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NATHALY CORMER
L'IMPLICATION D E LA CRYOPRÉSERVATION SUR LA PHYSIOLOGIE DES SPERMATOZOÏDES BOVINS
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures de l'université Laval
pour Y obtention du grade de maître 5s saences (M.Sc.)
Département des sciences animales FA~LTLTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL
O Nathaly Cormier, 1998
National Library Bibliothèque nationale du Canada
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Ces travaux avaient comme objectifs d'analyser la moindre efficacité à
féconder de la semence bovine cryopréservée en évaluant l'état capacité des spermatozoïdes partiellement et completement cryopréservés, puis
d'empêcher la capacitation induite par la cryopréservation en ajoutant du glucose tout en s'assurant de la réversibilité de cette inhibition. Le pourcentage de spermatozoïdes capacités, selon la chlor té tracycline, était 3 fois plus élevé chez les spermatozoïdes cryopréservés comparés aux frais.
Sans héparine, les spermatozoïdes partiellement cryopréservés ont fécondé
in vitro 2,6 et 9,2 fois plus d'ovocytes que les spermatozoïdes contrôles et
dilués, respectivement. Les taux de fécondation étaient similaires pour les spermatozoïdes partiellement ou complètement cryopréservés. L'ajou t de
glucose n'a pas empêché la capacitation induite par l a cryopréservation, tel
que révélé par l'habilité des spermatozoïdes partiellement ou compktement cryopréservés A subir la réaction acrosomale. La capacitation in vitro a été
inhibée chez les spermatozoïdes partiellement ou complgtement
cryopréservés avec du glucose.
J'aimerais profiter de l'occasion qui m'est offerte ici pour remercier les
personnes qui m'ont entourée et secondée au cours de mes deux années d'études au deuxième cycle.
Tout d'abord, je remercie ma directrice de recherche, Janice L. Bdey, pour son entiere confiance en ayant fait de moi sa premiere étudiante graduée. Les nombreuses discussions, alimentées de conseils judicieux, ont
permis de me surpasser et de mener A bien ce projet de recherche et d'études.
Je remercie ensuite mon CO-directeur de recherche, Marc-André Sirard, pour sa disponibilité et ses idees concernant particulièrement l'élaboration des expériences réalisées en fécondation in vitro.
Je remercie aussi Yves Brindle, Daniele Gilbert ainsi que les techniciennes oeuvrant au Centre d'Insémination Artificielle du Québec pour avoir fourni la semence et le support technique et ce, toujours avec le sourire et une extrême gentillesse.
Je remercie également Patrick Blondin pour son inepuisable patience lors de mon apprentissage des techniques de fécondation in vitro, Karine Coenen pour son aide indispensable au laboratoire, Lucien Marois pour être
N
ailé chercher les ovaires A l'abattoir, Annie Chamberland pour avoir fourni les photos des spermatozoïdes colorés la chlortétracycline, et le personnel du Département des saences animales.
Je remercie grandement ma famille et mes ami(e)s pour leurs
encouragements et leur affection à mon égard tout au long de ce périple. Un
merci tout spécial h ma m&re, Monique Taillon, pour avoir vérifié consciencieusement la qualité de la langue française de ce mémoire.
Je remercie sincerement Michel Delisle pour son appui constant au
cours de ma premiere année d'études, ainsi que François Pothier pour sa générosité d'âme et d'esprit.
Enfin, je remercie infiniment mon conjoint et mon confrere de travail, Steve Tardif, pour sa présence réconfortante, son bon jugement, de même que pour son soutien moral et technique. Grace h toi, achever cette
maîtrise fut beaucoup plus agrbable, bisous xxx...
PAGE
0 , RESUME .................... ,.. ............................................................................................. II
AVANT-PROPOS .......................... ... .......................................................................... a .
TABLE DES MATIERES ............................................................................................. V
.................................................................................... LISTE DES A B R É ~ T L O N S VIII
HSTE DES FIGURES ............................... .. ............................................................... X
LISTE DES TABLEAUX.. ............................................................................................ XII
...................................................................................... 1.1 Le spermatozoïde 1
..................................................................... 1.1.1 La spermatogen&çe 1
1.1.1.1 Définition et description ............................................ 1 1.1.1.2 Dynamique de la spermatogen&se ........................... 2
.................................................................. 1.2 Acquisition de la fécondance 3 1 -2.1 Maturation 4pididymaire. ................................................... . 3 1.2.2 Les glandes annexes ................................................................... 6
. . 1.2.2 La capaatation. ........................................................................... .8 1.2.2.1 Definition, lieu et temps de r6alisation .................. 8
1.2.2.2 Description et mécanismes .......................... .. ....... 10
1.3 Interactions entre le spermatozoïde et l'ovocyte ............................ ... 16 ......................................................... 1.3.1 La rencontre de l'ovocyte 16
1.3.2 La reactïon acrosomde (RA) .................................................... 18
1.3.2.1 Description et lieu de réalisation .............. .... ....... 18
......................... 1.3.2.2 Mécanismes putatifs ....... ............... 19
............................................................ 1.3.3 La fécondation ........ .... 21
1.3.3.1 In vivo ..................................................................... 21 1.3.3.2 In vitro ................... .- ................................................. 22
1.4 Les spermatozoïdes cryopréçervés ....................................................... 23 ................................................................................ 1.4.1 Utilisations 2 3
................................................................... 1 .4.2 La ayopréservation 24 .................................................................... 1 . 4.2. 1 Procédure 2 4
.............................................. 1 .4.2.2 Dommages cellulaires 2 6
.......................................................................................... 1.5 Problématique 2 8 ........................................................................ 1.5.1 Mïse en situation 28
................................................................ 1.5.2 Hypoth&ses de travail 30
............................................................................ 1.6 Lis te des ouvrages cith 30
CHAPITRE 2 PREMATURE CAPACITATION OF BOVINE SPERMATOZOA IS INTTLATED BY CRYOPRESERVATION
....................................................................................................... Résume 5 9
....................................................................................................... Abs tract 6 0
............................................................................................. Introduction 6 1
2.4 Materials and methods .......................................................................... 6 4
2.4.1 Collection and preparation of spennatozoa ......................... 64 2.4.2 Experiment 1
In vitro capacitation as detected by
chlortetracydine ................................................................... 6 5 2.4.2.1 Capacitation .................................................................. 65 2.4.2.2 CTC Assay ................... .... ................................... 65 2.4.2.3 Eosin-nigrosin staining ......................... .. ............... 6 6
2.4.3 Experiment 2 Assessrnent of IVF .................................................................. 67
2.4.3.1 Collection, maturation and fertilization of oocytes ........................................................................................ 67 2.4.3.2 Fixation and determination of fertilization rate .............................................................................................. 68 2.4.3.3 Statistical analyses ....................................................... 69
2.5.1 Determination of Capaatation by CTC Coloration ............. 69 2.5.2 Determination of Mortality by Eosin-Nigrosin Staining ................................................................................................. 72 2.5.3 Determination of Capacitation by IVF ....................... ...... 72
Discussion .................................................................................................. 75 2.6.1 More frozen-thawed than fresh spermatozoa exhibit CTC pattern B .................................................................................... 75 2.6.2 Cooled or thawed spermatozoa c m fertilize COC in the absence of heparin ....................................................................... 76 2.6.3 Putative mechanisms of cxyopresenration-induced
. . capautabon .................. ... .................................................................. 77 2.6.4 Implications of premature capacitation of cryopreserved spermatozoa .............................................................. 78
Acknowledgments .................................................................................... 79
References .................................................................................................. 79
CHAPITRE 3 LE GLUCOSE N' EMPÊCHE PAS LA CAPACITATXON INDUITE PAR LA CRYOPRÉSERVATTON DES SPERMATOZOÏDES BOVINS
3.1 Résumé .......................... ,.. ... , ............................... - - 87 .
3.2 Introduction .............................................................................................. 88
.............................................................................. 3.3 Matériel et méthode 9 0 ............................... 3.3.1 Collection et préparation de la semence 90
. . . . 3.3.2 Capaatation ln vztro .......................... .. .................................. 91
3.3.3 Détermination de l'état capacité (RA induite par la ....................................................................................................... LK) 9 2 I
3.3.4 Evaluation de la viabilité ................................................... 9 3 ................................................................ 3.3.5 Analyses statistiques 9 3
3.4 Résultats .............................................................................................. 9 3 3.4.1 Inhibition de la RA spontanée .................. .. ........................ 93 3.4.2 Inhibition de la capautation .................................................... 95 3.4.3 Viabilité .............................. .... .................................................... 97
3.5 Discussion .......................................................................................... 9 9 .......................... 3.5.1 Effets des traitements sur la RA spontanée 99
3.5.2 Effet du glucose pendant le pr&traitement .......................... 100 3.5.3 Effet du glucose lors de la capacitation .................................. 101 3.5.4 Effets des traitements sur la viabilite ..................................... 102
.................................................................................................. 3.6 Conclusion 102
......................................................................................... 3.7 Remerciements 1 0 3
.................................................................. ........................ 3.8 Réferences ..... 103
I ...................................................................................... CONCLUSION GENERALE 209
AA AC ADN AMPc ATP BSA BSP BSP-30-kDa BSP-AI, -A2 et -A3 Ca2+ CTC DAG FIV FMP g H+ HBP HBP-B5 HDL Hepes
IA LBMX p 3 p 4 JOTG LDL LJ?c
acide arachidonique adénylate cydase aade désoqnibonudéique adénosine monophosphate cydique adénosine triphosphate bovine serum albumin bovine seminal protein bovine seminal protein-30-kilo Dalton bovine semùial protein-acidic 1, -au& 2 et -aadic3 calcium chlortétracydine diacylglyc&ol fécondation in vifro forward motility protein gramme ion hydrogène (proton) heparin-binding pro tein heparin-binding protein-bound 5 high-density lipopro tein N-(2-hydroxyéthy le) piperazine-N'-2-éthane d'aade sulphonique insémination artificielle 3-isobuthyle-1-méthylexanthine inositol triphosphate inositol triphosphate méthylé jaune d'oeuf-Tris-glycérol light-density lipoprotein lysophosphatidyldioline metre millilitre sodium
P26h P34H PB= pl05 PA PC PDE PH PH-20 P r 2 PK-A PK-C PLA2 rL.c PLD protéine G
PTK R A SMA 4 TES
Tris vs
protéine épididymaire de 26 kDa (hamster) protéine épididymaire de 34 kDa (humain) protéine spermatique de 81 kDa (humain) protéine spermatique de 105 kDa (humain) acide hosphatidique p hosphatidylcholine phosphodies térase potentiel d'hydrogene protdiine testiculaire (cobaye) phosphatidylinositol biphosphate protéine kinase dépendante de 1'AMPc protéine kinase dépendante du Ca2+ phospholipase A2 phospholipase C phospholipase D protéine dépendante de la guanosine monophosphate cyclique proteine tyrosine kinase réaction acrosomale sperm maturation antigen number four N-tris(hydroxyméthy1e)méthyle-2-aminomé thane d'acide sulphonique tris (hydroxyméthy1e)aminométhane
volume par volume zone pellucide glycoprotéines 1,2 et 3 de la ZP degr6 Celaus
LISTE DES FIGURES
PAGE
FIGURE 1 The effect of preexposure for 4 hours to noncapacitating medium (NCM) at 23OC or egg yolk-Tris-glycerol extender (EYTG) (4OC, 23OC or full cryopreservation) on the subsequent capacitation of spermatozoa. .......................................... 70
FIGURE 2 The effect of preexposure for 4 hours to noncapaatating medium (NCM) or egg-yolk-Tris-glycerol extender (EYTG) (4"C, 23°C or full ayopreservation) on the capacitation of spermatozoa followed by A) 3 hours and B) 6 hours of incubation (3g°C, 5% COZ) in capacitating medium (CM) ............. 71
FIGURE 3 Tirnedependent changes in spermatozoal mortaiity (meaniSE%) after 4 hours of preexposure to either noncapacitating medium (NCM) at W C or egg yolk-Tris- glycerol extender (EYTG) (4OC, 23OC or full crypreservation) during the subsequent 6-hours incubation under conditions that support capaatation (n
FIGURE 1 Effet du prétraitement (dilution-refroidissement 4'C ou cryopréservation compliite) en présence ou non de glucose, et du temps d'incubation sur la prévalence de la RA spontanée die2 des spermatozoïdes bovins A) sans héparine B) avec heparine, n = 4 ......................................................... 95
X I I
FIGURE 2 Effet du pr&traitement (présence ou non de glucose lors de la dilution et du refroidissemmt à 4OC et/ou de la cryopréservation) et du temps d'incubation sur la capacitation (induction de la RA par la LPC) chez des spermatozoïdes bovins: dilués-refroidis incubés A) sans héparine 8) avec héparine et cryopréservés incubés C) sans héparine D) avec hbparine, n = 4. ......................................... 96
LISTE DES TABLEAUX
PAGE
TABLE 1 Effects of preincubation of spennatozoa for 4 hourç in either NCM ai 23OC or EYTG (4OC, 23OC) and freezhg- thawing on their ability to fertilize bovine COC ......................... 74
TABLEAU 1 Effet du prCtraitement et du temps d'incubation, en présence ou non d'héparine, sur la viabilité des spermatozoïdes bovins ..................................................................... 98
CHAPITRE 1
1.1 Le spermatozoïde
1.1.1.1 D4finition et description
La spermatogenèse, qui débute a la puberté et se poursuit durant toute
la vie, est un phénomgne se deroulant dans les tubules seminiferes contournés du testicule. Eiie réfère particulièrement à tous les événements, induant une série de divisions et de transformations cellulaires, menant à Ia production des gametes mâles, les spermatozoïdes (Dadoune et Démoulin, 1991; Marieb, 1993). Les cellules germinales 2N chromatides, appelées spermatogonies, sont disposées la péripherie des tubules &miniferes entre les cellules de Sertoli et se divisent un certain nombre de fois par mitoses
successives pour générer les spermatocytes 1. Ceux-a se divisent alors une
premiere fois de façon méiotique pour donner deux cellules haploïdes nommées spermatocytes II. Ces derniers, suite à une deuxième division méiotique, produisent les spermatides qui sont haploïdes à IN chromatide.
La différenciation cellulaire qui suit, la spermiogenese, assure la transformation des spermatides en cellules hautement spécialisées dont les prinüpaIes fonctions seront de véhicuier le matériel génétique et de se fusionner avec l'ovule. La réorganisation du noyau, le développement et la mise en place de l'auosome 2 partir de l'appareil de Golgi, l'assemblage des structures du flagelle et la réorganisation du cytoplasme sont au nombre des changements qui surviennent au cours de la spermiogenese. L'étape finale, la spermiation, menera A la libération des spermatozoïdes dans la lumiere des tubdes séminifères.
1.1.1.2 Dynamique de la spermatogenèse
Toutes les &tapes de développement du spermatozoïde sont synchronisées et la durée de la spermatogenése est constante pour une même espece. Ainsi, la formation d'un spermatocyte 1 jusqu'k la libération de spermatozoïdes immatures en un point fixe du tubule séminifgre (cycle spermatogenique) prend 74 jours chez l'homme, 35 jours chez le hamster et la souris et 54 jours chez le taureau (Clermont, 1972; cité par Dadoune et Démoulin, 1991). L'entrée des spermatogonies dans une nouvelle vague de spermatogenèse (cycle de l'épithélium germinal) est périodique et se produit a des intervalles réguliers. Ces derniers, qui ont une durée variable selon les espèces, sont de 9 jours chez le hamster, 135 jours chez le taureau et 16 jours chez l'homme (Dadoune et Démoulin, 1991). De plus, la persistance des
ponts cytoplasmiques reliant les spermatogonies d'une même génération jusqu'à la spermiation contribue à ce que la spennatogen&se s'effectue de maniere synchrone.
Il existe aussi un gradient de production des spermatozoïdes le long du tubule seminifgre (onde spermatoghique) de façon h ce qu'un flot
constant de spermatozoïdes nouvellement différenciés soit disponible. La
production journaliere de spermatozoïdes, qui est exprimée en nombre de spermatozoïdes produit par jour et par gramme de testicule, varie selon les especes. Chez la plupart des mammiferes, elle est de 20 à 28x106 de spermatozoïdes / jour/g de testicule sauf quelques exceptions dont font partis l'homme et le taureau. Chez ce dernier, il y a environ 53x109 de cellules spermatiques qui se forment par jour pour une production moyenne de
l6,9xlO6/ jour /g (Gürdey et cou., 1975; Dadoune et Démoulin, 1991).
1.2 Acquisition de la fécondance
1.2.1 Maturation epididymaire
A la sortie du testicule, les spermatozoïdes immobiles ou démontrant une faible motilité stationnaire ne sont pas encore aptes à féconder malgré le fait qu'ils semblent completement différenciés (Eddy, 1988; Setchell, 1991). Iis acquerront leur fertiütb potentielle suite A leur passage dans l'épididyme. Cette structure, dont la longueur varie selon les espèces (7 m chez l'homme et 40 m chez le taureau; Dadoune et Démoulin, 1991) est caractérisée par trois régions distinctes: la tête, le corps et la queue. Les principaux rôles de l'épididyme sont d'assurer la maturation fonctionnelle, le transport ainsi que le stockage des spermatozoïdes. De ce fait, plusieurs modifications structurales et biochimiques ont déja et& identifiées (Bedford et Hoskins, 1990; Yanagimachi, 1994) telles les changements du metabolisme (Mann et Lutwak-Mann, 1981) et de l'activité flagellaire (Acott e t cou., 1983; Cooper, 1986; Eddy, 1988), les remaniements au niveau des membranes plasmique et acrosomique (Eddy, 1988; Yanagimachi, 1994) de même que l'acquisition de l'habilite se fixer 2 la zone pellucide (ZP) de l'ovocyte (Saling, 1982; Boué et Sullivan, 19%).
Un des changements les plus apparents lors de la maturation épididymaire est le dkveloppement de la motilité des spermatozoïdes; ceux-
ci bougent plus vigoureusement et sont généralement aptes & se deplacer de façon linéaire B partir du corps (Cooper, 1990). Cette capadte soutenir une
motilité progressive implique des modifications autant morphologiques que métaboliques au niveau de la queue du spermatozoïde. La présence des
ponts disulfures renforcent la stabilité des fibres denses externes, de la piece connectrice, de la gaine fibreuse et de la membrane mitochondriale externe (Bedford et Calvin, 1974). De plus, l'augmentation du métabolisme et la diminution de l'activité de synthèse permettent la production de I'ATP nécessaire au battement fiagellaire (Bedford et Hoskins, 1990). Certaines
études ont d'ailleurs mis clairement en évidence les differences qui existent entre les spermatozoïdes immatures provenant soit du rete testis, soit de la
tête de l'épididyme, par rapport à ceux matures provenant de la queue (ou éjaculés) quant aux taux de glycolyse et de respiration ainsi qu'aux voies d'utilisation du glucose (Bedford, 1975; Dravland et Meizel, 1981).
Un autre élément majeur, relativement au développement de la capacité se mouvoir des spermatozoïdes, réfère aux nombreux changements membranaires qui surviennent lors de la maturation
épididymaire. En effet, les différentes régions de l'épididyme séd ten t dans
le fluide intraluminal et/ou en absorbent des protéines et des antighes
spécifiques dont la plupart sont androgéno-dépendants (OrgebinCrist et coll., 1975; Fournier-Delpech et coll., 1988; Ghyselinck et coll., 1989; Boué et Sullivui, 1995). Par conséquent, les spermatozoïdes peuvent ajouter, modifier ou perdre certains de ces composants de surface membranaires au
niveau de la tête et de la queue lors de leur transit i2 travers l'épididyme (Bedford et Hoskins, 1990; Eddy, 1988; Yanagimachi, 1988). Par exemple,
l'adsorption de glycoprotéines extrinsèques dites de mobilitk (FMI?, fonvard rnotility protein) induirait une motilité plus ou moins progressive tel que
montré chez les spermatozoïdes bovins provenant de la tête qui démontrent
une motilité davantage linéaire suite l'ajout de FMP (Acott et COU., 1983).
Certaines altérations membranaires visent plutôt changer la composition des lipides pour favoriser la stabilité de la membrane
plasmique, telle l'integration des molécules de cholestérol qui augmente le ratio stérols/phospholipides (Parks et Hammerstedt, 1985; Suzuki, 19901, alors que d'autres affectent les caractéristiques et la distribution des résidus
glycosylés fixes aux proteines ou aux lipides, tel que r6vélé par le
changement d'affinité de liaison aux lectines des spermatozoïdes matures (Olson et Danzo, 1981; Hammerstedt et cou., 1982; Eddy, 1988; Magargee et coll., 1988). Par ailleurs, le retrait ou la modification de protéines testiculaires de même que la fixation, par des liaisons non covalentes, de protéines spécifiques sécrétées par l'épididyme contribuent aussi h
l'acquisition de la fécondance (Fournier-Delpech et cou., 1988; Yanagimac& 1994).
Enfin, d'autres remaniements membranaires concernent davantage les aspects relatifs à l'acquisition de l'aptitude se fixer à la ZP proprement
dite, laquelle est essentielle a la manifestation du pouvoir fécondant du spermatozoïde en permettant la reconnaissance puis l'interaction avec le
grnete femelle (Saling, 1982; Cooper, 1986). La P-l,&galactosyltransférase du spermatozoïde mutin, qui reconnaît spécifiquement le reçidu N-acktyl- glucosamine de la glycoprotéine de la ZP (la ZP3) (Shur et Neely, 1988; Miller et coll., 19921, est présente dès la spermiogen&se mais n'acquiert la capacité de se lier à la ZP3 que suite A son passage dans l'épididyme Fournier-Delpech et Thibault, 1991); il en est de même pour la PH-20 du cobaye (Primakoff et coll., 1985; Phelps et coll., 1988).
D'autres proteines dont l'origine est épididymaire, telles la M 6 h du
hamster (Bérubé et Sullivan, 1994) et la P34H de l'humain (Bou6 et coll., 1994), sont aussi reconnues pour leur importance lors de la fécondation tel que montré par des études in vitro où l'interaction spermatozoïde-ZP est inhibée en présence d'anticorps dirigés contre la P26h. De plus, la capacite des spermatozoïdes epididymaires a se fixer aux glycoprotéines de la ZP diffgrent selon la région de l'épididyme d'où ils proviennent; chez la souris, les spermatozoïdes provenant de la tête ne se lient pas, ceux provenant du corps se lient faiblement et les autres provenant de la queue se lient correctement (Saling, 1982). Toutefois chez le taureau, les spermatozoïdes épididymaires, même s'ils proviennent de la queue, sont inaptes A subir la réaction acrosomale (RA) en présence de ZP solubilisées (Florman et First, 1988b; Florman et coll., 1989). Chez la souris, l'épididyme sécrgte dans le fluide intraluminal un lactoglycane et de l'a-lactalbumine qui, en venant se lier de façon réversible au niveau de la galactosyltransférase du
spermatozoïde, empêcheraient l'adhésion immédiate A la ZP (Shur et Hall., 1982a,b; McLaughlin et Shur, 1987; Fournier-Delpech et Thibault, 1991).
1.2.2 Les glandes annexes
L'ampoule, la prostate, les vésicules séminales et les glandes de
Cowper (ou bulbo-uréthrales) sont les principales glandes annexes du système reproducteur des rnammif&res (Harper, 1988; Çetchell, 1991). Au
moment de l'éjaculation dans le tractus génital femeile, les sécrétions de ces glandes s'ajoutent aux spermatozoïdes matures provenant de la queue de l'épididyme, où ils étaient majoritairement emmagasinés (Bedford et Hoskins, 1990), et constituent environ les trois quarts du plasma séminal (Fournier-Delpech et Thibault, 1991).
Malgré le fait que plusieurs composants sécrétés par les différentes glandes annexes du systeme reproducteur des rnammif&res aient déjA été identifiés, tels des constituants protéiques (phosphatases, protéases, spermadhésines, sialornucine, acides aminés libres), des bases azotées (spermine, choline), le fructose et des prostaglandines, les connaissances actuelles demeurent encore restreintes quant leurs rôles précis surtout en ce qui concerne la fertilité (Gürtley, 1975; Girod et Czyba, 1977; Harper, 1988;
Miller et coll., 1990; Setchell, 1991; Lee et Wei, 1994; Topfer-Petersen et COU., 1995a). Des études ont effectivement démontré qu'il n'y avait pas de baisse significative des taux de conception suite l'ablation des vésicules séminales
(et/ou des glandes de Cowper) chez le porc, la souris, le rat, le cobaye et le taureau (Davies et coll., 1975; Fournier-Delpech et Thibault, 1991).
Les fonctions les plus connues des sécrétions des glandes annexes sont de stimuler la motilite et 11activit4 métabolique des spermatozo'ides ainsi que de protéger ceux-ci contre divers stress telle la peroxidation (Mann, 1964;
Rodger, 1975; Baas et coll., 1983). 11 a aussi ét4 suggéré que, suite A
l'insémination, certains composants du plasma séminal stimulent les muscles utérins impliqués dans le transport des spermatozoïdes alors que d'autres agiraient comme facteurs "décapacitants" en inhibant la capacitation
(par une stabilisation accrue des membranes), la RA ou les enzymes acrosomales (Chang, 1957: Zaneveld et coll., 1972; Fritz et coll., 1973; Ventura et Freund, 1973; Yanagimachi, 1994). D'autre part, le plasma séminal aurait des effets plutôt dommageables sur la viabilite des spermatozoïdes, particulierement chez le taureau (Dott, 1974). Baas et coll. (1983) ont d'ailleurs démontré que L'inactivation rapide et permanente des spermatozoïdes bovins éjaculés était due A la fraction de haut poids moléculaire non-dialysable du plasma séminal.
Les études recentes mettent davantage l'emphase sur le r81e régulateur de certains composants du plasma seminal ainsi, que de leur contribution concernant la manifestation éventuelle de la fécondance des spermatozoïdes. Plusieurs protéines s&ninales, qui ont déjà été identifiees puis caractérisées chez le taureau et le verrat, démontrent en effet des propriétés qui suggèrent fortement leur implication lors de la capacitation et même, leur relation étroite avec la fertilité (Manjunath et Sairam, 1987; Chandonnet et coll., 1990; Miller et coll., 1990; Parry et coll., 1992; Killian et coll., 1993; Sam et COL, 1993; Bellin et coll., 1994; Thérien et coll., 1995).
Certaines de ces protéines lient l'héparine, un analogue des glycosaminoglycanes présents dans le tractus génital femelle et qui est essentiel a la r6alisation de la capautation in vitro chez le bovin (Lee et Ax, 19û4; Lee et coll., 1986; Parrish et coll., 1988); elles sont appelkes "heparin- binding proteins" ou HBP (Miller et coll., 1990). Chez le taureau, la seule présence des HBP-B5 au niveau des membranes des spermatozoïdes a ét6 reliée la meilleure fertilité observée lorsque comparée à celle des taureaux affichant une autre distribution des HBP-B5 (Bellin et coll., 1994). Ainsi,
l'affinité des HBP pour les membranes, et non seulement leur presence au sein des membranes spermatiques et/ou dans le plasma séminal, serait liée au potentiel des spermatozoïdes capaciter, A subir la RA et subséquemment,
féconder in vivo un ovocyte (Marks et ku, 1985; Bellin et coll., 1994).
D'autres protéines au caractère acide, appartenant A la famille des BSP
(bovine seminal proteins) et désignées BSP-Al, BSP-A2, BSP-A3 et BSP-30- kDa , ont aussi &te isolees a partir du plasma séminal bovin duquel elles
constituent plus de 30% de la fraction proteique (Manjunath et Sairam, 1987; Killian et cou., 1993). Ces protéines, qui sont sécretées par les vesicules
séminales et qui se fixent aux spermatozoïdes au moment de l'éjaculation,
affichent des propriétés intéressantes leur suggérant une participation active au cours du processus de capacitation et de la RA (Manjunath et cou., 1987a, 1988, cités par Chandonnet et COU., 1990). Les BSP ont en effet la capacité de se lier A l'héparine et l'apolipoprotéine A-1, un composant majeur des
accepteurs de cholest&ol HDL (Chandonnet et cou., 1990; Manjunath et coll., 1994; Thérien et coll., 1995), ce qui favoriserait les modifications induites par l'héparine ainsi que l'effiux de cholestérol impliqué dans la capaatation et la RA. De plus, par leur propriété d'interaction avec l'hbparine, les BSP seraient aussi associées la fertilité au même titre que les HBP (Miiler et
COU., 1990; Killian et coll., 1993).
1.2.2 La capatitation
1.2.2.1 Définition, lieu et temps de réalisation
Les spermatozoïdes mammaliens provenant de la queue de l'épididyme ou fraîchement éjaculés sont incapables de féconder un ovocyte
mature (Fournier-Delpech et Thibault, 1991; Yanagimachi, 1988). IIs doivent
entreprendre, lors de leur transit dans le tractus génital femelle, un processus
de maturation additionnel nommé "capacitation" (Austin, 1952) au cours duquel les spermatozoïdes acquigrent leur aptitude A subir la RA et leur compétence féconder (Austin, 1951; Chang, 1951). La reconnaissance de la
capacitation, comme étant un processus physiologique obligatoire pour la
manifestation de la fécondance, résulte des nombreuses tentatives
infructueuses A féconder des ovocytes in vitro avec des spermatozoïdes épididymaires ou éjaculés (Yanagimachi, 1990, 1994). En 1949, Noyes et COU. (Yanagimachi, 1990) avaient d'ailleurs découvert que les spermatozoïdes de lapin provenant de I'éjaculat ou du vas deferens étaient incapables de
Mconder des ovocytes in vit~o, alors que ceux qui avaient préalablement
résidé 4-8 heures dans les oviductes de lapines en étaient capables.
Ainsi, la capaütation physiologique se derouie normalement dans les voies genitales des femelles en periode d'oestnis (YanagimadU, 1988). Les
sites précis où le processus de capacitation s'initie et stachéve peuvent être variables selon le type d'insémination au moment du coït. Chez les especes
pour lesquelles la semence est émise dans le vagin (majorité des mammif&res dont le lapin et l'humain), la capaatation débuterait lors du passage des spermatozoïdes a travers le col utérin ou le mucus cervical (Yanagimachi, 1990; Fournier-Delpech et Thibault, 1991). Lorsque la semence est déposée en partie ou directement dans l'utérus (comme chez plusieurs rongeurs et le porc), le principal site où commence la capacitation serait plutôt l'oviducte (Yanagimachi, 1988, 1990; Fournier-Delpedi et Thibault, 1991).
Par ailleurs, l'endroit exact où la capacitation serait complétée demeure incertain. Alors qu'il a été clairement démontré que les spermatozoïdes de lapin peuvent completer leur capacitation dans l'utérus (Adams et Chang, 1962), cela n'exclut pas ia possibilité qu'ils y soient partiellement capacités et que la capacitation soit achevée lors de leur migration dans I'oviducte (Yanagimachi, 1988). Bedford (1967) rapporte en
effet que, chez le lapin, les spermatozoïdes capacitent plus efficacement lorsqutils sont exposés de façon séquentielle dans l'utérus puis dans l'oviducte. De plus, plusieurs &tudes réalisées in vivo chez des especes de
laboratoire et d'élevage ont révélk que les spermatozoïdes destinés féconder atteignaient plus rapidement l'isthme de l'oviducte et qu'ils y résidaient plusieurs heures avant d'entreprendre leur ascension vers
l'ampoule, lieu où s'effectue la fécondation (Overstreet et coll., 1978; Shalgi et Kraicer, 1978; Hunter, 1981; Hunter et Nichol, 1983; Smith et coll., 1987). Ces observations suggerent fortement que l'oviducte, particuli&rement la région de l'isthme, constitue le principal site in vivo où se déroule la capacitation (Yanagimachi, 1990).
Le temps nécessaire a la réalisation de la capacitation in vivo et in vitro n'est pas fixe et dépend de certains fadeurs tels l'etat hormonal de l'animal, la(1es) région(s) du tractus génital femelle &tudiée(s), la composition physico-chimique des milieux utilisés, la provenance des
spermatozoïdes (épididyme ou éjaculat) ainsi que l'espece considérke
(Bedford, 1972; Hunter, 1988; YanagimadU, 1994); une variation inha-espke est aussi rapportée en ce sens que certains mâles auraient des spermatozoïdes qui capacitent plus rapidement ou plus facilement que d'autres et ce, dans les mêmes conditions. Ainsi les stéroïdes ovariens, via leur action au niveau
des voies génitales femelles, peuvent moduler le délai de realisation de la capacitation in vivo (Bedford, 1970; Hunter, 1988; Fournier-Delpech et Thibault, 1991). Une étude chez le hamster a effectivement démontré que la
capacitation s'effectue rapidement lorsque l'ovulation approche dors qu'eue est plus lente au début de l'oestrus (c 4 heures vs 6-8 heures, respectivement) (Smith et Yanagimachi, 1989). Chez la vadie, aucune capacitation ne survient en @iode lutéale (Fournier-Delpech et Thibault, 1991).
Par ailleurs, plusieurs études utilisant comme indicateur temporel de la capacitation le temps minimal requis oh des ovocytes sont pénétrés in vitro ont révélé que, de façon générale, les spermatozoïdes épididymaires ont davantage de facilité féconder que ceux éjaculés (Nagai et coll., 1984; Yanagimachi, 1994). Il a été suggéré que ce soit la stabilisation accrue des
membranes spermatiques ayant été exposées au plasma seminal qui explique la plus grande resistance deç spermatozoïdes éjaculgs à subir la capacitation in vitro. Enfin, le temps de résidence nécessaire A la realisation de la
capaatation in vivo varie selon les espèces: il est de 3-5 heures chez le verrat, 4-6 heures chez le hamster et 8-10 heures chez le taureau (Fournier-Delpech
et Thibault, 1991). De plus, la durée de la capacitation in nitro differe chez ces mêmes espèces: elle dure > 4 heures chez le verrat, 3 heures chez le hamster (spermatozoïdes épididymaires) et 4-6 heures chez le taureau.
1.2.2.2 Description et mécanismes
La capacitation réfere à la série de changements biochimiques et
physiologiques réversibles que subit le spermatozoïde, particulierement au niveau membranaire, soit in vivo dans les voies génitales femelles, soit in vitro dans un milieu chimiquement defini et/ou en présence de fluides
utérin ou de l'oviducte, et qui rend celui-a apte à subir la RA et a developper une "hypermobilité" (ou "hyperactivation") nécessaires A la fécondation (Bedford, 1983; Hunter, 1988; Florman et Babcodc, 1991; Gordon, 1994;
Yanagimachi, 1994; Harrison, 1996). Au nombre des changements qui surviennent au cours de la capacitation, il y aurait le retrait et/ou la modification de certains composants membranaires, la diminution de la charge nette négative, une réduction du rapport st&ol/phosphoiipideç, une augmentation de la fluidité membranaire (Langlais and Roberts, 19851, la migration des proteines membranaires, une modification de la perméabilité ionique, une élévation du Ca2+ et du pH intracellulaires (Fraser, 1987; Parrish et coll., 1989; Handrow et coll., 1989), une activité accrue de l'adénylate cyclase (AC) et une augmentation de 1'AMPc (Fraser et Monks, 1990; Uguz et COL, 1992; Ijaz et coll., 1996), des changements métaboliques et de la motilitb (Bedford, 1970; Farooqui, 1983; Fournier-Delpech et Thibault, 1991; Yanagimachi, 1994).
Suite a leur émission dans le vagin ou l'utérus, les spermatozoïdes éjacul4s quittent le plasma séminal pour les sécr6tions des voies génitales femelles. Les premiers évenements reliés au processus de capacitation concernent le retrait et/ou la modification des glycoprotéines et des antighes qui avaient éte préalablement adsorbés lors de la maturation épididymaire et de l'éjaculation (Bedford et Hoskins, 1990; Yanagimachi, 1990; Fournier-Delpech et Thibault, 1991). Les changements obsentés quant a l'habilité des spermatozoïdes capacités à se lier aux lectines indiquent effectivement que la portion carbohydrate des glycoprotéines ou des glycolipides est altéré durant la capacitation (Talbot et Chacon, 1981; Singer et coll., 1985). Chez le taureau, très tôt au cours de la capacitation induite par l'héparine, une perte de liaison de la lectine agglutinine du germe de blé au niveau de la tête du spermatozoïde a été observée (Medeiros et Pamsh, 1996). Une étude effectuée &ez le rat a aussi démontre que l'antigène SMA 4, qui est sécrété par un court segment de la partie distale de la queue de l'épididyme et qui est lié la surface de la queue du spermatozoïde, disparait au cours de la capacitation (Vernon et al., 1982).
Le retrait et/ou la modification de ces agents dits "protecteurs" ou
"décapacitants", particulierement au niveau de la région acrosomale,
permettraient l'exposition de certains récepteurs spermatiques dont le rôle
éventuel serait d'interagir avec des ligands spécifiques de l'ovocyte (Shur et Hall, 1982a; Yanagimadii, 1990; Gordon, 1994). Par ailleurs chez le taureau, la
caltrine, un peptide qui provient des glandes annexes et qui séquestre le Ca*+ extracellulaire (Babcock et coll., 1979; Rufo et COU., 1982; Florman et Babcock, 1991), est liée fermement au spermatozoïde la suite de l'éjaculation et son détachement nécessiterait au moins 3 heures (Fournier-Delpech et Thibault,
1991). Son rôle serait de limiter l'influx de Ca2+ et ainsi empêcher les
spermatozoïdes de subir hâtivement la RA spontanée lors de leur transit
dans les voies génitales femelles (Babcock et coll., 1979; San Agustin et coll., 1987; Homan et Babcodc, 1991).
Alors que la mobilité latérale des phospholipides et des protéines membranaires est accrue au cours de la capacitation, des modifications importantes dans leur distribution et leur composition se produisent, principalement au niveau de Ifacrosome, quoique certains changements concernent aussi la queue du spermatozoïde (Fournier-Delpech et Thibault, 1991; Yanagimachi, 1994; Lin et Kan, 1996). Contrairement h ce qui était
observé lors de la maturation épididymaire, soit une augmentation de la
densité des st4rols (Suzuki, 1990), une diminution du ratio stérols/phospholipides survient au cours de la capacitation suite au retrait
du cholestérol, le stérol majeur et stabilisateur de la membrane plasmique
(Langlais et Roberts, 1985; Ehrenwald et coll., 1990; Lin et Kan, 1996). Les
composants protéiques accepteurs de stérols présents dans les fluides utbrin, d'oviducte et folliculaire, tels les lipoprotéines (LDL, HDL) et l'albumine (Go et Wolf, 1985), permettent cet efflux de cholestérol. Lorsque la capacitation
est réalisée in vitro, l'albumine sérique tel que le BSA (bovine serum albumin) semble remplir le rôle d'accepteur de stérols (Visconti et coll.,
199%).
Le retrait des molécules de cholestérol faciliterait donc la capaatation en augmentant la fluidité membranaire et la perméabilité certains ions
(Langlais et Roberts, 1985; Fournier-Ddpedi et Thibault, 1991). Ces auteurs ont d'ailleurs propose que l'efflux de cholesterol augmenterait la
perméabilité au ~ a 2 + extracellulaire, résultant en l'activation de phospholipases, A l'accumulation de lysophospholipides puis A l'induction de la RA. Alors qu'aucune évidence directe n'a pu confirmer cette hypothèse, il a plutôt été suggéré que la perte de cholestérol entraine une réorganisation des composants membranaires (Lin et Kan, 19961, laquelle faciliterait l'entrée de jeu des autres facteurs aux propriétés capacitantes (Parks et Ehrenwald, 1990). Enfin, le cholestérol réduit l'activité de l'AC et modifie la fonction des protéines auxquelles il se lie, ce qui suggere d'autres conséquences suite il son retrait au cours de la capacitation (Fournier- Delpech et Thibault, 1991).
La réorganisation des composants membranaires concerne aussi la migration des protéines en des sites spécifiques au niveau de l'acrosome. Ce mouvement des protéines laisse des zones dénuees de particules intramembranaires appellées "particle-free patches" qui peuvent être mises en évidence soit par la méthode de ayo-décapage, soit par le marquage avec des anticorps monoclonaux (Suzuki, 1990; Fournier-Delpech et Thibault, 1991). La diffusion et la segrégation des lipides en des domaines particuliers favoriseraient l'exclusion de ces protéines intégrées et prédisposeraient l'apposition des membranes plasmique et acrosomique externe de façon A ce qu'elles puissent fusionner lors de la RA (Parks et Ehrenwald, 1990; Fournier-Delpech et Thibault, 1991). Quant aux protéines périphériques,
elles sont tout simplement relarguées au cours de la capacitation.
Outre les nombreux remaniements membranaires qui surviennent au cours de la capacitation, d'autres modifications concernent plutôt la biochimie et le metabolisme du spermatozoïde tels l'activation d'enzymes et/ou de recepteurs (Fournier-Delpech et Thibault, 1991; Yanagimachi, 19%).
Ces changements, possiblement causes par une augmentation de la fluidite membranaire, meneraient a l'activation d'une voie de signalisation intracellulaire modulatrice de la capaatation ainsi qu'à la stimulation de la motdite (Fraser, 1990; Florman et Babcodc, 1991). Du fait que l'ensemble des mécanismes moléculaires qui régulent le processus de la capacitation demeurent encore incompris, plusieurs études actuelles tentent d'en élucider certains aspects et quelques modèles plus globaux ont déja été
proposés chez le taureau et la souris (Parrish et co11.,1994; Visconti et COU., 1995a,b; Galantino-Homer et COU., 1997).
Chez les spermatozoïdes mammaliens, il est génerdement admis que trois composants sont essentiels A la réalisation de La capacitation in vitro soit l'albumine, le Gaz+ et le bicarbonate (Go et Wolf, 1985; Lee et Storey, 1986; Fraser, 1987; Yanagimachi, 1994; Visconti et coll., 1995a,b), auxquels s'ajoute l'héparine chez le taureau (Parrish, 1988). Ces constituants seraient d'ailleurs impliqués dans l'initiation de la cascade dtévGnements associés A la capacitation. Le modMe proposé chez la souris suggère en effet que, dans un premier temps, l'augmentation de la fluidité membranaire favorisée par l'efflw de cholestérol permettrait l'influx de Ca2+ et de bicarbonate (Visconti et coll., 1995b). Dans un deuxième temps, la perméabilité accrue de ces ions et cette destabilisation membranaire stimuleraient l'activité de l'AC et par conséquent, le niveau dtAMPc serait augment&. Dans un troisSrne temps, I'AMPc activerait des protéines kinases A (PK-A) qui à leur tour, activeraient des protéines tyrosine kinases (PIX). Enfinf ce serait la régulation opérée par ces dernieres qui modulerait les phhomenes de capacitation et d'hyperactivation.
Chez les spermatozoïdes bovins, la capacitation est couramment réalisée in vitro dans un milieu supplément6 d'héparine, un glycoconjugué
sulfaté analogue des glycosaminoglycanes présents dans les sécrétions génitales femelles (Lee et Ax, 1984; Parrish et coll., 1988). Selon le modele proposé par Parrish et coll. (1994), la capacitation induite par l'héparine nécessiterait que, dans un premier temps, l'héparine se lie h un récepteur au niveau de la membrane plasmique du spermatozo'ide. Cette liaison
provoquerait des modifications extra et intracellulaires favorisant la prise de Ca*+ par le spermatozoïde, l'augmentation de Ca?+ cytosolique libre ainsi que I'Uvation du pH intracellulaire (Handrow et coll., 1989; Parrish et coll., 1989; P-sh et coll., 1993). Dans un deuxihe temps, ü a &té suggéré que cette induction de la capacitation par lth6parine menerait l'augmentation
des niveaux d'AMPc via une stimulation de l'AC et/ou une inhibition de la phosphodiestérase (PDE) par des seconds messagers comme le Ca*+, puis à
l'activation des PK-A.
L'implication de la voie de signalisation des PK-A dépendantes de 1'AMPc lors du processus de la capautation a d'ailleurs été étudiée plus en
détail chez les spermatozoïdes bovins (Galantino-Homer et coll., 1997). Ainsi, les résultats de cette étude sont venus s'ajouter à ceux obtenus par Parrish et COU. (1989, 1994) pour appuyer davantage l'idée que l'activation de I'AMPc et des PK-A soit un évenement clé associé à la réalisation de la
capautation induite par l'héparine. Ces résultats supportent donc le modèle, initialement proposé chez la souris (Visconti et cou., 1995a,b), voulant que la
capacitation implique des changements membranaires menant une modification du flux ionique, une élévation des concentrations d'AMR, A l'activation de PK-A et enfin, qu'elle soit régulée par une série de phosphorylations effectuée par des PTK. De plus, il a été récemment démontré chez l'humain que la phosphorylation sur les résidus tyrosine des protéines spermatiques pl05 et p81 augmentait lors de la capautation et
qu'elle était régulée par llAMPc (Leclerc et cou., 1996); 1'AMPc favoriserait,
via l'activité de PKA, la phosphorylation sur des résidus sérine/thréonine de PTK ou de protéine($ intermédiaire(& lesquelles activeraient les PTK responsables de l'augmentation de la phosphorylation observée sur les
résidus tyrosine lors de la capacitation.
Les spermatozoïdes ayant subi la capacitation démontrent aussi une
hyperactivation, bien que la réalisation de ces deux phénomènes puisse survenir de façon indépendante (Olds-ClarkeJ990). La motilité du
spermatozoïde hyperactivé est plus vigoureuse et elle est principalement
caractérisée par une augmentation de l'amplitude du battement flagellaire (YanagimadU, 1970; Fournier-Delpech et Thibault, 1991; Yanagimachi, 1994).
Ce mouvement, comparable celui d'un coup d'un fouet ("whiplash"),
résulte de la flexibilité accrue du flagelle et donne lieu A un déplacement circulaire ou discontinu plutôt que linéaire (Suarez et Dai, 1995; Harrison,
r 996).
Chez les spermatozoïdes mammaliens, la nécessite d'exprimer une
hypermobilité afin d'assurer la fécondation in vivo demeure controversée
mais certaines évidences tendent à démontrer l'existence de plusieurs avantages. En effet, les mouvements saccadés et puissants associés 2
l'hyperactivation aideraient le spermatozoïde capacité se détacher de
l'épithélium de l'oviducte au niveau de l'isthme (Smith et Yanagimachi,
1990; Demott et Suarez, 1992), faciliteraient sa migration à travers les
sécrétions visqueuses de l'oviducte pour atteindre le site de fécondation et m ê m e A se faufiler entre les cellules du cumulus entourant l'ovocyte (Suarez et coll., 1991; Suarez et Dai, 1991). De plus, il existe une forte corrélation
entre la démonstration de l'hyperactivation et l'habilité des spermatozoïdes
A féconder des ovocytes possédant une ZP intacte (Fraser et Quinn, 1981; Flemming et Yanagimachi, 1982; Boatman et Robbins, 1991).
Les mécanismes impliqués dans la manifestation de l'hyperactivation
sont encore très peu compris malgré certaines certitudes telles la nécessité du
Ca2+ extracellulaire (Fraser, 1977; Yanagimachi, 1994) et l'implication des
protéines G (Hinsch et coll., 1992) et kinases (Atherton et coll., 1985; Parisel et coll., 1984) au niveau de la queue du spermatozoïde. Un modele a d'ailleurs été proposé par YanagimadU (1994) pour tenter d'expliquer le phénomhe
d'hyperactivation: la capacitation modifierait la membrane de la queue du spermatozoïde et permettrait ainsi l'exposition ou l'activation de récepteurs putatifs. Ceux-ci stimuleraient alors une protéine G, qui à son tour,
activerait des canaux calciques favorisant un influx de Ca2+. Cette entrée de
Ca2+ stimulerait l'AC, laquelle initierait une cascade de phosphorylations dépendantes de 1'AMPc des proteines de llaxon&me. L'activation des
protéines G pourrait aussi activer un antiport Na+/H+ résultant en une
élévation du pH intracellulaire. La phosphorylation des protéines
axonémales et l'augmentaion du pH intracellulaire, jumelées à la présence
d'ATP, produiraient l'interaction entre llaxon&me et la dynéine nécessaire h
la manifestation des mouvements flagellaires associés à l'hyperactivation.
1.3 Interactions entre le spermatozoïde et l'ovocyte
1.3.1 La rencontre de l'ovocyte
Afin d'assurer une fbcondation reussie, les spermatozoïdes mammaliens capacites doivent franchir une autre série dt&apes qui
implique, cette fois-ci, le gamete femelle. En effet, ils doivent d'abord traverser les cellules et la matrice, riche en acide hyaluronique, du cumulus en expansion qui est attaché a l'ovocyte et présent suite l'ovulation chez la plupart des mammiferes (Crozet, 1991; Yanagimachi, 1994). La majorité des spermatozoïdes ayant achevé cette traversée avec succ&s atteignent ensuite la Zl?, cette coudie protectrice de glycoprotéines qui entoure l'ovocyte, avec un acrosome intact (Suarez et coll., 1983; Cherr et coll., 1986; Bleil, 1991). Chez tous les mammif&es étudiés jusqut& présent, la ZP apparaît composée de deux à quatre glycoprotéines qui sont associées de façon A constituer une matrice extracellulaire tridimensionnelle (Crozet, 1991; Kopf et Gerton, 1991). Chez la souris, les trois glycoprotéines majeures de la ZP ont été assez bien caractérisées et eues ont été nommées ZPI, ZP2 et ZP3 (Bleil et Wassarman, 1980; Yanagimachi, 1994).
Les spermatozo'ides capacités se lient fermement a la ZP, de la même espgce, avant de la pbnétrer et se rendre jusqu'a la membrane plasmique de L'ovocyte (Yanagimachi, 1994). Cette reconnaissance et ce type de fixation exigent une interaction entre les composants de surface de la région apicale du spermatozoïde et de la ZP, ce qui a été visualisé grâce aux techniques de microscopie optique et électronique (Bleil, 1991). Chez le porc et la souris, il a éte démontre que l'adhesion primaire du spermatozoide ayant un acrosome intact la ZP était assurée par la ZP3, qui joue le r61e de ligand, via un résidu
N-acétylglucosamine présent au niveau des chaînes glucidiques (Florman et Wassarman, 1985; Sacco et coll., 1989). La ZP2 interviendrait comme second ligand en maintenant la liaison du spermatozoïde la ZP, une fois que celui- ci aurait subi la RA (Crozet, 1991).
Concernant le spermatozoïde, une protéine membranaire remplirait le rôle de récepteur de ZP3 et bon nombre de candidates ont été proposées au cours des dernieres années telles la sialyltransférase (souris), l'acrosine (hamster, cobaye, humain) et la proaaosine (porc) (Yanagimachi, 1994). D'autre part, plusieurs études ont suggéré que la galactosyltransférase, une enzyme située au niveau de la membrane plasmique du spermatozoïde, soit la plus susceptible d'être impliquée dans la reconnaissance et l'adhésion primaire, particulièrement chez le cheval, le taureau (Fayrer-Hosken et coll.,
1991) et la souris (Shur et Hall, 1982; Shur et Neely, 1988). En effet, les
résultats obtenus chez la souris révdent que la fixation des spermatozoïdes h la ZP est empêchée en présence soit d'a-lactalbumine, qui a la propriété de modifier l'activité de la galactosyltransférase, soit avec des anticorps anti- galactosyltransférase dont l'inhibition est dose-dépendante (Shur et Hall, 1982).
1.3.2 La réaction acrosomale (RA)
1.3.2.1 Description et lieu de réalisation
Au conctact de la ZP, ultérieurement l'adhésion primaire, les spermatozoïdes capacités subissent rapidement la RA (Crozet, 1991; Yanagimachi, 1994). Ce phénomène d'exocytose irréversible implique de multiples fusions entre les membranes plasmique et acrosomique externe. La fenestration qui en résulte entraîne la libération des enzymes acrosomales dans l'environnement immédiat du spermatozoïde et au terme du processus, la membrane acrosomique interne est exposée A la ZP. L'acrosome est en fait une structure vésiculaire qui coiffe la tête du spermatozoide et qui contient diverses enzymes hydrolytiques telles la hyaluronidase (Harrison, 1988), l'acrosine (Urch, 1991) et des phospholipases (Langlais et Roberts, 1985). Le r6le de ces dernieres seraient de faciliter le passage du spermatozoïde à travers la ZP (Bedford, 1970; Yanagimachi, 1994). Quoique la nécessité de ces enzymes lors de la fécondation soit encore questionnable, aucun doute ne subsiste quant l'obligation de subir la RA
(Yanagimachi, 1988). En effet, seuls les spermatozoïdes ayant reagi sont capables de traverser la ZP et subséquemment, de fusionner avec la membrane plasmique de l'ovocyte.
I n vivo, il semble que tous les spermatozoïdes qui atteignent l'ampoule de l'oviducte soient pleinement capaatés et prêts subir la RA au contact des complexes ovocyte-cumulus (Yanagimachi, 1990). Toutefois, peu de spermatozoïdes réagissent h ce niveau (Yanagimachi, 1994) et plusieurs évidences indiquent que l'initiation physiologique de la RA chez plusieurs
especes survient au contact de la ZP (Cherr et coll., 1986; Florman et First,
1988; Berger et coll., 1989; Kopf et Gerton, 1991; Lee et coll., 1992). In vitro, la RA peut être provoquée chez les spermatozoïdes capaatés par des inducteurs
plus ou moins physiologiques tels des ZP solubilisées (Ward et Kopf, 19931, la
progesterone (Osman et coll., 1989), les glycosaminoglycanes (Handrow et coll., 1982), la lysophosphatidylcholine (LPC) (Parrish et coll., 1988) et l'ionophore du Ca2+ A23187 (Hanada, 1985; cite par Toyoda et Naito, 1990).
1.3.2.2 Mécanismes putatifs
Plusieurs modeles ont été proposés pour tenter d'expliquer le mécanisme par lequel les composants de la ZP induisent la RA (Yanagimachi, 1981; Roldan et Harrison, 1990; Kopf et Gerton, 1991; Saling, 1991; Storey, 1991). Néanmoins, il semble admis que la RA physiologique,
c'est-&-dire celle qui est requise pour traverser la ZP, soit médiée par un processus impliquant un ligand et un récepteur (Kopf et Gerton, 1991). Chez la souris, il a été démontré que la partie protéique intacte de la ZP3 (Roman et Wassarman, 1985), lorsque liée au récepteur spermatique, déclenchait la cascade d'év&nements menant A la RA (Crozet, 1991; YanagimadU, 1994). Il en est probablement de même chez plusieurs autres especes pour lesquelles le Ligand apparaît être un composant de la ZP (Kopf et Gerton, 1991). De plus, un influx massif de ~ a 2 + , une augmentation du pH intracellulaire ainsi que
la production de compos4s fusogenes sont des évenements jugés essentiels
pour la RA (Crozet, 1991; Yanagimachi, 1994).
Le modele proposé par Kopf et Gerton (1991) pour decrire la série d'évènements menant A la RA inclut des résultats obtenus chez diverses esp&ces, mais la plupart des éléments d'information proviennent d'expériences réalisées chez la souris où la RA était induite par la ZP. Dans
un premier temps, un récepteur spermatique activé par la ZP3 stimulerait une protéine G, qui a son tour stimulerait l'activité d'une phospholipase C (PLC) sise dans la membrane plasmique du spermatozoïde. Dans un
deuxième temps, la PLC cliverait le phosphatidylinositol biphosphate (PIP2) en diacylglycérol (DAG) et en inositol triphosphate (XP3). Celui-ci
augmenterait la concentration intracellulaire de Ca2+ via son action sur des réservoirs 21 Ca2+ intracellulaire. Le DAG, pour sa part, activerait des
protéines kinases dépendantes du ~ a 2 + (PKC), lesquelles auraient comme fonction de phosphoryler d'autres protéines impliqués dans la RA.
Dans un troisieme temps, certaines molecules d'lP3 rnkthylees (IF41 réguleraient l'ouverture de canaux calciques sensibles au voltage (Florman et coll., 1992), ce qui permettrait un influx massif de Ca2+ extracellulaire. Une partie de ce Ca2+ agirait directement sur les phospholipides membranaires afin de faciliter la fusion des membranes plasmique et acrosomique externe.
protéines G activées pourraient aussi stimuler D (PLA2 et PLD). La PLA2 cliverait la LPC et en acide arachidonique MA), deux hautement fusogéniques (Papahadjopoulos et
Dans un quatrieme temps, les les phospholipases A2 et phosphatidylcholine (PC) en produits ayant des propriétés coll., 1976; Fleming et Yanagimadu, 1984). La PLD diverait la PC en choline et en acide phosphatidique (PA), lesquels sont aussi fusogènes.
Enfin, les protéines G activeraient l'AC, qui en retour stimulerait la production d'AMPc et menerait à l'activation de la voie des PK-A. Une partie de l'AMPc agirait sur un antiport Na+/H+, de façon permettre un influx de Naf et un efflux de H+, entraînant ainsi une augmentation du pH intracellulaire. Chez le bovin, il a été démontre que cette alcalinisation du pH acrosomal pouvait être induite par la ZP sous des conditions favorisant l'induction de la RA (Florman et coll., 1989). Ce changement de pH semble en effet être important dans la mediation de la RA chez les spermatozoïdes mammaliens (Working et Meizel, 1983; Murphy et Yanagimachi, 1984). activerait des enzymes acrosomales, comme la transformation de la proacrosine en aaosine, qui participeraient B la dispersion de la matrice acrosomique (Crozet, 1991).
1.3.3 La fécondation
Lorsque le spermatozoïde a subi la RA, il traverse vigoureusement la ZP pour atteindre l'espace périvitellin puis, la membrane plasmique de l'ovocyte (Crozet, 1991; Yanagimachi, 1994). Le mécanisme par lequel les spermatozoïdes euthériens passent à travers cette épaisse matrice extracellulaire demeure encore obscur. Deux hypotheses ont été émises: la premiere suggere que la pénétration du spermatozoïde A travers la ZP soit essentiellement mécanique. A l'inverse, la deuxi-e implique uniquement Les enzymes acrosornales, telles l'acrosine et la hyaluronidase, dont le rôle serait de cliver les molecules de la ZP afin de faciliter le passage du spermatozoïde.
Après avoir franchi la Z?, le spermatozoïde ayant subi la RA atteint enfin la membrane plasmique de l'ovocyte avec laquelle il interagit, puis fusionne (Crozet, 1991; Yanagimachi, 1994). Sous des conditions physiologiques, un seul spermatozoïde fusionne avec la membrane plasmique de l'ovocyte et le pénetre. Le modele proposé pour décrire le processus de fusion suggère que la membrane plasmique, qui recouvre la région du segment équatorial du spermatozoïde, possede des protéines putatives de fusion non actives (Yanagimachi, 1994). La membrane plasmique de cette région subirait des modifications au cours de la capacitation, mais celles-a ne favoriseraient pas la fusion avec la membrane auosomique externe. Ainsi, les enzymes acrosomales relâchées suite ?î la RA activeraient les protéines putatives de fusion de la région équatoriale pour rendre la membrane plasmique du spermatozoïde apte A fusionner avec celle de l'ovocyte.
Au cours de la fusion, la membrane plasmique du spermatozoïde est intégrée A celle de l'ovocyte, alors que la membrane aaosomique interne est incorporée dans le cytoplasme de l'ovocyte en même temps que le noyau (Crozet, 1991). Chez les mammiferes, le flagelle du spermatozoïde s'y
introduit aussi sauf quelques exceptions. Subséquemment la fusion et à la
pénétration, le spermatozoide active le métabolisme de l'ovocyte dont la maturation était arrêtée au stade métaphase II de la méiose (Yanagimachi,
1994). Une série de changements morphologiques et biochimiques sont alors initiés tels une modification de potentiel membranaire, une mobilisation massive de Ca2+, la libération du contenu des granules corticaw et la reprise de la deuxihe division méiotique (Crozet, 199 1; Yanagimachi, 1994).
Plusieurs autres modifications concernent le noyau du spermatozoïde telles la dissolution de l'enveloppe nucléaire, la reduction des ponts
disulfures des proteines associées à l'ADN, la décondensation de la chromatine et le remplacement des protamines par des histones (Pemeault, 1990; Crozet, 1991; Yanagimachi, 1994). Tous ces évenements meneront A la
formation et 3 la syngamie des pronoyaux mâle et femelle, a la division et la différenciation cellulaires puis finalement, a la formation d'un nouvel individu. Chez les rnammif&res, l'intervalle de temps entre la fusion du spermatozoïde et l'ovocyte et la premigre division zygotique varie entre II et 20 heures (Ménézo et Renard, 1991).
In vivo, la fécondation se produit dans les voies génitales femelles
plus spécifiquement au niveau de l'ampoule ou de la jonction isthme- ampoule de l'oviducte (Yanagimachi, 1994). Actuellement, il est possible de
réaliser la fbcondation in vitro (FW) chez plusieurs espèces animales telles le lapin, le hamster, la souris, le bovin et le porc, de même que chez l'humain, en utilisant des milieux chimiquement définis (Crozet, 1991). Les milieux
modifiés de Tyrode sont utilisés couramment pour effectuer la FIV chez les animaux d'élevage tel le bovin (Brackett et coli., 1982; Parrish et COU., 1988).
Depuis la naissance du premier veau eprouvette (Bradcett et ~011.~
19821, l'utilisation des techniques de FIV chez les animaux domestiques est toujours en plein essor. La mise au point de méthodes in vitro permettant
d'induire la maturation des ovocytes (Sirard et coll., 1988; Utsumi et coll.,
1988) et la capacitation des spermatozoïdes (Bradcett et coll., 1982; Parrish et
coll., 1985) a permis d'augmenter l'efficacité de la FIV, tel qu'observé chez le bovin. Alors que l'objectif premier de l'utilisation de la F W était de traiter l'infertilité des animaux fort potentiel génétique, les applications actuëlles
visent plutôt A produire un plus grand nombre d'embryons (Sirard et coll., 1988; Leibfried-Rutledge et coll., 1989). Ces derniers sont effectivement
prérequis au développement commercial de d'autres techniques, telles le
clonage et le génie génétique, qui pennetteront un meilleur contrôle de la
production animale (Sirard et cou., 1988; Parrish, 1991).
1.4 Les spermatozOides cryoprésemés
1.4.1 Utilisations
Depuis l'avgnement de l'utilisation des techniques d'insémination
artificielle (IA) et de FIV, les méthodes de conservation de la semence tel que le processus de cryopréservation, revêtent une importance particuliere.
Ainsi, nombreux sont les avantages, autant scientifique que commercial, reliés cette possibilité de conserver et de préserver le pouvoir fécondant de la semence pendant plusieurs jours, voire même des années. En effet,
l'utilisation de l'LA et de la semence cryopréservée chez les animaux
domestiques facilitent Ia recherche dans les domaines de la fertilité, de la
génétique et de l'infertilité; ces techniques permettent aussi l'amélioration de la race par l'emploi de mâles génétiquement supérieurs, l'élimination des
contraintes géographiques et de temps, la réduction des coûts en gardant moins de mâles sur la ferme et en assurant un meilleur contrôle sanitaire
(Watson, 1990).
VIA et la semence cryopréservée peuvent également être utilisées comme therapeutique dans les cas d'infertilite ou de sous-fertilite, particuli&rement chez l'humain (Watson, 1990). De plus, la cryoprése~ation
de la semence peut s'avkrer utile pour les hommes qui doivent subir des traitements de chimio ou radiothérapie, car ceux-ci sont nocifs pour I'épithéIium germinal (Sherman, 1986; cité par Watson, 1990). Ces
techniques de reproduction assistée sont tout aussi importantes pour assurer
la perpétuation des espèces animales en captivité ou en voie de disparition (Watson, 1990; Wildt, 1990). Pour toutes ces considérations, il s'avhre
avantageux de généraliser l'utilisation de 1'IA chez plusieurs espèces animales et par conséquent, d'avoir Zt sa disposition une semence cryopréservée de qualité afin d'obtenir des taux de conception comparables à
ceux obtenus suite à des accouplements naturels.
1 A.2 La cryopréservation
1 A.2.l Procédure
La cryopréservation est un processus qui vise à préserver la semence A long terme pour des usages ultérieurs. La procédure, couramment utilisée dans l'industrie oeuvrant en IA, comprend une série d'étapes (ex.: dilution et refroidissement h 4 ou SOC, emballage, congélation et entreposage dans l'azote liquide h -196OC) au cours desquelles les spermatozoïdes sont susceptibles de subir bon nombre de stress les rendant moins aptes à
accomplir leurs fonctions physiologiques (Hammerstedt et coll., 1990; Watson, 1995). La décongélation de la semence, préalablement à son
utilisation, constitue aussi une étape critique quant à la survie, à la motilité et la capacité de féconder des spermatozoïdes cryopréservés.
Apres la récolte, la semence est diluée dans une solution cryoprotectrice (diluant) où le pH, l'osmolalit~ et la force ionique sont contrôlés (Watson, 1990). Chez les mammif&res, le pH optimal se situe
habituellement pres de la neutralite, soit entre 6,9 et 7,l. Les diluants utilisés different selon les espèces mais ils doivent avoir des propriétés communes comme ceiles d'inhiber le métabolisme et la recrudescence des altérations membranaires, tout en procurant un environnement propice à la
préservation de l'intégrite des membranes et de leurs fonctions (Watson, 1990, 1995). De plus, les diluants doivent contenir certains constituants tels des substrats énergétiques, des substances protectrices contre les effets néfastes inhérents a u réductions de température ainsi que des agents an& microbiens.
Les diluants a base de jaune d'oeuf et atrate sont parmi les plus
utilsés, particulièrement pour la semence bovine, car ils favorisent la suMe en génerant un bon pouvoir tampon ainsi qu'une protection membranaire et ce, même A de basses températures (Watson, 1990). L'introduction de
sucres glycolysables par le spermatozoïde, tel le fructose, a permis d'améliorer davantage l'efficacité de ce diluant en procurant une source d'énergie supplémentaire tout en contribuant au maintien de l'osmolalité. Quant au glycérol, il est souvent présent A titre de cryoprotectant et la concentration optimale pour la semence bovine varie entre 6 et 9% (v/v).
Des diluants à base de lait sont aussi utilisés avec succes chez différentes espkes telles le bovin, le cheval et le mouton. Enfin, d'autres composants
peuvent être ajoutés aux diluants tels des tampons organiques (Tris: tris(hydroxyméthyle)aminométhane, TES: N-tris (hydroxyméthy1e)méthyfe- 2-aminométhane d 'acide su lp honique, Hepes: N-(2-
hydroxyéthy1e)piperazine-N'-2-éthane d'acide sulphonique), des enzymes (catalase, amylases), des stimulants métaboliques (caféine, IBMX: 3- isobuthyle-1-méthylexanthine), des peptides et des acides aminés (glycine, cystéine, glutathione) et des prostaglandines, mais leurs rôles exacts sont parfois discutables.
Chez le taureau, apres une lente période de refroidissement jusqu'a
4OC, la semence diluée est généralement congelee dans l'azote liquide a -196'C dans des paillettes de plastique dont le volume est de 0 5 ou 0'25 mL (Pickett et Bemdtson, 1974). La quantité de spermatozo'ides peut varier de 15- 20 x 106 par paillette, ce qui permet d'obtenir des taux de conception acceptables in vivo. En effet, la semence de certains taureaux résistent moins bien A la procédure standard de cryopréservation et les doses doivent donc
être ajustées en conséquence de facon A optimiser les résultats (Watson, 1995). La décongélation consiste A plonger les pailletes dans de l'eau h 35 OU
37°C pour une période variant de 30 A 60 secondes. La semence est ensuite récupérée pour 1'IA ou pour d'autres fins, telle la FIV.
1 -4.2.2 Dommages cellulaires
De nombreuses évidences suggèrent que la membrane plasmique du
spermatozoïde soit le site privilégié où surviennent les dommages résultant du refroidissement et de la congélation (Hammerstedt et coll:, 1990; de Leeuw et coll., 1991). Les alt6raüons membranaireç, particulierement celles
survenant tr&s tôt lors du processus de cryopréservation, influenceraient la nature des dommages subséquents au niveau du cytosquelette, des srnichires impliquées dans la motilité et du noyau (Watson, 1995). Bien que la nature
des phospholipides et le cholestérol composant la membrane plasmique du spermatozoïde lui conferent un caractère unique (Watson, 19951, les perturbations membranaires reliées ii une diminution de température ressembleraient à celles observées chez d'autres types cellulaires. En effet, la
membrane plasmique du spermatozoïde possède essentiellement les mêmes caractéristiques que celles ülustrées par le modde de base, soit une mosaïque
fluide constituée d'une bicouche de phospholipides avec des protéines intégrées, ainsi que des glycoprotéineç et des gIycolipides périphériques (Singer et Nicolson, 1972). L'ajout du concept d'asymétrie, en complexifiant
ce modèie, a permis de mieux caractériser les fonctions cellulaires telles la
compartimentation et la perméabilité sélective (de Leeuw et coll., 1991; Parks et Graham, 1992). Ainsi, lorsque des spermatomïdes sont refroidis, il est fort
probable que ces fonctions soient affectées conséquemment à un réarrangement des composants membranaires (Hammers tedt et cou., 1990; Park et Graham, 1992), tel qu'observé chez d'autres membranes biologiqueç.
Au cours de 1a ayopréservation des spermatozoïdes, une baisse de température soudaine (ou en dessous du seuil critique) augmenterait la diffusion latérale des lipides membranaires et faciliterait le regroupement de
phospholipides non favorables une configuration en bicouche, occasionnant ainsi une fluidification et une déstabilisation des membranes (de Leeuw et coll., 1991; Parks et Graham. 1992; Watson, 1995). Cette
sensibilité du spermatozoïde aux variations rapides de température, particulièrement entre O et 20°C, varie selon les espèces et le terme "cold shock" est souvent employé pour référer ce phenornene (Watson, 1990,
1995). La perte de l'intégrité rnembranaire et de la pem6abilité sélective
consecutives au "cold shock" affecteraient les fonctions cellulaires telles l'activite enzymatique, la motilité et la viabilité (de Leeuw et cou., 1991; Pqks et Graham, 1992; Robertson et coll., 1990). La sévérité des dommages encourus dépend donc de la vitesse laquelle les spermatozoïdes sont refroidis, de l'intervalle de température couvert lors du refroidissement et de la longueur de l'incubation à des températures réduites (Watson, 1995). D'autres facteurs peuvent aussi être considérés tels la température minimale atteinte, la présence de cryoprotectants de même que le degré de maturation des spermatozoïdes (de Leeuw et cd., 1991; Parks et Graham, 1992).
La formation et la dissolution des cristaux de glace, lors de la congklation et de la décongélation respectivement, constituent aussi un stress pour le spermatozoïde (Parks et Graham, 1992; Watson, 1995). En effet, lorsque la temperature chute en dessous de O°C, le milieu extracellulaire subit les processus de nudeation et de cristallisation. La concentration en soluté du milieu qui demeure liquide augmente, ce qui crée un gradient osmotique favorisant un efflux d'eau de la cellule vers le milieu extracellulaire et la cellule se déshydrate. Ce phénomène dépend A la fois de la vitesse laquelle la congélation s'effectue, de la perméabilité hydrique de la membrane plasmique ainsi que de son tinergie d'activation. Si la congélation se fait trop rapidement, cela peut même entraîner la formation intracellulaire de cristaux de glace et la mort de la cellule (Mazur, 1984). Par contre, lorsque que la congélation est ultrarapide, la formation de microcristaux chez les cellules dont le volume initial est préservé ne semble pas occasionner de dommages cellulaires particuliers (de Leeuw et coll., 1991).
L'atteinte de la survie cellulaire optimale, suite au processus de cryopréservation, requiert que le choix de la vitesse de refroidissement et de congélation soient jumelées à une vitesse adéquate de décongélation (Mazur, 1984). En effet, un taux de décongélation trop rapide engendre un déséquilibre entre l'effiux de solutés, tek certains ayoprotectants incluant le glycérol, et i'influx d'eau lors du retour au volume cellulaire initial (Hammerstedt et coll., 1990). Il en resulte des dommages sév&res aux
structures acrosomales tel que démontré chez le verrat (Bamba et Cran, 19851,
le lapin et le taureau (Bamba et Cran, 1988a). A l'inverse, un taux de
décongélation trop lent entraîne une recristallisation des miaocristaux de l'eau intracellulaire occasionnant ainsi des dommages aux organelles
cellulaires (Hammerstedt et coll., 1990). Une vitesse de décongélation
adéquate doit donc permettre de minimiser les dommages encourus par un taux de transport inapproprié des solutés et de l'eau a travers les membranes spermatiques et par la formation intracellulaire de microcristaux de glace.
1.5 Problématique
1.5.1 Mise en situation
Au Canada et dans plusieurs autres pays, l'utilisation de la semence cryopréservée en IA bovine est une pratique largement répandue, particuli&ement en production laitigre ( I r i ta~ , 1980; cite par Watson, 1990; Gordon, 1994). Malgré l'amélioration marquée des techniques de préservation de la semence, un problhne subsiste encore aujourd'hui: la survie des spermatozoïdes cryopréservéç, aprh decongelation, se situe entre 50 et 60% de la population initiale (Foote et Parks, 1993; Gordon, 1994; Watson, 1995). De plus, ces mêmes spermatozoïdes, qui ont 4té congelés et
décongelés, survivent moins longtemps que ceux ayant été seulement refroidis à une température voisinant les SOC (Foote e t Parks, 1993). En conséquence, la fertilité obtenue en IA suite l'utilisation de la semence
cryopréservée est moindre que celle observée avec de le semence fraîche et ce, chez plusieurs especes (Watson, 1995). Cette fertilite reduite est
partiellement compensée par un plus grand nombre de spermatozoïdes vivants utilisés pour effectuer l'insémination.
Le processus de cryopréservation comprend plusieurs étapes (ex.:
dilution, refroidissement, cong6Iation) au cours desquelles les
spermatozoïdes sont susceptibles de subir bon nombre de stress les rendant moins aptes remplir leurs fonctions physiologiques (Watson, 1995). Les
dommages inhkrents A l'ensemble de cette procédure sont reconnus pour affecter particulierement la membrane plasmique du spermatozoïde
(Hamrnerstedt et coll., 1990; de Leeuw et coli., 1991; Parks et Graham, 1992).
L'augmentation du volume et les bris cellulaires (Woolley et Richardson,
1978; Pace et coll., 1981; Holt et North, 1994), la perte de la perméabilité sélective, les changements de fluidité membranaire (Buhr et coll., 1989; Canvin et Buhr, 1989), la déperdition et l'agrégation de phospholipides et de protéines, la réduction de la motilité, de l'activitb enzymatique et de la
viabilité (Watson, 1981; Panish et COU., 1986; Gordon, 1994) constituent les principaux dommages cellulaires. Ces derniers peuvent être imputables aux changements de température, la formation et Li la dissolution des aistaux de glace et aux contraintes osmotiques (Watson, 1995). Néanmoins, ces explications ne peuvent élucider entierement la moindre efficacité Li
féconder in vivo des spermatozoïdes cryoprésemés et ce, au même titre que la baisse de motilité et de viabilité observées aprh décongélation.
Des évidences assez récentes suggèrent que les spermatozoïdes
mammaliens ayant subi le processus de ayopréservation soient dans un état ressemblant à la capaatation (Watson, 1995). Une étude réalisée chez le
verrat par Ashworth et COU. (1994) a révélé qu'un refroidissement ik 5OC, suivi d'un réchauffement des spermatozoïdes en absence de bicarbonate (lequel est considéré comme étant essentiel la réalisation de la capacitation
et de la FrV chez le verrat; Suzuki et coll., 1994), mimait la fluidification membranaire induite par le bicarbonate à la température corporelle. Il semblerait donc que les membranes, suite au refroidissement, répondent comme si elles étaient capacitées. Chez l'humain, les spermatozoïdes
cryopréservés, immédiatement apres décongélation, péngtrent plus d'ovocytes de hamster dépourvus de leur ZP lorsque comparés aux
spermatozoïdes frais pour lesquels une période d'incubation de plusieurs heures est requise pour obtenir des hauts taux de pénétration (Critçer et COU., 1988). Enfin, Fuller et coll. (1994) ont montré que les spermatozoïdes de
souris, aprk un refroidissement à 4OC suivi d'un réchauffement, affichaient
un plus grand pourcentage de spermatozoïdes capaatés tel que determiné par la méthode de coloration la chlort6tracycline (CTC). Une capacitation induite par la cryoprése~ation apparaît donc une alternative intéressante pour expliciter davantage la moindre efficacité féconder in vivo de la
semence décongelée.
1.5.2 Hypothèses de travail
L'objectif de la premiere étude était de verifier l'hypothese selon laquelle le processus de cryopreservation, couramment utilisé dans l'industrie oeuvrant en IA, prédispose les spermatozoïdes bovins à subir une capacitation prématurée. Celle-ci pourrait en effet contribuer de façon significative à la moindre efficacité à féconder in uiuo de la semence cryopr4servée. Plus spécifiquement, nous proposons que la dilution des spermatozoïdes frais dans un diluant il base de jaune d'oeuf-Tris-glycerol (JOTG) ainsi que leur refroidissement il CC pendant une période de 4 heures, initient la capaatation. Afin de vérifier cette hypothese, deux methodes d'&mluation de la capacitation des spermatozoïdes ont été utilisées soit: la méthode de coloration au CTC et la W.
L'objectif général de la deuxieme étude était de vérifier l'hypothèse selon laquelle l'ajout de glucose à de la semence fraîche diluée dans le JOTG, empêche la capacitation prematurée induite par le processus de cryopréservation chez les spermatozoïdes bovins. L'objectif secondaire était de vérifier la reversibilite de cette inhibition lors d'une incubation sous des conditions favorisant la capacitation. Afin de vérifier ces hypotheses, M a t capacité des spermatozoïdes pré-traités avec ou sans glucose a éte évalu6 par leur habilité à subir la RA induite par la LPC et ce, grâce la methode de coloration a l'acide flavianique et erythrosine B.
1.6 Liste des ouvrages cités
Acott, T. S., Katz, D. F., Hoskins, D. D. Movement characteristics of bovine
epididymal spermatozoa: effects of forward motility protein and
epididymal maturation. Biol Reprod 1983;29:389-399.
Adams, C. E., Chang, M. C. Capacitation of rabbit spermatozoa in the
Fallopian tube and in the uterus. J Exp Zoo2 1962;151:159-165.
31
Amoult, C., Zeng, Y., Florman, H. M. ZP3-dependent activation of sperm
cation channels regulates acrosomal secretion during mammalian
fertilization. J Ce21 Biol l996;lM:637-645.
Ashworth, P. J. C., Harrison, R. A. P., Miller, N. G. A., Plummer, J. M.,
Watson, P. F. Survival of ram spermatozoa at high dilution: protective
effect of simple constituents of culture media as compared with seminal
plasma. Reprod Fertil Dm 1994;6:173-180.
Atherton, R. W., Khatoon, S., Schoff, P. K., Haley, B. E. A study of rat
epididymal sperm adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein
kinases: maturation differences and cellular location. Biol Reprod
2 985;32: 155-1 71.
Austin, C. R Observation on the penetration of sperm into the marnmalian
egg. A U S ~ J Sn RB 1951;~:697-69~.
Austin, C. R. The "capacitation" of the mammalian sperm. N a t u r e
1952;170:326.
Baas, J. W., Molan, P. C., Shannon, P. Factors in seminal plasma of bulls that
affect the viability and motility of spermatozoa. J Reprod Fertil
1983;68:275-280.
Babcock, D. F., Singh, J. P., Lardy, H. A. Alteration of membrane permeabili~
to calcium ions during maturation of bovine spermatozoa. Deo Biol
1979;69:85-93.
32
Bailey, J. L., Buhr, M. M. Cryopreservation alters the Ca2+ flux of bovine
spermatozoa. Can ] Anim Sei l994;74:4S-Sl.
gamba, K., Cran, D. G. Effect of rapid warming of boar çemen on sperm
morphology and physiology. J Reprod Ferfil 1985;75:133-138.
Bamba, K., Cran, D. G. Effea of rapid warming of bull and rabbit semen. 1
Reprod Fertil 1988a;82:501-507.
Bavister, B. D., Leibfried, M. L, Lieberman, G . Development of
preimplantation embryos of the golden hamster in a defined culture
medium. Biol Reprod 1983;28:235-247.
Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa
from different regions of the rabbit epididymis. J Exp Zwl 1967;166:271-
282.
Bedford, J. M. Sperm capacitation and fertilization in mammals. Bi01 Reprod
1970;2(Supp1.):12&158.
Bedford, J. M. Sperm transport, capacitation and fertilization. In: Balin, H.
and Glasser, S., eds. Reproduc the Biology. Amsterdam: Excerp ta Medica;
l972:33&392.
Bedford, J. M., Calvin, H. 1. Changes in the -SSiinked structures of the
sperm tail during epididymal maturation with comparative
observations in sub-mammalian species. J E x p Zool 1974;187:181-204.
Bedford, J. M.
epididymis.
Physiology.
33
Maturation, transport and fate of spermatozoa in the
In: Hamilton, D. W. and Greep, R. O., eds. Hanbook of
Endocrinology (Section 7): Male Reproducfioe System.
Washington, DC: American Physiology Society; 1975:303-317.
Bedford, J. M. Significance of the need for sperm capacitation before
fertilization in eutherian mammals. Biol Reprod 1983;28:108-lîO.
Bedford, J. M., Hoskins, D. D. The mammalian spermatozoa: morphology,
biochemis try and physiology. In: Lamming, G. E., ed. Marshall ' s
Physiology of Reproduction: Reproduction in the Male. New York:
Churchill Livingston; 1990:379-568.
Bellin, M. E., Hawkins, H. E., Ax, K. L. Fertility of range beef bulls grouped
according to presence or absence of heparin-binding proteins in sperm
membranes and seminal fluid. J Anim Sci 1994;72:244l-Z448.
Berger, T., Turner, K. O., Meizel, S., Hedrick, J. L. Zona pellucida-induced
acrosome reaction in boar spermatozoa. Biol Reprod 1989;40:525-530.
Bérube, B., Sullivan, R. Inhibition of in vivo fertilization by active
immunization of male hamsters against a 26kDa sperm glycoprotein.
Bi01 Rep~od l994;5l: 1255-1263.
Bleil, J. D., Wassarman, P. M. Structure and function of the zona pellucida:
identification and characterization of the proteins of the mouse oocyte's
zona pellucida. D m Bi01 1980;76:185-202.
34
Bleil, J. D. S p m receptors of mammalian eggs. In: Wassarman, P . M., ed.
Elements of Mammnlian Fertilization: Basic Concepts. Boca Raton, FL:
CRC Press; 1991:133-151.
Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining
characteristics for developmental cornpetence in bovine oocytes. Mol
Reprod Dm 1995;41:5462.
Boatman, D. E., Robbins, R. T. Bicarbonate: carbon-dioxide regdation of
sperm capautation, hyperactivated motility, and the acrosome reaction.
Bi01 Reprod 1991;44:806-813.
Boué, F., Bémbé, B., De Lamirande, E., Gagnon, C., Sullivan, R. Human
sperm-zona pellucida interaction is inhibited by an antisenim against a
hamster sperm protein. Bi01 Reprod 1994;51:577-587.
Boué, F., Sullivan, R. Les protéines épididymaires en tant que cibles pour
une contraception masculine et ferninine. Reférences en gyntcologie
obstétrique 1995;3:2-9.
Brackett, B. G., Bousquet, D., Boice, M. L., Donawick, W. J., Evans, J. F.,
Dressel, M. A. Normal development following in vitro fertilization in
the cow. Biol Reprod 1982;27:147-158.
Buhr, M. M., Canvin, A. T., Bailey, J. L. Effects of semen preservation on boar
spennatowa head membranes. Game te Res 1989;23:441-449.
Canvin, A. T., Buhr, M. M. Effect of temperature on
spenn membranes. J Reprod Fert 1989;85:533-540.
the fluidity of boar
Chandonnet, L., Roberts, K. D., Chapdelaine, A., Manjunath, P. Identification
of heparin-binding proteins in bovine seminal plasma. Mol Reprod D m
1990;26:313-318.
Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited in the fallopian
tubes. Nature 1951;168:697-698.
Chang, M. C. A detrimental effect of seminal plasma on the fertilizing
capaaty of sperm. Nature 1957;179:25&259.
Cherr, G. N., Lambert, H-, Meizel, S., Katz, D. F. In vitro studies of the golden
hamster sperm acrosome reaction: completion on the zona pellucida
and induction by homologous zonae pellucidae. Dm Biol 1986;114:119-
131.
Cooper, T. G. The Epid idymis, Sperm Maturation and Fertilization. New
York: Springer-Verlag; 19%.
Cooper, T. G. In defense of a function for the human epididymis. Fertil Steril
1990;54:965-975.
Critser, J. K., Huse-Benda, A. R, Aaker, D. V., Arneson, B. W., Baii, G. D.
Cryopreservation of human spermatozoa. III. The effect of
cryoprotectants on rnotility . Fer t il S teril 1988;50:314320.
36
Crozet, N. La fécondation in vivo et in vitro. Dans: Thibault, C. et Levasseur,
M X . , éds. Ln Reproduction chez les Mammif2res et l'Homme. Paris:
Édition Marketing; 1991 :3lS-337.
Dadoune, J. P., Démoulin, A. Structure et fonctions du testicule. Dans:
Thibault, C. et Levasseur, M.-C., éds. La Reproduction chez les
Mammifères et l'Homme. Paris: Édition Marketing; 1991:221-250.
Davies, D. C., Hall, G., Hibbitt, K. G., Moore, H. D. M. The removal of the
seminal vesicles from the boar and the effects on the semen
characteris tics. J Reprod Fer fil 1975;43:305-312.
de Leeuw, F. E., Colenbrander, B., Verkleij, A. J. The role membrane damage
plays in cold shock and freezing injury. In: Johnson, L. A. and Rath, D.,
eds. Boar Semen Presemtion II. Berlin: Paul Parey Su. Publ.; 1991:95-
104.
Demott, R. P., Suarez, S. S. Hyperactivated sperm progress in the mouse
oviduct Biol Reprod 1992;46:779-785.
Dott, H. M. The effects of bovine seminal plasma on the impedance change
frequency and glycolysis of bovine epididymal spermatozoa. J Reprod
Ferfil 1974;38:147-156.
Dravland, J. E., Meizel, S. Stimulation of hamster sperm capaatation and
acrosome reaction in vitro by glucose and lactate and the inhibition by
glycolytic inhibitor alpha-chlorhydrin. Ga W e Res 1981;4:515-523.
37
Eddy, E. M. The spermatozoon. In: Knobil, E. and Neill, J. D., eds. The
Ph ysiology of Reproduction. New York: Raven Press; 1988:27-68.
Edes, 1-, Kranias, E. G. c ~ ~ + - A T P ~ s ~ s . Zn: Sperelakis, N., ed. CeIl Physiology.
London: Academic Press, Inc.; 1995;:738.
Ehrenwald, E., Fwte, R H., Parks, J. E. Bovine oviductal Buid components
and their potential role in sperm cholesterol efflux. Mol Reprod D m
l99O;î5: l95-2O4.
Farooqui, A. A. Biochemistry of sperm capacitation. Int J Biochem
1983; l5:46~-4%8.
Fayrer-Hosken, R A., Caudle, A. B., Shur, B. D. Galactosyltransferase activity
is restxicted to the plasma membranes of equine and bovine spenn. Mol
Reprod Dm 1991;28:7478.
Fleming, A. D., Yanagimachi, R Effects of various lipids on the acrosome
reaction and fertilizing capacity of guinea pig spermatozoa with speual
reference to the possible involvement of lysophospholipids in the
acrosome reaction. Gamet e Res 198l;4:253-273.
Fleming, A. D., Yanagimachi, R Fertile life of acrosomereacted guinea pig
spermatozoa. J E x p Zoo2 l982;Z?O:IW-llS.
Flemming, A. D., Yanagimachi, R Evidence suggesting the importance of
fatty acids and fa* moieties of sperm membrane phospholipids in the
38
acrosome readion of guinea pig çpermatoma. J Exp Zool 19&2;229:485-
489.
Flonnan, H. M., Wasçarman, P. M. O-linked oligosaccharides of mouse egg
ïP3 account for its sperm receptor aaivity. Cell 1985;41:313-324.
Florman, H. M., First, N. L. Regdation of aaosomal exocytosis IL The zona
pehcida-induced acrosome reaction of bovine spermatozoa is
controlled by extrinsic positive regulatory elements. Dev Biol
1 988; l28:&i-473.
Florman, K M., Tombes, R. M., First, N. L., Babcock, D. F. An adhesion-
associateci agonist from the zona pelluâda activates G protein-promoted
elevationr of intemal Ca2+ and pH that mediate mammalian sperm
acrosomal exocytosis. Dm Biol 1989;135:133-146.
Flonnan, H. M., Babcock, D. F. Progress toward understanding the molecular
basis of capacitation. In: Wassarman, P. M., ed. Elements of Mammalian
Fertilizztion: Basic Concepts. Boca Raton, FL: CRC Press; 1991:105-132.
Florman, H. M., Conon, M. E., Kim, T. D. H., Babcock, D. F. Activation of
voltage-dependent calcium charnels of mammalian sperm is required
for zona pehada-induced aaosomal exocytosis. Dw Biol 1992;152:304-
314.
Florman, H. M. Çequential focal and global elevations of sperm intracdlular
Ca2+ are initiated by the zona pducida during acrosomal exocytosis. D m
Foote, R. H., Parks, J. E. Factors affecting presemation and fertility of buli
sperm: a brief review. Reprod Fertil D m 1993;5:665-673.
Fournier-Delpech, S., Holland, M. K., Skudlarek, M. D., Rankin, T. L.,
Orgebin-Crist, M. C., Courot, M. A ram epididymal secretory protein
shares cornmon antigenic determinants with rat epididymal proteins
and human seminal plasma proteins. Reprod Nutr Deaelop
l988;B: l28HZ99.
Fournier-Delpech, S., Thibault, C. Acquisition de la fécondance du
spermatozoïde: maturation épididymaire, glandes annexes et
capautation. Dans: Thibault, C. et Levasseur, M.-C., éds. La Reproduction
chez les Marnmiféreç et l'Homme. Paris: Édition Marketing; 1991:251-
Fraser, L. R. Motility patterns in mouse spermatozoa before and after
capacitation. J E x p Zoo1 1977;202:439-444.
Fraser, L. R, Quinn, P. J. A glycolytic product is obligatory for initiation of the
sperm acrosome reaction and whiplash motility required for
fertihation in the mouse. J Reprod Fertil 1981;61:25-35.
Fraser, L. R. Minimum and maximum extracelhdar Ca2+ requirements
during mouse sperm capacitation and fertilization in vitro. J Reprud
Fertil 1987;81:77-89.
40
Fraser, L. R. Sperm capacitation and its modulation. In: Bavister, B. D.,
C u m i n s , J. and Roldan, E. R. S., eds. Fertilization in Mammals.
Nonvell, Massachusetts: Serono Syrnposia, USA; 1990: 141-1 53.
Fraser, L. R., Monks, N. J. Cyclic nucleotides and mammalian spem
capacitation. J Reprud Fertil 1990;42(Suppl.):9-21.
Fraser, L. R, McDermott, C. A. Ca*+-related changes i n the mouse sperm
capacitation state: a possible role for C a l + - ~ ~ ~ a s e . Reprod Fut
1992,96:363-377.
Fraser, L. R, Abeydeera, L. R, Niwa, K. ~a*+-regulating mechanisrns that
modulate bu11 sperm capacitation and acrosomal exocytosis as
deterrnined by chlortetracydine analysis. Mol Reprod D m 1995;40:233-
241.
Fritz, H., Schiessler, H., Sdileuning, W., Fink, E., Tschesche, H., Lengel, O.
Boar and human acrosin and acrosin inhibitors: isolation and
biochemical characterizaiion. Biol R q o d 1973;9:64(abstract).
Fuller, S. J., Wood, M. J., Whittingham, D. G., Watson, P. F. Cooling mouse
spenn to 4OC does not affect fertilization or embryonic development. 1
Reprod Ferf il 1994;14:8(Abs tract Series).
Galantine-Homer, H. L., Visconti, P. E., Kopf, G. S. Reguiation of protein
tyrosine phosphorylation during bovine spem capacitation by a cy&c
adenosine 3',5'-monophosphate-dependent pathway. Biol Reprod
Ghyselinck, N. B., Jïimenez, C., Courty, Y., Dufaure, J. P. Androgen-dependent
messenger RNA(s) related to secretory proteins in the mouse
epididymis. J Reprod Fertil 1989;85:631-639.
Girod, C., Czyba, J. C. Biologie de la Reproduction: 1 . Appareils Génitaux.
Villeurbanne: Simep; 19773356~.
Go, K. J., Wolf, D. P. Albumin-mediated changes in sperm sterol content
during capacitation. Biol Reprod 1985;32:145-153.
Gordon, 1. Laboratory Producf ion of Cat tle Embryos.. Cambridge: CAB INTERNATIONAL; 1994: 640 pp.
Gürtley, H., Ketz, H. A., Kolb, E., Schroder, L., Seidel, H. Physiologie des
Animaux Domestiques. Paris: Vigot Frères Éditeurs; 19753974~.
Hammerstedt, R. H., Hay, S. R., Amam, R. P. Modification of ram sperm
membranes during epididymal transit. Biol Reprod 1982;27:745-754.
Hammerstedt, R. H., Graham, J. K., Nolan, J. P. Cryopreservation of
mammalian sperm: what we ask them to survive. J Androl 1990;11:73-
88.
Handrow, R. R., Lenz, R. W., Ax, R. L. Structural cornparisons among
glycosaminoglycans to prornote an acrosome reaction in bovine
spermatozoa. Biochem Biophys Res Comm 1982;107:1326-1332.
42
Handrow, R R., First, N. L., Pamsh, J. J. Calaum requirement and increased
assoaation with bovine sperm during capaatation by heparin. J Exp zml
1989;252:174-182,
Harrison, R. A. P. Hyaluronidase in ram semen. Biochem J 1988;252:865-874.
Harrison, R. A. P. Capacitation mechanisms, and the role of capacitation as
seen in eutherian mammals. Reprod Fertil Den 1996;8:581-594.
Hinsch, K. D., Hinsch, E., Aumuller, G., Tychowiedca, I., Schultz, G., SdUIl,
W. B. Imrnunogilical identification of G protein alpha- and beta-
subunits in tail membranes of bovine spermatozoa. Biol Reprod
1992;47:337-346.
Holt, W. V., North, R. D. Effects of temperature and restoration of osmotic
equilibrium during thawing on the induction of plasma membrane
damage in cryoprese~ed ram spem-tatowa. Biol Reprod 1994;51:414424.
Hunter, R. H. F. Spem transport and reservoirs in the pig oviduct in
relation to the time of ovulation. J Repmd Fertil 1981;63:109-117.
Hunter, R H. F., Nichol, R Transport of spermatozoa in the sheep oviduct:
preovulatory sequestrating of celis in the cauda isthmus. J Exp Zool
l983;228:IZl-l28.
Hunter, R H. F. Transport of gametes, seleciion of spermatozoa and gamete
lifespans in the female tract. In: The Fallopian Tubes: Their Role in
Fert ilif y and Infert ilit y. Berlin: Springer-Verlag; 1988:53-l08.
Ijaz, A., Fortier, M. A., Sirard, M. A. Adenylate cyclase activity increases
concomitantly with the onset of capacitation in heparin-treated bovine
spermatozoa. Reprod Nutr D m 1996;1996:221-232.
Kiliian, G. J., Chapman, D. A., Rogowski, L. A. Fertility-associateci proteins in
Holstein bull seminal plasma. Bi02 Reprod 1993;49:1202-1207.
Kopf, G. S., Gerton, G. L. The mammalian sperm acrosome and the acrosome
reaction. In: Wassarman, P. M., ed. Elements of Marnrnalian
Fert ilizn tion: Basic Concepts. Boca Raton, Fi,: CRC Press; l99l;l: 153-203.
Langlais, J., Roberts, K. D. A molecular membrane mode1 of sperm
capacitation and the acrosome reaction of mammalian spermatozoa.
Garneie Res l985;lZ: 183-224.
Leclerc, P., de Lamirande, E., Gagnon, C. Cyclic adenosine
3',5'monophosphate-dependent regulation of protein tyrosine
phosphorylation in relation to human sperm capacitation and motility.
Biol Reprod l996;55:684692.
Lee, C. N., Ax, R L. Concentrations and composition of glycosaminoglycans
in the fernale bovine reproductive tract J Daity Sci 1984;67:2006-2CW.
Lee, C. N., Clayton, M. K., Bushmeyer, S. M., First, N. L., Ax, R. L.
Glycosaminoglycans in ewe reproductive tracts and their influence on
44
acrosome reactions in bovine spermatozoa in vifro. J Anim Sci
1986;63:861-867-
Lee, M. A., Storey, B. T. Bicarbonate is essential for fertilization of mouse
eggs: mouse spem require it to undergo acrosome reaction. Biol Reprod
l986;34:349-356.
Lee, M. A., Storey, B. T. Endpoint of first stage of zona pellucida-induced
acrosome reaction in m o w spennatozoa characterized by acrosomai H+
and ~ a 2 + permeability: population and single ce11 kinetics. Gizmete Res
1989;24:303-326-
Lee, M. A., Check, J. H., Kopf, G. S. A guanine nudeotide-binding regdatory
protein in human spem mediates acrosornal exocytosis induced by the
human zona pellucida. Mol Reprod D m 1992;31:78-86.
Lee, S. L., Wei, Y. H. The involvement of extracellular proteinases and
proteinase inhibitors in mamrnalian fertilization. Biotechnol Appl
Biochem 1994;19:31-40.
Leibfried-Rutledge, M. L., Criber, E. S., P r i s , J. J . First, N. L. In vitro
maturation and fertilization of bovine oocytes. Ther iogenology
l989;3l: 61 -74.
Lin, Y., Kan, W. K. Regionalization and redistribution of membrane
phosphoiipids and cholesterol in mouse spermatozoa during in vitro
capacitation. Biol Reprod l996;55: 1133-1 146.
45
Magargee, S. F., Kunze, E., Hammerstedt, R H. Changes in lectin-binding
features of ram sperm surfaces associated with epididymal maturation
and ejaculation. B id Reprod 1988;38:667-685.
Manjunath, P., Sairam, M. R. Purification and biochemical characteriza tion
of three major acidic proteins (BSP-Al, BSP-A2 and BSP-A3) from
bovine seminal plasma. Biochem 1 1987;241:685-692.
Manjunath, P., Chandonnet, L., Leblond, E., Desnoyers, L. The major
proteins of bovine seminal vesicles bind to spermatozoa. Biol Reprod
1994;50:27-37.
Mann, T. The Biochemistry of Semen and the Male Reproductive Tract.
New York: Wüey; 1964493~~.
Mann, T., Lutwak-Mann, C. Male Reproductive Funciion and S m e n . New
York: Springer-VerIag; 1981.
Marieb, E . N. Anatomie et Physiologie Humaines. Saint-Laurent, Québec:
Éditions du Renouveau Pédagogique Inc.; 1993:1014p.
Marks, J. L., Ax, R L. Relationship of non return rates of dairy bulls to
binding affinity of heparin to sperm. 1 Dairy Scï 1985;68:207&2082
Mazu., P. Freezing of living celIs: mechanisms and implications. Amer
Physi~Z l984;24T 125-142.
46
McLaughlin, J. D., Shur, B. D. Binding of caput epididymal mouse sperm to
the zona pellucida. D m Biol 1987; lZ4:557-561-
Medeiros, C. M. O., Parrish, J. J. Changes in lectin binding to bovine sperm
during heparin-induced capaatation. Mol Reprod D m 1996;44:525-532.
Ménézo, Y., Renard, J. P. La vie de l'oeuf avant l'implantation. Dans:
Thibault, C. et Levasseur, M.-C., éds. La Reproduction chez les
Mamrni@res et l'Homme. Paris: Édition Marketing; 1991:339-357.
Miller, D. J., Ax, R L. Carbohydrates and fertüization in animais. Mol Reprod
Miller, D. J-, Winer, M. A., kw, R L. Heparin-binding proteins from semina
plasma bind to bovine spennatozoa and modulate capacitation by
heparin. B iol Reprod 1990;42:899-915.
Miller, D. J., Macek, M. B., Shur, B. D. Complementarity between sperm
surface &1,4-gala~osyl~ansferase and egg-coat ZP3 mediates sperm-egg
binding. Nafure 1992;357:589-593.
Muphy, S. JO, Yanagirnadii, R The pH dependence of motility and acrosome
reaction of guinea pig spermatozoa. Gamete Res 19&1;10:1-8.
Nagai, T., Niwa, K., Iritani, A. Effect of sperm concentration during
preincubation in a defined medium on fertilization in vitro of pig
follicular oocytes. J Reprod Ferfil 1984;70:271-275.
47
OldsClarke, P. Variation in the quality of spenn motility and its relationship
to capacitation. In: Bavister, B. D., Cummins, J. and Roldan, E. R S., eds.
Fertilization in Mammnls. Norwell, Massachusetts: Serono Symposia,
USA; 1990:91-99.
Olson, G. E., Danzo, B. J. Surface changes in rat spermatozoa during
epididymal transit. Bi01 Reprod 1981;24:431-443.
Orgebin-Crist, M. C., Danzo, B. J., Davies, J. Endocrine control of the
development and maintenance of sperm Çertilizing ability in the
epididymis. In: Hamilton, D. W. and Greep, R O., eds. Hanbook of
Physiology. Endocrinology (Section 7): Chapiter 15. Washington, DC:
American Physiology Sociew 1975:319-338.
Osman, R. A., Andria, M. L., Jones, A. D., Meizel, S. Steroid induced
exocytosis: the human acrosome reaction. Biochem Biophys Res Comm
1989;160:82&833.
Overstreet, J. W., Cooper, G. W., Katz, D. F. Sperm transport in the
reproductive tract of the female rabbit. II. The sustained phase of
transport. %id Reptod 1978;19:115-132.
Pace, M. M., Graham, E. F. Components in egg yolk which proted bovine
spermatozoa during freezing. J A n h Sci l974;39:ll4Wll49.
Pace, M. M., Sullivan, J. J., Elliott, F. I., Graham, E. F., Coulter, G. H. Effects of
thawing temperature, number of spennatowa and spermatozoal quality
48
on fertility of bovine spermatozoa padcaged in -5-ml french straws. J
Anim Sci l981;53:693-7Ol.
Papahadjopoulos, D., Hui, S., Vail, W. J., Poste, G. Studies on membrane
fusion. 1. Interactions of pure phospholipid membranes and the effect of
myristic acid, lysolecithin, proteins and DMSO. Biochem Biophys Acta
1976;448:245-.
Parisel, C. C., Weinman, J. S., Escaig, F. T., Guyot, M. Y., Iftode, F. C.,
Weinmam, S. J., Damaille, J. G. Analytical subcellular distribution of
CAMP-dependent protein kinase activity in bull spermatozoa. Gamete
Res 1984;10:433-44$1.
Parks, J. E., Hammerstedt, R. H. Developmental changes occurring in the
lipids of ram epididymal spermatozoa plasma membrane. Biol Reprod
1985;32:653-668.
Parks, J. E., Ehrenwald, E. Cholesterol efflux from mammalian sperm and its
potential role in capacitation. In: Bavister, B. D., Cummins, J. and
Roldan, E. R S., eds. Fertilization in Mammals. Norwell, Massachusetts:
Serono Symposia, USA; 1990:155-167.
Parks, J. E., Graham, J. K. Effects of cryopreservation procedures on s p m
membranes. Theriogenology 1992;38:209-222.
Panish, J. J., Susko-Parrish, J. L., First, N. L. Effect of heparin and chondroitin
sulfate on the acrosome reaction and fertility of bovine sperm in vitro.
Parrish, J. J., Susko-Parrish, J. L., Leibfried-Rutledge, M. L., Critser, E. S.,
Eyestone, W. H., First, N. L. Bovine in vitro fertilization with frozen-
thawed semen. Theriogenology 1986;25:591-600.
Parrish, J. J., Susko-Parrish, J., Winer, M. A., First, N. L. Capacitation of
bovine sperm by heparin. BioZ Reprod l988;38:ll7l-ll8O.
Parrish, J. J., Susko-Parrish, J. L., First, N. L. Capaatation of bovine s p m by
heparin: inhibitory effect of glucose and role of intracellular pH. Bi01
Reprod l989;4l:683-699.
Parrish, J. J. Application of in vitro fertilization to domestic animals. In:
Wassarman, P. M., ed. Elemenfs of Mammalian Fertiliza tion: Pra tical
Applications. Boca Raton, FL: CRC Press; 1991:111-132.
P-sh, J. J., Vredenburgh, W. L., Lavin, C. A. Increases in bovine sperm
intracellular calcium and pH during capacitation. Bi01 Reprod 1993;48
(suppl.l):1ffi(Abstract).
Pamsh, J. J., Susko-Parrish, J. L., Uguz, C., First, N. L. Differences in the role
of q d i c adenosine 3',5'-monophosphate during capacitaüon of bovine
spem by heparin or oviduct fluid. Biol Reprod 1994;51:1099-1108-
Parry, R V., Barker, P. J., Jones, R Characterizaiion of low Mr zona pduada
binding proteins from boar spermatozoa and seminal plasma. Mol
Perreault, S. D. Regdation of sperm nuclear reactivation during fertilization.
In: Bavister, B. D., Cummins, J. and Roldan, E. R. S., eds. Fertiliurfion in
Mammals. Norwell, Massachusetts: Serono Symposia, USA; 1990:285-
296-
Phelps, B. M., Primakoff, P., Koppd, D. E., Low, M. G., Myks, D. G. Restricted
lateral diffusion of PH-20, a PI-anchored sperm membrane protein.
Science l988;ZM:l78O-l782.
Pickett, B. W., Berndtson, W. E. Preservation of bovine spermatozoa by
freezing in straws: a review. J Dairy Sn' 1974;57:lZ87-l3Ol.
Primakoff, P., Hyatt, H., Myles, D. G. A role for the migrating sperm surface
antigen PH-20 in guinea pig sperm binding to the egg zona pelluuda. J
Ce21 Bi01 1985;101:2239-2244.
Robertson, L., Bailey, J. L., Buhr, M. M. Effects of cold shock and
phosphoiipase A2 on intact boar spermatozoa and sperm head plasma
membranes. Mol Reprod D m 2990;26:143-149.
Rodger, J. C. Seminal plasma, an unnecessary evil? Ther iogen ology
l975;3:237-247.
Roldan, E. R S., Fleming, A. D. 1s Ca2+-~TPase involved in Ca2+ regulation
during capacitation and the acrosome reaction of guinea-pig
spermatozoa? 1 Reprod Fertil 1989;85:297-308.
Roldan, E. R S., Harrison, R. A. P. Molecular mechanisms leading to
exocytosis during the sperm acrosome reaction. In: Bavister, B. D.,
Cummins, J. and Roldan, E. R S., eds. Fertilization in Mammnls.
Norwell, Massachusetts: Serono Symposia, USA; 1990:179-196.
Rufo, G. A., Jr., Singh, J. P., Babcock, D. F., Lardy, H. A. Purification and
characterization of a calcium transport inhibitor protein from bovine
seminai plasma. J Bi01 Chem 1982;257:4627-4632.
Sacco, A. G., Yvrewicz, E. C., Subramanian, M. G., Matzat, P. D. Porcine zona
pelluada: association of sperm receptor activity with the a-glycoprotein
component of the Mr= 55 000 family. Bi01 Reprod 1989;41:523-532.
Saling, P. M., Storey, B. T. Mouse gamete interactions during fermation in
v i t ro : chlortetracydine as a fluorescent probe for the mouse sperm
acrosome reaction. J Ce11 Bi01 1979;83:544-555.
Saling, P. M. Development of the ability to bind to zonae pelIucidae during
epididymal maturation: reversible immobilization of mouse
spermatozoa by lanthanum. Bi01 Replod 1982;26:429-436.
Saling, P. M. How the egg regulates sperm function during gamete
interaction: facts and fantasies. Bi01 R e p d 1991;44:246-251.
San Agustin, J. T., Hughes, P., Lardy, H. A. Properties and fuction of caltnn,,
52
the calcium-transport inhibitor of bu11 seminal plasma. FASEB
1987;1:60-66.
Sanz, L., Calvete, J. J., Mann, H., Gabius, H. J., Topfer-Perterçen, E. Isolation
and biochemical characterization of heparin-binding proteins from boar
seminal plasma: a dual role for spermadhesins in fertilization. M d
Reprod D m 1993;35:37-43.
Setcheu, B. P. Male reproductive organs and semen. In: Cupps, P. T., ed.
Reproduction in Domestic Animals. San Diego: Academic Press, Inc.;
1991 221 -249.
Shalgi, R., Kraicer, P. F. Timing of sperm transport, spenn penetration and
deavage in the rat. Exp Zoo1 1978;204:353-360.
Shur, B. D., Hall, N. G. Sperm surface galactosyltransferase aaivities during
in viho capacitation. J Cell Bi01 1982;95:567-573.
Shur, B. D., Hall, N. G. A role for m o w sperm surface gdadosyltransferase
in sperm binding to the egg zona pellucida. J Ce22 Bi01 1982;95:574-579.
Shur, B. D., Neely, C. A. Plasma membrane asdation, purification, and
partial charaderkation of mouse sperm b1,4-galabosyltransferase. J Biol
Chem l988;263: l7706-l7714.
Singer, S. J., Nicholson, G. L. The fluid mosaic mode1 of the structure of ce11
membranes. Science 1972;175:720-731.
53
Singer, S. L., Lambert, H., Cross, N. L., Overstreet, J. W. Alteration of the
human sperm surface during in vitro capacitation assessed by lectin-
induced agglutination. Gamet e Res l985;12:29 1-299.
Sirard, M. A., King, W. A., Xu, K. P. La maturation des ovules de bovins.
M d Vét Que3ec 1988;18:181-185.
Smith, T. T., Koyanagi, F., Yanagimachi, R. Distribution and number of
spermatozoa in the oviduct of the golden hamster after natural mating
and artificial insemination. Biol Reprod 1987;37:225-234.
Smith, T. T., Yanagimadii, R Capacitation status of hamster spermatozoa in
the oviduct at various times after mating. Reprod Fertil 1989;86:255-261.
Smith, T. T., Yanagimachi, R The viability of hamster spermatozua stored in
the isthmus of the oviduct: the importance of sperm-epithelium contact
for spem survival. Bi01 Reprod 1990;42:450-457.
Spungin, B., Breitbart, H. Calcium mobilization and influx during sperm
exocytosis. J Ce11 Sn' 1996;109:1947-1955.
Storey, B. T. Spem capacitation and the acrosome reaction. Ann of the New
York Academy of Sci 1991;637:459-473.
Suarez, S. S., Katz, D. F., Overstreet, J. W. Movement characteristics and
acrosomal status of rabbit spermatozoa recovered at the site and time of
fertilization. Bi01 Reprod l983;29: 1277-1 287-
54
Suarez, S. S., Katz, D. F., Owen, D. H., Andrew, J. B., Powell, R. L. Evidence
for the function of h~eractivated motility in sperm. Bi01 Reprod
I99l;U:375-38l.
Suarez, S. S., Dai, X. Hyperactivation enhances mouse sperm capacity for
penetrating viscwlastic media. Bi01 Reprod 1991;46:686-691.
Suarez, S. S., Dai, X. Intracellular calcium reaches different levels of
elevation in hyperactivated and acrosome-reacted hamster sperm. Mol
Repr~d D m 1995;42:325-333.
Suzuki, F. Morphological aspects of s p e m maturation: modification of the
sperm plasma membrane during epididymal transport. In: Bavister, B.
D., Cummins, J. and Roldan, E. R S., eds. Fertilization in Marnrnals.
Norweii, Massachusetts: Serono Symposia, USA; 1990:65-75.
Suzuki, K., Ebihara, M., Nagai, T., Clarke, N. G . E., Harrison, R. A. P.
Importance of bicarbonate/C@ for fertilization of pig oocytes in vitro,
and synergism with caffeine. Reprod Fertil D m 1994;6:221-227.
Talbot, P., Chacon, R. Detection of modifications in the tail of capacitated
guinea pig sperm using lectins. J Exp Zoo2 1981;216:435-444.
Thérien, I., Bleau, G., Manjunath, P. Phosphatidylcholine-binding proteins
of bovine seminal plasma modulate capacitation of spermatozoa by
heparin. Bi01 Repf'od 1995;52:1372-1379.
55
Toyoda, Y., Naito, K. IVF in domestic animals. In: Bavister, B. D., Cummins,
J. and Roldan, E. R. S., eds. Fertilization in Marnmak. Norwell,
Massachusetts: Serono S ymposia, USA; 1990:335-347.
Topfer-Petersen, E., Calvete, J. J., Sanz, L., Sinowatz, F. Carbohydrate- and
heparin-binding proteins in mammalian fertilization. And rologia
1995a;27:303-324.
Uguz, C., Susko-Parrish, J. L., Parrish, J. J. Cyclic-adenosine monophosphate
is elevated during capacitation of bovine sperm by heparin or oviduct
fluid. Theriogenology 1992;37:311 (Abstract).
Ur&, U. A. Biochemistry and function of acrosin. in: Wassannan, P. M., ed.
Elemenfs of Mamrnalian Fertilization: Basic Concepts. Boca Raton, FI,:
CRC Press; 1991:233-248.
Utsumi, K., Katoh, H., Iritani, A. Developmental ability of bovine follicular
oocytes matured in culture and fertilized in vitro. Theriogen ology
l988;29:3ZO.
Ventura, W. P., Freund, M. Evidence for a new ciass of uterine stimulants in
rat semen and male accessory gland secretions. J Reprod Fertil
3 973;33:507-511.
Vernon, R. B., Muller, C. H., Herr, J. C., Feuchter, F. A., Eddy, E. M.
Epididymal secretion of a mouse sperm surface component recognized
by a monodonal antibody. Bi01 Reprod 1982;26:523-535.
56
Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, S.
Capacitation of mouse spermatozoa 1. Correlation between the
capaatation state and protein tyrosine phosphorylation. Development
l995a;l2l: ll29-llV.
Visconti, P. E., Moore, G. D., Bailey, J. L., Leclerc, P., Comors, S. A., Pan, D.,
Olds-Clarke, P., Kopf, S. Capacitation of mouse spermatozoa II. Protein
tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by CAMP-
dependent pathway. Deuelopmen t l995b;lîl:ll39-llSO.
Ward, C. R., Kopf, G. S. Molecular events mediating sperm activation. Deo
Biol 1993;158:9-34.
Watson, P. F. The roles of lipids and protein in the protection of ram
spermatozoa at 5OC by egg-yolk lipoprotein. Reprod Fertil 1981;62:483-
492.
Watson, P. F. Artificial insemination and the preservation of semen. In:
Lamming, G. E., ed. Marshall's Physiology of Reproduction:
Reproduction in the Male. New York: Churchill Livingstone; 1990:747-
$69.
Watson, P. F. Recent developments and concepts in the cryopreservation of
spermatozoa and the assessrnent of their post-thawing funaion. Reprod
Ferf il D m l9%;7:871-891.
Wildt, D. E. Potential applications of IVF technology for species
conservation. In: Bavister,
Fert ilization in Mammals.
USA; 1990:349-364.
57
B. D., Cummins, J. and Roldan, E. R S-, eds.
Norwell, Massachusetts: Serono Symposia,
Woolley, D. M., Richardson, D. W. Ultrastructural injury to human
spermatozoa after freezing and thawing. J Reprod Fertil 1978;53:389-394.
Working, P. K., Meizel, S. Correlation of increased intraacrosomal pH with
the hamster spem acrosome reaction J Exp Zool 1983;227:97-107.
YanagimadU, R The movement of golden hamster spermatozoa before and
after capatita tiort. Reprod Fertil 1970;23:193-1%.
Yanagimachi, R. Mechanisms of fertilization in marnmals. In: Mastroianni,
L. and Biggers, J. D., eds. Fertiliration and Embryonic Development in
vitro. New York: Plenum Publishing Corp.; I981:81-182.
Yanagimachi, R Mammalian fertilization. In: Knobü, E. and Neill, J. D., eds.
The Physiology of Reproduction. New York: Raven Press; 1988:135-185.
Yanagimachi, R. Capacitation and the acrosome reaction. In: Asch, R. H.,
Balmaceda, J. P. and rohnston, I., eds. Garnefe physiology. Norwell,
Massachusetts: Serono Symposia, USA; 1990:31-42.
Yanagimachi, R Mammalian fertilization. In: Knobil, E. and Neill, J. D., eds.
The Physiology of Reproduction. New York: Raven Press; 1994:189-317.
58
Zaneveld, L. J. D., Dragoje, B. M., Schumacher, G. F. B. Purification and
characterization of human sperm acrosomal protease and inhibitor. Bi01
Reprod 1972;7:101 (abstract).
CHAPITRE 2
PREMATURE CAPACITATION OF BOVINE SPERMATOZOA
IS INITIATED BY CRYOPRESERVATION
(Ce chapitre est publié sous la référence: Cormier, N., Sirard, M.A. and Bailey, J.L. Premature capacitation of bovine spermatozoa is initiated by ayopreçervation. J Androl 1997; 18: 461-468.)
2.1 Résumé
La faible motilité et les anomalies morphologiques de l'acrosome contribuent partiellement à expliquer la réduction du pouvoir fécondant des spermatozoïdes bovins cryopréservés. Afin de verifier lthypoth&se selon laquelle le processus de cryopréservation (dilution, refroidissement, congélation-décongélation) induit la capacitation des deux expériences ont &té r6alisées avec de la semence
spermatozoïdes bovins, diluée dans le diluant B
base de jaune d'oeuf-Tris-glycérol (JOTG). L'état capaate des spermatozoïdes a été déterminé avant et apres une incubation avec différentes concentrations d'héparine l'aide de la méthode de coloration la dilort6tracydine (CTC), ou apres une préexposition au JOTG en effectuant la fécondation in vitro (W) de complexes ovocyte-cumulus bovins (COC) en absence d'héparine. Immédiatement apres la récolte, les éjaculats ont kt6
divisés en 4 traitements dont le premier était dilué avec un milieu non capacitant, MNC (+ 03% de polyvinyle alcool; contrôle) et maintenu à 23OC pendant 4 heures. Le restant de la semence a été dilué avec le JOTG. Sur une période de 4 heures, le deuxieme traitement a été refroidi et maintenu 4OC
(JOTG-41, et le troisSrne a été maintenu à 23OC (JOTG-23). Le quatrième traitement a été refroidi ii 4'C sur une période de 4 heures, tel qu'exécuté par l'industrie, puis congelé et décongelé (cryoprésemés). Apr&s 4 heures de
préexposition au JOTG ou décongélation, tous les spermatozoïdes ont ét& lavés puis dilués soit dans un milieu capacitant (MC; +0,6% d'albumine sérique bovine) pour l'essai au CTC (n = 3), soit dans le MNC pour la FiV (n
= 9-11). Avant l'incubation sous des conditions favorisant la capacitation, le pourcentage de cellules affichant le patron B (spermatozoïdes capacités selon l'essai au CTC) était similaire pour tous les traitements de semence fraîche préexposée au JOTG. Immédiatement aprgs l'ajout d'héparine (0, 2 ou
IOpg/mL), trois fois plus de spermatozoïdes ayopréservés affichaient le patron B lorsque comparés A ceux préexposés au JOTG ( p <0,05). Après 3 et 6
heures d'incubation, aucune différence entre les traitements n'a été observée
dans le pourcentage de patron B. En absence d'héparine, les spermatozo'ides préexposés au JOTG ont fécondé 2,6 fois plus de COC que ceux du contrale ( p ~0,001) et 9,2 fois plus que ceux du traitement JOTG23 ( p ~0,0001). Aucune
différence n'a été observée entre les taux de fécondation des spermatozoïdes JOTG-4 et ceux cryopréservés. Les résultats de cette étude suggerent donc qu'une capacitation prématurée survient chez les spermatozoïdes bovins partiellement (dilues-refroidis) et completement ayopréservés.
Abstract
Poor motility and abnormal acrosomal morphology only partially explain the reduced fertility of cryopreserved bovine spermatozoa. To test
the hypothesis that ayopreservation procedures (dilution, cooling, freeze-
thaw) induce capaatation in bovine spermatozoa, two experiments were conducted using semen diluted in egg yolk-Tris-glycerol extender (EYTG). Capautation was determineci prior to and following incubation with various concentrations of heparin using the chlortetracycline (CTC) fluorescence assay or after pre-exposure to EYTG using in vitro fertilization (IVF) of bovine cumulus-oocyte complexes (COC) in the absence of heparin. Fresh
ejaculates were divided into four treatments and the first was diluted with non-capacitating medium, NCM (Sp-TALP + 0.3% PVA; control) then maintained at 23OC for 4 hours. The remaining semen was diluted with
EYTG; the second treatment was held at 4OC (EYTG-4) and the third at 23OC (EYTG23) for 4 hours. The fourth treatment was cooled to 4°C over 4 hours,
as per the normal industry protocol, cryopreserved and thawed (frozen- thawed). After the Chour maintenance periods or thawing, all treatments were resuspended either in capaatating medium (CM; SpTALP + 0.6% BSA) for the CTC expriment (n = 3), or in NCM for the IVF experiment (n = 9 to 11). Prior to incubation in conditions that support capacitation, the
percentage of celIs exhibi ting pattern B (capaatated according to the CTC assay) was similar for al1 treatments with fresh-extended spermatozoa. hmediately following the addition of heparin (0, 2 or 10 &ml), three times more frozen-thawed than fresh-extended spermatozoa exhibited pattem B ( p c 0.05). After 3 or 6 hours of incubation, however, the percentages of cells
displaying pattern B did not differ among treatments. In the absence of
heparin, spermatozoa pre-exposeci to E Y T G 4 fertilized 2.6 tirnes more COC
than did control c a s ( p < 0.001) and 9.2 times more than spermatozoa pre- erposed to EYTG but held at 23OC (EYTG-23; p < 0.0001). No differences were
observed among fertilization rates for fresh-extended (EYTG-4) and frozen-
thawed spermatozoa. This study provides evidence that premature capacitation occurs in partially (extended and cooled) and fully cryopresewed bovine spermatozoa.
2.3 Introduction
Before they are able to fertilize oocytes, mammalian spermatozoa
must undergo capacitation, an obligatory maturation process involving
membrane alterations which occurs in vivo during their transit in the fernale reproductive tract (Austin, 1951; Chang, 1951), and in vitro in defined medium (see Yanagirnadii, 1994 for review). In the bovine, h e p a h is considered to be a necessary agent for in vitro capautation of spermatozoa (Parrish et al., 1988; Miller and Ax, 1990). The molecular modifications of capacitation include a decrease in net negative charge, a removal of spermatozoal-bound factors from seminal plasma and/or epididymal secretions, an efflux of membrane cholesterol, a change in membrane permeability and an increased influx of calcium ions (Farooqui, 1983; Langlais and Roberts, 1985; Visconti et al., 1995a). Procedures used to cryopreserve semen (dilution, cooling, freeung and thawing) are well known to damage spermatozoal plasma membranes (Hammerstedt et al., 1990; de Leeuw et al., 1991; Parks and Graham, 1992). This damage indudes swelling and breakage (Pace et al., 19811, loss of membrane-selective permeability, changes in membrane fluidity (Buhr et al., 1989; Canvin and Buhr, 1989), leakage and aggregation of phospholipids and proteins, reduction of motility, enzyme activity and viability (Watson, 1981; Parrish et al., 19û6; Gordon, 1994).
After thawing, bovine spermatozoa demonstrate altered intracellular calcium (Gaz+) control capabilities (Bailey and Buhr, 1994) and porcine spermatozoa exhibit reduced phosphoiipase A2 (PLA2) activity (Dyck and Buhr, 1994). Since both Ca2+ and PLA2 play an important role during capacitation and the acrosome reaction (Langlais and Roberts, 1985; Florman et al., 1989; Florrnan and Babcock, 1991; Fraser and McDermott, 1992), any alteration of their regulation or structure by ayopreservation procedures may be related to the reduced fertility of frozen-thawed bull spermatozoa.
The bovine artificial insemination (AI) industry has long known that cryoprese~ation deaeases the efficiency of sernen fertility, and Shannon and Vishwanath (1995) recently demonstrated that compared to fresh ceiis, eight times more cryopreserved spermatozoa are required to achieve normal fertilization rates in vivo . This reduced fertïlizing ability is not fully explained by the lower viability, poorer motility or inaeased acrosomal abnomalities of thawed spermatozoa. However, Ijaz and Hunter (1989)
used the zona-free hamster oocyte penetration assay to demonstrate that capacitation of buil spermatozoa is induced following storage frorn 4 to 48 hours in a noncryoprotectant egg yolk extender containing TES and Tris. Exposure to the semen extender for ~4 hours prior to freezing is a routine
practice in most bovine AI centers. Since capacitation is known to destabilize spermatozoal plasma membranes (Langlais and Roberts, 1985; Florman and Babcock, 1991; Yanagimachi, 1994), it codd be that prematurely capacitated spermatozoa die before they are able to reach the site of fertilization in vin0 .
Therefore, the general hypothesis of this study was that commercial cryopreservation procedures predispose bovine spermatozoa to undergo premature capaatation, which may be responsible for a signifiant part of the compromised in vivo fertility of frozen-thawed spermatozoa. More speuficaliy, we suggest that exposure of fresh spermatozoa in the egg yok- Tris-glycerol extender (EYTG) used for semen cryopreservation and cwling to 4 O C for 4 hours promotes capacitation. Two methods were used to determine spematozoal capautation, the chlortetracycline (CTC) assay and in vitro fertilization (IVF). The CTC assay is based on the ability of the CTC molecule to indicate the localization of membrane Ca2+, which is presumably bound to proteins or glycoproteins (Saling and Storey, 1979). During capacitation, modifications in the distribution of CTC fluorescence are observed in response to head plasma membrane alterations (Saling and Storey, 1979; Ward and Storey, 1984). Developed originally to study capacitation in vitro in the mouse (Ward and Storey, 1984), the CTC assay has recently been used with other species, including human (DasGupta et al., 1993), bovine (Fraser et al., 1995), pig (Wang et al., 1995; Mattioli et al., 1996) and sheep ( P h z et al., 1996). In a second part of this study, IVF was performed to provide further evidence regarding the effects of dilution, dilution and cooling, or full ayopreservation on capacitation.
2.4 Materials and methods
2.4.1 Collection and preparation of spermatozoa
Fresh semen from Holstein bulls of proven fertility was collected using an artificial vagina and generously donated by the Centre d'Insémination ktificielle du Québec (C.I.A.Q., St-Hyacinthe, Quebec). Only ejaculates with spermatozoal motility > 60% and concentration > 3x108
spermatozoa/ml were used for subsequent manipulations.
Each ejaculate was divided into four samples corresponding to four different treatments. The first treatment was diluted to 15-20x10~
spermatozoa/ml in non-capacitating medium, NCM (modified Sp-TALP [Parrish et al., 19881 containing 0.3% polyvinyl alcohol, MW 30,000-70,000 d [PVA; Sigma, St-Louis, MO]) and maintained at 23OC for 4 hours (control 1. The remainder of the ejaculate was diluted to 15-20x106 spermatozoa/ml with EYTG at 35-37T (0.25 M Tris, 60 mM citric acid, 69 mM fructose, 7% v/v glycerol, an antibiotic cocktail containing Tylosin, Gentamich, Lincospectin,
25% v/v egg yolk). The second treatment was cmled to 4OC in a refrigerator as per industry procedures and stored at this temperatme (EYTG4 ), and the third was maintained at B°C (EYTG23 ) for 4 h o m . The fourth treatment
was diluted in EYTG, cooled to 4OC over 4 hours, then frozen and stored as
per normal industry procedures (frozen-fhawed . The 4 hour pre-
incubation period was selected for al l treatments as the AI industry typically
stores the semen in the EYTG for 4 hours during cooling and prior to freezing. Treated fresh s e m e n was transported in insulated thermoses (23 or
4OC) to the university laboratory within 2 hours of colieccion; transport time was included in the pre-incubation period, thus the cooling rate of the E Y T G 4 semen in the refrigerated thermos was previously confirmed to be equivdent to the AI Center refrigeration units. Frozen semen straws were
transported to the university laboratory in portable liquid nitrogen tanks.
After 2-4 weeks of storage at -196OC, ayopreçerved spermatozoa were thawed
by plunging straws of semen in a water bath (3S°C) for 1 minute. Following
either the initial 4-hour incubation period or thawing, dl treatments were washed twice in NCM by centrifugation (375 x gr 10 minutes, room
temperature). The final spermatozoal pellet was resuspended in either capacitating medium, CM (SpTALP containing 1 mM pyruvate, 0.6% bovine
s e n i m albumin [BSA, fatty acid free, fraction V; Sigma] and either O, 2, 10 or 15 pg/ml heparin) for capacitation experiments (concentration was then adjusted to 50x106 spermatozoa/ml) or NCM for in vitro fertikation (M?) experiments (concentration was then adjusted to 25x106 spermatozoa/rnl). Unless specified, al1 subsequent incubations for both experirnents were carried out ai 3g°C, the intemal body temperature of the bovine, and in 5% CO2 in air at 100% humidity (Gordon, 1994).
2.4.2 Experiment 1: In vitro capacitation as detected by
chlortetracydine
2.4.21 Capautation
Three ejaculates from different bulls were used in this experiment (n = 3). Aliquots of the spermatozoal suspensions in CM were treated with various concentrations of heparin (O, 2, 10 or 15 &ml; Sigma), which is necessary for capacitation in vitro in the bovine, and incubated for 6 hours (Parrish et al., 1988). At 0, 3 and 6 hours, spermatozoa were evaluated for
pattern B staining, which indicates capacitation according to the CTC fluorescence assay (Ward and Storey, 1984; Fraser et al., 1995). Using modified eosin-nigrosin staining, the number of dead spermatozoa was also established (Barth and Oko, 1989).
2.4.22 CTC Assay
A modification of the technique desaibed by Ward and Storey (1984) was used. The CTC stock solution contained 750 pM (final concentration) CTC-HC1 (Sigma), 130 mM NaCl, 5 mM DL-cysteine and 20 m M Tris aud (pH 7.81, and was prepared daily then wrapped in foi1 to protect from light and maintained at lO0C before using. Ten microliters of spermatozoal
suspension were mked with an equal volume of CTC stock solution on a
clean slide at room temperature. After a few seconds, 0.8 pl of 12.5% (w/v)
paraformaldehyde in 20 mM Tris-HC1 (pH 7.4) was added as a fixative. Finally, a &op of 0.22 M 1, Cdiaza-bicydo (22.2) octane (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) in glycerol was mixed to retard the fading of CTC fluorescence. The samples (two per çlide) were covered with coverslips and stored in the dark at 10°C. For evaluation of the CTC patterns, the samples were observed within 24 hours under a Nikon microscope equipped with
phase contrast and epifluorescence optics; cells were then observed under blue-violet illumination (excitation at 400-440 n m and ernission at 470 nm). At least 200 spermatozoa per slide were dassified according to one of three CTC staining patterns as desaibed by Fraser et al. (1995): uniform bright fluorescence over the whole head (characteristic of pre-capacitated ceus,
pattern F), fluorescence-free band in the postaaosomal region (capacitated cells, pattern B) and dull fluorescence over the whole head except for a thin, bright punctate band of fluorescence dong the equatorial segment (acrosome reacted cells, pattern AR). Preliminary experiments (data not shown) with spermatozoa double stained with CTC and a viability indicator, Hoedist 2495
(Sigma; Fraser et al., 1995) demonshated that the CTC pattern B can appear in both dead and live cells. It was diffidt to discern the CTC patterns on these double-stained spermatozoa, however, so viability staining had to be performed separately h m the CTC assay.
2.4.2.3 Eosin-nigrosin staining
Eosin-nigrosin stain containhg 0.5% (w/v) sodium citrate was used to determine mortality of spennatozoa over time (Hancock, 1951; Barth and Oko, 1989). Five microliters of spermatozoal suspension were mixed with 10 pl modified eosin-nigrosin solution and 10 pl of this mixture was smeared ont0 a dean slide at room temperature. After drying, the samples were covered with Permount S-15 (Fisher, Montreal) and mounted under a coverslip. Two hundred cells were counted per slide under light microscopy (400~) and the percentage of dead spermatozoa (pink cells) was evaluated.
24.3 Experiment 2: Assessrnent of IVF
Three ejaculates, different from those in experiment 1, from different bulls were used in this experiment (n = 3). Where appropriate, additional replicates were performed using spermatozoa from a mixture of semen from five pooled ejacuiates that had been frozen for approximately one year. Analysis of variance (General Linear Models [GLM] procedure; SAS, 1990) showed no differences among fertilization rates using frozen-thawed semen from the individual bulls or the mixture (p > 0.05), therefore, these data were combined (n = 9 to II).
2.4.3.1 Collection, maturation and fertilization of oocytes
Bovine slaughterhouse ovaries were coiiected and transported to the laboratory within 2-3 hours at 35°C in 0.9% NaCl containing 10,000 W/ml penidlin, 10 mg/ml streptomycin and 25 pg/ml amphoierian B (Sigma). Cumulus-oocyte complexes (COC) were aspirated from 1-5 mm follides with an l&gauge needle, pooled and selected as described previously by Leibfried and First (1979). The COC were washed three times in Hepes-buffered Tyrode's medium (TL.; Bavister et al., 1983) supplemented with 10% heat- treated fetal calf serum (FCS; Flow Laboratorieç, McLean, VA), 0.2 mM pynivate (Sigma) and 50 pg/ml gentamicin (Sigma). In vitro maturation was conducted as described by Chian and Sirard (1995). Following a 22-24 hour maturation period, the COC were used for IVE Essentially the same technique was employed as describeci by Blondin and Sirard (19951, however, to avoid seleding a subpopulation of spermatozoa and to better represent in vivo AI, no swim-up procedure was carried out after washing. IVF was
performed ai 3g°C using 1x106 washed spermatou>a/ml(2 pl of spermatozoal suspension) to each droplet (50 000 spermatozoa per five bovine COC) for 6 hours in fertilization medium (TALP containing 20 mM pyruvate, 1 mM hypotaurine), 2 mM penicülamine, 250 @I epinephrine and 0.6% BSA) with or without heparin (2 pg/ml). In the absence of heparin, the n u b e r of fertilized COC should be representative of spenn which are dready capacitated, since heparin induces this process in vitro @&h et ai., 1988).
After 6 hours, fertilized COC were passed repeatedly through a fine pipette to
remove excess spermatozoa, then incubated in FCSennched medium (TCM- 199 supplemented with 10% FCS, 0.2 mM pyruvate and 50 pg/ ml
gentamich) at 39°C (5% CO2 in air) and 100% humidity for 12 hours longer to permit complete pronudear formation.
Since a 6-hour incubation of spermatozoa and oocytes and the absence of hep& are sub-optimal conditions for maximal fertilization rates but are necessary to discern subtle differences in spermatozoal function among treatment groups, positive interna1 controls were performed. For each
replicate, an additional treatment was performed under conditions routinely used in Our laboratory (Blondin and Sirard, 1995). Cryopreserved spermatozoa were washed and incubated with COC in the presence of 2
~ g / m l heparin for 18 hours. The objective was to ensure that the oocytes
and other assay conditions were relatively constant from one replicate to the next Such controls are always performed during experiments in our laboratories.
2.4.3.2 Fixation and determination of fermation rate
At 18 hours after the initial insemination, oocytes were denuded from
cumulus cells by hyaluronidase (Sigma) treatment (34 units/ml in TLH) and vortexhg for 5-8 minutes. Cumulus cell-free oocytes were transferred onto
glass slides in a small droplet of TLH. A vaselineparaffin mixture (95) was used to keep the coverslip in contact with the oocytes without excessive pressure. The slides were immersed in fixative solution (ethanol: acetic acid; 3:l) for at least 48 hours at room temperature and stained with 1% orcein in 45% acetic acid. Under light microscopy (400x), fertilized oocytes were
identified by the presence of either an enlarged spermatozod head or 2 two pronudei in the ooplasm. Approximately 35-40 oocytes were examined per treatment per repkate.
2-4.3-3 Statis tical analyses
In experiment 1, results expressed in percentages (mea&SE) were modified using arcsin transformation to normalize data. Homogeneity of variances among treated samples was tested for the CTC assay and the eosin- nigrosin staining then GLM procedures (SAS, 1990) were used for d l analyses of variance. The models included: ejaculate, pre-exposure treatment, sampling time during in vitro capacitation, concentration of heparin and the interaction of those factors. Multiple cornparisons using the protected Fisher's Least Significant Difference test (LSD) were made to determine the significance of pre-exposure treatment for fresh-extended and frozen-thawed spermatozoa. In experiment 2, the significance of the fertilization rates among pre-exposure treatments for fresh-extended and frozen-thawed spermatozoa was determined using the chi-square test (Steel and Torrie, 1980).
2.5 Results
2.5.1 Determination of Capacitation by mC Coloration
The effect of a 4hour pre-exposure to either NCM at 23OC or EYTG (4OC, 23OC or liquid nitrogen storage) on the capacitation (according to CTC pattern B) of bovine spermatozoa is shown in Figure 1. At time O, pnor to incubation in conditions that support capacitation (3g°C, 5% C02, 100% humidity, in CM), there was no effect of EYTG on fresh spermatozoa as compared to controls in either the absence or presence of heparin (0, 2, 10 or 15 pg/ml; p > 0.05). Consequently, the percentage of celh exhibiting pattern B
(capaatated spermatozoa according to CTC assessment) was very similar for al1 pre-exposure treatments with fresh-extended spermatozoa. However, three times more frozen-thawed spermatozoa exhibited pattern B than fresh- extended spennatozoa immediateiy after thawing and washing with NCM ( p < 0.05). With 15 pg/ml of heparin, the percentage of capaatated spermatowa did not statistically differ among the fresh-extended and frozen-thawed spermatozoa ( p > 0.05), although the tendency was dearly towards more
70
frozen-thawed sperm displaying pattern B relative to the fresh ceus. No differences among treatments were obsemed concerning the percentage of pattern B spermatozoa after 3 and 6 hours of incubation at 39OC in CM with various concentrations of heparin (Figure 2; p > 0.05). Following this 6-hour incubation, despite the fact that more frozen-thawed cells (either with or without heparin) exhibiteci pattern B coloration, there were no significant differences among the percentages of patterns B observed between fresh- extended and frozen-thawed spennatoma @ > 0.05).
O NCM (Control)
EYTG-4
FIG. 1. The effed of preexposure for 4 hours to noncapacitating medium (NCM) at 23OC or egg yolk-Tris-glycerol extender (EYX;) ( 4 O C , 23OC or full cryopreservation) on the subsequent capaàtation of spermatozoa. After washing with NCM, heparin was added and the numben of spermatozoa exhibiting CTC pattern B was immediatly determined (n = 3). One or two hundred cells were counted per slide. Data are presented as the mean f SE%. (a ,Hf Different letters within heparin doses denote significant differences ( p < 0.05) according to the proteckci least sigxuficant difference (LSD) test With 15 pg/ml heparin, no significant differences were observed between preexposure treatments ( p > 0.05).
NCY (Control)
a EYTG-4
Heparin ( pgfml)
FIG. 2. The effect of preexposure for 4 hours to noncapacitating medium (NCM) or egg-yolk-Tris-glycerol extender (EYTG) (4OC, 23OC or full uyopreservation) on the capaatation of spermatozoa followed by A) 3 hours and B) 6 hours of incubation (3g°C, 5% CO2) in capacitating medium (CM). Heparin was added after washing spermatozoa in NCM and the number of pattern B were determineci after 3 hours and 6 hours of incubation at 3g°C (n =3). One or two hundred ceUs were counted per slide. Data are presented as
the mean f SE%. Spermatozoal preexposure treatment did nof affect the percentage of cells exhibiting pattern B, regardless of hepMn concentration accordhg to the protected Ieast signüicant difference (LSD) test ( p > 0.05).
During the 6 hours of incubation, al1 treatment groups underwent capaatation as indicated by a tirnedependent inaease in the percentages of pattern B fluorescence, regardless of heparin dose ( p < 0.05). Interestingly, the augmentation in the number of pattern B spermatozoa was greater from O to 3 hours for the fresh-extended (EYTG-23 and EYTG-4) treatments than compared to controls and frozen-thawed cells @ < 0.05). There was no inaease in the percentage of pattern B cells in the frozen-thawed group (p = 0.86) until 6 hours ( p c 0.05).
Spermatozoal mortality (i.e. number of dead spermatozoa) over time is displayed in Figure 3. Immediatdy after thawing, more cryopreserved spermatozoa were dead than was obsewed in any of the 0th- treatments with fresh spermatozoa ( p c 0.05; tirne O). During the 6-hour of incubation in CM, spermatozoa from dl four treatment groups underwent a time- related inaease in mortality ( p < 0.05). However, spematozoa pre-exposed to NCM at 23OC (controls) demonstrated a significantly higher rate of mortality than for fresh-extended (EYTG-4 or EYTG-23) or frozen-thawed
spermatozoa ( p < 0.05). Following the 6hour of incubation in CM, more fresh-extended spermatozoa were dive as compared to frozen-thawed spermatozoa and control ( p < 0.05; time 6).
2.5.3 Determination of Capacitation by IVF
The effect of preewposure for 4 hours to either NCM at 23OC or EYTG (4OC, 23OC or full cryopresenration) on the ability of the spermatozoa to subsequently fertilize bovine COC during a 6-hou incubation is shown in Table 1. In the absence of heparin, spermatozoa pre-exposed to EYTG-4 fertiiized 2.6 times more COC than did control cells (20.3% vs. 7.9% respectively; p < 0.01). Fhermore, these spermatozoa, which were treated by cooling to 4OC in EYTG prior to preparation for NF, fertüized 9.2 times
more COC than did the spermatozoa presxposed to the same extender but
maintained at 23OC (20.3% vs. 2.2% respectively; p < 0.0001). In the absence of heparin, no sipificant differences were observed among fertilization rates
73
for fresh-extended (EYTG-4) and frozen-thawed spermatozoa (20.3% vs. 29.5% respectively; p > 0.05). The indusion of 2 pg/ml heparin in the fertiiizing medium augmenteci the fertilizing capaaty of the frozen-thawed spermatozoa (58.396 vs. 29.5% respectively; p < 0.0001). The fertilization rates of spermatozoa pre-exposed to either NCM or EYTG at 23OC were similar (7.9% vs. 2.2% respectively; p > 0.001).
a NCM (Control)
EYTG-4
EYTG-23
Fiozen-t hawed
3
Time (h)
FIG. 3. Time-dependent changes in spermatozod mortality (meanisEl) after 4 hours of preexposure to either noncapaatating medium (NCM) at 23OC or egg yolk-Tris-glycerol extender (EYTG) (4OC, 23OC or full crypresenration) during the subsequent Chours incubation under conditions that support capacitation (n = 3). Heparin concentration had no effea on percentage of dead spermatozoa ( p > 0.05) and, so these data were pooled within each preexposure treatment. (a, b, c), Different letters within each
period of time denote significant differences according to the protected least significant difference (LSD) test ( p < 0.05). t Of the spermatozoa that were preexposed to NCM, more were dead at 6 hours than at tirne O according to the protected LSD test ( p < 0.05).
Table 1. Effects of preincubation of spermatozoa for 4 hours in either NCM at 23OC or EYTG (4*C, B°C) and freezing-thawing on their ability to fertilize bovine COC*
Preincubation Type of Presence of Fertiliza tion rate heparin
treatment sperm (2 pg/ml) ~ u m b e r t Percentage
EYïG23 fresh- O 3/114 2.2 C
extended
fresh- extended
EYTG-4 frozen- - 180/341 29.5 b thawed
EYTG4 frozen- + 142/236 58.3 a thawed
NCM, noncapacitating medium; EYTG, egg yolk-Tris-glycerol extender; COC, cumulus-oocyte complexes; EYTG23, at Z0C; EYTG4, at 4OC.
* Concentration was 1 x 106 sperm/ml in the insemination droplets and spermatozoa were coincubateci with COC for 6 hours at 3g°C (5% Cm.
Number of oocytes f e r W d / total number of oocytes.
abc Different superscripts within the column denote significant differences ( p c 0.001) according to the chi-square test.
The IVF with treated spermatozoa (Table 1) was performed under conditions that were intentionally sub-optimal for achieving high oocyte penetration in order to discem subtle differences in spermatozoal fertilizing
ability (Johnson et al., 1995). Relatively low fertilization rates were anticipateci, thus positive internai controls were performed for each replicate to confirm that the experimental conditions (oocyte quality, incubators, media, etc.) were appropriate and could support high fertilization rates. The positive intemal controls were co-incubated with COC in the presence of 2 pg/ml heparin for 18 hours, the rate of fertilization was consistently 2 91%, representing the maximal fertilization rates achievable in those conditions.
2.6 Discussion
2.6.1 More frozen-thawed than fresh spermatozoa exhibit CTC pattern B
According to the CTC data, freezing and thawing, rather than earlier steps in the cryopreservation procedure (such as cwling and storage in EYTG), provoke medianical alterations to the plasma membrane that induce partial or complete capacitation (Figure 1). In fa&, Parent and Sullivan have
recently found that the plasma membranes of frozen-thawed bu11 spermatozoa contain fewer proteins than fresh spermatozoa (Université Laval, unpublished data). The present results are supported by Pérez et al. (1996), who recently showed that frozen-thawed rarn spermatozoa capaatate faster than fresh spermatotoa in vitro as assesseci by the CTC assay.
Lee and Storey (1989) previously identified an intermediate CTC pattern just p i o r to the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Also, Pérez al al. (2996) identified two different fonns of CTC distribution in ram spermatozoa that are both correlated with capacitation. In b d spermatozoa, however, only one pattern (pattem B) is indicative of capaatation using the CTC assay. This Limitation could partially explain the ineffiaency of this assay, relative to NF (Table l), in detecting early evenh associatecl with capaatation in the bovine. Relative to LVF, the CTC pattem B appears not to detect earlier events during capaatation since no differences were evident between samples b a t were able to readily ferfihe COC (EYTG-4) compared to those which could not (control and EMG-23). Although ïVF indicates the
ability of sperm to capacitate and undergo later events associated with fertilization (acrosome reaction, zona penetration, fusion with oolemma), this procedure was better able to provide more subtle differences in the fertiiizing ability among the treatment groups.
In thk study, aithough spermatozoa from al1 treatrnents undenvent capacitation during incubation for 6 hours in CM, no dose reçponse to
heparin was observed as detected by the CTC assay for any treatment induding control. For the latter, it appears that the C h o u preexposure to
NCM at 23OC induced certain unknown spermatozoal modifications, which interfere with normal heparin-induced capacitation. This eqlanation is plausible because when spermatozoa are maintained for a shorter period of time (2 hours) in NCM at W°C before incubation under the same capaatating conditions, a dose-response to heparin was obtained (data not shown) as desclibed originally by Parrish et al. (1988). Since the 4hour pre-exposure was selected to mimic the protocol normally used when cryopreserving bull semen, such a long incubation may have a deleterious impact on subsequent spermatozoal physiology (Ijaz and Hunter, 1988).
2.6.2 Cooled or thawed spermatoma can f e d h COC in the absence of heparin
The resuits obtained using IVF (for only 6 hours rather than 18 hours and without heparin) also support the hypothesis that cryopreserved bovine spermatozoa are capacitated, or capacitate more easily, than fresh cells. Indeed, within 6 hours frozen-thawed spermatozoa are able to fertifize COC even in the absence of heparin, which is considered to be a necessary agent for in vitro capaàtation of bovine spermatozoa (Parrish et al., 1988; Miller and Ax, 1990). In addition, fresh spematozoa pre-exposed to EYTG-4 fertilized (without heparin) as many COC as did the cryopreserved spermatozoa (Table 1). In contrast with the data obtained using the CTC assay, these NF results suggest that cooling and storage in EYTG induce premature capacitation. Subtle alterations to the plasma membrane may ocw during this early step in the cryopreservation procedure and are
possibly not detectable by CTC fluorescence patterns. The dissoaation of surface components is only a part of the capaatation process, and other events involving the plasma membrane take place during capaatation, such as modifications of the phospholipid/steroi ratio (Langlais and Roberts, 1985). Thus the CTC assay performed here may not provide complete information about changes in plasma membrane fluidity, which may occur prior to the surface relocalization of Ca*+ during capacitation. Since fertilization in vifro implies that the spermatozoa successfully underwent capacitation (Yanagimachi, 1994), TVF remains the supenor physiological assay for determining whether the spermatozoa are capacitated or not.
2.6.3 Putative mechanisms of ayopreservation-induced capaatation
It has been suggested that intracellular Ca2+ increases during capaatation (Fraser, 1987; Handrow et al., 1989; Yanagimachi, 1994; Visconti et al., 1995a,b). Cryopreservation, however, changes the ability of spermatozoa to regulate interna1 Ca2+ (Robertson et al., 1990; Bailey and Buhr, 1994; Zhao and Buhr, 1995). Enhanced ~ a 2 + permeabiüty rnay be due to two related phenornena, phase transitions of membrane phospholipids and increased membrane fluidity, during cooling and capacitation, respectively (Buhr et al., 1989; Parks and Graham, 1992). This study demonstrates that cooling promoted capacitation as assessed by the IVF rate of EYTG-4 spermatowa (Table 1). It is possible that cooling causes membrane damage to specïfïc Ca2+-channels present in bull spermatozoa (Florman et al., 1992; Florman, 1994; Arnoult et al., 19%; O'Toole et al., 1996; Spungin and Breitbart, 1996). Should these channels remain open due to cryopreservation-induced phospholipid phase transitions or protein reorganization (de Leeuw et al., 1991), an influx of extracellular Ca2+ would occur. It is tempting to speculate that in light of the present results, the cryopreservation-related increase in intracellular Ca2+ (Bailey and Buhr, 1994) initiates the signaling pathways of capacitation (Parrish et al., 1994;
Visconti et al., 1995a,b).
These temperature-induced modifications of the plasma membrane may also affect the ability of spermatozoa to extrude Ca*+. Bovine
spermatozoa that were better able to regdate their intemal Ca2+ levels foIlowirtg cryopreservation demons trated higher fertility rates in oivo than spermatozoa that were less able to control intracellular Ca*+ (Bailey et al., 1994). Moreover, fr-g and thawing reduced the PL& activity of boar spermatozoa (Dyck and Buhr, 1994). A product of PLA2 hydrolysis, lyçophosphatidylçerine, stimulated the plasma membrane Ca2+-ATPase of guinea pig spermatozoa (Roldan and FIeming, 1989). Also, Fraser et al. (1995) showed that incubation of bull spermatozoa with quercetin, an inhibitor of Ca2+-ATPase, induced capacitation. Since the plasma membrane Ca2+- ATPase maintains low intracellular Ca2+ concentrations by pumping it out of the ce11 (Edes and Kranias, 1995), decreased PLA2 activity following cryopreservation could explain the reduced Ca2+-ATPase activity which then results in subsequent elevation of intracellular Ca2+ in frozen-thawed spermatozoa and the premature capaatation of these cells.
The EYTG extender, which is used in commercial semen cryopreservation procedures, effectively preserved the survival of fresh spermatozoa (Figure 3). Citrate, Tris and egg yolk components likely function as effective buffers (Hammerstedt et al., 1990). In addition, the low- density fipoprotein fraction of egg yolk, specifically the phospholipids, prevents the loss of membrane phospholipids, and/or modulates the detrimental effects of this loss, protecting membranes during cooling (Pace and Graham, 1974; Parks and Graham, 1992). Consequently, the membrane integrity of fresh-tended sperrnatozoa was prese~ed compareci to controls.
26.4 Implications of premature capaatation of ayopreserved sperma tozoa
In conclusion, this study provides evidence that premature capaatation occurs in partially (extended and cooled) or fully cryopreserved bovine spermatozoa. We suggest that capacitated spermatozoa are probably less able to reach the site of fertilization in oviduct than are uncapaatated
spermatozoa. We speculate that once capaatated, spermatozoa exhibit elevated metabolic rates, increased membrane fluidity and permeability, and if they do not achieve fertilization, they undergo spontaneous acrosome reabions, due to an uncontrolled influx of ~ a 2 + . Hence, the fertilizing life span of capaatated spermatozoa is limited. Considering that the fertility of ayopreserved semen in viw is poorer compared to freçh semen, premature capacitation may contribute to this reduced fertility. Further investigation concerning the mechanisrns of capacitation in relation to cryopreservation and the prevention of premature membrane modifications will hopefully lead to the improvement of the fertility of cryopreserved spermatozoa in many speaes.
We are very grateful to the Centre d'Insémination Articifielle du Québec for generously providing the semen and for technical assistance. The travel tune of A. Chamberland and S. Tardif is very much appreciated. We also thank G. Vandenberg, B. Bérubé, R. Sullivan for pre-reviewing this manuscript. This work was supported by gants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Agriculture and Agri-Food Canada and the Cattie Breeding Research Cound.
2.8 References
Arnodt, C., Zeng, Y., Flonnan, H. M. ZP3-dependent activation of sperm cation channels regulates acrosomal seaetion during mammalian fertilization. J Ce11 Biot l996;134:637-6&.
Austin, C. R Observations on the penetration of sperm into the mamrnalian egg. Aust J Sei Res 1951;&4:697-698.
Bailey, J. L., Buhr, M. M. Cryopreservation alters the ca2+ flux of bovine
80
spermatozoa. Gin J Anim Sei 1994;74:45-51.
Bailey, J. L., Robertson, L., Buhr, M. M. Relationships among in vivo fertility, compter-analysed motility and in vitro ca2+ flux in bovine spermatozoa. Can 1 Anim Scî 1994;74:53-58.
Barth, A. D., Oko, R. J . Abnormal Morphology of Bovine Sperrnafozon. Ames, Iowa: Iowa State University Press; 1989: 285 pp.
Bavister, B. D., Leibfried, M. L., Lieberman, G. Development of preimplantation embryos of the golden hamster in a defined culture
medium. Biol Reprod 1983;28:235-247.
Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental cornpetence in bovine oocytes. Mol Reprod D m 1995;41:54-62.
Buhr, M. M., Canvin, A. T., Bailey, J. L. Effects of semen preservation on boar spermatozoa head membranes. Gamefe Res l989;23:44l-449.
Canvin, A. T., Buhr, M. M. Effect of temperature on the fluidity of boar sperm membranes. J Reprod Ferf 1989;85:533-540.
Chang, M. C. Fertilizing capaaty of spematozoa deposited in the fallopian tubes. Nature 1951;16û:697-698.
Chian, R. C., Sirard, M. A. Fertilizing ability of bovine spermatozoa . codtured with ovidud epithelial cells. Biol Rep~od 1995;52:156-162.
DasGupta, S., Mills, C. L., Fraser, L. R. ca2+-related changes in the
capacitation state of human spermatozoa assessed by a chlortetracydine fluorescence assay. J Reprod Fert 1993;99:135-143.
de h u w , F. E., Colenbrander, B., Verkieij, A. J. The role membrane damage plays in cold shodc and freezing injury. In: Johnson, L. A., Rath, D., eds. Bonr Semen Preserwtion II. Berlin: Paul Parey Sci. Publ.; 1992: 95-104.
Dyck, M. K., Buhr, M. M. Phospholipase A2 activity in fresh and a y o p r e s e d spermatozoa from boars. C m J Anim Sci 1994;74:59-64.
Edes, I., Kraniaç, E. G. ca2+-~T'I?ases. In: Sperelakis, N., ed. C d Physiology. London: Academic Press Inc.; 1995: 156-165.
Farooqui, A. A. Biodiemistry of sperm capacïtation. J Biochem 1983;15:463- 468.
Fleming, A. Yanagimachi, R Effects of various lipids on the acrosome reaction and fertilizing capacity of guinea pig spermatozoa with special reference to the possible involvement of lysophospholipids in the acrosome reaction. Gmete Res 1981;4:253-273.
Florman, H. M., Tombes, R. M., First, N. L., Babcock, D. F. An adhesion- associated agonist from the zona pellucida activates G protein- promoted elevations of internd ca2+ and pH that mediate mammalian spenn acrosomal exocytosis. Dm Biol 1989;135:133-146.
Florman, H. M., B a b ~ d ~ , D. F. hogress toward understanding the molecdar bais of capaatation. In: Wassarman, P. M., ed. Elements of Marnmnlian Fertil uP fion: &sic Concepts. Boca Ratan, FL: CRC Press: 1991;105-132.
Florman, H. M., Corron, M. E., Kim, T. D. H., Babcock, D. F. Activation of voltagedependent calcium channels of mammalian spem is required for zona pellucida-induced acrosomal exocytosis. Dm Biol l992;I52:3O4- 314-
Roman, H. M. Sequential focal and global elevations of sperm intracellular
Florman, H. M. Sequentid focal and global elevations of sperm intracellular ca2+ are ininated by the zona pellucida during aaoçomal exocytosis. D m Bi01 1994;165:152-164.
Fraser, L. R Minimum and maximum extracellular ca2+ requirements during mouse sperm capaatation and fertilization in vitro. J Reprod Ferf 1987;81:77-89.
Fraser, L. R Spem capacitation and its modulation. In: Bavister, B. D., Cumrnins, J., Roldan, E. R S., eds. Fertilization in Mnmmnls. Norwe11, Massachusetts; Serono Symposia; 1990: 141-153.
Fraser, L. R., McDermott, C. A. ca2+-related changes in the mouse sperm capacitation state: a possible role for ca2+-~'I'pase. 1 Reprod Fert 1992;%:363-377.
Fraser, L. R, Abeydeera, L. R, Niwa, K. ~ a ~ + - r e ~ u l a t i n ~ mechanisms that modulate bu11 sperm capacitation and acrosomal exocytosis as determined by dilortetracydine analysis. Mol Reprud Dm 1995;40:233- 241.
Gordon, 1. Liboratory Production of Cattle Embryos.. Cambridge: CAB INTERNATIONAL; 1994: 640 pp.
Hammerstedt, R. H., Graham, J. K., Nolan, J. P. Cryopreservation of mamrnalian sperm: what we ask them to survive. J Androl 1990;11:73- 88.
Hancock, J. L. A staining technique for the study of temperature shock in semen. Nature 1951;167:323-324.
Handrow, R R, First, N. L., Parrish, J. J. Calaum reqyirexnent and increased association with bovine sperm during capacitation by heparin. J Exp
Ijaz, A*, Hunter, G. Induction of bovine sperm capaatation by TEST-Yolk semen extender. J Dairy Scï 1989;72:2683-2690.
Johnson, L. R., Püder, S. H., Bailey, J. L., OldsClarke, P. Sperrn from mice carrying one or two t haplotypes are deficient in investment and oocyte penetration. Deuel Bi01 1995;168:138-149
Langlais, J., Roberts, K. D. A molecular membrane mode1 of sperm capacitation and the aaosome reaction of marnmalian spermatozoa. Gamete Res l985;I2:l83-Z4.
Lee, M. A., Storey, B. T. Endpoint of first stage of zona pelluada-induced acrosome reaction in mouse spennatozoa characterized by acrosomal H+ and ca2+ permeability: population and single cell kinetics. Gamete Res 1989;24:303-326.
hibfried, L., First, N. L. Characterization of bovine follicular oocytes and the* ability to mature in uiho. Anim Sci 1979;48:76-86.
Mattioli, M., Barboni, B., Lucidi, P., Seren, E. Identification of capacitation in boar spermatozoa by chlortetracycline staining. Ther ioge n O logy l996;45:373-381.
Miller, D. J., Ax, R. L. Carbohydrates and fertilization in anirnals. Mol Rept'od Dm I990;26:184-198.
OToole, C. M. B., Roldan, E. R S., Fraser, L. R Role for ca2+ channelç in the signal transduction pathway leading to aaosomal exocytosis in human spermatozoa. Mol Reprod Dm I996;45:2WZll.
Pace, M. M., Graham, E. F. Components in egg yolk which protect bovine
Pace, M. M., Sullivan, J. J., Elliott, F. 1, Graham, E. F., Coulter, G. H. Effectç of thawing temperature, number of spermatozoa and spermatozoal quality on fertiiity of bovine spermatozoa packaged in .ÇmL French straws. Anim Sci 1981;53:693-701.
Parks, J. E., Graham, J. K. Effects of cryopresemation procedures on sperm membranes. Theriogenoiogy 1992;38:209-222.
Parrish, J. J., Susko-Parrish, J. L., Leibfried-Rutledge, M. L., Critser, E. S., Eyestone, W. H., First, N. L. Bovine in vitro fertilization with frozen- thawed semen. Theriogenology 1986;25:591600.
Parrish, J. J., Susko-Parrish, J., Winer, M. A., First, N. L. Capacitation of bovine spem by heparin. Bi01 Reprod 1988;38:1171-3180.
Parrish, J. J., Susko-Parrish, J. L., Uguz, C., First, N. L. Differences in the role of cyclic adenosine 3'3'-monophosphate during capacitation of bovine spem by heparin or oviduct fluid. Biol R q o d 1994;51:1099-1108.
Pérez, L. J., Valcarcel, A., de las Heras, M. A., Moses, D. F., Baldassarre, H. In vitro capacitation and induction of acrosomal exocytosis in ram spennatozoa as assessed by the dilortetracydine assay. Theriogenology l9%;45:lOW-l046.
Pérez, C. J., Valcarcel, A., de las Heras, M. A., Moses, D. F., Baidassarre, H. Evidence that frozen/thawed ram spermatozoa show accelerated capacitation in vitro as assessed by chlortetracycline assay.
Theriogenology 1996;46:131-140.
Robertson, L., Bailey, J. L., Buhr, M. M. Effects of cold shock and phospholipase A2 on intact boar spermatozoa and sperm head plasma
membranes. Mol Reprod Dm 1990;26:143-149.
Roldan, E. R S., Fleming, A. D. b ca2+-~T'~ase involved in ca2+ regdation during capacitation and the acrosome reaction of guinea-pig spermatozoa? J Reprod Fert 1989;85:297-308.
Saling, P. M., Storey, B. T. Mouse gamete interactions during fertilization in vitro: chlortetracydine as a fluorescent probe for the mouse sperm acrosome reaction. J Cell B iol lW9;83:544-555.
Shannon, P., Vishwanath, R. The effect of optimal and suboptirnal concentrations of sperm on the fertility of fresh and frozen bovine semen and a theoretical mode1 to explain the fertility ciifferences. Anim Reprod Sci 1995;39:1-10.
Spungin, B., Breitbart, H. Calcium mobilization and influx during sperm exocytosis. J CeII Sci 1996;109:1947-1955.
Steel, R.G.D. and Tome, J.H. Prinaples and Procedures of Statistics - A Biometrical Approach, Second Edition. New York: McGraw-Hill, 1980.
Storey, B. T. Sperm capacitation and the acrosome reaction. Ann NY Acod
Sn' 1991;637:459-473.
Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, S. Capacitation of mouse spermatozoa 1. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Deoelopmen t l99Sa;l2l:llZ9-1137.
Visconti, P. E., Moore, G. D., Bailey, J. L., Lederc, P., Connors, S. A., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, S. Capautation of mouse spermatoma II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by CAMP- dependent pathway. Denelopment 199Sb;l2l:ll39-I150.
Wang, W. H., Abeydeera, L. R, Fraser, L. R, Niwa, K. Fundional analysis using chlortetracycline fiuorescence and in oit ro fertilization of fiozen- thawed ejaculated boar spermatozoa incubated in a protein-free chemicaily defined medium. J R v o d Fert 1995;104:305-313.
Ward, C. R, Storey, B. T. Determination of the time course of capaatation in mouse spermatozoa using a chlortetracycline fluorescence assay. Deo Bi01 1984;104:287-296.
Watson, P. F. The roles of Iipids and protein in the protection of ram sperrnatozoa at 5OC by egg-yolk lipoprotein. J R w o d Fert 1981;62:483- 492.
Yanagimadii, R. Mammalian fertilization. In: Knobil E., Neill, J= D., eds. The Physiology of Reproduction. New York: Raven Press; 1994: 189-317.
Zhao, Y., Buhr, M. M. Cryopreservation extenders affect calaum flux in bovine spermatozoa during a temperature challenge. AndroI 1995;16:27&285.
CHAPITRE 3
LE GLUCOSE N'EMPÊCHE PAS LA CAPACITATION INDUITE
PAR LA CRYOPRÉSERVATION DES SPERMATOZOÏDES
BOVINS
(La version anglaise de ce chapitre sera soumis pour publication la revue Theriogenology sous les auteurs et le titre: Cormier, N., Sirard, M.A. and Bailey, J.L. Glucose does not inhibit q o p r eservation-induced capacitation in bovine spennatozoa.)
3.1 Résumé
II est de plus en plus admis que les spermatozoïdes ayopr4servés sont dans un état ressemblant h celui associé h la capaatation, ce qui tend expliquer leur longévité réduite ainsi que leur moindre efficaat4 A feconder in vivo. Afin de vérifier les hypothkes selon lesquelles le glucose puisse
empêcher la capaatation induite par le processu de cryopréservation et que cette inhibition soit réversible lors d'une capacitation subsequente, la semence bovine diluée dans le diluant base de jaune d'oeuf-Tris-glycérol (JOTG) a eté refroidie 4OC et/ou congelée selon la procédure de cryoprésewation standard avec ou sans glucose (5 mM), puis incubée pendant 6 heures en présence ou non d'heparine (10 pg/mL). Aux temps 0,3 et 6 heures, l'etat capaate des spermatozoïdes prktraités a été évalué par leur habilité a subir la reaction acrosomale (RA) induite par 100 pg/mL de lysophosphatidylcholine (LPC) grâce la méthode de coloration a l'acide fiavianique et érythrosine B. Suivant la période de refroidissement ou immédiatement apres la d&cong61ation8 le taux de capacitation des spermatozoïdes dilués-refroidis et cryopréservés pré-traités au glucose est similaire aux contrôles non traités au glucose ( p > 0,05). Au terme du 6 heures d'incubation en présence d'heparine, la capacitation est observée chez les spermatozoïdes contrôles alors qu'elle est inhi& chez ceux pré-traités au glucose, qu'ils aient ét4 seulement diluéç-refroidis et/ou cryopréservés ( p =
0,0615). Cette étude a permis de demontrer que l'ajout de glucose, aux
spermatozoïdes bovins dilues dans le JOTG, est inefficace pour contrer la capacitation induite par le processus de cryopréservation. Par contre, lorsque les spermatozoïdes dilués-refroidis et/ou ayopr6serv6s sont incubés 6 heures en présence d'hdparine, une inhibition de la capacitation par le glucose est observée. Ces résultats justifient donc la poursuite des recherches visant a mieux comprendre les mécanismes impliques dans l'initiation de cette capaatation prhaturée et ce, afin d'am6liorer la qualit4 de la semence cryopréservée.
3.2 Introduction
L'utilisation de la semence cryopréservée est presque gbnéralisée en insémination artifiaelle (IA) bovine. Toutefois, aprhs décong&lation, 40 A 50% des spermatozoïdes cryopr&ervés sont inaptes fbconder (Foote et Parks, 1993; Gordon, 1994; Watson, 1995). Pour contrer la faible efficacitb à
féconder de la semence cryopréservée bovine, l'industrie oeuvrant en IA inclut davantage de spermatozoïdes par paillette d'insémination (soit 15 h 20x106) de f a ~ n à ce qu'un plus grand nombre de spermatozoïdes décongeldis
puissent vivre assez longtemps in vioo pour assurer un taux de conception acceptable (Fwte et Park, 1993; Watson, 19%).
Ainsi, les spermatozoïdes cryopréservés bovins ont comme particularité de se détériorer plus rapidement que les spermatozoïdes frais et les explications visant h élucider ce ph&om&ne demeurent toujours incompl&tes (Gordon, 1994). Dernièrement, il a été démontre qu'une des étapes courantes lors du processus de cryopréservation, soit le refroidissement à 4OC dans le diluant JOTG, initiait une capacitation dite "prématurée" chez les spermatozoïdes bovins (Cormier et coll., 1997). Par ailleurs, Shalgi et COU. (1992) ont dbmontré que, suite une IA uterine, les spermatozoïdes capacites étaient moins susceptibles d'atteindre le site de fécondation in vivo comparbs aux spermatozoïdes non capacites. Par conséquent, une capacitation trop hâtive contribuerait A expliater davantage la faible efficacite h féconder in vivo de la semence uyopréservée.
Chez les mammifères, la capacitation des spermatozoïdes constitue un prérequis essentiel à l'acquisition de la f6condance (Austin, 1951; Chang, 1951). Elle est principalement caractéris4e par des modifications membranaires et associ& une @lévation de calaum intracellulaire ainsi qu'a une alcalinisation cellulaire (Langlais et Roberts, 1985; Handrow et coll., 1989; Parrish et cd., 1989). Chez le bovin, la capacitation peut Ptre réalisée in vifro grâce A la prbsence d'héparine (Parrish et coll., 1988)) un analogue de glycosaminoglycanes prbsents dans le t r a m gbnital femelle &ee et Ax, 2984; Herz et coll., 1985). Des travaux ant4rieurs ont démontré que le glucose nuisait A cette capacitation bovine induite par l'hbparine soit en empêchant l'alcalinisation, soit en bloquant les év&nements impliqués dans la transduction des signaux intracellulaires (Parrish et cou., 1989; P-sh et coll., 1994; Galantino-Horner et coll., 1997). L'ajout de glucose, lors de la dilution de la semence, semblait être une alternative interessante pour contrecarrer la capacitation induite par la ayopréservation puisque c'est
facilement r4alisable en industrie et peu coûteux.
L'objectif premier de cette étude &ait donc de vérifier Ifhypoth&se selon laquelle l'ajout de glucose de la semence diluée dans le JOTG,
empeche la capacitation induite par le refroidissement h 4OC des spermatozoïdes bovins cryopr&serv&. Le second objectif consistait s'assurer de la réversibilité de cette inhibition lors d'une capacitation subséquente. En effet, il importe de vérifier que les spermatozoïdes servant
I'IA puissent capaciter apres avoir été prétraités au glucose de façon a garantir la fecondation in vivo. Afin de tester ces hypotheses, la semence diluée dans le JOTG a ét6 refroidie ik 4OC et/ou congelée selon la procédure de cryopréservation standard en presence ou non de glucose, puis incubée pendant 6 heures sous des conditions favorisant ou non la capaatation. Durant l'incubation, l'état capacité des spermatozoïdes pré-trait&s a été évalué par leur habilite h subir la RA induite par la LPC, un lipide déstabilisateur des membranes cellulaires et ce, @ce la methode de coloration A l'acide fiavianique et érythrosine B.
3.3 Matériel et méthode
3.3.1 Collection et préparation de la semence
Les éjaculats, ghéreusement donnés par Ie Centre d'Insémination Artifiaelle du Québec (St-Hyacinthe, Québec), ont &té obtenus l'aide d'un
vagin artifiael suite à la recolte de 4 taureaux Holstein de fertilite prouvée. Les éjaculats dont la motilité des spermatozoïdes &ait >60% et de concentration >3x108 spz/mL ont servi pour les manipulations subséquentes et un éjaculat a été u W par répetition (n = 4).
Chaque éjaculat a été dilué A une concentration de 15-20x106 spz/mL avec le diluant JOTG 35370C (0,25 M Tris, 60 mM d'acide citrique, 69 mM de fructose, 7% v/v de glycerol, mélange d'antibiotiques compose de Tylosine, Gentamicine et Lincospectine, 25% v/v de jaune d'oeuf) puis divisé en 2 de façon h ce que l'un des échantillons reçoivent un supplément de glucose (5 mM; Sigma Chernical Co., St-Louis, MO) et que l'autre, non supplémenté, constitue le contrble. Chacun de ces échantillons a ét6 subdivise en 2 représentant un total de 4 pré-traitements: la premiere fraction de l'échantillon diluée dans le JOTG non supplément& de glucose a
été refroidie à 4OC dans un réfrigérateur (tel qu'effectué dans l'industrie) et maintenue dans ces conditions pendant 4 heures (diluts-refroidis/-glu) alors que la deuxierne, suite ce refroidissement a 4°C pour 4 heures, a et& cryopreservée selon la procedure normale utilisée dans l'industrie (cryopréseroés/-glu). Conformément il la procédure prec6demment déaite, la premiere fraction de lléchantilIon diluée dans le JOTG supplemente de glucose a et6 refroidie A 4°C et maintenue dans ces conditions pendant 4
heures (d ilu es-refro id is/+gl u ) et la deuxieme a été cryopréservee (cryopréservt?s/cglu). La durée de pré-incubation pour tous les traitements (soit 4 heures) a été choisie parce que, dans l'industrie oeuvrant en IA, la semence diluée est refroidie a 4OC et maintenue dans le JOTG pendant une période d'au moins 4 heures avant d'être congelée sous O°C, puis h -1%OC.
Les échantillons pré-traités dilués-refroidis (f glucose) ont été transportés dans un réfrigérateur portatif reglé B 4OC jusqu'au laboratoire de l'université, au plus tard 2 heures apres la récolte. Les échantillons pré- traités uyoprésemés (f glucose) ont été transport& dans un reservoir portatif contenant de l'azote liquide. Apres 4 semaines d'entreposage B
-1%"C, les spermatozoïdes cryopréservés ont &té decongelés par immersion des paillettes de semence dans un bécher rempli d'eau (3S°C) pendant 1 minute. Suite à la pr&incubation de 4 heures ou immédiatement apres la d@congélation, tous les échantillons de semence pré-traitée ont été lavés 2
fois par centrifugation (375 x g, 10 min, temp6rature piece) dans un milieu non capaatant, MNC (Sp-TALP modifié de Parrish et coll., 1988 contenant 03% de polyvinylalcool, PM 30 000-70 000 d[PVA; Sigma]). Les culots de spermatozoïdes ainsi obtenus ont 6th resuspendus A une concentration de 50x106 spz/mL dans un milieu capacitant, MC (Sp-TALP contenant 1 mM de
pymvate, 2 mM de CaC12, 25 mM de NaHC03, 0,6% d'albumine sérique bovine [BSA; sans aades gras, fraction V; Sigmd.
3.3.2 Capacitation in vitro
Les spermatozoïdes pré-traites resuspendus dans le MC ont &té répartis en parties aliquotes de 200 pi, puis traites ou non avec de I'h6parhe
(O OU 10 pg/mL), celle-ci étant nécessaire pour r6aliser la capaatation in mtro chez le bovin, et incubés pendant 6 heures sous des conditions favorisant la capaatation (3g0Cf 5% Cm, 100% d'humidité; Parrish et cou., 1988). Aux temps 0, 3 et 6 heures, l'état capaaté des spermatozoïdes pré-hait& a été estimé par leur habilite subir la RA suite à l'ajout de 100 lg/mL de LPC (Sigma) et d'une incubation additionnelle de 30 minutes sous les conditions décrites prkédemment (Parrish et cou., 1988). Le nombre de spermatozoïdes induits soit spontanément, soit par la LPC, a été &due grâce à la méthode de coloration l'acide flavianique et erythrosine B (modifiée d'apres Bryan et Akrukf 1977; Lenz et coll., 1982). La viabilité des spermatozoïdes non traités A la LPC a éte déterxrtinée par la methode de coloration à l'éosine-nigrosine (modifiée d'apres Hancock, 1951; Barth et Oko, 1989).
3.3.3 Détermination de l'état capacité (RA induite par la LPC)
La technique utilisée pour colorer les spermatozoïdes bovins h l'acide flavianique et érythrosine B a été la même que celle déaite antérieurement par Lenz et coll. (1982). Quinze pL de la suspension de spermatozoïdes, traites ou non la LPC, ont été étalés sur une lame de verre. Apres 24 à 48
heures de séchage à la température de la piece, les lames couvertes de spermatozoïdes ont été colorées i3 l'acide flavianique (Sigma) puis h
lërythrosine B (Fisher Scientific, Montréal). Aprk 12 h 24 heures de séchage h la température de la piece, les lames couvertes de spermatozoïdes colores ont été enduites de Permount S15 (Fisher) puis recouvertes d'une lamelle de verre. Sous miaosmpie optique (4ûûx), 200 cellules ont et6 comptées par lame et le pourcentage de spermatozoïdes soit avec un acrosome intact (cellules dont les membranes plasmique et acrosomique externe apparaissaient rose foncé), soit avec un aaosome abîme ou absent (cellules ayant subi la RA et dont la membrane acrosomique inteme apparaissait rose pâle ou incolore) a et6 déterminé.
3.3.4 Évaluation de la viabilité
Une solution d'éosine-nigrosine contenant O 3% ( p h ) de citrate de sodium a étb utiiisée afin de d6terminer la viabilité des spermatozoïdes au cours de ltaXperimentation, soit de O h 6 heures d'incubation (Barth et Oko, 1989). Cinq PL de la suspension de spermatozoïdes non traités à la LPC ont été mélangés h 10 IL de la solution d'éosine-nigrosine, puis 10 PL de cette mixture ont ét6 étalés sur une lame de verre. Apr&s 12 à 24 heures de
séchage h la tempQature de la pike, les lames couvertes de spermatozoïdes ont été enduites de Pennount 515 puis recouvertes d'une lamelle de verre. Sous miaoscopie optique (400x), 200 cellules ont été comptées par lame et le pourcentage de spermatozoïdes vivants (cellules blanches n'ayant pas incorpore le colorant) a été evalué.
Afin subdivisés
Analysa statistiques
d'analyser les données de cette expérience factorielle en tiroirs (OU factoriel en split-split-plot), une analyse de la variance a
d'abord été effectuée puis des comparaisons simples d'inter& (choisies d priori) ont kt4 vérifiées h l'aide de contrastes qualitatifs et polynomiaux (SAS, 1990). Un test de comparaisons multiples, le LSD protég6 (ou PPDS, plus petite difference significative), a ét4 effectué lorsque les conditions d'analyse &aient appropriées.
3.4 Résultats
3.4.1 Inhibition de la RA spontanée
L'effet du pré-traitement et du temps d'incubation sur la prévalence de la RA spontanée des spermatozoïdes bovins non traites h la LPC est Uuçtr6 a la Figure 1. Ces résultats montrent qu'il n'y a pas d'effet du glucose sur les spermatozoïdes dilues-refroidis et cryopréservk au temps O ainsi qulapr&s 6 heures d'incubation sous des conditions favorisant la
capacitation; le pourcentage de RA spontanée varie de 31% A 41% chez les spermatozoïdes non pré-traités au glucose vs 31% h 46% chez ceux ayant été pré-traités ( p = 0,5849). Par contre, il faut noter qu'en présence d'héparine, l'induction spontanée totale (O et 6 heures confondues) est plus élevée lorsque les spermatozoïdes dilu&refroidis sont comparés h ceux cryopréservés (Figure 1 A et B; p = 0,0264). Puisque cet effet n'a pas d'inadence sur les diff&ences observées entre les 2 prétraitements diiution- refroidissement et/ou ayopr6servation selon le temps d'incubation, les données f heparine ont et6 regroupées afin d'éviter la redondance dans l'analyse subséquente des résultats.
Ainsi au temps O, il y a un effet du pré-traitement lorsque sedes la dilution-refroidissement à 4OC dans le JOTG et/ou la cryopréservation sont considérées (Figure 1; p < 0,05). En effet, le pourcentage de spermatozoïdes cryopréserv4s induits spontandiment est 2 fois plus &ve que celui des spermatozoïdes dilués-refroidis, soit 42B% vs 2M3% (moyenne f erreur- type, E.T.) respectivement, qu'ils aient et6 pr&hait& en présence de glucose ou non. Au temps 6 heures d'incubation, ce sont encore les spermatozoïdes cryopr&ervés qui affichent un plus grand nombre de RA induites spontanément lorsque comparés aux spermatozoïdes dilués-refroidis, soit 49W% vs 38S% (moyenne i: E.T.) respectivement ( p < 0,05).
Les résultats montrent aussi un effet linéaire du temps sur les différences observées quant la prévalence de la RA spontanée au cours du 6 heures d'incubation entre les 2 pré-traitements dilution-refroidissement et/ou cryopréservation, abstraction faite de la présence ou non de glucose (Figure 1; p = 0,0014). Par conséquent, l'augmentation du nombre moyen de spermatozoïdes induits spontanément de O 6 heures d'incubation est presque 3 fois plus Qevée chez les spermatozoïdes dilués-refroidis lorsque cornpar& à ceiie subie par les spermatozoïdes cryopréservés, soit 18% vs 7%, respectivement.
Sans héparine Avec héparine
Temps (h) Effet du pré-traitement (dilution-refroidissement 4OC ou
cryoprésewation complkte) en présence ou non de glucose, et du temps d'incubation sur la prévalence de la RA spontanée chez des spermatozoïdes bovins A) sans héparine B) avec heparine, n = 4. Les courbes sont sigruficatives selon le contraste comparant les 2 pré-traitements (Dilués- refroidis vs Cryopr6sewés) x Temps linéaire ( p = 0,0014). a,b,c des lettres différentes pour chacun des temps indiquent que le % de spermatozoïdes induits spontanément diffke de fawn significative selon le test LSD protégé ( p < 0,05). Aucun effet du glucose n'a ét4 observe selon le contraste non glucose vs glucose (p = 0-9). LtE.T. est f 3%.
3.4.2 Inhibition de la capacitation
L'effet du pré-traitement et du temps d'incubation sur la capacitation des spermatozoïdes bovins est montre à la Figure 2. Au temps O, avant
+ Sans glucose
Avec glucose
Sans hé~arine Avec heparine
Temps (h) Figure 2 Effet du pré-traitement (présence ou non de glucose lors de la dilution et du refroidissement 4OC et/ou de la cryopr&ervation) et du temps d'incubation sur la capacitation (induction de la RA par la LPC) chez des spermatozoides bovins: dilués-refroidis incubés A) sans héparine B ) avec héparine et cryopréservés incubés C) sans héparine D) avec héparine, n = 4. Les courbes sont lég&ement significatives seion le contraste glucose x héparine x Temps lineaire ( p = 0,0615). Aucune différence significative entre les traitements n'est observée dans le % de spermatozoïdes induits aux temps O et 6h selon le test LSD protégé ( p > 0,05). L'erreur-type (E.T.) est f 3%.
I'incubation sous des conditions favorisant la capacitation, il n'y a pas d'effet du glucose sur le taux de capaatation des spermatozoides dilués-refroidis et cryopr&ervés lorsque ceux-ci sont comparés aux contrBles et ce, en presence
ou non d'héparine ( p v 0,051. Par conséquent, le pourcentage de RA induites par la LPC (correspondant au nombre de spermatozoïdes capacitks) est similaire pour tous les pré-traitements (f glucose) imposés aux
spermatozoïdes, qu'ils aient &té seulement dilués-refroidis et/ou cryopréservés; l'induction varie de 6% A 14%.
Les spermatozoïdes dilués-refroidis et ayopr4servés, pré-traités au glucose, démontrent une hausse lég&ement significative du pourcentage de capacitation au terme du 6 heures d'incubation en absence d'héparine lorsque les spermatozoïdes sont cornpar& ceux non pré-traités au glucose
(Figure 2 A et C; p = 0,0615). Chez ces demiers, c'est plutôt une baisse de la capacitation qui est observee. Par contre, les résultats obtenus suite A
l'incubation de 6 heures en présence dfh6parine révelent un effet du glucose sur les spermatozoïdes dilués-refroidis et ayopréservés (Figure 2 B et D; p =
0,0615). Au cours de cette incubation, il y a effectivement une baisse légerement significative de la capacitation chez les spermatozoïdes pré- traités au glucose lorsqu'ils sont comparés aux contrôles (spermatozoïdes non pré-traités au glucose) pour lesquels une augmentation du nombre
moyen de spermatozoïdes capaatks est observée.
L'effet du prktraitement et du temps d'incubation, en prksence ou non d'héparine, sur la viabilite des spermatozoïdes bovins non trait& A la LPC est illustre au Tableau 1. Au terme du pré-traitement en presence ou
non de glucose (temps O heure d'incubation), la viabilité des spermatozoïdes dilues-refroidis est 1,5 fois plus blevée que celle observee chez les spermatozoïdes cryopr6servéç (soit 68MW vs 56-1 [moyenne f écart-type] respectivement; p < 0,05). De plus, les résultats montrent un effet linéaire du temps sur la viabilité des spermatozoïdes flués-refroidis lorsqu'ils sont comparés A ceux cryopréservés bien qu'ils aient et6 pré-traités avec ou sans glucose et incubés en présence ou non d'hkparine @ = 0,0001). De ce fait, la baisse du nombre moyen de spermatozoïdes vivants observée au terme du 6 heures d'incubation est environ 2 fois plus importante pour les
spermatozoïdes dilués-refroidis que pour ceux cryopréservéç, soit 37% vs 16% respectivement. Aussi, la viabilité totale des spermatozoïdes dilués- refroidis et cryopréservés est affectée par l'heparine ( p = 0,0001). En effet, lorsque l'héparine est présente, le nombre moyen de spermatozoïdes vivants chute de 9% chez les spermatozoïdes dilués-refroidis et de 7% chez ceux ayoprese~és.
Tableau 1 Effet du pré-traitement et du temps d'incubation, en présence ou non d1h6parine, sur la viabilité* des spermatozoïdes bovins$
Pré-bai tement Temps (h)l O 6
Spermatozoïdes2 Glucose
Dilués-refroidis - 86L2 82f 7 51i7 44f5
+ 87 1 2 86f 3 55 f: 6 4 û f 6
Cryopréservés - 58 i 1 53f 4 44f 7 41 f 4
+ 6 2 I 4 52f 4 M I 2 36k7
1 La viabilité des spz dilués-refroidis est superieure a celle des spz ayoprése~6s au temps O heure d'incubation selon le test LSD prote@ ( p c O,OS).
2 La diminution de viabilité selon le temps est plus importante de façon significative pour les spz dilués-refroidis que pour ceux cryopréservés selon le contraste (Dilués-refroidis vs Cryopréservés) x Temps héaire @ = 0,0001).
3 La viabilite des spz prCtraités est moins &levée lorsqu'ils sont incubés en présence d'héparine selon le contraste Non héparine vs hepafine @ = 0,0001).
+ Exprimée selon la moyenne I --type.
$ Non traités la LPC
3.5 Discussion
3.5.1 Effets des traitements sur la RA spontanée
La plus grande susceptibilité des spermatozoïdes cryopr&en& subir la RA spontanée, aux temps O et 6 heures d'incubation, démontre un effet de traitement relativement la dilution-refroidissement et/ou a la cryoprése~ation plutôt qu'A celui du glucose (Figure 1). Le refroidissement est reconnu pour entraîner une destabilisation membranaire mais la congélation-décongelation (incluant la redilution dans un milieu isosmotique) occasionnerait davantage d'altérations irréversibles, particuIierernent au niveau de la membrane acrosomique externe (Hammerstedt et coll., 1990; Watson, 1990; Holt et North, 1994). Les spermatozoïdes decongelés auraient des membranes plus fluides et instables, qui seraient plus susceptibles de fusionner, occasionnant davantage de RA spontanées (Watson, 1990; Parks et Graham, 1992). En pr6sence d'héparine, le plus grand nombre de RA spontanées observé serait aussi justifie par la fluidification mernbranaire des spermatozoïdes capacités (Langlais et Rom, 1985).
Par contre, ce sont les spermatozoïdes dilués-refroidis qui affichent une augmentation substantielie de la RA spontanée au cours du 6 heures d'incubation. La congelation-decongélation, une étape particuliérement stressante lors du processus de cryopréservation, constituerait une pré- s6lection des spermatozoïdes les plus aptes & survivre lors d'une incubation subséquente parce qu'ils auraient mieux conservé leur integrite membranaire (Parks et Graham, 1992; Watson, 1995). Contrairement aux
spermatozoïdes cryopréserv&, les spermatozoïdes dilués-refroidis formeraient donc une population davantage hétérogène parmi laquelle une double s6lection serait mise en évidence lors de l'incubation sous des conditions favorisant la capadtation. Ainsi, une sous-population de ces spermatozoïdes auait des membranes fragilisées suite a la pré-incubation dans le diluant, tandis que la présence des facteurs capaatanh seraient responsables de la desorganisation membranaire d'une autre sous- population.
3.5.2 Effet du glucose pendant le prktraitement
L'ajout de glucose lors du pré-traitement n'a pas empêche la capaatation prhaturée des spermatozoïdes bovins, tel qu'illustré par leur habilité similaire à subir la RA lorsqu'ils ont 6té traités h la LPC au temps O heure d'incubation (Figure 2). Lorsque la capaatation est réalisée in o i f ~ o , l'alcalinisation cellulaire est facilitée par la présence d'héparine (Parrish et dl., 1988). Parrish et cou. (1989) ont aussi démontré que Ie glucose, lorsque mbtaboliçé par les spermatozoïdes, provoquait une aadification du pHi suite h la génération de protons lors de la glycolyse; cette acidification préviendrait la capaatation induite par l'héparine suivant 4 h 5 heures d'incubation en atténuant l'alcaliriisation nécessaire à sa r6alisation. Ainsi, les conditions acides ne supporteraient pas la capaatation, ni la RA, tel que rapporte par des études effectuées chez le cobaye (Rogers et Yanagimadii, 1975; Hyne et Edwards, 1985).
Plusieurs raisons peuvent être invoquées afin d'expliquer pourquoi le glucose n'a pas empêché la capacitation des spermatozoïdes pré-traites. Premiérement, l'induction de la capacitation lors du processus de cryopr&e~ation n'est pas physiologique. Les variations de température
inhérentes à l'ensemble de cette procedure enhafnent des changements membranaires assez extrêmes (Hamrnerstedt et dl., 1990; Parks et Graham, 1992) tel qufillustr6, chez des spermatozoïdes bovins refroidis h O°C, par des régions de la tête d 6 p o m e s de particules membranaires (de Leeuw et COU., 1991). Par conséquent, la réorganisation des composants membranaires provoqu& par le refroidissement à 4OC et/ou la ayopréservation pourrait activer mécaniquement, plutôt que physiologiquement, des pompes ioniques et des canaux prot6iques permettant ainsi d'outrepasser certains évgnements associés ii la capacitation. Une activation hative et/ou un bris des structures régulatrices du Ca*+ par le refroidissement favoriserait une augmentation du Ca2+i, laquelle initierait la signalisation intracellulaire associée la capacitation sans avoir nécessairement à passer par une augmentation du pHi. En supposant que le glucose doive aadifier le pHi en amont de ces evhements pour exercer son action inhibitrice et que la signalisation cellulaire soit amorcée, cela expliquerait son inefficacite inhiber la capacitation induite par la cryopréservation.
Deuxi&mement, considerant que le glucose ait éte ajouté aprh la dilution, il est possible que son effet soit contre par le JOTG. En effet, la présence du glycérol lors du refroidissement augmente I'osmolalité du milieu extracellulaire (Hammerstedt et coll., 1990). Certaines évidences suggerent que ce soit lors de la déshydratation/réhydratation des spermatozoïdes, en condition hyperosmotique, que les alterations
membranaires sont les plus importantes (Hanunerstedi et d l . , 1990; Gao et coll., 1993). Celles-ci pourraient affecter les structures impliquées dans le transport du glucose, soit en interférant indirectement avec l'activit4 des proteines de transport membranaires, soit directement avec les canaux protéiques aqueux (Carruthers et Melchior, 1986; Toon et Solomon, 1988 et 1990). Les dommages induits par le refroidissement en présence de glycérol pourraient donc entraver les fonctions de la protéine porteuse membranaire de type perméase responsable de la diffusion facilit& du glucose (Dan id et coll., 1990; Alberts et coll., 1994) et conséquemment, nuire h son entrée dans la cellule.
3.5.3 Effet du glucose lors de la capaatation
L'ajout de glucose lors du pré-traitement inhibe la capacitation induite par l'hbparine des spermatozoïdes bovins, tel qu'ülustré par la baisse de RA induites observée après 6 heures d'incubation (Figure 2 B et Dl. Deux explications peuvent être invoquk: 1) une quantite suffisante de glucose a pén6tr6 dans la cellule lors du pr&traitement de façon pouvoir exercer son effet inhibiteur au cours de la capaatation en présence d'héparine et 2) le glucose n'a pas été compl&tement retiré du milieu même aprk 2 lavages de
la semence et que sa présence, tout au long de l'incubation, ait pu empêcher la capaatation de se rkaliser. Ces résultats supportent ceux obtenus par Parrish et COU. (1989) mais ne permettent pas de vérifier entigrement l'hypothèse de départ concernant la réversibilité de l'inhibition de la capacitation par le glucose. Une incubation prolongée en présence d'héparine aurait pu fournir des indications sur cette r6versibilité puisqu'il a
déja et4 démontré que la capaatation des spermatozoïdes bovins survient
suite a une incubation de 12 heures en présence d'héparine et de glucose (Parrish et cou., 1989). Cette période de temps n'est pas incompatible avec les
conditions qui prévalent in vivo puisque 1'IA est habituellement pratiquée vers la f in de l'oestrus, soit environ 12 heures avant l'ovulation (Salisbury et cd., 1978; Garner, 1991).
3.5.4 Effets des traitements sur la viabilité
La congélation-décongdation a plus sévèrement affect6 la viabilité des spermatozoïdes au temps O heure, qu'ils aient été prktraités ou non avec du glucose (Tableau 1). Le diluant JOTG, malgré son efficacité preserver 11intégrit6 des membranes lors du refroidissement, ne semble pas offrir une protection suffisante quant aux bris mkaniques provoqués par la
cong6lation-décongélation (Hammerstedt et c d . , 1990; Parks et Graham, 1992; Watson, 1995). Pourtant, la diminution de viabilité observée au cours du 6 heures d'incubation est davantage importante pour les spermatozoides dilués-refroidis lorsqu'elle est comparée à ceux cryopr#servés. Il est alors
tentant de spéculer qu'une pré-sélection des spermatozoïdes, similaire h celle suggbrée pour expliquer la prévalence acaue de la RA spontanée suite la
congélation-décongélation, se réflète par la viabilitg.
En présence d'héparine, la diminution de la viabilité totale des spermatozoïdes dilu&-refroidis et ayopréservés serait expliquée par la
fluidification membranaire et l'influx de Ca2+ associés Zi la capacitation (Langlais et Roberts, 1985; Handrow et cd., 1989); ces Mmements pourraient effectivement augmenter la susceptibilité des spermatozoïdes h subir la RA
spontanée et/ou mourir (Robertson et Watson, 1987; Watson, 1995).
3.6 Conclusion
Cette étude a démontré que la prbsence de glucose pendant le refroidissement à 4OC dans le JOTG n'a pas empêché la capaatation prématurée des spermatozoïdes bovins. Ii faut mentionner que le principe d'induction de la capacitation par la cryopr6servation demeure encore obscure et que cette premigre tentative, visant A la contrecarrer, repose sur
des connaissances relativement a l'inhibition de la capacitation par le glucose, mais sous des conditions davantage physiologiques. De futures investigations, quant aux mecanismes impliqués dans l'induction de cette capacitation pr&maturée, permetterait d'intervenir plus juducieusement et ainsi amêliorer l'efficaate a féconder in oiw de la semence cryopréservée.
3.7 Remerciements
Nous remercions grandement le Centre d'Insémination Artiàfielle du Québec pour avoir fourni généreusement la semence et le support technique. Les voyages effectués à St-Hyacinthe par A. Chamberland, S. Tardif et R Bussières ont beaucoup été appréciés. Cette &tude a été supportée financi&rement par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada, agriculture et agroalimentaire Canada, et le Conseil de recherches en devage de bovins.
3.8 Références
Alberts, B., Bray, D., Lewis, - T., Raff, I., Roberts, K., Watson, J. D. Molecular
Biology of the Cell. New York: Garland Publishing, hc.; 1994A294pp.
Austin, C. R Observation on the penetration of sperm into the mammalian
egg. Aust J Sn' Res 1951;84:697-698.
Barth, A. D., Oko, R. J . Abnormnl Morphology of Bovine Spermatozoa.
Ames, Iowa: Iowa State University Press; 1989:285pp.
Bryan, J. H. D., Akruk, S. R A naphthol yeIlow S and erythrosin B staining
procedure for use in studies of the acrosome reaction of rabbit
spermatozoa. Stnin Technol 1977;52:47-50.
Carruthers, A., Melchior, D. L. How bilayer lipids affect membrane protein
advity. TIBS 1986;11:331-335.
Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited in the faliopian
tubes. Nature 1951;168:697498.
Cormier, N., Sirard, M. A., Baiiey, J. L. Premature capacitation of bovine
spermatozoa is initiated by cryopreservation. J Androl 1997;18:461-468.
Darnell, J., Lodish, H., Baltimore, D. Molecular Cell Biology. New York:
Scientific American Booksf Inc.; 199û:l lO5pp.
de Leeuw, F. E., Colenbrander, B., Verkieij, A. J. The role membrane damage
plays in cold shodc and freezing injury. In: Johnson, L. A. and Rath, D.,
eds. Boar Semm Presmafion II. Berlin: Paul Parey Ça. Publ.; 1991:95-
104.
Foote, R. H., Parks, J. E. Factors affecting preservation and fertility of bu11
sperm:. a brïef review. Reprad Ferfil Dm 1993;5:665673.
Galantho-Homer, H. L., Visconti, P. E., Kopf, G. S. Regulation of protein
tyrosine phosphorylation during bovine sperm capaatation by a cyclic
adenosine 3l.5'-monophosphate-dependent pathway. Biol Reprod
1 997;56: 707-71 9.
105
Gao, D. Y., Ashworth, E., Watson, P. F., Kieinhans, F. W., Mazur, P., Critser, 1.
K. Hyperosmotic tolerance of human spennatozoa: separate effects of
glycerol, sodium diloride, and suaose on spermolysis. Bi01 Reprod
1993;49: 1 12-1 23.
Garner, D. L. Artificial insemination. Zn: Cupps, P. T., ed. Reproduction in
Domestic Animals. San Diego: Academic Press, Inc; 1991:251-277.
Gordon, 1. Labosatory Production of Cnttle Embryos. Cambridge: CAB
INTERNATIONAL; l994:dQOpp.
Hammerstedt, R. H., Graham, J. K., Nolan, J. P. Cryopreservation of
mammalian sperm: what we ask them to survive. J Androl 1990;11:73-
88.
Hancock, J. L. A staining technique for the study of temperature shodc in
semen. Nature 1951;167:323-324.
Handrow, R R, First, N. L., Parrish, J. J. Calcium requirement and inaeased
association with bovine sperm during capacitation by heparin. J Exp zwl
l989;2SM 744 8 2
Herz, Z., Northey, D., Lawyer, M., First, N. L. Acrosome reaction of bovine
spermatozoa in vivo: sites and effects of stages of the estrous cyde. Bi01
Repld 1985;3î:ll63-l168.
Holt, W. V., North, R D. Effects of temperature and restoration of osmotic
106
equilibrium during thawing on the induction of plasma membrane
damage in ayopreserved ram spermatozoa. Biol Reprod 1994;51:414-424.
Hyne, R. V., Edwards, K. P. Muence of 2-deoxy-D-glucose and energy
substrates on guinea-pig spem capaatation and aaosome reaction. J
Reprod Fertil 1985;73:59-69.
Langlais, J., Roberts, K. D. A molecular membrane mode1 of sperm
capacitation and the acrosome reaction of mammalian spermatozoa.
G a t e Res l985;l2: 183-224.
Lee, C. N., Ax, R L. Concentrations and composition of glycosaminoglycans
in the female bovine reproductive tract. J Dairy Sci 1984;67:2006-2009.
Lenz, R. W., Ax, R L., Grimek, H. J., First, N. L. Proteoglycan from bovine
follidar fluid stimulates an acrosome reaction in bovine spermatozoa.
Biochem Biophyç Res Comm 1982;106:1092-1098.
Parks, J. E., Graham, J. K. Effectç of cryopreçervation p r o c e d m on sperm
membranes. Theriogenology 1992;38:209-222.
Parrish, J. -J., Susko-Phsh, J., Winer, M. A., First, N. L. Capacitation of
bovine sperm by heparin. Biol Reprod l988;38:llïl-ll8O.
P h s h , J. J., Susko-Panish, J. L., First, N. L. Capacitation of bovine sperm by
heparin: inhibitory effect of glucose and role of intracellular pH. Bi01
Reprod 1989;41:683-699.
107
Parrish, J. J., Susko-Pamish, J. L., Uguz, C., First, N. L. Differences in the role
of qcl ic adenosine 3'9-monophosphate during capaatation of bovine
spem by heparin or oviduct fluid. Biol Reprod l994;5l:lO99-llO8.
Robertson, L., Watson, P. F. The effect of egg yolk on the control of
intracellular calcium in ram spermatozoa cooled and stored at 5OC.
Anim Reprod Sci 1987;15:177-187.
Rogers, B. J., Yanagimachi, R Retardation of guinea pig sperm acrosome
reaction by glucose: the possible importance of pyruvate and lactate
metabolism in capacitation and the acrosome reaction. Biol Reprod
1975;13:56&575.
Salisbury, G. W., VanDemark, N. L., Lodge, J. R. Physiology of Reproduction
and Arti'cial Insemination of Cattle. San Francisco: W . H. Freeman;
1978.
Shdgi, R., Smith, T. T., Yanagimachi, R. A quantitative cornparison of the
passage of capacitated and uncapautated hamster spermatozoa through
the uterotubal junction. Biol Reprod 1992;46:419-424.
Toon, M. R., Solornon, A. K. Modulation of water transport in human red
ceils: effect of urea. Biochem Biophys Acta 1988;940:266-274.
Toon, M. R., Solomon, A. K. Transport parameters in the human red cell
membrane: çolute-membrane interactions of hydrophilic alcohols and
th& effect on permeation. Biochem Biophys Acta IWO;lO22:5%7l.
108
Watson, P. F. Artifiaal insemination and the preservation of semen. In:
Lamming, G . E., ed. Marshall's Physiology of Reproduction:
Reproduction in the Male. New York: Churchill Livingstone; 1990:747-
869.
Watson, P. F. Recent developments and concepts in the cryopreservation of
spermatozoa and the assessrnent of their pst-thawing function. Reprod
Fertil Dm lW5;7:871-89l.
La premigre &tude a fourni des évidences quant a i'initiation d'une capacitation prématurée chez les spermatozoïdes bovins partiellement (dilués-refroidis) ou complhtement cryopréserv6s. En effet, ces derniers affichaient un plus grand nombre de patron B selon la coloration A la chlortétracydine (CTC) et ce, apr& la prdbincubation de 4 heures dans le diluant JOTG ou immédiatement apres la décongélation. De plus, ces mêmes spermatozoïdes ont fécondé davantage d'ovocytes in vitro en absence d'héparine que ceux ayant été pré-incubés dans le milieu contrôle. li est reconnu que les spermatozoïdes capacités demontrent un taux métabolique plus élevé et que leur fragilité est accrue, résultat d'une désorganisation membranaire. L'espérance de vie, et par conséquent le pouvoir fecondant des spermatozoïdes capacitbs, seraient ainsi limités. Enfin, puisque l'obtention de taux de conception acceptables in vivo est diminue suite h l'insémination de semence cryopréservée comparativement a de la semence fraîche, l'initiation d'une capacitation prématurée pourrait contribuer h expliquer cette fertilité réduite.
La deuxSrne &ude, qui constituait une premigre tentative visant contrecarrer cette capaatation prématurée, a montre que l'ajout de glucose à
de la semence diluée dans le JOTG n'a pas empêché la capaàtation des
spermatozoïdes bovins partiellement ou compPtement cryopréservés. Par contre, le glucose s'est révelé efficace pour inhiber, in vitro, la capacitation bovine induite par Yheparine. Il semble donc que le mécanisme d'induction de la capaatation par la cryopréservation ne soit pas le meme que celui invoqué lorsque la capaatation est initiée sous des conditions davantage physiologiques. Une meilleure connaissance des &vènements associés a cette capacitation pr6rnahirée permettrait d'intervenir plus adéquatement pour améliorer la qualité, et par consequent l'efficacité féconder in vivo, de la semence cryopréservée.
La coloration a l a chlort&racycline (CTC) est une methode relativement récente pour evaluer l'état physiologique des spermatozoïdes. Elle permet de visualiser concretement les spermatozoïdes qui sont "normaux" (patron F), capacités (patron 8) et ayant subi la réaction acrosomale (patron AR) alors que d'autres methodes, telle la coloration à
l'aâde flavianique et érythrosine B (Lenz), sont des mesures plut& indirectes de la capacitation. En effet, cette derniere évalue uniquement le nombre de spermatozoïdes ayant subi la réaction acrosomale. Cependant, des experiences préliminaires où la reaction aaosomde était induite avec la lysophosphatidylcholine ont révelé que le CTC tendait a sous-estimer le nombre de spermatozoïdes susceptibles de subir la réaction aaosomale, et donc d'être capacités, lorsque comparé la coloration de Lenz. Puisque les pourcentages de réaction acrosomale obtenus selon la coloration de Lenz étaient similaires ceux retrouvés dans la littbrature, cette méthode d'évaluation de l'état capacité des spermatozoïdes a été utilisée, préférentiellement au CKJ, dans la deuxième &tude.
A la lumiere de ces travaux, beaucoup d'interrogations subsistent quant aux mécanismes impliqués dans l'initiation de la capacitation induite par le processus de cryopreservation. Il en est de meme lorsqu'il s'agit d'expliquer la serie d'événements associés la réalisation de la capacitation in vivo. Néanmoins, plusieurs autres études suggerent que le Ca2+ ait un r61e primordial h jouer lors de la capaàtation. Il serait donc intéressant d'investiguer plus en détail la régulation du Ca2+ chez les spermatozoïdes partiellement ou compktement cryopréservés, puisque les structures
membranaires impliquées dans ce contr6le (pompes ioniques, canaux proteiques) sont justement susceptibles de subir des modifications lors du refroidissement et/ou de la congélation-décongélation. A titre d'exemple, des expériences realisées avec des bloqueurs de canaux calaques pourraient apporter des informations pertinentes quant a l'importance des mouvements du Ca2+ lors de ces étapes de la cryopr&e~ation. Ces bloqueurç pourraient même se rbvéler efficaces pour inhiber la capacitation prématurée des spermatozoïdes bovins ayopréserv&.
Selon les conditions expérimentales utilisées in vitro, la capacitation peut aussi etre caractérisée par des patrons particuliers de phosphorylations de protéines spécifiques. Ii serait alors justifié de faire une étude comparative de ces patrons chez les spermatozoïdes bovins partiellement ou completement cryopréservés et ce, afin de mieux visualiser les mécanismes moléculaires qui sont impliques dans la capacitation induite par la cryopréservation, plutbt que physiologiquement. Finalement, tout travaü futur dont les objectifs viseraient mieux comprendre les dommages encourus par le processus de cryopréservation et les mécanismes régissant la capacitation serait utile, car cela permettrait sans doute d'intervenir plus judiaeusement pour améliorer la qualité et l'efficacite à féconder in vivo de la semence cryopr&ervée.
ANNEXE A
photo: Annie Chamberland
Figure 1 Spermatozoïdes bovins color& à la chlort6tracycline (CTC): A) non capacité (patron F) B) capacité (patron B)
C) ayant subi la réaction acrosomale (patron AR).
