Vecteurs synthétVecteurs synthétiiques : ques : SyntheGeneTransfer et MégSyntheGeneTransfer et Mégaanucléanucléasseses

Applications à la thérapie géniqueApplications à la thérapie génique

Tours le 23 oct 2008Tours le 23 oct 2008

Gene Therapy

La thérapie génique est une stratégie thérapeutique qui consiste à faire pénétrer des gènes dans les cellules ou

les tissus d'un individu pour traiter une maladie.

La thérapie génique vise à remplacer ou complémenter un allèle mutant défectif par un allèle fonctionnel ou à

surexprimer une protéine dont l'activité aurait un impact thérapeutique.

Différentes Approaches pour la Thérapie Génique

1. Addition = Insertion du Gène dans un autre locus

2. Remplacement = Correction du Gène sur son locus

Intégration aléatoire

Intégration ciblée

Intégration ciblée

Complémentation

* Mutation

insertionnelle

* Activation

d’oncogènes

* Extinction du

transgène

* Extinction du

transgène choix du locus, du tissu

*

HR & TG

Qq 100 pb d’homologie entre la séquence cible et le locus

Des extrémités d’ADN libres = ADN db coupure

=> stimulation du processus

ADN db coupure = signal pour la machinerie HR

HR et TG = échange d’informations génétiques entre une séquence endogène sur un chromosome et une séquence exogène d’ADN (plasmide).

TG Gene targetting

Undamaged DNA (Allele S)

DSB Created (spontaneous or induced, e.g. by ZFN )

Strand Invasion into Undamaged Homologous DNA (Allele A)

In gene targeting exogenous DNA serves as homologous DNA donor.

Repairing of original strands of DNA. Gaps filled by DNA polymerase and nicks sealed

by DNA ligase.

Conversion of White Allele(“S”) into Red Allele (“A”) in region of DSB

S

A

A

Homologous RecombinaisonRéparation de l’ADN : coupure d’ADN double brin (DSB)

Homologous Recombinaison

transposition

3’ Néo 3’

HSV-TK

GcvR

GcvS

recombinaison

Homologous Recombinaison

Homologous Recombinaison

Réparation de l’ADN

Homologous Recombinaison

Réparation sans erreurs

NHEJ

Non Homologous End Joining

Réparation avec petites erreurs

van Attikum & Gasser Nature Reviews, Molecular Cell Biology 2005, 6 : 757-765

HR & TG

Dans les autres cellules : HR est inefficace 10-7 à 10-5

- Murine Embryonic Stem Cells 1/100 à 1/1000

100 % efficacité

- Saccharomyces cerevisiae

- Trypanosoma brucei

- Phycomitrella patens

- Chicken DT40 lymphoid cell line

- Qq souches E. coli

Développement d’alternatives

1 - Correction par de petits oligonucléotides : mutation ponctuelleTFO triplex forming oligonucleotides

RDO RNA-DNA oligonucleotide Kolb Trends Biotechnol 2005

SFHD short fragment homologous replacement

2 - Sequence-specific endonucleases = MEGANUCLEASE

Correction ou insertion

MEGANUCLEASE story

1980 découverte de HO et I-SceIEndonucléases de levureInitie HR à un locus spécifique

I-SceI codée par un intron mitochondrialCopie l’élément dans un seul locus : HOMING18 pb

18 pb parfait pour créer une seule coupure dans le génome (418)

46 pour les enzymes de restriction

MEGANUCLEASE story

Elles sont codées par des éléments génétiques mobiles comme les introns de classe I ou les intéines, qui promeuvent leur propre dissémination par leur activité d'endonucléase.

Domaine de liaison à l’ADN = domaine de coupure

MEGANUCLEASE story

Méganucléase = endonucléase site >12pb

Méganucléase naturelle = Homming endonuclease

Méganucléase artificielle = Zing finger.

Familles de protéines eucaryotes, bactéries et archébactéries, végétaux

Pas chez les métazoaires animaux pluricellulaires

GFP Gene Targeting System

CMV/CBA-GFP*-IRES-CD8PGK-Neo

37GFP-IRES-CD8

37GFP-IRES-CD8

Stop-Sce Site

327

Spontaneous Gene Targeting

CMV/CBA-GFP-IRES-CD8PGK-Neo

Rate= 7.1 x 10-7

(Approximately 1 per million)

DSB-Mediated Gene Targeting

CMV/CBA-GFP*-IRES-CD8PGK-Neo

37GFP-IRES-CD8CMV-Sce

Stop-Sce Site

37GFP-IRES-CD8

Stop-Sce Site

Cellules de mammifères

DSB-Induced Gene Targeting

CMV/CBA-GFP-IRES-CD8PGK-Neo

Optimized Rate of DSB Mediated Gene Targeting= 3-5 x 10-5 à-2

(3-5%) (or 30-50,000 per million)

Problèmes : Insertion aléatoireRéparation des jonctions efficace d’un seul côtéLocalisation DSB et correction (< 500pb) Pas de site I-SceI naturel chez les mammifères

Les méganucléases fonctionnent chez les mammifères

Méganucléase & CO

+ 100 candidats

Mais le répertoire des séquences cibles ne rend pas compte de la complexité des génomes

Engineering des protéines mais extrêmement complexeManque informations structurales et de méthodes

DAGLIDADG His-Cys box

How to create that DSB?

Possible Ways to Create a Gene-Specific DNA Double-Strand Break

1. Non-specifically (ionizing radiation, bleomycin. . .)

2. DNA cleaving ribozyme?

3. Modified Polyamide or Peptide Nucleic Acid

4. Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP

5. Modified homing endonuclease.

Not the purpose

Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP

- 30 AA organisés en une structure stabilisée par un ion Zn2+

Grand sillon de l’ADN

- Chaque ZF reconnaît un triplet de nucléotides

- Motifs les plus répandus dans les domaines de liaison à l’ADN (TFs)

Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP

Les ZF Cys2His2: de nombreux avantages

-Chaque ZF reconnaît un triplet de nucléotides

-Fonctionnement modulaire de la protéine

- Les ZF sont assemblables entre eux pour former des protéines polydactiles avec de nouvelles spécificité de reconnaissance.

Nous avons la spécificité comment créer la coupure?

Les ZFPs peuvent être fusionnées à un domaine effecteur

Création d’une Zinc Finger Nucleases

Initially developed by labs of Srinivasan Chandrasegaran (Johns Hopkins) and Dana Carroll (Univ. Utah)

FokI nucleasedomain (Fn)

FokI nucleasedomain (Fn)

= le domaine de coupure de FokI + domaine de reconnaissance de l’ADN de ZF

SANGAMO

SANGAMO

“Sure, but how to create that gene specific DSB?”

Zinc Fingers Seem to Bind DNA in a Modular Fashion

FokI nucleasedomain (Fn)

FokI nucleasedomain (Fn)

CMV/CBA GFP* IRES WRECD8

ZFN Full Site/Sce Site

tGFP

IRES WRECD8

tGFP

CMV/CBA GFP IRES WRECD8

Sce or ZFNExpression

PlasmidGFP Donor

G FPCMV/CBA

Témoin le donneur GFP seul

Le donneur GFP + le plasmide ZFN

Preuve de concept

(G2/M)

3% of asynchronously cells

Hah, reporter genes are fine, but show me an endogenous

target.

Mutations in IL2RG Gene that Cause SCID

24 pb; 4 ZFP de part et d’autre du hotspot

Urnov et al. (2005)

Stratégie ZFP

Stratégie IL2R

Experimental Design to Detect Targeting at Endogenous IL2RG Locus

1. Transfect K562 cells with IL2RG ZFNs with repair substrate that contains BsrBI polymorphism.

2. Isolate individual clones (no selection).

3. Expand individual clones (no selection).

4. Harvest genomic DNA from individual clones.

5. Analyze genomic DNA for BsrBI polymorphism.

Single-step Homozygous Gene Targeting in Somatic Cells

(K562)

Urnov et al. (2005)

Correction monoallèlique

Correction biallèlique

20% Correction

Next

1. Essais dans d’autres types cellulaires

2. Essais pour d’autres gènes

3. Sécurité.

• Existence de DSB à d’autres loci =>instabilité génomique?

• Immunogénicité des ZFN

• Toxicité

• Méthode de délivrance

• Moins de problèmes

• Cellules autologues

In vivo

Ex vivo

Possible Ways to Create a Gene-Specific DNA Double-Strand Break

1. Non-specifically (ionizing radiation, bleomycin. . .)

2. DNA cleaving ribozyme?

3. Modified Polyamide or Peptide Nucleic Acid

4. Zinc finger proteins. 1990 Aventure des ZFP

5. Modified homing endonuclease. Fin des années 90

Not the purpose

Modified homing endonuclease.

Spécifité et coupure

Modified homing endonuclease. Fin des années 90

Boost après la cristallisation des premières protéines

DAGLIDADG dans la 1ere hélice de His-Cys box

I-CreI, I-MsoI, PI-SceI dans le gros sillonLes + compactes, les + connues

I-PpoI dans le gros sillonCourbure de l’ADN cible

Interaction directe de qq AA et Ac nuc

Les plus intéressantes

Spécifité et coupure

Engineering HE DAGLIDADG

Smith et al NAR 2006

I-CreIInterface de

contact protéine/ADN

symétrie

AA cibles

Engineering HE DAGLIDADG

Modification de certains AA de

I-CreI mais conserver

64 cibles

palindrome

Smith et al NAR 2006

Engineering HE DAGLIDADGScreening de nouvelles cibles ADN palindromiques

Test de fonctionnalité en levure, coupure de lacZ-, HR, restauration lacZ+

ConclusionConclusion

Folding OK

Stabilité OK

Coupure OK

Mais9 AA contactent Ac Nucl

209 variantsImposible à cribler

X Levure bleue

site cible potentiel

Engineering HE DAGLIDADG

Découverte d’un fonctionnement en

4 sous modules

Analyse combinatoire en

petits sous problèmes

= même approche ZFP

Cible=patchwork

des mutants parentaux

Essai ciblage du gène RAG1

Recombinaison VDJMaturation des Ig

SCID phenotype

Engineering HE DAGLIDADG

- HE redessinée pour couper une séquence naturelle

- Efficacité (aussi efficace que I-SceI GT)

- Toxicité (peu ou pas toxique)

Résultats :- loci artificiels - lignées immortalisées

Et dans des cellules primaires et des gènes

endogènes ?

CELLECTIS

2007

http://www.oseo.fr/a_la_une/paroles_d_entrepreneurs/sur_lci/cellectis

PerspectivesRecombinaison et cycle de division (S/G2)

Recombinaison et accesibilité de la chromatine

Quels types de vecteurs?

Toxicité due à la perte de spécificité* tolérence de dégénérescence dans le site cible

=> coupure cryptique = génotoxicité (ZFN+++)

* HE ou ZFN fonctionnent sous la forme hétérodimèredans la cellule => formation d’homo et hétérodimère

=> homo => perte de spécificité solution dans la nature HE homodimere = un polypeptide

Engineering ZFN et HE grande avancée pour des applications en thérapie génique…

DEMAIN

I want to stay as close to the edge as I can without going over. Out on the edge you can see all kinds of things you can’t see from the center.http://www.vonnegut.com/

-Kurt Vonnegut

Réparation de l’ADN

van Attikum & Gasser Nature Reviews, Molecular Cell Biology 2005, 6 : 757-765

Lieber et al., 2004 DNA repair;

2 voies de réparation

Sans homologie

Avec homologie

Protéines ubiquitaires (MRN est partagé par les deux systèmes Lisby et al 2005 Biochimie)

6 protéines

Ku70/86, XRCCA, DNA ligase IV sont conservés de la levure à l’homme

MRN sont conservés de la levure à l’homme

Ma et al., 2005 Cell Cycle; Lieber et al., 2004 DNA repair;

Sur chaque extrémité

Nucléase reconnaît les jonctions ss et ds de l’ADN

Phosphorylation d’Artémis par ATM et PKc

Coupure

Libération du site

Ligase

Famille polymérase X

L’intervention séquentielle des 3 types de protéines est variable

La structure des extrémités reconnues est variable (5’ ou 3’ débordante, bout franc)

La nature des réparations est variable

L’hétérodimer Ku70/Ku86 très abondante--> dès l’apparition d’un DSB, Ku se fixe.

Nucléase (5’-> 3’) Sérine/Thréonine kinase une fois fixé sur l’ADN, s’autophophoryle et P Artémis

ATM active les protéines de contrôle du cycle cellulaire S et G2/M, indépendantes de la p53

PKc et Ku active l’apoptose via p53

Toutes les protéines ne sont pas toujours nécessaires

Ku/PKc n’existe pas en solution

Rapprochement des extrémités Ku? ou Pkc

Pour faire la réparation, il faut que l’ADN de la chromatine soit accessible à ces protéines.

Pour rendre ADN/nucléosome accessible

La modification la plus étudiée est le phosphorylation de l’histone H2AX sur Ser139 par les PIKK (ATM, ATR, PKc).

-H2AX recrute les enz de réparation et les enz de contrôle

H2AX est incorporée de manière aléatoire dans l’ADN.

Modification de la queue des histones acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitination

Incorporation de variants d’histones

Remodelage de la chromatine par des complexes protéiques ATP dépendant appartenant à la famille swi2/snf2

SWI2

ISWI

CHD (hélicase)

INO80

Recrutés sur les DSB

Des cellules dépourvues de H2AX ne réparent pas l’ADN et ne maintiennent pas l’intégrité du génome

Park et al 2006 EMBO J

Des cellules dépourvues des complexes SWI/SNF ne réparent pas l’ADN DSB et la survie cellulaire est affectée.

SWI/SNF complexes facilitent la réparation DSB en permettant la phosphorylation de H2AX.

H2AX phosphorylée par ATM génère des loci -H2AX qui serait le point de nucléation des protéines de réparation NHEJ et HR.

-H2AX aurait une fonction d’ancrage des extrémités DSB au travers de ces multiples intéractions afin d’éviter la séparation des extrémités.

MRN recrute ATM ATM

-H2AX

Se lient et rapprochent les extrémités DSB dans NHEJ et HR

H2AX

Bassing et al., DNA repair 2004

Evite les translocations et les délétions