Physicochimie de Macromolécules - lism.cnrs-mrs.fr · M1 BBSG/BE/MBVB – Physicochimie 2.1 James Sturgis 1 Physicochimie de Macromolécules Physicochimie des protéines Evolution

M1 BBSG/BE/MBVB – Physicochimie 2.1 James Sturgis 1

Physicochimie de Macromolécules

Physicochimie des protéines

Evolution et physicochimie

James SturgisJeanPierre Duneau

[email protected]mrs.fr


Sommaire Aujourd'hui

● But du programme

● Organisation des enseignements

● Organisation de l'examen

● Resources ● Rappels– Evolution

– Génétique

– Mutation

– Selection


But du programme

● Donner une introduction– A la physicochimie des

protéines

– A l'analyse de fonction

– Aux relations structurefonction

● Voir comment metre en evidence les liens structurefonction.

● Renforcer votre anglais scientifique.


Organisation des Enseignements

● Les Cours (JS) ● Les TD (JPD)

● Analyse des données– Pratiquer la conversion des

mesures experimentales en valeurs utiles.

– Comment lire un article scientifique.


Sommaire des cours

● Introduction

● Mutation et Evolution

● Oies et Poissons

● Variations intraespeces

● Vers et Neurones

● La Famille


Organisation de l'examen

● Exercise

● Question de Synthèse

● Seront inclus dans l'examen:– Les cours

– Les TD


Resources

● Les transparents – Site web du département.

● Les TD– Site web du département.

● Les articles pour approfondissement.

http://biologie.univmrs.fr/

http://lism.cnrsmrs.fr/JS_files/Teaching/index.html


Mutation et Evolution

Rappels sur...L'evolution, la génétique, les mutations

la selection et quelques nouvautés!


Sommaire

● Rappels sur l'évolution et la génétique

● Les origines de variation

● Sélection

● Absence de sélection

● Importance de l'évolution

Variants du papillon Biston betularia


Rappels évolution

● Variabilité individuelle

● Transmission de cette variabilité aux enfants

● Sélection des individus les plus adaptés à l'environnement

Darwin avait 31 ans quand il élaborait sa théorie.

Aujourd'hui nous pouvons examiner les bases moléculaires de ces trois points.


Rappels génétique




● Les bactéries sont simples...– Une copie d'un simple

chromosome● parfois deux ● parfois des plasmides

– Qui est répliqué – et une copie distribuée

à chaque cellule fille.Transmission d'une seule copie de l'ensemble du patrimoine génétique par l'unique cellule génitrice aux deux cellules filles.


Rappels génétique

Transmission d'une copie (ou plusieurs copies) du patrimoine génétique par chaqun de deux progenitors aux enfants.

● Les eukaryotes sont plus complexes...– Plusieurs copies de

plusieurs chromosomes– Qui sont répliqués– Réorganisés (linkage)– La moitié des

chromosomes hérités de chaque parent.








Les origines moléculaire de la variabilité génétique

● Changements des séquences d'ADN – Codants et – Noncodants

● Réorganisations d'ADN– Délétion– Transposition– Insertion

Transposons et virus, systèmes de réparation





Les origines moléculaire de la variabilité génétique

● Changements des séquences d'ADN – Codants et – Noncodants

● Réorganisations d'ADN– Délétion– Transposition– Insertion

Erreurs de reproduction, mutations pontuelles.

Plus facile a comprendre au niveau de la protéine.





Mutations et Protéines




● Mutation rates:– Jukes Cantor (1969)

– Kimura (K2P1980)

– Plus complexe

GA

C T

GA

C T


Mutations et Protéines




● Si les fréquences des mutations sont previsibles les résultats ne sont pas.

● Code génétique


Mutation et sélection

● Une fois qu'une mutation est faite le nouvel allèle peut être:– Perdu

– Fixé (transmis dans la population).

● On parle de la penetration d'une allèle dans la population.





Dérive génétique et sélection

● Son sort dépend de– La pression de sélection

– La dérive génétique (chance)





Même dans l'absence de sélection la pénétration d'un allèle dans la population varie de generation en generation.

Avec une petite population c'est parfois très rapide

F(0): p(bleu) = 0,5


La moitié de la population ont des enfants




F(0): p = 0,5

F(1): p = 0,7





La probabilité de l'allèle (p) change avec chaque génération. Il n'y a aucune tendance à retourner à la distribution initiale.

F(0): p = 0,5

F(1): p = 0,7

F(2): p = 0,9F(3): p = 0,8F(4): p = 0,9F(5): p = 1,0


La mutation (bleu) est fixé en absence de selection.



Dans une population la dérive génétique s'assure que même dans l'absence de toute sélection une mutation sera eventuellement fixée (p = 1) ouperdue (p = 0)

La dérive génétique n'a aucun direction.Elles accumule avec le tempsElle cause la perte de la variabilité génétique d'une population.Elle augmente la variabilité entre populations.

Une pression de sélection peut augmenter la vitesse d'une dérive génétique en diminuant la population – sans que l'allèle ait la moindre influence sur la survie!!

Considérer les effets des liens génétique...



● les mutations augmentent la variabilité génique

● la sélection et la dérive génétique diminuent la variabilité génétique.

● Tous les deux modifient les séquences des gènes et des protéines.

Quelle est l'importance rélative de la sélection et de la dérive génétique dans la détermination de la séquence d'une protéine?

Tous les différences ne sont pas dû a la sélection.


Le Paradigme (Biologie Moléculaire)

Séquence du Géne

Séquence de la Protéine

Structure de la Protéine

Fonction de la Protéine





Le Paradigme (Evolution Moléculaire)

Séquence du Génome

ARN messagerSéquence, Quantité et Patron d'expression

ProtéineSéquence, Quantité et Patron d'expression

Structure

FonctionBiochimique Cellulaire Physiologique

Résistance à la séléction






Structure





Pour le comprendre il faut examiner des systèmes modeles un peu plus simples...

Les plus grandes difficultés sont d'établir les liens en structure – fonction et ecologie.




Structure




Etude de l'evolution moléculaire

● Comment éclaircir les liens entre séquence et niche écologique?

● Manipuler d'une façon expérimentale la variabilité et la pression de sélection.– Evolution dirigée...

– Mutagénèse dirigée...● Etudier la variation naturelle.

Facile a comprendre les resultats... difficile d'en avoir beaucoup.

Maintenant!

Facile d'avoir beaucoup de resultats... dificle de les comprendre!

Les autres cours!


Evolution dirigée

● Comment éclaircir les liens entre séquence et niche écologique?

● Manipuler d'une façon expérimentale la variabilité et la pression de sélection.– Evolution dirigée...

– Mutagénèse dirigée...● Etudier la variation naturelle.

Evolution d'une fucosidase à partir d'une glucosidase.

Protocol de DNAshuffling et sélection un exemple d'évolution dirigée.

Zhang JH, Dawes G. and Stemmer W.P. 1997. Directed evolution of a fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94: 45044509.


DNAshuffling

Fragmentation aléatoire

Réassemblage par PCR (mutagénique et recombinogénique)

Criblage (hydrolyse du nouveau substrate)


DNAshuffling

● Fragmentation aléatoire.● Réassemblage par PCR

– Mutagénique et

– Recombinatoire● Criblage


DNAshuffling


– Mutagénique et



DNAshuffling


– Mutagénique et



DNAshuffling


– Mutagénique et



DNAshuffling


– Mutagénique et



DNAshuffling


– Mutagénique et


Nouvelle sequence différente des originals


DNAshuffling


– Mutagénique et


Nouvelle sequence différente des originals

De plus introduction de mutations


DNAshuffling


– Mutagénique et



DNAshuffling

Ce protocol donne après 8 cycles une fucosidase (presque)....

Glucosidase FucosidasePNPG k

cat (s1) 268 31

KM

(mM) 0,04 0,18

kcat

/KM

6700 172

PNPF kcat

(s1) 209 97K

M (mM) 31 1,5

kcat

/KM

6,7 64,4

Specificity 1000 2,7


DNAshuffling

Quelles sont les modifications de séquence...

t/cg/a g/a

t/c

c/t a/g a/g a/g a/g a/g

g/a

g/ac/t

D908

NN604

S

Q573

R

P511

SQ135

RV9IV/P

G/S

13 mutations ponctuelles – 6 changements dans la séquence protéique de la galactosidase – 5 changements silencieux


DNAshuffling

Quelles sont les modifications de la structure...

Quatre changements sur la surface:V

9I, Q

135R P

511S D

908N

Un changement proche de la site active:Q

573R

et un changement dans la site de liaison de substrat: N

604S


DNAshuffling

Quelles sont les modifications de séquence...

t/cg/a g/a

t/c

c/t a/g a/g a/g a/g a/g

g/a

g/ac/t

D908

NN604

S

Q573

R

P511

SQ135

RV9IV/P

G/S

Résidu dans la site actif

1 ou 2 sur 13 (715%) mutations probablement important – résultat de sélection positive et les autres 11 d'une dérive génétique.

Modification du niveau d'expression?


Liens séquence – ecologie

● Actuellement nos connaissances ne suffisent pas dans la plupart des cas pour voir les relations entre une séquence protéique dans un organisme et sa niche écologique.


Evolution Moléculaire

Pour le comprendre il faut examiner des systèmes modeles un peu plus simples...

Les plus grandes difficultés sont d'établir les liens en structure – fonction et ecologie.

● Rôle physiologique important.

● Patron d'expression simple.

● Structure et fonction biochimique bien établis.


Hémoglobine – les essentiels

Structure

● La protéine a une structure complexe.

● L'hémoglobine est un tetramère

– Dans l'homme l'HbA est fait de deux chaines et deux chaines .


Structure

Monomère d'hémoglobine

A

BC

D

EFG

H

● La protéine a une structure complexe.

● L'hémoglobine est un tetramère

● Chaque monomère a une chaine repliée en 8 hélices



● La forme de la courbe de saturation pour:– Myoglobine est

hyperbolique

– Hémoglobine est sigmoïde

● C'est dû à la coopérativité.

Coopérativité



Au niveau moléculaire comment expliquer la coopérativité?

D'abord il faut plusieurs sites de fixation.

Il faut que les différentes sites interagissent:● Sites proches● Sites éloignés – changement de

structure de la protéine

Hémoglobine est un tétramère

Les sites sont loins l'un de l'autre

StructureCoopérativité



4 sites identiques et indépendants2 conformations distincts T et R


Allostérie


La courbe de saturation refléte la conversion entre la forme T et la forme R.


Allostérie


● Comment une toute petite molécule O2 (Mr = 32) d'une

taille d'environ 2Å, peut-elle déplacer des enormes protéines (Mr = 67000) d'une taille de 50Å des longues distances?

● Comment c'est déplacements changent-elles l'affinité pour l'oxygène?

Mécanique



● Ces deux mouvements déplace l'hélice F

● Comment ces petites movements (environ 0,5Å) declenchent ils une changement de la structure quaternaire importante?

HF8HE6


Mécanique


● Des importants modifications de conformation des Cterminaux...

● Une liaison hydrogène entre le tyrosine HC2 et la chaine peptidique (F8) est brisée. Helice F

YHC2

HF8HE6


Mécanique


H146

pont salin avec D94

pont salinavec αΚ40

● Que font les Cterminaux des sousunitées?

– Sous unitée

– Sous unitée


Mécanique


● Que font les Cterminaux des sousunitées?

– Sous unitée

– Sous unitée

R141

pont salin Κ127 pont salin D126


Mécanique


T RL

0

c4L0

Les oxygènes destabilisent les ponts salins et ainsi rendent la transition TR plus facile.

c=K R

K T KT

4 KR

4

Donc: c > 1K

R > K

T, comme ils sont des

constants d'association ca veut dire que la transition TR (L0) augment l'affinité.


Energétique


T R

Energie

On peut regarder en termes d'énergie libre également...


Energétique


C'est important dans l'aclimatisation

Avec BPG

Sans BPG

Le 2,3bisphosphoglycerate diminu l'affinité de l'hémoglobine

Modulateurs


● Plusieurs modulateurs changent l'affinité.

– H+

– CO2

– 23BPG

● Ils modifient l'equilibre TR.


Il se lie entre les deux sousunités β dans la forme T – il n'y a pas d'espace dans la

forme R

Modulateurs



– H+

– CO2

– 23BPG

● Ils modifient l'equilibre TR.



– H+

– CO2

– 23BPG

● Ils modifient l'equilibre TR. Le 2,3bisphosphoglycerate diminu

l'affinité de l'hémoglobine en stabilisant la forme T

Modulateurs



TR

Une forme T de basse affinité et une forme R de haute affinité. Le P

50 est déterminé par la facilité

d'échange entre ces deux formes.

Ponts salins23BPG

Sommaire


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