Elodie Laine

Analyse de l’Activation du Facteur Oedémateux de Bacillus anthracis par la Calmoduline, en vue de la Recherche d’Inhibiteurs

Elodie Laine

Dr. Thérèse MalliavinDr. Arnaud BlondelEcole doctorale iVIV, Université Pierre et Marie CurieUnité de Bioinformatique Structurale, Institut Pasteur (M. Nilges)

2

La bactérie Gram+ Bacillus anthracis est l’agent pathogène du charbon (anthrax).

3 formes de contamination cutanée (plaie) intestinale (ingestion) pulmonaire (inhalation)

Introduction

I. Stabilité del’interactionEF-CaM

II. Aspectsdynamiquesénergétiques

III. Recherched’inhibiteurs

Conclusion

Contexte biologique

B. anthracis a la particularité de former des spores très résistantes, qui se propagent facilement dans l’air et dans l’eau (risque bioterroriste).

Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Liddington et al. 2002

3Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009

Introduction




Conclusion

La virulence de B. anthracis est associée à :1 capsule + 2 toxines (PA-EF/LF)

Facteur oedémateux

Activationpar CaM

Productiond’AMPc

Translocation

PA : antigène protecteur LF : facteur létal EF : facteur oedémateux


Introduction




Conclusion

Le complexe EF-CaM

EF CaM EF-CaM+

Drum et al. 2002 (1K8T) Drum et al. 2002 (1K93)

Calmoduline Senseur du calcium 148 résidus, très flexible 2 lobes + 1 linker central

N-CaM

C-CaM

S1S2

S3

S4


Introduction




Conclusion

Architecture du complexe

Hel N-CaM

C-CaM

SC

SB

SACA

CB


Introduction




Conclusion

Questions biologiques :

Influences mises en jeu au sein du complexe EF-CaM rôle des ions calcium mécanismes de l’interaction protéique organisation du réseau de résidus

Mobilité structurale de la protéine EF large transition conformationnelle relation avec la fonction enzymatique recherche rationnelle d’inhibiteurs de la toxine

Méthodes :Simulations de dynamique moléculaireDétermination de chemin de réactionCriblage virtuel & validation expérimentale

Problématiques

7

Introduction




Conclusion

I. Stabilité de l’interaction protéique EF-CaM a. Simulations de dynamique moléculaire du complexe b. Plasticité conformationnelle de CaM c. Affinité de CaM pour le calcium

II. Aspects dynamiques et énergétiques du complexe a. Réseau élastique b. Corrélations généralisées c. Influences énergétiques

III. Recherche d’inhibiteurs de EF a. Chemin d’activation de EF b. Définition d’une poche de liaison potentielle c. Criblage virtuel et tests enzymatiques


Plan


Introduction




Conclusion

Plan




9

Introduction

I. Stabilité del’interactionEF-CaM a. Simulations

b. Plasticité de CaM

c. Affinitéde CaM pour le calcium



Conclusion


Influence du calcium

S2 S1

S4 S3

Drum et al. 2002 (1K93)

Ulmer et al. 2003

Le niveau de calcium influence la stabilité, voire la formation, du complexe EF-CaM.

Affinité de la calmoduline pour le calcium

N-CaM

C-CaM


Introduction






Conclusion

1k93-0Ca

Superposition de 4Ca-CaM + phase d’équilibration sous contraintes

0Ca 2Ca 4CaNombre de contre-ions 13 9 5

Dimensions de la boîte d’eau (Ǻ3) 123.9 x 81.9 x 99.2

Nombre de molécules d’eau (TIP3P) 24 632 24 642 24 652

Nombre total d’atomes 83 851 83 879 83 907

champ de force AMBER (ff99), thermostat de Berendsen, PME

Simulations de dynamique moléculaire (DM) - 15 ns

Simulations DM

1k93-2Ca 1k93-4Ca


Introduction






Conclusion

Analyse de convergence - méthodeLyman & Zuckerman 2006

Sur l’ensemble de la trajectoire 1) conformation tirée au hasard 2) retrait des conformations à

moins de r = 2.5 Å

structures de référence

Sur chaque moitié de trajectoireChaque conformation est associéeà la structure de référence la plus proche

groupes de référence

9001-150003001-9000

1ere moitié 2eme moitié

12

Introduction






Conclusion

Dérive conformationnelle


Déviation par rapport à la structure initiale

Population des groupes de référence

La trajectoire 1k93-2Ca présente la plus petite dérive conformationnelle et un bon critère de convergence.

13

Plasticité de CaMAnalyse en composantes principales (ACP) des mouvements de CaM le long des trajectoires

Introduction






Conclusion



Introduction






Conclusion

+ Ca2+

Les mouvements de CaM sont plus collectifs et plus indépendants avec 0 ou 4 Ca2+. CaM agit comme un ressort qui maintient EF en conformation ouverte active.

Plasticité de CaM

- Ca2+

Mode ACP de plus forte amplitude

1k93-0Ca 1k93-2Ca 1k93-4Ca


Introduction






Conclusion

Chattopadyaya et al. 1992Zhang et al. 1995

motif EF-hand

La calmoduline et le calciumPatchs hydophobes

Chatt. et al. 1992

Meador et al.1992

fermé ouvert

16

Introduction






Conclusion


Coordination du calcium par CaM

N-CaM C-CaMS1 S2 S3 S4

1k93-0Ca - - - -1k93-2Ca - - 5.7 5.61k93-4Ca 3.1 4.5 5.6 5.7

Nombre moyen d’atomes d’oxygène coordonnant les ions calcium

La coordination des ions calcium est incomplète dans N-CaM.

Asp 3

Asp 1

Asn 5

Tyr 7

Glu 12

Site canonique

(distance à l’ion Ca2+ < 2.8 Å)

17

N-CaM

S1 (°) S2 (°)

1k93-0Ca 33.4 ± 3.9 62.6 ± 6.5

1k93-2Ca 41.2 ± 2.3 60.2 ± 7.3

1k93-4Ca 43.7 ± 7.2 75.7 ± 7.7

Introduction






Conclusion

Changements conformationnels de CaM


Ouverture des motifs EF-hands

θ

L’interaction avec EF requiert que C-CaM soit ouvert, chargé de calcium, et bloque N-CaM en conformation fermée.

θ

C-CaM

S3 (°) S4 (°)

1k93-0Ca 79.8 ± 3.8 94.8 ± 4.3

1k93-2Ca 74.4 ± 3.4 98.3 ± 3.8

1k93-4Ca 80.4 ± 2.7 101.0 ± 4.6

Introduction






Conclusion

1K93 1XFX

Drum et al. 2002 Shen et al. 2005

(EF)Hel

S1

S2

Structures cristallographiques

(CaM)

Elodie Laine - Soutenance de Thèse Institut Pasteur, 2 octobre 2009 18

(EF)Hel

(CaM)

S1S2

19

Changements conformationnels de CaMIntroduction






Conclusion


Ouverture des motifs EF-hands

Mise en évidence d’une influence du réseau d’interactions entre EF et N-CaM sur l’ouverture des sites de fixation au calcium.

θ

θ

N-CaM

S1 (°) S2 (°)

1k93-0Ca 33.4 ± 3.9 62.6 ± 6.5

1k93-2Ca 41.2 ± 2.3 60.2 ± 7.3

1k93-4Ca 43.7 ± 7.2 75.7 ± 7.7

1xfx-4Ca 36.7 ± 4.1 55.3 ± 4.5

C-CaM

S3 (°) S4 (°)

1k93-0Ca 79.8 ± 3.8 94.8 ± 4.3

1k93-2Ca 74.4 ± 3.4 98.3 ± 3.8

1k93-4Ca 80.4 ± 2.7 101.0 ± 4.6

1xfx-4Ca 79.3 ± 2.9 95.4 ± 2.8


Introduction






Conclusion

Glu 12

Glu 12

Asn 5

Asp 3

Asn 5

Distances au calcium dans les sites

EF contraint directement S1 dans les deux systèmes 1k93 et 1xfx. Le réseau plus dense d’interactions entre EF et N-CaM dans 1xfx contraint indirectement S2.

S1 S2

21

Introduction






Conclusion P : pas de dissociationC : dissociation commençanteD : dissociationLeandro Martinez

«Locally enhanced sampling» : augmenter la probabilité de dissociation du calcium en utilisant plusieurs copies de l’ion.

Simulations LES

- CHARMM version 33b2 (200ps)- potentiel ligand-protéine réduit- fonction sigmoïdale diélectrique


Copies1248

161820222426283032

S1PPPPCCC

4D7D

17D17D29D32D

S2PPPPPPCCC

1D4D8D

19D

S1PPPPCCCC

6D16D9D

22D32D

S2PPPPPPCCC

10D6D

29D32D

1k93 1xfx

22

Introduction






Conclusion


Calculs d’énergie libreCycle thermodynamique de disparition du calcium

1xfx 1xfx

1k93 1k93

∆Gdiss(Ca2+/1xfx)

∆Gdiss(Ca2+/1k93)

Intégration thermodynamique

(application d’une contrainte harmonique sur l’ion Ca2+)

1k93 ∆G (kcal/mol)

S1 318.43 ± 0.54

S2 323.28 ± 0.67

+

+

23

Introduction




Conclusion


Conclusion

Stabilité de la forme EF-(2Ca-CaM) en accord avec les données expérimentales

Modèle de l’interaction EF-CaM exemple d’une conformation inhabituelle de CaM

Influence mutuelle EF-CaM / Ca2+-CaM modulation par EF de l’affinité de CaM pour le calcium

Données quantitatives de l’affinité de CaM pour le calciumcalculs d’énergie libre (FEP, TI)

24

Introduction




Conclusion


Plan




25

Introduction


II. Aspectsdynamiquesénergétiquesa. Réseau élastique

b. Corrélationsdynamiques

c. Influences énergétiques


Conclusion


Architecture du complexe

Hel N-CaM

C-CaM

SC

SB

SACA

CB


Introduction






Conclusion

Bahar et al. (1997), Fold. Des.

Modèle de réseau élastiqueRéseau élastique

Simulations DM (Pearson)

La méthode ENM prédit correctement les fluctuations thermiques (0.90 < R² < 0.99), mais ne permet pas de distinguer les différents niveaux de calcium.

Les Cα distants de moins de 9 Ǻ sont connectés par des ressorts.

Lindahl et al. (2006),Nucl. Acids Res.

27

Introduction






Conclusion

Corrélations dynamiques - méthodeLange & Grubmüller (2006), Proteins


Coefficient de corrélation généralisée

Information mutuelle

Entropie de Shannon

Corrélations généralisées

Corrélations de Pearson

- mesure moins biaisée - rend compte des corrélations non linéaires

Classification hiérarchique

28

fortement corrélés (> 0.7)

Introduction






Conclusion


Corrélations dynamiquesFluctuations atomiques et groupes de résidus

100

non corrélés (< 0.5)moyennement corrélés (0.6 - 0.7)

1k93-0Ca

1k93-2Ca

1k93-4Ca

29

Introduction






Conclusion

CB

CA

SASC

Hel

C

N

Définition de pseudo-domaines

Les corrélations LFA permettent de redéfinir des pseudo-domaines.


Corrélations résiduelles de la méthode LFA

30

Srinivasan et al. (1998), J. Am. Chem. Soc.

Introduction






Conclusion

Influences énergétiques - méthode


Méthode MMPBSA

Mécanique moléculaire Eint + Evdw + Eele

Interactions polaires de solvatation

Poisson - Boltzmann

Interactions non polairesde solvatation

Surface Accessible

Entropie conformationnelleModes Normaux

31

Hamacher et al. (2006), PloS Comput. Biol.


Introduction






Conclusion

Si Rang-Y (X') moins bon que Rangref(X'), alors Y influence la stabilité de X' au sein du complexe. (intensité = nb de rangs perdus)

Influences énergétiques - méthode

Rang de réference Rangref

Calcule et range les énergies de liaison de chaque domaine X au reste du complexe.

Rang relatif Rang-Y

Calcule et range les énergies de liaison de chaque domaine X‘ au complexe amputé du domaine Y.

Cartes de dépendances énergétiques

CACBSASCHelNCaMCCaM

Rangref

6723541

Rang-Hel

4613-52

Introduction






Conclusion

Influences énergétiques

1k93-0Ca

1k93-2Ca

1k93-4Ca


Hiérarchie relative de stabilité des domaines au sein du complexe

1k93-2Ca : centrées, équilibrées1k93-0Ca : perte d’influences1k93-4Ca : plus diffuses

*

**

*

*

**

*

32


Introduction






Conclusion

La stabilité du complexe dépend de la connexité du réseau de résidus.

Connexité du réseau de résidus1k93-2Ca1k93-0Ca 1k93-4Ca

Influences énergétiques & corrélations dynamiques

*

*

*

*

*

**

*


ConclusionIntroduction




Conclusion

Architecture globale du complexemodèle de réseau élastique

Dynamique globale et localegroupes de résidus et domaines dynamiques

Connexité du réseau de résiduspropagation de l’information

Tests des modèles par l’expérienceprotéolyse, fluorescence, mutations

35

Introduction




Conclusion


Plan




36

Introduction



III. Recherched’inhibiteursa. Chemin d’activation

b. Identificationde la poche

c. Criblage virtuel et tests

Conclusion


Transition conformationnelle de EFTranslation de 15 ÅRotation de 30°

Boucle SB désordonnée

Drum et al. 2002 (1K8T et 1K93)

Détermination de chemin de réaction


Chemin : série de conformations qui ne sont séparées par aucune barrière énergétique.

Introduction






Conclusion

Chemin d’activation de EF - méthode

Fischer & Karplus (1992),Chem. Phys. Lett.

Arnaud Blondel

Cycle d’affinement : (i) réduction du nombre de conformations (ii) échantillonnage entre des paires de conformations, avec l’algorithme «Conjugate Peak Refinement» (CPR).

Premier jet : Simulations DM orientées


Introduction






Conclusion

Chemin de transition


Introduction






Conclusion

Analyse des mouvements de EF

Le chemin de transition de EF permet d’explorer des régions de l’espace conformationnel non atteignables par les simulations du complexe EF-CaM.

Analyse en composantes principales (ACP) des mouvements de EF le long du chemin


Introduction



III. Recherched’inhibiteursa. Chemind’activation



Conclusion

Lee et al. (2004)Chem Biol.

Site catalytique933 Å3

122 Å3

223 Å3

SABC450 Ǻ3

102 Å3

Identification de la poche

ICM PocketFinder – Trotov & Abagyan (2004), Genome Inform.

Recherche systématique de poches


Introduction






Conclusion

conf 1

conf 8

conf 28conf 47

Switch C

Switch B

Switch A

Identification de la poche

Stratégie : Sélectionner des molécules capables de se fixer sur la poche SABC dans la forme inactive de EF et de maintenir sa forme, bloquant ainsi l’activation.

42

Introduction






Conclusion


Abagyan et al. (1994), J. Comput. Chem.

Placement dufragment de base

Outils de criblage virtuel

FlexX

ICM

Rarey et al. (1996), J. Mol. Biol.

Configurationinitiale Rotation/Translation

aléatoire

E1 < E0 E0 E2 > E0

Rotation/Translationaléatoire

Application du critère de Metropolis

Reconstructionincrémentale

43

Introduction






Conclusion

Approche in silico / in vitro


Criblage Virtuel Validation expérimentale

Chimiothèque Nationale 28 000 mol.

1. Elagage S < m -

3500 mol.meilleur 1%

Conformations intermédiaires comme contrôles négatifs.

Sélection des meilleurs ligands.

Tests enzymatiques

18 composés testés

30% inhibent totalement l’activité de EF à des concentrations de 10-100 µM.

44

Introduction






Conclusion


CyaA

Inhibiteurs del’activité de EF(Ki ~ 2-3 µM)

activité enzymatique (1)

activité enzymatique (2)

Tests enzymatiques

Christophe Goncalves, Johanna KarstDaniel Ladant

EF

CaM

+ I

ATP

EF CaM+I ATP

FCH3-O

diClHBrCl

++++++

--+---

+++-++

(1) (2)

45

Introduction






Conclusion


Inhibition de CyaA

Boucle SC / queue C-term

Boucle SB /Boucle T300-K312

Boucle SA /Hélices F-G-H-H’

Comparaison des structures de EF et CyaA

Guo et al. 2005

SABC de EF : 16 résidus6 identiques, 5 similaires chez CyaA

46

Introduction






Conclusion


Inhibition de EF-CaMAnalyse des poches à la surface de EF le long des trajectoires DM du complexe EF-CaM

Poche résiduelle104-326 Å3

Site catalytique

47

Introduction




Conclusion


Conclusion

Modélisation d’une transition complexeconformations intermédiaires plausibles

Définition d’un site de liaison potentielstratégie innovante : cibler une poche allostérique

Identification d’inhibiteursnouvelle famille de composés, affinités de quelques µM

Caractérisation du mode de liaison des composésrésolution d’une structure co-cristallisée

48

Introduction




Conclusion


Conclusion générale et perspectives Influences mises en jeu au sein du complexe EF-CaM modèle de l’interaction EF-CaM influence mutuelle entre les interactions EF-CaM et Ca2+-CaM modèle de l’effet du calcium sur le réseau de résidus

Mobilité structurale de la protéine EF chemin plausible de transition conformationnelle modulation de l’activité enzymatique par effet allostérique identification d’une nouvelle famille d’inhibiteurs

Extrapolation à la toxine CyaA de B. pertussis caractéristiques différentes de EF mécanismes de l’activation par CaM déterminants de l’affinité des inhibiteurs


RemerciementsBenjamin BardiauxGiacomo Bastianelli

Aymeric BernardRenée Communal

Pak-Lee ChauClaire Colas

Nathalie DuclertJulia FormanDavid Giganti

Christophe GoncalvesTru Huynh

Leandro Martínez (Brésil)Olivier PerinEdithe Selwa

Edouard YeramianArnaud Blondel

Thérèse MalliavinMichael Nilges

Unité Biochimie des Interactions MacromoléculairesAlexandre Chenal

Johanna KarstDaniel Ladant

University of ChicagoWei-Jen Tang

CERMNAurélien Lesnard

Sylvain Rault

Claire DaneGilles Vergnaud

B I

S

Universidade Federal FluminenseJulliane Yoneda


50

Equilibration 1k93-4CaDistances de coordination du calcium dans S1 et S2

* : contraintes de distance de 10 kcal/mol/Å2

51

Plasticité de EF


Modes (1 et 2) PCA de EF


52

Changements conformationnels de CaMExposition des patches hydrophobes

C CC

C

NNNN

C

C

N

N


53

Réseau d’interactions EF-(N-CaM)


54

Matrice de Kirchhoff Fluctuations prédites

Réseau élastique et corrélation

Similarités entre matrices de corrélations


55

Classification hiérarchique


56

Corrélations généralisées - classificationClassification hiérarchique des résidus en fonction de leurs corrélations généralisées

57

Zhang & Wriggers (2006), Proteins

Dynamique locale - méthode

Analyse locale des traits caractéristiques

(LFA)


Analyse en composantes principales

(ACP)

Information par mode(globale)

Réduction de dimensionalité(15 modes = 81-84 % fluct.)

Information par degré de liberté (locale)

Réduction de dimensionalité ?algorithme de clairsemage

Le formalisme LFA permet d’identifier des résidus « graines », autour desquels s’articulent des domaines dynamiques locaux.

58

Dynamique locale Polarisation du site catalytique autour de deux spots.

Propagation du signal calcium le long de CaM.



59

Test de Kolmogorov-Smirnov Test non paramétrique : pas d’hypothèse sur la nature des données

Tester si deux échantillons sont issus de la même distribution

H0 : les deux échantillons proviennent d’une même distributionH1 : les deux échantillons proviennent de distribution différentes

P-value = probabilité d’observer les échantillons sous l’hypothèse nulle.

Principe : comparaison des fonctions de répartition empiriques

F(x) = P(X<x) = 1/n ∑ δxi<x


60

Contributions MMPBSAEnergies libres de liaison de référence 1k93-2Ca


61

Contributions MMPBSADifférences d’énergies libres de liaison


62

Caractéristiques du chemin

Historique de l’affinement Chemin final


63

Similarités de formes – ROCS


64

Structural interaction fingerprints


65

Robustesse de la poche

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