Transport, Capacitation et Reactionacrosomique

des spermatozoïdes de mammifères

Voies génitales féminines: transport , capacitation et interaction gamétique

VOIES GENITALES FEMININES

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Mouvement des spermatozoïdes humains éjaculés: analyse microcinématographique

Mouvement de la tête des spermatozoïdes humains

David et al , 1981

La Force propulsive est fonction de: - Vitesse de propagation des ondes- Amplitude de la courbure flagellaire

Mouvement spermatique:

transformation d’un glissement microtubulaire en courbure flagellaire

Tête

Flagelle

Coupe transversale de

pièce principale flagellaire

Shingyoji et al , 1977

Satir et al., 1981

Schéma de l’axonème:

Vue longitudinale

Mouvement dans le mucus cervical

Contrainte du mouvement par la structure fibrillaire du mucus

Mouvement orienté et uniforme

Analyse automatique du mouvement par système CASA ( Computer-Assisted Sperm Analysis )

Exemple de deux dyskinésies flagellaires

Témoin

Absence de bras externes de dynéines

Anomalies des structures périaxonémales: spermatozoïdes glissants

Caractéristiques dynamiques ** = Spermatozoïde glissant

VSL (µm/s) ALH (µm/s) Fr(Hz) Fb( Hz)

Patients 22,7 ± 2,7 1,6 ± 0,2 4,8 ± 1,7 13,5 ± 2,9

Témoins 29,0 ± 4,2 5,2 ± 0,4 7,1 ± 1,8 8,5 ± 2,4

P < NS 0,05 0,01 0,01

C arac té ris tiques d ynam iques **

D ans le liqu ide sém ina l

V S L(µm /s) V A P (µm /s) V C L(µm /s) A LH (µm )

P a tien ts (n=15 ) 17 ,8 ± 5 ,1 25 ,7 ± 5 ,2 34 ,4 ± 7 ,3 2 ,3 ± 0 ,9

tém o ins (n=7) 39 ,8 ± 8 ,9 48 ,0 ± 10 ,1 62 ,7 ± 13 ,0 4 ,0 ± 0 ,9

P < 0 ,001 0 ,001 0 ,001 0 ,001

D ans le m ilieu B 2

P a tien ts 34 ,2 ± 10 ,0 49 ,1 ± 10 ,1 66 ,4 ± 9 ,0 4 ,3 ± 1 ,7

C on trô les 83 ,6 ± 17 ,2 94 ,3 ± 15 ,9 113 ,4 ± 12 ,9 5 ,6 ± 1 ,2

P < 0 ,001 0 ;001 0 ,001 N S

D'après Wolf et al, 1995

(Feneux et al., 1985)

Valeur pronostique

• Des paramètres sont souvent cités: ALH,LIN, VSL.

• Pas de valeur seuil mais une corrélation

• D’après les pathologies connues, on peut proposer que– ALH ne doit pas être < à 2 µm – VSL ne doit pas être < à 25µm Pour qu’un spermatozoïde ait la force propulsive suffisante pour traverser

les barrières (mucus, zone pellucide) le séparant de l’ovocyte.

ACQUISITION DU MOUVEMENT HYPERACTIVE (1)

CAPACITATION: définition

Austin et Chang 1950,1951

Temps pendant lequel le spermatozoïde doit séjourner dans les voies génitales féminines afin d’être fécondant

•Ensemble des modifications membranaires et intra-cellulaires qui rendent le spermatozoïde capable de féconder l’ovocyte

Capacitation: conséquences

Mesure de la capacitation par des tests fonctionnelsÉtude du mouvement: hyperactivationTest de fixation à la zone pellucideInduction de la réaction acrosomiqueTest de pénétration dans des ovocytes dépellucidés de hamster

- Hyperactivation du mouvement

- Exposition des récepteurs spermatiques à la ZP

- Aptitude à faire une réaction acrosomique

- Capacité à fusionner avec la membrane ovocytaire

ZP

ovocyte

CAPACITATION: lieu

• Lieu: voies génitales féminines

CAPACITATION: Durée

Dans l’espèce humaine:

-Variation inter-spermatique

-Variation intra-spermatique

Notion de sous population

( Perreault et Rogers , 1982)

Capacitation: Déstabilisation membranaire

État capacité = fenêtre de déstabilisation (Harrison , 1996)

-Conduit à des modifications internes et éventuellement à la mort cellulaire

-Phénomène réversible

-Intéresse une sous- population

(15 à 20% des spermatozoïdes)

Résulte de:dé-répression (enlèvement de facteurs stabilisants)modulation positive par des agents du tractus génital féminin

facteurs décapacitants

Nature:Protéines ou glycoprotéines CholestérolZinc

Origine: plasma séminal (vésicules séminales prostate

Role:

Éviter capacitation prématurée

Stabiliser la membrane

Localisation :Adsorbée sur la membrane plasmique du spermatozoïde pour les protéines (SBP)Dans le plasma séminal (Zinc, cholestérol….)

Elimination indispensable à la capacitation lors de la traversée du mucus cervical

Capacitation: Modifications membranaires

(1)Réorganisation des phospholipides

PC

PE

Flesch et al., 2001

(2) Redistribution du cholestérol et efflux

Complexe filipin-stérol

Baisse du rapport C/PL augmentation fluidité membranaire

(3) Modifications des protéines (singer et al., 1985; Cross et Overstreet, 1987)enlèvement acide sialiques(role des SABP de l’endomêtre

Modifications des sucres

Réaménagement des protéinesTopfer-Petersen et al., 1990

Fig. 5. Immunolocalization of VCP/p97 in human sperm beforeand after capacitation. Ficarro et al, 2003

Suzuki et Yanagimachi, 1989)

Seminolipid?

Proteine du complexe SNARE migre dans l’acrosome durant la capacitation (de Vries à publier )

VAM6P et SNAP (Brahmaraju et al , 2004)

Capacitation: Modifications ioniques- Influx de calcium (Fraser, 1993)

- Augmentation de [Ca2+]i (Baldi et al., 1981)

Mécanisme?

- Stimulation d’un influx

- échangeur Ca2+/Na+

- Ca2+ ATPases

Capacitation: modifications ioniques (suite) D’après Darzon et al., 2001)

De 6,9 à7,1(Cross et Razy, 1997 Hyperpolarisation :

-40mv à – 60mv (Zeng et al., 1995

-50mv à -80mv (Arnoult et al., 1999)

Canaux sensibles aux baryum

(Munoz-G&ray et al., 2001

Inactivation de canaux dépendant du voltage de type T (bas seuil)

phosphorylations de protéinesPendant la capacitation: augmentation de AC (Monks et al, 1986) et diminution de phosphodiestérase ( Monks et Fraser, 1987)

Augmentation de l’AMPc (White et Aitken, 1989)

Stimulation de PKA Phosphorylation sur Tyr (Urner et al ; Tyrosine kinaseMAP kinase

(Ficarro et al., 2003)

• Voltage-dependent anion select channel 2• Keratins• Phospholipid hydroperoxide gluthathione peroxidase• Ubiquinol cytochrome c, Reductase 1• Glutamate ammonia ligase• Pyruvate dehydrogenase• F-actin capping protein• A kinase anchor protein 3• A kinase anchor protein 4• TRAP-1 (tumor necrosis factor type 1 receptor-associated protein)• N-Acyl-aminoacylpeptide hydrolase• Valosin-containing protein (VCP or p97)• HSP 70• HSP 90 • Proacrosin-binding protein (sp 32)• Glutathion s-transferase M3• Outer dense fiber 1 (ODF 1)• -Tubulin

Phosphorylation sur Ser/Treo

(Harrison 2004)

Protéines de Divers PM :

- 96 -59 kDa (membre des ODF dans le flagelle)

-64 kDa (dans la tête)

-- 44 kDa (tête et flagelle )

O’ Flaherty et al 2004

P 105 et P 80

HSP90 (Ecroyd et al., 2003)

FSP 95 ( Mandal et al., 1999)

CABYR (Naaby Hansen et al 2002)Naz 1999

phosphorylations de protéines

Régulation par le calcium

Régulation par les ROS(Baker et Aitken, 2004)

Production d’O2 et d’H2O2 pendant capacitationROS: accélèrent capacitation et stimulent certaines activités enzymatiques (AC, PLA2, PKC)

Mouvement hyperactivé

Facteurs capacitants

Capacitation in vivo

Réservoir spermatique

Isthme de l’oviducte chez le hamster

Interaction spermatozoïdes – épithélium isthmique

le calcium intraspermatique est maintenu bas (Dobinski et al., 1996 et 1997)

ATP intracellulaire augmenterait (Baker et al 2004)

La phosphorylation de protéines membranaires est réduite (Petrunkina , 2001)

(Dobrinski et al 1996)

Conséquences:

- Empêchement d’une capacitation prématurée

- Maintien de la vitalité des spermatozoïdes

Détachement des spermatozoïdes de l’épithélium

Changement des conditions environnementales:

- stimulation du mouvement hyperactivé? (ATP élevé)- modification membranaire du spermatozoïde ?

role des glycoconjugués sulfatés (héparine) (Talveri et giraltieri 2001)

Existence d’un signal lors de l’arrivée de l’ovocyte?

Chimiotactisme?

INTERACTION AVEC LE COMPLEXE CUMULO-OVOCYTAIRE

FIXATION PRIMAIRE

REACTION ACROSOMIQUE

FIXATION SECONDAIRE

TRAVERSEE DE LA ZP

Structure de la zone pellucide

Trois glycoprotéines chez la souris:

(Schéma selon Wassarman)

ZP2 ZP3ZP1

Quatre glycoprotéines chez l’homme: (HARRIS, 1994)H ZP1 code pour la glycoprotéine ZP1

hZPA code pour la glycoprotéine appelée ZPA ou ZP2,

hZPC code pour la glycoprotéine appelée ZPC ou ZP3, hZPB code pour la glycoprotéine appelée ZPB, équivalent de la glycoprotéine ZP3α chez le porc et rc55 chez le lapin

.

hZPA et mZP2 : 57 %

hZPC et mZP3 : 67 %

hZP1 et mZP1 : 67 %

Caractérisation biochimique de la ZP humaine

PM kDa ZP1est un dimère de 140kDa chez la souris

ZPA:: 90/110 kDa

ZPB: 65/75 kDa

ZPC: 55/60 kDa

Après la fécondation :

ZPC et ZPB ne se modifie pas en PM

ZPA se clive en 70 kDa et 30kDa environ

ZPA ZPB ZPCWesternblot des ZP natives révélées avecles anticorps anti ZP recombinantes

Travail F PETIT

Role des glycoprotéines pellucidaires

ZPC et ZPB récepteur primaire au spermatozoïde

et induction de la réaction acrosomique

ZPA récepteur secondaire au spermatozoïde

ZP1 élément pontant des chaînes

ovocyteovocyteZPA

ovocyteZPC

Fixation et Fusion Fixation secondaireFixation primaire

Acrosome intact Reactionacrosomique

Acrosome réagi

Récepteurs spermatiques à la zone pellucideEspèce Récepteurs spermatiques Références

galactosyltransférase Shur, 1991sp 56 Bleil and Wassarman, 1988p95 Leyton and Saling, 1989mannosidase Cornwall et al. , 1991protéine de 15kDa Richardson et al. , 1987enzyme trypsine-like Benau and Storey, 1988

Bovin SP-10 Coonrod et al. , 1996Hamster P26h Sullivan et Bleau, 1985Cobaye PH-20 Hunnicutt et al. , 1996

proacrosine Jones and Brown, 1987Sp38 Mori et al. , 1993

Souris

Porc

Chez l’hommze

Récepteurs spermatiques Références RemarquesFA-1 Naz et al. , 1992 auto-anticorps anti spermatozoïde (ZPA)p95 Burks et al. , 1995 homologue humain de m-p95 (ZPC)FA-2 Naz et al. , 1993 anticorps de souris anti spermatozoïde humain (ZPC)SP-10 Wright et al. , 1990 clonage et production d'anticorps anti SP-10 (ZPA)

mannosidase Tulsiani et al. , 1990 activité enzymatique spermatiqueenzyme trypsine-like Llanos et al. , 1993 activité d'inhibiteurs de trypsineprotéine de 20 kDa Boettger-Tong et al. , 1993 induction de la RA par des inhibiteurs de protéasesmannose-lectine Benoff, 1997 induction de la RA par des groupements sucrésfucose-lectine Mahony et al. , 1993 inhibition de binding

protéines de 17 et 18 kDa O'Rand et al. , 1985 immunoblotting de ZP (ZPC)protéines de 16, 18, 19, 35 et 60 kDA

Shabanowitz et al. , 1988 immunoblotting de ZP radiomarquée

DESCRIPTION DE LA REACTION ACROSOMIQUE- Fusion membranes plasmique et membrane acrosomique externe- Exocytose du contenu acrosomique

membrane plasmiquemembrane acrosomique externeacrosomemembrane acrosomique interneMembrane nucléaire

noyau

Méthode d’étude de la réaction acrosomique

Microscopie optique: sans coloration impossible dans l’espèce humaine

Emploi de fluorochrome

RA+

RA -

Marquage avec anti CD46 FITC

Coloration négative lectine PSA

Coloration positive CD46

Microscopie électronique

Réaction acrosomique: Modifications ioniques

Chez le bovin Florman et al;1989

ZP

Chez l’homme Patrat et al 2000

Il existe une double entrée de calcium 1pic transitoire élevé par des CCVD type T (Arnoult 1999)1 entrée progressive par des SOC (canaux activés par la déplétion de stocks interne )(0 Toole et al 2000)

Reaction acrosomique

Effet de la toxine pertussis (PT) Lee et al, 1992

Implication de protéine G i Implication de l’AC

Reaction acrosomique induite par la zone pellucide

Patrat et al., 2000

Contenu de l’acrosome

Conséquences de la réaction acrosomiqueLyse de la zone pellucide pénétration de la ZP

Fixation et fusionModifications de protéines des régions équatoriale et post acrosomique