle-ci peut être accomodée dans le site actif de l’ADN polymérase alors cette

dernière pourra réaliser la synthèse translésionnelle. En revanche, si elle peut insérer des

nucléotides en face de la lésion mais ne peut pas poursuivre la réplication, un nouveau

changement d’ADN polymérase sera alors nécessaire pour continuer. En effet, trois types de

lésions (Fig 20) peuvent être considérés (Shachar et al, 2009) :

- les lésions qui sont répliquées de manière fidèle et rapide par une ADN polymérase

translésionnelle, comme un dimère de thymines est répliqué par Pol η.

- les lésions qui sont répliquées de manière un peu plus lente mais fidèle par l’action

coordonnée de deux ADN polymérases. Il s’agit des adduits bloquants (benzopyrène,

par exemple) pour lesquels Pol κ réalise l’étape d’insertion et Pol ζ l’étape

d’élongation.

- les lésions qui sont répliquées de manière lente et infidèle, comme par exemple les

sites abasiques. Au niveau de cette absence de base, le choix de l’ADN polymérase est

plus difficile et donc le taux d’erreur est donc beaucoup plus important.

Figure 20. Modèles des trois mécanismes de TLS possibles suivant les lésions rencontrées. A) La TLS d’une lésion CPD est très rapide et fidèle. Une seule ADN polymérase est nécessaire, Pol η. B) La TLS d’adduits de l’ADN tels que le benzopyrène nécessite la combinaison de deux ADN polymérases Pol κ et Pol ζ. Ce mécanisme est fidèle mais plus long. C) Enfin, la TLS d’un site abasique est lente et fortement mutagène. Ce mécanisme implique Pol ζ pour l’étape d’extension et certainement une autre ADN polymérase pour l’étape d’initiation. (Adapté de (Shachar et al, 2009))

Ub

TT ^

Pol ε

AA CC

CC

TT ^ A

A

Pol η Pol κ

Pol ζ

Pol ?

Pol ζ

Insertion Extension

Pol η

Insertion Pol κ

Extension

Pol ζ

Insertion Pol ?

Extension

Pol ζ

A) TLS rapide et fidèle au niveau d’un CPD

B) TLS retardée, rapide et fidèle au niveau d’un adduit (Benzopyrène)

C) TLS lente et mutagène au niveau d’un site abasique

Pol ε

Pol ε Pol ε

Chapitre II A. Les ADN polymérases translésionnelles de la famille Y

72

CHAPITRE II : LES ADN POLYMERASES

TRANSLESIONNELLES ET LES ADN HELICASES

SPECIALISEES

A. Les ADN polymérases translésionnelles de la famille Y

Nous avons étudié brièvement les caractéristiques communes des ADN polymérases

de la famille Y par rapport aux ADN polymérases réplicatives dans le chapitre précédent

(p.53). Nous allons maintenant détailler les caractéristiques et les fonctions de chacune de ces

protéines.

1. REV1 : la protéine plate-forme

Il est important de noter que REV1 n’est pas une ADN polymérase à proprement

parler mais plus exactement une déoxycytidyl-transferase (d-CMP). Nous venons de voir que

Rev1 joue un rôle important au cours de la TLS, notamment via ses interactions avec les

autres ADN polymérases de la famille Y. Nous allons maintenant étudier plus précisément les

caractéristiques et les différentes fonctions de cette protéine.

a- Description du gène et de la protéine

Le gène humain REV1 est localisé au niveau du chromosome 2q11.1-11.2 et présente

environ 40% d’homologie de séquence avec le gène correspondant chez la levure (Gibbs et al,

2000; Lin et al, 1999). Ce gène code pour une protéine de 128 kDa (Lin et al, 1999).

L’extrémité N-terminale contient le domaine catalytique de cette protéine ainsi qu’un

domaine particulier, un BRCT, dont nous détaillerons plus particulièrement le rôle ci-dessous

(Gibbs et al, 2000). La partie C-terminale quant à elle contient un domaine de liaison à

l’ubiquitine (UBM) ainsi qu’un domaine de 100 acides aminés d’interaction avec d’autres

protéines (PBM) (Bienko et al, 2005). L’UBM de REV1 est important pour son interaction

avec PCNA mono-ubiquitinylé ainsi que pour son rôle dans la tolérance aux dommages de

l’ADN et dans la mutagénèse induite par les dommages de l’ADN in vivo (Gangloff et al,

1994; Guo et al, 2006b; Wood et al, 2007). Le niveau d’expression de cette protéine est très

faible, ce qui rend son étude in cellulo plus délicate (Gibbs et al, 2000). Cependant, ce niveau


73

d’expression semble augmenter d’un facteur 50 chez la levure au cours de la phase G2/M

(Waters & Walker, 2006). Ce résultat reste à être confirmé, notamment dans les cellules

humaines.

Il est important de souligner que Rev1 est phosphorylée en partie via l’action de

Mec1, l’homologue d’ATR chez la levure (Hirano & Sugimoto, 2006; Sabbioneda et al,

2007). Le niveau de cette modification post-traductionnelle est régulé au cours du cycle

cellulaire. En effet, Rev1 n’est pas phosphorylée en phase G1, commence à être modifiée au

cours de la phase S et devient hyper-phosphorylée au cours de la mitose (Sabbioneda et al,

2007). Rev1 est aussi hyper-phosphorylée en réponse à différents dommages de l’ADN, et

notamment en présence de CDB ou après irradiation UV (Sabbioneda et al, 2007). Cependant,

l’absence de Mec1 n’élimine pas complètement la phosphorylation de Rev1, suggérant qu’une

autre kinase puisse modifier Rev1 (Sabbioneda et al, 2007). Cette modification pourrait avoir

lieu au niveau du motif BRCT de Rev1, ce domaine étant essentiel pour la survie et la

tolérance aux dommages de l’ADN que ce soit chez la levure ou dans les cellules de poulet

DT40 (Guo et al, 2006a). Dans les cellules DT40, le BRCT ne semble pourtant pas

directement impliqué dans la tolérance aux dommages de l’ADN mais serait plutôt nécessaire

pour la localisation nucléaire de Rev1 (Ross et al, 2005). Ce rôle de régulation via le domaine

BRCT a aussi été proposé chez la souris (Jansen et al, 2005).

Dans les cellules humaines non traitées, la protéine REV1 fusionnée avec la GFP peut

se localiser en foyers nucléaires qui co-localisent avec des foyers PCNA, confirmant la

localisation constitutive de REV1 au niveau des fourches de réplication (Murakumo et al,

2006; Tissier et al, 2004). Cependant, la majorité des cellules présentant des foyers REV1 ne

montrent aucune réactivité avec l’anticorps anti-BrdU (utilisé pour « marquer » la synthèse

d’ADN), suggérant que ces cellules ne sont pas encore entrées en phase S (Murakumo et al,

2006). Ces résultats suggèrent donc que REV1 puisse être localisée en foyers en dehors et au

cours de la phase S.

Il est important de souligner que les cellules DT40 déficientes en Rev1 présentent une

viabilité fortement réduite, suggérant le rôle prépondérant de Rev1 chez les vertébrés

(Simpson & Sale, 2003).

b- Son activité déoxycytidyl-transferase au travers de nombreuses lésions

REV1 possède une activité déoxycytidyl-transferase (d-CMP) que ce soit chez la

levure ou dans les cellules humaines (Lin et al, 1999; Nelson et al, 1996). Ainsi, cette protéine

catalyse l’insertion de dCMP en face des sites abasiques, des 8-oxo-guanines, des adduits


74

benzopyrène sur des guanines, mais n’est pas capable de réaliser de la TLS au niveau des

lésions induites par les radiations UV (Haracska et al, 2001d; Nelson et al, 1996; Zhang et

al, 2002). Sur une matrice poly(dG), Rev1 synthétise de l’ADN, in vitro, en incorporant des C

et incorpore environ deux nucléotides par évènements de liaison à l’ADN. Rev1 peut aussi

insérer des C en face des autres bases de l’ADN avec des fréquences comprises entre 10-3 et

10-4 (Haracska et al, 2002a). En outre, des études génétiques chez S. cerevisiae ont démontré

que Rev1 était impliquée dans la mutagénèse induite au niveau des sites abasiques (Haracska

et al, 2001d). Cependant, ces données sont controversées (Lawrence, 2002) et le rôle

enzymatique de REV1 au cours de la TLS reste encore à être mieux défini.

Il est important de souligner que la délétion de REV1 dans les cellules humaines

diminue la mutagénèse induite par les radiations UV mais n’a aucun effet sur la sensibilité des

cellules aux radiations UV (Clark et al, 2003; Gibbs et al, 2000). De plus, les souris

déficientes en Rev1 présentent un retard de croissance mais une fréquence d’hypermutation

somatique normale (il s’agit d’un processus, spécifique aux lymphocytes B, permettant la

diversification des anticorps, comme nous le verrons plus tard dans ce manuscrit) (Jansen et

al, 2006). Il est important de noter que le spectre de mutations dans les souris déficientes en

Rev1 est très différent par rapport aux souris sauvages. En effet, des transversions C→G ont

été observées, suggérant que Rev1 incorpore, au cours de l’hypermutation somatique, des

C en face des uraciles produits lors de la déamination des deoxy-cytidines par l’action d’AID

(Activation-Induced-deoxycytidine Deaminase) (Jansen et al, 2006). Ces résultats ont aussi

été retrouvés dans les cellules de poulet DT40 déficientes en Rev1 (Ross & Sale, 2006).

c- Ses partenaires, rôles particuliers des domaines BRCT et PBM

Nous venons de voir que REV1 ne peut pas, à elle seule, réaliser la TLS au niveau des

lésions induites par les UV. Cependant, REV1 se localise en foyers après irradiation UV,

suggérant un rôle de cette protéine au cours de la réponse aux dommages de l’ADN (Tissier et

al, 2004). Ainsi, en dehors de son activité catalytique, REV1 doit avoir un autre rôle au cours

de la TLS. Il a notamment été proposé que REV1 puisse jouer un rôle de plateforme en

recrutant les diverses ADN polymérases nécessaires à la TLS. En effet, des analyses en

double-hybride et des expériences de co-immunoprécipitation ont permis de montrer que

REV1 interagit avec les autres ADN polymérases de la famille Y (Pol η, Pol ι, Pol κ) ainsi

qu’avec la sous-unité REV7 de Pol ζ, via le domaine PBM de 100 acides aminés présents

dans la partie C-terminale de REV1 (Guo et al, 2003; Ohashi et al, 2004; Tissier et al, 2004).

Il est important de noter que ces différentes interactions n’affectent pas l’activité de REV1 ni


75

son rôle dans la TLS (Guo et al., 2003). Deux articles récents ont permis de montrer que

quatre ou deux phénylalanines respectivement présentes dans Pol η et Pol κ jouaient un rôle

crucial dans l’interaction du C-terminal de REV1 avec ces protéines (Akagi et al, 2009;

Ohashi et al, 2009). En effet, des mutants de Pol η et Pol κ au niveau de ces phénylalanines

n’interagissent plus avec REV1 (Akagi et al, 2009; Ohashi et al, 2009). Toutefois, ces

interactions ont été mises en évidence par double-hybride et aussi par SPR (Surface Plasmon

Resonnance, une technique permettant de mesurer les interactions de manière quantitative)

mais seulement à partir de peptides et non des protéines entières (Akagi et al, 2009; Ohashi et

al, 2009). En outre, le mutant de Pol κ au niveau de ces phénylalanines ne permet pas de

complémenter la sensibilité aux agents génotoxiques des cellules déficientes en Pol κ (Akagi

et al, 2009). En revanche, le mutant au niveau des quatre phénylalanines de Pol η empêche la

localisation de REV1 au niveau des sites de dommages induits par les radiations UV mais

corrige la sensibilité aux UV des cellules XP-V, naturellement déficientes en Pol η, ainsi que

la mutagénèse induite par les radiations UV (Akagi et al, 2009). Par conséquent, l’interaction

de Pol η avec REV1 serait importante afin d’éviter les mutations spontanées, probablement en

favorisant la TLS fidèle des lésions endogènes, alors que cette interaction ne serait pas

nécessaire pour le rôle fidèle de Pol η dans la TLS des dommages induits par les UV (Akagi

et al, 2009). De plus, l’interaction de REV1 avec les autres ADN polymérases de la famille Y

ne semble pas nécessaire pour la re-localisation de ces trois protéines en réponse aux

dommages de l’ADN (Kannouche et al, 2001; Ogi et al, 2005; Vidal et al, 2004). En

revanche, les interactions entres les ADN polymérases de la famille Y et REV1 sont

importantes pour la TLS après leurs recrutements dépendants de PCNA mono-ubiquitinylé au

niveau des fourches de réplication bloquées. Le choix de l’ADN polymérase au niveau d’une

lésion donnée n’est pas encore bien compris. Il est possible, comme nous l’avons vu

précédemment, qu’elles essaient tour à tour de se lier au niveau de la lésion. Ainsi, REV1

pourrait jouer un rôle au niveau de l’échange entre une ADN polymérase non

appropriée pour une lésion et une autre ADN polymérase.

Il est important de noter que REV1 peut interagir avec PCNA au niveau de deux

domaines : un domaine situé dans le BRCT (Guo et al, 2006a) et un domaine situé dans la

partie C-terminale (Ross et al., 2005). De plus, le domaine BRCT pourrait participer à la

localisation de REV1 au niveau des cibles phosphorylées sur la chromatine (Sabbioneda et

al, 2007).


76

2. Pol η : la protéine déficiente dans le syndrome du Xeroderma pigmentosum variant


Pol η est une protéine de 713 acides aminés (78 kDa) codée par le gène POLH sur le

chromosome 6p21.1 (pour revue (Sweasy et al, 2006). La protéine contient divers domaines

responsables de différentes activités. L’activité catalytique réside entièrement dans les

premiers 512 acides aminés (Kannouche et al, 2001). La partie C-terminale de Pol η est

beaucoup moins connue puisqu’elle n’a pas encore été cristallisée. Elle contient un signal de

localisation nucléaire (NLS) compris entre les acides aminés 682 et 698 (Kannouche et al,

2001). Ainsi, Pol η est localisée en majorité de manière uniforme dans le noyau. Cependant,

10 à 15 % des cellules transfectées par un vecteur exprimant Pol η fusionnée à une étiquette

GFP présentent de nombreux petits foyers brillants en immuno-fluorescence suggérant des

endroits de forte concentration de cette protéine (Kannouche et al, 2001). En revanche, après

irradiation UVC, Pol η est localisée en foyers dans plus de 70 % des cellules transfectées

(Kannouche et al, 2001). Ces foyers sont résistants à une extraction au Triton et co-localisent

avec des foyers PCNA, suggérant que, dans cette situation, Pol η est fortement associée aux

machineries de réplication (Kannouche et al, 2001; Limoli et al, 2000). Les 120 acides aminés

du C-terminal de Pol η sont nécessaires et suffisants pour la relocalisation de Pol η en foyers

après irradiations UV (Kannouche et al, 2001). Pol η contient aussi un domaine

d’interaction avec PCNA compris entres les acides aminés 702 et 708 (Haracska et al,

2001a). De ce fait, Pol η interagit directement avec PCNA et cette interaction stimule

l’activité de synthèse de Pol η (Haracska et al, 2001a; Haracska et al, 2001c). Pol η contient

aussi un domaine de liaison à l’ubiquitine (UBZ) dans le domaine C-terminal et un niveau

endogène de Pol η mono-ubiquitinylée a été mis en évidence dans des fibroblastes humains

non transformés (Bienko et al, 2005). Le rôle précis de cette modification post-traductionnelle

n’est pas encore bien défini mais elle pourrait intervenir dans la re-localisation de cette

protéine. Enfin, Pol η peut être phosphorylée au niveau de différents sites et la serine 587

serait importante pour la re-localisation ainsi que pour l’activité de cette protéine dans la TLS

(Chen et al, 2008).


77

Pol η est une protéine qui a une demi-vie courte, de 30 minutes chez la levure

(Skoneczna et al, 2007). Sa demi-vie est augmentée temporairement par les radiations UV

puisqu’elle passe à 120 minutes, 45 minutes après irradiation UV (Skoneczna et al, 2007).

Cette stabilité dépend de la dégradation de la protéine via le protéasome (Skoneczna et al,

2007). Dans une étude plus récente, une autre régulation de Pol η a été mise en évidence chez

le nématode C. elegans (Kim & Michael, 2008). Dans cette étude, ils montrent que l’absence

de GEI-17, une SUMO-E3 ligase, conduit à la dégradation de Pol η après de faibles niveaux

de traitements endommageant l’ADN et cette dégradation est médiée par la voie CRL4-Cdt2,

une ubiquitine ligase. En fait, GEI-17 contrôle la sumoylation de Pol η, à la fois in vitro et

in vivo ; les sites de sumoylation ayant été identifiés sur les lysines 85 et 260 (Kim & Michael,

2008). Enfin, la voie CRL4-Cdt2 dégrade Pol η même en présence de GEI-17 lorsque de

fortes doses d’agents endommageant sont utilisées. Cependant, GEI-17 contrôle tout de même

le timing de dégradation de Pol η au cours de la réponse aux dommages de l’ADN (Kim &

Michael, 2008). Ces données leur ont permis de proposer le modèle de la figure 21 ci-après.

Lorsque Pol η est associée au niveau des sites de dommages de l’ADN, elle est

sumoylée par GEI-17. Si ce n’est pas le cas, la voie CRL4-Cdt2 dégrade Pol η avant qu’elle

n’ait pu remplir sa fonction. Même sumoylée, Pol η sera aussi dégradée par la même voie,

mais cette fois-ci après avoir rempli sa fonction dans la TLS de la lésion. Ces résultats

suggèrent qu’il pourrait exister un mécanisme actif permettant aux ADN polymérases

translésionnelles d’être remplacées par les ADN polymérases réplicatives une fois la

TLS accomplie. Ce mécanisme impliquerait leur dégradation via la voie CRL4-Cdt2. En

outre, les composants du mécanisme cité ci-dessus tels que GEI-17, Cul4-Ddb1, Cdt2 et

PCNA sont conservés dans les cellules humaines ainsi que les différents sites de Pol η

importants pour ce mécanisme (le site d’interaction avec PCNA et les lysines 85 et 260 cibles

de la sumoylation), suggérant qu’un tel mécanisme puisse aussi exister dans les cellules

humaines.


78

Figure 21. Modèle de la régulation de Pol η au cours de la réponse aux dommages de

l’ADN. (A) En absence de GEI-17, Pol η est dégradée par la voie CRL4-Cdt2 (représentée sur la figure par la protéine Cdt2) avant qu’elle ne puisse réaliser la synthèse translésionnelle du dommage (triangle rouge). Ce modèle propose qu’une même lésion puisse induire plusieurs cycles de dégradation de Pol η comme indiqué par la flèche rouge. (B) En revanche, en présence de GEI-17, Pol η est sumoylée, ce qui permet d’inhiber sa dégradation par la voie CRL4-Cdt2 jusqu’à ce que la TLS soit réalisée. (Adapté de (Kim & Michael, 2008))

b- Son rôle majeur dans la TLS des adduits UV

Le syndrome du Xeroderma pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare (1 à

4 cas pour 1 000 000 en Europe) décrite initialement en 1974 par Hebra et Kaposi ; son nom a

été introduit plus tard, en 1982. Cette maladie est caractérisée par une hyper-sensibilité aux

radiations du soleil, une apparition précoce de taches de rousseur et des changements au

niveau de la peau exposée au soleil. Ces symptômes cutanés apparaissent très tôt, vers l’âge

de 1 ou 2 ans chez ces patients, et conduisent à l’apparition de cancers de la peau vers 8 ans

Ub Cdt2

Pol η

Cdt2 GEI-17

Cdt2

PCNA

A) En absence de GEI-17 B) En présence de GEI-17

Pol ε

Pol η

Pol η

Pol η

Pol η

Pol η

Pol η

Ub Ub

Ub Ub

Ub

S S

S S


79

(Kraemer et al, 1987). Ces anormalités de la peau résultent d’une exposition à la lumière du

soleil et sont causées par l’incapacité à réparer les dommages induits par les UV

(Lehmann et al, 1975; Lehmann et al, 1977). Ces lésions peuvent être prises en charge par

deux mécanismes : le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER) et le

mécanisme de synthèse translésionnelle lorsque ces lésions persistent en phase S. La

majorité des patients XP présentent un défaut de NER. Cependant, 20 % des patients XP,

appelés Xeroderma pigmentosum variant (XP-V) ont un mécanisme NER fonctionnel mais

présentent un défaut de TLS au travers de ces lésions persistantes (Lehmann et al, 1975;

Lehmann et al, 1977). En effet, la réplication de dommages induits par les UV est anormale

dans des extraits cellulaires de cellules XP-V (Cordeiro-Stone et al, 1997; Ensch-Simon et al,

1998; Svoboda et al, 1998). Plus tard, en 1999, Masutani et ses collaborateurs ont montré que

l’addition d’une protéine isolée à partir de cellules HeLa aux extraits cellulaires XP-V

permettait de restaurer une réplication normale des lésions CPD, induites par les radiations

UV (Masutani et al, 1999a). La séquence de cette protéine a été isolée et identifiée comme

l’homologue du gène Rad30 chez la levure, une ADN polymérase translésionnelle capable de

réaliser la réplication fidèle des lésions CPD induites par les UV. Ce gène est en fait muté

chez les patients XP-V et a été désigné sous le nom de hRAD30 ou Pol η (Johnson et al,

1999a; Masutani et al, 1999b). Les différents types de mutations observées peuvent être

classées en trois catégories : une troncation sévère induisant la perte du domaine catalytique,

une troncation moins sévère conduisant à la perte du domaine C-terminal et enfin des

mutations faux sens au niveau des résidus conservés du domaine catalytique (Broughton et al,

2002; Masutani et al, 1999b). Afin de confirmer le rôle de Pol η dans les XP-V, l’activité de

TLS de cette protéine au travers des dimères de thymines a été validée par des tests in vitro

(Haracska et al, 2000) et la sensibilité des cellules XP-V a été validée in vivo (Stary et al,

2003). De plus, l’activité TLS de Pol η sur les dimères de thymines est fidèle puisqu’elle

incorpore deux adénines face à cette lésion (Johnson et al, 2000b; Masutani et al, 2000). Il est

important de souligner que les foyers de Pol η observés après irradiation UV co-localisent

avec PCNA, avec les sites d’incorporation de BrdU ainsi qu’avec les sites de CPD, suggérant

que Pol η est recrutée au niveau des fourches de réplication bloquées par un dommage de

l’ADN induit par les UV (Kannouche et al, 2001). De plus, Pol η interagit directement avec

l’ubiquitine ligase de PCNA, RAD18, via son domaine C-terminal après irradiation UV

(Watanabe et al, 2004). Il faut noter que les foyers de REV1 co-localisent avec des foyers

Pol η (Tissier et al, 2004). La production d’un anticorps permettant de visualiser la protéine


80

REV1 endogène en immunofluorescence représente une grande avancée (Akagi et al, 2009).

En effet, la localisation en foyers de REV1 endogène est augmentée par expression ectopique

de Pol η (Akagi et al, 2009). Après exposition aux radiations UV, le nombre de cellules

présentant des foyers endogènes REV1 augmente dans les cellules exprimant Pol η mais pas

dans les cellules XP-V (Akagi et al, 2009) contrairement à la localisation ectopique de REV1

qui semble indépendante de Pol η (Murakumo et al, 2006). Bien que l’accumulation de REV1

au niveau des sites de dommages induits par les radiations UV dépende de la présence de

Pol η, Pol η s’accumule en foyers même sans REV1, suggérant que Pol η est recrutée

préférentiellement au niveau des lésions induites par les UV et indépendamment de REV1

(Akagi et al, 2009).

En revanche, cette ADN polymérase n’est pas capable de répliquer une autre lésion

induite par les UV, les 6-4 PP. Elle n’incorporerait qu’une guanine en face du premier T puis

se dissocierait de l’ADN et Pol ζ finirait la TLS (Zhang et al, 2000a). Pol η est aussi capable

de répliquer d’autres types de lésions tels que les O6-méthylguanines ou les

8-oxodésoxyguanosine (8-oxoG) mais cette fois-ci de manière moins fidèle. En effet, elle

incorpore un C ou un T en face la première lésion citée conduisant ainsi à des transitions

G→A, et un C ou un A en face la seconde lésion citée (Haracska et al, 2000; Masutani et al,

2000; Zhang et al, 2000c). Par conséquent, Pol η est spécialisée dans la réplication fidèle

des dimères de thymines, mais son site actif plus ouvert lui permet de répliquer d’autres

lésions de manière infidèle.

En accord avec ces résultats, les souris déficientes (Knock out, KO) pour Pol η sont

viables et fertiles et ne présentent aucun signe spontané au cours de la première année (Lin et

al, 2006). Cependant, les fibroblastes issus de ces souris sont sensibles aux radiations UV et

toutes les souris KO pour Pol η présentent des pigmentations accrues de la peau ainsi

que des tumeurs de la peau après irradiations UV (Lin et al, 2006; Ohkumo et al, 2006).

En outre, 37,5% des souris hétérozygotes pour Pol η développent aussi des tumeurs de la peau

5 mois après un traitement UV de 5 mois, suggérant que les humains hétérozygotes pour

Pol η présentent un risque important de développer des cancers de la peau (Lin et al, 2006).

Ce résultat a été confirmé indépendamment par Ohkumo et ses collaborateurs (Ohkumo et al,

2006). De plus, il a été proposé que Pol ι puisse intervenir au niveau des lésions UV en

absence de Pol η (Ohkumo et al, 2006). En effet, les souris déficientes en Pol η et Pol ι

développent des tumeurs de la peau quatre semaines avant les souris uniquement déficientes

en Pol η (Ohkumo et al, 2006).


81

c- Son rôle potentiel dans la TLS des pontages de l’ADN

Nous venons de voir que Pol η possède un site actif plus ouvert lui permettant de

répliquer de nombreuses lésions. Aux lésions induites par les UV s’ajoutent des dommages

induits par des agents pontants (Alt et al, 2007). En effet, des cellules XP-V, exprimant une

protéine Pol η non fonctionnelle, sont plus sensibles au Cisplatine que les cellules XP-V

complémentées par l’expression d’une protéine Pol η fonctionnelle ou que les cellules MRC5

(Albertella et al, 2005). Le Cisplatine est un agent chimio-thérapeutique couramment utilisé

en clinique. Les pontages intra-brin qu’il induit ne peuvent être répliqués par les ADN

polymérases réplicatives et constituent donc des lésions bloquant la réplication de l’ADN

(Hoffmann et al, 1995). Pareillement, les cellules XP-V sont aussi plus sensibles à des agents

tels que le carboplatine ou l’oxaloplatine qui ont des mécanismes d’action similaires au

Cisplatine (Albertella et al, 2005). Ces résultats sont en accord avec la capacité de Pol η à

répliquer des lésions induites par le Cisplatine in vitro (Vaisman et al, 2000).

Contrairement aux résultats présentés ci-dessus (Albertella et al, 2005), une autre

étude a démontré que les cellules XP-V utilisées ne sont pas sensibles au Cisplatine, bien

qu’une implication de Pol η au niveau de la TLS fidèle des lésions induites par le Cisplatine

soit proposée (Bassett et al, 2004). En effet, la mutagénèse induite par le Cisplatine est deux

fois plus élevée dans les fibroblastes déficients en Pol η par rapport aux fibroblastes normaux

ou aux fibroblastes présentant une forte expression de Pol η (Bassett et al, 2004). Les

différences entre ces deux études résident majoritairement dans les cellules utilisées ainsi que

dans le temps de traitement. En effet, dans la première étude citée (Albertella et al, 2005), ils

utilisent des lignées transformées par SV40 exprimant de manière stable Pol η à un niveau

égal ou légèrement supérieur au niveau endogène. En revanche, dans la deuxième étude

présentée (Bassett et al, 2004), des cellules primaires transfectées par hTERT pour les

immortaliser et des surexpressions de Pol η 50 fois plus élevées que le niveau endogène sont

utilisées. De plus, le temps de traitement varie entre 1h et 24h d’une étude à l’autre.

La sensibilité au Cisplatine observée dans les cellules déficientes en Pol η (Albertella

et al, 2005) est plus importante que celle observée dans les cellules déficientes pour le

mécanisme NER (mécanisme de réparation principalement utilisé face à ce type de lésion),

suggérant que la TLS par Pol η est au moins aussi importante que le NER pour

déterminer la survie cellulaire après traitement au Cisplatine (Albertella et al, 2005). De

plus, les cellules XP-V sont extrêmement sensibles au blocage en phase S induit par le

Cisplatine, appuyant le fait que Pol η intervienne au niveau de la TLS de ces dommages


82

(Albertella et al, 2005). En outre, PCNA est mono-ubiquitinylé après traitement au Cisplatine,

probablement pour favoriser le recrutement de Pol η au niveau des dommages (Albertella et

al, 2005). Enfin, Pol η s’associe au niveau des foyers de réplication avec PCNA après

traitement au Cisplatine (Albertella et al, 2005). En accord avec le rôle mutagène de Pol η

dans la TLS des dommages induits par le Cisplatine, les cellules déficientes pour le NER

accumulent plus de mutations lorsqu’elles sont traitées au Cisplatine (Bubley et al, 1991).

En revanche, les cellules déficientes en Pol η ne sont pas sensibles à des agents tels

que la Mitomycine C (MMC) qui induisent des pontages inter-brins (Albertella et al, 2005).

Cependant, un autre groupe démontre que Pol η serait partiellement requise pour la TLS des

adduits induits par la MMC (Zheng et al, 2003). Pour cela, ils ont développé un système

in vivo qui permet de mesurer l’élimination d’un pontage inter-brin induit par la MMC à un

endroit spécifique par l’utilisation d’un gène rapporteur, la luciférase. Ils montrent que

l’élimination des pontages inter-brin créés par la MMC est très faible dans des cellules XP-V

comparée aux cellules complémentées (Zheng et al, 2003). Ainsi, Pol η serait requise lors de

l’étape de TLS des lésions induites par la MMC.

Le psoralène est un autre agent pontant de l’ADN souvent utilisé en clinique pour

traiter par exemple les dermatoses inflammatoires (Dronkert & Kanaar, 2001). Il s’intercale

entre les bases de l’ADN et sous l’absorption d’un photon issu des radiations UVA forme des

mono-adduits avec les bases pyrimidines. L’absorption d’un second photon permet de former

un pontage inter-brin de l’ADN. Ainsi, l’utilisation de faibles doses d’UVA conduit à la

formation de mono-adduits alors que l’utilisation de fortes doses induit la formation de

pontages inter-brins. Pol η répondrait préférentiellement aux pontages inter-brins induit par le

psoralène plutôt qu’aux mono-adduits (Mogi et al, 2008). De plus, dans les cellules XP-V, le

niveau d’expression de γ-H2AX est augmenté de deux fois après traitement avec un dérivé du

psoralène couplé à des radiations UVA, ce traitement induisant la formation de foyers

γ-H2AX (Mogi et al, 2008). Par conséquent, Pol η serait impliquée dans la réponse

cellulaire aux pontages inter-brins induits par le psoralène, en intervenant au niveau des

cassures de l’ADN qui induisent la phosphorylation de H2AX (Fig 22).


83

Figure 22. Modèles de réparation des pontages inter-brins impliquant Pol η. Deux

mécanismes de réparation des pontages inter-brins ont été proposés. (A) Le premier représenté à gauche est initié par la formation de cassures double-brin de l’ADN reconnue par γ-H2AX. Ces cassures double-brin sont ensuite réparées par recombinaison homologue, mécanisme dans lequel Pol η pourrait être impliquée. (B) Le deuxième mécanisme est initié par la formation de cassures simple-brin de l’ADN issues de la première incision par le mécanisme NER. Pol η réalise ensuite la synthèse translésionnelle afin de compléter la brèche sur un des brins. Suite à la deuxième incision par le mécanisme de NER, Pol ζ complète la seconde brèche. (Adapté de (Mogi et al, 2008; Shachar et al, 2009; Szuts et al, 2008; Zheng et al, 2003))

Les cassures simple-brin de l’ADN seraient issues de la première incision par le

mécanisme NER. Pol η complèterait alors ces brèches par synthèse translésionnelle. Enfin,

après deuxième incision par le NER, Pol ζ complèterait la seconde brèche. Cependant, un

autre mécanisme est envisageable. L’endonucléase XPF/ERCC1 convertirait les lésions en

cassures double-brin de l’ADN (Mogi et al, 2008; Rothfuss & Grompe, 2004) qui pourront

par la suite être réparées par recombinaison homologue, mécanisme au cours duquel Pol η

pourrait être impliquée (Kawamoto et al, 2005; McIlwraith et al, 2005; McIlwraith & West,

2008). Il est important de noter que le mécanisme de réparation par excision de base (BER)

pourrait aussi intervenir au niveau des pontages de l’ADN (Couve-Privat et al, 2007).

d- Son rôle controversé dans la recombinaison homologue

Plus récemment Pol η a été impliquée au niveau du mécanisme de recombinaison

homologue (HR), mécanisme utilisé, comme nous l’avons vu précédemment, pour réparer les

cassures de l’ADN. En effet, dans l’article de McIlwraith et ses collaborateurs, les auteurs ont

mis en évidence une activité capable d’étendre une D-loop (un intermédiaire de la HR) à

Pol η

1ère incision NER

2ème incision NER

P P

P P

P Pγ-H2AX γ-H2AX

Pol η


A B

Pol ζ

Pontage inter-brin

Incisions indépendantes

du NER

Remplissage de brèche

Recombinaison homologue


84

partir d’extraits totaux de cellules HeLa (McIlwraith et al, 2005). Cette activité est présente

dans toutes les fractions contenant Pol η. Ils ont ensuite démontré que la protéine Pol η

purifiée pouvait étendre une D-loop, in vitro, contrairement à d’autres ADN polymérases

telles que Pol δ et Pol ι. De manière importante, des extraits de cellules XP-V, naturellement

déficientes en Pol η, ne permettent pas d’étendre une D-loop in vitro. Il avait précédemment

été démontré que les foyers de Pol η co-localisaient, de manière partielle, avec des foyers

RAD51 dans les cellules humaines seulement après irradiations UV (Kannouche et al, 2001).

Dans cette nouvelle étude, ils démontrent que Pol η et RAD51 interagissent après irradiations

UV via des expériences d’immunoprécipitation, et que la protéine RAD51 stimule l’activité

d’extension de Pol η au niveau d’une D-loop in vitro (McIlwraith et al, 2005). Ainsi, RAD51

pourrait jouer un rôle dans le recrutement de Pol η au niveau des D-loop. Dans une étude

plus récente, le même groupe a démontré que RAD52, RPA et Pol η étaient nécessaires pour

faciliter la capture de la deuxième extrémité de la CDB lors du mécanisme de HR in vitro

(Fig 23) (McIlwraith & West, 2008).

Dégradation des extrémités 5’

Invasion de brin

Synthèse d’ADN

Capture de la 2ème extrémité Synthèse d’ADN

Résolution des produits

Pol η ?

Pol η ?

Figure 23. Les différentes étapes de la HR. La première étape consiste à dégrader les extrémités 5’ de la CDB. L’invasion de brin et la synthèse d’ADN peuvent alors avoir lieu. Par la suite, RAD52, RPA et Pol η seraient nécessaires pour réaliser la capture de la deuxième extrémité de la CDB et pour la synthèse d’ADN. (Adapté de (McIlwraith & West, 2008))


85

Afin d’étudier le rôle potentiel de Pol η au niveau de la recombinaison homologue

in vivo, Kawamoto et ses collaborateurs ont analysé l’implication de Pol η au cours de la

conversion génique (CG) des gènes des immunoglobulines (Ig), responsables de la

diversification des anticorps dans les cellules de poulet DT40 (Kawamoto et al, 2005). Les

cellules DT40 déficientes en Pol η présentent une diminution de CG au niveau des Ig d’un

facteur 2 à 6 fois suivant le clone considéré (Kawamoto et al, 2005). Ce défaut de CG est

aussi observé lors de l’utilisation d’un substrat de recombinaison homologue permettant

d’analyser les CG après induction d’une CDB à un locus particulier par l’action d’une enzyme

de restriction (Fig 24). Ce défaut de CG est complémenté par la protéine Pol η humaine

sauvage mais pas par la protéine Pol η mutée dans le domaine catalytique. En revanche, les

cellules déficientes en Pol η ne sont pas déficientes en « gene targetting », ni sensibles aux

radiations ionisantes et n’accumulent pas non plus de CDB après irradiation (Kawamoto et al,

2005). Il est aussi important de souligner que les cellules de poulet DT40 ont un cycle

cellulaire extrêmement rapide et une proportion importante de cellules en phase S dans une

population asynchrone. De plus, ces cellules sont déficientes en p53 qui est connu pour

inhiber l’activité de RAD51 (Buchhop et al, 1997; Saintigny et al, 1999). Ces dernières

remarques pourraient expliquer que le rôle de Pol η lors du mécanisme de CG soit si bien mis

en évidence dans ce type de cellules.

D’autre part, les cellules XP-V transformées par SV40 présentent des fréquences

d’échanges de chromatides sœurs (SCE) plus élevées que des fibroblastes normaux après

traitement UV (Cleaver et al, 1999). Les mêmes cellules XP-V non transformées présentent

une induction de SCE après radiations UV comparable à celle observée dans les cellules

normales (De Weerd-Kastelein et al, 1977). Ces résultats questionnent fortement un rôle de

site ISceI

I-SceI

DDoouubbllee ssttrraanndd bbrreeaakk

neo neo

Figure 24. Modèle simplifié du substrat de recombinaison utilisé dans l’article (Kawamoto et al, 2005). Le substrat de HR est composé de deux copies inactives de résistance à la Néomycine. Après induction d’une CDB par transfection d’un plasmide codant pour l’enzyme de restriction I-SceI, les évènements de conversion génique permettent de restaurer une copie fonctionnelle du gène de résistance à la Néomycine.


86

Pol η dans la recombinaison homologue. Les différences de phénotypes observées entre les

cellules transformées et les cellules non transformées seraient dues au statut de p53

(Cleaver et al, 1999). En effet, les cellules transformées, déficientes en p53, ne présentent plus

d’inhibition pour l’activité de RAD51, ce qui permet une induction des évènements de HR

(Buchhop et al, 1997; Saintigny et al, 1999).

En outre, chez la levure, l’ADN polymérase réplicative Pol δ serait

préférentiellement recrutée lors du mécanisme de HR (Maloisel et al, 2008). En effet, le

défaut de HR observé en absence de Pol δ n’est pas seulement visible lors de la méiose

(Maloisel et al., 2004) puisque des fragments plus courts de CG sont aussi observés après

induction de CDB par l’endonucléase HO (Maloisel et al., 2008). De plus, le mutant de Pol δ

présente aussi un défaut de HR après irradiation UV (Maloisel et al, 2008). Ces résultats

suggèrent donc que le rôle de Pol δ au niveau de la HR ne dépende pas de la nature de la

lésion initiatrice du mécanisme. En outre, Pol δ participerait à l’élongation de l’ADN au cours

du mécanisme de HR puisque son absence induit la formation d’intermédiaires de HR plus

courts (Maloisel et al, 2008). Il est important de souligner que le mutant de Pol η chez la

levure présente un phénotype hyper-recombinogène après irradiation UV mais non après

radiations ionisantes (Maloisel et al, 2008). De plus, l’absence de Pol η dans les mutants de

Pol δ ne change pas la taille des fragments de CG, suggérant que Pol η ne participe pas à la

HR ou que son rôle peut facilement être remplacé (Maloisel et al, 2008).

En conclusion, le rôle de Pol η dans le mécanisme de HR n’est pas encore

complètement compris. De plus, ce rôle n’a encore jamais été étudié dans les cellules

humaines où la régulation de tels mécanismes est certainement beaucoup plus fine.

e- Son rôle dans l’hypermutation somatique dans les cellules B

L’hypermutation somatique est un processus mutagène, physiologique, spécifique aux

cellules B, qui permet de diversifier les gènes des immunoglobulines (Ig) lors de la

différenciation des cellules B. Ce processus contribue à la diversification du répertoire des Ig

et permet d’affiner la maturation des Ig au cours de la réponse immunitaire, via la sélection de

cellules B présentant les meilleures capacités de liaison à l’antigène (Longo & Lipsky, 2006).

L’hypermutation somatique est initiée par l’enzyme AID (Activation-Induced-cytidine

Deaminase) qui transforme les cytosines en uraciles dans les cellules B activées, ces uraciles

devant par la suite être otées de l’ADN (Muramatsu et al, 2000). Les mutations finalement

introduites dans les régions variables des Ig sont distribuées de manière équivalente entre G/C


87

et A/T car les mécanismes de réparation lors de ce processus sont mutagènes afin

d’augmenter le spectre de mutations et donc la diversité des anticorps (Reynaud et al, 2003).

Malgré le nombre important de facteurs capables d’intervenir au niveau des uraciles dans les

cellules eucaryotes, seuls quelques uns d’entre eux sont clairement impliqués au niveau de

l’hypermutation (Fig 25). Les ADN polymérases TLS interviennent dans la synthèse

réparatrice, suite à l’action de l’uracil-N-glycosylase (UNG) sur l’uracile, en présence ou non

des protéines MSH2-MSH6 du MMR (Frey et al, 1998; Rada et al, 1998; Rada et al, 2002).

Figure 25. Modèle de l’impact du complexe MSH2-MSH6 sur l’activité de l’uracil-N-glycosylase (UNG) au cours de l’hypermutation somatique. (A) Schéma simplifié de l’hypermutation. En présence de MSH2-MSH6, UNG va majoritairement créer des sites abasiques au niveau des uraciles. Ces lésions seront ensuite réparées par TLS au cours de la phase S via l’action d’ADN polymérases telles que Rev1 ou Rev3. Ce complexe MSH2-MSH6 recrutera Pol η pour réparer le brin contenant l’uracile majoritairement en phase G1. (B) Différents rôles possibles de la glycosylase UNG en absence de MSH2-MSH6 et les conséquences en termes d’hypermutation dans les souris déficientes en MSH2. D’une part, l’intervention du mécanisme de réparation fidèle peut être augmentée conduisant à une baisse de la fréquence de mutations. D’autre part, UNG peut recruter Pol η pour participer à la réparation infidèle conduisant à des mutations A/T résiduelles. Enfin, AID pourrait ne pas être déplacée et augmenter de ce fait les transitions G/C. (Adapté de (Delbos et al, 2007))

Les ADN polymérases translésionnelles ont été considérées comme des candidats

majeurs pour générer des mutations au niveau des bases A/T à partir de la déamination

initiale. En effet, les patients XP-V, naturellement déficients en Pol η, présentent une

mutagénèse réduite au niveau des bases A/T dans les gènes des Ig (Faili et al, 2004; Zeng et

al, 2001; Zeng et al, 2004). L’inactivation de Pol η chez la souris a permis de confirmer ce

phénotype (Delbos et al, 2005; Martomo et al, 2005; Martomo et al, 2006). Pareillement,

l’inactivation de Msh2 chez la levure conduit à une diminution de la mutagénèse au niveau

des bases A/T (Frey et al, 1998; Rada et al, 1998). De ce fait, il a été proposé que le

mécanisme de réparation médié par UNG soit responsable de la majorité des mutations au

U G

UNG MSH2-6

Pol η Site abasiqueAutres Pol

UG

CG

UG

G

GC UG

UG AC

Réparation Réparation mutagène

Pas d’accès

Fréquence de mutation réduite

Mutagénèse A/T résiduelle

Augmentation des transitions GC

A B

UNG MSH2-6

UNGUNG Pol η AID


88

niveau des bases G/C, alors que le mécanisme médié par MSH2 contribue aux mutations

observées au niveau des bases A/T (Rada et al, 2004). Cependant, en absence de MSH2, des

mutations résiduelles sont présentes au niveau des bases A/T (Delbos et al, 2005). Ces

mutations résiduelles seraient en fait dues à l’action de Pol η mais cette fois-ci via la voie

dirigée par UNG (Fig 25). Par conséquent, Pol η serait la seule ADN polymérase générant

des mutations au niveau des bases A/T au cours du processus de mutagénèse

physiologique (Delbos et al, 2007).

Ainsi, outre sa fonction dans la TLS des CPD, Pol η joue également un rôle en

absence de stress génotoxique car elle contribue à l’hypermutation somatique dans les cellules

B et donc à la réponse immunitaire.

3. Pol ι : le paralogue de Pol η

L’ADN polymérase ι, le plus proche homologue de Pol η, a été découverte il y a dix

ans (McDonald et al, 1999). Il s’agit d’une protéine de 80 kDa codée par le gène POLI

localisé en position 18q21.1 (Johnson et al, 1999c). Pol ι possède deux activités : une activité

ADN polymérase et une activité dRP-lyase localisées toutes deux dans le domaine

N-terminal de la protéine. La partie C-terminale de Pol ι contient un domaine de liaison à

Pol η (Kannouche et al, 2002) ainsi que deux domaines de liaison à l’ubiquitine (UBM)

(Bienko et al, 2005). En revanche, Pol ι ne possède pas de signal de localisation nucléaire

(NLS), mais elle est tout de même localisée dans le noyau (Kannouche et al, 2002). Le

domaine requis pour cette localisation nucléaire est compris entre les acides aminés 219 et

451 (Kannouche et al, 2002). Cette ADN polymérase est particulière puisque sa structure

permet uniquement des appariements de bases en Hoogsteen (Nair et al, 2004; Nair et al,

2005b).

La fidélité de cette enzyme in vitro dépend de manière très importante de la séquence

servant de matrice. En effet, lorsqu’elle réplique la base A, Pol ι est relativement fidèle

puisque son taux d’erreur est de 10-4 (Tissier et al, 2000b). Par contre, lorsqu’elle réplique la

base T, elle incorpore préférentiellement la base G, au lieu de la base A prévue par la loi

d’appariement de Watson-Crick (Tissier et al, 2000b; Zhang et al, 2000c).

Depuis sa découverte, cette enzyme a été surexprimée, purifiée et caractérisée dans de

nombreux laboratoires. Malheureusement, les résultats publiés en utilisant les mêmes


89

substrats d’ADN varient d’un groupe à l’autre. Ces résultats contradictoires peuvent

s’expliquer par l’utilisation de systèmes de production ou de constructions différents afin de

faciliter l’étape de purification, mais aussi par les conditions de réplication in vitro qui varient

d’une étude à l’autre. Contrairement à la majorité des ADN polymérases, Pol ι est inhibée par

des concentrations modérées en NaCl ou en KCl. De plus, des études récentes ont montré que

l’activité de Pol ι est maximale lorsque les concentrations en cations Mg2+ et Mn2+ sont

faibles (Frank & Woodgate, 2007; Pence et al, 2009). Malheureusement, la majorité des

études de réplication sur ADN endommagé a été réalisée in vitro en présence de NaCl, KCl et

Mg2+, conditions qui ne sont pas optimales pour Pol ι.

En raison de son infidélité sur de nombreux substrats, il semblait clair qu’un défaut de

Pol ι in vivo devait conduire à un phénotype remarquable. Cependant, les souris 129 qui

possèdent une mutation non sens dans l’exon 2 du gène Poli murin ne présente aucune

anormalité de croissance (McDonald et al, 2003). Toutefois, les souris 129 présentent une

prédisposition plus forte aux cancers du poumon induit par l’uréthane (Lee & Matsushita,

2005). Ainsi, une des fonctions de Pol ι serait donc de protéger les cellules humaines

contre des carcinogènes induisant des cancers du poumon.

Alors que Pol ι a été caractérisée de manière intensive in vitro, peu d’études se sont

concentrées sur le rôle cellulaire de cette ADN polymérase. Cependant, des rapports récents

indiquent que Pol ι serait importante pour protéger les cellules humaines contre les

conséquences délétères des dommages oxydatifs de l’ADN ou induits par les radiations UV.

a- Le rôle de Pol ι au niveau des dommages oxydatifs de l’ADN

Parmi les dommages de l’ADN résultants de l’attaque des espèces oxygénées

réactives, nous retrouvons les oxydations de bases, les sites apurinique/apyrimidinique (AP),

les cassures de l’ADN et les liaisons ADN-Protéines. Nous avons vu précédemment que les

bases oxydées ou les sites AP étaient majoritairement réparés par le mécanisme d’excision de

base (BER) impliquant Pol β. Cependant, une étude récente démontre que Pol ι pourrait

participer in vivo à la réparation des bases oxydées (Petta et al, 2008). En effet, l’extinction

de Pol ι par interférence ARN dans les cellules humaines rend les cellules hyper-sensibles à

des agents oxydants tels que le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et la ménadione mais pas à des

composés alkylants tels que la neocarzinostatine qui crée des cassures de l’ADN, ni à des

radiations UVC ou UVA. De plus, la sensibilité à H2O2 est reversée par l’expression

ectopique de Pol ι, excluant les effets non spécifiques des siRNA utilisés.


90

Dans cette même étude, ils ont analysé la localisation cellulaire de Pol ι couplée à la

GFP (puisqu’il n’existe pas à ce jour d’anticorps fonctionnant en immuno-fluorescence) dans

des cellules exposées à de fortes irradiations locales avec un laser à 405 nm. Un tel traitement

induit des cassures simple et double-brin de l’ADN ainsi que des dommages de base de

l’ADN. Les auteurs émettent l’hypothèse que Pol ι serait recrutée spécifiquement au niveau

des bases endommagées puisqu’aucun recrutement n’a été observé avec des doses plus faibles

d’irradiations conduisant majoritairement à des cassures simple-brin de l’ADN. De plus, le

recrutement de Pol ι est augmenté par addition d’un photo-sensibilisateur, le

8-méthoxypsoralène, qui est connu pour induire l’accumulation des ADN glycosysales OGG1

et NTH1 au niveau des bases oxydées (Prasad et al, 2007). En outre, la relocalisation de Pol ι

après irradiation n’est pas altérée dans les cellules XP-V, naturellement déficientes en Pol η,

indiquant que la localisation de Pol ι au niveau de dommages induits par irradiation laser ne

dépend pas de la présence de Pol η (Petta et al, 2008).

Par construction de différents mutants, ce même groupe a démontré que les acides

aminés compris entre les positions 219 et 451 étaient suffisants pour induire la relocalisation

de Pol ι après irradiation laser (Petta et al, 2008). Cette région contient un motif

hélice-boucle-hélice (HhH) qui pourrait être le centre catalytique servant à l’excision du

groupement desoxyribose phosphate (Vidal & Woodgate, 2009). Des mutations au niveau de

ce domaine, réduisent la relocalisation de Pol ι après irradiation laser mais ce défaut est

augmenté lorsque le premier UBM de Pol ι est aussi muté. Cet UBM, localisé au niveau des

acides aminés 498-526, permet la liaison à l’ubiquitine ainsi que la localisation de Pol ι au

niveau des fourches de réplication (Prasad et al, 2007). Un mutant possédant les deux

mutations au niveau du motif HhH et de l’UBM est incapable de complémenter la sensibilité à

H2O2 des cellules déficientes en Pol ι (Petta et al, 2008). Ce résultat suggère donc que ces

deux domaines ne sont pas seulement nécessaires pour le recrutement de Pol ι, mais aussi

pour sa fonction de réparation au niveau des bases oxydées de l’ADN.

Un rôle de Pol ι dans le BER est appuyé par le fait que Pol ι soit recrutée en même

temps que les protéines du BER telles que XRCC1 ou FEN1 au niveau de la chromatine

après traitement H2O2 (Petta et al, 2008). Nous savons que XRCC1 interagit physiquement

avec la majorité des protéines impliquées dans le BER à ce jour (Almeida & Sobol, 2007) et

XRCC1 interagirait aussi avec Pol ι dans les cellules humaines (Petta et al, 2008). Une telle

interaction favorise sûrement le recrutement de Pol ι au niveau des sites de dommages

oxydatifs.


91

En accord avec ces résultats, Pol ι est une ADN polymérase qui fonctionne dans un

mécanisme de BER in vitro (Bebenek et al, 2001; Prasad et al, 2003). En effet, des substrats

contenant des uraciles, l’activité ADN polymérase et dRP-lyase de Pol ι en présence d’autres

enzymes du BER permettent de compléter la réparation (Bebenek et al, 2001; Prasad et al,

2003). Cette activité est aussi efficace que celle de Pol β et la protéine Pol ι purifiée est

capable de complémenter un défaut de BER existant dans des cellules déficientes en Pol β

(Prasad et al, 2003).

Ce nouveau rôle de Pol ι soulève encore de nombreuses questions. Tout d’abord,

quelle est la nature exacte du dommage oxydatif de l’ADN responsable de la mort cellulaire

en absence de Pol ι ? Ensuite, est ce que Pol ι fonctionne comme une enzyme de réparation ou

une enzyme translésionnelle en face de ce dommage oxydatif ? Ce mécanisme est-il fidèle ou

provoque-t-il des erreurs ? Il est important de souligner que Pol ι possède une activité

dRP-lyase qui permet l’excision du groupement desoxyribose phosphate (Bebenek et al,

2001). Etant donné cette activité, il est naturel de supposer que Pol ι participe au mécanisme

fidèle de BER, par exemple au niveau des lésions thymines. En effet, cette enzyme est

capable d’incorporer de manière fidèle un T en face d’un A sur une matrice non endommagée

(Tissier et al, 2004). Nous pouvons aussi nous demander quels acides aminés composent le

site actif de l’activité dRP-lyase et comment Pol ι est régulée pour que son rôle soit réduit aux

bases oxydées et non aux dommages créés par alkylation. L’étude des partenaires potentiels

de Pol ι au niveau de ce rôle permettrait sûrement de répondre à certaines de ces questions.

b- Le rôle de Pol ι en hypoxie

Il est connu que l’incubation de cellules en hypoxie conduit à une augmentation de la

fréquence des mutations ponctuelles, telles que des transversions CG AT ou TA GC

(Yuan et al, 2000). Bien que le mécanisme expliquant la mutagénèse induite par l’hypoxie ne

soit pas connu, les ROS sont inévitablement impliquées. En effet, les ROS sont surproduites

durant la ré-oxygénation et génèrent des modifications de bases telles que les 8-oxo-guanines

(Breen & Murphy, 1995; Ito et al, 2006). La présence de 8-oxo-guanines dans l’ADN conduit

à des transversions CG AT ou TA GC puisque des adénines et des cytosines peuvent être

incorporées en face de ces lésions au cours de la réplication (Shibutani et al, 1991). Dans des

conditions d’hypoxie, certaines ADN polymérases translésionnelles impliquées dans la TLS

de ces lésions pourraient être sur-régulées. En effet, l’expression de l’ARNm de Pol ι est

fortement augmentée dans des conditions hypoxiques dans de nombreuses lignées


92

cellulaires (Ito et al, 2006). De plus, le niveau protéique de Pol ι est aussi augmenté (Ito et

al, 2006). Enfin, l’expression de Pol ι est contrôlée par un facteur majeur de l’hypoxie,

HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor 1) dans des conditions hypoxiques (Ito et al, 2006). Ainsi,

en accord avec le rôle de Pol ι au niveau des dommages oxydatifs, l’hypoxie augmente le

niveau d’expression de Pol ι (Ito et al, 2006).

c- Le rôle de Pol ι au niveau des lésions de l’ADN induites par les UV

La capacité de Pol ι à répliquer un dimère de thymines (CPD), une lésion induite par

les radiations UV in vitro est assez controversée. En effet, certaines études démontrent que

Pol ι n’est pas capable d’insérer une base en face le T en 3’ (Johnson et al, 2000b; Zhang et

al, 2001) alors que d’autres affirment que cette enzyme incorpore la mauvaise base en face le

T en 3’ et qu’elle n’est pas capable de complètement répliquer cette lésion (Frank &

Woodgate, 2007; Tissier et al, 2000a; Vaisman et al, 2000; Vaisman et al, 2003). De plus,

Pol ι interagit avec Pol η et cette interaction est nécessaire pour que Pol ι se localise au

niveau des foyers de dommages induits par les UV (Kannouche et al, 2003). Le rôle de Pol ι

au niveau de la synthèse translésionnelle des dommages induits par les UV in vivo est

probablement masqué par l’activité de Pol η (Johnson et al, 1999b; Masutani et al, 1999a).

Cependant, trois études indépendantes ont permis de mettre en évidence un rôle de Pol ι au

niveau des lésions induites par les UV.

D’une part, les souris portant une mutation dans le gène Polh ont été croisées avec des

souris 129, générant ainsi des souris déficientes en Polh ou Poli seul ou déficientes pour ces

deux gènes (Ohkumo et al, 2006). Ces souris ont ensuite été irradiées aux UV tous les jours

pendant 20 semaines et l’apparence des tumeurs de la peau a été suivie. De manière

intéressante, les souris déficientes en Polh et Poli commencent à développer des tumeurs

de la peau quatre semaines avant les souris déficientes seulement en Polh (Ohkumo et al,

2006). De plus, la présence de sarcomes a été observée dans les souris déficientes en Poli

(Ohkumo et al, 2006), suggérant que Pol ι participe au mécanisme de réparation ou de

tolérance qui protège les mammifères contre les tumeurs de la peau induites par les UV.

En utilisant des souris générées de manière indépendante, Dumstorf et ses

collaborateurs ont aussi observé l’apparition de tumeurs de la peau quatre semaines avant

dans les souris déficientes en Polh et Poli comparées aux souris déficientes en Polh

uniquement (Dumstorf et al, 2006). De manière intéressante, la fréquence de mutations

induites par les UV au niveau du locus Hprt dans les fibroblastes primaires déficients en Pol ι


93

est réduit de 4,5 fois en absence de Pol η mais aussi de 2,5 fois en présence de Pol η

(Dumstorf et al, 2006). Ces résultats indiquent que Pol ι ne sert pas seulement de secours en

absence de Pol η, mais elle a aussi la capacité d’induire de la mutagénèse après

radiations UV, in vivo, même en présence d’une enzyme plus efficace pour répliquer les

CPD.

Enfin, dans une étude récente, Gueranger et ses collaborateurs ont généré des lignées

cellulaires humaines déficientes en Pol η ou Pol ι et déficientes pour les deux ADN

polymérases (Gueranger et al, 2008). Bien que la lignée cellulaire déficiente en Pol ι ne soit

pas plus sensible aux UV que les cellules sauvages, la lignée cellulaire déficiente pour Pol ι et

Pol η est plus sensible que la lignée cellulaire déficiente en Pol η (Gueranger et al, 2008).

Ainsi, Pol ι participe à la réplication des lésions induites par les UV in vivo et

particulièrement lorsque Pol η est absente. De plus, cinq points chauds de mutagénèse ont été

mis en évidence dans la lignée cellulaire déficiente en Pol η qui disparaissent dans la lignée

cellulaire déficiente en Pol η et Pol ι (Gueranger et al, 2008). Ces points chauds sont localisés

au niveau de dimères T-T dans un contexte favorable à la réplication dépendante de Pol ι

(Frank & Woodgate, 2007; Vaisman et al, 2006).

Ces trois études, qui utilisent des stratégies différentes, impliquent Pol ι au niveau des

lésions induites par les UV in vivo. Le fait que les souris déficientes en Pol ι développent des

tumeurs plus rapidement que les souris sauvages suggèrent qu’au moins une partie de la

réplication des lésions UV par Pol ι est fidèle et donc que Pol ι protège les mammifères des

effets délétères d’une exposition aux radiations UV.

d- Les protéines partenaires de Pol ι

Quel que soit son rôle in vivo, Pol ι doit être fortement contrôlée pour qu’elle ne

puisse agir que sur le ou les substrats spécifiques de son activité. Il est possible que cette

régulation soit réalisée via ses interactions avec ses partenaires fonctionnels (Fig 26).

Pour le moment différentes interactions ont été mises en évidence : avec Pol η

(Kannouche et al, 2002), avec PCNA (Vidal et al, 2004) avec REV1 (Guo et al, 2003; Ohashi

et al, 2004; Tissier et al, 2004), avec l’ubiquitine et PCNA-ubiquitinylé (Bienko et al, 2005;

Plosky et al, 2006) et avec XRCC1 (Petta et al, 2008). De plus, la présence de Pol ι au niveau

des fourches de réplication est fortement déterminée par sa capacité à interagir avec PCNA et

PCNA-ubiquitinylé. En effet, un mutant de Pol ι, incapable d’interagir avec ces protéines, ne

se localise pas en foyers après dommages de l’ADN (Plosky et al, 2006; Vidal et al, 2004).


94

L’interaction de Pol ι avec PCNA-ubiquitinylé peut avoir deux buts : stabiliser Pol ι au

niveau des fourches de réplication ou réguler son accès au niveau du brin néo-synthétisé

pour faciliter la TLS.

Alors que l’interaction avec PCNA-ubiquitinylé semble recruter les ADN polymérases

de la famille Y pour participer à la TLS, l’interaction avec XRCC1 ou d’autres protéines

du BER pourrait faciliter la fonction de réparation de Pol ι au cours du BER (Petta et al,

2008). De manière intéressante, Pol ι formerait un complexe stable avec une autre protéine de

50 kDa (Sabbioneda et al, 2008). Cependant, aucun partenaire connu de Pol ι n’a un poids

moléculaire de 50 kDa, suggérant qu’au moins un autre partenaire de Pol ι pourrait réguler

son activité in vivo.

Figure 26. Les deux rôles possibles de l’ADN polymérase ι. (A) Une lésion induite par les

UV (dimère de thymines) bloquant la réplication, peut être répliquée de manière fidèle par Pol η. La présence de Pol ι au niveau de la fourche de réplication est favorisée par son interaction avec PCNA, Pol η et l’ubiquitine. (B) De plus, Pol ι pourrait aussi participer au BER des dommages oxydatifs via son interaction avec XRCC1 ou une protéine ubiquitinylée non connue du BER. Ce deuxième schéma montre les interactions possibles entre XRCC1 et d’autres protéines du BER telles que l’endonucléase APE1, les ADN glycosylases OGG1et NTH1 et l’ADN ligase III. Le complexe du BER est représenté au niveau d’une cassure simple-brin avec le 5’ desoxyribose phosphate, un des substrats potentiel de Pol ι. (Adapté de (Vidal & Woodgate, 2009))

4. Pol κ : l’homologue de DinB chez E. coli


Bien que le gène DinB chez E. coli fût premièrement identifié en 1980 comme un gène

significativement surexprimé au cours de la réponse SOS (Kenyon & Walker, 1980), il a

APE1 LIG3

TT ^ Ub

Ub

Pol η

Pol ι A) Réplication au niveau

d’une lésion UV

B) Dommage oxydatif

Pol ι

Pol ι

Ub

XRCC1 OH dRP

OGG1 NHT1

?

Ub


95

fallut attendre 20 ans pour que son activité ADN polymérase soit découverte (Wagner et al,

1999).

Pol κ est une protéine de 99 kDa codée par le gène POLK situé en position 5q13.1,

qui s’étend sur 87,5 kb et qui est composé de 13 exons et 14 introns (Gerlach et al, 1999).

Contrairement aux ADN polymérases réplicatives qui ne possèdent que des domaines

activateurs, une région répresseur de 465 pb au niveau du promoteur de POLK a été

identifiée (Lemee et al, 2007). En outre, une région activatrice de 237 pb a été identifiée

contenant des éléments de réponse à SP1 (Stimulating protein 1) et des sites de liaison aux

éléments de réponse à l’AMP-cyclique (Cyclic AMP responsive elements, CRE) (Lemee et

al, 2007).

Le domaine polymérase est localisé dans le domaine N-terminal de la protéine

(Gerlach et al, 1999; Ogi et al, 1999). Le domaine C-terminal de Pol κ présente 60%

d’homologie entre l’ADN polymérase humaine et murine (Ogi et al, 1999) mais n’est pas

présent ni chez la bactérie, ni chez l’archae (Prakash et al, 2005). La fonction de ce domaine

n’est pas encore véritablement connue et il n’a pas encore été cristallisé. Comme toutes les

ADN polymérases de la famille Y, Pol κ ne possède pas d’activité de correction d’erreur

3’-5’ exonucléase (Gerlach et al, 2001; Ohashi et al, 2000b; Zhang et al, 2000d). En outre, les

souris déficientes en Pol κ sont viables et fertiles, démontrant que cette protéine n’est pas

essentielle (Schenten et al, 2002). La processivité de Pol κ est modérée puisque lors d’un

cycle d’association et de dissociation, elle incorpore de 1 à 25 nucléotides (Ohashi et al,

2000a). Elle est aussi infidèle puisqu’elle réalise 760 erreurs par 105 nucléotides alors que

Pol δ ne produit que 3 erreurs lors du test de mutagénèse M13 (Ohashi et al, 2000a).

Cependant, Pol κ est l’ADN polymérase de la famille Y la plus fidèle. En effet, Pol η et

Pol ι font respectivement 3700 et 72 000 erreurs (Ohashi et al, 2000a). Cette caractéristique

serait certainement due à son site actif plus refermé que celui des autres ADN polymérases de

la famille Y (Jia et al, 2008; Lone et al, 2007; Uljon et al, 2004).

Pol κ est régulée par des modifications post-traductionnelles comme la

mono-ubiquitination. En effet, cette protéine contient deux domaines de liaison à l’ubiquitine

UBZ dans la partie C-terminale (Bienko et al, 2005). De plus, Pol κ interagit avec le

complexe PCNA/RFC/RPA qui stimule son activité mais pas sa processivité (Haracska et al,

2002b). La co-localisation au niveau de foyers de réplication de PCNA et Pol κ dans les

cellules confirme l’interaction de ces deux protéines (Bergoglio et al, 2002). Cette interaction

aurait lieue via le PIM située dans la partie C-terminale de Pol κ. Chez E. coli, DinB interagit


96

aussi avec le β-clamp et le site requis pour cette interaction à la fois in vitro et in vivo a

d’abord été localisé au niveau du PIM motif dans les derniers acides aminés de DinB

(Lenne-Samuel et al, 2002). Cependant, un deuxième domaine d’interaction dans le petit

doigt de DinB a été identifié et cristallisé (Bunting et al, 2003). Ce deuxième domaine

pourrait induire un changement entre une position où DinB est orienté vers le solvant et une

position où l’ADN polymérase pivote et interagit fortement avec l’ADN (Bunting et al, 2003).

Lorsque la protéine Pol κ est fusionnée avec la GFP, elle est distribuée en foyers

contenant PCNA dans 20 % des cellules d’une population cellulaire asynchrone en absence de

tout traitement et elle est diffuse dans le noyau des autres cellules (Bergoglio et al, 2002). La

proportion des cellules présentant des foyers Pol κ augmente à 60-75% quelques heures après

traitement avec des agents endommageant tels que le Cisplatine ou le benzopyrène (BPDE)

(Bassett et al, 2004). La relocalisation en foyers au niveau de fourches de réplication bloquées

semble être un mécanisme général des ADN polymérases de la famille Y étant donné que

Pol η et Pol ι se comportent de manière similaire (Kannouche et al, 2001; Kannouche et al,

2002). Cependant, une étude menée par un groupe indépendant, démontre que la localisation

de Pol κ au niveau de foyers de réplication et l’accumulation de cellules avec des foyers Pol κ

après traitements UV ou HU sont beaucoup plus limitées qu’avec les autres ADN

polymérases de la famille Y (Ogi et al, 2005). De plus, seule une faible partie des cellules

présentant des foyers PCNA contiennent des foyers Pol κ (Ogi et al, 2005). La différence

entre les deux études est simplement la manière de comptabiliser les cellules présentant des

foyers Pol κ. En effet, dans la première étude citée (Bergoglio et al, 2002), les cellules

présentant seulement quelques foyers Pol κ étaient comptabilisées positivement alors que

dans la deuxième étude (Ogi et al, 2005), seule les cellules avec de nombreux foyers Pol κ

étaient comptabilisées. Mais les deux études concluent que la localisation de Pol κ en foyers

est différente et beaucoup plus faible que celle de Pol η, par exemple.

b- Son rôle établi dans la TLS

La capacité de Pol κ à réaliser la TLS in vitro a été étudiée de manière extensive dans

différents laboratoires. Pol κ est incapable de répliquer les lésions induites par le Cisplatine

(Gerlach et al, 2001; Ohashi et al, 2000b) et les lésions induites par les UV que ce soient des

photoproduits 6-4 ou des dimères de thymines (CPD) (Ohashi et al, 2000b; Zhang et al,

2000b). Des tests de réplication de sites absiques ont donné des résultats contradictoires. Dans

la première étude (Johnson et al, 2000a) Pol κ ne réalise aucune TLS alors que dans trois


97

autres études (Ohashi et al, 2000b; Wolfle et al, 2003; Zhang et al, 2000d), Pol κ insère un A

avec une efficacité 250 fois moins importante que sur un ADN non endommagé. De plus,

Pol κ réalise de la TLS fidèle en face d’une 8-oxo-guanine (Zhang et al, 2000b), d’une

éthéno-désoxyadenine (Levine et al, 2001), d’un thymine glycol (Fischhaber et al, 2002), d’un

BPDE-dG (Suzuki et al, 2002; Zhang et al, 2000b), de lésions AF-dG ou AAF-dG (Gerlach et

al, 2001; Suzuki et al, 2002; Zhang et al, 2000b). Ces résultats suggèrent donc que Pol κ

aurait préférentiellement un rôle au niveau des bases oxydées ou des adduits

aromatiques. En accord avec ces résultats, les cellules déficientes en Pol κ sont plus

sensibles au benzopyrène (BPDE), présent notamment dans la fumée de cigarette, et

présentent une mutagénèse plus importante que des cellules contrôles (Ogi et al, 2002). De

plus, les cellules déficientes en Pol κ sont arrêtées en phase S après traitement au BPDE et

présentent une augmentation des CDB, ainsi qu’une activation des kinases ATM et Chk2 (Bi

et al., 2005). L’utilisation de cellules de souris déficientes en Pol κ a permis de montrer que

Pol κ est responsable des deux tiers de la TLS des adduits BDPE. Cette synthèse est fidèle à

70% dans les cellules de souris et à 90-100% dans les cellules humaines (Avkin et al, 2004).

Bien que Pol η puisse réaliser de la TLS au niveau des lésions BPDE in vitro (Shachar et al,

2009), ce rôle ne semble pas retrouvé in vivo, puisque les cellules XP-V ne sont pas affectées

par le BPDE (Avkin et al, 2004).

Etant donné que Pol κ est capable d’étendre des mésappariements (Washington et

al, 2002; Zhang et al, 2000d), la capacité de cette ADN polymérase à synthétiser de l’ADN à

partir d’un nucléotide incorporé par une autre ADN polymérase en face une lésion a été

étudiée pour de nombreuses lésions (je ne citerai que deux exemples ci-dessous). En effet,

bien que les lésions UV bloquent Pol κ, cette enzyme peut synthétiser de l’ADN à partir d’un

G inséré en face le T en 3’ d’un dimère de thymines. En revanche, aucune extension n’est

possible à partir de n’importe quel nucléotide inséré en face le T en 3’ d’un photo-produit 6-4

(Washington et al, 2002). Un autre exemple a été étudié au niveau des lésions 8-oxo-G qui

sont répliquées de manière efficace par l’action de Pol δ et Pol κ. En effet, l’étape d’insertion

est réalisée soit par Pol δ qui incorpore un C ou un A en face de la lésion, soit par Pol κ qui

insère les mêmes nucléotides mais avec une efficacité différente. L’étape d’extension est

ensuite réalisée par Pol κ (Haracska et al, 2002b).


98

Par conséquent, Pol κ permet de protéger les cellules contre les effets cytotoxiques et

mutagènes d’agents induisant des adduits en position N2 des déoxy-guanines. Cette ADN

polymérase jouerait aussi un rôle prépondérant dans l’extension de la réplication de

certains dommages de l’ADN.

c- Son rôle dans le mécanisme de réparation par excision de nucléotide

De manière surprenante, des études indépendantes ont démontré que l’absence de

Pol κ chez la souris ou dans les cellules de poulet DT40 induisait une sensibilité

importante aux radiations UV, même si Pol κ n’est pas capable de répliquer in vitro des

lésions induites par les UV (Bi et al, 2005; Ogi et al, 2002; Okada et al, 2002). Cette

sensibilité a été vérifiée dans les fibroblastes embryonnaires de souris déficients en Pol κ et la

complémentation par l’ADN polymérase κ humaine permet de complémenter cette sensibilité

(Ogi & Lehmann, 2006). En revanche, la complémentation avec la protéine humaine mutée

dans le domaine catalytique ne complémente pas le phénotype (Ogi & Lehmann, 2006).

Ainsi, l’activité catalytique de Pol κ serait nécessaire en réponse aux dommages induits par

les UV. Nous avons vu que le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER) est

le mécanisme principal de réparation des dommages induits par les UV. Ils ont donc étudié

l’implication de Pol κ dans le NER. De manière similaire, ils ont montré que les fibroblastes

embryonnaires de souris déficients en Pol κ présentaient une réduction importante de la

synthèse lors du mécanisme de NER mais que ce phénotype était complémenté par la

protéine humaine sauvage et non par la protéine humaine catalytiquement inactive (Ogi &

Lehmann, 2006). Ces résultats suggèrent donc que l’absence de Pol κ induit une réduction de

l’activité du NER et expliqueraient la sensibilité des cellules déficientes en Pol κ aux UV.

Cependant, ce nouveau rôle de Pol κ dans le NER reste encore controversé. En effet, E.

Friedberg (communication personnelle, Gordon Conference Mutagenesis, 2008) propose qu’il

puisse y avoir un transcrit alternatif de Pol κ présent dans les souris déficientes en Pol κ,

qui sont délétées uniquement de l’exon 5 ou 6, qui pourrait agir comme dominant négatif.

De plus, les cellules embryonnaires de souris déficientes en Pol κ présenteraient un

phénotype mutateur (E. Friedberg, communication personnelle, Gordon Conference

Mutagenesis, 2008). Ainsi, des mutations dans des gènes importants pour le NER pourraient

expliquer la sensibilité des cellules déficientes en Pol κ aux radiations UV. Enfin, une autre

étude montre que la sensibilité aux UV des cellules déficientes en Pol κ ne serait pas due

ni à un défaut de NER, ni à un défaut de HR (Okada et al, 2002). En effet, la double


99

délétion de Pol κ et XPA (une protéine impliquée dans les premières étapes du NER) dans des

cellules de poulet DT40 induit un effet additif, suggérant que ces deux protéines ne sont pas

redondantes (Okada et al, 2002). De plus, la HR mesurée via le « gene targetting » et la

sensibilité aux IR n’est pas affectée en absence de Pol κ. En revanche, la double déplétion de

Pol κ/Rad18 induit un effet additif. Ces données suggèrent donc que la sensibilité des cellules

déficientes en Pol κ soit plutôt due à une absence de TLS qui serait indépendante de Rad18

(Okada et al, 2002). Cette absence de TLS serait par ailleurs compensée par une augmentation

de la HR. En effet, l’absence de Pol κ induit une augmentation des échanges entre

chromatides sœurs, résultants des mécanismes de HR (Okada et al, 2002).

d- Son rôle dans le point de contrôle de phase S

De manière intéressante, une interaction entre DinB et Hus1-Rad1 faisant partie du

complexe Hus1-Rad1-Rad9 (9-1-1), un clamp similaire à PCNA et impliqué dans la

signalisation du point de contrôle, a été mise en évidence chez S. pombe (Kai & Wang, 2003).

Cette interaction suggère qu’après dommages de l’ADN, 9-1-1 est activé et permettrait le

recrutement de DinB au niveau des sites de dommages. De plus, la mono-ubiquitination de

PCNA par Rad18 et la mise en place d’un point de contrôle impliquant RPA, ATR et

Chk1 seraient nécessaires pour le recrutement de Pol κ au niveau des fourches de réplication

bloquées (Bi et al, 2006). Afin d’analyser ce rôle de Pol κ au niveau du point de contrôle de

phase S, Rémy Bétous et ses collaborateurs au sein du laboratoire ont utilisés la technique

d’interférence ARN dans différentes lignées cellulaires humaines. Ils ont pu montrer qu’en

absence de Pol κ, le niveau de RPA recruté à la chromatine (protéine qui se lie au simple-brin

de l’ADN et qui constitue le premier signal du point de contrôle de phase S) ainsi que le

niveau de TOPBP1 recruté à la chromatine (une protéine phosphorylée par ATR et importante

pour l’activation de Chk1) sont augmentés (données non publiées). En revanche, malgré ces

manifestations de mise en place du point de contrôle de phase S, Chk1, la kinase

effectrice, n’est pas activée par phosphorylation en absence de Pol κ, que ce soit sans

dommage, après radiations UV ou traitement HU (données non publiées). Alors que Pol κ

n’affecte pas le recrutement de TOPBP1 et de Smc1 (Structural Maintenance of Chromosome

Subunit 1, une autre cible d’ATR), le recrutement de la Claspin, un acteur important dans la

phosphoryaltion de Chk1, est inhibé en absence de Pol κ (données non publiées). En accord

avec ces données, des immuno-précipitations ont permis de montrer que Pol κ et la Claspin

interagissent. Ainsi, Pol κ participerait au point de contrôle de phase S en permettant le


100

recrutement de la Claspin et donc l’activation de Chk1 après un stress réplicatif. Cependant,

de plus amples investigations sur les partenaires fonctionnels de Pol κ ainsi que sur le

mécanisme impliqué sont nécessaires afin de mieux comprendre ce nouveau rôle.

e- Les conséquences de sa dérégulation sur l’instabilité génétique

Pol κ est surexprimée chez les patients atteints de cancer du poumon (Non-Small

Cell Lung Cancer, NSCLC) (pour revue, (Sweasy et al, 2006)). En effet, les transcrits de Pol

κ sont surexprimés de 75 % dans les échantillons tumoraux NSCLC, obtenus avant thérapie,

comparés aux tissus normaux adjacents à la tumeur (pour revue, (Sweasy et al, 2006)). Cette

augmentation de Pol κ n’est pas corrélée avec le stade de la maladie, mais est corrélée avec le

statut du suppresseur de tumeur p53 (Wang et al, 2004c). De manière similaire, la

surexpression de Pol κ dans les cellules de souris ou dans les fibroblastes humains MRC5

augmente la fréquence de mutations spontanées au niveau du locus HPRT (Bergoglio et al,

2002; Ogi et al, 1999). De plus, la surexpression stable de Pol κ dans les cellules CHO

augmente la présence de CDB ainsi que les évènements de recombinaison homologue ou

non homologue (Bavoux et al, 2005). En outre, les pertes d’hétérozygotie (Losses Of

Heterozygosities, LOH) et l’aneuploïdie sont deux phénotypes induits par la surexpression de

Pol κ (Bavoux et al, 2005). En accord avec ces résultats, la surexpression de Pol κ combinée à

l’absence d’une protéine p53 fonctionnelle induit la tumorigenèse chez la souris nude

(Bavoux et al, 2005). Pour expliquer ces phénotypes, les auteurs proposent qu’un excès de

Pol κ puisse interférer avec la réplication normale de l’ADN, rendant ce processus mutagène

et générant des CDB, substrats potentiels pour les mécanismes de recombinaison. Afin de

vérifier cette hypothèse, ils ont mesuré la vitesse de réplication globale après une

surexpression de Pol κ via la technique du peignage moléculaire. Ainsi, ils ont montré qu’un

excès de Pol κ induit la formation de segments répliqués plus courts, traduisant une vitesse de

réplication plus faible (Pillaire et al, 2007). Cette baisse de vitesse de réplication est en fait

compensée par une augmentation d’allumage des origines de réplication (Pillaire et al, 2007).

Deux hypothèses sont donc possibles : i) soit Pol κ interfère avec les ADN polymérases

réplicatives et en prenant leur place induit un ralentissement des vitesses, ii) soit l’excès de

Pol κ joue un rôle indirect en interagissant et en piégeant par exemple certains facteurs

nécessaires à la réplication normale de l’ADN.

D’autre part, nous avons observé au laboratoire que Pol κ est sous-exprimée dans

deux types de cancers : les cancers co-lorectaux (Fig 27) (Lemee et al, 2007) ainsi que dans


101

les cancers du sein (données non publiées). Peu d’études ont été réalisées concernant

l’impact d’une telle dérégulation au niveau de l’instabilité génétique. Cependant, les souris

déficientes en Pol κ présentent un phénotype mutateur comme nous l’avons vu

précédemment. De plus, les fréquences de gain et de perte de séquences répétées en tandem

au niveau des lignées germinales de souris déficientes en Pol κ sont augmentées (Burr et al,

2006). Enfin, comme nous venons de le voir Pol κ pourrait jouer un rôle au niveau du point de

contrôle de phase S, suggérant un rôle important de Pol κ dans la stabilité du génome. En

effet, l’absence de Pol κ induit une augmentation des CDB ainsi qu’une accumulation des

cellules en phase G2/M (données non publiées). Il est donc important que le niveau

d’expression de cette ADN polymérase soit fortement régulé.

Figure 27. Expression relative des rapports des ARNm de Pol κ et Pol δ dans 74 biopsies du cancer du colon. Le niveau des transcrits a été mesuré en triplicats via la technologie LDA. Afin de normaliser les résultats, quatre gènes contrôles (18S, GADPH, HPRT, YWHAZ) ont été amplifiés à partir de chaque cDNA. Les rapports des transcrits T (Tumoral) / N (Normal) à partir des valeurs normalisées ont été calculés. Les valeurs T/N inférieures à 1 ont été transformées en valeurs négatives. Les signes + et – indiquent respectivement des expressions supérieures ou inférieures dans le tissus tumoral comparé au tissus normal adjacent. (Lemee et al, 2007)

+

+

-

-

Rapport d’expression des ARNm

Rapport d’expression des ARNm

Chapitre II B. Des ADN hélicases spécialisées

102

B. Des ADN hélicases spécialisées

Nous avons vu que des séquences particulières du génome susceptibles d’adopter des

structures secondaires constituent des barrières de fourches de réplication naturelles. Parmi

ces structures secondaires de l’ADN, les G-quadruplex (G4) sont formés par l’appariement

plan de quatre guanines stabilisé par des liaisons Hoogsteen. Ces structures sont présentes

dans tout le génome humain avec plus de 360 000 séquences d’ADN susceptibles de former

des G4 (pour revue, (Tuteja & Tuteja, 2004)). La stabilité exceptionnelle de ces structures

suggère que ce sont des obstacles significatifs de la réplication de l’ADN. Cependant,

certaines ADN hélicases spécialisées peuvent intervenir au niveau de ces séquences et

permettre le déroulement des structures secondaires. En effet, les ADN hélicases sont des

moteurs moléculaires utilisant l’énergie libérée par l’hydrolyse de l’ATP pour catalyser le

déroulement de l’ADN (pour revue, (Tuteja & Tuteja, 2004)). Nous allons étudier, trois de ces

enzymes, dont les déficiences sont responsables de maladies génétiques rares, toutes trois

prédisposant notamment aux cancers (Tableau 2) : l’ADN hélicase BLM, mutée dans le

syndrome de Bloom (Ellis et al, 1995), l’ADN hélicase WRN, dont l’absence est responsable

du syndrome de Werner (Yu et al, 1996) et l’ADN hélicase BRIP1 ou BACH1 ou FANCJ

(appelée par la suite BACH1), dont la déficience est impliquée dans l’Anémie de Fanconi

(Levitus et al, 2005; Levran et al, 2005).

Tableau 2. Trois ADN Hélicases associées à des maladies génétiques rares et leurs caractéristiques biochimiques.

Hélicase Maladie

associée

Locus

du gène

Taille

protéine Direction

Partenaires

connus Substrats Fonctions

BLM Syndrome

de Werner 15q26.1 1417 aa 3’-5’

Topo, BRCA1,

PML, RAD51,

RPA, MRN, FEN1,

p53

G-quadruplex

Triplex, Fourche

Jonction de

Holliday

D-loop

Réplication

Recombinaison

Réparation

WRN Syndrome

de Bloom

8p12-

p11.2 1430 aa 3’-5’

Topo, PCNA,

Pol δ, RPA, p53,

Ku70/80, RAD52,

RAD51, FEN1,

TRF2/POT1

G-quadruplex

Triplex, Fourche

Jonction de

Holliday

D-loop

Réplication

Recombinaison

Réparation

BACH1 Anémie de

Fanconi 17q22 1249 aa 5’-3’

BRCA1

RPA

Fourche

D-loop

G-quadruplex

Réplication

Recombinaison

Réparation


103

1. Les ADN hélicases de la famille RecQ : BLM et WRN

Les protéines de la famille RecQ ont été nommées ainsi en référence à la protéine

bactérienne qui intervient dans la voie de recombinaison homologue RecF et dans la

suppression de recombinaisons illégitimes. Les protéines BLM et WRN présentent des

activités hélicases de polarité 3’-5’ (Gray et al, 1997; Karow et al, 1997). Outre leur

domaine hélicase, ces protéines présentent une région conservée composée de deux modules

additionnels :

- le domaine RQC, qui intervient dans le recrutement des partenaires protéiques et

dont un motif hélice-boucle-hélice est capable de fixer l’ADN double-brin ;

- le domaine HRDC, dont la topologie est proche de celle trouvée dans d’autres

protéines participant au métabolisme de l’ADN, qui permettrait la formation de

contacts spécifiques avec des intermédiaires de recombinaison (Bernstein et al,

2003).

L’ADN hélicase WRN possède en plus un domaine exonucléase au niveau du

domaine N-terminal qui agit indépendamment du domaine hélicase situé au centre de la

protéine (Huang et al, 1998; Kamath-Loeb et al, 1998; Shen et al, 1998a; Suzuki et al, 1999).

a- Les syndromes d’instabilité génétique associés à l’absence de ces ADN

hélicases

L’absence d’une ADN hélicase BLM fonctionnelle caractérise les patients atteints du

syndrome de Bloom (SB) (Ellis et al, 1995). Ces patients présentent un retard de croissance,

une sensibilité importante à la lumière du soleil, une immuno-déficience accrue, une infertilité

touchant particulièrement les hommes ainsi qu’une forte prédisposition à différentes tumeurs

malignes (German, 1993). La caractéristique majeure des cellules SB est leur instabilité

génomique qui se manifeste par une fréquence élevée de cassures de chromosomes et un

nombre important d’échanges entre chromatides sœurs (German, 1993). De plus, les

premières études sur les cellules SB ont permis de mettre en évidence que la progression des

fourches de réplication est ralentie et que les intermédiaires de réplication s’accumulent en

absence de BLM (Lonn et al, 1990).

L’absence de l’ADN hélicase WRN caractérise les patients atteints du syndrome de

Werner (SW) (Yu et al, 1996). Ces patients souffrent de vieillissement accéléré et de

différentes maladies liées à l’âge telles que l’ostéoporose, des infarctus du myocarde,


104

l’athérosclérose et la cataracte (Epstein et al, 1966). Le syndrome de Werner est aussi associé

à une prédisposition aux tumeurs malignes, le cancer étant la cause principale de décès,

comme pour le syndrome de Bloom (Epstein et al, 1966). Les cellules dérivées des patients

SW présentent également une instabilité génomique importante et un nombre de mitoses

réduit (Martin, 1977). L’instabilité génomique se manifeste notamment par une fréquence

élevée de réarrangements chromosomiques tels que des translocations, des inversions et

des grandes délétions (Fukuchi et al, 1989).

Du fait de la présence de nombreux réarrangements chromosomiques dans les cellules

déficientes en BLM ou WRN, le rôle de ces deux ADN hélicases dans le mécanisme de

recombinaison homologue a été étudié.

b- Leurs rôles au niveau de la recombinaison homologue de l’ADN

La recombinase RAD51 est la protéine majeure de la recombinaison homologue

(HR). Cette protéine interagit avec WRN et BLM, suggérant un rôle pour ces deux ADN

hélicases au cours de la HR (Otterlei et al, 2006; Wu et al, 2001).

BLM serait présente en complexe avec d’autres protéines :

- la Topoisomérase Topo III α, qui dénoue les deux brins d’ADN en introduisant des

cassures transitoires,

- la protéine RPA, qui couvre le simple-brin d’ADN afin de le protéger de la

dégradation,

- la protéine RMI1, qui lie directement BLM et Topo III α, et qui stimule la

dissociation des jonctions de Holliday,

- la protéine RMI2, qui stimule la dissolution d’intermédiaires de HR in vitro, qui,

comme RMI1, est essentielle pour la stabilité, la localisation et la fonction du

complexe in vivo et qui interagirait directement avec RMI1 avant de se fixer au reste

du complexe (Singh et al, 2008; Xu et al, 2008).

Les activités biochimiques de BLM suggèrent que cette protéine joue un rôle

important au niveau de la HR. Premièrement, BLM facilite la migration de branche au niveau

d’intermédiaires de HR tels que les D-loop et les jonctions de Holliday (Bachrati et al, 2006;

Karow et al, 2000; van Brabant et al, 2000). Deuxièmement, BLM peut éliminer les filaments

de RAD51 et facilite la synthèse d’ADN par Pol η (Bugreev et al, 2007b). Troisièmement,

BLM peut convertir des fourches de réplication bloquées en jonction de Holliday et de ce fait


105

permettre le redémarrage des fourches de réplication (Fig 28C) (Ralf et al, 2006).

Quatrièmement, BLM et Topo III α coopèrent pour dissoudre les doubles jonctions de

Holliday en supprimant les cross-over (Fig 28G) (Plank et al, 2006; Raynard et al, 2006; Wu

& Hickson, 2003; Wu et al, 2006). Ainsi, BLM permet d’éviter des fréquences trop élevées

d’échanges entre chromatides sœurs, ainsi que des recombinaisons aberrantes, et donc

des réarrangements chromosomiques.

Figure 28. Implication des ADN hélicases BLM et WRN au niveau des fourches de

réplication et dans les mécanismes de réparation de l’ADN afin de maintenir la stabilité du génome. Les schémas A, B et C représentent le rôle des ADN hélicases au niveau des fourches de réplication bloquées par une lésion de l’ADN (représenté par la croix). Dans le modèle de la régression de fourche (B), le découplage permet la synthèse d’un fragment d’Okazaki en face de la lésion. Au niveau d’une double jonction de Holliday (C), la migration de brin permet de redémarrer la réplication. Les schémas D, E et F représentent le rôle des ADN hélicases au niveau de la résolution de structures secondaires. Le schéma G représente la dissolution des doubles jonctions de Holliday en évitant les cross-over faisant intervenir le complexe BLM/Topo III α. Les panneaux H et I représentent la correction d’erreur de WRN au cours de la réplication et de la réparation de l’ADN. (Brosh & Bohr, 2007)

Rôle au niveau des fourches de réplication bloquées par une lésion

Résolution de structures secondaires de l’ADN

Dissolution des doubles JH Correction d’erreur pendant la réplication/réparation


106

Il a été montré que les cellules SW présentaient une fréquence élevée d’échanges entre

chromatides sœurs, mais uniquement au niveau des télomères (Laud et al, 2005). Ces

expériences suggèrent donc un rôle de WRN dans la HR au niveau des télomères. De plus,

WRN interagit avec POT1 (une protéine se liant au niveau des répétitions télomériques) et

avec l’hétéro-dimère Ku (protéines intervenant dans le NHEJ et retrouvées au niveau des

télomères). Ces deux protéines stimulent respectivement l’activité hélicase et nucléase de

WRN (Cooper et al, 2000; Opresko et al, 2005). Ainsi, WRN fonctionnerait avec POT1 et Ku

pour supprimer les évènements de recombinaison au niveau des extrémités télomériques.

D’autre part, le complexe WRN/RAD52 pourrait permettre la résolution de structures

anormales au niveau des fourches de réplication. En effet, WRN augmente l’efficacité de

l’appariement de brin médié par RAD52 (Baynton et al, 2003). De plus, WRN stimule

l’activité de synthèse de Pol η et Pol κ in vitro et co-localise in vivo avec Pol η au niveau de

foyers de réplication après irradiation UV (Kamath-Loeb et al, 2007). En outre, Pol η et WRN

font partie du même complexe dans des cellules humaines sur-exprimant Pol η (Yuasa et al,

2006). L’interaction de WRN avec deux protéines pouvant intervenir au cours des

mécanismes de HR, suggère donc son implication dans le même processus.

En accord avec le rôle proposé pour ces deux ADN hélicases au cours de la HR, BLM

et WRN seraient capables de favoriser la migration de branche au niveau de deux

intermédiaires de recombinaison (Fig 28C) : les D-loop et les jonctions de Holliday (Bachrati

et al, 2006; LeRoy et al, 2005; Mohaghegh et al, 2001; Orren et al, 2002).

c- Leurs rôles dans le déroulement des structures G-quadruplex

Les deux ADN hélicases BLM et WRN peuvent, in vitro, dérouler les structures en G4

(Fig 28D-F) (Mohaghegh et al, 2001; Popuri et al, 2008; Shen & Loeb, 2001; Sun et al, 1998).

De manière plus spécifique, WRN nécessiterait un substrat G4 présentant une extrémité 3’

pour que son activité soit maximale (Mohaghegh et al, 2001).

Par ailleurs, WRN permettrait de faciliter la réplication de l’ADN puisque les

cellules SW présentent une durée de phase S plus longue (Fig 28H-I) (Poot et al, 1992;

Rodriguez-Lopez et al, 2002). En outre, la réplication serait asymétrique dans les cellules SW,

suggérant que les fourches de réplication sont bloquées ou effondrées en absence de WRN

(Rodriguez-Lopez et al, 2002). En accord avec ces résultats, les cellules SW sont sensibles

aux agents induisant des blocages de fourches de réplication (Opresko et al, 2003). WRN est

aussi requise pour la réplication de l’ADN après dommages génotoxiques, mais aussi après un


107

traitement arrêtant les fourches de réplication (Fig 28A-C) (Sidorova, 2008). En outre, WRN

et ATR co-localisent après un arrêt de réplication, suggérant que WRN et ATR coopèrent

pour éviter la genèse d’instabilité génomique en phase S du cycle cellulaire (Pichierri et al,

2003). Il est important de noter que WRN est située au niveau de certains télomères au cours

de la réplication normale de l’ADN en absence de traitement exogène, suggérant que WRN

joue un rôle au niveau de lésions endogènes ou de blocages induits notamment par la

présence de structures secondaires de l’ADN au niveau des télomères (Crabbe et al, 2004;

Johnson et al, 2001; Opresko et al, 2004). Cependant, WRN ne serait pas nécessaire pour la

réplication de tous les télomères. En effet, des expériences d’immuno-précipitation de

chromatine ont permis de montrer que WRN est associée avec 5% de l’ADN télomérique

dans des cellules en phase S (Crabbe et al, 2004). En outre, le rôle de WRN au niveau de

l’élongation des télomères aurait majoritairement lieu sur le brin discontinu (Crabbe et al,

2004). Il est important de rappeler que la progression des fourches de réplication vers la fin du

chromosome nécessite la dissociation des T-loop formées au niveau des extrémités

télomériques (Griffith et al, 1999). Les deux activités hélicase et exonucléase de WRN

coopèrent pour libérer le brin envahissant de la structure en T-loop in vitro (Opresko et al,

2002; Opresko et al, 2004). En outre, la protéine télomérique TRF2 interagit physiquement

avec WRN et la recrute au niveau de la T-loop in vitro (Machwe et al, 2004; Opresko et al,

2002; Opresko et al, 2004). De plus, en augmentant la processivité de l’hélicase, POT1

facilite le relargage du brin télomérique envahissant en limitant l’activité exonucléase de

WRN (Opresko et al, 2005). La séquence télomérique (TTAGGG)n étant riche en G forme

spontanément une structure en G4 in vitro mais aussi in vivo (Duquette et al, 2004; Paeschke

et al, 2005). Ces structures bloquent la progression des fourches de réplication in vitro et la

présence de WRN permet d’éviter le blocage de Pol δ au niveau des G4 (Kamath-Loeb et al,

2001). De plus, POT1 se lie au niveau des simple-brins d’ADN télomérique afin d’éviter la

formation de G4 (Zaug et al, 2005). POT1 et les ADN hélicases WRN ou BLM pourraient

donc coopérer afin de dissocier les structures en G4, les hélicases en déroulant les

structures secondaires de l’ADN et POT1 en stabilisant les simple-brins d’ADN résultants.

Par conséquent, les ADN hélicases joueraient un rôle au niveau des télomères via leur

rôle dans la recombinaison homologue, mais aussi via leur implication dans le déroulement

des G4.


108

2. L’ADN hélicase BACH1, impliquée dans l’Anémie de Fanconi

Nous allons maintenant étudier une autre ADN hélicase, BACH1, impliquée dans le

déroulement des structures secondaires de l’ADN, et qui intervient notamment au niveau des

séquences riches en G.

a- L’Anémie de Fanconi

Nous allons dans un premier temps, nous intéresser à l’anémie de Fanconi (AF). Il

s’agit d’une maladie génétique très rare, récessive et de transmission autosomique pour la

grande majorité des cas, caractérisée par des malformations congénitales, des anomalies

au niveau de la pigmentation de la peau, un défaut progressif au niveau de la moelle

osseuse et une forte prédisposition aux cancers, tels que les leucémies aigües myéloïdes ou

des tumeurs solides au niveau de la tête et du cou (Alter, 2003; Butturini et al, 1994; Grompe

& D'Andrea, 2001; Joenje & Patel, 2001). Il est cependant important de souligner que les

signes cliniques sont très hétérogènes chez les patients atteints de l’Anémie de Fanconi. En

effet, douze groupes de complémentation ont été mis en évidence FANC A, B, C, D1, D2,

E, F, G, I, J, L, M (Levitus et al, 2004; Levitus et al, 2005; Levran et al, 2005; Meetei et al,

2005), qui mettent en cause différentes protéines non fonctionnelles. Tous les groupes ne sont

pas représentés de la même manière puisque 60 à 80% des patients font partie du groupe

FANCA (pour revue, (Levitus et al, 2006)). Les protéines FANC A, B, C, E, F, G, L, M

s’assemblent pour constituer le « core complex » de l’Anémie de Fanconi (Fig 29) (pour

revue, (Patel & Joenje, 2007)).

USP1

FANCL

Figure 29. Représentation schématique des protéines de l’Anémie de Fanconi et de leurs interactions. La majorité des protéines de l’Anémie de Fanconi forment le « core complex » qui permet la mono-ubiquitination de FANCD2 via l’E3-ubiquitine ligase FANCL et l’E2 Ube2t. Cette modification post-traductionnelle cible FANCD2 au niveau de la chromatine. Les autres protéines de l’Anémie de Fanconi FANCD1 et FANCJ fonctionnent indépendamment du « core complex » et après l’étape de mono-ubiquitination de FANCD2. Les modifications post-traductionnelles de FANCD2 et de FANCI sont inter-dépendantes. USP1 permet de déubiquitinyler FANCD2. (Adapté de (Patel & Joenje, 2007))

Ub

FANCI

FANCI


109

Seule deux des protéines de ce « core complex » présentent une activité catalytique.

En effet, FANCL serait une E3-ubiquitine ligase (Meetei et al, 2003; Seki et al, 2007) et

FANCM possèderait un domaine hélicase et un domaine nucléase (Meetei et al, 2005;

Mosedale et al, 2005). En réponse aux dommages de l’ADN ou à un blocage de fourches de

réplication, la protéine FANCD2 est mono-ubiquitinylée sur la lysine 561 par FANCL

(Meetei et al, 2003). L’enzyme de conjugaison E2 serait Ube2t (Alpi et al, 2007). Par la suite,

FANCD2-Ub se lie à la chromatine et s’accumule au niveau des foyers de dommages de

l’ADN observés en immunofluorescence (Garcia-Higuera et al, 2001). Il est important de

noter qu’une mutation touchant la fonction de n’importe quelle protéine au niveau du « core

complex » entraîne un défaut d’activité E3-ubiquitine ligase, ainsi que la dissociation du

complexe, conduisant finalement à un défaut de mono-ubiquitination de FANCD2

(Matsushita et al, 2005). En revanche, l’absence de BACH1 ou de FANCD1 n’affecte pas la

mono-ubiquitination de FANCD2, suggérant que ces protéines agissent en aval de la

modification post-traductionnelle de FANCD2 (Bridge et al, 2005; Levitus et al, 2004; Wang

et al, 2004a). De plus, la réparation des CDB induites par irradiation est retardée dans les

cellules exprimant une protéine BACH1 inactivée (Cantor et al, 2001). Ainsi, BACH1

interviendrait même après la formation des CDB. D’autre part, la mono-ubiquitination de

FANCD2 est régulée par la protéine USP1, la même déubiquitine ligase qui régule la

mono-ubiquitination de PCNA (Nijman et al, 2005).

En outre, FANCI s’associe avec FANCD2 et le complexe FANCI-FANCD2 se

localise au niveau de la chromatine en réponse aux dommages de l’ADN (Smogorzewska et

al, 2007). De manière similaire à FANCD2, FANCI est mono-ubiquitinylée et la

mono-ubiquitination de chacune de ces protéines est importante pour le maintien de

l’ubiquitine sur l’autre protéine (Fig 30) (Smogorzewska et al, 2007). En outre, la

phosphorylation de FANCD2 par ATR (Pichierri & Rosselli, 2004b; Taniguchi et al, 2002)

est nécessaire pour sa propre mono-ubiquitination et par conséquent pour la

mono-ubiquitination de FANCI (Smogorzewska et al, 2007). De manière similaire, la

phosphorylation de FANCI est importante pour la mono-ubiquitination et la formation de

foyers de FANCI et FANCD2 (Ishiai et al, 2008). Il est important de noter que la

mono-ubiquitination de FANCD2 dépend aussi des protéines ATR, Chk1 et Claspin

(Andreassen et al, 2004; Guervilly et al, 2008). En outre, in vitro, FANCD2 peut être

mono-ubiquitinylée sur d’autres lysines puisqu’un mutant sur la lysine K563 dans les cellules

de poulet (ou lysine 561 dans les cellules humaines) est tout de même ubiquitinylé (Alpi et al,

2007). Cependant, FANCI stimule la mono-ubiquitination de FANCD2 mais pas de FANCD2


110

mutée sur la lysine 563 (Alpi et al, 2007). Ainsi, FANCI serait importante pour restreindre

la mono-ubiquitination de FANCD2 au niveau du site de mono-ubiquitination observée

in vivo.

Figure 30. Modèle de la régulation du complexe FANCI/FANCD2. La cascade de phosphorylation médiée par ATR/ATRIP et d’ubiquitination médiée par le « core complex » conduit au chargement sur la chromatine du complexe FANCI/FANCD2, permettant ainsi sa fonction au niveau des mécanismes de réparation. (Adapté de (Smogorzewska et al, 2007))

Au niveau cellulaire, il a tout d’abord été démontré que les lymphocytes de cellules

AF présentaient une forte instabilité chromosomique spontanée telles que des cassures de

chromatides ou des échanges de chromatides impliquant des chromosomes hétérologues

(Schroeder et al, 1964; Schroeder & German, 1974). De plus, ces cellules sont sensibles aux

agents pontants tels que la mitomycine C et le cisplatine (Auerbach & Wolman, 1976; Ishida

& Buchwald, 1982; Sasaki & Tonomura, 1973; Weksberg et al, 1979). Ces agents génèrent

principalement des pontages intra-brin qui connectent des bases au sein du même brin d’ADN

mais aussi des pontages inter-brins qui relient deux brins antiparallèles d’ADN (Alter, 1996).

Les pontages inter-brins représentent une faible proportion des lésions induites par les agents

pontants (environ 5 à 13 % pour la MMC) mais sont plus toxiques puisqu’ils inhibent la

séparation des brins d’ADN et donc la réplication (Dronkert & Kanaar, 2001; Warren et al,

1998). En outre, la sensibilité observée dans les cellules AF semble uniquement due aux

pontages inter-brins puisqu’elles ne montrent pas de sensibilité aux agents alkylants

mono-fonctionnels tels que l’éthyl-méthane-sulfonate (Weksberg et al, 1979). Ces résultats

suggèrent donc que les protéines de l’Anémie de Fanconi participent à la réparation des

pontages inter-brins de l’ADN. D’autre part, les cellules AF présentent un défaut de cycle

cellulaire puisqu’elles s’accumulent au niveau de la phase G2/M et présentent donc une

transition G2/M retardée (Dutrillaux et al, 1982; Kubbies et al, 1985). Cet arrêt en phase

G2/M est accentué après traitement des cellules avec des agents pontants (Kaiser et al, 1982)

et dépend de Chk1 (Guervilly et al, 2008). Comme la phase G2 est prolongée dans les cellules

Complexe FANCI/FANCD2

Complexe FANCI/FANCD2

activé sur la chromatine

Pontages Fourches bloquées


111

AF même en absence de dommage externe de l’ADN, il est possible que les protéines de

l’AF soient impliquées au niveau des lésions endogènes de l’ADN.

Les cellules AF ne sont pas les seules à être sensibles aux agents pontants puisque les

cellules déficientes au niveau du NER, de la HR (défaut au niveau des paralogues de RAD51

ou de BRCA2) ou de la TLS (défaut au niveau des ADN polymérases Rev1 et Rev3) sont

aussi sensibles (pour revue, (Patel & Joenje, 2007)). En outre, les mutants pour la TLS

seraient les plus sensibles, suivis par les mutants AF et les mutants HR (Nojima et al, 2005).

De plus, les doubles mutants (TLS + AF ou HR + AF) ne montrent pas d’effet additif au

niveau de leur sensibilité, indiquant que le rôle de l’Anémie de Fanconi est fortement relié

aux mécanismes de TLS et de HR (Nojima et al, 2005). En outre, les mutants AF, TLS ou

HR ne produisent pas d’échanges entre chromatides sœurs en réponse aux agents pontants

(Niedzwiedz et al, 2004). Même si les échanges entre chromatides sœurs ne représentent

qu’une partie des évènements de HR, ils permettent de rendre compte de l’implication de ces

différents mécanismes dans la HR. Ces résultats ont permis de proposer le modèle représenté

sur la figure 31 (Patel & Joenje, 2007). Dans ce modèle, les protéines AF interviendraient

dans les étapes initiales afin de créer un substrat adéquat pour la HR (CDB) ou pour la TLS

(en déplaçant le pontage sur un brin).

Figure 31. Modèle de la réparation des pontages combinant les actions des mécanismes

AF, TLS et HR. L’encadré jaune représente les étapes au cours desquelles les protéines de l’Anémie de Fanconi pourraient intervenir. (Patel & Joenje, 2007)

Incision

Cassure double-brin

Blocage de fourche de réplication

TLSTLS

NER Chromatide sœur intacte

Invasion de brin Rétablissement de la fourche de réplication

Résolution de la jonction d’Holliday

Redémarrage de la

fourche de réplication

NER


112

En accord avec ce modèle, lorsqu’une CDB est induite par une endonucléase dans les

cellules humaines déficientes en FANCC ou FANCD2 (Nakanishi et al, 2005) ou dans les

cellules de poulet DT40 déficientes pour FANCC, FANCD2 ou FANCG (Niedzwiedz et al,

2004; Yamamoto et al, 2003), un défaut modéré de recombinaison homologue est détecté. De

plus, les cellules de poulet DT40 déficientes en FANCL, FANCD2, FANCG, FANCC

présentent une réduction importante de l’efficacité de « gene targetting » (Hirano et al, 2005;

Seki et al, 2007; Yamamoto et al, 2003; Yamamoto et al, 2005). Ainsi, certaines protéines

de l’AF seraient importantes pour la HR mais pas toutes. En effet, les cellules de poulet

DT40 déficientes en FANCM ou BACH1 ne présentent aucun défaut de HR (Bridge et al,

2005; Mosedale et al, 2005). Cependant, l’absence de BACH1 dans les cellules humaines

MCF7 induit un défaut de HR d’un facteur 10 par rapport aux cellules contrôles (Litman et al,

2005). D’autre part, BACH1 interagit avec le domaine BRCT de BRCA1, ce qui établit un

autre lien entre HR et AF (Cantor et al, 2001). Cette liaison est dépendante de la

phosphorylation de BACH1 sur la sérine 990 au cours des phases S et G2/M et semble

nécessaire pour que le point de contrôle de phase G2/M fonctionne (Yu et al, 2003). De plus,

des foyers RAD51 induits par des dommages de l’ADN sont visibles même en absence de

BACH1, suggérant que les étapes initiales de la HR sont initiées normalement en absence de

BACH1 (Litman et al, 2005). Il est important de noter que BLM et la voie AF semblent

coopérer pour réparer les pontages inter-brins (Hirano et al, 2005). En outre, WRN

intéragit fonctionnellement avec le mécanisme de l’Anémie de Fanconi (pour revue,

(Pichierri & Rosselli, 2004a)). De plus, des défauts de TLS ont été observés dans les cellules

déficientes pour l’AF (Niedzwiedz et al, 2004; Papadopoulo et al, 1990; Yamamoto et al,

2005). Par conséquent, certaines évidences suggèrent que les protéines de l’AF facilitent les

mécanismes de HR et de TLS mais il reste encore à préciser par quel mécanisme.

Enfin, un lien entre AF et MMR a été suggéré puisque BACH1 interagit avec

MutLα (Peng et al, 2007). En effet, cette interaction serait nécessaire pour corriger

l’accumulation des cellules AF en phase G2/M (Peng et al, 2007). Il reste à déterminer si cette

interaction facilite la réparation des pontages en favorisant la HR ou un autre mécanisme de

réparation.

b- Le rôle de BACH1 dans le déroulement des structures G-quadruplex

Nous allons maintenant nous intéresser un peu plus à la protéine du groupe de

complémentation FANCJ qui s’avère être l’ADN hélicase BACH1 et qui a été identifiée


113

comme un partenaire de BRCA1 (Cantor et al, 2001). Des mutations de BACH1 prédisposent,

comme BRCA1, au cancer du sein, mais dans une moindre mesure (pour revue, (Mathew,

2006)). BACH1 est une des premières protéines de l’AF à se lier à l’ADN via son domaine

hélicase composé d’une boîte DEAH (Cantor et al, 2001; Levitus et al, 2005; Peng et al,

2007). BACH1 est donc une ADN hélicase ATP-dépendante qui déroule les duplex

ADN/ADN ou ADN/ARN de 5’ vers 3’ (Cantor et al, 2004). BACH1 déroule

préférentiellement des substrats avec une extrémité simple-brin en 5’ et intervient aussi au

niveau des intermédiaires de recombinaison en D-loop (Gupta et al, 2005). De plus, BACH1

pourrait utiliser son activité ATPase afin de déstabiliser les complexes ADN/protéines tels

que les filaments de RAD51 (Sommers et al, 2009). En accord avec ces résultats, FANCJ

interagirait avec RPA, une protéine se liant au niveau des simple-brins d’ADN, après

dommages de l’ADN (Gupta et al, 2007). In vitro, la protéine humaine BACH1 est capable de

dérouler 90% de plusieurs oligonucléotides capables d’adopter une structure secondaire en G4

alors qu’aucun déroulement de duplex d’ADN ou de fourches de réplication n’a lieu pendant

le même temps de réaction (London et al, 2008). Ces résultats sont en contradiction avec les

résultats observés par Gupta et ses collaborateurs (Gupta et al, 2005) qui montrent que

BACH1 peut dérouler efficacement des fourches de réplication d’ADN. Afin de confirmer

leurs résultats, London et ses collaborateurs ont effectué des tests de compétition en

pré-incubant la protéine purifiée avec des oligonucléotides non radioactifs simple-brin, en

forme de fourche de réplication ou en G4 (London et al, 2008). Seule la pré-incubation avec

des oligonucléotides G4 non marqués perturbe le déroulement du substrat G4 marqué

(London et al, 2008). Ainsi, BACH1 serait une ADN hélicase très spécialisée avec une

préférence pour le déroulement des G4. En outre, RPA stimulerait l’activité hélicase de

BACH1 au niveau de ces structures secondaires (Wu et al, 2008). Comme cité précédemment,

BACH1 déroule les G4 de 5’ vers 3’ contrairement aux ADN hélicases WRN et BLM

(London et al, 2008). La polarité de cette ADN hélicase pourrait permettre à BACH1 de

dérouler préférentiellement des G4 situés au niveau du brin discontinu (London et al,

2008). Bien qu’aucune évidence n’existe quant au rôle de BACH1 au niveau des G4 situés

aux télomères, il est important de noter que l’orthologue de BACH1 chez la souris, Rtel, est

important pour la maintenance des télomères (Ding et al, 2004). En accord avec le rôle de

BACH1 au niveau des G4, l’activité hélicase de BACH1 est inhibée (Wu et al, 2008) par un

ligand stabilisant de manière spécifique les G4, la télomestatine (Lemarteleur et al, 2004).

Au niveau cellulaire, de nombreuses évidences suggèrent un rôle de BACH1 au

niveau des G4. En effet, dans les cellules de nématode déficientes en Dog-1 (homologue de


114

FANCJ chez C. elegans, (Youds et al, 2008)) ou dans les cellules humaines de patients

déficients pour FANCJ, des délétions de séquences riches en G ont été observées (Cheung et

al, 2002). De plus, des délétions de séquences riches en G comportant la signature de

formation des G4 (G3-5N1-3G3-5N1-3G3-5N1-3G1-3) ont été observées dans les tissus somatiques

et germinaux de nématodes déficients en Dog-1 (Kruisselbrink et al, 2008). Ces délétions de

séquences riches en G sont augmentées dans les doubles mutants Dog-1 et protéines de la HR

telles que Rad51, Him6 (l’homologue de BLM chez C .elegans), ainsi que dans les doubles

mutants Dog-1 et Pol η ou Pol κ (Youds et al, 2006). Ainsi, la HR et la TLS seraient

importantes pour stabiliser les séquences riches en G en absence de Dog-1 (Youds et al, 2006;

Youds et al, 2008). En revanche, le NHEJ et le NER ne sont pas requis pour le maintien des

séquences riches en G (Youds et al, 2006). D’autre part, ces résultats suggèrent une

coopération fonctionnelle entre Pol η et Dog-1 mais aussi entre Pol κ et Dog-1. Il est aussi

important de souligner que les cellules humaines déficientes en BACH1 sont sensibles à la

télomestatine et présentent une augmentation des dommages de l’ADN et d’apoptose par

rapport aux cellules contrôles (Wu et al, 2008). Les résultats d’apoptose sont à nuancer car

aucun test n’a été fait sur l’apoptose induite par l’absence de BACH1 en sans stress exogène.

D’autre part, BACH1 serait nécessaire au cours de la phase S (Kumaraswamy &

Shiekhattar, 2007). En effet, BACH1 existe sous forme de complexe avec BARD1, BRCA1 et

BRCA2 et l’association de BACH1 avec ses partenaires au niveau de la chromatine est

augmentée au cours de la phase S (Kumaraswamy & Shiekhattar, 2007). De plus, la déplétion

de BACH1 par interférence ARN induit une accumulation des cellules en phase G1, ainsi

qu’une progression plus lente au cours de la phase S (Kumaraswamy & Shiekhattar, 2007).

En accord avec ces résultats, l’activité ATPase de BACH1 est quasiment absente en phase G1

mais, augmente au cours de la phase S (Kumaraswamy & Shiekhattar, 2007). Enfin, l’absence

de BACH1 induit une augmentation des cassures de l’ADN. Cependant, ces résultats ont été

obtenus après synchronisation des cellules par l’aphidicoline, qui est un inhibiteur de la

réplication, susceptible d’induire des stress génotoxiques, et restent donc à être vérifiés.

Chapitre III Problématiques posées

115

CHAPITRE III : PROBLEMATIQUES POSEES

La tumorigenèse est un processus qui sélectionne les évènements génétiques et

épigénétiques qui permettent aux cellules d’échapper aux mécanismes antiprolifératifs et de

mort cellulaire programmée induite qui limitent normalement l’expansion clonale des cellules

somatiques (Lowe et al, 2004). La grande majorité des tumeurs est caractérisée par une forte

instabilité génétique mais il reste encore à déterminer à quelle étape du processus tumoral cela

se produit (Lengauer et al, 1998). De nombreux mécanismes limitant la tumorigenèse ont

été proposés, tels que l’hypoxie (Graeber et al, 1994) ou l’attrition des télomères (Counter et

al, 1992). Ces mécanismes contribuent à l’activation du suppresseur de tumeur p53, lequel est

muté dans la majorité des cancers (Counter et al, 1992; Graeber et al, 1994; Lowe et al, 2004;

Vogelstein et al, 2000). Cependant, nous ne savons toujours pas si ces mécanismes constituent

l’étape clef permettant de protéger les cellules contre l’instabilité génétique et la

tumorigenèse. Plus récemment, il a été montré que Chk2, la kinase effectrice du point de

contrôle G2/M activée par ATM en réponses aux CDB de l’ADN, était activée de manière

constitutive dans les carcinomes des poumons et du sein (DiTullio et al, 2002). D’autre part,

des oncogènes tels que Myc induisent des dommages à l’ADN dans les cellules en culture

(Vafa et al, 2002). De ce fait, il est possible que les points de contrôle soient activés dans les

stades précoces de la tumorigenèse humaine, conduisant à un blocage du cycle cellulaire, à

la mort cellulaire le cas échéant et inhibant de ce fait la progression tumorale. Deux études

récentes confirment cette hypothèse et proposent le mécanisme représenté sur la figure 32

(Bartkova et al, 2005; Gorgoulis et al, 2005).

Figure 32. Modèle d’activation des points de contrôle du cycle cellulaire au cours de la

progression tumorale.

CDB majoritairement au

niveau des SFC

Hyperplasie Cancer

Stress réplicatif Activation des

points de contrôle du cycle

cellulaire

Apoptose dépendante de p53

Sénescence

Instabilité génomique

Attrition des télomères Hypoxie

? Dérégulation des ADN

polymérases translésionnelles


116

En effet, les auteurs proposent que la stimulation aberrante de la prolifération dans les

cellules précancéreuses conduise à un stress réplicatif. D’autre part, l’activation d’oncogènes

pourrait aussi induire un stress réplicatif (Halazonetis et al, 2008). Ce stress pourrait, de

manière directe ou indirecte via la formation de cassures de l’ADN, activer les points de

contrôle du cycle cellulaire, induisant ainsi un arrêt du cycle cellulaire ou l’apoptose. La

majorité des cassures de l’ADN auraient lieu au niveau des sites fragiles communs, qui sont

souvent localisés au niveau de gènes suppresseur de tumeur, indiquant que ces régions

seraient les plus sensibles au stress réplicatif (Gorgoulis et al, 2005). Aux stades plus tardifs

de la tumorigenèse, l’attrition des télomères et l’hypoxie participeraient à l’activation des

points de contrôle. Enfin, des suppresseurs de tumeur tels que p53 peuvent être inactivés,

permettant aux cellules de se libérer de l’effet inhibiteur des points de contrôle du cycle

cellulaire et facilitant de ce fait la progression tumorale.

Mon travail de thèse s’inscrit dans ce modèle puisque nous supposons qu’une

dérégulation des ADN polymérases translésionnelles au cours des phases précoces du

développement tumoral participe au stress réplicatif. Dans l’équipe, nous avons montré

récemment que les ADN polymérases de la famille Y, Pol η, Pol κ et Pol ι, étaient

sous-exprimées dans les cancers colorectaux. Ainsi, au cours de ma thèse nous nous sommes

particulièrement intéressés au rôle physiologique de Pol η, en absence de dommage exogène

de l’ADN. Mes travaux se sont donc articulés autour de deux questions majeures :

- Quelles sont les conséquences d’une sous-expression de Pol η, dans une lignée

cellulaire humaine présentant une protéine p53 fonctionnelle, au niveau des points de

contrôle du cycle cellulaire, sur l’expression des sites fragiles communs et d’un point

de vue plus large au niveau des séquences particulières de l’ADN susceptibles de

former des structures secondaires difficiles à répliquer ?

- Dans quel(s) mécanisme(s) Pol η joue-t-elle un rôle dans les cellules humaines en

absence de traitement génotoxique : réplication de l’ADN ou recombinaison

homologue ?

La partie résultats va donc se diviser en trois chapitres : un premier chapitre expliquant

le rôle des ADN polymérases translésionnelles au niveau des séquences particulières de


117

l’ADN, un deuxième chapitre présentant les conséquences de la déplétion de Pol η dans les

cellules humaines et son rôle dans la maintenance de la stabilité du génome et enfin, un

dernier chapitre nous permettra d’étudier plus précisément le rôle de Pol η dans la

recombinaison homologue dans les cellules humaines.

La partie discussion permettra de replacer les résultats trouvés au cours de cette thèse

dans le contexte de la progression tumorale et notamment dans le contexte du syndrome du

Xeroderma pigmentosum variant.

118

RESULTATS

Résultats A. Rôle des ADN polymérases TLS sur les ADN non-B

119

A. Rôle des ADN polymérases TLS sur les ADN non-B

Afin de maintenir l’intégrité du génome, la réplication doit être fidèle. Cependant, des

lésions de nature endogène ou exogène peuvent survenir. Les différents mécanismes de

réparation et de tolérance permettant de contrecarrer les lésions exogènes ont été grandement

étudiés. En revanche, les mécanismes impliqués au niveau des barrières de fourches naturelles

telles que les séquences particulières de l’ADN susceptibles d’adopter des structures

secondaires ne sont que peu connus à ce jour. Chez le nématode C. elegans, l’ADN hélicase

Dog-1, l’homologue de BACH1 dans les cellules humaines, a été impliquée au niveau des

séquences riches en G (Cheung et al, 2002). En effet, l’absence de Dog-1 entraîne des

délétions de séquences riches en G, cette fréquence de délétions étant encore augmentée en

absence de Pol η ou Pol κ (Cheung et al, 2002). Ainsi, une coopération fonctionnelle entre les

ADN polymérases spécialisées et l’ADN hélicase Dog-1 au niveau des séquences riches en G

susceptibles d’adopter des structures en G-quadruplex a été proposée. Nous avons donc

étudié, le rôle des ADN polymérases de la famille Y (Pol η, Pol κ, Pol ι) au niveau des

séquences particulières de l’ADN susceptibles d’adopter des structures secondaires en

ADN-H, ADN-Z ou ADN-G dans les cellules humaines (article I).

1. Utilisation de shRNA épisomaux pour diminuer le niveau d’expression de Pol η

Afin d’analyser le rôle potentiel des ADN polymérases de la famille Y au niveau des

séquences riches en G, nous avons utilisé la technique d’interférence ARN que nous allons

détailler dans un premier temps avant d’étudier la validation des clones cellulaires exprimant

des shRNA utilisés dans nos expériences.

a- L’interférence ARN et les shRNA épisomaux

L’interférence ARN est un processus cellulaire qui permet d’induire l’extinction de

gènes endogènes ou exogènes par expression d’un petit ARN dans lequel un brin est

complémentaire de la cible ARNm (Fire et al, 1998; Zamore et al, 2000). Au cours de ce

processus, l’ARN double-brin est converti en molécules de 21 à 27 nucléotides appelées

siRNA (small interfering RNA) par le complexe DICER (Elbashir et al, 2001; McManus &

Sharp, 2002; Schwarz et al, 2003a; Tomari & Zamore, 2005; Zamore et al, 2000). La

séquence anti-sens du siRNA est amenée au niveau de la séquence ARNm homologue par le

complexe RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Ce complexe clive alors la séquence


120

ARNm homologue en fragments de 10 ou 11 nucléotides, conduisant à la dégradation de cet

ARNm cible (Hammond et al, 2000).

La technique siRNA est utilisée depuis de nombreuses années, mais il n’en reste pas

moins que son utilisation est parfois controversée. En effet, les siRNA ne permettent d’obtenir

une extinction du gène cible que transitoirement (pendant 2 à 5 jours). De plus, les

transfections de lignées cellulaires différentes donnent des résultats variables en termes

d’extinction. Enfin, les effets « off-target », principalement dus aux séquences de siRNA qui

ciblent d’autres gènes, dépendent de la concentration de siRNA utilisée et sont fréquents.

Ainsi, en 2002, un vecteur pSUPER permettant l’extinction transitoire d’un gène cible

endogène ou ectopique a été mis au point (Brummelkamp et al, 2002). En parallèle, des virus

exprimant des siRNA ont été développés à partir des rétrovirus qui s’intègrent tels que les

lentivirus ou à partir des adénovirus épisomaux. Cependant, le transfert de gènes basé sur les

adénovirus déclenche une réponse immunitaire chez l’hôte, conduisant à la dégradation rapide

des vecteurs. Ces effets dépendent bien entendu du vecteur, de l’hôte et du transgène (Fish &

Kruithof, 2004). D’autre part, bien que les lentivirus présentent de nombreux avantages

notamment en terme d’efficacité de transfection, les contraintes de sécurité et d’éthique sont à

prendre en compte (Romano et al, 2003). De plus, ces techniques d’intégration au niveau de la

chromatine hôte comportent divers problèmes notamment au niveau des sites d’intégration

incontrôlables pouvant induire des variations de phénotypes ou compromettre l’intégration à

long terme.

Afin de contrecarrer ces différents problèmes, Denis Biard et ces collaborateurs ont

développé des plasmides exprimant des shRNA basés sur le virus d’Epstein Barr (EBV)

(Biard et al, 2005). Les shRNA sont caractérisés par un appariement de base et une boucle et

sont reconnus de la même manière que les siRNA. Les vecteurs EBV ont été utilisés pendant

de nombreuses années afin de modifier les génotypes cellulaires humains (Biard et al, 1992).

Ces plasmides contiennent une origine de réplication latente du virus EBV appelée OriP et

permettent l’expression de l’antigène 1 du transactivateur viral EBV appelé EBNA-1. Cette

protéine attache les plasmides EBV au niveau des chromosomes en métaphase permettant

ainsi leur rétention nucléaire ainsi que leur ségrégation au cours de la mitose (Kapoor &

Frappier, 2003; Marechal et al, 1999). Leur réplication est semi-conservative et associée à la

réplication génomique (Dhar et al, 2001). En présence de l’OriP et de la protéine EBNA-1, les

vecteurs EBV persistent donc dans le noyau des cellules comme des épisomes stables, même

après une longue période en culture (Reisman et al, 1985).


121

Lors de notre étude nous avons utilisé ces vecteurs EBV contenant des séquences

shRNA dessinées via le site internet siSearch (Chalk et al, 2004; Chalk et al, 2005). Quatre

vecteurs ont été construits pour chaque gène d’intérêt POLH, POLI et BACH1. Seule

deux séquences de shRNA indépendantes, donnant la meilleure extinction au niveau des

transcrits et des protéines, ont été utilisées par la suite pour chaque gène d’intérêt (article I,

matériel et méthodes, p.127). Ces séquences ciblent soit les régions codantes, soit les

régions 3’-UTR. Le choix de séquences ciblant la région 3’UTR des ARNm nous permet de

complémenter les phénotypes plus simplement avec l’ADN complémentaire sauvage

correspondant à la séquence codante, sans avoir à réaliser des mutations silencieuses au

niveau des séquences shRNA pour éviter que l’ADN complémentaire exprimé de manière

ectopique soit également la cible de l’interférence ARN. D’autre part, nous avons utilisé des

clones cellulaires stables plutôt que des populations de clones afin d’obtenir une extinction

homogène et continue. Cette extinction était présente dans la moitié des clones testés et est

maintenue environ quatre à cinq mois en culture. La construction de clones cellulaires

exprimant un shRNA dirigé contre les transcrits de Pol κ en utilisant cette technique s’est

révélée impossible dû à la forte mortalité des cellules après transfection. Nous avons par

conséquent utilisé les deux séquences de siRNA dirigés contre l’ARNm de Pol κ cités dans

l’article I (matériel et méthodes, p.127). Comme contrôle, nous avons utilisé le vecteur

pBD650 contenant deux mésappariements dans une séquence dessinée pour cibler la protéine

XPA (Biard, 2007). Ce vecteur a été testé sur différents gènes impliqués dans les mécanismes

de réparation de l’ADN tels que la HR, le NER, le NHEJ et aucun phénotype n’a été observé

avec ce vecteur (Biard, 2007). De plus, toutes nos analyses phénotypiques ont aussi été

réalisées sur des cellules non transfectées et sur des cellules exprimant des shRNA dirigés

contre des transcrits d’autres protéines de la même famille, qui finalement ne présentent pas

les mêmes caractéristiques. Le meilleur contrôle reste cependant la complémentation par la

protéine d’intérêt. Pour les transfections de siRNA, deux séquences de siRNA contrôles ont

été utilisées : une séquence dirigée contre la luciférase (Sigma) et un siRNA contrôle

provenant de chez Eurogentec.

b- Validation des clones shRNA et des siRNA utilisés en termes d’extinction

Ces différents clones ont été générés à partir des cellules U2OS#18, des cellules

tumorales, issues d’un ostéosarcome, qui contiennent un substrat de recombinaison

homologue intégré en copie unique dans le génome (Puget et al, 2005). Ces cellules ont été

choisies pour leur substrat de recombinaison homologue, puisque nous voulions étudier le rôle


122

de Pol η au niveau de ce mécanisme dans les cellules humaines. Ces cellules, bien qu’elles

soient tumorales, ne semblent présenter aucun défaut des mécanismes fondamentaux de

réplication, de HR, de réparation et d’activation des points de contrôle du cycle cellulaire. En

outre, contrairement à de nombreuses lignées transformées, ces cellules possèdent une

protéine p53 fonctionnelle.

Les différents clones celluaires choisis ont été validés par analyses western blot

(article I, figure 1). L’extinction des protéines Pol η, Pol ι et BACH1 est comprise entre 70 et

90 %, ce qui est correct pour analyser les phénotypes induits par l’absence de ces protéines.

Nous avons, par la suite, vérifié l’effet spécifique des shRNA en montrant que la baisse des

transcrits d’une protéine d’intérêt n’entrainait pas de variation de l’expression des transcrits

de deux ADN polymérases réplicatives Pol α et Pol δ et de deux autres ADN polymérases de

la famille Y Pol η (ou Pol ι) et Rev1 et de l’ADN hélicase BACH1 (Fig 33). Nous pouvons

remarquer, d’une part, que le shRNA ι1 n’induit qu’une faible baisse des transcrits de Pol ι et

d’autre part, que la baisse des ARNm de Pol η induit une baisse de 30-40% des ARNm de

BACH1. Cependant, ces deux résultats n’ont pas été retrouvés en termes de protéines lors des

analyses par western-blot.

shC1 shC2 shη1 shη2 shι1 shB1 shB2

POLDPOLA

shι2

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0

BACH1

shC1 shC2 shη1 shη2 shι1 shι2 shB1 shB2

1,2 1,0

0,8 0,6 0,4 0,2 0

POLIREV1POLH

shC1 shC2 shη1 shη2 shι1 shι2 shB1 shB2

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Expression relative des ARNm

Figure 33. Analyse en PCR quantitative des niveaux d’expression des ARNm des ADN polymérases réplicatives α et δ, des ADN polymérases de la famille Y η, ι, REV1 et de l’ADN hélicase BACH1. Les ARN ont été extraits des différents clones cellulaires shRNA, puis rétrotranscrits. Les analyses en PCR quantitative en temps réel ont été réalisées avec différentes sondes spécifiques des transcrits POLA, POLD, POLH, POLI, REV1, BACH1. Les niveaux d’expression ont été normalisés par rapport au gène de ménage 18S.


123

Pour Pol κ, l’effet spécifique de ces siRNA a été analysé par PCR quantitative en

temps réel. En effet, la baisse des transcrits de Pol κ n’affecte pas l’expression des transcrits

des autres ADN polymérases humaines (Fig 34).

Figure 34. Analyse en PCR quantitative des niveaux d’expression des ARNm des ADN

polymérases réplicatives α et δ, des ADN polymérases de la famille Y η, ι, κ, REV1 et de l’ADN polymérase Pol θ. Les ARN ont été extraits des cellules Hela transfectées par un siRNA contrôle dirigé contre la Luciférase (Si-luc) ou par deux siRNA dirigés contre l’ARNm de Pol κ (si-κ1, si-κ2), puis rétrotranscrits. Les analyses en PCR quantitative en temps réel ont été réalisées avec différentes sondes spécifiques des gènes POLA, POLD, POLQ, POLH, POLI, REV1, POLK. Les niveaux d’expression ont été normalisés par rapport aux deux gènes de ménage les plus stables parmi YWHAZ, HPRT et ACTINE. La moyenne de trois expériences (sauf pour Pol ι) est représentée et les barres d’erreur correspondent aux écart-types.

c- Analyse fonctionnelle des clones shRNA et conséquences des siRNA

Afin de valider fonctionnellement les clones déficients en Pol η, nous avons analysé

leur sensibilité aux UVC. En effet, il est connu que les cellules déficientes en Pol η, telles

que les cellules XP-V, sont sensibles aux UVC en présence de caféine (Stary et al, 2003).

Nous avons constaté une sensibilité des clones U2OS déficients en Pol η aux UVC même

sans ajout de caféine lors des tests de clonogénie (Fig 35A). En outre, l’addition de caféine

induit une augmentation de cette sensibilité (Fig 35B) : i) pour le clone shη1, la survie n’est

plus que de 13% après traitement à la caféine alors qu’elle était de 27% sans ajout de caféine ;

ii) ce résultat est moins visible pour le clone shη2 certainement à cause du fort écart type

observé en absence de caféine. Il est important de rappeler que les cellules U2OS ont une

protéine p53 fonctionnelle, contrairement aux cellules XP-V transformées par SV-40. L’arrêt

Expression relative des ARNm


124

du cycle cellulaire en phase G1 médié par p53 étant fonctionnel, ces cellules sont donc plus

sensibles aux UVC, puisqu’elles peuvent être dirigées vers la voie de l’apoptose.

Figure 35. Sensibilité des cellules déficientes en Pol η aux radiations UVC. Les cellules

shRNA contrôles et les cellules déficientes en Pol η ont été ensemencées dans des boîtes 6 puits à 500 ou 1000 cellules par puits. Elles sont traitées avec 2,5 et 5 J/m² d’UVC 24h après ensemencement et colorées au cristal violet 8 jours après. La caféine a été rajoutée à 500µM juste après le traitement UV. Ce test de clonogénie permet de déterminer l’efficacité de clonage des cellules ainsi que la survie cellulaire aux radiations UVC. Les survies cellulaires ont été normalisées par rapport aux efficacités de clonage des cellules. La moyenne de trois expériences en triplicats est représentée sur ce graphe et les barres d’erreur correspondent aux écart-types.

Peu d’études avaient été réalisées concernant le rôle de Pol ι in vivo au cours de cette

étude. Par conséquent, il était difficile de valider fonctionnellement les clones déficients en

Pol ι. Cependant, vu la littérature récente impliquant Pol ι au niveau des dommages oxydatifs

de l’ADN (Petta et al, 2008), il serait intéressant d’analyser la sensibilité des cellules

déficientes en Pol ι au peroxyde d’hydrogène afin de valider fonctionnellement ces clones.

Les clones cellulaires déficients en BACH1 ont été validés via leur sensibilité à la

mitomycine C (MMC), un agent pontant de l’ADN (Fig 36A). En effet, comme toutes les

cellules déficientes pour une des protéines de l’Anémie de Fanconi, les cellules déficientes en

BACH1 sont sensibles aux agents pontants (Litman et al, 2005). De plus, les cellules

déficientes en BACH1 s’accumulent en phase G2/M du cycle cellulaire après traitement au

melphalan, un autre agent pontant de l’ADN (Fig 36B) (Litman et al, 2005).

Survie (%) Survie (%)

1

10

100

0 2 4 6

shC1

shC2

sheta1

sheta2

1

10

100

0 2 4 6

shC1

shC2

sheta1

sheta2

UVC (J/m²) UVC (J/m²)

A B - Caféine + Caféine


125

Figure 36. Sensibilité des cellules déficientes en BACH1 aux agents pontants de l’ADN. (A) Les cellules shRNA contrôle ou les cellules déficientes en BACH1 ont été ensemencées dans des boîtes 6 puits à 500 ou 1000 cellules par puits. Elles sont traitées avec 250 et 500nM de mitomycine C (MMC) 24h après ensemencement et colorées au cristal violet 8 jours après. Ce test de clonogénie permet de déterminer l’efficacité de clonage des cellules ainsi que la survie cellulaire à la MMC. Les survies cellulaires ont été normalisées par rapport aux efficacités de clonage des cellules. (B) D’autre part, les cellules déficientes en BACH1 et les cellules contrôles ont été ensemencées à 100 000 cellules dans des boîtes 6 puits. Elles ont ensuite été traitées 24h après avec 0,5µg/mL de melphalan. 65h après, ces cellules sont marquées à l’iodure de propidium et analysées par cytométrie en flux. Le pourcentage de cellules en phase G2/M a été déterminé via l’utilisation du logiciel Modfit. La moyenne de trois expériences en triplicats est représentée sur ces graphes et les barres d’erreur correspondent aux écart-types.

L’extinction de Pol κ in vivo a été validée via la sensibilité des cellules déficientes en

Pol κ aux radiations UVC (Fig 37). En effet, les fibroblastes embryonnaires de souris

déficients en Pol κ sont sensibles aux radiations UV et l’introduction de l’ADN

complémentaire de l’ADN polymérase κ humaine permet de complémenter cette sensibilité

(Ogi & Lehmann, 2006).

1

10

100

0 100 200 300 400 500 600

shC1shC2shB1shB2

MMC (nM) 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

shC1 shC2 shB1 shB2

- melphalan+ melphalan

Survie (%)

Survie (%)

UVC (J/m²)

NT si-luc si-κ2

A

Cellules en phase G2/M (%)

B

Figure 37. Sensibilité des cellules déficientes en Pol κ aux radiations UVC. Les cellules HeLa ont été transfectées par les siRNA (si-luc, si-κ2) ou non transfectées (NT) puis ensemencées à 500 cellules par puits. Elles sont irradiées à 5 et 10J/m² 24h après ensemencement et colorées au cristal violet 8 jours après. Ce test de clonogénie permet de déterminer l’efficacité de clonage ainsi que la survie cellulaire aux radiations UVC. Les survies cellulaires ont été normalisées par rapport aux efficacités de clonage des cellules. La moyenne de trois expériences en triplicats est représentée et les barres d’erreur correspondent aux écart-types.


126

Les clones cellulaires shRNA et les séquences siRNA étant validés en termes de baisse

d’expression des ARNm, de protéines et des fonctions, nous avons pu les utiliser pour étudier

le rôle de nos protéines d’intérêt au niveau des séquences particulières de l’ADN.

2. Identification d’un nouveau rôle pour les ADN polymérases de la famille Y

Afin d’analyser le rôle potentiel des ADN polymérases de la famille Y au niveau des

séquences particulières de l’ADN, nous avons utilisé deux approches différentes : la

sensibilité des cellules à un agent permettant de stabiliser les G-quadruplex et l’utilisation de

différentes lignées cellulaires contenant de multiples copies de séquences particulières de

l’ADN (obtenues en collaboration avec le laboratoire de Karen Vasquez., University of Texas,

Smithville)

a- La télomestatine : un agent stabilisant les G-quadruplex

Nous avons vu lors de l’introduction bibliographique (p.110) que la télomestatine est

un ligand spécifique des G-quadruplex qui permet de les stabiliser en s’intercalant entre les

plans formés par les guanines (Lemarteleur et al, 2004). La télomestatine a d’abord été

identifiée comme un ligand se liant aux G-quadruplex présents au niveau de la séquence

télomérique et comme un inhibiteur de la télomérase (Shin-ya et al, 2001). Cependant, la

télomestatine permet aussi de stabiliser des G-quadruplex d’origine non télomérique

(Lemarteleur et al, 2004). Nous avons dans un premier temps analysé la sensibilité des

cellules déficientes en Pol η, Pol ι ou Pol κ à la télomestatine via un test de clonogénie. Nous

avons utilisé comme contrôle positif les cellules déficientes en BACH1 qui sont sensibles à la

télomestatine (Wu et al, 2008). De manière intéressante, seules les cellules déficientes en

Pol η ou Pol κ sont sensibles à la télomestatine (article I, figure 2), suggérant que Pol ι

n’intervienne pas au niveau des séquences riches en G.

b- Différentes lignées cellulaires contenant des séquences particulières de

l’ADN

Afin de confirmer les résultats précédents, nous avons utilisé différentes lignées

cellulaires construites dans le laboratoire de Karen Vasquez (University of Texas, Smithville)

(voir article I et annexe 1 pour le détail des séquences et des constructions). Des vecteurs

contenant différentes séquences particulières d’ADN, capables de former des G-quadruplex,


127

de l’ADN-H ou de l’ADN-Z, issues du promoteur de c-MYC, du gène BCL-2 ou du génome

KSHV (Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus), ont été transfectés dans des cellules HeLa.

8 à 12 copies ont été intégrées dans le génome. Ces nombres d’intégration ont été mesurés

par PCR quantitative. Ainsi, nous ne connaissons ni les sites d’intégration, ni la nature de leur

insertion (tandem). Des expériences de southern-blot auraient permis de déterminer plus

précisément les caractéristiques d’intégration.

Il est important de noter que la séquence du gène c-MYC humain, capable d’adopter

des structures en ADN-H ou ADN-Z, est mutagène et induit des cassures double-brin de

l’ADN (Wang & Vasquez, 2004; Wang et al, 2006a). De plus, les séquences capables

d’adopter des structures en ADN-H ou ADN-Z induisent aussi de l’instabilité chromosomique

lorsqu’elles sont introduites dans des souris (Wang et al, 2008). Cependant, le mécanisme

expliquant l’instabilité au niveau de ces séquences n’est pas connu.

Nous avons pu mettre en évidence que, quelle que soit la lignée cellulaire contenant de

l’ADN non-B utilisée, le pourcentage de cellules positives pour γ-H2AX, un marqueur des

cassures de l’ADN, augmentait après transfection d’un siRNA ciblant les transcrits de Pol κ

(article I, figures 3 à 5). Par contre, l’absence de Pol η induit une augmentation des cassures

de l’ADN uniquement dans une lignée cellulaire enrichie en séquences susceptibles d’adopter

des structures en G-quadruplex (article I, figures 3 à 5).

c- Article I : “Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing

naturally occurring structured DNA in human cells”

Un article, relatant la majorité des résultats présentés ci-dessus a été publié dans le

journal « Molecular Carcinogenesis ».

Role of TLS DNA Polymerases eta and kappa inProcessing Naturally Occurring Structured DNAin Human Cells

Remy Betous,1,2 Laurie Rey,1,2 Guliang Wang,3 Marie-Jeanne Pillaire,1,2 Nadine Puget,1,2

Janick Selves,4 Denis S.F. Biard,5 Kazuo Shin-ya,6 Karen M. Vasquez,3

Christophe Cazaux,1,2* and Jean-Sebastien Hoffmann1,2*1CNRS, Institute of Pharmacology and Structural Biology (IPBS), Toulouse, France2University of Toulouse, UPS, Toulouse, France3Science Park-Research Division, Department of Carcinogenesis, M. D. Anderson Cancer Center,University of Texas, Smithville, Texas4INSERM U563, Centre of Physiopathology of Toulouse-Purpan, Federation of Digestive Cancerology,Department of Anatomo-pathology, University of Toulouse, Toulouse, France5Commissariat a l’Energie Atomique, CEA-DSV-iRCM, Laboratoire de Genetique de la Radiosensibilite,Fontenay-aux-roses, France6Biomedicinal Information Research Center, National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology (AIST) Biological Systems Control Team 2-42 Aomi, Tokyo, Japan

Accurate DNA replication during S-phase is fundamental to maintain genome integrity. During this critical process,

replication forks frequently encounter obstacles that impede their progression. While the regulatory pathways whichact in response to exogenous replication stress are beginning to emerge, the mechanisms by which fork integrity ismaintained at naturally occurring endogenous replication-impeding sequences remains obscure. Notably, little is

known about how cells replicate through special chromosomal regions containing structured non-B DNA, for example,G4 quartets, known to hamper fork progression or trigger chromosomal rearrangements. Here, we have investigatedthe role in this process of the human translesion synthesis (TLS) DNA polymerases of the Y-family (pol h, pol i, and polk), specialized enzymes known to synthesize DNA through DNA damage. We show that depletion by RNA interference

of expression of the genes for Pol h or Pol k, but not Pol i, sensitizes U2OS cells treated with the G4-tetraplexinteractive compound telomestatin and triggers double-strand breaks in HeLa cells harboring multiple copies of aG-rich sequence from the promoter region of the human c-MYC gene, chromosomally integrated as a transgene.

Moreover, we found that downregulation of Pol k only raises the level of DSB in HeLa cells containing either one oftwo breakage hotspot structured DNA sequences in the chromosome, the major break region (Mbr) of BCL-2 geneand the GA rich region from the far right-hand end of the genome of the Kaposi Sarcoma associated Herpesvirus.

These data suggest that naturally occurring DNA structures are physiological substrates of both pol h and pol k. Wediscuss these data in the light of their downregulation in human cancers. � 2008 Wiley-Liss, Inc.

Key words: DNA replication; genetic instability; double strand breaks; non-B DNA

INTRODUCTION

Cell proliferation involves numerous processesthat need to be tightly coordinated to ensure thepreservation of genome integrity and to promotefaithful genome propagation. Efficient and accu-rate DNA replication is critical for such maintenanceof genome stability during the error-free duplicationof chromosomes before their segregation. In eukary-otic cells, this process relies on the well-orchestratedactivation of a large number of replication originsand the duplication of an enormous amount of DNA[1]. This challenging task is made more difficult bygenotoxic insults and endogenous blocks, whichimpede fork progression and trigger chromosomalrearrangements [2]. Failure to protect stalled forks or

MOLECULAR CARCINOGENESIS 48:369–378 (2009)

� 2008 WILEY-LISS, INC.

Additional Supporting Information may be found in the onlineversion of this article.

Abbreviations: Mbr, major breakpoint region; TLS, translesionsynthesis; DSB, double-strand breaks; Pol, DNA polymerase; KSHV,Kaposi Sarcoma associated Herpesvirus; shRNA, short hairpin RNA;siRNA, small interfering RNA; TMS, Telomestatin; G4 DNA, Guanine-quadruplex DNA.

R. Betous and L. Rey contributed equally to the study.

Denis S.F. Biard’s present address is Hopital Paul Brousse, INSERMU602/CEA-DSV-iRCM, 12 av Paul Vaillant Couturier, 94807 Villejuif,France.

*Correspondence to: Genetic Instability and Cancer, CNRS, IPBS,UMR 5089, University of Toulouse, 205 Route de Narbonne 31077Toulouse cedex 4, France.

Received 28 August 2008; Revised 21 October 2008; Accepted 3November 2008

DOI 10.1002/mc.20509

Published online 30 December 2008 in Wiley InterScience(www.interscience.wiley.com)

to process the replication fork appropriately forreplication restart results in the accumulation ofmutations and genomic aberrations. Indeed, avariety of human genetic syndromes that lead tocancer predisposition are caused by mutations ingenes that protect the genome integrity duringchromosome replication [3]. While many studiesusing several model systems have provided newinsights into how DNA replication forks are main-tained and restarted when cells are transientlyexposed to genotoxic drugs, much less is knownabout how cells tolerate fork pausing in an unchal-lenged S phase. Some of the endogenous sources ofinterference with fork progression are the naturallyoccurring sequences which have the potential toadopt non-B-DNA conformations. These sequencesare very abundant in chromosomal regions that areprone for gross rearrangement [4] and some havebeen associated with human diseases, such severaltrinucleotide repetitions [5]. Impediment of thereplication fork occurs also at guanine-rich nucleicacids which have the potential to form G-quadruplex(G4) DNA, stabilized by Hoogsteen hydrogen bond-ing between guanine residues, which influence geneexpression and genomic stability [6]. The non-B DNAstructures are also associated with a variety of othertypes of genetic instability in vivo. Genomic regionscontaining fragile sites are prone to undergo DNAbreaks, chromosomal translocations, deletions andamplifications [7]. Many leukemias, lymphomas,and sarcomas exhibit specific reciprocal chromoso-mal translocations that either result in the activationof proto-oncogenes or generate new oncogenicfusion genes. The mechanisms of instabilities occur-ring in these hotspot regions of the human genomeare still poorly understood. Interestingly, manybreakage hotspots are mapped inside or nearsequences that have the potential to adopt non-BDNA structures. For example, segments of thehuman c-MYC gene capable of adopting non-Bstructures are found in the regulatory sequences ofthe gene [8] and overlap with the major breakagehotspots found in c-MYC-induced lymphomas orleukemias [9,10] [reviewed in [11]]. An H-DNAstructure also occurs at the BCL-2 gene major break-point region (Mbr) in follicular lymphomas [12].Several of the fragile sites have been shown to beprone for breakage after partial inhibition of DNAsynthesis, as caused by aphidicolin, an inhibitorof replicative DNA polymerases [13]. To date, theprecise mechanisms maintaining genomic stabilityduring the replication of these hotspot regions ofthe human genome remain poorly understood.Evidence suggests that several DNA helicases, suchas the RecQ-family helicases defective in Bloom andWerner syndromes [14,15], and BRIP1 (FANCJ) [16]have roles in the resolution of aberrant DNAstructures, including G quartets. Here, we investi-gated if the specialized enzymatic activities of the

translesion (TLS) DNA polymerases could be requiredwhen the replication forks are challenged by non-BDNA to facilitate replication fork reactivation and/orto avoid fork collapses and DSB induction. TLSpolymerases are specialized enzymes that present amuch more open structure of their catalytic site thanerror-free replicative DNA polymerases (Pol delta andPol epsilon) [17], enabling them to accommodatedamaged bases in their active sites. In the translesionprocess, TLS polymerases take over from stalledreplicative polymerases and allow synthesis througha variety of DNA lesions [17]. In human cells, manyTLS DNA polymerases belong to the Y-family whichincludes Polh, Pol i, and Pol kproteins, the most welldocumented enzymes of this family. Pol h has theunique property of being able to synthesize past DNAcontaining UV-generated cyclobutane thyminedimers (CPD) with similar efficiency to that inundamaged DNA [18] and was described as thedeficient protein in the variant form of XerodermaPigmentosum (XPV) cancer-prone syndrome [19].Pol i has very low processivity and is able to insertbases opposite some types of damage, but unable toextend synthesis further from the inserted base. Ithas a very high error rate [20] and its functionremains a mystery. Pol k is able to carry out TLS pastbenzo[a]pyrene-guanine and other adducts at the N2position of guanine both in vitro and in vivo [21–23].In addition to its role in TLS, Pol k seems to have arole in the repair synthesis step of nucleotideexcision repair (NER) pathway [24].

Here, we present evidence suggesting that both Polh and Pol k prevent genomic instability occurringat natural DNA sequences capable of formingunusual secondary structures in human cells. Wediscuss the data in the scope of the frequent down-regulation of these two TLS DNA polymerases inhuman cancers.

MATERIALS AND METHODS

Construction of Non-B DNA-Containing Plasmids

Natural occurring human sequences that arecapable of forming non-canonical DNA structureswere amplified by PCR and were cloned into plasmidpUCNIM at the same location similar as describedpreviously [25]. pULCtrl has 600 bp control non-BDNA sequence from the GAPDH gene and is notknown to form non-B DNA structures. pUMycPromhas 556 bp of the human c-MYC promoter region,containing at least three Z-DNA forming sequences[26], one H-DNA [27], and one G-DNA formingsequence [28]. pUMBR has 520 bp from the humanBCL-2 gene major break region (MBR) where severalH-DNA forming sequences have been defined [12].pUGA-rich has a GA rich region (�700 bp), abreakage hotspot region from the far right-handend of the KSHV genome and can form an H-DNAstructure.

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Molecular Carcinogenesis

Cell Culture

U2OS cells and HeLa cells were grown in DMEMmedium (Gibco, Invitrogen Ltd., Paisley, UK)complemented with 10% of FBS (Lonza Verviers,Verviers, Belgium) and 80 units/mL of penicillin, and80 mg/mL of streptomycin (Gibco) for U2OS cells and500 mg/mL neomycin only for transgenic HeLa cellscontaining pUCNIM derivatives that express theneomycin resistant gene.

Construction of Transgenic HeLa Cell Lines Harboring

Chromosomal Non-B DNA Forming Sequences

After the initial cloning of the naturally occurringsequences and verification by DNA sequencing,the plasmids, pULCtrl, pUMycProm, pUMBR, andpUGA-rich were digested with BsaI, and 5 mg of eachlinearized plasmid DNA was transfected into HeLacells using Nucleofector kit R according to themanufacturer’s recommendations (Amaxa Biosys-tems, Cologne, Germany). Stably transfected cellswere obtained after selecting in medium containing500 mg/mL G418. The self-ligated episomal plasmidsare not able to replicate in HeLa cells and will be lossduring cell proliferation.

The integration of plasmid fragments containingnon-B DNA forming sequences into the genomicDNA were random and the copy number of theintegrated vector was variable among the differentcell lines. To determine the copy number of integra-tion per genome, the genomic DNA of each trans-genic cell line was isolated and subjected toquantitative real-time PCR, and the amplificationof integrated fragments was compared with thatfrom the GAPDH gene. A standard curve was derivedby using serial dilutions made by mixing transgene-negative human genomic DNA with plasmid DNA at1:1, 1:3, 1:10, 1:30, and 1:100 ratio, according to thelengths of human genome (3�109) and plasmidDNA (7�103), and was used to estimate the absolutecopy number of transfected HeLa cells.

Gene Silencing in U2OS and HeLa Cells

To stably knock down the expression of POLH, thegene encoding DNA polymerase eta, POLI, the geneencoding DNA polymerase iota and BRIP1(BACH1),the gene encoding the DNA helicase BRIP1(BACH1/FANCJ) in U2OS cells, we used replicative shorthairpin (shRNA) expressing vectors (pEBVsiRNA)which have been previously shown to impose a verystrong and stable gene silencing in human cells afterseveral months in culture [29]. siRNA design,pEBVsiRNA vector cloning and establishment ofstable knockdown cells were carried out as previouslydescribed [30]. RNAi sequences for Pol h (NM006502) extended nucleotides 50-GTGTTGAAGT-GATGGAGAT-30 in the ORF (shh1) and 50-GCAAT-GAGGGCCTTGAACA-30 in the 30UTR region (shh2).

For Pol i (NM 007195), RNAi sequences stretchednucleotides 50-CTCAGTCCTTTAGTGAAGA-30 in theORF (shi1) and 50-GAAGTAAATTCTGGCACAA-30 inthe 30UTR region (shi2). For BACH1 (NM 032043),RNAi sequences corresponded to 50-GGAATTGCTA-GATGGGAAA-30 in the ORF (shB1) and 50-TGCTT-ATGTTAAACTCTGT-30 in the 30UTR region (shB2).Long-term expression of shRNA in human cells wasmaintained by addition of 200mg/mL of Hygromycin(Gibco, Invitrogen Ltd.). As control, we used thepBD650 plasmid which expresses an inefficientshRNA sequence, as previously validated [29].

For transient gene silencing in HeLa cells, twoindependent siRNAs were used to silence the expres-sion of POLK, the gene encoding DNA polymerasekappa (sik1: 50-CCAAUAGACAAGCUGUGAUdTdT-30 and sik2: 50-CCCAGUUAAUCAACCCAAAdTdT-30) or POLH (sih1: 50-GCAATGAGGGCCTTGAACA-30 and sih2: 50-GCAAACTTAGCTCTGGTTA-30). Forcontrol, siRNA against luciferase (50-CGUACGCG-GAAUACUUCGAdTdT-30) [31] was used.

Western Blotting

Cells were lysed in a buffer containing 50 mM TrispH 7.5, 300 mM NaCl, 1% Triton, 5 mM EDTA, 1 mMDTT, supplemented with inhibitors. Cell lysateswere cleared by centrifugation for 10 min at10 000 rpm. Cell extracts were boiled in loadingbuffer (250 mM Tris pH 6.8, 5% SDS, 30% glycerol,20% b-mercaptoethanol, bromophenol blue). Pro-teins were separated on 7% SDS–PAGE gel during 2 hand electrotransfered (Biorad Laboratories, Hercules,CA) during 2 h on PVDF membranes (AmershamBiosciences, Buckinghamshire, UK). Pol h was de-tected using DNA polymerase h polyclonal antibodyab17725 at 50 mg/mL (Abcam Inc., Cambridge, MA).Pol i antibodies were a gift from R. Woodgate (NIH).Pol k polyclonal antibody was kindly provided byT Nohmi, Naoko Niimi, and Petr Gruz (Tokyo).BACH1/BRIP1 polyclonal antibodies were fromAbcam (ab 16608). Actin and Ku70 were detectedusing monoclonal antibody C4 at 1:10 000 (Chemi-con International, Temecula, CA) and monoclonalantibody N3H10 (Interchim, Montlucon, France) at1:10 000 respectively. All blots were detected by ECLWestern Blotting substrate (Pierce, Perbio Science,Brebieres, France).

Colony-Forming Survival Assay After TMS Treatment

Five hundred or 1000 U2OS cells stably depletedfor BRIP1(BACH1), Pol h, or Pol i, were seeded intriplicate 24 h prior 5 and 8 mM treatment withtelomestatin (TMS) [32]. Clones were countedafter Crystal Violet coloration 8 d after treatment.Standard deviations have been calculated fromthree independent experiments. For Pol k depletionexperiments, 20 mM of siRNA directed against Pol Kwere transfected 24 h before seeding by usingLipofectamine 2000 protocol.

POL ETA AND POL KAPPA PROCESS NON-B DNA 371


Cell Preparation and Measurement of g-H2AX byFlow Cytometry

Forty-eight hours after transfection with siRNA,cells (1�106 cells) were harvested, fixed in ethanol70%, washed in PBS before permeabilization for10 min in PBS SVF 2% Triton 0.1%, centrifuged andresuspended in 100 mL of mouse monoclonal anti-phospho-histone H2AX antibody (Upstate Bio-technology, Temecula, CA; clone JBW301; 1:400dilution). Samples were incubated for 1 h underconstant agitation at room temperature (RT). Atthe end of the incubation time, samples werecentrifuged, rinsed twice with FACS Buffer (PBS SVF2% Triton 0.1%) and resuspended in 100 mL ofsecondary antibody Alexa 488 goat anti-mouseIgG (Hþ L)F(ab0)2 fragment conjugate (Molecularprobes, Eugene, OR; 1:200 dilution) for 1 h underconstant agitation at RT. Samples were washed twicewith FACS buffer, resuspended in PBS containing250 mg/mL propidium iodide and 500 mg/mLRNAse-A before an analysis of 15 000 cells/samplewith a FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes,NJ). Analysis of flow cytometry data were conductedusing Cellquest software. Samples were gated onpropidium iodide for DNA content and time of flightto eliminate debris and cell doublets before theanalysis of gH2AX antibody staining intensity.

Processing of Tissue Specimen From Cancer Patients

Tissue specimens from 74 patients who underwentsurgery for primary colorectal adenocarcinomaresection at the Toulouse University Hospitalbetween 1999 and 2002 were selected. Exclusioncriteria were patients treated with adjuvant therapyand with tumor microsatellite instability (MSI).Before RNA and DNA extraction, a frozen sectionwas cut and stained with hematoxylin and eosin toevaluate the percentage of neoplastic cells. Except forthree patients, malignant cells accounted for atleast 50% of the tumor involvement. The study wasapproved by the National Institute of Cancer (INCa)following the recommendations of the NationalAgency of Agreement and Evaluation for Health(ANAES). Tumor samples have been collected inagreement with the 2004 French Bioethic law.

For RNA extraction, 40–80 frozen sections with5–10 mm thick from tumoral and adjacent normalsamples were immediately homogenized in the lysisbuffer of the RNeasy extraction kit and total RNA wereextracted according to the manufacturer’s instruction(Qiagen, Courtaboeuf, France). The quality of totalRNA was assessed on the Agilent 21001 bioanalyserusing the RNA NanoLab1 chip and RNA 6000 NanoAssay1 kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).One to 2 mg of total RNA were reverse transcribedusing the High-Capacity cDNA Archive Kit (AppliedBiosystems, Foster City, CA). cDNA of Pol E and Pol Htranscripts have been amplified in triplicate in

tumoral and normal samples using gene expressionassays (ABI cat# Hs00173030_m1 and Hs00197814_m1, respectively), TaqMan Universal PCR Masterand the 7900 HT fast real-time PCR apparatus.Four control cDNA (18 S, GAPDH, HPRT, YWHAZ)were simultaneously amplified (gene expressionassays: ABI cat# Hs99999901_s1, Hs99999905_m1,Hs99999909_m1, Hs00237047_m1). For each pair ofsamples, the two most stable control genes wereselected by qBases software (http://medgen.ugent.be/qbase/) to normalized the expression of Pol E andPol H then ratios T (tumoral)/N (normal) betweennormalized values were calculated.

RESULTS

Generation of the RNA Interference-BasedKnockdown Cellular Models

We succeeded in stably knocking down theexpression of POLH, POLI, and BRIP1(BACH1) genesin U2OS cells, by using replicative short hairpin(shRNA) expressing vectors (pEBVsiRNA) whichexerted a very strong and stable gene silencing afterseveral months in culture. For POLK silencing, wefailed to obtain viable long-term depleted cellularclones and we decided to transiently silence the geneby using siRNA. All these siRNA/shRNA interference-based knockdown cellular clones presented a strongreduction of protein levels for BRIP1, Pol h, Pol i, andPol k, as evidenced by Western blotting (Figure 1).We checked by real-time PCR that depletion for eachTLS DNA polymerase was specific since none ofreplicative polymerases (pols a, d, e), the otherY-family polymerases, or other alternative DNApolymerases (pols b, l, m, and y) were downregulatedat the transcript level (data not shown).

Pol h and Pol k Depletion Sensitizes Cells tothe G-Quadruplex Ligand TMS

G-quadruplex structures are stabilized in vitro bysmall molecules called G-quadruplex ligands (G4ligands). Although firstly described on G-quadruplexstructures formed by telomeric sequence, G4 ligandsare able to stabilize all G-quadruplex independentlyon primary DNA sequence capable of formingthese secondary structures. Several classes of smallmolecules that bind to G-quadruplex DNA have beendescribed. Among them, the natural compoundtelomestatin (TMS) is a G4 ligand with exceptionalselectivity [33]. To investigate a potential role of TLSpolymerases in cellular G4 DNA metabolism, weasked if TLS pol-depleted cells were sensitive toTMS by performing clonogenic colony formationassays. As an additional reference, we used a set ofisogenically cell lines deleted for the helicaseBRIP1(BACH1), which has been shown to play a rolein the resolution of alternate G4 DNA structures thatimpede DNA replication [34]. All the cell lines wereexposed to 5 and 8 mM of TMS and we determined

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the colony formation capability for each cell line(Figure 2). As expected, depletion of BRIP1(BACH1)with two different shRNAs sensitized cells to TMS,with only 26% of survival after 8 mM TMS treatment(as compared to 52% in control cells). We did notobserve a significant impact of the Pol i depletion onTMS sensitivity compared to control cells, support-ing the notion that Pol i is not essential in G4 DNAmetabolism. In contrast, we found that TMS inhib-ited colony formation to a significantly greaterextent among Pol h-depleted and Pol k-depletedcells than among control cells, suggesting that bothTLS DNA polymerases could have an important rolein processing G4 DNA structures.

Figure 1. Validation of the RNA interference-based knockdowncellular models (A–C). We generated U2OS clones expressing shRNAcontrol sequences (shC1 and shC2) and targeting BRIP1(BACH1)(shB1 and shB2), POL I (shi1 and shi2) or POL H (shh1 and shh2).Extracts from these cells were analyzed by immunoblotting with theindicated antibodies and Ku70 as a loading control (D) U2OS cellswere transfected with control siRNA (Luciferase) or two independentPol k siRNAs (sik1 and sik2). The levels of Pol k was analyzed byWestern blotting 48 h after transfection and normalized againstactin.

Figure 2. Pol h and Pol k depletion sensitizes cells to TMS. Cellsurvival after 1 wk treatment with a range of TMS concentrations forU2OS cell lines depleted for BACH1, Pol h, Pol i, or Pol k. All datawere performed in triplicate and were taken from the meansurvival values obtained from three independent experiments (errorbars¼ standard deviation).



The Depletion of Pol h or Pol k Elevates DNA DamageAssociated With Non-B DNA Formed at the

Human c-MYC Promotor

We next asked if Pol h and Pol k depletiondisrupted the cellular ability to cope with replicationstress associated with the presence of non-B DNAsince prolonged stalling of the replication forks atthese alternate structured DNA sequences can lead tofork collapse and double-strand breaks. To assess theimportance of both TLS polymerases in preventingor reducing the number of double-strand breaks thatarise from the presence of non-B DNA, we establishedtransgenic HeLa cells with approximately 8–12copies (determined by quantitative real-time PCR,data not shown) of chromosomally integratedplasmid containing G-rich sequences from thehuman c-MYC promoter region (pUMycProm),sequences from the human BCL-2 major break region(pUMBR), GA-rich sequences from the breakagehotspot region of the KSHV genome (pUGA-rich),or a similar length (600 bp) of control B-DNAsequence from the human GAPDH gene, respectively(see Supplementary Figure 1). By using a siRNAtechnique, we successfully depleted Pol h or Pol kindividually in HeLa cells containing pUMycProm(MYC-DNA) or control plasmid pULCtrl (B-DNA) inthe genome, as evidenced by immunoblotting of thetransfected HeLa cell lines shown in Figure 3. Wethen measured by Flow Cytometry (see Materials andMethods Section and Figure 4A) the proportion ofcells positive for g-H2AX, a well-known marker fordouble-strand breaks, in MYC-DNA cells and wecompared to the control B-DNA cells. For the B-DNAcells, depletion of Pol h had no significant effect ong-H2AX positive cell population, while downregula-tion of Pol k seemed to slightly increase spontaneousDSB (Figure 4B). Compared to B-DNA cells, we foundthat DSBs were significantly more elevated in MYC-DNA cells knocked-down for Pol h or Pol k, whilecontrol siRNA transfection in these cells had no

Figure 3. Illustration of Pol k or Pol h depletion in Hela cellstransfected with B-DNA and non-B DNA used in this study. Wholecell extracts from Hela cells containing c-MYC-DNA transientlytransfected with siRNA against Luciferase (siC), Pol h (sih1 and sih2)or Pol k (sik1 and sik2) were probed by Western blotting withantibodies against Pol h, Pol k, or Ku70 (as a loading control).

Figure 4. Pol H and Pol K gene silencing triggers H2AXphosphorylation in HeLa-MYC cells. HeLa cells containing B-DNAor MYC-DNA were transfected with control siRNA (Luciferase), twoindependent Pol k siRNAs (sik1 and sik2) or two independent Pol hsiRNAs (sih1 and sih2). Quantification of g-H2AX-positive cells in thepopulation of each cell line was performed by Flow CytometryAnalysis as described in Materials and Methods Section. An exampleis given in (A) where a scatter plot is presented with g-H2AX intensityon the y-axis and propidium iodide intensity on the x-axis for thecontrol B-DNA cells and the MYC-DNA cells depleted for Pol k. Thecell populations used for the measurement of the g-H2AX-positivecells were enclosed by rectangles. (B) Quantification of the FACSanalysis were performed as shown in (A) with the cell linestransfected with the indicated siRNAs. The error bars indicatestandard deviations of three independent experiments.

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effect. The increased number of g-H2AX positive cellsin those populations silenced for Pol h or Pol kcompared to that in undepleted cells stronglysuggests that the presence of each polymeraseprevents the replicative stress associated with thenon-B DNA structure (e.g., G4 DNA, H-DNA, or Z-DNA), thereby decreasing the extent of DSBs. Thesedata further support the conclusion that bothpolymerases contribute to the metabolism of non-BDNA forming sequences in human cells and showthat these enzymes prevent genomic instabilityoccurring at these naturally occurring sequences.

Analysis of DSBs in HeLa Cells Transfected With Mbr-DNA

and GA-DNA After Depletion for Pol h or Pol k

We next investigated whether the loss of Pol h orPol k contributes to genomic instability associatedwith two other naturally occurring DNA sequencescapable of forming unusual secondary structures,and which have been shown to be breakage hotspots.The first one is a 520 bp sequence of the BCL-2 majorbreak region (Mbr) within which several H-DNAforming sequences have been defined (Supplemen-tary Figure 1). The second one is a 700 bp GA richregion from the far right-hand end of the KSHVgenome (Supplementary Figure 1). HeLa cells weretransfected with plasmids containing these struc-tured regions (see Materials and Methods Section)and ultimately depleted for Pol h or Pol k. Theproportion of g-H2AX positive cells was measured byFlow Cytometry and compared to that observed withcontrol Hela cells transfected with B-DNA. We foundthat downregulation of Pol k significantly enhancedthe proportion of cells positive for g-H2AX in Mbrand GA cells (Figure 5), similarly to the resultsobtained from cells containing the c-MYC sequence.However, in contrast to what we observed with MYC-DNA, depletion of Pol h had no significant effect ong-H2AX positive cell population for the cellscarrying Mbr or GA structured sequences (Figure 5).These data suggest that Pol k and Pol h may playdifferent roles in processing different types of non-BDNA structures in vivo.

Concomitant Downregulation of Pol h and Pol k inColorectal Cancer

Recent studies have emphasized the existence of arelationship between replication stress and tumorprogression [35,36]. Since loss of Pol h or Pol kexpression results in increased DSBs linked to naturalstructured DNA sequences which interfere with theprogression of the replication fork during S phase,downregulation of these TLS DNA polymerasescould be an important contributor for endogenousreplication stress and genetic instability, as it occursin tumors. We previously reported that levels ofexpression of POL K were significantly lower intumors than in adjacent tissues in a human coloncancer cohort including 74 coupled primary color-

ectal carcinomas at different stages of development[37]. Using the same cohort, we analyzed here byreal-time PCR-based Micro Fluidic Cards the POL Hexpression profiles (Figure 6). Unlike Pol E, whichencodes the replicative Pol e and whose expressionwas not significantly affected, we found that, likePOL K, levels of expression of POL H were stronglyaffected in tumors than in adjacent tissues (Figure 6).We next explored if the deregulations of both DNApolymerases gene expression were concomitant incancer tissues by performing a non-parametricSpearman’s rank-correlation test to analyze gene/gene correlations in the cohort. The closer to 1 theSpearman coefficient (rho), the more associated theexpression of the two genes would be. Interestingly,we found that expression defects of genes encodingPOL H and POL K were the most correlated (Table 1).

Figure 5. Depletion of Pol k, but not that of Pol h, increases H2AXphosphorylation in HeLa-Mbr and HeLa-GA cells. HeLa cellscontaining B-DNA, Mbr-DNA or GA-DNA were transfected withcontrol siRNA (Luciferase), two independent Pol k siRNAs (sik1 andsik2) or two independent Pol h siRNAs (sih1 and sih2). Quantificationof g-H2AX-positive cells was achieved as in Figure 4. The error barsindicate standard deviations of three independent experiments.



DISCUSSION

S phase is a period of great vulnerability for thegenome of eukaryotic cells. Many complicatedprocesses are undertaken during this critical phaseof the cell cycle, including the unwinding togetherwith the duplication of enormously complex DNAmolecules. During this process, replication forksfrequently encounter obstacles that impede theirprogression. Arrested forks are unstable structuresthat have to be stabilized and restarted in order toprevent the formation of double-strand breaks,unscheduled homologous recombination, or possi-bly NHEJ, and consequently genomic instability. Tothis aim, cells have evolved complex surveillancemechanisms sensing DNA damage and replicationstress [38]. The past decade has seen a dramaticadvance in our understanding of how these regu-latory pathways act in response to exogenousreplication stress. However, the mechanisms bywhich genome stability is conserved at naturalreplication-impeding sequences remain obscure.Alternate DNA structures capable of formingunusual secondary structures in human cells suchas G4 structures, H-DNA or Z-DNA have beenimplicated in critical biological processes and caninterfere with normal cellular DNA transactions suchas the advancement of the replication fork during Sphase [11]. Based on the ability of TLS DNA polymer-ases to facilitate the progression of the replicationfork through external replicative barriers such bulkyadducts [17], we have examined in this study the role

of these specialized enzymes for preventing thereplicational stress response associated to thesealternate non-B DNA structures. The results of ourinvestigations suggest that Pol h and Pol k helpprevent genomic instability occurring at suchnatural DNA sequences.

To probe the functional importance of TLS DNApolymerases in G4 metabolism in vivo, we examinedthe effects of TMS, a selective quadruplex bindingagent, on cell survival in Pol h-, Pol k-, and Pol i-depleted versus control cells. Although TMS wasoriginally identified as a potent telomerase inhibitorby virtue of its ability to stabilize telomeric quad-ruplex DNA and inhibit the polymerase reaction,results from recent studies suggest that TMS exertcytotoxic effects through its action on non-telomereG4 targets [39–41]. The selectivity of TMS for theG-quadruplex structure over a single-stranded orduplex DNA structure has been demonstrated [42].This compound does not make covalent bonds withDNA and just inserts in G-quadruplex with stackingeffect on the G-quartet sequence. We hypothesizedthat cells depleted for TLS DNA polymerases wouldbe hypersensitive to the biological effects of TMS.Indeed, this turned out to be the case for Polh and Polk, and much less for Pol i. TMS was observed tosignificantly impair cell proliferation and growth inPol h- and Pol k-depleted cells, suggesting that bothTLS DNA polymerases operate in G4 metabolism.This was further supported by showing increasedDSB induction after Pol k or Pol h depletion in HeLacells transfected by G-rich MYC-DNA. Thus, ourwork provides the first description of DNA polymer-ases required specifically for the maintenance ofguanine-rich DNA in vivo. Recent evidence showed afunctional cooperation between the WRN helicase,known to unwind G-quadruplex DNA, and the Y-family TLS DNA polymerases Pols h and k for lesionbypass [43]. It would be of interest to investigate if

Table 1. Downregulation of Pol h and Pol k areSignificantly Correlated in a Cohort of Colorectal Tumors

Pol k Pol e Pol d

Pol h 0.7145 0.6532 0.4610

Figure 6. mRNA expression of Pol h in the 74 colorectal-adenocarcinomas. Expressions of Pol h as well as the replicativeDNA polymerase Pol e have been measured in the matched humantumoral and normal samples. T (tumoral)/N (normal) mRNAexpression ratios between normalized values were calculated. T/Nvalues lower than 1 were transformed to the inverse value N/T. þ and

� indicate a higher or lower expression respectively in the tumorversus adjacent control tissue. Black boxes above the x-axis point outthe sample numbers. P-values from bilateral exact binomial test aregiven uncorrected, the significance level is evaluated using theBenjamini Krieger Yekutieli 2001 procedure for and overall FDR of0.05. All computations were performed using Stata 9.0 SE (Tiermips).

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such interaction could facilitate the replication oftetraplex DNA structures.

Interestingly, elevated DNA breakage associatedwith other alternative DNA structures than G4,such Mbr-DNA or repetitive GA-DNA, was observedonly after Pol k downregulation, and not Pol h,supporting the idea that Pol k may have a moregeneral role for genomic maintenance during unper-turbed S-phase.

How could depletion of a TLS DNA polymeraseenhance genomic instability at naturally occurringstructured DNA? One possibility would be thatdownregulation of Pol h or Pol k may affect normalDNA replication per se through alternate structuredDNA domains. Non-B DNA structures such as G4 andH-DNA have been shown to affect the progress ofsome DNA polymerases [44,45] and RNA polymer-ases [46–48]. So it is possible that TLS pol h or pol k isrequired for overcoming the structural barrier at astalled replication fork. Knocking down the expres-sion of these polymerases might result in a failure torescue the stalled replication fork and thus result inDNA breakage. Alternatively, their depletion maycompromise the repair processes of replication-induced DSB at these non-B DNA sites. Recentevidence has suggested that, outside its role in TLS,Pol h may be required in the homologous recombi-nation repair pathway (HRR) in chicken DT40cells during the generation of antibody diversity ofIg genes [49] and in vitro for the extension of theinvading strand in a D-loop structure [50], facilitat-ing the RAD52-mediated second-end captureduring the repair process [51]. Therefore, we cannotrule out the possible involvement of Pol h inrecombinational events associated with G4-inducedDSB repair. Further investigations will be requiredto understand by which mechanisms Pol h and Pol kcould act and eventually cooperate to preventgenomic instability at structured DNA in absenceof external stress. Notably, it would be of interestto look at the posttranslational processing of thepolymerases as well as PCNA in relation to theiraction at non-canonical DNA structure encumbran-ces compared to DNA lesions that interfere withDNA replication. Whether these TLS polymerasescontribute to the normal genome replication isan attractive possibility that deserves furtherexploration.

Interestingly, we have uncovered unexpectedalterations in the expression pattern of these twoTLS DNA polymerases in a human colorectal cancercollection. Indeed, we have found that they aredownregulated as compared to the normal adjacenttissues while the expression of the replicative DNApolymerases d and ewas not affected. These data mayhelp to understand how cancer cells use this alteredexpression pattern of TLS DNA polymerases topromote genomic instability in absence of externalstress.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank T Nohmi, Naoko Niimi, and Petr Gruz(Tokyo) for the Pol k antibodies and R Woodgate(NIH) for the Pol i antibodies. We thank R Guimbaudand K Gordien (Inserm/CHU Purpan, Toulouse)for collection and annotation of the tumors, PAGourraud for statistical analysis, F Viala (IPBSToulouse) for iconography assistance, D Gomez(IPBS Toulouse) for helpful comments, as well as JJMaoret (IFR31 Toulouse) from the plateforme de‘‘Genomique et Biologie Moleculaire’’ for his tech-nical help on the 7900HT fast real-time PCR systems.This work was supported by INCa (‘‘Checkpol’’projet libre 2007 to JSH), the Association pour laRecherche sur le Cancer (No 4887 to JSH), theCanceropole Grand Sud Ouest grant 2004–009 (toCC), Electricite de France (EDF) (to DB), and by NIH,NCI grant (CA093729) TO KMV.

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378 BETOUS ET AL.



138

3. Perspectives et résultats préliminaires concernant le rôle de Pol η sur l’ADN non-B

a- Analyse du recrutement spécifique de Pol η sur les G4 par ChIP on chip

Afin d’analyser plus précisément le rôle de Pol η au niveau des séquences particulières

de l’ADN, nous avons entrepris des expériences d’immuno-précipitation de chromatine

(ChIP) couplées à des analyses en PCR-quantitative. Ces expériences sont réalisées sur des

cellules HeLa, contenant des séquences issues du promoteur de c-MYC susceptibles

d’adopter des structures en G-quadruplex. Ces cellules sont transfectées de manière

transitoire avec un plasmide codant soit pour l’ADN polymérase eta sauvage (Pol η WT), soit

pour l’ADN polymérase eta mutée dans le domaine catalytique (Pol η Dead), toutes deux

ayant une double étiquette FLAG en N-terminal. Les cellules sont traitées 24h après

transfection avec 10µM de télomestatine et récupérées 24h après traitement. Connaissant la

séquence riche en G introduite dans les cellules HeLa, nous avons dessiné des amorces

permettant d’amplifier une séquence située à 124 pb de la séquence riche en G. Pour

valider ces amorces, nous avons analysé les courbes de dissociation réalisées en PCR

quantitative (augmentation de température de 60°C à 90°C pendant 20 minutes) avec des

quantités croissantes d’ADN complémentaire et elles ne montrent pas de formation de

dimères d’amorces (Fig 38).

0,20

0,16

0,12

0,08

0,04

0,00

- 0,04 60 65 70 75 80 85 90

Température (°C)

Dérivé (courbe de dissociation)

Figure 38. Analyse de la formation de dimères d’amorce en PCR quantitative. Les ARN ont été extraits des cellules HeLa contenant de multiples séquences riches en G, puis rétrotranscrits. Les analyses en PCR quantitative en temps réel ont été réalisées avec l’amorce spécifique des séquences riches en G contenues dans cette lignée cellulaire, à partir de quantités croissantes d’ADN complémentaire allant de 0,5 à 50ng. Sur ce graphe est représentée la dérivée de la courbe de dissociation correspondant à la perte de fluorescence observée lorsque le Sybrgreen est libéré du double-brin d’ADN, en fonction de la température. Un seul pic de dissociation est obtenu, démontrant la spécificité des amorces et leur incapacité à former des dimères.


139

Des mises au point en termes de sonication pour fragmenter l’ADN et

d’immuno-précipitation de chromatine par l’anticorps anti-FLAG ont permis d’obtenir des

conditions optimales (voir le protocole en annexe 2) (Fig 39). Toutefois, malgré ces mises au

point, les premiers résultats ne sont pas concluants puisque les quantités d’ADN récupérées

sont trop importantes (plus de 10µg d’ADN à partir de 2 millions de cellules) et que l’ARNm

du gène contôle ACTINE est amplifié lors des cycles de PCR quantitative de la même manière

dans les « inputs » (chromatine avant immuno-précipitation) et dans les produits

d’immuno-précipitation. Il semble donc que les immuno-précipitations anti-FLAG ne soient

pas spécifiques ; d’autres mises au point sont en cours afin de les améliorer.

Figure 39. Mises au point des conditions d’immuno-précipitation de chromatine. Les

cellules HeLa contenant de multiples séquences riches en G sont transfectées soit par un plasmide codant pour FLAG-Pol η, soit pour FLAG-Pol η Dead, traitées avec 10µM de télomestatine et récupérées 24h après (A). Deux cycles de 15 minutes de sonication (30 secondes ON, 30 secondes OFF ; position High du Bioruptor de Diagenode) permettent d’obtenir des fragments d’ADN d’environ 300pb. (B) Un mélange de 100µL de lysat, de 20µL de billes magnétiques (Dynal) et de 2,5µg d’anticorps monoclonal anti-FLAG (Sigma M2) permettent d’obtenir une immuno-précipitation correcte. Aucun signal pour Pol η n’est observé par western-blot après immuno-précipitation avec des anticorps anti-IgG par rapport à l’immuno-précipitation avec des anticorps anti-Pol η. 1% du volume servant pour l’immuno-précipitation a été déposé pour l’input.

Une autre solution serait de réaliser une immuno-précipitation anti-γH2AX, déjà

mise au point dans le laboratoire du Dr. Philippe Pasero (IGH, Montpellier). En effet, nous

verrons par la suite que la sur-expression d’un mutant catalytiquement inactif (Pol η Dead)

induit des cassures de l’ADN contrairement à celle de Pol η sauvage. Ainsi, il est possible que

1000pb

500pb 400pb 300pb 200pb 100pb

ηWT

Input

ηD ηWT

IP IgG

ηD ηWT

IP FLAG

ηD

Pol η

ηWT ηD ηWT ηD

- Sonication + Sonication

A) Migration de la chromatine sur gel d’agarose

B) Analyse des protéines Pol η immuno-précipitées par WB


140

Pol η Dead puisse agir comme un dominant-négatif sur Pol η endogène, et que les cassures

observées après transfection de Pol η Dead soient majoritairement localisées au niveau des

séquences particulières de l’ADN telles que les G-quadruplex. Une immuno-précipitation

anti-γH2AX permettrait donc de voir, si notre hypothèse est juste, une amplification

spécifique des régions riches en G après transfection de Pol η Dead mais pas de Pol η

sauvage. Une hybridation sur puces affymetrix couvrant le chromosome 8 sur lequel est

situé c-MYC) de ces mêmes produits d’immuno-précipitation permettrait en outre de

déterminer l’ensemble des séquences particulières de l’ADN où Pol η Dead est recrutée et

bloquée (figeant de ce fait le système).

b- Recherche des partenaires de Pol η au niveau de l’ADN non-B par

fractionnement cellulaire

Afin de confirmer le recrutement spécifique de Pol η au niveau des G-quadruplex,

nous avons réalisé des expériences de fractionnement cellulaire. Pour cela, des cellules U2OS

ont été traitées ou non avec 10µM de télomestatine pendant 1h avant d’être récupérées. Des

extractions successives au triton et à la RNAse permettent de récupérer uniquement les

protéines fortement associées à la chromatine (voir protocole en annexe 3). Par cette

technique, nous avons pu observer une légère augmentation du niveau d’expression global de

Pol η après traitement à la télomestatine et un recrutement de Pol η et BACH1 à la

chromatine qui semble plus important après traitement à la télomestatine (Fig 40). Ces

résultats préliminaires restent encore à être reproduits pour être confirmés. D’autre part,

il serait important d’analyser le recrutement de Pol κ après ce même traitement. Cette

approche étant mise au point, il serait également intéressant de déterminer quelles autres

protéines sont recrutées au niveau de la chromatine dans les mêmes conditions que Pol η et

de confirmer d’éventuelles interactions par immuno-précipitation. La détermination de

nouveaux partenaires fonctionnels de Pol η permettra de mieux appréhender son rôle au

niveau des séquences particulières de l’ADN.


141

Figure 40. Fractionnement cellulaire après traitement à la télomestatine. Les cellules

U2OS sont traitées avec 10µM de télomestatine ou non traitées (NT) et récupérées 1h après traitement. Des extractions successives avec du Triton et de la RNAse permettent d’isoler les protéines fortement liées à la chromatine. Des analyses western-blot avec des anticorps dirigés contre BACH1 (Abcam 16608, 1/1000) ou Pol η (Abcam 17725, 1/1000) ou l’Actine (Chemicon C4, 1/10000) sur les extraits totaux et sur les fractions chromatiniennes indiquent que Pol η et BACH1 sont plus fortement recrutées à la chromatine après traitement à la télomestatine, un agent stabilisant les G-quadruplex. Ces résultats préliminaires restent à être confirmés.

4. Discussion et perspectives des résultats publiés dans l’article I

L’ensemble des résultats présentés ici suggère un rôle de deux ADN polymérases de la

famille Y, Pol η et Pol κ, au niveau des séquences particulières de l’ADN. Le rôle de Pol κ

serait plus général alors que le rôle de Pol η serait plus spécifique des séquences riches

en G susceptibles d’adopter des structures en G-quadruplex.

Comme nous l’avons vu lors de l’introduction bibliographique (p.113), un lien entre

stress réplicatif et progression tumorale a été proposé (Bartkova et al, 2005; Gorgoulis et al,

2005). Nous avons montré dans cette étude que les transcrits de Pol η, étaient sous-exprimés

de manière significative dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus adjacents sains d’une

cohorte de cancers colorectaux humains comportant 74 biopsies de carcinomes colorectaux

à différents stades de développement (article I, figure 6 et figure 41A). De plus, cette

sous-expression semble retrouvée au niveau protéique sur les coupes de tissus (Fig 41B).

Cependant, ce dernier résultat reste à valider puisque très peu de cellules marquées ont pu être

analysées. Dans la même étude, les transcrits de Pol κ, sont aussi sous-exprimés de manière

significative (Lemee et al, 2007). De manière intéressante, les défauts d’expression des

transcrits de Pol η et de Pol κ sont fortement corrélés dans les mêmes échantillons

tumoraux (article I, table 1).

Extrait total Chromatine

NT Télomestatine NT Télomestatine

BACH1

Pol η

Actine


142

Figure 41. Sous-expression de Pol η dans les cancers colorectaux. (A) Le niveau des

transcrits a été mesuré en triplicats via la technologie LDA. Afin de normaliser les résultats, quatre gènes contrôles (18S, GADPH, HPRT, YWHAZ) ont été amplifiés à partir de chaque ADN complémentaire. Les rapports des transcrits T (Tumoral) / N (Normal) à partir des valeurs normalisées ont été calculés. Les valeurs T/N inférieures à 1 ont été transformées en valeurs négatives. Les signes + et – indiquent respectivement des expressions supérieures ou inférieures dans le tissu tumoral comparé au tissu normal adjacent. (B) L’expression de la protéine Pol η a été analysée via la technologie du TMA (tissue micro-array, annexe 5) sur les 74 couples d’échantillons colorectaux. Deux échantillons de 1mm de diamètre ont été prélevés dans les blocs de tissus en paraffine pour le tissu normal et pour le tissu tumoral. Ils ont ensuite été marqués par l’anticorps anti-Pol η (Santa Cruz).

Une autre étude menée par un groupe indépendant a permis de mettre en évidence la

sous-expression des transcrits de Pol η et Pol κ dans les cancers du poumon et de l’estomac

(Pan et al, 2005). Dans cette même étude, Pol η n’est pas retrouvée sous-exprimée de manière

significative dans les cancers du colon (Pan et al, 2005). Cependant, cette étude a été menée

sur 59 couples de tissus normaux-tissus tumoraux et n’a pas été réalisée de la même manière

en termes techniques (pas d’utilisation de plaques TLDA) mais également en termes

d’analyses statistiques puisque le seuil n’a pas été choisi de la même manière. D’autre part,

les facteurs de sous-expression sont très importants, allant jusqu’à 100 et les transcrits du seul

gène de ménage utilisé pour la normalisation par cette équipe, GADPH, variaient fortement

lors de l’étude menée par notre équipe sur les échantillons de cancers colorectaux. Toutefois,

quelques patients présentant des adénocarcinomes du colon ont un taux très faible de Pol η

comparé au tissu sain (Pan et al, 2005). Par conséquent, Pol η semble tout de même dérégulée

généralement dans les cancers du colon, du poumon et de l’estomac. De plus, l’absence de Pol

η ou de Pol κ induit une augmentation du nombre de cassures de l’ADN au niveau de

A

B


143

certaines séquences particulières de l’ADN en absence de stress exogène. Ces résultats

suggèrent donc que l’absence ou la dérégulation de ces deux ADN polymérases de la famille

Y puisse participer au stress réplicatif observé au cours des phases précoces de la progression

tumorale et à l’instabilité génomique qui en résulte.

Les résultats présentés ci-dessus suscitent de nombreuses interrogations :

- quels éléments permettent d’expliquer la différence de spécificité des ADN

polymérases de la famille Y au niveau des séquences particulières de l’ADN ?

- quels sont les partenaires fonctionnels des ADN polymérases au niveau des séquences

particulières de l’ADN ?

- est-il possible d’extrapoler le rôle de Pol η au niveau des séquences riches en G mis

ici en évidence à un rôle de Pol η au niveau de l’élongation des télomères ?

a- Pourquoi Pol κ est-elle impliquée indépendamment de la séquence

particulière d’ADN étudiée ?

Nous avons pu démontrer que contrairement à Pol η, l’absence de Pol κ induit des

cassures de l’ADN quelle que soit la lignée cellulaire contenant de multiples copies des

différentes séquences particulières d’ADN. Ces résultats suggèrent donc un rôle de Pol κ plus

global ou plus en amont de Pol η. Nous avons vu lors de l’introduction bibliographique (p.99)

que Pol κ pourrait jouer un rôle au niveau du point de contrôle de phase S (données non

publiés de l’équipe). En effet, l’absence de Pol κ induirait un défaut de phosphorylation de la

kinase majeure du point de contrôle de phase S, Chk1, suite à des traitements normalement

inducteurs de ce point de contrôle (HU, UV). Il est donc possible que suite à un blocage des

fourches de réplication au niveau des séquences particulières de l’ADN, quelle que soit leur

nature, la signalisation via Chk1 ne puisse s’opérer en absence de Pol κ. Par conséquent, le

cycle cellulaire ne serait pas arrêté conduisant à des effondrements de fourches de réplication

et donc à des cassures de l’ADN. Il est important de souligner que l’activation de Chk1 est

importante pour le maintien de la stabillité des sites fragiles communs. Ainsi, en absence de

Pol κ, il est possible que les cassures de l’ADN aient lieu principalement au niveau de ces

séquences, mais cela n’a pas encore été analysé par hybridation in situ d’une sonde spécifique

de ces séquences couplée à une immunodétection du marqueur des cassures de l’ADN,

γ-H2AX. D’autre part, les gènes localisés au niveau des sites fragiles communs sont parfois

des gènes suppresseurs de tumeurs. Par conséquent, l’absence de Pol κ pourrait avoir des

conséquences importantes sur la progression tumorale.


144

En conclusion, le rôle de Pol κ au niveau du point de contrôle de phase S pourrait

expliquer les effets de son absence sur l’ensemble des structures analysées.

b- Existe-t-il une coopération fonctionnelle entre ADN polymérases et ADN

hélicases spécialisées ?

Le rôle de Pol η au niveau des séquences particulières de l’ADN semble spécifique

des séquences riches en G susceptibles d’adopter des structures en G-quadruplex. Afin

de déterminer les différents partenaires fonctionnels de Pol η spécifiquement au niveau des

séquences riches en G, des expériences d’immuno-précipitation de Pol η après traitement ou

non à la télomestatine pourraient être couplées à une analyse par spectrométrie de masse.

Deux rôles distincts d’intervention de Pol η au niveau de ces séquences peuvent être

proposés : un rôle directement dans la réplication de ces séquences car elles bloqueraient ou

ralentiraient les ADN polymérases réplicatives, ou un rôle dans la réparation des cassures de

l’ADN générées au niveau de ces séquences particulières du génome (voir introduction

bibliographique p.81), même si ce rôle est encore discutable et mérite de plus amples

investigations (expériences réalisées au cours de ma thèse et que nous détaillerons

ultérieurement). Les expériences d’immuno-précipitation, citées ci-dessus, permettraient

notamment de déterminer si les partenaires fonctionnels de Pol η font majoritairement partie

du réplisome ou de la machinerie de recombinaison homologue après un traitement à la

télomestatine.

Il est donc envisageable que Pol η puisse intervenir dans la réplication de ces

séquences particulières. Parmi les partenaires putatifs de Pol η au niveau de ces séquences,

deux candidats majeurs se dégagent des données de la littérature : les ADN hélicases

spécialisées, WRN et BACH1, qui ont été impliquées au niveau du déroulement des

séquences riches en G. En effet, Pol η est retrouvée dans un même complexe avec WRN

(Yuasa et al, 2006) et WRN est capable d’augmenter l’activité de polymérisation de Pol η

(Kamath-Loeb et al, 2007). En outre, une coopération fonctionnelle entre Pol η et Dog-1

(l’homologue de BACH1 chez C. elegans) a été montrée. En effet, la double délétion

Pol η-Dog-1 induit une augmentation des délétions des séquences riches en G par rapport à la

simple délétion de Dog-1 (Youds et al, 2006). L’ensemble de ces données suggère donc que

Pol η puisse agir au niveau de ces séquences en coopération avec des ADN hélicases

spécialisées. Afin de déterminer si cette coopération est réelle, des expériences de

réplication in vitro à partir d’oligonucléotides riches en G susceptibles de former des


145

G-quadruplex pourraient être réalisées. En effet, en présence de télomestatine, les

oligonucléotides riches en G devraient être répliqués en présence de Pol η et de BACH1 ou

WRN si notre hypothèse est juste.

Cependant, ces ADN hélicases spécialisées interviennent aussi au cours de la

recombinaison homologue. Ainsi, la coopération fonctionnelle avec Pol η proposée au

niveau de la réplication pourrait aussi avoir lieu au niveau de la réparation par

recombinaison homologue des cassures générées au niveau des séquences riches en G.

Par conséquent, des études de recombinaison homologue via un substrat de RH intégré en

copie unique dans des cellules humaines permettraient de déterminer l’implication et la

coopération de ces différentes protéines au niveau de ce mécanisme. L’analyse des échanges

entre chromatides sœurs dans les cellules déplétées en Pol η et/ou en WRN ou BACH1

confirmeraient ou infirmeraient la coopération fonctionnelle de ces protéines au cours de la

recombinaison homologue.

c- Peut-on envisager un rôle de Pol η au niveau des télomères ?

Nous avons vu que la séquence télomérique (TTAGGG)n est capable de former des

structures en G-quadruplex. Nos résultats démontrant l’implication de Pol η au niveau des

séquences riches en G susceptibles d’adopter des structures en G-quadruplex, il est possible

que Pol η puisse être requise pour l’élongation des télomères. En accord avec cette

hypothèse, WRN, interagissant avec Pol η, est impliquée au cours de l’élongation du brin

discontinu au niveau des télomères (Crabbe et al, 2004). Il est important de noter que WRN

est localisée au niveau de certains télomères au cours de la réplication normale de l’ADN,

c’est-à-dire en absence de traitement exogène, suggérant que WRN joue un rôle au niveau de

lésions endogènes ou de blocages induits notamment par la présence de structures secondaires

de l’ADN au niveau des télomères (Crabbe et al, 2004; Johnson et al, 2001; Opresko et al,

2004). D’autre part, bien qu’aucune évidence n’existe quant au rôle de BACH1 au niveau des

G4 situés aux télomères, il est important de noter que l’orthologue de BACH1 chez la souris,

Rtel, est important pour le maintien des télomères (Ding et al, 2004). Ainsi, il n’est pas exclu

que Pol η puisse coopérer avec WRN et BACH1 au niveau des séquences télomériques.

Afin de savoir si Pol η est impliquée au niveau des télomères, des expériences

d’immuno-FISH en utilisant un anticorps anti-Pol η et une sonde d’ADN spécifique des

télomères pourraient être envisagées. Pour aller plus loin en termes mécanistiques, ces

expériences de FISH avec une sonde d’ADN spécifique des télomères pourraient être


146

couplées au peignage moléculaire de l’ADN afin de déterminer si Pol η intervient au niveau

de l’élongation des télomères. Enfin, il serait important de déterminer si Pol η intervient sur le

brin continu ou sur le brin discontinu en réalisant des expériences de « chromosome

orientation FISH » qui consistent à marquer les télomères avec deux sondes simple-brin,

l’une spécifique du brin riche en G et l’autre spécifique du brin riche en C (Crabbe et al,

2004). Brièvement, les cellules sont incubées en présence de bromodéoxyuridine et de

bromodéoxycytosine. Les brins nouvellement synthétisés, bromo-substitués, sont dégradés par

traitement UV et par l’action d’exonucléases, avant l’hybridation des sondes simple-brin. En

analysant l’hybridation de ces deux sondes en absence de Pol η, nous pourrons déterminer sur

quel brin d’ADN Pol η intervient.

D’autre part, il a été montré que les cellules déficientes en WRN présentaient une

fréquence élevée d’échanges entre chromatides sœurs au niveau des télomères (Laud et al,

2005). Afin de voir si un effet similaire pourrait exister en absence de Pol η, la même

approche pourra être utilisée. Cette technique est similaire à celle utilisée lors du

« chromosome orientation FISH ». Cependant, un évènement d’échange de chromatides sœurs

au niveau de la séquence télomérique va diviser le signal d’hybridation de la sonde en deux

spots au niveau des deux chromatides sœurs. De ce fait, au lieu d’observer deux spots

spécifiques de la sonde, trois ou quatre spots vont être présents. Avec cette technique, il est

donc facile de repérer les évènements d’échanges entre chromatides sœurs au niveau des

télomères et de déterminer au niveau de quel brin ils ont lieu.

Par conséquent, les résultats que j’ai obtenus au cours de ma thèse ouvrent de

nombreuses perspectives pouvant conduire à la découverte de nouvelles implications de Pol η

dans le maintien de la stabilité du génome en absence de stress exogène mais aussi au cours

du vieillissement, via son potentiel rôle au niveau des télomères.

Résultats B. Nouveau rôle pour Pol η dans le maintien de la stabilité du génome

147

B. Identification d’un nouveau rôle pour Pol η dans le maintien

de la stabilité du génome

Au vu des résultats présentés auparavant, l’ADN polymérase spécialisée Pol η semble

importante pour le maintien de la stabilité du génome en absence de dommage externe à

l’ADN. Nous nous sommes donc intéressés aux rôles physiologiques de Pol η notamment en

étudiant les conséquences de sa sous-expression sur la prolifération cellulaire, et plus

particulièrement au niveau de la phase S et de l’instabilité génomique. Pour cela, nous avons

utilisé dans des modèles cellulaires humains, soit les clones shRNA déficients en Pol η et déjà

décrits ci-dessus, soit des transfections transitoires de siRNA ciblant l’ARNm de Pol η

(article II, tableau 1).

1. Mise en évidence d’un défaut de prolifération dans les cellules déficientes en Pol η

Dans les deux clones cellulaires stables exprimant, à partir de vecteurs épisomaux, des

séquences indépendantes de shRNA ciblant l’ARNm de Pol η, nous avons pu mettre en

évidence une faible mais significative accumulation des cellules en phase G2/M du cycle

cellulaire (article II, figure 2A). Cette transition vers la mitose qui est retardée corrèle avec

l’observation d’un défaut de prolifération en absence de tout stress génotoxique (article II,

figure 2B). Il est important de noter que ces deux phénotypes ne sont pas observés dans les

clones shRNA ciblant l’ARNm de l’ADN polymérase translésionnelle Pol ι, le plus proche

homologue de Pol η (article II, figure 2C-D), suggérant qu’ils sont spécifiques de Pol η. En

outre, nous avons aussi observé une baisse de l’efficacité de clonage des cellules déficientes

en Pol η comparées aux cellules contrôles (Fig 42). De plus, après un temps donné en culture,

les clones observés en absence de Pol η (environ 30 à 50 cellules par clone) sont plus petits

que les clones observés dans les cellules contrôles (environ 80 à 100 cellules par clone),

confirmant le défaut de prolifération des cellules déficientes en Pol η.


148

2. Observation d’une augmentation d’instabilité génomique en absence de Pol η

Nous nous sommes ensuite intéressés aux cassures de l’ADN. Pour cela, nous avons

utilisé deux techniques différentes : le marquage en immunofluorescence de γH2AX, un

variant d’histone phosphorylé spécifiquement aux sites de cassures de l’ADN, et l’analyse des

anormalités chromosomiques sur plaques métaphasiques. Nous avons observé une

augmentation d’un facteur 2 du pourcentage de cellules positives pour γH2AX dans les

clones shη1 et shη2 par rapport aux clones contrôles (article II, figure 4A-B). Cette

augmentation n’est pas significative dans les clones déficients en Pol ι. Cependant, le clone

shι2 présente une légère augmentation de γH2AX pouvant être expliquée par le rôle de Pol ι

au niveau des dommages oxydatifs endogènes (Petta et al, 2008). D’autre part, le nombre de

métaphases présentant une ou plusieurs cassures de chromatides est aussi augmenté d’un

facteur 2 en absence de Pol η dans les cellules tumorales U2OS (shRNA) et dans les

fibroblastes primaires MRC5-N (siRNA) et d’un facteur 3 dans les lignées immortalisées

provenant d’un patient XP-V (POLH mutée) (article II, Figure 3). Il est important de noter que

cet effet est augmenté par addition d’aphidicoline, un inhibiteur de la réplication, suggérant

que Pol η pourrait intervenir au cours de la phase S.

Cette augmentation d’instabilité génomique conduirait à l’activation du point de

contrôle de phase G2/M, Chk2 phosphorylé, comme observé lors des expériences

d’immuno-fluorescence (article II, figure 4C). Toutefois, lors des analyses par western-blot de

l’activation de la kinase majeure du point de contrôle des dommages de l’ADN, Chk2, aucune

0

5

10

15

20

25

30

CTR1 CTR2 hETA1 hETA2

Efficacité de clonage (%) Figure 42. Efficacité de clonage des cellules contrôles (CTR1, CTR2) et des cellules déficientes en Pol η (shη1, shη2). Les différentes cellules ont été ensemencées en triplicats dans des boîtes 6 puits à 500 ou 1000 cellules par puits. Les clones ont été colorés au cristal violet 8 jours après ensemencement. La moyenne de trois expériences en triplicats est représentée sur ce graphe et les barres d’erreur correspondent aux écart-types.

CTR1 CTR2 shη1 shη2


149

activation de cette protéine par phosphorylation sur la théronine 68 n’a pu être mise en

évidence en absence de Pol η (Fig 43). Il est possible que le nombre de cellules présentant

une activation de Chk2 ne soit pas suffisant pour que le signal puisse être détecté en

western-blot. Pour augmenter ce signal, il aurait fallu synchroniser les cellules et analyser le

signal P-Chk2 en phase G2/M du cycle cellulaire. Cependant, toutes les méthodes de

synchronisation actuelles induisent des stress génotoxiques aux cellules, il est donc difficile

d’analyser l’activation du point de contrôle des dommages de l’ADN dans ces conditions.

D’autre part, la protéine majeure du point de contrôle de phase S, Chk1, ne semble pas activée

par phosphorylation sur la sérine 345 en absence de Pol η, ni de Pol ι (Fig 43). De manière

similaire à Chk2, il est possible que le western blot ne soit pas suffisamment sensible pour

détecter une faible activation de Chk1.

Figure 43. Analyse par western blot de l’activation des points de contrôle médiés par

Chk1 et Chk2. Les cellules des clones shRNA sont lysées en présence d’anti-phosphatases. 100µg de protéines totales sont déposées sur un gel SDS/PAGE 10%. La migration est réalisée à 120V pendant 1h30 et le transfert à 100V pendant 2h. Le blocage des membranes PVDF est réalisé dans une solution de TBST 0,1% triton contenant 3% de lait, 3% de BSA et des inhibiteurs de phosphatases. Les membranes sont incubées pendant au moins 2h avec l’anticorps primaire anti-Chk1 (Cell Signalling, 1/1000) ou anti-P-Chk1 (Cell Signalling 1/1000) ou anti-Actine (Chemicon International C4, 1/10000) puis avec l’anticorps secondaire couplé à HRP pendant 1h à température ambiante. La révélation avec de l’ECL (Pierce) permet d’obtenir les résultats présentés qui ne montrent pas d’activation de Chk2 (A) et Chk1 (B) par phosphorylation en absence de Pol η et de Pol ι. Les pistes +UV et –UV représentent respectivement des contrôles positifs et négatifs d’activation des points de contrôle. Le niveau d’expression de Chk2 ou Chk1 phosphorylé est comparé au niveau d’expression de Chk2 ou Chk1, l’actine étant un contrôle de dépôt supplémentaire.

Suite à l’observation d’une augmentation des cassures de chromatides en absence de

Pol η nous nous sommes intéressés aux sites fragiles communs. En effet, ces séquences

particulières de l’ADN sont très fragiles, et fréquemment cassées suite à un stress réplicatif

comme semble produire la perte de Pol η. Les sites fragiles communs sont souvent impliqués

dans des réarrangements comme ceux observés dans les cellules tumorales : en cas

d’apparition de délétions, amplifications ou translocations, on parle de l’expression des sites

fragiles communs. Les sites fragiles communs les plus étudiés sont FRA3B et FRA16D.

A B

+ UV - UV CTR1 CTR2 shη1 shη2 shι1 shι2

U2OS

P-Chk2

Chk2


U2OS

P-Chk1

Chk1

Actine


U2OS

P-Chk2

Chk2


U2OS

P-Chk1

Chk1

Actine


150

Cependant, ces deux sites ne sont pas exprimés dans les cellules U2OS, probablement dû au

fait qu’ils soient déjà réarrangés dans cette lignée cellulaire tumorale (Casper et al, 2002).

Nous avons donc étudié un autre site fragile commun, FRA7H, couramment utilisé par FISH

et qui n’est pas réarrangé dans les cellules humaines U2OS. Après avoir validé la spécificité

de la sonde par un double marquage sonde FRA7H/sonde centromérique, nous avons mis en

évidence une augmentation d’un facteur 2 des réarrangements (amplifications, délétions,

translocations) de ce site fragile commun en absence de Pol η par rapport aux clones contrôles

(article II, figure 5 A-D). Cet effet est à nouveau amplifié par de très faibles doses

d’aphidicoline (100nM), inhibiteur de la réplication de l’ADN qui est connu pour activer

l’expression des sites fragiles communs (Fig 44). Il est important de noter que cette

augmentation d’expression de FRA7H n’est pas observée en absence de Pol ι (Fig 44). Par

ailleurs, le nombre de métaphases présentant des cassures de chromatides est diminué après

réintroduction de la protéine humaine Pol η dans les cellules XP-V (article II, figure 3). Ces

deux derniers résultats suggèrent que le rôle dans la stabilité des sites fragiles communs mis

en évidence ici est bien spécifique de Pol η.

Figure 44. Analyse de l’expression du site fragile commun FRA7H par hybridation in

situ (FISH) dans les clones shRNA. Les cellules sont ensemencées dans des boîtes de 10cm de diamètre avec 500 000 cellules, traitées avec 100nM d’aphidicoline 24h après ensemencement. Les métaphases sont réalisées 24h après traitement. L’hybridation de la sonde FRA7H est effectuée comme présenté dans la section matériel et méthodes de l’article II. Les réarrangements tels que les amplifications, les délétions et les translocations ont été quantifiés sur plus de 50 métaphases et sur trois expériences indépendantes (sauf pour les clones shRNA iota pour lesquels une seule expérience à été réalisée). Les barres d’erreur représentent les écart-types.

Pour confirmer ces résultats, il aurait été intéressant d’analyser l’expression d’autres

sites fragiles communs tels que FRA3B ou FRA16D dans une lignée diploïde comme les

0

5

10

15

20

25

30

35

40

CTR1 CTR2 shη1 shη2 shι1 shι2

Expression de FRA7H induite par l’aphidicoline(%)


151

MRC5-N (en utilisant dans ce cas des siRNA). A plus grande échelle, il serait intéressant de

réaliser une expérience d’hybridation génomique comparative sur puce (CGH array) afin

d’identifier les régions de remaniements en absence de Pol η. Pour cela, il faudrait construire

de nouveaux clones cellulaires stables exprimant les deux séquences indépendantes de shRNA

dirigées contre les transcrit de Pol η et la séquence contrôle dans une lignée cellulaire diploïde

(les cellules mammaires immortalisées mais non transformées MCF10, par exemple). Ensuite,

les ADN génomiques extraits de ces différents clones, après traitement à l’aphidicoline,

seraient hyrbidés sur une puce CGH contenant de nombreux sites fragiles communs (FRA3B,

FRA16D, FRA7G, FRA1F, FRA1G, FRA1K, FRA1H, FRA1I, FRA8B, FRA8C, FRA8D,

FRA17B, FRAXB, FRAXC, FRAXD) et quelques sites fragiles rares (FRA8F, FRA8A,

FRA8E, FRA17A, FRAXE), et disponible sur la plateforme CGH de Montpellier (C. Theillet,

IRCM, Montpellier). La comparaison des profils obtenus en absence et en présence de Pol η

permettrait ainsi de déterminer si le rôle de Pol η observé au niveau de FRA7H dans les

cellules U2OS, est vérifié au niveau d’autres sites fragiles communs dans une autre lignée

cellulaire.

En accord avec l’implication de Pol η au niveau de la stabilité des sites fragiles

communs, les cellules déficientes en Pol η sont sensibles à la caféine (article II, figure 5E),

même à des doses faibles qui avaient été décrites comme n’engendrant pas de stress réplicatif

dans des cellules contrôles (Stary et al, 2003). Or la caféine est un inhibiteur d’ATR, et cette

kinase a été impliquée dans le maintien de la stabilité des sites fragiles communs. En effet, en

absence d’ATR dans des conditions normales de croissance ou après un stress réplicatif,

l’expression des sites fragiles communs est fortement augmentée (Casper et al, 2002). Notre

hypothèse est donc que les fourches de réplication bloquées sur les sites fragiles communs en

absence de Pol η ne soient pas stabilisées lorsqu’ATR est inhibée par la caféine, conduisant

de ce fait à de l’instabilité génomique et dans certains cas à la mort cellulaire, d’où la

sensibilité accrue des clones déficients en Pol η à ce traitement. La caféine permettant aussi

d’inhiber ATM, il serait important de valider la sensibilité des cellules déficientes en Pol η

après traitement avec un inhibiteur plus spécifique d’ATR.

3. Démonstration d’une perturbation de la phase S en absence de Pol η

L’augmentation d’instabilité génomique et le défaut de phase G2/M observés en

absence de Pol η pourraient être expliqués par un défaut en fin de phase S du cycle cellulaire,


152

moment où sont répliqués les sites fragiles communs. Par conséquent, nous avons analysé

précisément la phase S du cycle cellulaire.

Dans un premier temps, lors de l’analyse de la durée de la phase S, nous avons pu

mettre en évidence que l’absence de Pol η perturbait légèrement la progression en fin de

phase S (article II, figure 6A). Nous avons ensuite analysé l’impact de l’extinction de Pol η

sur la progression des fourches de réplication par peignage moléculaire de l’ADN en

collaboration avec Julia Sidorova et Raymond Monnat (Université de Washington, Seattle).

L’absence de Pol η n’induit pas de modification de la vitesse des fourches de réplication

au niveau du génome global (article II, figure 6B-D). Cependant, ces résultats n’excluent par

un rôle de Pol η lors de la réplication en fin de phase S et plus précisément au niveau des

séquences particulières de l’ADN difficiles à répliquer. Finalement, nous avons montré que la

dynamique des foyers de réplication au cours de la phase S était affectée en absence de

Pol η (article II, figure 7 et figure supplémentaire 2). En effet, dans les cellules humaines, la

réplication a lieu au niveau de foyers discrets visibles en microscopie qui contiennent de

l’ADN associé à la machinerie de réplication incluant notamment l’anneau de processsivité

PCNA. Les foyers de réplication subissent des changements reproductibles au cours de

chaque phase S (article II, figure 7A). Ainsi, en suivant le marquage PCNA par

immuno-fluorescence, nous avons montré que l’absence de Pol η induit une augmentation des

cellules avec des foyers de début de phase S concomitante avec une baisse des cellules

présentant des foyers de fin de phase S (article II, figure 7). Ce phénotype est complémenté

par la réintroduction d’une protéine ectopique Pol η sauvage (WT), suggérant qu’il est bien

spécifique de l’absence de Pol η (article II, figure 7C). En revanche, la complémentation par

le mutant catalytique de Pol η (Dead) ne permet pas de restaurer une répartition normale des

cellules au cours de la phase S, suggérant que l’activité catalytique de Pol η est nécessaire

(article II, figure 7D).

En accord avec ce rôle de Pol η au cours de la phase S, les clones shRNA déficients en

Pol η sont sensibles à deux inhibiteurs de la réplication (Fig 45), l’aphidicoline qui inhibe

les ADN polymérases réplicatives et l’hydroxyurée qui diminue le pool de dNTP en agissant

au niveau de la ribonucléotide réductase.


153

Figure 45. Sensibilité des cellules déficientes en Pol η à deux inhibiteurs de la réplication, l’aphidicoline et l’hydroxyurée. Les cellules shRNA contrôles et les cellules déficientes en Pol η ont été ensemencées dans des boîtes 6 puits à 500 ou 1000 cellules par puits. Elles sont traitées avec 100 et 250nM d’aphidicoline ou avec 100, 250 et 350µM d’hydroxyurée 24h après ensemencement et colorées au cristal violet 8 jours après le traitement. Ce test de clonogénie permet de déterminer l’efficacité de clonage des cellules ainsi que la survie cellulaire à l’aphidicoline ou à l’hydroxyurée. Les survies cellulaires ont été normalisées par rapport aux efficacités de clonage des cellules. La moyenne de trois expériences en triplicats est représentée sur ce graphe et les barres d’erreur correspondent aux écart-types.

4. Article II : “Human DNA polymerase eta is required for common fragile site stability during unperturbed DNA replication”

Un article relatant la majorité des résultats présentés ci-dessus a été publié dans le

journal «Molecular and Cellular Biology ».

1

10

100

0 50 100 150 200 250 300

CTR1CTR2

shEta1shEta2

1

10

100

0 100 200 300 400

CTR1CTR2shEta1shEta2

Survie (%) Survie (%)

Hydroxyurée (µM) Aphidicoline (nM)

MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, June 2009, p. 3344–3354 Vol. 29, No. 120270-7306/09/$08.00�0 doi:10.1128/MCB.00115-09Copyright © 2009, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.

Human DNA Polymerase � Is Required for Common Fragile SiteStability during Unperturbed DNA Replication�

Laurie Rey,1,2 Julia M. Sidorova,3‡ Nadine Puget,1,2‡ Francois Boudsocq,1,2† Denis S. F. Biard,4Raymond J. Monnat, Jr.,3,5 Christophe Cazaux,1,2 and Jean-Sebastien Hoffmann1,2*

CNRS, IPBS (Institute of Pharmacology and Structural Biology), 205 Route de Narbonne, F-31077 Toulouse, France1; University ofToulouse, UPS, F-31077 Toulouse, France2; Department of Pathology3 and Department of Genome Sciences,5 University of

Washington, Seattle, Washington 98195-7705; and CEA-DSV-IRCM/INSERM U935, Institut A. Lwoff-CNRS,7 Rue Guy Moquet, BP 8, 94801 Villejuif, France4

Received 26 January 2009/Returned for modification 26 February 2009/Accepted 9 April 2009

Human DNA polymerase � (Pol �) modulates susceptibility to skin cancer by promoting translesion DNAsynthesis (TLS) past sunlight-induced cyclobutane pyrimidine dimers. Despite its well-established role in TLSsynthesis, the role of Pol � in maintaining genome stability in the absence of external DNA damage has notbeen well explored. We show here that short hairpin RNA-mediated depletion of Pol � from undamaged humancells affects cell cycle progression and the rate of cell proliferation and results in increased spontaneouschromosome breaks and common fragile site expression with the activation of ATM-mediated DNA damagecheckpoint signaling. These phenotypes were also observed in association with modified replication factorydynamics during S phase. In contrast to that seen in Pol �-depleted cells, none of these cellular or karyotypicdefects were observed in cells depleted for Pol �, the closest relative of Pol �. Our results identify a new rolefor Pol � in maintaining genomic stability during unperturbed S phase and challenge the idea that the solefunctional role of Pol � in human cells is in TLS DNA damage tolerance and/or repair pathways followingexogenous DNA damage.

Mutations in the POLH gene that encodes DNA polymerase� (Pol �) are responsible for the variant form of xerodermapigmentosum (XP-V). XP-V is a rare autosomal recessive dis-order characterized by extreme sensitivity to sunlight and avery high incidence of sunlight-induced skin cancer, as are theother forms of “classical” XP (17, 27). However, in contrast tothe other nucleotide excision repair (NER)-defective XPcomplementation groups (XP-A to XP-G), XP-V cells havenormal NER but cannot support translesion synthesis (TLS)past DNA-containing cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs)(27). Purified Pol �, the TLS polymerase that is mutated inXP-V, is able to synthesize past this lesion with a high level ofefficiency (28), and in a majority of cases it inserts the correctnucleotide, adenine, opposite the two thymines contained inthe cyclobutane pyrimidine dimer ring (26).

The ability to replicate efficiently past UV pyrimidine dimershas been the principal—or sole—function assigned thus far toPol �. In the absence of Pol �, cells display an increased rateof UV-induced mutagenesis and carcinogenesis (23) that mayreflect inefficient or error-prone synthesis by another polymer-ase. In mouse cells, this back-up polymerase may be Pol � (12).Despite its ability to replicate past cyclobutane pyrimidinedimers, Pol � does not appear to be able to carry out TLS pastthe other major UV photoproduct, the pyrimidine (6-4)pyrimidone photoproduct [(6-4)PP] in vitro or in vivo. It can,

however, replicate past a limited number of other types ofDNA damage in vitro, albeit with a lower level of efficiencythan past CPDs (21). Whether the bypass of these lesions isperformed in vivo by Pol � is less clear. For example, XP-Vcells are sensitive to cisplatin, suggesting that bypass of cispla-tin lesions may depend on Pol � (1). Combined NER- and Pol�-mediated lesion bypass has also been suggested as the likelymechanism for repairing DNA interstrand cross-links formedby mitomycin C (46) and psoralen (32). In contrast, Pol � doesnot appear to play a role in replication past endogenous lesionssuch as 8-oxoguanine (3) or abasic sites (2).

It has been difficult to visualize or identify sites of action ofPol � or any of the other TLS polymerases by immunofluores-cence due to their low levels of expression. However, in cellsthat mildly overexpress Pol �, it has been possible to localizethe polymerase to nuclear replication factories during S phase.This localization depends on several motifs located close to theC terminus of Pol �, including an NLS and a ubiquitin-bindingzinc finger domain (7, 18). Localization of Pol � in replicationfactories may concentrate the polymerase near sites of repli-cation to facilitate recruitment to carry out TLS. If cells cannotremove or synthesize through a lesion blocking the replicationfork, then homology-dependent recombinational repair(HRR) may be used to restart the replication fork (11, 34).RAD51-mediated HRR has been shown to be important forthe repair of DNA damage during replication in all organisms(20, 31, 42). Recent evidence has suggested that Pol �, inaddition to its role in TLS, may participate in HRR. This hasbeen suggested by analyses of gene conversion in chickenDT40 cells during immunoglobulin gene diversification (19), aswell as by in vitro experiments showing that Pol � is capable ofpromoting extension of the invading strand in D-loop struc-

* Corresponding author. Mailing address: CNRS, UMR 5089, 205Route de Narbonne, F-31077 Toulouse, France. Phone: 33 5 61 17 5975. Fax: 33 5 61 17 59 94. E-mail: [email protected].

† Present address: CNRS, UMR 5099, LBME, and Universite PaulSabatier, F-31062 Toulouse, France.

‡ J.M.S. and N.P. contributed equally to this work.� Published ahead of print on 20 April 2009.

3344

by on May 28, 2009

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tures to facilitate RAD52-mediated second-end capture duringrecombination-mediated repair (29, 30). The functional impor-tance of this observation is less clear. Recent evidence fromyeast argues that the bulk of heteroduplex DNA strand exten-sion during HRR is mediated by the preferential recruitmentof a replicative DNA polymerase, Pol � (25). Moreover, thereis no obvious recombination deficit in XP-V patients or inXP-V cells beyond a modest elevation in the frequency ofUV-induced sister chromatid exchanges (10).

In order to better understand the functional roles and im-portance of Pol � in human cells, we used short hairpin RNAs(shRNAs) to selectively deplete Pol � from cells and thendetermined how the loss of Pol � affected cell cycle progres-sion, DNA replication dynamics, and cell proliferation in oth-erwise unperturbed cells. These experiments revealed an un-expected role for Pol � in maintaining chromosomal stabilityand preventing common fragile site (CFS) breakage duringunperturbed S phase. Our results thus broaden the functionalrole of Pol � in human cells to include the maintenance ofgenomic stability during unperturbed DNA replication in Sphase.

MATERIALS AND METHODS

Pol � cloning and mutagenesis. The human Pol � coding sequence was clonedas a NheI-XhoI fragment from the pGBKT7-hpoleta vector (44) into pET28(Novagen). A catalytically inactive mutant of human Pol � (Dead Pol �) wasconstructed by using QuikChange (Stratagene) according to the manufacturer’sinstructions to incorporate mutations (D115A and E116A) as well as a silentSacII site used for the mutant selection. The resulting products were sequenceverified prior to transfection into Escherichia coli host strain BL21-Codon-Plus(DE3)-RIL (Stratagene) for protein production. The open reading frames ofnative and Dead Pol � were also subcloned into the cytomegalovirus-drivenexpression vector pcDNA.3.1/Hygro (Invitrogen) to allow transient ectopic ex-pression of Pol �. A new multiple cloning site (Table 1) was introduced into thepcDNA3.1/Hygro vector (Invitrogen) as a NheI-XhoI fragment. A double FLAGsequence (Table 1) has been inserted as a HindIII-BamHI fragment. Finally, thePol � PCR product obtained from pET28 plasmid using Eta Fw and Eta Revprimers (Table 1) was cloned into the modified pCDNA3.1/Hygro vector as aBamHI-NotI fragment.

RheoSwitch-inducible system (New England Biolabs) for the regulated ex-pression of native and catalytically inactive ectopic Pol �. A double FLAG tag(Table 1) was introduced in the pNEBR-X1 plasmid as a BamHI-HindIII frag-ment. The open reading frames were cloned in the pNEBR-X1-FLAG expres-sion vector as a BamHI-NotI fragment. The pNEBR-R1 vector was transfectedinto U2OS cells, and clones were selected with neomycin (Invitrogen) at 50�g/ml for 15 days. To select the best repressor clone, we have transiently trans-

fected the pNEBR-X1 vector expressing green fluorescent protein into theseclones and we have analyzed green fluorescent protein expression by flow cy-tometry 24 h after the addition of the RSL1 ligand (500 nM; New EnglandBiolabs). The best clone was then cotransfected with the pNEBR-X1-FLAGvector expressing either the wild-type (WT) Pol � or the Dead Pol � togetherwith the pcDNA3.1/Hygro vector (Invitrogen), so selection was achieved byaddition of hygromycin (Invitrogen) at 250 �g/ml for 15 days. Regulated expres-sion of proteins was assayed after RSL1 induction, followed by Western blotting.Clones presenting the expression level of ectopic Pol � similar to the endogenousPol � were used in this study.

Cell culture. U2OS cells, MRC5 fibroblasts, and XP-V XP30RO cells (kindlyprovided by Patricia Kannouche, Villejuif, France) were grown as describedpreviously (18, 38, 43). Control or depletion replicative vectors (pEBVsiRNA)(6) were calcium phosphate transfected into U2OS cells. Individual stable cloneswere selected and maintained in 200 �g/ml hygromycin-B (Invitrogen). Fortransient depletion experiments, 100 nM of control small interfering RNA(siRNA) (Eurogentec) or a Pol �-specific siRNA (Sigma) (Table 1) was trans-fected 24 h after seeding by using the Lipofectamine 2000 protocol.

Cell growth and survival assays. Growth curves were determined by seeding75,000 cells in duplicate into six-well plates, counting duplicate wells each dayover the subsequent 4 days of growth. Doubling time [Td � ln(2)/slope], means,and standard deviations were calculated from three independent experiments.For cell survival after UVC radiation (2.5 and 5 J/m2) or caffeine (100, 500, and1,000 �M) exposure, 500 to 1,000 cells were seeded into six-well plates andtreated 24 h after seeding, and 8 days later cells were stained with crystal violet.Mean survivals and standard deviations were determined from three indepen-dent experiments.

Antibodies for Western blot analysis. We used primary antibodies against Pol� (50 �g/ml; Abcam ab17725), Pol � (a gift from R. Woodgate [NIH, Bethesda,MD]), phosphorylated Ser345-Chk1 (1:1,000; 133D3; Cell Signaling), total Chk1(1:1,000; G-4, Cell Signaling), Ku70 (1:10,000; N3H10; Interchim), and actin(1:10,000; C4; Chemicon).

Immunofluorescence. Experiments were performed as described in reference18. Different primary antibodies directed against PCNA (1:500; Abcam ab-18197), Pol � (1:100; FLAG M2 F-3165; Sigma), �-H2AX (1:500; JBW 301;Upstate Biotechnology), and pChk2 (1:100; pThr68-Chk2; Cell Signaling) wereused. Alexa Fluor 488 and 594 (Fisher) were used as secondary antibodies at adilution of 1:1,000. All antibody incubations were performed for 1 h at 37°C.Images were collected through a 12-filter set on a Leica microscope (�100objective), using a CoolSNAP HQ charge-coupled-device camera (Photometrics,Roper Scientific) driven by MetaMorph software (Roper Scientifics).

Cell cycle. To determine the cell cycle phase distribution, cells were fixed in70% ethanol and then labeled with propidium iodide as described previously(35). S-phase progression analysis was performed as described in reference 37,except that cells were blocked in G2/M phase by the addition of colcemid (0.1�g/ml; Gibco). Cells were then incubated for 15 min at 37°C in phosphate-buffered saline (PBS)-5 mM EDTA containing 10 �g/ml propidium iodide(Sigma) and 1 mg/ml RNase A (Sigma). Fluorescence-activated cell sorter(FACS) analysis of the doubly labeled cells was performed on a FACScan(Becton Dickinson). Results were analyzed using ModFIT or WinMDI 1.8 soft-ware. Means and standard deviations were calculated from three independentexperiments.

DNA fiber stretching. DNA was stretched on silanized glass and loaded intochannels by capillary tension as described in reference 41. Immunodetection withconfocal microscopy of stretched DNAs was performed on the Zeiss Axiovertmicroscope with a �63 objective. Up to 70 merged two-color digital images oftracks were collected and saved. Lengths of tracks were subsequently measuredin these images using the attached Zeiss AxioVision software.

Metaphase. Cells (500,000) were seeded into 10-cm dishes in growth mediumfor 24 h, at which point 100 nM aphidicolin (Sigma) was added or not for anadditional 24 h. Colcemid (0.1 �g/ml; Gibco) was added for the last 3 h toaccumulate mitotic cells prior to centrifugation, resuspension in PBS, and hypo-tonic swelling in 0.075 M KCl for 6 min at 37°C. Cells were then centrifuged,rinsed, and fixed in methanol-acetic acid (3:1). Spread chromosomes werestained for 5 min with 70 �g/ml acridine orange (Sigma), washed with severalchanges of PBS, and then mounted on slides in mounting medium (Dako-Cytomation) prior to microscopy (see “Immunofluorescence”).

FISH analysis. A total of 500 ng of FRA7H probe (BAC 36B6 RP-11) waslabeled with Chromatid Alexa Fluor 488 dUTP (Invitrogen) using the BioPrimeDNA labeling system (Invitrogen), purified on Probe Quant microcolumns (GEHealthcare), and then ethanol precipitated with human Cot-1 DNA (Invitrogen;0.1 �g/�l) overnight at 20°C. Precipitated DNA was collected by centrifugation(30 min at 10,000 � g) and incubated for 2 h at 37°C in hybridization mix (45)

TABLE 1. Oligonucleotides and sequences used in this study

Oligonucleotide Oligonucleotide sequence

sh�1 ...................................5-GTGTTGAAGTGATGGAGAT-3sh�2 � si� (3 UTR)......5-GCAATGAGGGCCTTGAACA-3sh�1 ....................................5-CTCAGTCCTTTAGTGAAGA-3sh�2 (3 UTR) ..................5-GAAGTAAATTCTGGCACAA-3FLAG................................5-AGCTTTTAATTAAGCCGCCACCAT

GGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTAGCG-3

MCS ..................................5-CTAGTAAGCTTGGGTTAATTAAGGATAGCTAGCGCAGGCGGATCCGGCGGAAAAGCGGCCGCTTAC-3

Eta Fw...............................5-CGCGGATCCCTTATGGCTACTGGACAGGATCG-3

Eta Rev .............................5-TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTAATGTGTTAATGGCTTAAAAAATG-3

VOL. 29, 2009 Pol � FUNCTIONS DURING UNPERTURBED DNA REPLICATION 3345

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prior to use. A human chromosome 7-specific centromeric probe labeled withCy3 was also used according to the supplier’s recommendations (Cambio). Afluorescence in situ hybridization (FISH) experiment was carried out as described inreference 45. Analyses were performed on a Zeiss microscope Imager.Z1 (�100objective) coupled with a SenSys camera using the CytoVision software measuringmodule (Applied Image Corp.).

RESULTS

Generation of Pol �- and Pol �-depleted human cells. Weconstructed independent clonal derivatives of human p53-pro-ficient osteosarcoma U2OS cells in which the expression ofPOLH or POLI had been silenced by using replicative vectors(pEBVsiRNA) (6) expressing independent shRNA sequencesspecific for the POLH (sh�1 and sh�2) or POLI (sh�1 andsh�2) mRNAs (see Materials and Methods) (Table 1). Thecontrol shRNA sequence was previously validated in severalstudies (5). This vector system produced stable gene silencingeven after several months in culture, with substantial depletionof Pol � (90% and 70% for sh�1 and sh�2, respectively) or Pol� (75% and 80% for sh�1 and sh�2, respectively) as assessed byWestern blot analysis (Fig. 1A and B). We verified both theextent and specificity of depletions by using real-time PCR aswell and used the same method to demonstrate that expressionof none of the other replicative or Y family DNA polymerasesthat were examined was altered in cells depleted of Pol � orPol � (data not shown). The phenotype of Pol �-depleted cellswas further verified by demonstrating increased UV sensitivitycompared to cell clones expressing control shRNAs (Fig. 1Cand D).

Pol �-depleted cells have G2/M and proliferative defects.We used quantitative FACS analysis to determine whether Pol�- or Pol �-depleted cells displayed a cell cycle progressiondefect in the absence of DNA damage. These analyses were

performed using asynchronous cultures of sh�1- and sh�2-depleted and CTR1 and CTR2 clones in order to avoid poten-tial artifacts introduced by synchronization. Flow analyses re-vealed a modest but significant (P values of 0.002 for sh�1 and0.01 for sh�2) accumulation of Pol �-depleted cells in G2/Mwith a correspondingly reduced G1 fraction compared withthat in control cells (Fig. 2A). In agreement with these results,Pol �-depleted cells proliferated more slowly in exponentialculture (Fig. 2C) with a doubling time �7 h longer than that ofcontrol cells (37 and 38 h for sh�1 and sh�2, respectively,versus 30 and 31 h for CTR1 and CTR2, respectively). Incontrast, we observed no difference in cell cycle phase distri-bution or doubling time in cells depleted of the Y family Pol �(Fig. 2B and D).

Spontaneous chromosome abnormalities in Pol �-depletedcells. We analyzed metaphase spreads prepared from Pol �(sh�1 and sh�2)-depleted and control (CTR1 and CTR2) cellsto further investigate the consequences of loss of Pol � forchromosomal stability. Pol � depletion from U2OS cells re-sulted in a significant increase in the frequency of cells display-ing chromatid breaks in the absence of exogenous DNA dam-age or S-phase perturbation (7 to 8% of metaphases indepleted cells versus 2 to 3% of metaphases in control cells)(Fig. 3A). Two additional experiments were performed todemonstrate the specificity of this effect for Pol � loss offunction. First, we depleted Pol � from normal diploid humanMRC5 fibroblasts using si�2 (Table 1) and confirmed thekaryotypic instability first observed in Pol �-depleted U2OScells (Fig. 3B). Second, we confirmed an elevated level ofspontaneous chromatid breaks in XP30RO cells from an XP-Vpatient who carries a POLH gene deletion that leads to trun-cation of Pol � at residue 35 (Ala35) (17) and demonstratedthat breakage was suppressed when these cells were comple-mented with a POLH cDNA encoding full-length Pol � (Fig.3B). Chromatid breaks and gaps were the most common ab-normalities in all of the Pol �-deficient cell lines analyzed (Fig.3C). We also observed a substantially higher frequency ofaberrant metaphases with more than two breaks or gaps permetaphase in Pol �-depleted cells treated with the replicationinhibitor aphidicolin (Fig. 3A). This observation, together withthe preponderance of chromatid-type lesions, indicates thatmost or all chromosomal abnormalities in Pol �-depleted cellsare likely to be replication dependent (Fig. 3A). These dataare, to the best of our knowledge, the first demonstration thatspontaneous chromosome instability occurs in XP-V/Pol �-de-ficient cells in the absence of exogenous stress.

Pol � depletion leads to DNA break-mediated damage sig-naling. We noticed that a subset of Pol �-deficient cells showedelevated levels of �-H2AX focus formation, an indicator ofDNA strand breakage, in the absence of exogenous DNAdamage (Fig. 4A and B). Although the intensity of the�-H2AX response in Pol �-depleted cells was weaker than thatafter exposure to exogenous DNA damage, it was reproducibleand significantly elevated over the background compared withthat in Pol �-proficient cells. We also observed, although at alesser extent and at a lesser intensity, elevated �-H2AX focusformation in Pol �-depleted cells (Fig. 4B), probably due to therecently identified novel role of Pol � in protecting cells fromendogenous oxidative damage (36).

These focus-forming data indicated that Pol � might be local-

FIG. 1. Pol � depletion from U2OS cells affects UV survival. (Aand B) Western blot analyses of whole-cell extracts prepared fromU2OS cell clones that are expressing either a control shRNA (CTR1,CTR2), Pol � shRNAs sh�1 or sh�2, or Pol � shRNAs sh�1 or sh�2revealed near-complete depletion of both polymerases by each poly-merase-specific shRNA. Ku70 was used as a loading control. (C and D)Colony-forming assay results of Pol �- and Pol �-depleted U2OS cellsdescribed above were determined as a function of UV dose. Cellsdepleted of Pol � (sh�1 and sh�2) (dotted lines) displayed a significantdose-dependent decrease in survival after UVC radiation, in contrastto Pol �-depleted or control cells. Experiments were done twice, withtriplicate samples for each UV dose, in order to determine meancolony-forming assay results, and the standard deviations are indicatedby error bars.

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izing to sites of DNA double-strand breaks (DSBs) marked by�-H2AX in Pol �-depleted cells.

In order to further investigate this possibility, we determinedthe level of expression and the phosphorylation status of twocentral transducer kinases in DNA damage response signaling,Chk1 and Chk2. These kinases are phosphorylated by the api-cal DNA damage response kinases ATR and ATM in responseto replication stress (33). The level of phosphorylated Chk1,assessed by Western blotting with a Chk1 anti-phosphoserine345-specific antibody, did not change when either Pol � or Pol� was depleted from U2OS cells (data not presented). In con-trast, there was a twofold induction of pThr68-Chk2 formationin cells depleted of Pol � (Fig. 4C). This response was notobserved in mock-depleted cells and was observed to a lesserextent in cells depleted of Pol � (Fig. 4A and C). Doubleimmunostaining revealed that pThr68-Chk2 colocalized in nu-clear foci with �-H2AX in cells depleted of Pol � (Fig. 4A).These results indicate that depleting Pol � from human cellscauses increased genomic instability, DSB accumulation, anddamage-induced focus formation in the absence of addedDNA damage and suggest that these events occur late in Sphase or in G2 phase.

Increased CFS expression following Pol � depletion. Thekaryotypic and cytologic results reported above raised thequestion of whether specific chromosomal regions might bepreferentially affected or destabilized in Pol �-depleted cells.We focused first on CFSs, specific regions of the human karyo-type that preferentially exhibit metaphase gaps or breaks fol-

lowing partial inhibition of DNA synthesis. These sites are alsofrequently “expressed” in human tumors, meaning rearrangedor lost as a consequence of chromosomal breakage, and may besensitive indicators of replication stress in premalignant cells(4, 14). The most highly expressed CFSs in human cells include3p14.2 (FRA3B), 16q23 (FRA16D), 6q26 (FRA6E), 7q32.3(FRA7H), and Xp22.3 (FRAXB). Fragile site sensitivity is inpart cell line dependent, and among the sites listed above, thetypical expression of the only 7q32.3 FRA7H CFS can beobserved in U2OS cells, probably due to rearrangements inother CFSs in this tumor cell line (9). In order to determinewhether depletion of Pol � from U20S cells promoted insta-bility at the 7q32.3 (FRA7H) fragile site, we used a FISH-based assay to quantify the fraction of chromosomal breaksthat localized to 7q32.3 (FRA7H) in Pol �-depleted U2OScells (Fig. 5).

We first verified the specificity of our FRA7H probe byhybridizing it along with a chromosome 7-specific centromericprobe to metaphase spreads from diploid cells. FRA7H probewas then used to assess expression of the FRA7H fragile site inPol �-depleted cells. We observed an eightfold increase inFRA7H expression (translocations, amplifications, deletions)under conditions of replication stress in Pol �-depleted cells(Fig. 5D). When we analyzed the same cells under unper-turbed growth conditions, there was a threefold increase ofFRA7H expression in Pol �-depleted cells compared with thatin control cells (Fig. 5A to D). FRA7H expression was notelevated in either mock-depleted or Pol �-depleted U2OS cells

FIG. 2. Pol �-deficient cells present a defect of cell cycle progression. (A and B) Cell cycle progression was investigated by flow cytometryanalysis after propidium iodide incorporation on controls (CTR1, CTR2) and Pol �-deficient cells (sh�1, sh�2) (A) and on controls (CTR1, CTR2)and Pol �-deficient cells (sh�1, sh�2) (B). Experiments were done three times, and standard deviations are indicated by error bars. P values werecalculated using the Student t test (P values of 0.002 for sh�1 and 0.01 for sh�2). (C and D) Growth curve analysis was done over 96 h on controlcells (CTR1 and CTR2) (full line) and on Pol �-deficient cells (sh�1 and sh�2) (dotted line), shown in panel C, and on control cells (CTR1, CTR2)and Pol �-deficient cells (sh�1 and sh�2) (dotted line), shown in panel D. Experiments were done three times in triplicate, and standard deviationsare indicated by error bars. The doubling time was calculated from this curve.


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(not shown). These results indicate that Pol � may contributeto CFS stability under conditions of unperturbed growth aswell as under conditions of replicative stress.

ATR was found to play a major role in maintaining thestability of CFSs by directing the cellular checkpoint responseto stalled replication at these sites (9). Cells lacking ATRshowed a dramatic increase in CFS expression following treat-ment with low doses of aphidicolin (50 and 100 nM). Further-more, ATR deficiency alone induced a low frequency of spon-taneous gaps and breaks at CFSs, showing that ATR isrequired for CFS stability even during unperturbed replication,as we show here for Pol �. One prediction from these obser-vations was that Pol �-depleted U2OS cells should have en-hanced sensitivity to the ATR inhibitor caffeine compared to

cells expressing control shRNAs. The data demonstrate thatthis is the case: the absence of Pol � in conjunction with ATRdeficiency further suppresses cell viability (Fig. 5E). This resultfurther supports a role for Pol � in maintaining CFS stability.

FIG. 3. Loss of Pol � affects chromosomal stability. The frequencyof spontaneous chromatid breaks in three independent experiments(�50 metaphases for each) was quantified from spread metaphaseanalysis by fluorescence microscopy from U2OS control (CTR1 andCTR2) and Pol �-deficient U2OS cells (sh�1 and sh�2) treated or nottreated with 100 nM of aphidicolin (A) and XP30RO/XP30RO-Pol �cells and MRC5 cells (untransfected [NT], siCTR and si�2) (B). Stan-dard deviations are indicated by error bars. (C) Illustration of chro-matid breaks (noted with arrows) in all Pol �-deficient cell lines.

FIG. 4. Increase of DNA breaks and activation of cell cycle check-point Chk2 in the absence of Pol �. (A) �H2AX and P-Chk2 focusformations were analyzed by immunofluorescence in control cells(CTR1) and Pol �-deficient cells (sh�1) 48 h after seeding. DNAcontent was visualized by 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) col-oration. Merged images show the partial colocalization of each pro-tein. The number of cells with �H2AX or P-Chk2 foci (called positivecells) was determined in control cells (CTR1 and CTR2), in Pol �-de-ficient cells (sh�1 and sh�2), and in Pol �-deficient cells (sh�1 and sh�2).The quantification in three experiments (�100 cells) is presented inpanels B and C, and standard deviations are indicated by error bars.


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Analysis of replication dynamics in Pol �-depleted cells.Our fragile site results led us to examine replication dynamicsin Pol �-depleted cells. CFSs are known to be induced byinhibitors of DNA synthesis, are late replicating, and are de-pendent upon a functional intra-S checkpoint for expression(14). These observations have led to the hypothesis that CFSsmay result from the delayed or incomplete replication ofgenomic regions that are inherently difficult to replicate, withthe production of stalled or broken replication forks or DNAsingle-strand gaps. In order to better understand how Pol �depletion was contributing to CFS expression in the absence ofadded DNA damage, we determined whether Pol �-deficientcells had altered S-phase progression, replication fork rates, orS-phase nuclear replication factory dynamics.

We analyzed the duration of S phase in Pol �-depleted andcontrol cells by performing a flow cytometric analysis of cellsthat had been pulse-labeled for 15 min in early S phase withbromodeoxyuridine followed by a thymidine “chase” and werethen analyzed over a 10-h time course (Fig. 6A). Pol �-de-pleted cells and control cells did not differ significantly inprogression through S phase until 6 h after labeling, when a

slight delay in S phase was observed in Pol �-depleted cells(Fig. 6A).

We next asked whether Pol �-depleted cells exhibited alter-ations in the rate of replication fork progression on undam-aged DNA. For this analysis, we used a newly developedmethod in which replicated DNA is labeled in vivo with thehalogenated nucleosides IdU and CldU and then isolated andstretched by passive flow through microchannels prior to cap-ture on silanized glass coverslips (see Materials and Methods).Newly replicated regions (“replication tracks”) in the stretchedDNA molecules could then be visualized and measured byimmunostaining with antibodies that are specific to CldU orIdU (41). This method enabled us to monitor replication forkprogression at the level of individual replicating DNA mole-cules (Fig. 6B) and to show that, as it was recently observed inavian cell lines (15), fork progression rates did not differ be-tween Pol �-depleted cells and control cells in the absence ofDNA damage (Fig. 6C and D).

We also determined whether Pol � depletion affected rep-lication factory dynamics over the duration of S phase in oth-erwise unperturbed cells (Fig. 7). DNA replication in human

FIG. 5. Role of Pol � in CFS stability. (A) Localization of FRA7H probe (in green) was analyzed by using FISH in control cells (CTR1) andchecked using a centromeric probe (in red) specific to chromosome 7. (B and C) Expression of the CFS FRA7H (translocations, amplifications,deletions) was analyzed by using FISH in Pol �-deficient cells (sh�1 and sh�2). The quantification of FRA7H expression in cells treated or nottreated with aphidicolin (100 nM) for 24 h is presented in panel D (three experiments; �50 metaphases), and standard deviations areindicated by error bars. (E) Colony-forming assay of Pol �-depleted U2OS cells was determined as a function of caffeine concentration.Experiments were done three times, with triplicate samples for each caffeine dose, in order to determine mean numbers of CFUs, andstandard deviations are indicated by error bars.


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cells takes place at discrete sites in the nucleus, termed repli-cation factories, where DNA is colocalized with large proteincomplexes that contain DNA polymerases and accessory rep-lication proteins such as PCNA. These replication foci undergoreproducible changes in number, size, and location during S-phase progression (22). During early S phase, hundreds ofsmall factories are distributed throughout the nucleoplasm,with the exception of the nucleoli (Fig. 7A). In late S phase,replication foci decrease in number but increase in size andoften form characteristic ringlike structures in the nucleoplasmtogether with factories distributed along the nuclear mem-brane (Fig. 7A). We found that Pol �-depleted U2OS cellscontained predominantly early replication factories with fewercells displaying late replication factory morphologies (Fig. 7B).

In order to determine whether these changes in replicationfactory dynamics depend on Pol � catalytic activity, we used aRheoSwitch-regulated, inducible gene expression system (seeMaterials and Methods) to reexpress at comparable levels (asevidenced by the intensity of the green flag-stained cells) cat-alytically active or inactive Pol � in depleted cells (Fig. 8) priorto analyzing replication factory morphology by PCNA immu-nostaining (Fig. 7C and D). The catalytically inactive mutant ofPol � (Dead Pol �) contains two mutations (D115A andE116A) in the two critical active site residues. This mutant Pol� open reading frame was also tagged with a double FLAGepitope tag to facilitate cytologic analyses (see Fig. S1A in thesupplemental material). The absence of catalytic activity of thisdouble mutant form of Pol � was verified by purifying DeadPol � and showing that it was not able to replicate past CPDsin vitro (see Fig. S1B in the supplemental material). We dem-onstrated that replication factory abnormalities observed inPol �-depleted cells could be suppressed by native, though notcatalytically inactive, Pol � (Fig. 7C and D). We observedsimilar perturbed replication factory dynamics in Pol �-de-pleted normal human diploid fibroblasts and in XP-V cellsprior to complementation with catalytically active Pol � (seeFig. S2A and B in the supplemental material). These resultscollectively indicate that Pol � activity is required for normalreplication factory formation and maturation during S phase.

Our results provide the first documentation of an alteredDNA replication program in XP-V or Pol �-depleted cells inthe absence of exogenous DNA damage that is associated withand may be mechanistically linked to fragile site expression.Interestingly, we observed similar changes in replication fac-tories in cells partially depleted for Rad51 by siRNA (40; datanot shown), a key component in HRR. This could reflect thepresence or persistence of DSBs occurring during replicationof CFSs, or that Pol � and Rad51 act in the same postreplica-tion repair pathway during S phase.

DISCUSSION

Pol � is best known for its role in responding to genomedamage that arises when a cell is exposed to an extrinsic geno-toxic stress, such as UV irradiation. Individuals with mutationsin the human POLH gene are affected by the variant formXP-V, a rare, autosomal recessive human genetic syndromewith sun hypersensitivity associated with UV hypermutability,numerous skin abnormalities, and a high level of early andmultiple skin cancers on sun-exposed sites of the body, which

FIG. 6. Analysis of S-phase duration and fork progression in Pol�-deficient cells. (A) Percentage of cells in S phase for control (CTR1,CTR2) and Pol � shRNA clones (sh�1, sh�2) as determined by bro-modeoxyuridine incorporation is presented. Experiments were donethree times, and standard deviations are indicated by error bars.(B) Analysis of replication fork progression at a single-molecule levelin Pol �-depleted cells as described in Materials and Methods. Repli-cation tracks that represented individual ongoing forks, for example,labeled with both IdU (green) and CldU (red) as shown in the image(marked by green and red arrows), were identified and the lengths oftheir IdU and CldU segments (on average, 100) were measured foreach sample. (C and D) Fork rates in micrometers/10 min were de-termined by dividing the length of IdU or CldU segments by thelabeling time coefficient (1.5 and 3, respectively). (C) Cumulative plotof typical fork rate distributions derived from CldU segments in one ofthe experiments. (D) Summary of the rates obtained by measuringlengths of IdU or CldU segments in ongoing forks in all three inde-pendent experiments. In this case, median fork rates were calculatedand then averaged between experiments. Error bars indicate standarddeviations. Of note, fork rates estimated on the basis of IdU or CldUsegment lengths were very similar, as anticipated.


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is consistent with the ability of Pol � to support efficient anderror-prone TLS across one of the sites of major UV damage,the cyclobutane thymine dimer.

We used shRNA-mediated Pol � depletion from humancells to explore and better understand physiologic roles of Pol� in both unperturbed S phase and in cells following the ad-dition of replication inhibitors. Pol �-depleted cells demon-strated two consistent abnormalities that may be mechanisti-cally linked: altered replication factory dynamics and elevatedinstability of a CFS. Of importance, these abnormalities weredemonstrated in unperturbed replicating cells and in severaldifferent cell types, including primary fibroblasts, and appearedto depend on Pol � catalytic activity as demonstrated by acombination of depletion and complementation experiments.Moreover, these effects are specific to Pol � since none of thesecellular or karyotypic defects was observed in cells depleted forPol �, the closest relative of Pol �. These observations providenew information on the role of Pol � during S phase in unper-turbed normal cells and extend the function of Pol � to normalDNA replication in cycling cells.

This newly identified role of Pol � in suppressing CFS in-stability is of particular interest as the regulation of CFS sta-bility is still poorly understood. CFSs are typically relativelylarge (several-hundred-kilobase) regions of chromosomalDNA of unremarkable sequence that are replicated in late Sphase. Delay or inhibition of replication has been shown toinduce chromosomal breakage at these sites. CFS instability isenhanced in ATR-deficient cells (9) or when Chk1 activity iscompromised (13). These results have led to the proposal thatthe ATR pathway stabilizes replication forks stalled withinfragile site sequences to ensure replication and the completionof S phase while avoiding DNA breakage (14). We found thatcells lacking Pol � were hypersensitive to the ATR inhibitorcaffeine. One mechanistic explanation for this observation isthat fork stalling in the absence of Pol � cannot be stabilized incells where ATR is inhibited by caffeine. The resulting col-lapsed or broken forks, at CFS and other genomic sites under-going replication, would be predicted to lead to chromosomalinstability and cell death. This model would explain the obser-vation made by several groups that XP-V cells are hypersen-sitive to killing by UV irradiation in the presence of caffeine (8,24, 43). Thus, combined treatment with UV and caffeine maytarget functional roles for Pol � in human cells in the TLS ofUV damage and in ensuring CFS stability.

We also analyzed the replication program of Pol �-depletedcells by examining replication fork rates and replication factorydynamics. Using replication track analysis (RTA) on stretchedDNA, we detected no change in global fork progression ratesin cells depleted of Pol � compared to those in controls. How-ever, if replication in Pol �-depleted cells is impaired only at aspecific subset of loci, such as CFSs, our assay may not revealit. In the future, it should be possible to apply a variant ofRTA, RTA-FISH with a FRA7H probe, to determine whetherfork rates in FRA7H itself are altered in Pol �-deficient cellsprior to and after DNA damage. Our analyses of replicationfactory dynamics, in contrast, revealed an unexpected decreasein the proportion of cells with a late-replication foci patternand a corresponding increase in cells with early patterns in Pol�-depleted cultures. This may be an indication of delayedcompletion of bulk replication occurring in early S and/or a

FIG. 7. Depletion of Pol � affects the spatial organization of activereplication foci in U2OS cells. (A) An image of early and late repli-cation PCNA foci in U2OS cells analyzed by immunofluorescence.(B) Quantification of cells with early and late replication foci wasperformed in three experiments (�100 cells) for control cells (CTR1,CTR2) and Pol �-deficient cells (sh�1, sh�2). (C and D) Normalreplication focus pattern is restored after expression of a WT form, butnot a catalytically inactive form, of Pol � in U2OS cells containing aRheoSwitch-inducible system. Cells with early and late replication fociwere quantified in untransfected cells (NT), cells transfected by controlsiRNA, or cells transfected by Pol � siRNA after induction or not ofectopic Pol � forms by the RSL1 ligand (500 nM) (see Materials andMethods). Standard deviations are indicated by error bars.


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delayed or impaired onset of late replication. One potentiallyinteresting experiment would be to determine whether thetiming of FRA7H replication is delayed or otherwise altered inPol �-depleted cells, as little is known about mechanisms thatregulate replication timing or switching between early and latereplication timing.

One of the most intriguing ideas suggested by our results isthat Pol � may have two fundamentally different functionalroles in human cells, one in the context of the replisome, wherePol � is recruited to allow the replication of UV dimers andrelated types of DNA damage, and a second role in the contextof DNA synthetic events that do not involve the full replisome.

Two roles of the latter type may be envisioned. Pol � mayextend invading strands in D loops as it has been recentlyproposed (19, 29, 30), and in addition, Pol � may be recruitedat the termination of replication when DNA between two con-verging forks needs to be completely replicated prior to topo-logical resolution of the two replicated sister chromatids. Al-ternatively, Pol � may be required for the replication per se ofnaturally occurring DNA structures capable of forming un-usual secondary structures, as many breakage hot spots in thehuman genome are mapped inside or near sequences that havethe potential to adopt non-B DNA structures. A failure of anyof these postulated roles for Pol � would be expected to pro-

FIG. 8. Rescue experiments by the RheoSwitch-inducible system. (A and C) Western blots of whole-cell extracts prepared from U2OS cellscontaining a RheoSwitch-inducible system, cells not transfected (lane 1 and 4), and cells transfected by control siRNA (lane 2 and 5) or Pol �siRNA (lane 3 and 6). Blots were incubated with DNA Pol � antibody and Ku70 antibody, with the latter used as a normalization control. ThePol � siRNA (si�2) used in this experiment corresponds to the sequence of the shRNA used to construct sh�2 stable clones. To induce theexpression of the tagged WT form of Pol � (FLAG-WT Pol �) (A, lanes 4 to 6) or the tagged catalytically inactive mutant of Pol � (FLAG-DeadPol �) (C, lanes 4 to 6), cells were exposed to the ligand RSL1 (500 nM) (see Materials and Methods). (B and D) Induction of the expression oftagged FLAG-WT Pol � and FLAG-Dead Pol � was analyzed by immunofluorescence in control cells (siCTR) and in Pol �-deficient cells (sh�1).The DNA content was visualized by staining with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).


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duce the phenotype that we have observed, namely, chromatidbreaks with the accompanying damage response activation,CFS expression, and potentially altered maturation of replica-tion factories as seen with replication focus patterns.

The XP-V syndrome has been estimated to comprise 20% ofXP patients with mild or severe clinical features, includinglate-onset skin cancers (16). Most mutations in the POLH genein XP-V patients are heavily biased toward the N-terminalregion and encode a Pol � protein with either missense muta-tions or severe truncations that abolish both DNA polymeraseand bypass activities. Our results make several predictionsabout the pathogenesis of XP-V and suggest additional anal-yses of tumors arising in XP-V patients as well as in acquiredPol � deficiencies and in Polh mutant mice.

First, CFS instability should be elevated in otherwise normalXP-V cells and may lead to a higher percentage of cell deathor senescence in vivo in the absence of exogenous DNA dam-age. A prediction is that the frequency of senescent cellsshould be higher in tissue from XP-V patients or Polh mutantmice. It may also be possible to address this issue by determin-ing the mitotic history of cells from XP-V patients and controls(39), where the prediction is that cells from XP-V patients orPolh mutant mice would have undergone more mitotic divi-sions at any given chronological age due to higher cell lossduring and after development.

A second prediction is that CFS instability in Pol �-deficientcells may be further accentuated by exposure of UV or otherforms of DNA damage, such as cisplatin, that may depend onPol � for accurate replication or repair. This type of analysiscould be performed initially in cell lines or strains and could bereadily extended to primary cells from XP-V patients or fromPolh mutant mice. A related, third prediction is that thereshould be a higher frequency of CFS-associated loss of het-erozygosity in tumors arising in sun-exposed skin and perhapsat other sites of the body exposed to high levels of exogenousor endogenous DNA damage (e.g., the liver and kidney) andthat instability or loss of heterozygosity would be more pro-nounced in the absence of Pol �.

The tumor spectrum in XP-V patients and in Polh mutantmice argues that Pol � deficiency alone may lead to instabilityor mutagenesis but is not sufficient to cause tumors in mice orhumans. The absence of Pol � becomes a powerful cocarcino-gen only in conjunction with a strong “driver” that could beeither chemical (in the form of DNA damage) or genetic. Thisrequirement likely reflects the relatively highly specializedfunctional roles that Pol � appears to fill in mammalian cells.It should be possible to further explore the mechanistic andmolecular aspects of these roles using human cells that areeither mutant for or depleted of Pol �, as well as in Polh-deficient mice with biochemical and cellular defects thatclosely resemble the Pol �-deficient/XP-V human phenotype.Our results provide an important contribution to these analy-ses by identifying an unexpected new function of Pol � duringS phase in unperturbed normal human cells that is in additionto the well-established role of Pol � in TLS.

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by an INCa award (Checkpol Projet Libre2007) and an Association pour la Recherche sur le Cancer (no. 4887)to J.-S.H., by a Canceropole Grand Sud Ouest 2004–2009 award to

C.C., by an NIH PO1 award (PO1 CA77852) to R.J.M., and by an EDF(Electricite de France) award to D.S.F.B. L.R. received a fellowshipfrom La Region Midi-Pyrenees–CNRS.

We thank M. Yerle and F. Mompart (INRA-Toulouse) for helpfuladvice for FISH analysis and A. Tissier (Marseille) for the Pol �cDNA.

J.-S.H. and C.C. jointly direct the Genetic Instability and CancerGroup at IPBS.

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Supplemental figure 1: Construction of a Catalytic inactive mutant of Pol η (Dead Pol η).

Panel A, SwissPDB viewer generated model of tri-dimensional structure of Human N-terminal Pol η with two mutations in the catalytic site. Figure was generated by Pymol (http://www.pymol.org). Panel B, Ability of purified proteins Pol η WT and Pol η Dead to replicate through a CPD lesion. To purify the Pol η proteins, overnight cultures of E. coli containing pET28 plasmids encoding either native or Dead mutant Pol η were diluted 1:100 into fresh Luria-Bertani media containing 50µg/ml kanamicin and growth at 37°C to an OD/A 600 of 0.5. Protein production was then induced by adding 1mM IPTG followed by growth for 3 hrs at 25°C. Cells were harvested by centrifugation, and cell pellets were resuspended in 20ml of buffer A (20mM Tris-HCl pH 7, 500mM NaCl and 5mM imidazole) then frozen for 16 hrs at -70°C. Cells were lysed by slowly thawing frozen cell pellets on ice in the presence of 20 mg/ml lysozyme, 1% Triton X100 and an EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche). Insoluble debris was removed by centrifugation at 8000xg for 15 min, and the remaining supernatant was applied to a Ni-chelating column (Ni Trap FF, GE Healthcare) following the vector manufacturer’s instructions (Novagen). Bound protein was then eluted using a linear 5-500mM gradient of imidazole in buffer B (500mM imidazole, 20mM Tris-HCl pH 7, 500mM NaCl). Fractions containing Pol η were pooled and concentrated using Vivaspin 20ml 30K spin filters (Sartorius) before being applied to a Superdex 200 gel filtration column (GE Healthcare). Gel filtration fractions containing Pol η were concentrated using a Vivaspin 2ml 30K filter prior to being stored at -80°C in 20mM Tris HCl pH 7, 150mM Nacl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT and 20% glycerol. Protein purity was estimated after 8% SDS-polyacrylamide gels by visual inspection of Coomassie Blue-staining and Western blotting. Measure of the in vitro activity of the purified forms of Pol η was performed by primer extension on a template containing a single site-specific CPD followed by electrophoresis of the extension products. The negative control was the Taq DNA polymerase and the positive control was the Archae DNA polymerase DPO4. Decreasing concentrations of purified proteins were used (0.1, 0.05 and 0.01 µM). Standard primer extension reactions were performed at 37°C for 1hr as previously described (Boudsocq et al, 2001) using a partially single-stranded template. The primer consisted of oligonucleotide P16 (sequence 5'- CACTGACTGTATGATG-3′) that was labelled at the 5’ end using T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs) and γ-32P-ATP (5000 Ci/mmol; Amersham Pharmacia Biotech). The template strand consisted of a single-stranded oligonucleotide that contained a single cys-syn cyclobutane pyrimidine thymine-thymine dimer (a generous gift from Shigenori Iwai and Fumio Hanaoka; 3'-GTGACTGACATACTACT^TCTACGACTGCTC-5′) (Servant et al, 2002).

A

Cel

ls w

ithla

te re

plic

atio

n fo

ci (%

)

XP30ROXP30RO+η0

5

10

15

20

0

5

10

15

20

25

30

Cel

ls w

ithea

rly re

plic

atio

n fo

ci (%

)

XP30ROXP30RO+η

B0

2468

10

12

14

16

siCTR siη2NT

Cel

ls w

ithla

te re

plic

atio

n fo

ci (%

)

siCTR siη2NT0

2468

10

12

14

1618 18

Cel

ls w

ithea

rly re

plic

atio

n fo

ci (%

)

Supplemental Figure 2 : Quanti�cation of early versus late replication foci in various cell lines with compromised Pol η expression

The quanti�cation was performed in three independent experiments (n>100 cells) for each cell line, in normal diploid MRC5 cells (Panel A), and in XP30RO/XP30RO-Pol η cells (Panel B).


167

5. Discussion des résultats publiés dans l’article II

L’ensemble de nos données suggèrent donc que Pol η ait deux rôles distincts : un rôle

déjà bien établi dans la synthèse translésionnelle des dommages induits par les UV (dimères

de thymines) et un rôle ici mis en évidence au niveau de la stabilité des sites fragiles

communs qui pourrait être étendu à d’autres séquences particulières de l’ADN, telles que les

séquences riches en G comme nous l’avons vu dans le chapitre A. Ces résultats permettent

notamment d’expliquer pourquoi la caféine (un inhibiteur d’ATR, impliquée au niveau du

maintien de la stabilité des sites fragiles communs) et les UV ont un effet additif sur la

sensibilité des cellules déficientes en Pol η, comme cela avait été montré dans des lignées

XP-V (Stary et al, 2003). De même que précédemment, il reste à déterminer si Pol η intervient

directement au niveau de la réplication des sites fragiles communs, ou bien si Pol η intervient

plus tardivement au niveau de la réparation des cassures générées à ces sites par

recombinaison homologue.

a- Quel est précisément le rôle de Pol η lors de la réplication des SFC ?

D’après les résultats de peignage moléculaire de l’ADN, Pol η n’est pas impliquée au

niveau de la réplication globale du génome comme cela avait été montré dans les cellules de

poulet DT40 (Edmunds et al, 2008). Afin de déterminer si Pol η intervient au niveau de la

réplication des séquences particulières de l’ADN en fin de phase S, nous avons

synchronisé les clones shRNA avec 0,5mM de L-mimosine (Sigma) qui bloque les cellules en

phase G1 du cycle cellulaire. Les cellules sont ensuite relâchées pendant 7h, moment où elles

sont en milieu de phase S. Elles sont ensuite traitées pendant deux heures avec 100nM

d’aphidicoline afin d’induire l’expression des sites fragiles communs, puis marquées deux

fois 30 minutes avec deux analogues de nucléotides successifs (Iodo-déoxyuridine et

Chloro-déoxyuridine). Pendant ces marquages, les cellules sont en fin de phase S, moment où

sont répliqués les sites fragiles communs (Hellman et al, 2000). Les cellules sont ensuite

récupérées et incluses dans des blocs d’agarose. Une expérience de peignage moléculaire de

l’ADN classique permettra dans un premier temps de déterminer si l’absence de Pol η

modifie les vitesses de réplication de fin de phase S. Dans un deuxième temps, le couplage de

l’hybridation in situ (FISH) de la sonde FRA7H et du peignage moléculaire de l’ADN

permettra de déterminer si l’absence de Pol η modifie les vitesses de réplication au niveau du

site fragile commun FRA7H.


168

D’autre part, nous avons entrepris des expériences d’immuno-FISH afin de

déterminer si Pol η Dead contrairement à Pol η WT est localisée au niveau du site fragile

commun FRA7H après traitement avec 100nM d’aphidicoline. En effet, nous pensons que le

mutant catalytiquement inactif de Pol η pourrait agir comme un dominant négatif sur Pol η

endogène et donc figer le système. De manière similaire, nous pourrons étudier d’autres

mutants de Pol η notamment au niveau du domaine d’interaction avec PCNA ou du domaine

d’interaction avec l’ubiquitine afin de caractériser les domaines de Pol η critiques pour le

maintien de la stabilité des sites fragiles communs. Enfin des expériences de fractionnements

cellulaires ou d’immuno-précipitations permettront de déterminer quels sont les partenaires

de Pol η après traitement à l’aphidicoline ou en absence de stress exogène.

L’absence de Pol η induit aussi une modification de la dynamique des foyers de

réplication au cours de la phase S. Ceci pourrait être dû à un défaut ou un retard de réplication

en début ou fin de phase S. Il serait donc intéressant de déterminer si la cinétique de

réplication du site fragile commun FRA7H est retardée ou perturbée en absence de Pol η

via une hybridation in situ avec une sonde spécifique de FRA7H sur noyaux interphasiques.

b- Existe-t-il un rôle de Pol η au niveau des séquences répétées ?

Les sites fragiles rares sont dus à des expansions d’éléments répétés, tels que des di-

ou tri-nucléotides. Ces expansions sont anormales et peuvent créer de nombreuses maladies. Il

est important de noter que ces séquences répétées peuvent adopter différentes structures

secondaires de l’ADN (pour revue, (Mirkin, 2006)).

Dans les systèmes modèles, la réplication est clairement impliquée dans l’expansion

des répétitions. En effet, la stabilité des répétitions de tri-nucléotides dépend de leur

orientation par rapport aux origines de réplication, que ce soit chez la bactérie, la levure ou

dans les cellules humaines en culture (pour revue, (Mirkin & Mirkin, 2007)). De plus, des

mutations dans la machinerie de réplication chez la bactérie ou la levure, augmentent

l’instabilité des répétitions de tri-nucléotides (pour revue, (Mirkin & Mirkin, 2007)). Un des

modèles, utilisé actuellement, suggère que les expansions ou les contractions de répétitions

ont lieu au cours de la synthèse du brin continu après un blocage de fourche de

réplication et le redémarrage dans la séquence répétée (Fig 46).


169

Figure 46. Modèle d’expansion des triplets de nucléotides. La réplication est tout d’abord

bloquée par la formation d’une structure secondaire de l’ADN sur le brin discontinu. Une réversion de fourche se produit sûrement, assistée par diverses protéines. L’extrémité 3’ du brin continu néo-synthétisé est sous forme simple-brin. Ainsi, il peut former à son tour une structure secondaire de l’ADN en épingle à cheveux. La réplication est alors prête à reprendre mais l’ADN est toujours structuré. Ainsi, le redémarrage de la fourche nécessite probablement d’autres protéines telles que des ADN polymérases spécialisées (Pol η par exemple) et des ADN hélicases spécialisées. Le redémarrage ayant lieu au niveau de la séquence répétée, des expansions peuvent survenir.

D’autre part, la coordination entre brin discontinu et brin continu peut être éliminée par le blocage de la réplication au niveau du brin discontinu, dû à la formation de la structure secondaire au niveau de la séquence répétée. La réplication peut redémarrer sur le brin discontinu après avoir laissé une brèche en face de la structure secondaire. Des contractions peuvent alors survenir si l’ADN polymérase impliquée dans la réparation de cette brèche ne prend pas en compte la partie structurée et l’élimine. (Adapté de (Mirkin & Mirkin, 2007) et de (Mirkin, 2007))

Comme nous venons de démontrer, par deux fois (articles I et II), un rôle de Pol η au

niveau de certaines séquences particulières de l’ADN (G4 et SFC), il serait intéressant de

déterminer si Pol η ou une autre ADN polymérase de la famille Y est également impliquée au

niveau des séquences répétées. Bien que, chez la levure, Pol η ne semble pas impliquée au

niveau des répétitions de tri-nucléotides (CNG)n (Dixon & Lahue, 2002), cela mérite d’être

testé chez l’homme. Pour cela, une première expérience préliminaire serait de déterminer la

sensibilité des cellules déficientes pour une ADN polymérase de la famille Y au

methotrexate, un inhibiteur de la synthèse du folate, connu pour induire l’expression des sites

fragiles rares puisqu’il est important pour la synthèse de certaines bases de l’ADN. Par la

suite, les mêmes expériences que celles réalisées sur les sites fragiles communs pourraient

être appliquées aux sites fragiles rares afin de mieux comprendre le rôle des ADN

polymérases de la famille Y au niveau de ces expansions de répétitions, et le cas échéant leur

implication éventuelle dans les maladies à expansion de triplets. Il serait notamment

intéressant d’analyser les résultats obtenus lors de l’expérience de CGH array décrite à la

page 148 au niveau des sites fragiles rares afin de voir l’effet de l’absence de Pol η. Par la

suite, des expériences in vitro à partir de protéines purifiées (ADN polymérases spécialisées et

ADN hélicases) ou d’extraits cellulaires déplétés permettraient de déterminer si ces protéines

Brin complémentaire

Répétition

Répétition

Répétition

Répétition

Répétition

Brin complémentaire

Pol η Brin

complémentaire


170

peuvent répliquer des séquences répétées pouvant adopter des structures en éplingle à

cheuveux (Mirkin, 2006).

De plus en plus d’études récentes ont permis de mieux comprendre le rôle des

protéines des points de contrôle et des protéines de réparation des cassures de l’ADN au

niveau du maintien de la stabilité des séquences particulières de l’ADN, notamment les

séquences riches en G et les sites fragiles communs. Cependant, très peu de données sont

connues quant au mécanisme de réplication de ces séquences d’ADN non-B. Les résultats

présentés ici permettent de proposer un rôle de l’ADN polymérase spécialisée Pol η dans le

maintien de ces séquences lors de la phase S. Le rôle éventuel de Pol η au niveau des

séquences répétées pourrait concerner directement l’expansion de ces séquences (Fig 46) ou

alors leur stabilité. Ainsi, la découverte du mécanisme d’intervention de cette ADN

polymérase soit dans la réplication de l’ADN soit dans la recombinaison homologue

constituerait une avancée importante dans la compréhension de l’expression de ces sites

fragiles.

Résultats C. Etude du rôle de Pol η dans la HR de l’ADN

171

C. Etude du rôle de Pol η dans la HR de l’ADN

Au vu des résultats précédents, il apparaît important de démontrer si Pol η intervient

dans la recombinaison homologue (HR) dans les cellules humaines. Ce rôle de Pol η a déjà

été montré in vitro et dans les cellules de poulet DT40. En effet, Pol η est capable in vitro

d’étendre une D-loop, un intermédiaire de la recombinaison homologue (McIlwraith et al,

2005), intéragit avec RAD51, et facilite aussi la capture du deuxième brin lors du processus

de recombinaison homologue (McIlwraith & West, 2008). Dans les cellules de poulet DT40,

l’absence de Pol η induit un défaut d’un facteur 10 des conversions géniques observées après

cassure de l’ADN (Kawamoto et al, 2005). Cependant, ce rôle reste encore controversé

puisque chez la levure, une ADN polymérase réplicative, Pol δ, serait préférentiellement

requise (Maloisel et al, 2008). Afin d’étudier le rôle de Pol η dans la recombinaison

homologue dans les cellules humaines, nous avons utilisé deux lignées cellulaires, les cellules

d’un ostéosarcome U2OS et les cellules XP-V, naturellement déficientes en Pol η. Différentes

approches, détaillées ci-dessous, ont été utilisées : par transfection transitoire du mutant

catalytiquement inactif Pol η Dead, par mesure du niveau d’expression des protéines de la HR

dans les cellules XP-V par rapport aux cellules complémentées, et en utilisant un substrat de

recombinaison homologue intégré dans les cellules U2OS ou dans les cellules XP-V.

1. Analyse d’un mutant catalytiquement inactif de Pol η

a- Validation biochimique du mutant Pol η Dead

Afin de construire le mutant catalytiquement inactif de Pol η, nous avons réalisé une

mutagénèse dirigée pour muter deux acides aminés de la triade du site catalytique en

alanine (D115A, E116A) (article II, figure supplémentaire 1A). Nous avons ensuite vérifié

que ce mutant était incapable de répliquer une lésion CPD (un dimère de thymines, induit

par les radiations UV), contrairement à la forme Pol η WT (article II, figure supplémentaire

1B). Une autre manière de valider in vivo le mutant catalytiquement inactif de Pol η serait

d’étudier la sensibilité aux UVC des cellules U2OS transfectées par un vecteur codant soit

pour Pol η WT, soit pour Pol η Dead. Les cellules exprimant Pol η Dead devraient être plus

sensibles que les cellules exprimant Pol η WT lors d’un test de clonogénie après irradiation

UVC.


172

b- Localisation nucléaire de la protéine mutée Pol η Dead

Ensuite, nous avons analysé la localisation cellulaire de Pol η et de Pol η Dead.

Pour cela, des cellules U2OS ont été transfectées par un vecteur pcDNA3.1.Hygro exprimant,

avec une double étiquette FLAG en N-terminal, soit la forme sauvage soit la forme mutée de

Pol η. 48h après transfection, ces cellules ont été traitées ou non avec 10J/m² d’UVC. 5h

après traitement, nous avons analysé la localisation en foyers des deux formes de Pol η par

immunofluorescence (Fig 47). Pol η se localise en petits foyers ponctuels dans le noyau dans

la majorité des cellules (70% environ) seulement après irradiation UV (Fig 47A et

(Kannouche et al, 2002)). Cette localisation après irradiation UV est retrouvée pour le mutant

Pol η Dead (Fig 47B). En absence de radiation UV, Pol η sauvage se localise de manière

diffuse dans le noyau dans la majorité des cellules, seules 15 % des cellules présentent des

petits foyers ponctuels. Cependant, même en absence de dommage exogène de l’ADN, Pol η

Dead se localise en plus gros foyers dans environ 40% des cellules, suggérant la présence de

fourches de réplication bloquées (Fig 47B).

Figure 47. Localisation en foyers de Pol η WT après UVC et de Pol η Dead même en

absence de dommage exogène de l’ADN. Les cellules U2OS sont transfectées au phosphate de calcium avec 25µg de vecteur codant soit pour FLAG-Pol η WT, soit pour FLAG-Pol η Dead 24h après ensemencement à 500 000 cellules dans une boîte de 10cm de diamètre. 24h après transfection les cellules sont traitées avec 10J/m² d’UVC puis, fixées 5h après traitement avec une solution de paraformaldéhyde 2%, perméabilisées et hybridées avec l’anticorps anti-FLAG (FLAG M2, Sigma, 1/100) pendant 1h, puis avec un anticorps alexa-fluor 488 (Fischer, 1/1000) pendant 1h. Le montage avec du Vectashield-Dapi permet de marquer les noyaux des cellules.

c- Co-localisation de Pol η Dead avec des protéines de la HR

Afin de déterminer si la présence de foyers Pol η Dead en absence de dommage

exogène de l’ADN est due à un blocage de fourche de réplication et/ou à des dommages

endogènes de l’ADN, nous avons analysé le marquage de l’anneau de processivité PCNA et

-UV +UV -UV +UV

DAPI DAPI DAPI DAPI

FLAG-eta WT FLAG-eta WT FLAG-eta Dead FLAG-eta Dead

Pol η WT Pol η Dead A B


173

du marqueur des cassures de l’ADN γH2AX, en immunofluorescence, dans les cellules U2OS

transfectées par un vecteur codant soit pour Pol η WT, soit pour Pol η Dead. Seuls les foyers

de Pol η Dead, observés avec l’anticorps anti-FLAG, en absence de dommage exogène,

co-localisent avec les foyers PCNA et γH2AX (Fig 48). De plus, trois protéines de la HR,

RAD51, BRCA1 et BACH1 sont recrutées au niveau des foyers Pol η Dead (Fig 48).

En revanche, aucune co-localisation entre Pol η Dead et Pol α n’a été observée.

Figure 48. Co-localisation des foyers de Pol η Dead et des protéines de la recombinaison homologue en absence de dommage exogène de l’ADN. Les cellules U2OS sont transfectées au phosphate de calcium avec 25µg de vecteur codant soit pour FLAG-Pol η WT, soit pour FLAG-Pol η Dead 24h après ensemencement à 500 000 cellules dans une boîte de 10cm de diamètre. 48h après transfection les cellules sont fixées avec une solution de paraformaldéhyde 2%, perméabilisées et hybridées avec l’anticorps anti-FLAG (FLAG M2, Sigma, 1/100) et soit l’anticorps anti-PCNA (Abcam ab18197, 1/500), soit anti-γH2AX (Upstate Biotechnology, JBW 301, 1/500), soit anti-RAD51 (Calbiochem P1C130, 1/500) soit anti-BRCA1 (donné par Ralph Scully, Boston, 1/50), anti-BACH1 (Abcam, ab16608, 1/300) pendant 1h, puis avec un anticorps alexa-fluor 488 ou alexa-fluor 594 (Fischer, 1/1000) pendant 1h. Le montage avec du Vectashield-Dapi permet de marquer les noyaux des cellules.

DAPI FLAG BRCA1 Merge

DAPI FLAG BACH1 Merge

DAPI FLAG RAD51 Merge

DAPI FLAG γH2AX Merge

DAPI FLAG PCNA Merge


174

Une hypothèse permettant d’expliquer l’ensemble de ces résultats est de considérer

qu’en absence d’une ADN polymérase eta fonctionnelle, les séquences particulières de l’ADN

pourraient ne pas être correctement répliquées, entraînant par conséquent des blocages de

fourches de réplication (marquage PCNA). Ces fourches de réplication bloquées pourraient

dégénérer en cassures de l’ADN (marquage γH2AX). Les protéines de la recombinaison

homologue seraient alors recrutées pour réparer ces cassures (marquage RAD51, BRCA1,

BACH1). Par contre, en présence de Pol η sauvage, les séquences particulières sont

répliquées correctement, peut-être plus lentement, expliquant la localisation dans 15% de

cellules de Pol η en petit foyers qui co-localisent avec PCNA (Kannouche et al, 2002). Mais

les fourches de réplication ralenties par la présence de Pol η, de faible processivité, et par la

présence des structures secondaires de l’ADN, ne s’effondreraient pas, ne conduisant pas par

conséquent à une accumulation de cassures et à un recrutement des protéines de la HR.

En accord avec un rôle de Pol η au cours de la phase S au niveau des séquences

difficiles à répliquer, le point de contrôle de phase S est activé dans les cellules

transfectées par le mutant Pol η Dead, contrairement aux cellules transfectées par Pol η

WT. En effet, nous avons observé l’activation de la kinase majeure de ce point de contrôle,

Chk1, par phosphorylation sur la sérine 345, lors des analyses par western-blot (Fig 49).

Figure 49. Activation du point de contrôle de phase S après transfection transitoire d’un vecteur codant pour Pol η Dead. Les cellules U2OS sont transfectées par la méthode au phosphate de calcium avec 25µg de vecteur codant soit pour FLAG-Pol η WT, soit pour FLAG-Pol η Dead 24h après ensemencement à 500 000 cellules dans des boîtes de 10cm de diamètre. 48h après transfection, les cellules sont lysées en présence d’anti-phosphatases. 100µg de protéines totales sont déposés sur un gel SDS/PAGE 10%. La migration est réalisée à 120V pendant 1h30 et le transfert à 100V pendant 2h. Le blocage des membranes PVDF est réalisé dans une solution de TBST 0,1% triton contenant 3% de lait, 3% de BSA et des inhibiteurs de phosphatases. Les membranes sont incubées pendant au moins 2h avec l’anticorps primaire anti-Chk1 (Cell Signalling, 1/1000) ou anti-P-Chk1 (Cell Signalling 1/1000) ou anti-FLAG (Sigma M2, 1/5000) puis avec l’anticorps secondaire couplé à HRP pendant 1h à température ambiante. La révélation avec de l’ECL (Piece) permet d’obtenir les résultats présentés montrant une activation de Chk1 par phosphorylation après expression de Pol η Dead. Le niveau d’expression de Chk1 phosphorylé est comparé au niveau d’expression de Chk1.

Pol η WT Pol η DeadNT Vide

Flag-Pol η

P-Chk1

Chk1

Pol η WT Pol η DeadNT Vide

Flag-Pol η

P-Chk1

Chk1


175

De plus, comme lors de l’extinction de Pol η, la dynamique des foyers de

réplication est perturbée après transfection du mutant Pol η Dead contrairement à Pol η

WT. En effet, le nombre de cellules présentant des foyers PCNA de début de phase S est

augmenté après transfection du mutant Pol η Dead alors que le nombre de cellules avec des

foyers de fin de phase S diminue (Fig 50).

Figure 50. Modification de la dynamique de réplication en présence de Pol η Dead. Les cellules U2OS sont transfectées au phosphate de calcium avec 3µg de vecteur codant soit pour FLAG-Pol η WT, soit pour FLAG-Pol η Dead 24h après ensemencement à 150 000 cellules dans des boîtes de 6 puits. 48h après transfection, les cellules sont fixées avec une solution de paraformaldéhyde 2%, perméabilisées et hybridées avec l’anticorps anti-PCNA (Abcam ab18197, 1/500) pendant 1h, puis avec un anticorps alexa-fluor 594 (Fischer, 1/1000) pendant 1h. Le montage avec du Vectashield-Dapi permet de marquer les noyaux des cellules. La quantification du nombre de cellules avec des foyers de début et de fin de phase S a été réalisée à partir de l’analyse de 3 expériences indépendantes sur plus de 100 cellules à chaque fois. Les barres d’erreur représentent les écart-types.

Ces derniers résultats suggèrent donc un rôle de Pol η plutôt au cours de la

réplication, c’est-à-dire en amont de la recombinaison homologue.

2. Augmentation de l’expression des protéines de la HR dans les cellules XP-V

Afin de valider ces résultats par une autre approche et dans un autre modèle cellulaire,

nous avons analysé l’expression des protéines de la HR dans les cellules XP-V et dans les

cellules XP-V + Eta qui expriment de manière stable l’ADN complémentaire (ADNc) de

Pol η sauvage.

Dans un premier temps, nous avons extrait les ARN de ces deux types cellulaires, puis

nous les avons rétro-transcrit en ADNc. Nous avons ensuite réalisé une PCR quantitative en

temps réel avec différentes sondes ciblant les gènes POLA et POLD codant pour les ADN

Vecteur vide

Pol ηWT

Pol ηDead

Vecteur vide

Pol ηWT

Pol ηDead

Cellules avec des foyers de début de phase S (%)

Cellules avec des foyers de fin de phase S (%)

Vecteur vide

Pol ηWT

Pol ηDead

Vecteur vide

Pol ηWT

Pol ηDead




176

polymérases réplicatives, les gènes POLH, POLI, POLK et REV1 codant pour les ADN

polymérases de la famille Y, le gène POLQ codant pour l’ADN polymérase Pol θ, et les gènes

RAD51 et BACH1 codant pour les protéines de la recombinaison homologue. Nous avons

observé des baisses de 30 à 40% des transcrits POLA, POLD, POLI et POLQ en absence de

Pol η lors de l’analyse de trois couples d’extraits XP-V/XP-V+Eta réalisés à différents temps

après leur mise en culture (Fig 51A). Cependant, ces variations ne sont pas significatives

puisqu’elles n’ont pas été retrouvées lors des analyses western-blot (Fig 51B). Il est plus

intéressant de préciser que nous avons observé une augmentation de 20 à 50% des

transcrits de deux protéines de la recombinaison homologue, RAD51 et BACH1, en

absence de Pol η dans les mêmes couples d’extraits XP-V/XP-V+Eta (Fig 51A). Ce résultat a

été confirmé par western-blot (Fig 51B) ; nous avons observé une augmentation d’environ

deux fois de RAD51 et d’environ trois fois de BACH1 en absence de Pol η par rapport aux

cellules complémentées.

Figure 51. Analyse de l’expression des ADN polymérases humaines et des protéines de la

recombinaison homologue, par PCR quantitative et par western-blot dans des couples d’extraits XP-V/XP-V+Eta. (A) Les ARN ont été extraits de couples XP-V/XP-V+Eta à trois moments différents après leur mise en culture. Ces ARN ont ensuite été rétro-transcrits. Les analyses par PCR quantitative en temps réel ont été réalisées avec différentes sondes spécifiques de POLA, POLD, POLH, POLI, POLK, REV1, POLQ, RAD51, BACH1. Les résultats ont été normalisés par rapport aux gènes de ménage (YWHAZ, HPRT) et comparés aux valeurs obtenues pour les extraits XP-V+Eta. (B) Des couples d’extraits protéiques XP-V/XP-V+Eta, réalisés à d’autres temps après leur mise en culture, ont été analysés par western-blot. Les membranes ont été hybridées par l’anticorps anti-Pol α (Abcam 31777, 1/200), anti-BACH1 (Abcam, ab16608, 1/1000), anti-Pol η (Abcam, 17725, 1/1000), anti-Pol ι (donné par Roger Woodgate, NIH Bethesda, 1/2500), anti-RAD51 (Calbiochem PC130, 1/500), anti-Actine (Chemicon C4, 1/10000). Les quantifications entre XP-V/XP-V+Eta normalisées par l’Actine ont été réalisées via le logiciel ImageQuant.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,6

1,8

POLA POLD POLH POLI POLK REV1 POLQ RAD51 BACH1

XP-V

XPV + Eta

Pol α

Pol η

ACTINE

RAD51

BACH1

XP-V XP-V + η

X 0,8

X 2,4

X 3,2

Pol ι

Pol η

ACTINE

X 1,3

2,0

Expression des transcrits A B

1,4


177

3. Etude de la HR dans deux modèles cellulaires différents

Suite à ces résultats, nous proposons l’hypothèse suivante qu’il serait intéressant de

tester : en absence de Pol η, des cassures de l’ADN seraient créées lors de la réplication,

nécessitant l’intervention de la recombinaison homologue en phasse S et G2 pour être

réparées. Ceci suggère que :

- soit Pol η est impliquée dans la HR : alors, en son absence, les cassures de l’ADN

ne peuvent pas être complètement réparées d’où l’accumulation des protéines de la HR. Nous

devrions observer une baisse des évènements de conversion génique mesurés via l’utilisation

d’un substrat de recombinaison intégré dans le génome.

- soit Pol η n’intervient pas dans la HR : alors, en son absence, les séquences

particulières de l’ADN ne peuvent pas être répliquées correctement, conduisant à des blocages

de fourches de réplication, puis à leur effondrement et donc à la présence de cassures de

l’ADN. Les protéines de la HR seraient alors recrutées pour réparer ces cassures de l’ADN.

Nous ne devrions observer aucune variation des conversions géniques mesurées par

l’utilisation d’un substrat de recombinaison intégré dans le génome après une cassure

double-brin dans le substrat.

Afin de tester cette hypothèse, nous avons initié l’analyse des évènements de

conversion génique dans deux types cellulaires humains, les cellules U2OS et les cellules

XP-V, contenant deux substrats de HR différents, intégrés dans le génome.

a- Analyse des évènements de conversion génique dans les cellules U2OS

Le substrat de recombinaison homologue intégré en copie unique dans les cellules

U2OS (Puget et al, 2005) permet de déterminer les évènements de réparation d’une cassure

double-brin induite spécifiquement dans le substrat par conversion génique en mesurant par

cytométrie en flux les cellules exprimant la GFP. Avec ce substrat, les évènements de

conversions géniques longues qui ont lieu uniquement entre chromatides homologues sont

mesurés en testant la sensibilité des cellules à la Blasticidine (Fig 52).


178

Figure 52. Substrat de recombinaison homologue intégré en copie unique dans les

cellules U2OS (Puget et al, 2005). Ce substrat contient deux copies inactives du gène GFP : l’une est tronquée puisqu’il manque les 12 premiers acides aminés et l’autre a été inactivée par insertion d’un site de coupure unique pour l’enzyme I-SceI qui introduit un codon stop prématuré. Après transfection d’un plasmide codant pour l’endo-nucléase I-SceI, la cassure double-brin générée dans la deuxième copie inactive du gène GFP va induire des évènements de conversion génique. Ces évènements peuvent être des conversions géniques courtes qui sont la résultante des évènements de recombinaison au sein de la même chromatide ou entre chromatides homologues. La deuxième copie du gène GFP alors réparée, devient fonctionnelle et les cellules expriment la protéine fluorescente verte. Ce substrat contient aussi deux exons inversés (A et B), codant pour la résistance à la Blasticidine. Puisque dans le substrat initial, ces exons sont inversés, le gène ne s’exprime pas. Après cassure de l’ADN par I-SceI, des évènements de conversion génique longue entre chromatides sœurs permettent de dupliquer les exons et donc de permettre la résistance à la Blasticidine. Les cellules expriment la GFP et sont en plus résistantes à l’antibiotique.

Nous avons donc utilisé ce substrat afin de mesurer les évènements de conversion

génique en absence de Pol η. Pour cela, nous avons utilisé des transfections transitoires de

siRNA dirigés contre l’ARNm de Pol η (GCTGGAATTTCACACAATA) ou contre l’ARNm

de BACH1 (GTACAGTACCCCACCTTAT), seuls ou en association, ainsi qu’un siRNA

contrôle (Eurogentec). La technique utilisée est un peu complexe puisqu’elle nécessite deux

transfections avec deux agents différents ainsi que deux divisions successives (Fig 53).

site ISceI

==>> ccaassssuurree ddoouubbllee--bbrriinn

GFP AB

AB

intrachromatide

interchromatide

““ccoouurrttee””

ccoonnvveerrssiioonn ggéénniiqquuee

GGFFPP ++

GFP AB

““lloonngguuee””

ccoonnvveerrssiioonn ggéénniiqquuee

GFP ABAB

AB

AB

interchromatide

==>> dduupplliiccaattiioonn ddeess eexxoonnss

I-SceI

site ISceI

==>> ccaassssuurree ddoouubbllee--bbrriinn

GFP

GFP GFP

GFP GFP

GFP GFP

GFP GFP

I-SceI

GGFFPP ++ eett BBssdd RR


179

Figure 53. Protocole d’analyse des évènements de conversion génique dans les cellules

U2OS. Les cellules U2OS sont ensemencées à 150 000 cellules par puits dans des boîtes 6 puits 24h avant d’être transfectées avec 100nM de siRNA à la lipofectamine 2000. 24h après transfection, les cellules sont divisées et ensemencées à 100 000 cellules par puits, puis transfectées 10h après avec 3µg de vecteur exprimant I-SceI au phosphate de calcium. 72h après la division initiale, des extraits sont réalisés pour mesurer l’efficacité d’extinction des protéines et l’efficacité de transfection d’I-sceI par western blot. De plus, 10 000 et 50 000 cellules sont ensemencées en duplicats dans des boites de 10cm pour étudier la résistance à la Blasticidine. La Blasticidine est ajoutée à 10µg/mL le lendemain de l’ensemencement. Les cellules seront colorées au cristal violet environ 20 jours après traitement. 5 jours après la transfection du vecteur codant pour I-SceI, le pourcentage de cellules exprimant la GFP est mesuré par cytométrie en flux.

En utilisant cette technique, nous n’avons pas pu obtenir de résultats

reproductibles, ce qui est certainement dû à la complexité de la technique (deux divisions et

deux transfections successives) ainsi qu’à la faible reproductibilité d’extinction des protéines

d’intérêt par siRNA. Un exemple, le plus représentatif, mais à confirmer, de ce que nous

avons observé, est représenté sur la figure 54.

Au cours de ces expériences, nous avons majoritairement observé une légère baisse

des évènements de conversion génique après extinction de Pol η et de BACH1 (10 et 15%),

suggérant une faible implication de ces protéines dans la HR dans les cellules humaines

(Fig 54A). Or BACH1 semble critique pour la HR puisqu’une autre équipe a démontré que sa

déplétion conduit à une baisse de HR d’un facteur 10 (Litman et al, 2005). Cependant, les

études n’ont pas été faites avec le même type cellulaire, ni avec le même substrat de

recombinaison homologue, ce qui pourrait expliquer les divergences des résultats. Cette

baisse est fortement augmentée (environ 50%) après extinction simultanée des deux protéines,

suggérant une coopération fonctionnelle de ces deux protéines au niveau de la recombinaison

homologue (Fig 54A). De manière intéressante, nous avons observé, en absence de Pol η, une

augmentation d’un facteur 4 des évènements de conversion génique longue. Après extinction

simultanée de Pol η et BACH1, ces évènements sont stimulés d’un facteur 15 (Fig 54A). Les

conversions géniques longues ne sont pas fidèles puisqu’elles résultent de la duplication d’une

partie du substrat de HR. Ainsi, ces résultats préliminaires suggèrent que Pol η et BACH1

Division 150 000 cellules par puits

T0

Transfection des siRNAs (100nM) à la lipofectamine 2000

T24h

Division 100 000 cellules par puits

T48h

Transfection ISceI au phosphate de calcium

T56h

- Extraits pour western-blot ( 48h après siRNA et 16h

après ISceI) - 10 000 et 50 000 cellules par

P100 pour résistance à la blasticidine (duplicats)

T72h

Analyse au FACS (5 jours après ISceI)

T168h


180

n’interviendraient pas dans la réparation des cassures de l’ADN par HR mais plutôt qu’elles

seraient requises pour éviter des évènements de recombinaison homologue aberrante et non

fidèle. De manière similaire, en absence de cassure induite, les évènements de longue

conversion génique spontanés sont augmentés d’un facteur 2 en absence de Pol η et d’un

facteur 8 en absence de Pol η et BACH1 (Fig 54B). Ces résultats suggèrent donc que Pol η et

BACH1 seraient requises, même en absence de stress exogène, pour éviter les évènements de

HR aberrants.

Figure 54. Analyse des évènements de conversion génique après transfection des siRNA

Eta et BACH1 dans les cellules U2OS. Le tableau A présente les résultats obtenus pour une expérience de mesure de conversions géniques courtes et longues après transfection de siRNA contrôle, Eta, BACH1 ou Eta + BACH1, suite à l’induction d’une cassure par transfection d’un vecteur codant pour I-SceI. La figure B présente une photographie du résultat de résistance à la Blasticidine après transfection des différents siRNA, en spontanné, c’est-à-dire sans induction de cassures. Les colonies ont été colorées au cristal violet 20 jours après traitement. Le western-blot en C présente les efficacités d’extinction des protéines d’intérêt 48h après transfection des siRNA.

Il est important de noter que lors de cette expérience, l’extinction de Pol η après

simple transfection de siRNA dirigé contre l’ARNm de Pol η n’est pas efficace alors que la

double extinction et l’extinction de BACH1 sont quasiment totales (Fig 54C). Par conséquent,

les résultats observés en absence uniquement de Pol η sont à nuancer. Il est important de

souligner que les efficacités de transfection, obtenues au cours de cette expérience en

transfectant transitoirement 2,7µg de vecteur codant pour I-SceI et 0,3µg de vecteur codant

siRNA

contrôlesiRNA

EtasiRNA

Eta + BACH1siRNA BACH1

Conversions géniques longues spontanées (résistance à la Blasticidine)

B

C

siBACH1siEta

+ + + + -

- - - - -

- - - - + siCTR

BACH1

Pol η

PCNA

Induites

x2 x8 x2

6,1 x15 8 55% siRNA Eta + BACH1

0,2 x2 15 15% siRNA BACH1

1,7 x4 16 10% siRNA Eta

0,4 18 siRNA contrôle

Conversion génique longue

(%)

Conversion génique (%)

A


181

pour la GFP, étaient faibles mais similaires (environ 30%), et permettent donc de comparer

les résultats obtenus. Malheureusement, les écart-types entre les différentes expériences que

nous avons réalisées sont trop importants pour affirmer la validité de ces résultats.

Nous avons essayé de reproduire ces résultats dans les clones shRNA, afin de nous

affranchir de la transfection des siRNA. Malheureusement, nous n’avons jamais réussi à

observer une baisse de conversion génique quel que soit le contrôle positif utilisé

(RAD51/BACH1), probablement dû aux faibles efficacités de transfection du vecteur I-SceI

que nous obtenions.

D’autre part, l’utilisation de ce substrat intégré ne permet pas d’étudier la réparation

des cassures survenant uniquement en phase S, et notamment au niveau de séquences

particulières de l’ADN.

b- Analyse des évènements de conversion génique dans les cellules XP-V

Afin de contrecarrer ces problèmes techniques et d’essayer de déterminer si Pol η joue

un rôle dans la recombinaison homologue, nous avons utilisé un autre substrat de

recombinaison homologue intégré dans les cellules XP-V et dans les cellules MRC5

(Collaboration avec Patricia Kannouche, IGR, Villejuif).

Ce substrat de recombinaison homologue (Pierce et al, 1999), appelé DR-GFP, est

composé de deux copies inactives du gène GFP orienté en répétitions directes et séparées par

un marqueur de sélection de résistance à la Puromycine (Fig 55). Une des copies GFP

contient un site de coupure I-SceI. L’introduction de ce site génère une protéine tronquée

puisqu’un codon stop a été créé juste après le site I-SceI. Le deuxième gène GFP est aussi

tronqué en 5’ et en 3’. Deux types de produits de recombinaison homologue sont possibles :

les produits de conversion génique courte (Fig 55C) et les produits de délétion (Fig 55D). Les

produits de conversion génique courte résultent d’évènements de HR sans crossing-over et

utilisent l’homologie de séquence entre les deux copies de GFP, la deuxième copie GFP

servant de donneur. Les produits de délétion peuvent être dus à des évènements de conversion

génique longue avec cross-over ou au mécanisme SSA (Single Strand Annealing) au cours

duquel la séquence entre les deux copies de GFP est délétée. Alors que les évènements de

conversion génique courte restaurent une copie fonctionnelle GFP, les produits de délétion ne

possèdent que la partie 5’ de ce gène. Ainsi, par analyse en cytométrie en flux des cellules, il


182

est possible de mesurer les évènements de conversion génique courte en quantifiant le nombre

de cellules exprimant la GFP.

Figure 55. Substrat de recombinaison intégré dans les cellules XP-V et MRC5. (A) Le

gène modifié GFP exprime une protéine EGFP fusionnée à un signal de localisation nucléaire (noté N) et à un domaine Zinc-finger (noté Z). Le gène GFP modifié, appelé SceGFP, contient un site de restriction I-SceI ainsi qu’un codon stop souligné. (B) Dans le substrat de recombinaison homologue DR-GFP, la copie SceGFP est suivie par une autre copie tonquée en 5’ et 3’ du gène GFP, appelée iGFP. (C) Au cours des évènements de conversion génique courte, la cassure double-brin générée par I-SceI est réparée à partir de la copie iGFP située sur la même chromatide ou sur la chromatide sœur, restaurant une copie fonctionnelle GFP. (D) Les produits de délétion sont dus au mécanisme de recombinaison entre chromatides sœurs avec cross-over ou au mécanisme SSA.

Nous avons dans un premier temps validé le substrat intégré dans deux lignées

cellulaires, les cellules XP-V et les cellules MRC5 servant de contrôle, via la transfection d’un

siRNA dirigé contre l’ARNm de BACH1 (5’-GGAATTGCTAGATGGGAAA-3’). Lors

d’une première expérience préliminaire (voir protocole en annexe 4), nous avons observé une

baisse de 50% des évènements de conversion génique en absence de BACH1 dans le clone

cellulaire XP-V après cassure de l’ADN générée par I-SceI, suggérant que le substrat est bien

fonctionnel dans cette lignée cellulaire (Fig 56). En revanche, le niveau spontané de

conversion génique est anormalement élevé dans les cellules MRC5 suggérant que le clone

choisi n’est pas adapté pour notre étude. Un deuxième clone est en cours de validation.

B. Substrat de recombinaison homologue DR-GFP

C. Produits de conversions géniques courtes

D. Produits de délétion, médiés par l’homologie

A. Gène GFP modifié

B. Substrat de recombinaison homologue DR-GFP

C. Produits de conversions géniques courtes

D. Produits de délétion, médiés par l’homologie

A. Gène GFP modifié


183

D’autre part, Il serait aussi intéressant de valider ce substrat après transfection d’un siRNA

dirigé contre RAD51. Cette validation a été réalisée dans le laboratoire de Patricia Kannouche

(IGR, Villejuif), mais il apparaît important de reproduire cette expérience avec nos méthodes

de transfection et nos critères d’analyse.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

NT siBACH1

Figure 56. Analyse des conversions géniques dans les cellules XP-V. Les cellules sont

ensemencées à 100 000 cellules par puits, transfectées 24h après avec 100nM de siRNA ou non transfectées. 24h après les cellules sont transfectées avec 3µg de vecteur exprimant I-SceI au JetPEI. L’analyse des cellules exprimant la GFP est réalisée sur le FACScan (BD Dickinson) avec le logiciel Cell Quest Pro (BD Dickinson) 72h après expression d’I-SceI. Le pourcentage de cellules GFP positives donc présentant des évènements de conversion génique est présenté sur ce graphe.

Après validation d’un clone XP-V et d’un clone MRC5, nous envisageons de

déterminer le pourcentage de conversion génique en absence (XP-V) ou en présence (MRC5)

de Pol η, ainsi que dans les cellules XP-V complémentées soit par la forme sauvage de Pol η

soit par la forme mutée de Pol η. Si Pol η ne joue aucun rôle dans la recombinaison

homologue par conversion génique, alors les évènements de conversion génique ne devraient

pas varier.

4. Discussion des résultats préliminaires obtenus

L’ensemble de nos résultats suggère que Pol η joue plutôt un rôle en amont de la

recombinaison homologue. En effet, l’absence d’une ADN polymérase Pol η fonctionnelle

induit une augmentation des cassures de l’ADN ainsi qu’une augmentation de l’expression

des protéines de recombinaison et leur recrutement au niveau des cassures de l’ADN. Deux

expériences permettraient de conforter ces résultats : l’étude des échanges entre chromatides

sœurs et l’analyse des partenaires fonctionnels de Pol η et de Pol η Dead.

Conversion génique (%)

NT siBACH1


184

a- Etude des échanges entre chromatides sœurs

L’utilisation des substrats de recombinaison intégrés dans le génome ne permet

d’étudier que les évènements de réparation par conversion génique qui interviennent à un site

unique de cassure, générée à n’importe quel moment du cycle cellulaire. Ainsi, il serait

intéressant de déterminer si l’absence d’une protéine Pol η fonctionnelle induit des

évènements de recombinaison homologue de manière spontanée, au cours de la phase S,

sans dommage exogène de l’ADN. Pour cela, nous allons étudier les échanges entre

chromatides sœurs après transfection d’un vecteur codant pour Pol η WT ou pour Pol η Dead

dans des cellules U2OS. 10µM de BrdU seront incorporés pendant deux cycles cellulaire, ce

qui permettra de distinguer les chromatides sœurs après coloration. Un choc hypotonique avec

une solution KCl à 75mM est réalisé avant de fixer les cellules par trois lavages avec une

solution d’acide acétique/méthanol. Les métaphases sont ensuite colorées avec de l’acridine

orange à 70µg/mL. L’analyse des plaques métaphasiques colorées permettra de déterminer le

nombre d’évènements d’échange entre chromatides sœurs.

Une autre manière d’analyser les évènements spontanés de recombinaison homologue

serait d’utiliser le substrat de recombinaison homologue intégré dans les cellules U2OS. En

effet, la résistance des cellules à la blasticidine, après transfection d’un vecteur codant soit

pour la forme sauvage soit pour la forme mutée de Pol η, permettrait de déterminer la

fréquence des évènements de conversion génique longue entre chromatides sœurs.

b- Existe-t-il différents complexes impliquant Pol η WT et Pol η Dead ?

Afin de vérifier le rôle de Pol η en amont de la recombinaison homologue, dans la

réplication, nous allons réaliser des immuno-précipitations sur la fraction chromatinienne

après transfection d’un vecteur codant soit pour Pol η WT, soit pour Pol η Dead. Si Pol η

joue vraiment un rôle en amont de la réparation par recombinaison homologue, les protéines

de la réplication telles que PCNA, Claspin, P-Chk1, seront recrutées avec Pol η WT mais

aussi plus fortement avec Pol η Dead dû à son actvité de mutant dominant négatif.

c- Quel serait le rôle de Pol η dans le redémarrage des fourches de

réplication bloquées ?

Bien que les résultats obtenus ne soient pas en faveur d’un rôle de Pol η dans la

réparation « globale » des cassures double-brin de l’ADN par recombinaison homologue,

l’implication de Pol η dans le redémarrage des fourches de réplication par recombinaison


185

homologue est à prendre en compte. En effet, la recombinaison homologue apparaît

importante pour le redémarrage des fourches de réplication. D’une part, l’absence de la

majorité des protéines de la recombinaison homologue telles que RAD51, BRCA1, BRCA2,

BLM, est létale chez la souris (Chester et al, 1998; Gowen et al, 1996; Lim & Hasty, 1996;

Sharan et al, 1997; Shen et al, 1998b; Tsuzuki et al, 1996). De plus, les cellules de hamster

(CHO) déficientes pour des protéines de la recombinaison homologue progressent plus

lentement au cours du cycle cellulaire (Fuller & Painter, 1988; Griffin et al, 2000; Tebbs et al,

1995), sont hyper-sensibles à des agents bloquant la réplication (Lundin et al, 2002),

présentent des niveaux élevés d’apoptose spontanée (Hinz et al, 2003), une forte instabilité

chromosomique (Cui et al, 1999; Griffin, 2002), ainsi que de fort taux de mutations (Fuller &

Painter, 1988; Thacker et al, 1994). D’autre part, les agents inhibant la réplication de l’ADN

induisent la recombinaison homologue (Arnaudeau et al, 2000; Saintigny et al, 2001), ainsi

que la formation de foyers RAD51 (Lundin et al, 2002; Lundin et al, 2003; Saintigny et al,

2001). Par conséquent, la recombinaison homologue semble être un mécanisme clé pour

assister le redémarrage des fourches de réplication bloquées. Plus récemment, il a été montré

que des cellules de hamster déficientes pour la recombinaison homologue présentent des

vitesses de fourche de réplication au niveau du génome global plus faibles que des cellules

proficientes pour la recombinaison homologue (Daboussi et al, 2008). Cette baisse de vitesse

de réplication est toutefois compensée par une augmentation de l’activation des origines de

réplication (Daboussi et al, 2008). Ainsi, la recombinaison homologue jouerait aussi un rôle

important dans le contrôle de la vitesse de réplication et dans la distribution des évènements

d’initiation.

Chez la bactérie, les fourches de réplication bloquées pourraient être réversées et

former des structures en « chicken foot » pouvant conduire à une réparation, soit par synthèse

translésionnelle, soit par recombinaison homologue (pour revue, (McGlynn & Lloyd, 2002)).

Bien qu’aucune évidence n’existe, il est possible que le même mécanisme de réversion de

fourches de réplication ait lieu dans les cellules humaines. Il est important de souligner que

des lignées cellulaires humaines traitées avec de l’hydroxyurée, qui inhibe la réplication de

l’ADN, présentent une accumulation de cassures double-brin de l’ADN au niveau des

fourches de réplication (Lundin et al, 2002). Les deux mécanismes de recombinaison, la

recombinaison homologue et la recombinaison par jonction d’extrémités non homologues, ont

été impliqués au niveau de la réparation des cassures induites par l’hydroxyurée (Lundin et al,

2002). En revanche, lorsque les cellules sont traitées avec de faibles doses de thymidine qui

diminuent uniquement le pool en dCTP et qui ralentissent seulement la réplication de l’ADN,


186

sans l’arrêter, aucune cassure double-brin n’est observée (Bjursell & Reichard, 1973). Dans ce

cas là, seule la recombinaison homologue est impliquée dans le redémarrage des fourches. Par

conséquent, une partie des évènements de recombinaison homologue semble spécifiquement

impliquée au niveau du redémarrage des fourches de réplication bloquées qui ne présentent

pas de cassures double-brin détectables.

Nous avons vu que l’absence de Pol η n’est pas létale, mais diminue la progression

des cellules au cours du cycle cellulaire. Ainsi, Pol η ne semble pas être une protéine clé des

mécanismes de recombinaison homologue permettant de réparer les cassures de l’ADN.

Cependant, elle pourrait être impliquée dans le redémarrage des fourches de réplication

bloquées à certains endroits du génome, comme par exemple, par les structures secondaires de

l’ADN. Ces blocages de fourches particuliers pourraient entraîner la formation de structures

en « chicken foot » stimulant la recombinaison homologue pour redémarrer les fourches de

réplication.

Chez la levure, la recombinaison homologue dépendante de Rad51 est essentielle pour

redémarrer les fourches de réplication bloquées suite à un stress réplicatif induisant

l’activation du point de contrôle de phase S médié par les protéines Mec1 er Mrc1 (ATR et

Claspin dans les cellules humaines) (Alabert et al, 2009). De plus, ce point de contrôle

permettrait aussi d’inhiber la recombinaison homologue au niveau des cassures double-brin de

l’ADN en présence d’un stress réplicatif en empêchant la dégradation des extrémités 5’ des

cassures de l’ADN (Alabert et al, 2009; Barlow & Rothstein, 2009). Ce mécanisme

permettrait par conséquent de réguler la recombinaison homologue afin d’éviter tout effet

délétère de celle-ci.

En accord avec un rôle potentiel de Pol η au niveau du redémarrage des fourches de

réplication par recombinaison homologue après un stress réplicatif, nous avons remarqué que

l’absence de Pol η « mime » l’absence de RAD51 dans les cellules humaines en terme de

dynamique de réplication (Fig 57C-D). En effet, le nombre de cellules présentant des foyers

de début de phase S (marquage PCNA) est augmenté alors que le nombre de cellules

présentant des foyers de fin de phase S est diminué en absence de RAD51. Le phénotype

intermédiaire observé en absence de la recombinase RAD51 est certainement dû à la faible

efficacité du siRNA qui ne permet pas une extinction totale de la protéine (Fig 57A) mais qui

entraîne toutefois une sensibilité des cellules aux radiations ionisantes (Fig 57B) (Collis et al,

2001; Taki et al, 1996). Ceci suggère donc que Pol η et RAD51 pourraient agir dans la

même voie au cours de la phase S du cycle cellulaire.


187

Figure 57. Analyse de la répartition des foyers de réplication en absence de RAD51.

(A) 100µg de protéines totales ont été déposées sur un gel SDS-PAGE 10%. La migration est réalisée à 120V pendant 1h30 et le transfert pendant 2h à 100V. Le blocage des membranes PVDF est réalisé dans une solution de TBST 0,1% triton contenant 3% de lait. Les membranes sont incubées sur la nuit avec un anticoprs dirigé contre RAD51 (Calbiochem PC130, 1/500), dirigé contre Pol η (Abcam ab17725, 1/1000), dirigé conte l’Actine (Chemicon International C4, 1/10000) puis avec l’anticorps secondaire couplé à HRP pendant une heure. La révélation avec de l’ECL (Pierce) permet d’observer une extinction totale de Pol η alors que l’extinction n’est que partielle pour RAD51 (siRNA 5'-TGTAGCATATGCTCGAGCG-3’). (B) Les cellules ont été ensemencées à 500 cellules par puits, puis traitées avec 2 ou 4Gy 24h après ensemencement et colorées au cristal violet 8 jours après. Les résultats de deux expériences sont présentés et les barres d’erreur correspondent aux écart-types. (C-D) Les cellules sont ensemencées à 100 000 cellules sur des lamelles dans des boîtes 6 puits puis transfectées 24h après avec 100nM de siRNA dirigés soit contre l’ARNm de Pol η soit contre l’ARNm de RAD51, soit avec un siRNA contrôle (Eurigentec) ou non transfectées (NT). Les cellules sont fixées avec une solution de paraformaldéhyde 2%, perméabilisées et incubées avec un anticorps anti-PCNA (Abcam ab18197, 1/500) pendant 1h puis avec l’anticorps secondaire Alexa-fluor 594 (Fischer, 1/1000) pendant 1h. Le montage avec du Vectashield DAPI permet de visualiser les noyaux des cellules.

Ces résultats préliminaires seront intégrés dans un prochain article concernant le

rôle de l’ADN polymérase eta humaine dans la recombinaison homologue.

Pol Eta

RAD51

NT siCTR siETA2

Actine

siRAD51

A

100

100 1 2 3 4

no txn

siCTR

siETA2siRAD51

Survie (%)

IR (Gy)

B

02468

1012141618

NT siCTR siETA2 siRAD51



C

0

5

10

15

20

25

NT siCTR siETA2 siRAD51NT siCTR siETA2 siRAD51


D

Pol Eta

RAD51

NT siCTR siETA2

Actine

siRAD51

A

Pol Eta

RAD51

NT siCTR siETA2

Actine

siRAD51Pol Eta

RAD51

NT siCTR siETA2

Actine

siRAD51

A

100

100 1 2 3 4

no txn

siCTR

siETA2siRAD51

Survie (%)

IR (Gy)

B

100

100 1 2 3 4

no txn

siCTR

siETA2siRAD51

Survie (%)

IR (Gy)

B

02468

1012141618




C

02468

1012141618




1012141618




C

0

5

10

15

20

25



D

0

5

10

15

20

25



0

5

10

15

20

25


5

10

15

20

25



D

188

DISCUSSION ET PERSPECTIVES

Discussion A. Un nouveau rôle inattendu pour Pol η

189

Mes travaux de thèse ont permis d’étudier les conséquences de la sous-expression des

ADN polymérases translésionnelles Pol η et Pol ι dans les cellules humaines et ont conduit à

l’identification d’un nouveau rôle de Pol η au cours de la phase S en absence de dommage

exogène de l’ADN. Dans cette partie du mémoire, nous allons approfondir la discussion de

ces résultats, d’une part au niveau de l’apport fondamental de ces données en termes

mécanistiques de la réplication des séquences particulières de l’ADN, d’autre part en ce qui

concerne les patients atteints du Xeroderma pigmentosum variant, chez qui de nouvelles

analyses de tissus sains et tumoraux seraient importantes, et enfin leur impact sur la régulation

de Pol η et son rôle dans la progression tumorale.

A. Un nouveau rôle inattendu pour Pol η

Suite aux données obtenues au cours de cette thèse, nous pouvons donc proposer deux

rôles indépendants pour Pol η : un rôle, déjà bien établi dans la littérature, au niveau de la

synthèse translésionnelle des dommages induits par les UV (dimères de thymines) et un

nouveau rôle au niveau du maintien de la stabilité des sites fragiles communs, qui peut

s’étendre à d’autres séquences particulières de l’ADN, telles que les séquences riches en G

susceptibles d’adopter des structures en G-quadruplex (Fig 57).

Figure 57. Modèle pour illustrer les deux rôles indépendants de Pol η dans le maintien de

la stabilité du génome. Pol η aurait deux rôles indépendants : un rôle au niveau de la synthèse translésionnelle des dimères de thymines induits par les UV, et un rôle au cours de la phase S dans le maintien de la stabilité des sites fragiles communs, qui pourrait être étendu à d’autres séquences particulières de l’ADN capables de former des structures d’ADN non-B. Les éléments permettant le recrutement de Pol η au cours de la synthèse translésionnelle ont été étudiés et la mono-ubiquitination de PCNA notamment semble importante. En revanche, il reste à déterminer quelles protéines permettent le recrutement spécifique de Pol η au niveau de ces séquences particulières de l’ADN. En se basant sur la littérature et sur nos propres données, nous pouvons proposer la mono-ubiquitination de PCNA, l’interaction avec l’ADN polymérase de la famille Y REV1, servant de plateforme, l’interaction avec des ADN hélicases spécialisées, telles que BACH1 et WRN, et/ou le recrutement via les protéines du point de contrôle de phase S.

^ Ub

TT

Synthèse translésionnelle des dommages UV

Maintien de la stabilité des sites fragiles communs

Pol η

Pol η

Pol η

REV1

Ub BACH1 WRN


190

1. Recrutement de Pol η au niveau des séquences particulières de l’ADN

Alors que les éléments divers permettant le recrutement de Pol η au niveau d’un

dimère de thymines ont beaucoup été étudiés, il reste maintenant à déterminer comment Pol η

est recrutée spécifiquement au niveau des séquences particulières de l’ADN. Plusieurs

hypothèses peuvent être envisagées (Fig 57).

a- La mono-ubiquitination de PCNA

Comme nous l’avons étudié dans l’introduction bibliographique (p.57), PCNA serait

mono-ubiquitinylé même en absence de dommage exogène de l’ADN au cours de la phase S

chez S. pombe (Frampton et al, 2006). Ainsi, les blocages de fourches de réplication au niveau

des sites naturels de pause, tels que les structures secondaires de l’ADN, pourraient induire la

mono-ubiquitination de PCNA. En accord avec ces résultats, des études in vitro à partir

d’extraits cellulaires humains ont permis de montrer que le blocage de fourches de réplication

par la présence d’une structure en épingle à cheveux induit la mono-ubiquitination de PCNA

au cours de la synthèse d’ADN (Schmutz et al, 2007). Il est donc légitime de penser que dans

les cellules humaines, la formation de structures secondaires au niveau des séquences

particulières de l’ADN puisse induire la mono-ubiquitination de PCNA. Il semblerait que

cette modification de PCNA augmente l’affinité des ADN polymérases de la famille Y pour

PCNA conduisant ainsi à un changement d’ADN polymérases entre les ADN polymérases

réplicatives et Pol η par exemple (Bi et al, 2006; Bienko et al, 2005; Guo et al, 2006a;

Kannouche et al, 2004; Watanabe et al, 2004). Par conséquent, il serait intéressant de tester si

la mono-ubiquitination de PCNA est requise pour le recrutement spécifique de Pol η au

niveau des séquences particulières de l’ADN au cours de la phase S du cycle cellulaire, en

testant dans un premier temps les régions riches en G et les SFC.

b- L’interaction avec REV1

Il a été montré récemment que Rev1 a un rôle prépondérant dans la TLS au cours de

la phase S (Edmunds et al, 2008). En effet, l’absence de Rev1 dans les cellules de poulet

DT40 conduit à des blocages des fourches de réplication plus fréquents après dommages de

l’ADN induits par les UV (Edmunds et al, 2008). En outre, le domaine C-terminal de REV1

est nécessaire pour la progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé

(Edmunds et al, 2008). Il est important de rappeler que le domaine C-terminal de REV1

contient deux UBM ainsi qu’un domaine de liaison aux autres ADN polymérases de la famille


191

Y (PBM) (Bienko et al, 2005; Guo et al, 2003). La complémentation des cellules déficientes

en Rev1 par un mutant délété du domaine PBM ou par un mutant délété des UBM, ne restaure

pas une progression normale des fourches de réplication après dommages de l’ADN

(Edmunds et al, 2008). Par conséquent, la liaison de REV1 aux autres ADN polymérases,

ainsi que sa liaison à de potentielles cibles ubiquitinylées, semblent cruciales dans ce

processus. Etant donné que REV1 peut interagir avec les autres ADN polymérases

translésionnelles (Guo et al, 2003; Ohashi et al, 2004; Tissier et al, 2004), cette protéine

pourrait servir « d’adaptateur » entre les ADN polymérases et PCNA comme semble le faire

l’ubiquitine. D’autre part, Rev1 apparait importante pour le maintien de la stabilité des

séquences répétées susceptibles d’adopter des structures en épingle à cheveux (Collins et al,

2007). Par conséquent, il serait pertinent de tester le rôle de REV1 dans le recrutement de

Pol η au niveau des séquences particulières de l’ADN au cours de la phase S du cycle

cellulaire.

c- L’interaction avec des ADN hélicases spécialisées

Nous avons vu au cours de l’introduction bibliographique que les ADN hélicases

BACH1 et WRN étaient impliquées au niveau du déroulement des séquences riches en G

susceptibles d’adopter des structures en G-quadruplex aussi bien in vitro qu’in vivo. De plus,

plusieurs données de la littérature indiquent que ces diverses protéines pourraient interagir ou

coopérer au niveau de ces structures. Ainsi, une interaction entre BACH1 et/ou WRN et

Pol η pourrait permettre le recrutement de cette ADN polymérase translésionnelle au niveau

des séquences particulières de l’ADN. En accord avec cette hypothèse, l’activité hélicase de

WRN est également importante pour le maintien de la stabilité des sites fragiles communs

(Pirzio et al, 2008). D’autre part, WRN, qui interagit avec l’ADN polymérase réplicative

Pol δ (Kamath-Loeb et al, 2001) et avec les ADN polymérases de la famille Y (Kamath-Loeb

et al, 2007), pourrait servir de « médiateur » et réguler le changement d’ADN polymérases au

niveau des séquences particulières de l’ADN.

d- Le recrutement par des protéines du point de contrôle de phase S

Il est important de rappeler que les ADN polymérases de la famille Y peuvent être

mono-ubiquitinylées au niveau des UBM (Bienko et al, 2005), mais aussi phosphorylées

comme cela a été observé pour Pol η et Rev1 (Chen et al, 2008; Sabbioneda et al, 2007). Ces

modifications post-traductionnelles pourraient jouer un rôle sur le recrutement des ADN


192

polymérases translésionnelles au niveau des machineries de réplication (Chen et al, 2008)

mais leurs fonctions précises restent encore à élucider. Par conséquent, l’interaction avec des

protéines du point de contrôle telles qu’ATR pourrait être importante afin de recruter Pol η au

niveau des séquences particulières de l’ADN. Des travaux récents, menés dans l’équipe par

Valérie Bergoglio, ont permis de montrer que l’extinction des protéines du point de

contrôle de phase S, telles que la Claspin, ATR ou RAD17 dans les cellules humaines,

induit la localisation de Pol η en foyers dans un plus grand nombre de cellules par

rapport aux contrôles en absence de dommage exogène de l’ADN (données non publiées).

Par conséquent ces diverses protéines pourraient jouer un rôle important dans le recrutement

de Pol η au niveau des zones difficiles à répliquer.

e- Le recrutement par un facteur de chargement de PCNA

Quatre facteurs de chargement de PCNA ont été identifiés à ce jour : i) le complexe

RFC, qui permet le chargement de PCNA au cours de la réplication de l’ADN ; ii) le

complexe Rad17-RFC, qui est impliqué dans la signalisation des dommages via le point de

contrôle ; iii) le complexe Ctf18/Chl12/RFC (noté par la suite Ctf18-RFC), qui intervient dans

la cohésion des chromatides sœurs ; iv) le complexe Elg1-RFC, qui est important pour la

stabilité du génome (pour revue, (Aroya & Kupiec, 2005)). Parmi ces quatre complexes de

chargement de PCNA, deux présentent un lien direct avec Pol η. En effet, Ctf18 stimule

l’activité de synthèse de Pol η et interagit physiquement avec Pol η dans les cellules

humaines (Shiomi et al, 2007). De plus, Ctf18-RFC jouerait un rôle dans la réponse aux

dommages de l’ADN en favorisant le changement d’ADN polymérases (Shiomi et al, 2007).

Ainsi, Ctf18-RFC pourrait reconnaitre les structures d’ADN non conventionnelles créées

par des blocages de fourche de réplication au niveau des sites de dommages de l’ADN, ou

intervenir au niveau des problèmes de cohésion engendrés, et pourrait alors recruter PCNA et

Pol η, mais aussi les autres protéines nécessaires au passage de ces structures (Shiomi et al,

2007). D’autre part, Elg1-RFC participe au maintien de la stabilité du génome puisqu’en

absence d’Elg1 la recombinaison inter ou intra-allélique et les réarrangements

chromosomiques sont fortement augmentés (pour revue, (Banerjee et al, 2007)). De plus, cette

protéine semble interagir avec PCNA mono-ubiquitinylé, USP1 et Pol η (communication

personnelle de K. Myung, Keystone « Genome instability and DNA repair », 2009). Par

conséquent, ELG1 pourrait permettre d’éviter les erreurs de réplication en éliminant PCNA

mono-ubiquitinylé de la chromatine via son interaction avec USP1. Dans ce cas là, Pol η ne


193

serait plus recrutée à la chromatine, permettant aux ADN polymérases réplicatives de

reprendre leur rôle. Ainsi, les deux facteurs de chargement de PCNA, Ctf18-RFC et

ELG1-RFC, pourraient jouer un rôle important dans le recrutement de Pol η au niveau des

structures particulières de l’ADN, mais aussi dans le changement suivant, permettant le retour

des ADN polymérases réplicatives pour reprendre leur rôle dans la réplication fidèle du

génome.

En conclusion, différents éléments pourraient permettre le recrutement spécifique de

Pol η au niveau des séquences particulières de l’ADN. La recherche des complexes formés

autour de Pol η après traitement ou non avec des faibles doses d’aphidicoline ou

d’hydroxyurée (permettant de ralentir la réplication et ainsi de favoriser les blocages de

fourches de réplication au niveau des séquences particulières de l’ADN) permettrait de mieux

appréhender le recrutement de Pol η au niveau des structures d’ADN non-B.

2. Modèle expliquant le rôle de Pol η au niveau des séquences particulières de l’ADN

Les différents résultats obtenus au cours de ma thèse semblent suggérer un rôle de

Pol η au niveau de la réplication des séquences particulières du génome, en amont des

évènements de recombinaison homologue éventuellement engendrés à ces régions.

En effet, l’extinction de Pol η par interférence ARN perturbe la dynamique de

réplication, observée par la modification de la répartition des cellules au cours de la phase S

du cycle cellulaire. De plus, la progression au cours de la fin de phase S, moment où sont

répliqués les sites fragiles communs, est perturbée en absence de Pol η. Bien que Pol η ne

semble pas intervenir au niveau de la réplication globale du génome, elle pourrait tout de

même jouer un rôle important dans la réplication de fin de phase S, et plus précisément au

niveau des séquences particulières de l’ADN. Les résultats des expériences de peignage

moléculaire de l’ADN au niveau du site FRA7H nous permettront de valider ou d’infirmer

notre hypothèse.

D’autre part, les expériences réalisées avec le mutant catalytiquement inactif de Pol η,

Pol η Dead, ont permis de reproduire les phénotypes observés dans les clones défcients en


194

Pol η au niveau de la dynamique de réplication. Ceci conforte l’idée que suite à l’expression

ectopique de la forme mutante, Pol η Dead exerce un rôle dominant-négatif sur la protéine

Pol η endogène. De plus, l’expression de Pol η Dead permet d’activer le point de contrôle de

phase S, suggérant que l’absence d’une protéine Pol η fonctionnelle perturbe la progression

des fourches de réplication. En outre, le mutant Pol η Dead se localise au niveau des fourches

de réplication bloquées (foyers PCNA), qui peuvent dégénérer en cassures double-brin de

l’ADN (visibles par marquage γ-H2AX), et ainsi recruter les protéines de la recombinaison

homologue (RAD51, BRCA1, BACH1) et cela même en absence de dommage exogène de

l’ADN, ce que ne fait pas la protéine Pol η WT. Enfin, le niveau d’expression des protéines

de la recombinaison homologue semble augmenté dans les cellules XP-V, naturellement

déficientes en Pol η, par rapport aux cellules XP-V complémentées avec l’ADN

complémentaire de Pol η. Ce résultat reste bien évidemment à être confirmé avec d’autres

couples de cellules XP-V.

L’ensemble de nos résultats me permet donc de proposer le modèle représenté sur la

figure 58 dans lequel Pol η jouerait un rôle en phase S, au cours de la réplication de l’ADN,

en amont de la recombinaison homologue induite par un blocage de fourche. En présence de

l’ADN polymérase eta sauvage et de ses partenaires fonctionnels, notamment les ADN

hélicases spécialisées, les structures secondaires rencontrées par les fourches de réplication

pourraient être déroulées et répliquées sans entraîner de cassures de l’ADN. En revanche, en

absence d’une ADN polymérase eta fonctionnelle, les fourches de réplication seraient

bloquées au niveau des séquences particulières du génome structurées en ADN non-B. Par

conséquent, une partie des fourches de réplication s’effondrerait conduisant à la formation de

cassures de l’ADN. Les protéines de la recombinaison homologue seraient alors recrutées au

niveau de ces cassures pour les réparer, probablement par conversion génique entre

chromatides sœurs afin de permettre un redémarrage de la réplication.


195

Figure 58. Modèle d’intervention de Pol η au niveau des séquences particulières de l’ADN. La situation en absence de Pol η réfère dans nos expériences à trois systèmes modèles : i) l’interférence ARN (siRNA ou shRNA dirigés contre les transcrits de Pol η) ; ii) les cellules de patients XP-V (gène POLH muté) ; iii) l’expression d’un mutant dominant négatif Pol η Dead. Lors de la réplication de l’ADN, un découplage entre ADN polymérases réplicatives et ADN hélicases peut se produire suite à un stress réplicatif, des stuctures d’ADN non-B peuvent alors se former sur le simple-brin d’ADN au niveau des séquences particulières (représentées en rouge). La présence de Pol η permettrait en coopération avec d’autres co-facteurs de continuer la réplication. En revanche, en absence de Pol η, les fourches seraient bloquées et des cassures de l’ADN créées. La chromatide sœur étant disponible au cours de la phase S, la recombinaison homologue pourrait alors intervenir pour réparer les cassures double-brin de l’ADN.

Des expériences réalisées in vitro (McIlwraith et al, 2005) ont montré que Pol η, et

non Pol δ ou Pol ι, est capable de synthétiser de l’ADN à partir d’une D-loop, un

intermédiaire de recombinaison homologue qui peut aussi être apparenté à une structure

secondaire de l’ADN. Ainsi, il peut sembler normal que Pol η contrairement à Pol δ, soit

capable de répliquer de tels substrats. D’autre part, les résultats obtenus in vivo dans le groupe

de Takeda montrent que l’absence de Pol η induit une baisse d’un facteur 10 de la fréquence

des évènements de conversion génique mesurés au niveau d’une cassure double-brin induite

En présence de Pol η En absence de Pol η

Pol η

REV1

Ub BACH1 WRN

Déroulement de la structure et réplication

REV1

Ub BACH1 WRN

Blocage de la fourche de réplication et cassures double-brin de l’ADN

Rad51

Rad55/ Rad57

Rad54

RPA

Rad52RPA

Recrutement des protéines de la recombinaison

homologue et réparation


196

dans un substrat de recombinaison qui est intégré dans le génome et contient un site unique de

coupure pour l’enzyme I-SceI (Kawamoto et al, 2005). Ces dernières expériences ont été

effectuées dans des cellules de poulet DT40, qui présentent un cycle cellulaire très court, une

forte proportion de cellules en phase S, ainsi qu’une protéine p53 non fonctionnelle. Ainsi, le

rôle de Pol η mis en évidence dans ces cellules pourrait être en partie dû à ces différentes

caractéristiques qui exacerbent la recombinaison homologue. Enfin, il est important de noter

que les échanges entre chromatides sœurs sont fortement augmentés après irradiation UV

dans les cellules XP-V comparés aux cellules XP-V complémentées par l’ADNc de Pol η

(Cleaver et al, 1999).

Ainsi, il s’avère qu’en absence d’une ADN polymérase eta fonctionnelle, la

recombinaison homologue est amplifiée afin de réparer les nombreuses cassures produites par

les effondrements de fourches de réplication.

3. Emergence d’un nouveau concept

Jusqu’à présent, les ADN polymérases translésionnelles étaient considérées comme

« spécialisées » puisqu’on pensait qu’elles jouaient un rôle bien précis. Par exemple, Pol η

était spécialisée dans la synthèse translésionnelle des dimères de thymines induits par les

radiations UV (Johnson et al, 2000b; Masutani et al, 2000) et Pol κ dans la synthèse

translésionnelle des adduits benzopyrènes (Ogi et al, 2002). Il s’avère que ce concept d’une

seule fonction pour une ADN polymérase translésionnelle est sérieusement remis en question.

En effet, Pol η serait aussi impliquée au niveau des mécanismes de recombinaison homologue

(Kawamoto et al, 2005; McIlwraith et al, 2005; McIlwraith & West, 2008) et également au

cours de la réplication de l’ADN en absence de dommage exogène de l’ADN. De manière

similaire, Pol κ semble jouer un rôle au niveau du mécanisme de réparation par excision de

nucléotide (Ogi & Lehmann, 2006) et être importante pour la mise en place du point de

contrôle de phase S (données non publiées du laboratoire). Par conséquent, les ADN

polymérases translésionnelles semblent avoir des implications bien plus diverses que nous le

supposions lors de leur découverte.

Discussion B.L’impact du nouveau rôle de Pol η sur la maladie XP-V

197

B. L’impact du nouveau rôle de Pol η sur la maladie du

Xeroderma pigmentosum variant

Il est important de souligner que les patients XP-V ont certes une sensibilité accrue

aux UV et du coup une prédisposition aux cancers de la peau mais ils n’ont apparemment

aucun problème de croissance, ce qui est surprenant compte tenu de nos résultats. Ceci

suggère que l’absence de Pol η in vivo dès le développement embryonnaire n’est pas

suffisante pour développer des modifications majeures et/ou qu’une redondance fonctionnelle

se produise chez ces patients. Dans ce dernier cas, il serait intéressant de déterminer quelle

ADN polymérase est utilisée pour remplacer la fonction de Pol η dans la réplication des

séquences particulières chez les patients XP-V. Il semble à la vue de mes résultats que ce ne

soit pas Pol ι puisqu’aucun phénotype observé au niveau somatique en absence de Pol η n’est

retrouvé en absence de Pol ι, du moins dans les cellules U2OS. Si nous nous référons aux

résultats obtenus lors des analyses de PCR quantitative, il ne semble pas que les ADN

polymérases de la famille Y soient plus exprimées pour contrecarrer l’absence de Pol η. Au

cours de ces analyses, nous n’avons pas étudié l’ADN polymérase Pol ζ qui est très

importante lors de la TLS de divers dommages de l’ADN et dans le maintien de la stabilité

génomique. Cette ADN polymérase moins fidèle, pourrait peut-être remplacer Pol η au

niveau des séquences difficiles à répliquer et permettre de pallier à l’absence de Pol η même

si elle est plus mutagène. En effet, Pol ζ est spécialisée dans la TLS des bases distordantes

telles que les mésappariements ou les agents pontants (Lawrence, 2004; Prakash et al, 2005).

Ainsi, il est possible que les structures secondaires de l’ADN soient reconnues par Pol ζ en

absence de Pol η. De plus amples études sur cette éventuelle redondance des ADN

polymérases translésionnelles sont nécessaires pour mieux comprendre leur implication dans

le maintien de la stabilité du génome.

1. Nouvelles études envisagées sur les cellules de patients XP-V

La majorité des études réalisées sur les cellules XP-V ont été effectuées à partir de

cellules transformées par le virus simien SV40. Puisque l’antigène T du virus SV40 piège la

protéine p53, le point de contrôle médié par p53 est donc défectueux et la progression dans le

cycle cellulaire n’est pas arrêtée en G1/S en cas de dommages à l’ADN. De ce fait, le défaut

Discussion B.L’impact du nouveau rôle de Pol η sur la maladie XP-V

198

de croissance observé dans les cellules U2OS (p53 fonctionnel) en absence de Pol η n’est pas

retrouvé dans les cellules XP-V (p53 inactivé) (Stary et al, 2003) ni dans les cellules de poulet

DT40 également déficientes en p53 (Kawamoto et al, 2005). Il serait donc intéressant de

chercher dans des cellules primaires issues de patients XP-V les phénotypes observés en

absence de Pol η dans les cellules U2OS. Au vu de mes résultats, les cellules XP-V

primaires devraient présenter un plus fort pourcentage de mort cellulaire ou de sénescence

en absence de dommage exogène de l’ADN.

D’autre part, si Pol η a bien deux rôles distincts, l’instabilité génomique observée en

absence de Pol η devrait être augmentée par des dommages induits par les UV. Ainsi,

l’étude des effets additifs de la perte de Pol η sous traitement UV dans les cellules primaires

XP-V, ou dans un autre modèle cellulaire, permettrait de mieux analyser les deux rôles

distincts de Pol η. Il semble que l’absence de Pol η seule ne suffise pas pour induire des

tumeurs chez les humains ou dans les souris. Ainsi l’absence de Pol η deviendrait un

cocarcinogène uniquement après dommages exogènes de l’ADN ou en supplément d’un

autre défaut génétique. Ces résultats expliqueraient notamment la très forte incidence des

radiations UV sur les patients XP-V qui ont pourtant un système de réparation par excision de

nucléotide fonctionnel.

Enfin, si le rôle de Pol η au niveau du maintien de la stabilité du génome est retrouvé

dans les cellules XP-V primaires, nous devrions observer en absence de Pol η une fréquence

élevée de perte d’hétérozygotie ou LOH (Loss Of Heterozygosity) au niveau des sites

fragiles communs, dans des cellules exposées à de forts taux de dommages endogènes ou

exogènes de l’ADN.

2. Excès de recombinaison homologue chez les patients XP-V

Nous avons vu que le niveau d’expression des protéines de la recombinaison

homologue RAD51 et BACH1 était légèrement augmenté aussi bien au niveau des transcrits

qu’au niveau des protéines, dans les cellules XP-V par rapport aux cellules XP-V

complémentées par l’ADNc de Pol η. Si Pol η jouait uniquement un rôle au niveau de la TLS

des dommages induits par les UV, pourquoi la recombinaison homologue serait exacerbée

dans les cellules XP-V en absence de dommage exogène de l’ADN ? Le nouveau rôle de Pol η

mis en évidence au cours de ma thèse permet d’expliquer ce résultat. En effet, en absence de

Pol η, les protéines de la recombinaison homologue seraient recrutées au niveau des cassures

Discussion C. L’impact de la dérégulation de Pol η sur la progression tumorale

199

générées lors des blocages de fourches au niveau des séquences particulières de l’ADN. Ceci

pourrait peut-être expliquer l’augmentation d’expression de ces protéines. Les résultats

trouvés au cours de ce travail de thèse corroborent ceux de la littérature. En effet, les

échanges entre chromatides sœurs sont fortement augmentés après irradiation UV dans les

cellules XP-V comparées aux cellules XP-V complémentées par Pol η (Cleaver et al, 1999).

Ces résultats suggèrent donc qu’un défaut de Pol η génère un excès de recombinaison

homologue, que ce soit en absence de dommage exogène de l’ADN ou après irradiation

UV. La détermination de la fréquence des échanges entre chromatides sœurs en absence de

dommage exogène de l’ADN dans les cellules XP-V permettrait d’avancer sur cette

hypothèse.

C. L’impact de la dérégulation de Pol η au niveau de la

progression tumorale

Nous avons montré au cours de cette thèse que Pol η est sous-exprimée dans les

cancers colorectaux aussi bien au niveau des transcrits mesurés par PCR quantitative qu’au

niveau des protéines visualisées par immuno-histochimie. De plus, cette protéine est aussi

sous-exprimée dans les cancers du poumon et dans les cancers de l’estomac (Pan et al, 2005).

Bien que l’absence de Pol η ne soit pas suffisante pour induire la prise de tumeur chez les

souris, elle pourrait être un facteur de prédisposition pour la progression tumorale. Il est

important de rappeler que plusieurs sites fragiles communs sont localisés au niveau de gènes

suppresseur de tumeur. Ainsi, la baisse d’expression de Pol η induisant des remaniements

chromosomiques au niveau des sites fragiles communs, il apparaît important de comprendre la

régulation de Pol η.

1. La régulation de l’expression de Pol η

Une étude du promoteur de POLH a été menée dans l’équipe par Fanny Lemée et

Clarisse Bavoux. Des résultats préliminaires ont permis d’identifier différentes régions

activatrices ou répressives. De plus, le facteur de transcription Sp1 semble induire

l’activité transcriptionnelle de ce promoteur. D’autres études plus approfondies

permettraient peut-être de compléter cette étude et de déterminer comment POLH est régulé


200

au niveau transcriptionnel. Il apparaît tout de même intéressant de déterminer si le facteur de

transcription Sp1 est sous-exprimé ou muté dans les cancers colorectaux. Si tel est le cas, il

serait important de déterminer le facteur de corrélation entre la sous-expression des transcrits

de Pol η et la sous-expression des transcrits de Sp1 ou la mutation du gène Sp1.

La régulation de l’expression peut également avoir lieu au niveau de la protéine

par des modifications post-traductionnelles. Nous savons notamment que Pol η est une

protéine à demi-vie courte et qu’elle est dégradée via le protéasome (Skoneczna et al, 2007).

D’autre part, lorsque Pol η est associée au niveau des sites de dommages de l’ADN, elle est

sumoylée par GEI-17, une SUMO-E3 ligase (Kim & Michael, 2008). Si ce n’est pas le cas, la

voie CRL4-Cdt2 ubiquitinyle et dégrade Pol η avant qu’elle n’ait pu remplir sa fonction (Kim

& Michael, 2008). Même sumoylée, Pol η est aussi dégradée par la même voie mais cette

fois-ci après avoir rempli sa fonction dans la TLS (Kim & Michael, 2008). Ces résultats

suggèrent qu’il pourrait exister un mécanisme actif permettant aux ADN polymérases

translésionnelles d’être remplacées par les ADN polymérases réplicatives une fois la TLS

accomplie. En outre, les composants du mécanisme cité ci-dessus tels que GEI-17,

Cul4-Ddb1, Cdt2 et PCNA sont conservés dans les cellules humaines ainsi que les différents

sites de Pol η importants pour ce mécanisme, suggérant qu’un tel mécanisme puisse aussi

exister dans les cellules humaines. Dans un premier temps, il serait donc intéressant de

déterminer si cette même régulation de Pol η existe dans les cellules humaines. Dans un

deuxième temps, analyser l’expression des transcrits des protéines GEI-17, Cul4-Ddb1 et

Cdt2 dans les mêmes échantillons de cancer colorectaux et voir si leur sur-expression corrèle

avec la sous-expression de Pol η permettrait de mieux appréhender la dérégulation de Pol η

dans les cancers colorectaux.

2. L’effet délétère d’un excès de recombinaison homologue

Les échanges de matériel génétique entre séquences homologues, s’ils ne sont pas bien

régulés, par exemple excessifs, peuvent conduire à des translocations, à des duplications ou à

des délétions de certaines régions, eux-mêmes sources d’instabilité génétique. Par exemple,

l’augmentation transitoire de RAD51 au cours de la réparation des cassures double-brin de

l’ADN est suffisante pour induire des recombinaisons homologues avec des cross-over

aberrantes conduisant à des translocations, de l’aneuploïdie et de l’instabilité génomique


201

(Richardson et al, 2004). Il apparaît donc important de réguler finement le processus de

recombinaison homologue afin d’éviter des excès. Afin de voir si une augmentation de

l’expression des protéines de la recombinaison homologue a un impact sur la progression

tumorale, nous avons analysé l’expression des transcrits de RAD51, BLM, BRCA1 et

BRCA2 dans les échantillons de cancers colorectaux. Ces transcrits sont effectivement

sur-exprimés dans la majorité des échantillons et ce de manière significative (données non

publiées). Nous avons donc par la suite voulu déterminer le facteur de corrélation entre la

baisse des transcrits de Pol η et la sur-expression des gènes de la recombinaison homologue.

Pour cela, nous avons utilisé un test non paramétrique de rang de corrélation de Spearman qui

permet de déterminer la corrélation entre deux gènes dans une cohorte d’échantillons. Plus le

coefficient obtenu est proche de 1 plus les expressions des deux gènes considérés sont

associées. Malheureusement, aucune corrélation n’a été retrouvée entre la sur-expression

des transcrits des protéines de la recombinaison homologue et la sous-expression des

transcrits de Pol η (Tableau 3). Cependant, la sous-expression des transcrits de Pol η est

fortement corrélée à la sous-expression des transcrits des autres ADN polymérases de la

famille Y (Tableau 3). Etant donné les différents rôles des ADN polymérases de la famille Y,

de nombreux mécanismes peuvent être perturbés par leur faible expression, conduisant à

l’augmentation de l’instabilité génomique et donc à des cassures de l’ADN. Ceci permettrait

peut-être d’expliquer la forte expression des gènes de la recombinaison homologue dans les

échantillons tumoraux par rapport aux échantillons sains. De manière alternative, les niveaux

élevés de RAD51 pourraient simplement refléter la forte capacité proliférative des cellules

tumorales et l’activité normale mais exacerbée de RAD51 au cours de la phase S du cycle

cellulaire.

Tableau 3. Analyse de la corrélation entre la sous-expression des transcrits de l’ADN polymérase eta et la sous-expression des transcrits des ADN polymérases de la famille Y ou la sur-expression des transcrits de la recombinaison homologue.

Gène POLI POLK REV1 RAD51 BRCA1 BRCA2 BLM

Facteur de corrélation 0,71 0,71 0,70 0,22 0,36 0,23 0,29

202

CONCLUSION

GENERALE

Conclusion

203

Les résultats obtenus au cours de ma thèse ont permis d’avancer dans la

compréhension des mécanismes impliqués au niveau des séquences particulières de l’ADN.

En effet, Pol η semble jouer un rôle dans la réplication de ces séquences particulières

susceptibles d’adopter des structures secondaires, telles que des épingles à cheveux, des

structures en cruciformes ou des G-quadruplex. Pol η semble particulièrement importante au

niveau des séquences riches en G, notamment retrouvées au niveau des télomères, et des

sites fragiles communs, souvent réarrangés dans les cellules tumorales. Par conséquent,

comprendre le mécanisme d’implication de Pol η au niveau de ces deux types de séquences

particulières relève d’un intérêt évident en cancérogenèse. En effet, Pol η pourrait être

importante pour contrecarrer le vieillissement prématuré dû à l’attrition des télomères mais

aussi pour éviter l’augmentation d’instabilité génomique pouvant conduire au développement

tumoral.

Bien que d’autres études soient nécessaires pour mieux comprendre le mécanisme

d’implication de Pol η au niveau des séquences particulières de l’ADN, plusieurs résultats

obtenus nous permettent d’impliquer Pol η en amont de la réparation par recombinaison

homologue. En effet, Pol η semble nécessaire pour la réplication de ces séquences puisque

son absence induit une augmentation des cassures de l’ADN ainsi qu’un recrutement des

protéines de la recombinaison homologue. Ce travail de thèse a donc permis de révéler une

deuxième fonction de Pol η, outre son rôle dans la TLS.

La progression tumorale est un processus qui sélectionne les évènements génétiques et

épigénétiques qui permettent aux cellules d’échapper aux mécanismes antiprolifératifs et de

mort cellulaire induite (Lowe et al, 2004). Un stress réplicatif précoce pourrait participer à la

progression tumorale en induisant de manière directe ou indirecte via la formation de cassures

de l’ADN, l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire (Bartkova et al, 2005;

Gorgoulis et al, 2005). Nous avons montré au cours de cette thèse que la sous-expression de

l’ADN polymérase de la famille Y, Pol η, induit une augmentation des cassures de l’ADN et

une augmentation de l’instabilité génomique ainsi qu’une activation du point de contrôle

médié par Chk2. Ainsi, la dérégulation de cette protéine pourrait participer au stress réplicatif

observé au cours des phases précoces de la progression tumorale (Bartkova et al, 2005;

Gorgoulis et al, 2005). Cependant, la sous-expression de Pol η seule ne suffirait pas à

Conclusion

204

induire la prise de tumeurs, suggérant qu’elle n’agisse que comme cocarcinogène couplé

à des dommages exogènes de l’ADN ou à un autre défaut génétique (Fig 59).

Figure 59. Modèle de l’implication de Pol η au cours de la progression tumorale. La

sous-expression de Pol η ou l’absence d’une protéine Pol η fonctionnelle conduit à un stress réplicatif, à des cassures de l’ADN, à de l’instabilité génomique et à l’activation des points de contrôle (indiqués en rouge). (Adapté de (Gorgoulis et al, 2005))

Hyperplasie Cancer

Stress réplicatif Activation des

points de contrôle du cycle

Apoptose dépendante de p53

Sénescence

CDB

Instabilité génomique Attrition des télomères

Hypoxie

Sous-expression de Pol η ou absence de Pol η fonctionnelle + dommages exogènes de l’ADN ou autre défaut génétique ?

rey

Note

205

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Références

242

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243

ANNEXES DE

MATERIEL ET

METHODES

Annexe 1 Séquences particulières de l’ADN utilisées

244

Annexe 1 : Différentes séquences utilisées formant des

structures secondaires de l’ADN

MYC PROMOTER

ATGCGTTGCTGGGTTATTTTAATCATTCTAGGCATCGTTTTCCTCCTTATGCCTCTATCATTCCTCCCTATCTACACTAACATCCCACGCTCTGAACGCGCGCCCATTAATACCCTTCTTTCCTCCACTCTCCCTGGGACTCTTGATCAAAGCGCGGCCCTTTCCCCAGCCTTAGCGAGGCGCCCTGCAGCCTGGTACGCGCGTGGCGTGGCGGTGGGCGCGCAGTGCGTTCTCGGTGTGGAGGGCAGCTGTTCCGCCTGCGATGATTTATACTCACAGGACAAGGATGCGGTTTGTCAAACAATACTGCTACGGAGGAGCAGCAGAGAAAGGGAGAGGGTTTGAGAGGGAGCAAAAGAAAATGGTAGGCGCGCGTAGTTAATTCATGCGGCTCTCTTACTCTGTTTACATCCTAGAGCTAGAGTGCTCGGCTGCCCGGCTGAGTCTCCTCCCCACCTTCCCCACCCTCCCCACCCTCCCCATAAGCGCCCCTCCCGGGTTCCCAAAGCAGAGGGCGTGGGGGAAAAGAAAAAAGATCCTCTCTCGCTAATCTCCG

Les trois séquences formant du Z-DNA sont surlignées en jaune, la séquence formant du H-DNA est surlignée en rouge; et celle formant un G-quadruplex est soulignée.

BCL-2 MBR

GTCATGTGCATTTCCACGTCAACAGAATTGTTTATTGTGACAGTTATATCTGTTGTCCCTTTGACCTTGTTTCTTGAAGGTTTCCTCGTCCCTGGGCAATTCCGCATTTAATTCATGGTATTCAGGATTACATGCATGTTTGGTTAAACCCATGAGATTCATTCAGTTAAAAATCCAGATGGCAAATGACCAGCAGATTCAAATCTATGGTGGTTTGACCTTTAGAGAGTTGCTTTACGTGGCCTGTTTCAACACAGACCCACCCAGAGCCCTCCTGCCCTCCTTCCGCGGGGGCTTTCTCATGGCTGTCCTTCAGGGTCTTCCTGAAATGCAGTGGTGCTTACGCTCCACCAAGAAAGCAGGAAACCTGTGGTATGAAGCCAGACCTCCCCGGCGGGCCTCAGGGAACAGAATGATCAGACCTTTGAATGATTCTAATTTTTAAGCAAAATATTATTTTATGAAAGGTTTACATTGTCAAAGTGATGAATATGGAATATCCAATCCTGTGCTGCTATCC

La séquence formant du H-DNA est surlignée en rouge.

Far right-hand end of the KSHV genome

CTGCAAAAAGCTGATAATGTAACACTGCATCCTGGTGTTTTTGATTGTAGCGGAAAAATGTAATAAATTTTACAGACAGTTTTGCCTACTGAGAACATGTTGAAAAAAAGGCACTAAGGGCTTTTTTGCCAAAGGAAAAATGCCCCCGTGGGGTTAGGGGAAAGGGGGGATGGGGTGATGGGGGAATGGTGGGAAAGGGGGGATGGGGTGATGGGGGAATGGTGGGAAAGGGGTGATGGGGTGATGGGGGAATGGGGGGAAAGGGGGAATGGGGGGAAAGGGGGAATGGGGGGAAAGGGGGAATGGGGGGAAAGGGGGGATGGGGGGAAAGGGGGAATGGGGGGAAAGGGGGAATGGGGGGAAAGGGGGGATGGGGGGAAAGGGGGAATGGGGGGAAAGGGGGGATGGGGGGAAACGGGGGATGGGGGGAAAGGGGGGATGGGGGGGAAAGGGGGGATGGGGGGGAAAGGGGGGATGGGGGGGAAAGGGGGGATGGGGGGGAAAGGGGGGATGGGGAAGGGGGGGGGGAGGGGGAAGGGGGTGAAGGGGGAAGGGGGGAGGCGAGTATGGGAGAAAGAGTGTGAGGAGCGACATGTGAAATGTGGCTACAGTGTGCCCTGCCTAACGGCCACACCTATATCCGCACGTGTGTTTCCGGGGCGGCGGAGCGTTTTTTTCGGGGGCGGGGGNCGGGGGAGGGGGGGTAAAACAGGGGGGGGGGGGGAT

La sequence riche en GA qui peut former du H-DNA est surlignée en rouge. LONG CONTROL

Annexe 1 Séquences particulières de l’ADN utilisées

245

GGATGCCTTTGTGGAACTGTACGGCCCCAGCATGCGGCCTCTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTCTCTGAAGACTCTGCTCAGTTTGGCCCTGGTGGGAGCTTGCATCACCCTGGGTGCCTATCTGGGCCACAAGTGAAGTCAACATGCCTGCCCCAAACAAATATGCAAAAGGTTCACTAAAGCAGTAGAAATAATATGCATTGTCAGTGATGTACCATGAAACAAAGCTGCAGGCTGTTTAAGAAAAAATAACACACATATAAACATCACACACACAGACAGACACACACACACACAACAATTAACAGTCTTCAGGCAAAACGTCGAATCAGCTATTTACTGCCAAAGGGAAATATCATTTATTTTTTACATTATTAAGAAAAAAAGATTTATTTATTTAAGACAGTCCCATCAAAACTCCTGTCTTTGGAAATCCGACCACTAATTGCCAAGCACCGCTTCGTGTGGCTCCACCTGGATGTTCTGTGCCTGTAAACATAGATTCGCTTTCCATGTTGTTGGCCGGATCACCATCTGAAGAGCAGACGGATGGAAAAAGGACCTGATCATTGGGGAAGCTGGCTTTCTGGCTGCTGGAGGCTGGGGAGAAGGTGTTCATTCACTTGCATTTCTTTGCCCTGGGGGCTGTGATATTAACAGAGGGAGGGTTCCTGT

Annexe 2 Immuno-précipitation de chromatine

246

Annexe 2 : Protocole de l’immuno-précipitation de chromatine

(ChIP) couplée à la PCR quantitative (Q-PCR)

1. Préparation du lysat - Cultiver les cellules jusqu’à sub-confluence

- Réaliser l’étape de crosslink et de trypsinisation des cellules avec le Red-CHIP KIT en

suivant les recommandations du fabricant (Diagenode).

- Lyser les cellules avec le Red-CHIP KIT en suivant les recommandations du fabricant et en

doublant les volumes de tampons D.

- Soniquer les extraits pendant deux cycle de 15 minutes (30 secondes ON, 30 secondes OFF,

position High du bioruptor de Diagenode).

- Garder une fraction non soniquée et une fraction soniquée comme contrôle de l’efficacité de

la sonication

2. Immuno-precipitations - Garder une fraction de lysat comme input

- Pour chaque IP, mettre 20 µL de billes Dynabeads Protein A (Dynal) dans un tube (low

binding) de 1,5mL

- Laver les billes 3 fois avec 1mL de PBS-BSA-0,1%Tween 20 et resuspendre avec 20 µL de

PBS-BSA-0,1%Tween 20.

- Ajouter 2,5µg d’anticorps (IgG contrôle ou FLAG M2, Sigma)

- Agiter sur une roue à 4°C pendant au moins 3h

- Laver les billes couplées à l’anticorps 3 fois avec 1mL de PBS-BSA-0,1%Tween 20 et

resuspendre dans 20µL de PBS-BSA-0,1%Tween 20.

- Dans la glace, ajouter 1,9mL de dilution buffer additionné d’inhibiteurs de protéases à

100µL de lysat. Mélanger en inversant le tube et laisser dans la glace 10 minutes.

- Ajouter les 20µL de complexe billes-anticorps et incuber sur une roue toute la nuit à 4°C

- Laver les billes-anticorps-protéines 2 fois avec 1mL :

a) Low salt immune complex wash buffer, 2 lavages

b) High salt immune complex wash buffer, 2 lavages

c) LiCl immune complex wash buffer, 2 lavages

d) TE buffer, 2 lavages


247

3. Reversion du crosslink et extraction d’ADN - Culotter les cellules après le dernier lavage

- Eliminer le maximum de tampon et resuspendre dans 250µL de Talianidis buffer.

- Vortexer brièvement et placer les échantillons à 65°C pendant 10 minutes.

- Transférer le surnageant dans un nouveau tube et répéter l’élution.

- Combiner les surnageants

- Ajouter 250µL NaCl (5M) et reverser le crosslink en chauffant pendant 4-5h à 65°C.

Remarque : Pour vérifier en western-blot si les IP sont correctes rajouter directement le Laemmli 2X avec les billes et faire bouillir 30mn avant de déposer sur un gel SDS/PAGE 10

Ajouter les inputs et les contrôles de sonication à cette étape : rajouter 500µL de talianadis buffer et procéder de la même manière.

- Ajouter 40µg de Protéinase K et incuber 2h à 37°C

- Extraire deux fois l’ADN avec 0,5mL de phénol/Chloroforme/isoamylalcohol. Ajouter 20µg

de glycogène et mélanger. Ajouter 40µL de NaOAc et mélanger. Précipiter 1mL d’éthanol et

placer à -20°C toute la nuit.

- Centrifuger 10 minutes à 13000rpm à 4°C

- Laver le culot avec 500µL d’éthanol 70%.

- Laisser sécher le culot et resuspendre avec 30µL de tampon TE contenant 10µg de RNAseA.

- Incuber 1h à 37°C.

- Purifier l’ADN avec le kit Qiagen PCR purification kit en suivant les recommandations du

fabricant. Eluer dans 100µL

- Précipiter à nouveau l’ADN avec 10µL de NaOAc, 2µL de Glycogène, 250µL d’éthanol

100% toute la nuit à 4°C.

- Centrifuger 10 minutes à 12000rpm à 4°C, laver le culot avec de l’éthanol 70% et

resuspendre dans 11µL d’eau.

- Pour les tests de sonication : les faire migrer dans un gel d’agarose 1,5% à 100V pendant 30

minutes.

4. PCR quantitative - Utiliser 3ng des produits d’IP par PCR

- Ajouter 10µL de mix SybrGreen 2X et 5µL d’un mélange des deux amorces à 1,2µM

chacun


248

- Programme : 10 minutes à 95°C, puis 40 cycles (15 secondes à 95°C, 1 minute à 60°C), pour

les courbes de dissociation, rajouter une augmentation de température de 60°C à 90°C

pendant 20 minutes.

5. Différents tampons utilisés

Lysis buffer

1% SDS;10mM EDTA pH 8,0; 50mM Tris-HCl pH 8,0

PMSF 1mM; Leupeptine 1µg/ml; Aprotinine 1µg/ml; Pepstatine 1µg/ml

Ajouter les inhibiteurs de proteases juste avant l’utilisation ou utiliser un cocktail

d’inhibiteurs (Complete mini EDTA-free, Roche)

IP dilution buffer

0,01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1,2mM EDTA, 16,7mM Tris-HCl pH 8,0; 150mM NaCl;


Ajouter les inhibiteurs de proteases juste avant l’utilisation ou utiliser un cocktail

d’inhibiteurs (Complete mini EDTA-free, Roche)

Low Salt Immune Complex Wash buffer

0,1% SDS; 1% Triton X-100; 2mM EDTA pH 8,0; 20mM Tris-HCl pH 8,0; 150mM NaCl


High Salt Immune Complex Wash buffer

0,1% SDS; 1% Triton X-100; 2mM EDTA pH 8,0; 20mM Tris.Cl pH 8,0; 500mM NaCl

LiCl Immune Complex Wash Buffer

0,25M LiCl; 1% NP-40; 1% Na-Deoxycholate; 1mM EDTA pH 8,0; 10mM Tris-HCl pH 8,0

TE

10mM Tris-HCl pH 8,0; 1mM EDTA pH 8,0

Talianidis

70mM Tris-HCl pH 8,0

1mM EDTA pH 8,0

1,5% SDS

Annexe 3 Fractionnement celllulaire

249

Annexe 3 : Protocole de fractionnement cellulaire

- Ensemencer 4 boîtes de 10 cm de diamètre par condition à 106 cellules

2 boîtes pour un extrait total (WCE)

2 boîtes pour la fraction chromatinienne (P2)

- 24h après gratter les cellules deux fois au PBS à 4°C

- Centrifuger à 1500rpm pendant 4 minutes à 4°C

- Pour le WCE, reprendre le culot dans 150µL de tampon B et congeler à -20°C

- Pour le P2, reprendre le culot dans 200µL de tampon B additionné de 0,1% triton X100.

Laisser 10 minutes dans la glace avant de centrifuger à 14000rpm pendant 3 minutes à 4°C.

Reprendre le culot dans 100µL de tampon B additionné de 0,2mg/mL de RNAseA. Incuber

sur agitation de 30 secondes toutes les 2 minutes pendant 30 minutes à 25°C. Centrifuger à

14000rpm pendant 3 minutes à 4°C. Ajouter 150µL de tampon B, vortexer et congeler à -

20°C.

- Le jour du dépôt : chauffer à 100 °C pendant 10 min et vortexant de temps en temps.

Refroidir dans la glace avant de soniquer (Amplitude 30, durée des pulses 2sec, deux séries de

15 pulses). Déposer sur gel SDS/PAGE 10%.

Tampon B Concentratiopn finale (M) Hepes KOH pH 7,5 (M) 0,05 NaCl (5M) 0,30 EDTA (0,5M) 0,001 Aprotinine (20mg/mL) 0,01 Pepstatine (1,5mg/mL) 0,003 Leupeptine (3mg/mL) 0,006 PMSF (0,1M) 0,001 NaF (1M) 0,010 Glycérophosphate (1M) 0,010 Orthovanadate (0,2M) 0,001 Cantharidine (0,1M) 0,0001

Annexe 4 Recombinaison homologue

250

Annexe 4 : protocole d’analyse de la recombinaison homologue

1. Culture cellulaire

- Ensemencer les cellules à 100 000 cellules par puits - Transfecter 24h après 100nM de siRNA à la lipofectamine 2000 (Invitrogen) - Transfecter 24h après 3µg de vecteur codant pour I-SceI au Jet PEI (Polyplus

Transfection) ou 2,7µg de vecteur codant pour I-SceI + 0,3µg de vecteur codant pour la GFP

- Récupérer les cellules 72h après transfection du vecteur codant pour I-SceI dans 400µL de PBS (après trypsinisation 0,25%, centrifugation 1000rpm pendant 5 minutes, lavage avec 5 mL de PBS, centrifugation 1000rpm pendant 5 minutes et reprendre dans 400µL de PBS)

2. Analyse par cytométrie en flux - Analyses sur le cytomètre FACScan (BD Dickinson) FL1-H/FL2-H - Utilisation du logiciel Cell Quest pro (BD Dicknison) - Les cellules GFP positives sont repérées sur le canal FL1-H, l’auto-fluorescence des

cellules vertes est repérée sur le canal FL2-H - Une compensation FL2-H- 25% FL1-H permet de repérer les cellules faiblement

positives pour la GFP - Paramètres d’acquisition

FSC P1 Voltage E-1 Amplifier Gain 3.50 lin. SSC P2 Voltage 320 Amplifier Gain 1.00 lin. FL1 P3 Voltage 500 Amplifier Gain - log. FL2 P4 Voltage 450 Amplifier Gain - log.

Seuil : FSC-H = 52 Acquisition de 40 000 évènements Remarques sur les vecteurs utilisés

- Le vecteur permettant l’expression d’I-SceI est un plasmide pcDNA3-mycNLS-I-SceI qui est une version modifiée du plasmide pCMV-I-SceI contenant la séquence codante d’I-SceI fusionnée en 5’ avec une triple étiquette Myc et un signal de localisation nucléaire dans le vecteur pCDNA3β.

- Le vecteur codant pour la GFP est un vecteur pcDNA3 dans lequel la séquence codante de l’EGFP a été clonée.

Annexe 5 Tissue micro-array

251

Annexe 5 : Tissue micro-array (TMA)

- Par l’utilisation du TMA (Beecher Instruments, Alphelys), retirer deux « carottes » de

1mm de diamètre des blocs de paraffine contenant les tissus sains et tumoraux.

- Démasquage antigénique par régénération au micro-onde à 65°C dans plusieurs

tampons (citrate pH=6, EDTA pH=8)

- Inhibition de la biotine endogène par ajout d'albumine bovine afin de limiter les

artéfacts d'interprétation

- Réaliser l’immuno-marquage avec l’anticorps anti-Pol η (Santa Cruz) pendant 1h.

- Détecter la liaison de l’anticorps via le système de detection iVIEWTM (Ventana);

- Analyser les lames au niveau de la station de travail Spot Browser (Alphelys) en

quantifiant l’intensité du marquage dans les tissus cancéreux et dans les tissus sains.

Documents

THÈSE - thesesupsthesesups.ups-tlse.fr/510/1/Rey_Laurie.pdfLE MECANISME DE REPLICATION DE L’ADN ... L’HOMOLOGUE DE DINB CHEZ E. COLI..... 94 a- Description du gène et de la protéine