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Caractérisation de l’interaction entre la glycoprotéine d’enveloppe gp120 du VIH-1 et les héparanes sulfate : importance des changements conformationnels induits par la liaison à CD4. Travail réalisé au LEM à l’Institut de Biologie Structurale Grenoble Présenté par: Elodie Crublet - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Travail réalisé au LEM
à l’Institut de Biologie Structurale
Grenoble
Présenté par:
Elodie Crublet
sous la responsabilité de:
Hugues Lortat-Jacob
Romain Vivès
LES HÉPARANES SULFATE
Chaîne d’héparane sulfate (HS)
Core protéique
Marquage fluorescent des HS à la surface d’un tapis de 10 cellules endothéliales de poumon (*)
Stevens et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, in press (may 2007)
1 unit = 7.2 μm
[acide hexuronique (GlucA ou IdoA) et N-acétyl glucosamine] n
n = 20 à 100N-SO3
-2-O-SO3-
6-O-SO3-
3-O-SO3-
OAc-N
OHOO O
OHOHO
OH
COO-
n
Grande hétérogénéité et diversité structurale considérable
48 disaccharides différents
48² = 2304 : tétrasaccharides
483 > 105 : hexasaccharides
484 > 5.106 : octasaccharides
485 > 2.108 : décasaccharides
486 > 1010 : dodécasaccharides...
48² = 2304 : tétrasaccharides
483 > 105 : hexasaccharides
484 > 5.106 : octasaccharides
485 > 2.108 : décasaccharides
486 > 1010 : dodécasaccharides...
N-SO3-2-O-SO3
-
6-O-SO3-
3-O-SO3-
OAc-N
OHOO OO
HOHOOH
COO-
OAc-N
OO O
OHOHO
OH
COO-
OH
domaine NA domaine NS
Régions N-Sulfatées
hautement sulfatées
Régions N-Sulfatées
hautement sulfatées
Régions N-Acétylées, peu
sulfatées
Régions N-Acétylées, peu
sulfatées
Facteurs de
croissance
Cytokines
Chimiokines
Molécules
d’adhésion
Protéines de la
matrice
Enzymes
Inhibiteurs d’enzymes
Agents pathogènes
...
Prolifération
Différenciation
Migration
Adhésion
Cohésion
tissulaire
Voies
métaboliques
Coagulation
Infection
...
•Des bactéries•Des parasites•De nombreux virus
HSPG
HSPG HSPG
INFECTION EN CISFMDV, HIV, Ad-2, Ad-5, AAV…
INFECTION EN TRANS
HIV
Cellulecible
INFECTION DIRECTEHSV-1
•Adenovirus 2 et 5•Adeno-associated virus•Cytomegalovirus•Flavivirus (Dengue, Yellow fever, Hepatitis C)•Foot-and-mouth disease virus•Herpes simplex virus I et III•Human immunodeficiency virus (VIH)•Papilloma virus•Pseudorabies virus•Respiratory syncytical virus•Sindbis virus•Vaccine virus…
LE VIRUS DE L’IMMUNODÉFICIENCE
HUMAINE
33,2 millions de personnes séropositives
(2007 - ONUSIDA)
Prévalence chez l’adulte
Europe occidentale 0,3%
Afrique subsaharienne
Zimbabwe Swaziland
5%20,9%33,4%
Définition
•Agent responsable: le VIH•Attaque du système immunitaire•Lymphocytes T•Monocytes•Macrophages
•Agent responsable: le VIH•Attaque du système immunitaire•Lymphocytes T•Monocytes•Macrophages
Données épidémiologiques
Corécepteurs et tropisme viral
CD4i
CD4
gp120
gp41
Corécepteur
CD4i
CCR5 CXCR4
Virus R5 Virus X4Monocytes
MacrophagesLymphocytes T
Virus R5X4
Cellule
Source: Boehringer Ingelheim
binding to the CD4 receptor
Stephen Harrisonhttp://www.childrenshospital.org
Kwong et al., Nature, 1998Structure de gp120 en complexe avec un
fragment de CD4 et de 17b
Domaine externe
Domaine interne
Feuillet intermédiaire
LE RÔLE DES HÉPARANES SULFATE DANS L’INFECTION PAR
LE VIH
Cis infection
HS CD4
Macrophages +++ +
Lymphocyte T CD4+ + +++
Cellules épithéliales/endothélial
es +++ -
cellule CD4- (épithéliale)
Trans infection cellule CD4+
Transcytose
Barrière hématoencéphaliq
ue
(?)
(?)
Bobardt et al., Immunity, 2003Saphire et al., J. Virol., 2001Argyris et al., J. Virol., 2003Bobardt et al., J. Virol., 2004
Seuls les virus X4 fixent l’héparine
Baba et al., Antimicrob Agents Chemother, 1988
DEPUIS : composés polyanioniques testés pour inhiber le VIH
résultats mitigés
Fin des années 80: l’héparine inhibe le VIH, in vitro
-1000
100200300400500600700800
0 200 400 600 800
Time (s)
Res
pon
se (
RU
)
-1000
100200300400500600700800
0 200 400 600 800
Res
pon
se (R
U)
Time (s)
virus X4 (MN) virus R5 (JRFL)
Héparine Héparine
Lortat-Jacob et al., Virologie, 2005Vivès et al., J. Biol. Chem, 2005
Moulard et al., J. Virol., 2000
gp120 interagit avec les HS via sa boucle V3
Expériences de destruction des HS cellulairesRoderiquez et al., J. Virol., 1995
Virus R5
Virus X4
Boucle V3 basique (< +5)
Boucle V3 très basique (+7 à +10)
Moulard et al., J. Virol., 2000
gp120gp120 + CD4
Boucle V3Boucle V3
CD4i, site de fixation aux corécepteurs
CD4i, site de fixation aux corécepteurs
gp120
Lys 121
Arg 419
Lys 421
Lys 432
0
20
40
60
80
100
0 500 1000 1500
Temps (s)
gp120/CD4
gp120
X4
R5
Moulard et al., J. Virol., 2000Vivès et al., J. Biol. Chem, 2005
CD4i
HS
Les HS pourraient inhiber l’interaction
gp120/corécepteur
Approfondir les connaissances sur
l’interaction gp120/HS
Confirmer le rôle de CD4i dans l’interaction et
déterminer les résidus impliqués
Production et purification de gp120 et de ses formes mutées
Caractérisation fonctionnelle de gp120
Développement et optimisation d’une méthode d’identification des domaines protéiques
d’interaction avec l’héparine
•BIAcore•Tests cellulaires (chimiotaxie)•BIAcore•Tests cellulaires (chimiotaxie)
Etude du site CD4i de gp120 par mutagénèse dirigée
Production et purification de gp120 et de ses formes mutées
•Principe•Exemple de résultats: la chimiokine RANTES•Optimisation: élimination du support solide•Application à gp120
•Principe•Exemple de résultats: la chimiokine RANTES•Optimisation: élimination du support solide•Application à gp120
•Cellules d’insectes
Cellules S2 de drosophiles
Technologie « Baculovirus »
Optimisations
110 –Sf9
110 –
110 –
Sf21
HF
24h 48h 72h 96h 120h
Type cellulaire
Type cellulaire
Production en mini fermenteur (1L)infection de cellules Sf21 pendant 72h25 à 30 mg/L
130 –100 – 72 – 55 – 130 –
100 – 72 –
st 0h 24h 48h 72h 96h
Séquence signal
Séquence signal
melittine
egt
Echangeuse d’ions
Affinité
Exclusion
Rendements
SP sépharoseSP sépharose
Lentil lectineLentil lectine
600
mAU
400
200
0
0 10 20 30 40 50 60 mL
180 –130 –100 – 72 – 55 – 43 – 34 –
10 12 14 16 18 20 22 24
65 70 75 80 85 mL
mAU
350
300
250
200
150
100
50
0
10 11 12 13 14 15 16 7 18180 –130 –100 – 72 – 55 – 43 –
mAU 200 150 100 50 0
0 5 10 15 20 mL
Superdex 200
180 –130 –100 – 72 – 55 – 43 –
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Superdex 200Superdex 200
1 à 2 mg de protéine purifiée/L
Production et purification de gp120 et de ses formes mutées
Caractérisation fonctionnelle de gp120
Développement et optimisation d’une méthode d’identification des domaines protéiques
d’interaction avec l’héparine
•BIAcore•Tests cellulaires (chimiotaxie)•BIAcore•Tests cellulaires (chimiotaxie)
Etude du site CD4i de gp120 par mutagénèse dirigée
BIAcore
ass diss
eq
Res
pons
e (R
U)
CD4
gp120
200 nM
100 nM
50 nM
gp120 interagit avec CD4.Cette interaction induit l’exposition du site de fixation aux corécepteurs (CD4i)
gp120 interagit avec CD4.Cette interaction induit l’exposition du site de fixation aux corécepteurs (CD4i)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 100 200 300 400
Temps (s)
Rép
onse
(RU
)
gp120 wt 50nM
gp120 wt/CD4 50/50nM
17bgp120
gp120+CD4
Kd: 8 nM
YCD417b
17b: anticorps anti-CD4i
Chimiotaxie
gp120 n’induit pas les voies de signalisation en aval de CXCR4
gp120 n’induit pas les voies de signalisation en aval de CXCR4
Insert TranswellChambre supérieureMembrane poreuseChambre inférieure
Cellules CXCR4+
SDF-1 ou gp120/CD4
Cell. mammifères Cell. d’insectes
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0,3 3 2 20 200 2 20 200 (nM)
% m
igra
tio
n
SDF-1 gp120 LAI/CD4 (200 nM)
gp120 HXBc2 (labo)/CD4 (200 nM)
Production et purification de gp120 et de ses formes mutées
Caractérisation fonctionnelle de gp120
Développement et optimisation d’une méthode d’identification des domaines protéiques
d’interaction avec l’héparine
Etude du site CD4i de gp120 par mutagénèse dirigée
•Principe•Exemple de résultats: la chimiokine RANTES•Optimisation: élimination du support solide•Application à gp120
•Principe•Exemple de résultats: la chimiokine RANTES•Optimisation: élimination du support solide•Application à gp120
Héparine
Vivès RR. et al., J. Biol.Chem., 2004
Crublet E. and Vivès RR., New developments in therapeutic glycomics, 2006
Séquençage N-terminal
Principe de la méthode des
« billes »
Domaines basiques
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
“méthode des billes”
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
Digestion à la thermolysineRANTES (9-68)~300nM
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
Fragment 3LG4/5 de la laminine-5, protéine matricielle
Glycoprotéine d’enveloppe gC du virus de la pseudo rage
PrincipeBUTS - s’affranchir du support billes - choisir des oligosaccharides de taille et de structure définies
BUTS - s’affranchir du support billes - choisir des oligosaccharides de taille et de structure définies
Héparine ou oligosaccharide
B
Purification des complexes peptides/héparine sur une résine de DEAE
MRVKEKYQHLWRWGWRWGTMLLGMLMICSATEKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEVVLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNTNSSSGRMIMEKGEIKNCSFNISTS IRGKVQKEYAFFYKLDIIPIDNDTTSYKLTSCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGF AILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSVNFTDNAKTIIVQLNTSVEINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQIASKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQIINMWQKVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNSNNESEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQ REKR
MRVKEKYQHLWRWGWRWGTMLLGMLMICSATEKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEVVLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNTNSSSGRMIMEKGEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFFYKLDIIPIDNDTTSYKLTSCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGFAILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSVNFTDNAKTIIVQLNTSVEINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQIASKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQIINMWQKVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNSNNESEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKR
V3
•Rôle dans le clivage de gp160 en gp120 et gp41.
•Interaction C-ter/héparine nécessaire au clivage
C-ter•proche du site CD4i
•réarrangements structuraux sous l’influence de CD4, aboutissant à l’exposition de CD4i
V3V1/V2
C
CD4i
V1/V2•Site d’interaction avec les HS déjà caractérisé (Arg298)
•Impliquée dans le choix du corécepteur
V3
KIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRXXXXX
gp41gp120
Site de clivage (Furine)
•Participation à l’attachement du virus aux HS des cellules (virus Sindbis)C-ter
Production et purification de gp120 et de ses formes mutées
Caractérisation fonctionnelle de gp120
Développement et optimisation d’une méthode d’identification des domaines protéiques
d’interaction avec l’héparine
Etude du site CD4i de gp120 par mutagénèse dirigée
Lys 121
Arg 419
Lys 421
Lys 432
180 –130 – 100 –
wt 121 419 421 432 2M 3M 4M
2M: R419S-K421S3M: K121S-R419S-K421S4M: K121S-R419S-K421S-K432S
Héparine
RésiduParticipation à l’interaction
avec l’héparine
K121 -
R419 +++
K421 +++
K432 +++
17b
Y
RésiduParticipation à l’interaction
avec l’héparine
K121 -
R419 +++
K421 +++
K432 ++
o Identification des domaines d’interaction de gp120 avec l’héparine
boucle V3 (K305)
Site CD4i (R419, K421et K432)
Deux autres domaines
•V1/V2 (K168)•C-ter (K499)
o Mise au point d’une méthode permettant d’identifier les domaines d’une protéine interagissant avec l’héparine
Détection simple et rapide de domaines d’interaction
Nombreuses protéines testées: RANTES, gp120, gC, laminine, Adam12, prp, AT-III…
o Développement de systèmes de production et purification
Baculovirus: système optimisé pour la production de gp120
Purification en trois étapes: protéine pure à 90-95%
CD4
HS
CD4CD4
CD4i
o Caractérisation structurale et fonctionnelle des domaines V1/V2 et C-ter
o Développement d’un inhibiteur de l’entrée virale, dérivé des HS
o Etude de l’interaction gp120/corécepteurs
o Etude du rôle physiologique des HS dans l’infection des cellules cibles
Existence de cluster corécepteurs/HS?Infectiosité de virus mutés sur CD4i?
o Etude des motifs saccharidiques de l’interaction gp120/sucre
LES GAGOPHILES
oHuguesoRomain
oRabiaoPascaloStéphaneoCédric
LE LEM CANAL HISTORIQUE
oJP Andrieu
oEvelyne GOUToIsabelle BALLYoEt tous les autres…
INSTITUT PASTEUR, PARIS
oF. Arenzana-SeisdedosoP. Rueda QuerooF. Baleux
UNIVERSITY OF OXFORD
oQ. Sattentau
MES AMIS ET MA FAMILLE…
CERMAV, GRENOBLE
oA. Imberty
ANRS
Sidaction