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©2008, Promega Corporation. All rights reserved.
遺伝子導入試薬
MultiFectam
2
Outline
• 遺伝子導入試薬MultiFectamについて
• 基礎データ
• 他社製品との比較
• 初代培養細胞への遺伝子導入
• siRNAの導入
• 特徴
3
遺伝子発現メカニズム
分解
Cell
H+
H+
H+Cl-
H+
H+
H+
H+
Cl-
Cl-
核
H2O
H2O
MultiFectam-DNA複合体
エンドサイトーシス
浸透圧上昇エンドソーム破裂
エンドソーム
リソソーム
pH低下
H+、Cl-流入によりエンドソーム内イオン濃度上昇
プロトンスポンジ効果
プロトンスポンジ効果と膜融合能の相乗効果によるエンドソームからの効果的な脱出
+
+
++ + +
+
+
++++
−
− −+
膜融合
遺伝子発現
DNA MultiFectam
4
原理とプロトコル
MultiFectamの透過型電子顕微鏡写真
0
10
20
30
40
50
0.1 1 10 100 1000 10000
Inte
nsity (%
)
Size (d.nm)
0
200000
400000
600000
800000
-200 -100 0 100 200
Inte
nsity
(kcps)
Zeta Potential (mV)
lot A
lot B
Size distribution by intensity
Zeta potemtial distribution
検出器機:Zetasizer Nano : ZS90
(MALVERN CO., LTD)
141nm
164nm
49.2
46.5
プロトコル:
リポソーム形成
凍結乾燥製品
再水和溶液
d.w.
DNAとの複合体形成 細胞への添加
DNA溶液
r.t. 30min
+
+
++ + +
+
+
++++
MultiFectam
製品
原理: 本製品は、プラスミドDNAを様々な哺乳動物由来の培養細胞中へ効果的に導入できるトランスフェクション試薬です。本試薬は、ポリアミドアミンデンドロンを極性基とするカチオン性脂質からなり、静電気的相互作用によりDNA
と複合体を形成します。この複合体は、エンドサイトーシスにより細胞内のエンドソームに取り込まれます。その後、複合体は、ポリアミドアミンデンドロンにより誘起されるプロトンスポンジ効果およびエンドソーム膜との疎水的相互作用により、効率よくエンドソームから細胞質へと放出される為、高い遺伝子発現効率が得られます。
5
細胞への導入効率
400倍観察
200倍観察
+
MultiFectam+ NBD DNA-Alexa Fluor 546
48 hr後、観察
MultiFectam-DNA
複合体形成細胞への添加
明視野 NBD標識MultiFectam DNA-Alexa Fluor 546HeLa-S3
6
様々な細胞株での遺伝子発現(GFP)A549
CHOBalb3T3
HeLa-S3
COS 7
U2OS SKOV3100倍観察:COS7, K562, Jurkat,
Balb3T3
200倍観察:その他
K562浮遊系
Jurkat
7
他社製品との比較C
OS
7H
eL
a-S
3
MultiFectam 競合品 A 競合品 B
COS7: 100倍 HeLa-S3 : 200 倍K562 : 100倍
48hr後GFP発現
K5
62
0
0.5
1
1.5
2
1 2 3
DL-U2
LTX
HD
COS7 HeLa-S3 K562
ルシフェラーゼ活性測定
競合品Aの活性値を1とした(それぞれの推奨プロトコルに従った)
毒性評価 (WST-8)
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
DL-U2
LTX
HD
Relative activity
生存率(%)
COS7 HeLa-S3 K562
MultiFectam
競合品A
競合品B
MultiFectam
競合品A
競合品B
8
NHDF-ad (正常ヒト皮膚繊維芽細胞)へのDNA、MultiFectamの導入効率
+
DNA-Alexa Fluor 546
48 hr後、観察
MultiFectam-DNA
複合体形成細胞への添加
明視野 NBD標識MultiFectam DNA-Alexa Fluor 546
400倍観察
200倍観察
MultiFectam+ NBD
9
他社製品との比較(活性: NHDF-ad細胞 )
MultiFectam 0.2ug 競合品A 0.2ug 競合品B 0.2ug 競合品C 1ug
100倍
GFP発現
48hr後
Lu
cife
rase
activity
×1
04R
LU
/mg p
rote
in
0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 5
0.2ug
0.5ug
MultiFectam 試薬X 競合品A 競合品B 競合品C
ルシフェラーゼ活性測定
GFP発現
10
他社製品との比較(毒性評価:NHDF-ad細胞)
トランスフェクションから48hr後、WST-8により測定未添加を100%とした
NP= 4 8 4 80
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
1 2 3 4 5
0.2ug
0.5ug
1.0ug
未添加 MultiFectam 競合品C 競合品B 競合品A
11
複数回トランスフェクション (NHDF-ad細胞)[ 非ウイルス性ベクターを用いて、iPS細胞を作製する際に行われる ]
MultiFectam 競合品A
100倍
競合品B 競合品C
0.5ug
1.0ug
0.2ug
1.0ug
0.5ug
1.0ug
0.5ug
1.0ug
トランスフェクション トランスフェクション トランスフェクション
1day 3day 5day 7day
解析(GFP発現、細胞毒性)
7day
DNA=
DNA=
GFP発現
12
複数回トランスフェクション (NHDF-ad細胞)
010
2030
4050
6070
8090
100110
1 2 3 4 5
0.2ug
0.5ug
1.0ug
未添加 MultiFectam 競合品A 競合品B 競合品C
7day
トランスフェクション トランスフェクション トランスフェクション
1day 3day 5day 7day
解析(GFP発現、細胞毒性)
細胞毒性(WST-8)
13
siRNA導入メカニズム
分解
Cell
H+
H+
H+Cl-
H+
H+
H+
H+
Cl-
Cl-
核
H2O
H2O
MultiFectam-siRNA 複合体
エンドサイトーシス
浸透圧上昇エンドソーム破裂
エンドソーム
リソソーム
pH低下
H+、Cl-流入によりエンドソーム内イオン濃度上昇
プロトンスポンジ効果
プロトンスポンジ効果と膜融合能の相乗効果によるエンドソームからの効果的な脱出
+
+
++ + +
+
+
++++
−
− − +
siRNAの細胞質への放出
RNAi
siRNA MultiFectam
14
他社製品との比較(ルシフェラーゼ活性)
細胞:ルシフェラーゼ定常発現細胞(HeLa-S3)siRNA:ルシフェラーゼsiRNA 20pmol / 24well
未添加の細胞の活性を100%とした
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5未添加 MultiFectam 競合品E 競合品F 競合品G
15
他社製品との比較(GFP発現)
未添加 MultiFectam 競合品E 競合品G
( GFP siRNA 20pmol/48well plate, LNCap細胞(GFP-luc+定常発現株), 48hr後)
×200
16
他社製品との比較(細胞毒性)
WST-8により、細胞毒性を評価した未処理の細胞を100%とするHeLa-S3,LNCap細胞について評価を行った
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5
HeLa-S3
LNCap
未添加 MultiFectam 競合品E 競合品F 競合品G
17
ノックダウン効果の経時的データ(持続性)
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5
細胞:ルシフェラーゼ定常発現細胞(HeLa-S3)siRNA:ルシフェラーゼsiRNA 20pmol / 24well未処理の細胞の活性を100%とした
0 24 48 96 120 hr
18
MultiFectamの特徴
1) 新規メカニズム
プロトンスポンジ効果+膜融合による効率的なエンドソームからの脱出
2) 血清・抗生物質存在下でも導入可能
3) 生物由来成分を含まない(非ウイルス系ベクター)
4) 操作が簡便
高い発現効率
株化細胞 : COS7, HeLa-S3, A549, U2OS, SKOV3, CHO, Balb3T3, K562, Jurkat
初代培養細胞 : NHDF-ad
・ 多くの細胞種で、高い発現効率を有することを確認浮遊細胞、正常細胞でも高い発現効率
・ 他社製品と比べ、同等以上の発現効率
低毒性
・発現効率が高い条件において、80%以上の細胞生存率
siRNA にも使用可能
・他社製品と同等のノックダウン効果を有する