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Microscopie électronique et traitement d’images Cours N°2 Traitement d’images Reconstruction d’images dans
les 3D de macromolécules biologiques Master informatique spécialité BIOMED
Catherine Vénien-Bryan!
Institut de minéralogie, de physique des matériaux et de cosmochimie (IMPMC)!
CNRS UMR 7590, UPMC!E-mail: [email protected]!
!
!
1!
Traitement d’images Particules isolées, protéines macromolécules, petits
virus (haute résolution) • Capture de l’image • Camera CEMOS • Sélection des particules et normalisation du contraste • Analyse dans les 2dimensions:
• Alignement • Classification des images
• Création du modèle dans les 3 dimensions et raffinement • Méthode des séries coniques aléatoires • Lignes communes (transformée de Radon) • Raffinement
Cellules entières, bactéries virus (moyenne résolution) • Tomographie électronique cellulaire
2!
Digital images Sampling and grey level
Discrétisation spatiale et quantification
Image Digitization
Original image Image sampled at low resolution
Grey level resolution: one bit can code for 2 states: “0” or “1” Byte (octet): a string of 8 bits can code for 28 = 256 different states Computer storage Fineness of grid (5122 = 262144) No. of different gray levels: e.g. 0-7, 0-63, 0-255 28 = 256, 8 bits or 1 byte
Pixel size The image must be divided up into pixels (sampled) at a spacing at least twice as fine as the finest detail (highest frequency) to be analysed. (in practice, 3-4x as fine).
Each picture element stored in the computer, with its own grey level, is called a pixel.
3!
Digital images Sampling-1
More!is!be,er!!!!
4!
Digital images Sampling -3 - spatial resolution Théorème de Nyquist-Shannon
Nyquist-Shannon frequency: the sampling frequency is twice the highest frequency term being represented.
If the same sampling frequency is used for a higher frequency wave, the sample points do not follow the oscillations. The features will not be correctly represented in the image.
Remember that the image can be represented as the sum of a series of sinusoidal waves. The highest frequency wave term present defines the resolution limit. When an image is digitised, the wave components are sampled at an interval defined by the scanner step size.
• In practice, it is necessary to sample at 3-4x the resolution, to avoid numerical rounding errors.
5!
Digital images Scanning – number of grey levels-1
144 72 16
8 4 2 6!
NEW!GENERATION!CAMERA:!
Direct!Electron!DetecAon!camera!
the!world!before!direct!detecAon!camera!
!
!
!
Although!the!quality!of!microscopes!has!steadily)improved,!two!key!limi/ng)factors)has!been:!!
!
• The!quality!of!image!recording!mediumO!DQE!(scinAllatorObased!CCD!cameras!and!even!film)!
!
• The!image!blurring!caused!by!!
o !Instability!of!the!sample!stage!!
o !MoAon!induced!by!the!illuminaAng!electron!beam!
!
The!low)signal5to)noise)ra/o)(SNR))image!quality!can!substanAally!limit!how!!
accurately!these!parameters!can!be!determined!
The!new!generaAon!of!complementary!metalOoxide!semiOconductor!
!(CMOS)!cameras!can!overcome!both!limiAng!factors!
O Improved!signalOtoOnoise!performance!
O Fast!enough!to!follow!parAcle!movements!during!electron!irradiaAon!!!
7!
Direct!Electron!DetecAon!camera!
the!world!before!direct!detecAon!camera!
!
Scin/llator)based)camera:)The!resoluAon!is!limited!by!the!
sca,ering!of!the!electron!in!the!
scinAllator!or!the!fiber!opAcs.!This!
point!spread!funcAon!(PSF)!grows!at!
higher!beam!energies!
!
5Direct)detec/on)camera)receives!the!incoming!electrons!directly!
to!the!imaging!sensor.!
!OEach!pixel!contains!a!photo!detector!and!acAve!amplifier!that!is!
addressed!and!read!out!individually!!
ODirect!Detector!sensor!uses!much!smaller!pixels!(5um)!!
Tradi/onal)camera)
8!
Direct!Electron!DetecAon!camera!
DQE!curves!
!
CombinaAon!of!
OVery)low)noise)OSuperior)contrast)performance!(high!DQE)!!
Allows!very!significant!improvements!in!the!
detectability!of!small,!low!contrast!objet!
!
9!
Direct!Electron!DetecAon!camera!
FracAonaAon!mode!OO!Dose!fracAonaAon!
!Each!image!is!made!of!many!sequen/al)frames,)it!is!recorded!like!a!movie))Full!frame!are!read!at!an!extreme)speed)so!the!dose!from!a!single!exposure!is!spread!over!
many!sequenAal!frames!held!in!the!so^ware!
)This!frac/ona/on)mode)allows!to!monitor!
!
O The!sample!movement!or!stage!dri^!during!the!illuminaAon!!
O The!sample!damage!under!irradiaAon!
O The!freedom!to!chose!which!frames!to!include!in!an!image:!full!dose!exposure!for!
parAcle!selecAon!(high!SNR!but!more!irradiaAon)!but!part!of!the!exposure!(iniAal!
frames!to!a!lower!dose)!for!the!3D!reconstrucAon!!!
O To!compensate!for!sample!movement!or!stage!dri^:!moAon!correcAon!!
!
!
!
!
10!
Direct!Electron!DetecAon!camera!
Monitoring!the!MoAon!!
!
Li#X,et#al.,#Nat#Methods.#2013#Jun;10(6)#
This!moAon!induces!image!blurring!!
11!
Direct!Electron!DetecAon!camera!
MoAon!correcAon!
!
Average!speed!of!moAon!from!the!
!enAre!data!set!of!553!images!versus!
!subframe!number!!
In!the!case!of!the!proteasome!20S,!
images!were!taken!with!a!series!of!
frame!total!up!to!25!frames!!
12!
Direct!Electron!DetecAon!camera!
MoAon!correcAon!restores!the!lost!highOresoluAon!informaAon!!
!
!
image!of!frozen!hydrated!T.!acidophilum!20S)proteasome)embedded!in!
vitreous!ice!and!recorded!with!a!defocus!of!~0.9!μm.!!
Electron!micrograph!of)rotavirus)frozen.!Image!
recorded!using!adirect!electron!
detector!in!movie!mode!at!40)frames/sec!!#
B:!the!frames!have!been!aligned!to!
compensate!for!this!movement,!the!
image!shows!significantly!reduced)blurring)and!improved)contrast.!Grigorieff#N,#elife#2013!
A:!60!frames!have!been!
averaged!without!alignment,!
the!image!is!blurred!due!to!
beamOinducted!movement.!
!
13!
Direct!Electron!DetecAon!camera!
Ribosome!structure!detecAon!of!movement!
tracking!the!movement!of!the!parAcles!
!
!
Ribosome#structures#to#nearEatomic#resoluFon#from#thirty#thousand#cryoEEM#parFcles.#Bai#XC,#Fernandez#IS,#McMullan#G,#Scheres#SH.#Elife.#2013;2:e00461.#doi:#10.7554/eLife.00461.#Epub#2013#Feb#19#
16!frames!videos!during!1s!exposure.!At!a!total!doses!of!16!electrons/Å2,!each!individual!
video!frame!integrates!less!than!a!electron/Å2.!
Alignment)method:)uses)addi/on)sta/s/cs)to)predict)the)movement)of)the)par/cles)caused)by)the)electron)beam))
14!
ApplicaAon!of!the!staAsAcal!video!processing!procedure!to!an!80S!ribosome!data!set!!
ResoluAon:!�4!Å!resoluAon!using!unprecedented!small!number!of!parAcles!(15202)!
To!compare!with!5.5Å!resoluAon!with!1.4!million!parAcles,!tradiAonal!EM!technology!
The!fuzzy!appearance!for!the!
density!of!the!40S!subunits!
(green!and!red!lines)!is!an!
indicaAon!structural!
heterogeneity.!!
Ribosome#structures#to#nearEatomic#resoluFon#from#thirty#thousand#cryoEEM#parFcles.#Bai#XC,#Fernandez#IS,#McMullan#G,#Scheres#SH.#Elife.#2013;2:e00461.#doi:#10.7554/eLife.00461.#Epub#2013#Feb#19#!
15!
Resolu/ons)achieved)using)electron)cryo5microscopy)tradi/onal)methods!
Most!of!the!obtainable!resoluAon!have!been!in!
the!5!to!10Å!regime,!which!is!sufficient!for!
docking!crystal!structures!but!NOT!for!de!novo!
structure!determinaAon!!
16!
Direct!Electron!DetecAon!Camera!
Structure!of!a!proteasome!20S!at!3.3Å!resoluAon!
Electron)coun/ng)and)beam5induced)mo/on)correc/on)enable)near5atomic5resolu/on)single5par/cle)cryo5EM!
Li!X,!Mooney!P,!Zheng!S,!Booth!CR,!Braunfeld!MB,!Gubbens!S,!Agard!DA,!Cheng!Y.!
Nat!Methods.!2013!Jun;10(6):584O90.!doi:!10.1038/nmeth.2472.!Epub!2013!May!5.!
!
!
!
XOray!3.4Å!EM!3.3Å!
FEIOPolara!300kV!
Direct!Electron!Camera!
1Å/pixel!1O2!um!defocus!
Total!dose!25e/Å2!
Dose!rate!10e/pix/sec!
!
17!
Sampling - grey scale resolution
Film scanners generally scan into 8 bits (256 grey levels) or more. But if they are not set up correctly it is quite possible to end up with a digital image represented by far fewer grey levels. This can lead to degradation of the image and loss of resolution.
Scaled into 256 grey levels
5 grey levels
3 grey levels
18!
Noise reduction by averaging
Averages of 2 5 10 25 200 images
Raw images
19!
Variance
For a stack of aligned images, the variance can be calculated for each pixel, to give a map of variations between the images in the data set. This can help to assess the reliability of features seen on the average image, and can reveal if images of different structures are mixed up in the same data set.
The variance is determined for each pixel as the difference between the pixel value in a given image and the average value of that pixel in all the images. This difference is squared and the sum of these squares is calculated for all the images in the stack.
Variance = [1/(N-1)] Σ[Pi(rj) - Pav (rj)]2
where Pi(rj) is the value of pixel j in image i and Pav (rj) is the average value of pixel j in all the images, for a set of N images.
i,,j
20!
Analyse)d’images)dans)les)2D)Sélec/on)des)par/cules)(hemocyanin!Helix#pomaFa))
21!
Normalisation du contraste Soustraction de la moyenne et division par l’écart type
22!
Alignement et fonctions de corrélation
Corrélation croisée 2D
A!=!Ref! B!=!Image!
and =
B!est!translaté!et!à!chaque!posiAon!de!B!!
en!X!et!Y!un!nouveau!coefficient!de!corrélaAon!!
est!calculé.!
!
Le!résultat!final!est!une!carte!bidimensionnelle!dont!la!taille!!
correspond!à!celle!des!images!d’origine!et!qui!possède!un!!
pic!de!corrélaAon!qui!correspond!à!la!translaAon!de!B!pour!!
laquelle!les!deux!disques!se!superposent!parfaitement.!
La!posiAon!du!pic!par!rapport!à!l’origine!(centre!de!la!carte)!
correspond!au!vecteur!de!translaAon!à!appliquer!pour!
recentrer!l’image!B!par!rapport!à!l’image!A!(x!+15!,!y!O15).!!
y!
X!
ΣΣ!!k(i,j)!.!f(i+n,j+m)!
k(i,j)! f(i,j)!
X!translaAon!n!=!0!!
Y!translaAon!m!=!0!
23!
Alignement et fonctions de corrélation
Fonction d’Auto-Corrélation = FAC
C’est!la!corrélaAon!croisée!d’une!image!avec!elleOmême!
Image! ACF!
La!FAC!est!une!foncAon!“Centrée”!
Fmax!toujours!à!la!posiAon!X!=!0!et!Y!=0!
!
La!FAC!est!une!foncAon!“Paire”!!
F(x,y)!=!F(Ox,Oy)!!24!
Corrélation croisée angulaire
Une!image!B!(supposée!centrée)!est!placée!sur!une!!
image!de!référence,!et!pour!chaque!rotaAon!de!B,!on!mesure!
leur!coefficient!de!corrélaAon.!
Alignement et fonctions de corrélation
ref!
B!
RotaAon!angle!
correlaAon!
La!corrélaAon!est!calculée!sur!une!série!de!!
rayons!et!la!valeur!globale!est!inscrite!en!!
foncAon!de!l’angle!de!rotaAon.!
25!
Exemple d’alignement sur une référence
Référence!!!!!!!!!!!!image!B!
FAC!ref!!!!!!!!!!!!!!!FAC!B!
CorrélaAon!croisée!angulaire!des!FACs!
Mais!comme!les!FACs!sont!des!foncAons!paires,!
il!y!a!une!ambiguïté!de!180°!sur!l’angle!de!
rotaAon!qu’on!trouve!en!calculant!leur!
corrélaAon!croisée!angulaire.!
On!calcule!les!FACs!des!images!
pour!obtenir!une!représentaAon!!
centrée!et!reflétant!parAellement!
la!structure!des!parAcules.!
Alignement et fonctions de corrélation
26!
Fmax!=!0.91! Fmax!=!0.76!
!
Alignement!et!foncAon!de!corrélaAons!
Alignement!sur!une!référenceO2!
27!
D’autres méthodes d’alignement ont été proposées pour minimiser l’influence de l’image de référence.
"Reference free" iterative alignment (Penczek et al., 1992) : 1) Ici deux images sont prises au hasard, alignées et leur moyenne est alors utilisée comme nouvelle référence pour aligner une troisième image. Le processus se reproduit itérativement jusqu’à ce que toutes les images soient alignées. 2) Pour minimiser l’influence de l’ordre dans lequel les images ont été choisies pendant l’alignement, on repart ensuite à l’envers, en réalignant la première image et en la réalignant sur (Moyenne totale - l’image 1). Puis la seconde image est réalignée sur (Moyenne totale - l’image 2), etc … 3) Le processus entier est recommencé à nouveau sur les images issues de ce premier cycle d’alignement (étapes 1 et 2), jusqu’à ce qu’aucune amélioration ne soit constatée d’un cycle au suivant. "multi-reference alignment" et d’autres méthodes d’alignement utilisent la classification en parallèle du processus d’alignement.
28!
Exemple)de)centrage)et)d’alignement),)hemocyanin51)
29!
Classification 2D Brétaudière JP and Frank J (1986) Reconstitution of molecule images
analyzed by correspondence analysis: A tool for structural interpretation. J. Microsc. 144, 1-14.
30!
Classifica/on)2D53)
31!
Image No1
Image No80
Pixel 1 Pixel 2754
x ij
Classifica/on)2D54)Matrice!
32!
Méthode de la dragée
Espace à 2754 dimensions
λ2!
λ3!
λ1!
Axe!factoriel!1!
Axe!factoriel!2!
Axe!factoriel!3!
La!diagonalisaAon!de!la!matrice!carrée!T = X'X!permet!de!déterminer!la!plus!grande!direcAon!d’extension!
de!nos!données!(nuage!de!points)!dans! l’espace!mulAOdimensionnel.!Ce,e!direcAon!d’extension!correspond!à! la!
plus!grande!«!variaAon!»!ou!«!tendance!»!au!sein!de!nos!données.!C’est! l’axe!factoriel!N°1!dont! l’amplitude!est!
caractérisé!par! la!valeur!propre!λ1.!On!effectue!alors!un!changement!de!repère!pour!déterminer! la!posiAon!de!
chacune! de! nos! données! (images)! par! rapport! à! cet! axe! factoriel.! Puis,! on! recherche! la! seconde! plus! grande!
direcAon!d’extension!«!orthogonale!»!à!la!première!pour!définir!l’axe!factoriel!N°2!caractérisé!par!une!amplitude!
de!λ2.! Le! fait! que! les! axes! factoriels! N°1! et! 2! soient! orthogonaux,! indique! qu’ils! caractérisent! des! variaAons!
indépendantes!(nonOcorrélées).!On!exprime!ainsi!par!ordre!décroissant!toutes!les!variances!indépendantes!de!nos!
données!sur!les!axes!factoriels!N°1,!2,!3,!4!,etc!…!!!
Classifica/on)2D55)Créa/on)d’une)matrice)a)2758)dimensions)
)
33!
34!
35!
Classification 2D a) Méthodes par partition: e.g. "Moving seeds" method Diday E (1971) La méthode des nuées dynamiques. Rev. Stat. Appl. 19, 19-34.
Deux images prises au hasard servent de centres d’agrégation pour la partition. Les centres de gravité de chaque classe servent de nouveaux centres d’agrégation pour un nouveau cycle de partition. Arrêt lorsque les centres d’agrégation ne bougent plus d’un cycle à l’autre, ou après un nombre déterminé d’itérations.
36!
Classification 2D b) Classification Ascendante Hiérarchique
1! 2!
3!
4!
5!
1! 2!
3!
4!
5!
1! 3!
6!
6!
5!2!
7!
7!
4!
8!
8!
37!
38!
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39!
Contrainte)de)la)cryoMET)sur)objets)biologiques):))Travailler!à!faible!dose!d'électrons!(10e
O/Å
2)!
Seulement!1!(ou!2)!prise(s)!de!vue(s)!!par!zone!
Collecter!N!images!à!faible!rapport!signal/bruit!
Avec!une!forte!sousOfocalisaAon!(contraste)!
Calculer!des!moyennes!numériques!2D!ou!3D!
Corriger!la!foncAon!de!transfert!de!contraste!(CTF)!
!
UAliser! les! symétries! et/ou! disposiAon! des!
parAcules:!
Symétrie!hélicoïdale,!icosaédrale,!réseaux!2D,!
ou!pas!de!symétrie.!
!
La)reconstruc/on)d’un)modèle)préliminaire)3D)L’acquisition des séries coniques aléatoires
Les méthodes de reconstructions
Réduction de l'effet du cône manquant !
40!
Série!de!projecAons!
inclinées!
Calcul!d’un!volume!
de!reconstrucAon!3D!!
par!rétroprojecAon!
Principe)de)la)tomographie)moléculaire)(1)!!
41!
2!5 4 3
6 7 1
Espace!de!Fourier!
1 2 7 6 5 4 3
Théorème!de!la!secAon!centrale:!
En!espace!réciproque,!toute!projecAon!biO
dimensionnelle! d’un! objet! correspond! à!
une! secAon! centrale! dans! la! transformée!
de! Fourier! 3D! de! l’objet.! Chaque! secAon!
centrale!est!orientée!perpendiculairement!
à! la! direcAon! de! projecAon! (direcAon! du!
faisceau!d’électrons).!!
Principe)de)la)tomographie)(séries)inclinées))(2)!!
42!
X y
Z
ϕ θ ψ !
!!
X
Y
Z
Les!convenAons!SPIDER!
concernant!les!angles!eulériens.!
ϕ = phi = rotation autour de Z&θ = theta = rotation autour de Y&ψ = psi = rotation autour de Z 43!
La)reconstruc/on)d’un)modèle)préliminaire)3D)L’acquisition des séries coniques aléatoires
Les méthodes de reconstructions
44!
0°
45°
1!2!
5
4 3
6 7 8 1 2 8 7 6 5 4 3
ParAcules!isolées:!Avec!seulement!deux!prises!de!vues!on!peut!!
calculer!un!volume!de!reconstrucAon!
Séries!coniques!aléatoires!
45!
1!
2!
5
4 3
6 7 8
Espace!de!Fourier!
Principe!de!la!
reconstrucAon!!
conique!aléatoire!
Z
ReprésentaAon!sur!une!sphère!de!la!série!de!projecAons!comme!une!série!de!points!
situés!aux!intersecAons!entre!une!sphère!englobant!l’objet!et!les!vecteurs!de!projecAons!
dirigés!vers!le!centre!de!la!sphère.!Pour!une!série!conique!les!points!sont!disposés!en!
cercle.!
Sphère!de!topologie!
46!
X!
Y!
Z!
47!
Simple!backOprojecAon!!
Reciprocal!space! halfOvolume!
φ!=36°! φ!=36°!
Once!the!3!Euler!angles!are!determined,!the!3D!reconstrucAon!can!be!performed!from!the!AltedO
specimen!projecAons.!The!simple!backOprojecAon!is!nothing!more!than!adding!in!reciprocal!space!
the! FT! of! the! 2D! projecAons! in! their! relaAve! orientaAons! (waffleOlike! distribuAon! of! central!
secAons),!followed!by!Fourier!transform!of!this!3D!distribuAon!to!come!back!in!real!space.!
Uneven!distribuAon!of!the!signal!
Why!does!it!look!so!bad?!
48!
Weigthed!backOprojecAon!
Reciprocal!space! halfOvolume!
φ!=36°! φ!=36°!
Missing!cone!
Similar!as!previously,!but!a^er!applying!a!bandOpass!filtering!or!weigh/ng!of!the!signal!(lowering!contribuAon!in!low!spaAal!frequencies).!!!
It!is!be,er,!but!we!have!a!nonO
isotropic!reconstrucAon.!Why!?!!
49!
0°!
45°!
45°! 0°
0°!
45°!
Exemple)de)reconstruc/on)à)par/r)des)images)expérimentales!(Hémocyanine!d!’Helix#pomaFa,#symétrie!D
5)!
50!
Vues!de!côté!brutes! Mêmes!images!alignées!
Alignement!
DéterminaAon!
de!l!’angle!(φ)&
ClassificaAon!automaAque!!!5!vues!
Calcul!d’un!volume!par!classe!à!parAr!des!images!inclinées!
Assemblage!des!volumes!alignés!!
51!
Surface!externe! Cavité!centrale!
Hémocyanine!d’Helix#pomaFa#
52!
A)retenir)sur)l’approche)des)série)coniques)aléatoires)1! Ce,e!méthode! nécessite! de! collecter! des! images! avec! et! sans! inclinaison! dans! le!
microscope.!La!microscopie!a!un!faible!rendement!car!il!y!a!des!effets!de!charge!et!
de!superposiAon!parAelle!des!parAcules!qui!ne!sont!pas!maîtrisables.!
2!La!technique!foncAonne!même!sur!les!images!à!faible!rapport!signal!/!bruit!de!fond!
!!on!travaille!donc!sur!les!images!brutes.!
3!Il!y!a!toujours!un!artéfact!du!cône!manquant!qui!peut!être!supprimé!si!on!regroupe!
des! volumes! correspondant! à! des! vues! différentes! de! la! parAcules,! ou! si! la!
parAcules!a!des!symmétries! internes!favorables.! (exemple:!parAcule!cylindrique!à!
symétrie!D5:!Les!vues!de!dessus!produisent!un!volumes!anisotrope!avec!un!artéfact!
du!cône!manquant!alors!que!les!vues!de!côté!produisent!un!volume!isotrope).!
53!
Les)méthodes)d’affinement)de)l’alignement)et)de)la)reconstruc/on)
ART5SIRT)
54!
Require!a!reference!3D!model.!
!
Real!space!:!!
Shaikh!T.,!Gao,!H.,!Baxter,W.T.,!Asturias,!F.J.,!Boisset,!N.,!Leith,!A.,!and!Frank,!J.!(2008)!SPIDER!image!processing!
for!singleOparAcle!reconstrucAon!of!biological!macromolecules!from!electron!micrographs!Nature#Protocols#3!(12)!1941O1974.!SPIDER!so^ware!
Penczek,!P.A.,!Grassucci,!R.A.,!Frank,!J.!(1994)!The!ribosome!at!improved!resoluAon:!new!techniques!for!merging!
and!orientaAon!refinement!in!3D!cryoOelectron!microscopy!of!biological!parAcles.!Ultramicroscopy!53:!251–270.!Spider!so^ware!
Fourier!transform:!
Grigorieff,!N.!(1998).!ThreeOdimensional!structure!of!bovine!NADH:!ubiquinone!oxidoreductase!(complex!I)!at!22!A!
in!ice.!J.#Mol.#Biol.!277:!1033–1046.!Jonic,!S.,!Sorzano,!C.O.,!Thevenaz,!P.,!ElOBez,!C.,!De!Carlo,!S.!&!Unser,!M.!(2005).!SplineObased!imageOtoOvolume!
registraAon!for!threeOdimensional!electron!microscopy.!Ultramicroscopy!103(4),!303O17.!
Radon!transform:!Radermacher,!M.!(1994).!ThreeOdimensional!reconstrucAon!from!
random!projecAons:!orientaAonal!alignment!via!Radon!transforms.!Ultramicroscopy)53:!121–136.!Wavelet!transform:!Sorzano,!C.O.,!Jonic,!S.,!ElOBez,!C.,!Carazo,!J.M.,!De!Carlo,!S.,!Thevenaz,!P.!&!Unser,!M.!
(2004).!A!mulAresoluAon!approach!to!orientaAon!assignment!in!3D!electron!microscopy!of!single!parAcles.!J!
Struct!Biol!146(3),!381O92.!
Polar!Fourier!transform:!Baker,!T.S.!&!Cheng,!R.H.!(1996).!A!modelObased!approach!for!determining!
orientaAons!of!biological!macromolecules!imaged!by!cryoelectron!microscopy.!J!Struct!Biol!116(1),!120O30.!!
!
So^ware:!!SPIDER,!IMAGIC,!XMIPP,!EMAN,!etc.!
Methods)for)refinement)of)alignment)and)reconstruc/on!!
55!
Methods)that)quan/ze)the)alignment)parameters)(1))
�������
��������
Direct!a,ribuAon!of!Euler!angles!to!the!
experimental!images!by!comparison!
with!2D!projecAons!of!a!lowerO
resoluAon,!reference!volume.!!
Reference)projec/ons!(projecAons!of!a!reference!volume,!
discrete!number!of!projecAon!direcAons)!
56!
Methods)that)quan/ze)the)alignment)parameters)(2))
One!of!the!global!refinement!strategies.!
Egelman!2000,!Ultramicroscopy,!85:!225O234.!
Global)refinement!
Angular!sampling!step!for!
computaAon!of!the!library!of!
reference!projecAons!is!
reduced!in!each!iteraAon!of!the!
refinement.!
57!
Autres)méthodes)de)reconstruc/on)d’un)modèle)préliminaire)3D)L’approche!des!lignes!communes,!sinogrammes,!transformée!de!Radon!
58!
La)méthode)des)lignes)communes)(Elena)Orlova)EMBO)2003))
4 orientations du GroEL-GroES
Les projections 2D correspondantes
Transformée de Fourier 3D.
Lorsque toutes directions de l’espace sont représentées, la transformée inverse produit un volume de reconstruction 3D isotrope.
Les transformées de Fourier 2D
zzz!Each!2D!transform!is!a!
central!secAon!of!the!3D!
transform!of!the!object.!!
!So!each!pair!of!2D!
transforms!has!a!common!
line!
!
59!
2D))))))))))1D)
Projection 2D
α&
00&
3600&
Le « sinogram » d’une image 2D correspond à l’empilement de ses différentes projections 1 D ( l i g n e s ) d a n s toutes les directions (0° à 360°).
y
α&
00 ≤ α ≤ 3600&
00&
3600&
60!
Les lignes communes en espace réel:
La méthode des lignes communes est basée sur le fait que :
N’importe quelle paire de projections 2D d’un objet 3D a au moins une ligne commune dans leurs projections 1D respectives.
61!
Projections Views
62!
Crossinocorrelation function
Image 3 Image 1
-6
-4
-2
0
2
4
6
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121
-6
-4
-2
0
2
4
6
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121
-6
-4
-2
0
2
4
6
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121
900 2700
3100
1300
63!
Projections
Sinograms
C5 D5
64!
A)retenir)sur)l’approche)des)lignes)communes))et)des)sinogrammes)
1!Ce,e!méthode!permet!de!collecter!des!images!sans!inclinaison!dans!le!microscope.!
2! Les! sinogrammes! ne!marchent! que! sur! des! images! à! fort! rapport! signal! /! bruit! de!
fond!!!on!travaille!donc!sur!des!moyennes!2D!
3!Le!centre!de!masse!des!moyennes!2D!doit!coïncider!avec!le!pixel!central!des!images.!
Le! plus! peAt! décalage! introduit! un! biais! dans! la! déterminaAon! des! lignes!
communes.!
4!La!structure!3D!d’une!parAcule!produite!par!ce,e!approche!a!une!chance!sur!deux!
d’être!le!mauvais!énanAomorphe.!Il!faut!donc!réaliser!au!moins!une!fois!une!paire!
de!prises!de!vues!avec!le!porteOobjet!incliné!à!0°!et!à!15~30°!pour!vérifier!qu’on!a!
bien!produit!le!bon!énanAomère.!
5!La!technique!marche!d’autant!mieux!que!la!parAcule!possède!des!symétries!internes.!
65!
Tomographie)électronique)cellulaire))
An object viewed from many different angles will generate slightly different images.
66!
These images can be recorded and analyzed to create a tomographic rendering of the specimen.
Object creates multiple images so the inverse is also possible
T!
Tomographie)cellulaire)
67!
Electron Tomography
Double!Alt!holder!Double!Alt!holder!
68!
Electron!Tomography!of!kinetochores!
69!
ReconstrucAon!of!Golgi!
70!
Microscopie!électronique!!
Ce!qu’il!faut!retenir!O!
O Pourquoi)u/liser)cet)ou/l?)La!cryoOmicroscopie!
OAvantage:!environnement!naturel!Inconvenient:!peu!de!contraste,!et!tres!fragile!!
(faible!dose!nécessaire)!
O Résolu/on!!!Quelles!sont!les!limitaAons!pour!obtenir!une!résoluAon!élevée?!
!(microscopes!peu!performant,!aberraAon!du!ME,!échanAllon!pas!tres!homogene)!
!
Les)méthodes)pour)aligner)dans)les)2D)et)reconstuire)dans)les)3D)un)volume)Odigitaliser!l’image!!echanAllonage!et!quanAficaAon!normalisaAon!
Centrage!reference!free!mulAreference!
ClassificaAon!KOmean!
!
ReconstrucAon!d’un!modele!3D.!
Methode!des!series!coniques!aleatoie!
Osinogramme!
ORafinement!de!la!structure!3D,!Back!projecAon,!ART!SIRT!
!!
!
71!
