N° d’ordre 2006-ISAL-0016 année 2006

THESE Présentée

DEVANT L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

Pour obtenir

LE GRADE DE DOCTEUR

Formation doctorale : Biochimie

Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé

Par

Catherine GIROTTI-CHANU

ÉTUDE DE LA LIPOLYSE ET DE LA SYNTHÈSE DE COMPOSÉS DU

DERME SOUS L’EFFET DE LA CIRSIMARINE, FLAVONE EXTRAITE DE

MICROTEA DEBILIS

Soutenue le 22 mars 2006 devant la Commission d’examen

Jury : Mr le Pr Pierre CLOUET Mr le Pr Philippe HUMBERT Mr le Dr Bernard WENIGER Mr le Pr Michel LAGARDE Mr le Dr Frédéric DEMARNE Mr le Dr Alain GÉLOËN

Cette thèse a été préparée au laboratoire Physiologie des Lipides et Membranes (PLM), UMR 585 INSERM / INSA-Lyon, en collaboration avec l’Institut de Biologie et Chimie des Protéines (IBCP), UMR 5086 CNRS / UCBL et la société GATTEFOSSE, Service Recherche et Développement.

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Novembre 2003 INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON Directeur : STORCK A. Professeurs : AMGHAR Y. LIRIS AUDISIO S. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE BABOT D. CONT. NON DESTR. PAR RAYONNEMENTS IONISANTS BABOUX J.C. GEMPPM*** BALLAND B. PHYSIQUE DE LA MATIERE BAPTISTE P. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BARBIER D. PHYSIQUE DE LA MATIERE BASKURT A. LIRIS BASTIDE J.P. LAEPSI**** BAYADA G. MECANIQUE DES CONTACTS BENADDA B. LAEPSI**** BETEMPS M. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE BIENNIER F. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BLANCHARD J.M. LAEPSI**** BOISSE P. LAMCOS BOISSON C. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE BOIVIN M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES BOTTA H. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOTTA-ZIMMERMANN M. (Mme) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOULAYE G. (Prof. émérite) INFORMATIQUE BOYER J.C. MECANIQUE DES SOLIDES BRAU J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Thermique du bâtiment BREMOND G. PHYSIQUE DE LA MATIERE BRISSAUD M. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE BRUNET M. MECANIQUE DES SOLIDES BRUNIE L. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION BUFFIERE J-Y. GEMPPM*** BUREAU J.C. CEGELY* CAMPAGNE J-P. PRISMA CAVAILLE J.Y. GEMPPM*** CHAMPAGNE J-Y. LMFA CHANTE J.P. CEGELY*- Composants de puissance et applications CHOCAT B. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine COMBESCURE A. MECANIQUE DES CONTACTS COURBON GEMPPM COUSIN M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures DAUMAS F. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et Thermique DJERAN-MAIGRE I. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL DOUTHEAU A. CHIMIE ORGANIQUE DUBUY-MASSARD N. ESCHIL DUFOUR R. MECANIQUE DES STRUCTURES DUPUY J.C. PHYSIQUE DE LA MATIERE EMPTOZ H. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION ESNOUF C. GEMPPM*** EYRAUD L. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE FANTOZZI G. GEMPPM*** FAVREL J. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS FAYARD J.M. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS FAYET M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES FAZEKAS A. GEMPPM FERRARIS-BESSO G. MECANIQUE DES STRUCTURES FLAMAND L. MECANIQUE DES CONTACTS FLEURY E. CITI FLORY A. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATIONS FOUGERES R. GEMPPM*** FOUQUET F. GEMPPM*** FRECON L. (Prof. émérite) REGROUPEMENT DES ENSEIGNANTS CHERCHEURS ISOLES GERARD J.F. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES GERMAIN P. LAEPSI**** GIMENEZ G. CREATIS** GOBIN P.F. (Prof. émérite) GEMPPM*** GONNARD P. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GONTRAND M. PHYSIQUE DE LA MATIERE GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS** GOUJON L. GEMPPM***

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GOURDON R. LAEPSI****. GRANGE G. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GUENIN G. GEMPPM*** GUICHARDANT M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE GUILLOT G. PHYSIQUE DE LA MATIERE GUINET A. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS GUYADER J.L. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE GUYOMAR D. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE HEIBIG A. MATHEMATIQUE APPLIQUEES DE LYON JACQUET-RICHARDET G. MECANIQUE DES STRUCTURES JAYET Y. GEMPPM*** JOLION J.M. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION Novembre 2003 JULLIEN J.F. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures JUTARD A. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE KASTNER R. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique KOULOUMDJIAN J. (Prof. émérite) INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION LAGARDE M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LALANNE M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES STRUCTURES LALLEMAND A. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LALLEMAND M. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LAREAL P (Prof. émérite) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique LAUGIER A. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE LAUGIER C. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LAURINI R. INFORMATIQUE EN IMAGE ET SYSTEMES D’INFORMATION LEJEUNE P. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE LUBRECHT A. MECANIQUE DES CONTACTS MASSARD N. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE MAZILLE H. (Prof. émérite) PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MERLE P. GEMPPM*** MERLIN J. GEMPPM*** MIGNOTTE A. (Mle) INGENIERIE, INFORMATIQUE INDUSTRIELLE MILLET J.P. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MIRAMOND M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine MOREL R. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ET D’ACOUSTIQUES MOSZKOWICZ P. LAEPSI**** NARDON P. (Prof. émérite) BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS NAVARRO Alain (Prof. émérite) LAEPSI**** NELIAS D. LAMCOS NIEL E. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE NORMAND B. GEMPPM NORTIER P. DREP ODET C. CREATIS** OTTERBEIN M. (Prof. émérite) LAEPSI**** PARIZET E. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PASCAULT J.P. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES PAVIC G. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PECORARO S. GEMPPM PELLETIER J.M. GEMPPM*** PERA J. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Matériaux PERRIAT P. GEMPPM*** PERRIN J. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PINARD P. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE PINON J.M. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION PONCET A. PHYSIQUE DE LA MATIERE POUSIN J. MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE PREVOT P. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PROST R. CREATIS** RAYNAUD M. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux REDARCE H. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE RETIF J-M. CEGELY* REYNOUARD J.M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures RICHARD C. LGEF RIGAL J.F. MECANIQUE DES SOLIDES RIEUTORD E. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ROBERT-BAUDOUY J. (Mme) (Prof. émérite) GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES ROUBY D. GEMPPM*** ROUX J.J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON – Thermique de l’Habitat RUBEL P. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION SACADURA J.F. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux SAUTEREAU H. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SCAVARDA S. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE SOUIFI A. PHYSIQUE DE LA MATIERE SOUROUILLE J.L. INGENIERIE INFORMATIQUE INDUSTRIELLE

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THOMASSET D. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE THUDEROZ C. ESCHIL – Equipe Sciences Humaines de l’Insa de Lyon UBEDA S. CENTRE D’INNOV. EN TELECOM ET INTEGRATION DE SERVICES VELEX P. MECANIQUE DES CONTACTS VERMANDE P. (Prof émérite) LAEPSI VIGIER G. GEMPPM*** VINCENT A. GEMPPM*** VRAY D. CREATIS** VUILLERMOZ P.L. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE Directeurs de recherche C.N.R.S. : BERTHIER Y. MECANIQUE DES CONTACTS CONDEMINE G. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE COTTE-PATAT N. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE ESCUDIE D. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON FRANCIOSI P. GEMPPM*** MANDRAND M.A. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE POUSIN G. BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE ROCHE A. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SEGUELA A. GEMPPM*** VERGNE P. LaMcos Directeurs de recherche I.N.R.A. : FEBVAY G. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS GRENIER S. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS RAHBE Y. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. : KOBAYASHI T. PLM PRIGENT A.F. (Mme) BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE MAGNIN I. (Mme) CREATIS** * CEGELY CENTRE DE GENIE ELECTRIQUE DE LYON ** CREATIS CENTRE DE RECHERCHE ET D’APPLICATIONS EN TRAITEMENT DE L’IMAGE ET DU SIGNAL ***GEMPPM GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX ****LAEPSI LABORATOIRE D’ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DES PROCEDES ET SYSTEMES INDUSTRIELS

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SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE

CHIMIE DE LYON

M. Denis SINOU Université Claude Bernard Lyon 1 Lab Synthèse Asymétrique UMR UCB/CNRS 5622 Bât 308 2ème étage 43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.44.81.83 sinou@univ-lyon1.fr

E2MC

ECONOMIE, ESPACE ET MODELISATION DES COMPORTEMENTS

M. Alain BONNAFOUS Université Lyon 2 14 avenue Berthelot MRASH Laboratoire d’Economie des Transports 69363 LYON Cedex 07 Tél : 04.78.69.72.76 Alain.Bonnafous@mrash.fr

E.E.A.

ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE

M. Daniel BARBIER INSA DE LYON Laboratoire Physique de la Matière Bâtiment Blaise Pascal 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.64.43 Daniel.Barbier@insa-lyon.fr

E2M2

EVOLUTION, ECOSYSTEME, MICROBIOLOGIE, MODELISATION http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2

M. Jean-Pierre FLANDROIS UMR 5558 Biométrie et Biologie Evolutive Equipe Dynamique des Populations Bactériennes Faculté de Médecine Lyon-Sud Laboratoire de Bactériologie BP 1269600 OULLINS Tél : 04.78.86.31.50 Jean-Pierre.Flandrois@biomserv.univ-lyon1.fr

EDIIS

INFORMATIQUE ET INFORMATION POUR LA SOCIETE http://www.insa-lyon.fr/ediis

M. Lionel BRUNIE INSA DE LYON EDIIS Bâtiment Blaise Pascal 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.60.55 lbrunie@if.insa-lyon.fr

EDISS

INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE http://www.ibcp.fr/ediss

M. Alain Jean COZZONE IBCP (UCBL1) 7 passage du Vercors 69367 LYON Cedex 07 Tél : 04.72.72.26.75 cozzone@ibcp.fr

MATERIAUX DE LYON http://www.ec-lyon.fr/sites/edml

M. Jacques JOSEPH Ecole Centrale de Lyon Bât F7 Lab. Sciences et Techniques des Matériaux et des Surfaces 36 Avenue Guy de Collongue BP 163 69131 ECULLY Cedex Tél : 04.72.18.62.51 Jacques.Joseph@ec-lyon.fr

Math IF

MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE FONDAMENTALE http://www.ens-lyon.fr/MathIS

M. Franck WAGNER Université Claude Bernard Lyon1 Institut Girard Desargues UMR 5028 MATHEMATIQUES Bâtiment Doyen Jean Braconnier Bureau 101 Bis, 1er étage 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43.27.86 wagner@desargues.univ-lyon1.fr

MEGA

MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE CIVIL, ACOUSTIQUE http://www.lmfa.ec-lyon.fr/autres/MEGA/index.html

M. François SIDOROFF Ecole Centrale de Lyon Lab. Tribologie et Dynamique des Systêmes Bât G8 36 avenue Guy de Collongue BP 163 69131 ECULLY Cedex Tél :04.72.18.62.14 Francois.Sidoroff@ec-lyon.fr

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Je remercie le Professeur Pierre CLOUET, le Professeur Philippe HUMBERT ainsi que le Docteur Bernard WENIGER d’avoir accepté d’être rapporteurs de ce travail. Je remercie le Professeur Michel LAGARDE pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire ainsi que pour l’intérêt et la contribution apportés à ce travail. Je remercie la société GATTEFOSSE de m’avoir donné les moyens de mener à bien mon travail de thèse dans les meilleures conditions. Je remercie le Professeur Claire LETHIAS et le Docteur Jean-Yves EXPOSITO pour la qualité de leur accueil lors de mon passage dans leur laboratoire, ainsi que pour leur expertise technique et leurs nombreux conseils. Je remercie les Docteurs Alain GELOEN et Frédéric DEMARNE pour leur soutien, leur aide scientifique et technique, ainsi que pour leurs nombreux conseils. Je remercie Françoise DUROUSSET, Estelle BONNET-BLANES et Christelle SWIATHOWSKI pour leur efficacité dans le traitement de mes recherches documentaires ainsi que pour leurs précieux conseils. Je remercie Anne-Emmanuelle GUISE-GANZ, Virginie CHARTON ainsi que le Docteur Ghislaine PASSARO pour leur regard critique lors de la relecture de ce travail. Je remercie le Docteur Elisabeth PEYROT, le Docteur Ghislaine PASSARO, Virginie Charton, Jean-David Rodier, Anne-Emmanuelle GUISE-GANZ, Estelle BONNET-BLANES et Nathalie Launay pour leur aide dans l’élaboration de ma présentation orale. Je remercie Estelle BONNET-BLANES et Nathalie LAUNAY pour leur soutien dans les semaines qui ont précédées la soutenance.

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1. INTRODUCTION ............................................................................................16

1.1. LE METABOLISME LIPIDIQUE ............................................................................ 18 1.1.1. LA LIPOLYSE ............................................................................................... 18 1.1.2. LA LIPOGENESE............................................................................................ 22 1.2. LA PEAU ET LA MATRICE EXTRACELLULAIRE .......................................................... 23 1.2.1. LA PEAU : ORGANISATION STRUCTURALE............................................................... 23 1.2.2. LA MATRICE EXTRACELLULAIRE .......................................................................... 26 1.3. LES FLAVONOÏDES.......................................................................................... 32 1.3.1. GENERALITES SUR LES FLAVONOÏDES................................................................... 32 1.3.2. PROPRIETES BIOLOGIQUES DES FLAVONOÏDES......................................................... 33 1.4. LE STRESS OXYDANT....................................................................................... 36

2. CARACTERISATION ET DOSAGE DE LA CIRSIMARINE....................................38

2.1. MATERIELS ET METHODES ................................................................................ 38 2.1.1. CARACTERISATION ET IDENTIFICATION DE LA CIRSIMARINE.......................................... 38 2.1.2. METHODES DE DOSAGE................................................................................... 38 2.2. RESULTATS ET CONCLUSIONS............................................................................ 40 2.2.1. IDENTIFICATION DE LA CIRSIMARINE.................................................................... 40 2.2.2. METHODES DE DOSAGE................................................................................... 42 2.2.3. PREPARATION DE L’ETALON .............................................................................. 44

3. CARACTERISATION, EXTRACTION DU VEGETAL ET MISE AU POINT D’UN EXTRAIT SOUS FORME DE POUDRE TITREE EN CIRSIMARINE ............................45

3.1. MATERIELS ET METHODES ................................................................................ 45 3.1.1. CHOIX DE LA PLANTE...................................................................................... 45 3.1.2. CHOIX DES CONDITIONS D’EXTRACTION................................................................ 48 3.1.3. DECOLORATION DES EXTRAITS VEGETAUX.............................................................. 49 3.1.4. MISE AU POINT D’UN EXTRAIT SOUS FORME POUDRE.................................................. 52 3.2. RESULTATS ET CONCLUSIONS............................................................................ 53 3.2.1. CHOIX DES CONDITIONS D’EXTRACTION................................................................ 53 3.2.2. CHOIX DE LA TECHNIQUE DE DECOLORATION DE L’EXTRAIT VEGETAL ............................... 55

4. EFFETS DE LA CIRSIMARINE ET D’UN EXTRAIT VEGETAL SUR LE METABOLISME LIPIDIQUE..................................................................................61

4.1. EFFETS DE LA CIRSIMARINE ET D’UN EXTRAIT VEGETAL SUR LA LIPOLYSE .................... 61 4.1.1. MODELE D’ADIPOCYTES ISOLES DE RAT................................................................. 61 4.1.2. MODELE ADIPOCYTES ISOLES HUMAINS................................................................. 64 4.1.3. MODELE EXPLANTS DE PEAU HUMAINE .................................................................. 68 4.1.4. ACTIVITE DE LA CIRSIMARINE SUR LA PHOSPHODIESTERASE ......................................... 74 4.2. EFFETS DE LA CIRSIMARINE ET D’UN EXTRAIT VEGETAL SUR LA LIPOGENESE ................ 77 4.2.1. MATERIELS ET METHODES ................................................................................ 77 4.2.2. RESULTATS ................................................................................................ 77

5. EFFETS DE LA CIRSIMARINE ET D’UN EXTRAIT VEGETAL SUR LA MATRICE EXTRACELLULAIRE .............................................................................................80

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5.1. ÉTUDE PAR PUCES A ADN................................................................................ 80 5.1.1. MATERIELS ET METHODES ................................................................................ 81 5.1.2. RESULTATS ................................................................................................ 87 5.2. ÉTUDE PAR RT-Q-PCR................................................................................... 90 5.2.1. MATERIELS ET METHODES ................................................................................ 92 5.2.2. RESULTATS ................................................................................................ 96 5.3. EXPRESSION MOLECULAIRE .............................................................................. 97 5.3.1. MATERIELS ET METHODES ................................................................................ 97 5.3.2. RESULTATS .............................................................................................. 102

6. EFFET ANTI-OXYDANT DE LA CIRSIMARINE................................................107

6.1. MATERIELS ET METHODES .............................................................................. 107 6.1.1. ÉTUDE DES ACTIVITES ANTI-OXYDANTES SUR UN MODELE ACELLULAIRE.......................... 107 6.1.2. ÉTUDE DES ACTIVITES ANTI-OXYDANTES SUR UN MODELE PHYSIOLOGIQUE ...................... 108 6.2. RESULTATS ................................................................................................ 109 6.2.1. ÉTUDE DES ACTIVITES ANTI-OXYDANTES SUR UN MODELE ACELLULAIRE.......................... 109 6.2.2. ÉTUDE DES ACTIVITES ANTI-OXYDANTES SUR UN MODELE PHYSIOLOGIQUE ...................... 111

7. DISCUSSION SUR LES PROPRIETES BIOLOGIQUES DE LA CIRSIMARINE ET D’UN EXTRAIT VEGETAL ...................................................................................114

7.1. ACTIVITES DE LA CIRSIMARINE ET D’UN EXTRAIT VEGETAL SUR LE METABOLISME LIPIDIQUE

…………... ........................................................................................................ 114 7.1.1. ACTIVITE LIPOLYTIQUE DE LA CIRSIMARINE ET D’UN EXTRAIT VEGETAL ........................... 114 7.1.2. ACTIVITE ANTI-LIPOGENIQUE DE LA CIRSIMARINE ET D’UN EXTRAIT VEGETAL.................... 118 7.1.3. FLAVONOÏDES ET VOIES DE SIGNALISATION.......................................................... 119 7.2. ACTIVITE DE LA CIRSIMARINE ET D’UN EXTRAIT VEGETAL SUR LA SYNTHESE DE PROTEINES

DE LA MATRICE EXTRACELLULAIRE ........................................................................... 122 7.3. ACTIVITE ANTI-OXYDANTE DE LA CIRSIMARINE .................................................. 124

8. PERSPECTIVES............................................................................................126

9. BIBLIOGRAPHIE..........................................................................................127

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Index des figures

Figure 1 : Représentation schématique du tissu adipeux sous-cutané ………………………..p 16 Figure 2 : Contrôle de la lipolyse…………………………………………………………………………………….p 19 Figure 3 : Structure de la peau humaine………………………………………………………………………..p 23 Figure 4 : Schéma de la jonction dermo-épidermique……………………………………………………p 25

Figure 5 : Formation des fibres de collagènes……………………………………………………………….p 28 Figure 6 : Représentation de la décorine……………………………………………………………………….p 30 Figure 7 : Squelette de base des flavonoïdes…………………………………………………………….….p 32 Figure 8 : Action de flavonoïdes sur les cyclo-oxygénases et lipoxygénases……………….p 35 Figure 9 : Formule de la cirsimarine…………………………………………….…………………………….….p 38 Figure 10 : Droite étalon permettant le dosage de la cirsimarine par HPTLC………..…...p 42 Figure 11 : Droite étalon permettant le dosage de la cirsimarine par HPLC…………………p 43 Figure 12 : Sélection du solvant d’extraction .……………………………………………………………….p 53 Figure 13 : Sélection de la température d’extraction …………………………………………………..p 54 Figure 14 : Sélection de la durée de l’extraction …………………………………………………………..p 55 Figure 15 : Comparaison de l’activité lipolytique de la cirsimarine et de la caféine sur adipocytes isolés de rat…………………………………………………………………………………………….…….p 63 Figure 16 : Activité lipolytique de la cirsimarine et de la caféine sur adipocytes isolés humains. Etude 1…………………………………………………………………………………………………………….p 65 Figure 17 : Comparaison de l’activité lipolytique théorique et observée de l’association caféine et cirsimarine……………………………………………………………………………………………………….p 66 Figure 18 : Activité lipolytique de la cirsimarine et de la caféine sur adipocytes isolés humains. Etude 2…………………………………………………………………………………………………………….p 67 Figure 19 : Activité lipolytique de la cirsimarine et de la caféine sur adipocytes isolés humains. Etude 3…………………………………………………………………………………………………………….p 68 Figure 20 : Activité lipolytique de la caféine et de l’extrait de Microtea debilis Sw. sur explants de peau humaine. Étude 1……………………………………………………………………………….p 71 Figure 21 : Activité lipolytique de la caféine et de l’extrait de Microtea debilis Sw. sur explants de peau humaine. Étude2…………………………………………………..………………………..…p 72 Figure 22 : Activité lipolytique de la caféine et de l’extrait de Microtea debilis Sw. sur explants de peau humaine. Étude 3………………………………………………………………………………p 73 Figure 23 : Inhibition de la caféine et de la cirsimarine sur la phosphodiestérase….….p 75

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Figure 24 : Activité lipogénique de la cirsimarine comparée à celle d’une référence positive …………………………………………………………………………………………………………………………….p 78 Figure 25 : Activités lipogéniques de la cirsimarine et de l’extrait de Microtea debilis Sw. ………………………………………………………………………………………………………………………………………….p 79 Figure 26 : Electrophorèse d’un échantillon d’ARN…………………………………………………………p 85 Figure 27 : Test de viabilité cellulaire au MTT réalisé sur fibroblastes humains normaux (PF2). Traitement avec de la cirsimarine pendant 24…………………………………………………….p 87 Figure 28 : Test de viabilité cellulaire au MTT réalisé sur fibroblastes humains normaux (pool PF2). Traitement avec de l’extrait de Microtea debilis Sw. pendant 24h ……………p 88 Figure 29 : Résultat obtenu après un essai de RT-PCR ….…………………………………………….p 91 Figure 30 : Montage de l’électrotransfert …………………………………………………………………….p 100 Figure 31 : Test de viabilité cellulaire au MTT réalisé sur fibroblastes humains normaux (025). Traitement avec de la cirsimarine et de l’extrait végétal pendant 4J …………….p 102 Figure 32 : Effet de la cirsimarine et de l’extrait végétal sur le collagène de type I ..p 103 Figure 33 : Effet de la cirsimarine et de l’extrait végétal sur le collagène de type III.p 104 Figure 34 : Effet de la cirsimarine et de l’extrait végétal sur la décorine……………………p 105 Figure 35 : Effets de la cirsimarine et de l’extrait végétal Microtea debilis Sw. sur la synthèse des collagènes de type I et III et sur la décorine………………………………………..p 106 Figure 36 : Activité anti-oxydante de la quercétine …………………………………………………..p 109 Figure 37 : Activité anti-oxydante de la génistéine ……………………………………………………p 110 Figure 38 : Activité anti-oxydante de la cirsimarine…………………………………………………….p 110 Figure 39 : Courbe standard de la quantité de peroxyde d’hydrogène ……………………..p 111 Figure 40 : Inhibition de la production de peroxyde d’hydrogène par trois flavonoïdes……………………………………………………………………………………………………………………..p 112 Figure 41 : Effet de différents flavonoïdes sur la concentration en peroxyde d’hydrogène……………………………………………………………………………………………………………………p 113

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Index des tableaux

Tableau 1 : Résultats du spectre du proton pour l’échantillon E090…………………………….p 41 Tableau 2 : Résultats du spectre du carbone pour l’échantillon E090……………………….….p 41 Tableau 3 : Exemple de résultats obtenus pour le dosage par HTPLC d’un extrait hydro-éthanolique …………………………………………………………………………………………………………..p 42 Tableau 4 : Exemple de résultats obtenus pour le dosage par HPLC d’un extrait hydro-éthanolique………………………………………………………………………………………………….………..p 43 Tableau 5 : Calcul du rendement de purification de la cirsimarine par HPLC préparative…………………………………………………………………………………………………………….…………p 44 Tableau 6 : Description des essais réalisés avec Cirsium japonicum, Microtea debilis Sw et Scoparia dulcis …………………………………………………………………………………………………………...p 47 Tableau 7 : Nature des matières premières utilisées pour la réalisation d’extraits végétaux……………………………………………………………………………………………………………………….….p 48 Tableau 8 : Nature des charbons actifs utilisés……………………………………………………….…….p 51 Tableau 9 : Résultats des essais, étude 1, décoloration par pré traitement de la plante par solvants………………………………………………………………………………………………………………………p 56 Tableau 10 : : Résultats des essais, étude 2, décoloration par pré traitement de la plante par solvants……………………………………………………………………………………………….………………….…p 56 Tableau 11 : Résultats des essais, décoloration des extraits par extraction liquide-liquide……………………………………………………………………………………………………………………………….p 57 Tableau 12 : Résultats préliminaires, décoloration par l’utilisation de charbons actifs……………………………………………………………………………………………………………………………..….p 57 Tableau 13 : Résultats de la cinétique de décoloration d’un extrait végétal par l’utilisation de différents charbons actifs…………………………………………………………………………………………..p 59 Tableau 14 : Liste des ingrédients utilisés pour la formulation des gels testés sur explants…………………………………………………………………………………………………………………….………p 69 Tableau 15: Etude de la cytotoxicité de la cirsimarine et de l’extrait de Microtea debilis Sw. Concentrations testées………………………………………………………………………………… p 82 Tableau 16 : Résultats partiels de l’étude par puce à ADN – macroarray…….………….p 89 Tableau 17 : Nature des produits ajoutés. Étude de la matrice extracellulaire……………p 92 Tableau 18 : Description des amorces utilisées dans l’étude par RT-Q-PCR………………..p 95 Tableau 19 : Résultats de l’expression génique par RT-Q-PCR de cinq molécules étudiées en absence et en présence des deux composés étudiés (cirsimarine et extrait de Microtea debilis Sw.) …………………………………………………………………….………………………….……………………p 96 Tableau 20 : Composition des gels de séparation et des gels de migration…..……………p 99

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Tableau 21 : Anticorps primaires et secondaires utilisés dans l’étude de l’expression protéique…………………………………………………………………………………………………………………………p 101

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Abréviations AC : Adénylyl Cyclase

ADN : Acide DésoxyriboNucléique

ADNc : ADN complémentaire

AKAPS : A-Kinase Anchoring Proteins

AMP c : Adénosine Mono Phosphate cyclique

ARN : Acide RiboNucléique

ARN m : ARN messager

ATGL : Adipose TriGlycéride Lipase

ATP : Adénosine Tri-Phosphate

BNP : Brain Natriuretic Peptide

CAM : Cell Adhesion Molecule

CAPS : 3-(CyclohexylAmino)-1-PropaneSulfonic acid

CO2 : Dioxide de carbone

C(T) : Cycle Threshold

DEPC : DiEthylPyroCarbonate

DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DTT : DiThioThréitol

dATP : désoxy-Adénosine Tri-Phosphate

dCTP : désoxy-Cytosine Tri-Phosphate

dGTP : désoxy-Guanine Tri-Phosphate

dTTP : désoxy-Thymine Tri-Phosphate

ECL : ElectroChemiLuminescence

EDTA : Acide EthylèneDiaminoTétraacétique

EGF : Epidermal Growth Factor

FeCl3 : Chlorure de fer III

GAPDH : GlycérAldéhyde 3-Phosphate DésHydrogénase

GMP c : Guanine MonoPhosphate cyclique

H2O2 : Péroxyde d’hydrogène

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

HPTLC : High Performance Thin Layer Chromatography

HRP : Horse Radish Peroxidase

HVA : HomoVanillic Acid

IC50 : Inhibitory Concentration 50

JDE : Jonction Dermo-Epidermique

LHS : Lipase HormonoSensible

LMG : Lipase des MonoGlycérides

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LPL : LipoProtéine Lipase

MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase

MDA :Malonaldéhyde

MEC : Matrice ExtraCellulaire

MEM : Minimum Essential Medium

MMP : Matrix MetalloProtease

MTT : 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromide

NAD : Nicotinamide Adénine Dinucléotide

NADP : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate

NaHCO3 : Hydrogénocarbonate de sodium

PBS : Phosphate-Buffered Saline

PDE : PhosphoDiEstérase

PKA : Protéine Kinase A

PKC : Protéine Kinase C

PKG : Protéine Kinase G

PPi : PyroPhosphate inorganique

PTK : Protéine Tyrosine Kinase

RT-Q-PCR : Reverse Transcription Quantitative-polymerase Chain Reaction

RER : Reticulum Endoplasmique Rugueux

RMN : Résonance Magnétique Nucléaire

ROS : Radical Oxygen Species

SVF : Sérum de Veau Foetal

TBA : ThioBarbituric Acid

Tm : Temperature melting

TMS : TétraMéthylSilane

TMPO : 1,1,3,3 TétraMéthOxyPropane

SDS :Sodium Dodécyl Sulfate

SPARC : Secreted Protein Acidic and Rich in Cystein

SLRP : Small Leucine Rich Protein

SNS : Système Nerveux Sympathique

TBARS : ThioBarbituric Acid Reactive Substances

TBS : Tris Buffered Saline

T-TBS : Tween-TBS

UV : Ultra-Violet

14

Résumé Notre objectif était de trouver un agent lipolytique original pouvant être utilisé comme

amincissant en cosmétique. Plutôt que de rechercher des agonistes activateurs de la

lipolyse comme par exemple des agonistes béta adrénergiques, nous nous sommes basés

sur des mécanismes de régulation de la lipolyse peu connus dans lesquels la lipolyse est

inhibée en permanence. A partir de cette possibilité, vérifiée dans nos travaux

préliminaires, nous avons recherché des antagonistes de l’inhibition de la lipolyse. Les

données de la littérature nous ont permis d’identifier une molécule pouvant

potentiellement jouer ce rôle : la cirsimarine. Nos objectifs ont été : 1) de trouver un

approvisionnement, pour cela nous nous sommes procurés plusieurs plantes référencées

pour contenir ce flavonoïde afin de choisir le végétal à utiliser ; 2) de mettre au point une

méthode d’extraction et de purification de la cirsimarine ; 3) de mettre au point une

méthode de dosage de cette molécule ; 4) de tester les effets lipolytiques de cette

molécule sur différents modèles : adipocytes isolés de rats, adipocytes isolés humains,

explants cutanés. Ces travaux nous ont permis d’établir que la plante Microtea debilis

Swartz (Sw.), plante appartenant à la famille des Phytolaccacées, est la meilleure source

potentielle en cirsimarine. Plusieurs conditions d’extraction ont été testées. Une méthode

de purification de la cirsimarine par chromatographie préparative liquide haute

performance a été développée afin de disposer d’un étalon fiable pour réaliser nos

travaux de recherche. La cirsimarine produite a été identifiée et dosée par

chromatographie sur couche mince et par chromatographie liquide haute performance.

Nous avons étudié les effets de l’extrait végétal et de la flavone sur le métabolisme

lipidique : la lipolyse (sur des modèles d’adipocytes isolés et sur des explants) et la

lipogenèse (sur un modèle d’adipocytes isolés). Étant donné que la matrice

extracellulaire est altérée lors de l’hypertrophie des adipocytes, nous nous sommes

intéressés à l’action de l’extrait végétal sur la synthèse de certains composants de cette

matrice. Les résultats préliminaires sur l’expression des ARNm et sur la synthèse de

différentes molécules de la matrice extracellulaire suggèrent que la cirsimarine puisse

jouer un rôle important sur la fermeté cutanée. Enfin, considérant l’effet anti-oxydant de

la plupart des flavonoïdes, nous avons recherché cet effet pour la cirsimarine. Nos

résultats suggèrent une action cellulaire directe de la cirsimarine résultant en une

diminution de la production de peroxyde d’hydrogène par le tissu adipeux.

15

Avant propos Ce travail a fait l’objet de collaborations entre la société GATTEFOSSÉ et des laboratoires

de recherche (INSERM et CNRS). Il présente la démarche suivie par GATTEFOSSÉ pour

développer un actif cosmétique, d’origine végétale, doué d’activités biologiques lui

permettant d’être incorporé dans des produits de soin minceur.

L’analyse bibliographique des connaissances sur les principales voies de lipolyse et de

lipogenèse ainsi que sur les propriétés biologiques des flavonoïdes nous a orientés vers la

recherche de molécules originales pouvant interagir sur différentes voies régulant

l’activité des adipocytes. C’est à ce titre que la cirsimarine a retenu notre attention. Ce

flavonoïde glycosylé est décrit comme antagoniste des récepteurs adénosines de type A1,

lesquels, présents à la surface des adipocytes, stimulent la lipolyse lorsqu’ils sont

bloqués.

La cirsimarine est signalée dans quelques plantes exotiques mais n’est pas disponible sur

le marché. Elle n’est pas commercialisée et nous avons dû dans un premier temps, la

rechercher, l’extraire, la purifier et la caractériser pour disposer d’étalons fiables,

indispensables pour réaliser nos travaux de recherche. Après avoir mis au point un

extrait végétal de Microtea debilis Sw., plante tropicale originaire de Guyane, nous avons

étudié les effets biologiques de la cirsimarine et de l’extrait végétal afin de vérifier notre

hypothèse.

Nous nous sommes tout d’abord intéressés à son action sur la lipolyse, mécanisme le

plus logique compte tenu de notre démarche. Ensuite, ayant remarqué que certains

extraits végétaux actuellement commercialisés revendiquaient un effet sur la lipogenèse,

nous avons souhaité également explorer cette voie. Pour cela, après avoir fait un état

des lieux des différents mécanismes décrits dans la littérature, nous avons mis en œuvre

différents tests d’objectivation. Puis, parce que la bibliographie cite aussi l’action des

flavonoïdes sur la matrice extracellulaire nous avons recherché des effets de la

cirsimarine sur la synthèse des collagènes et sur certaines protéines de la matrice

extracellulaire, espérant qu’en plus d’une action sur le métabolisme lipidique, ce produit

pourra améliorer la fermeté cutanée. Pour cela, nous avons tout d’abord étudié la

modulation de l’expression de gènes d’intérêt puis nous avons validé ces résultats en

quantifiant ces protéines. Enfin, vu que beaucoup de flavonoïdes sont pourvus de

propriétés anti-oxydantes, nous avons souhaité mettre en évidence celles de la

cirsimarine et les comparer à celles d’autres flavonoïdes.

16

1. Introduction

Pour se développer et survivre les organismes vivants ont besoin d’énergie. Cette énergie

est assurée par la photosynthèse chez les organismes autotrophes et par l’alimentation

chez les organismes hétérotrophes. Ces derniers ont été contraints de développer des

mécanismes de régulation assurant un équilibre en apports et besoins énergétiques.

L’apparition du tissu adipeux, lieu de stockage de l’énergie ingérée, non dépensée, dans

le régne animal a constitué un avantage majeur pour la survie des espèces. En effet,

l’énergie mise en réserve dans le tissu adipeux permet de s’affranchir des variations

quotidiennes des apports énergétiques. Cette énergie s’accumule dans les cellules

adipeuses, appelées également adipocytes, sous forme de gouttelettes de triglycérides

qui occupent l’essentiel de l’espace cellulaire. Le volume des adipocytes augmente en

fonction de la taille de la gouttelette lipidique. La cellule adipeuse est une des rares

cellules dont le volume peut être multiplié jusqu’à 20 fois.

Le tissu adipeux est organisé en dépôts très localisés (rétropéritonéal, épididymal…), on

le retrouve également présent sous la peau de façon générale où il constitue l’hypoderme

et de façon plus précises (hanche, cuisse) où il est à l’origine de la cellulite. La cellulite

désigne, dans le langage courant, une lipodystrophie gynoïde (anomalie du tissu

graisseux dans sa répartition gynoïde donc de type féminin), cloisonnée par des fibres

conjonctives peu extensibles, perpendiculaires au derme qui entraîne la formation de

capitons (figure 1).

Figure 1 : Représentation schématique du tissu adipeux sous cutané. La figure de gauche représente le tissu adipeux sous cutané en condition normale. La figure de droite le représente lors d’une hypertrophie du tissu adipeux : les chambres graisseuses crèent des tensions qui provoquent en surface l’apparition des capitons qui donnent à la peau un aspect « peau d’orange ».

17

Comme le montre la figure 1, l’augmentation de la taille et du nombre des adipocytes

crée des tensions dans les chambres graisseuses qui se transmettent au derme et à

l’épiderme, ce qui produit un aspect en « peau d’orange ».

Bien qu’elle ne présente aucun risque pathologique, la cellulite est perçue

défavorablement, essentiellement pour des raisons esthétiques. Ceci motive la recherche

de nouveaux moyens de lutter efficacement contre la cellulite. Pour réduire la cellulite,

c’est-à-dire diminuer les tensions généré sur les fibres conjonctives, il faut diminuer le

volume des adipocytes, ce qui revient à diminuer son contenu en triglycérides et donc

stimuler la lipolyse.

Le tissu adipeux sous-cutané est en étroite relation avec le derme. L’excès de tissu

adipeux altére la matrice extracellulaire dermique. Pour cette raison, nous avons étudié

les effets d’un agent lipolytique sur les adipocytes mais également sur la synthèse de

certains constituants de la matrice extracellullaire dermique.

Par ailleurs, l’excès de radicaux libres est impliqué dans de nombreuses pathologies et

dans des processus physiologiques comme le vieillissement. Des travaux récents ont mis

en évidence que le stress oxydant altère les fonctions cellulaires comme par exemple la

lipolyse des cellules adipeuses. Pour cette raison et parce que l’actif étudié est un

flavonoïde, dont certains sont connus pour leurs propriétés anti-oxydantes, le stress

oxydant des adipocytes a été mesuré.

L’objectif de ce travail était de mettre au point un agent lipolytique d’origine végétale qui

puisse être utilisé à des fins cosmétiques. Dans une première partie les principales

régulations du tissu adipeux : la lipolyse et la lipogenèse seront rappelées. Parce que le

tissu adipeux sous-cutané interagit avec la matrice extracellulaire du derme, ses

principaux constituants seront décrits. Le principe actif sélectionné étant un flavonoïde,

cette famille sera décrite. Enfin, le stress oxydant connu pour altérer les réponses

cellulaires, ses effets sur le fonctionnement des adipocytes sera expliqué.

18

1.1. Le métabolisme lipidique

Le tissu adipeux blanc assure la régulation des besoins énergétiques de l’organisme. Au

cours de la lipolyse, le catabolisme des lipides permet de libérer des substrats

énergétiques qui seront utilisés par les tissus périphériques, tandis que la lipogenèse

assure le stockage des acides gras sous forme de triglycérides.

1.1.1.La lipolyse

La lipolyse correspond au catabolisme des triglycérides stockés dans les adipocytes

c’est-à-dire leur dégradation en acides gras non estérifiés et en glycérol. Les molécules

ainsi libérées dans le flux sanguin peuvent être utilisées par d’autres tissus comme

substrat énergétique (acides gras) ou servir de précurseurs néoglucogéniques (glycérol).

Au sein de l’adipocyte, la voie principale qui conduit à la lipolyse est celle qui agit sur

l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et la protéine kinase A (PKA). Dans cette

voie de signalisation (figure 1), la lipolyse est contrôlée par la concentration

intracellulaire en AMPc : plus cette concentration est élevée, plus la lipolyse est activée

(Honnor et al. 1985a; Honnor et al. 1985b; Londos et al. 1985). Aussi, toute molécule

capable d’augmenter la concentration intracellulaire en AMPc conduit à stimuler la

lipolyse.

19

Figure 2 : Contrôle de la lipolyse dans l’adipocyte humain, d’après Valet. P et Richard. D. (Richard and Valet, 1997) Les récepteurs β- et α2A-adrénergiques sont couplés positivement ou négativement à l’adénylyl cyclase et à la production d’AMPc par des protéines G hétérotrimériques (Gs ou stimulatrice et Gi ou inhibitrice). La stimulation des récepteurs β- ou α2- adrénergiques active les protéines Gs ou Gi, respectivement. L’AMPc produit par l’activation de l’adénylyl cyclase active la protéine kinase A (PKA) qui stimule la phosphorylation des périlipines et de la lipase hormonosensible (LHS). La phosphodiestérase de type 3B (PDE-3B), qui hydrolyse l’AMPc, est représentée. Cette voie exerce des effets modulateurs puissants sur la lipolyse adrénergique. Lorsque la LHS est activée, elle hydrolyse les triglycérides en diglycérides (DG) et acides gras libres (AGL). Les monoglycérides sont hydrolysés par une lipase des monoglycérides (LMG). L’activité lipolytique de l’adipocyte humain est sous le contrôle permanent des voies lipolytiques (β-adrénergique) et anti-lipolytiques (α2- adrénergiques, adénosine). + : stimulation ; - : inhibition.

La figure 2 représente la cascade lipolytique PKA / AMPc dans le tissu adipeux, où les

catécholamines (adrénaline et noradrénaline) ainsi que l’insuline sont les principaux

régulateurs. Différents effecteurs physiologiques (hormones, amines…) peuvent agir sur

des récepteurs membranaires capables de stimuler ou d’inhiber l’adénylyl cyclase (AC)

via des protéines G stimulatrices (Gs) ou inhibitrices (Gi). L’adénosine triphosphate (ATP)

intracellulaire est transformé sous l’action de l’adénylyl cyclase en AMPc. L’AMPc

phosphoryle une PKA qui, avec l’aide de protéines kinases A d’ancrage (AKAPs),

phosphoryle une lipase hormonosensible (LHS) ainsi que des périlipines A (isoformes

majoritairement présentes à la surface de la gouttelette lipidique). Les périlipines sont

Triglycérides

Récepteur α2 adrénergiqueRécepteur adénosine A1

Récepteur β adrénergique

AGL + glycérol

Gi Gs

ATPAMPc

- +

Protéine kinase Ainactive

Protéine kinase Aactive

LHSinactive

LHS phosphoryléeactive

Phosphodiestérase

5 ’AMP

Adénosine

AdénosineAdénylyl cyclase

AGL + DG

AGL + MGLMG

20

des protéines de structure situées à la surface de la gouttelette lipidique (Birnbaum

2003). Ces modifications provoquent la translocation des LHS du cytoplasme vers les

gouttelettes lipidiques. La LHS hydrolyse in vivo les triglycérides et les diglycérides. A

l’inverse, l’activation de récepteurs liés à des protéines Gi stimule des phosphatases,

enzymes qui suppriment les résidus phosphates des HSL et des périlipines. Ce processus

conduit à inhiber la lipolyse. Par ailleurs, l’AMPc produit par l’AC peut être transformé en

5’ adénosine monophosphate (5’AMP) par une phosphodiestérase nucléotidique

cyclique 3B (PDE3B), activée lorsque l’insuline est fixée à son récepteur. Ainsi, toute

molécule capable d’inhiber la phosphodiestérase, conduira à augmenter la concentration

intracellulaire en AMPc et stimulera la lipolyse.

La mobilisation des acides gras à partir des triglycérides stockés dans le tissu adipeux,

nécessite l’activation d’une enzyme lipolytique, la LHS. Cependant, de récents travaux

ont mis en évidence l’existence d’une autre enzyme fortement exprimée dans le tissu

adipeux humain, l’adipose triglycéride lipase (ATGL) qui catalyse l’étape initiale de

l’hydrolyse des triglycérides (Zimmermann et al. 2004). D’autres travaux corroborent

cette découverte (Jenkins et al. 2004; Villena et al. 2004). Ainsi, les termes ATGL,

desnutrin et iPLA2ζ désignent la même protéine. Cette lipase, présente majoritairement

dans le cytoplasme, montre une forte spécificité de substrat pour les triacylglycérols. La

lipase hormono-sensible (HSL) clive les triglycérides avec une activité spécifique dix fois

inférieure que pour les diglycérides (Fredrikson et al. 1981). A l’inverse, ATGL montre

une très faible activité pour les diglycérides comparée aux triglycérides (Zimmermann et

al. 2004). ATGL et HSL ont des spécificités de substrat différentes dans la cascade

lipolytique, ce qui suggère qu’elles puissent agir de façon coordonnée dans le catabolisme

des triglycérides. Par ailleurs, l’inhibition simultanée de l’ATGL et de la HSL se traduit par

une inhibition de plus de 90% de l’hydrolyse des triglycérides dans le tissu adipeux

(Zimmermann et al. 2004). Ainsi, l’hydrolyse des triglycérides est majoritairement

dépendante de l’ATGL, l’hydrolyse des diacylglycérols est assurée par la HSL, enfin une

monoacylglycéride lipase produit le dernier acide gras et un glycérol. L’activation de

ATGL n’est liée ni à l’activation de la protéine kinase A (Zimmermann et al. 2004) ni à la

présence de l’AMPc (Villena et al. 2004). In vitro, le gène codant cette enzyme est régulé

de façon dose dépendante par la dexaméthazone, suggérant ainsi que les

glucocorticoïdes puissent augmenter la synthèse de l’ATGL (Villena et al. 2004).

Le contrôle de la cellule adipeuse par les catécholamines met en jeu cinq sous types

d’adrénorécepteurs différents (Lafontan and Berlan 1993), trois β-récepteurs (β1, β2 et β3)

et deux α-récepteurs (α2 et α1). Les récepteurs adrénergiques qui activent l’adénylyl

cyclase (les trois récepteurs β) coexistent sur la même cellule adipeuse que ceux qui

l’inhibent (récepteurs α2). Tous ont les mêmes agonistes physiologiques (noradrénaline

et adrénaline). Des études (Arner et al. 1990) ont montré que les récepteurs

21

β-adrénergiques modulent la lipolyse lors d’un exercice physique ou de toute autre

activité entraînant une activation importante du système nerveux sympathique (SNS)

alors que les récepteurs α2 adrénergiques sont impliqués dans la modulation de la

lipolyse basale, au repos. Ces études montrent également que les catécholamines à

faibles concentrations stimulent les récepteurs α2. Cette observation corrobore plusieurs

études (Berlan and Lafontan 1985) selon lesquelles les catécholamines à faible

concentration ont une affinité plus importante pour les récepteurs α2 que pour les

récepteurs β adrénergiques.

Ainsi, l’effet lipolytique des catécholamines résulte de la balance fonctionnelle entre

récepteurs activateurs et inhibiteurs (Lafontan and Berlan 1995). A faible concentration,

la voie α2-adrénergique est principalement activée, ceci provoque une inhibition tonique

de la lipolyse. Par contre, lorsque le système nerveux sympathique est activé, ce qui

implique une augmentation de la concentration en catécholamines, les récepteurs β sont

stimulés. L’activation de ces récepteurs domine la voie α2-adrénergique, ce qui se traduit

par une stimulation de la lipolyse.

La concentration en AMPc joue un rôle important dans le déclenchement de la lipolyse. Il

est admis que la lipolyse est proportionnelle à cette concentration.

L’adénosine exerce un contrôle négatif sur la lipolyse. Cette molécule provient de l’AMPc.

Nous avons vu que la phosphodiestérase PDE3B hydrolyse l’AMPc en 5’-AMP. Cet AMP est

dégradé en adénosine sous l’action de la 5’-nucléotidase. Cette dégradation a deux

conséquences. La première est de diminuer la concentration intracellulaire en AMPc et

donc de diminuer la lipolyse. La seconde est de produire de l’adénosine. L’adénosine est

une petite molécule, elle traverse par conséquent facilement la membrane adipocytaire.

Cette molécule se fixe sur les récepteurs adénosine A1, situés sur la membrane

adipocytaire et reliés à une protéine Gi. Compte tenu de la forte densité des récepteurs

adénosines A1 à la surface adipocytaire, malgré une affinité faible de l’adénosine pour son

récepteur (Liang et al. 2002), l’adénosine inhibe la lipolyse.

Si la voie de l’AMPc / LHS joue un rôle essentiel dans le contrôle de la lipolyse, d’autres

voies de régulations peuvent également moduler l’activité lipolytique. Ainsi, Fricke et al

(2004a) ont mis en évidence, dans les adipocytes 3T3-L1, la voie de signalisation PKC /

MAPK. Cette voie est indépendante de la voie PKA / APMc. Sengenes et al. ont

récemment décrit un nouveau mécanisme de contrôle de la lipolyse qui implique la voie

de la guanine monophosphate cyclique (GMPc) et les peptides natriurétiques d’origine

cardiaque (Sengenes et al. 2005). La stimulation des récepteurs aux neuropeptides est

associée à une augmentation importante et soutenue de la concentration intracellulaire

en GMPc. Cette production de GMPc est suivie de l’activation d’une protéine kinase

22

dépendante du GMPc (PKG). Cette activation conduit à la phosphorylation de la périlipine

A et de la LSH, étapes précédant le processus lipolytique.

D’après la revue des différentes voies de régulation de l’activité lipolytique, nous nous

sommes interessé à la voie de régulation interférant avec le récepteur A1 adénosine et

avons recherché des molécules antagonistes de ce récepteur.

1.1.2. La lipogenèse

La lipogenèse est une voie métabolique qui permet la synthèse des acides gras et leur

estérification sous forme de triglycérides. Les triglycérides sont fabriqués dans le foie,

dans les cellules adipeuses ainsi que dans les cellules intestinales. Leur biosynthèse a lieu

dans le réticulum endoplasmique. On distingue deux précurseurs aux triglycérides : le L-

glycérol et l’acétyl-CoA. Le L-glycérol provient de la réduction de la 3-

phosphodihydroxyacétone formée au cours de la glycolyse, réaction catalysée par la 3-

phosphoglycérol déshydrogénase. L’acétyl-CoA provient de la glycolyse. L’acétate peut

être utilisé comme précurseur métabolique des triglycérides dans les adipocytes.

Dans ce cas, l’acétate peut être transformé en acétyl-CoA par une acétyl-CoA synthétase

selon : ATP + acétate + CoA ↔ AMP + PPi + acétyl-CoA ou par une acétyl coA

hydrolase selon : acétate + CoA ↔ acetyl-CoA + H2O (Knowles et al. 1974)

La synthèse des triglycérides comporte trois étapes :

la formation de l’acide phosphatidique : deux acyl-CoA (R1-CoA et

R2-CoA) réagissent sur les positions 1 et 2 du glycérol-3 phosphate

pour former, grâce à l’action de l’acyl transférase, de l’acide

phosphatidique.

la déphosphorylation de l’acide phosphatidique, réaction catalysée

par une hydrolase, la phosphatidate phosphatase.

l’estérification de la dernière fonction alcool de l’acide phosphatidique

par un acyl-CoA via une acyl-CoA transférase pour aboutir à la

formation du triglycéride.

Notons que la synthèse de novo des acides gras dans les adipocytes est peu importante

(Sjostrom 1972) : 10% des acides gras stockés dans les adipocytes proviennent de la

lipogenèse de novo (Strawford et al. 2004), la fonction lipogénique de l’adipocyte est

essentiellement constituée de la captation d’acides gras exogènes provenant de

lipoprotéines circulantes et de leur estérification (Wang et al. 2004). La source principale

des acides gras dépend de l’activité des lipoprotéines lipases (LPL) qui hydrolysent les

23

lipoprotéines plasmatiques riches en triglycérides pour produire des acides gras et du

monoacylglycérol.

1.2. La peau et la matrice extracellulaire

Après une description du métabolisme de la cellule adipeuse, la nature de la matrice

extracellulaire qui est un réseau de molécules adjacentes au tissu adipeux sous cutané,

sera présentée. Toutefois, avant cette description, l’organisation structurale de la peau et

la localisation de ses divers compartiments seront rappelés.

1.2.1.La peau : organisation structurale

La peau est un organe complexe recouvrant le corps en entier. Son poids totalise environ

15% du poids total du corps adulte, sa surface représente jusqu’à 2 m², son épaisseur

varie de 1,5 mm à 4 mm selon la région anatomique. Les nombreux vaisseaux sanguins

qui traversent le derme transportent de 8 à 10% du sang en circulation dans le corps :

c’est le plus grand et le plus important organe du corps humain. La peau humaine

normale (figure 3) est constituée de trois compartiments distincts : l’épiderme, le derme,

séparé de l’épiderme par la jonction dermo-épidermique et l’hypoderme.

Figure 3 : Structure de la peau humaine normale (Centre de médecine et de

chirurgie esthétique 2005)

24

L’épiderme

L’épiderme est un épithélium pavimenteux kératinisé, essentiellement constitué de

quatre types cellulaires : les kératinocytes en grande majorité (90%), les mélanocytes,

les cellules de Langerhans et les cellules de Merkel. Les kératinocytes subissent un

processus continu de reproduction, différenciation, kératinisation et desquamation de 28

jours. Cinq couches superposées constituent l’épiderme. De la plus superficielle à la plus

profonde on distingue :

la couche cornée ou stratum corneum. Les kératinocytes de la

couche cornée sont anucléés et aplatis, on les appelle cornéocytes.

la couche granuleuse ou stratum granulosum où débute la

kératinisation des kératinocytes. Elle contient des granules de

kératohyaline, d’où son nom.

la couche de Malpighi ou stratum spinosum comporte des

kératinosomes, vacuoles renfermant des précursueurs de lipides

épidermiques.

la couche cellulaire basale ou stratum basale formée d’une rangée

unique de kératinocytes. Ces cellules reposent directement sur la

membrane basale (barrière entre le derme et l’épiderme).

La jonction dermo-épidermique

La jonction dermo-épidermique (JDE) ou lame basale épidermique (figure 4) correspond

à une zone d’adhérence comprise entre la couche basale des kératinocytes (stratrum

basale) et les couches les plus superficielles du derme. Cette structure, constituée de

matrice extracellulaire (MEC), assure la cohésion dermo-épidermique, joue un rôle

d’ancrage pour les cellules de la couche basale de l’épiderme, permet la diffusion

contrôlée des nutriments (en provenance des vaisseaux sanguins jusqu’aux

kératinocytes), ainsi que des échanges de types cellulaires (processus de cicatrisation,

inflammatoires ou immunologiques) (Karp, 2004). La JDE est traversée par les annexes

de la peau comme les glandes sudoripares, les glandes sébacées et les phanères. Elle est

composée de cinq constituants majeurs : le nidogène, le collagène de type IV, les

laminines, la fibronectine et l’héparanne sulfate. Trois zones distinctes composent la

jonction dermo-épidermique, de l’épiderme vers le derme :

la lamina lucida (zone claire aux électrons, observation en

microscopie électronique à transmission), traversée par des

éléments d’ancrages (hémidesmosome, intégrine).

la lamina densa (zone dense aux électrons), majoritairement

composée de collagène de type IV.

25

la lamina fibroreticulatis (zone fibrillaire), s’étend de la lamina densa

jusqu’aux couches superficielles du derme papillaire. Elle contient

des faisceaux fibrillaires, des fibres d’ancrage essentiellement

composées de collagène de type VII.

Figure 4 : Schéma de la jonction dermo-épidermique, localisation de certains de ses composants. (Schöni-Affolter,F. et al. 2005) copyright Dr. med. F. Schöni-Affolter

Le derme

Le derme est un tissu conjonctif lâche et fibreux qui confère à la peau son élasticité ainsi

que sa résistance. Il est constitué essentiellement de MEC dans laquelle baignent les

fibroblastes. Ce tissu comprend différentes annexes cutanées : vaisseaux sanguins et

lymphatiques, terminaisons nerveuses, glandes sébacées et sudoripares ainsi que des

follicules pileux. Le derme est composé de deux parties :

le derme papillaire ou derme superficiel, riche en cellules et très

vascularisé.

le derme réticulaire, plus dense que le derme papillaire, il est

constitué principalement de faisceaux de collagène et de fibres

élastiques.

L’hypoderme

L’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau. Ses fonctions principales sont

d’emmagasiner de l’énergie sous forme de graisse et d’assurer un rôle de

thermorégulation. Les cellules qui la composent sont, en majorité, des adipocytes. Cette

couche contient aussi des fibroblastes, des macrophages, des vaisseaux sanguins ainsi

que des terminaisons nerveuses.

26

1.2.2. La matrice extracellulaire

La matrice extracellulaire (MEC) est un réseau organisé de matériaux extracellulaires

présent au-delà du voisinage immédiat de la membrane plasmique. Une des MEC la

mieux définie est la lame basale, couche située en dessous de l’épiderme (Karp, 2004).

Les macromolécules qui composent la MEC du derme ainsi que celle de la lame basale

sont essentiellement produites par les fibroblastes et sécrétées dans l’espace

extracellulaire où elles forment un réseau tridimensionnel. Les paragraphes suivants

décrivent la nature des principales molécules composant la MEC : les molécules de

collagène, d’élastine, de glycosaminoglycanne, de protéoglycanne.

Les collagènes

Les collagènes représentent 30% des protéines de l’organisme humain. Ce sont des

molécules structurales de la matrice extracellulaire qui comportent un ou plusieurs

domaines ayant une structure en triple hélice, c’est-à-dire formés de trois chaînes

polypeptidiques α, enroulées les unes autour des autres (van der Rest et al. 1991). Dans

le derme, les constituants majeurs sont les collagènes de type I, III, V, VI, XII et XIV ; le

collagène de type IV est le constituant majeur des membranes basales ; le collagène de

type VII constitue les fibrilles d’ancrage.

Les collagènes de type I (hétérotrimère : deux chaînes α1 et une

chaîne α2), de type III (homotrimère : trois chaînes α1) et de type V

(trimère, pouvant être soit sous la forme de deux hélices α2 et de

deux hélices α1 soit sous la forme d’une chaîne α1, d’une chaîne α2 et

d’une chaîne α3) sont des collagènes fibrillaires. Ces molécules

s’agencent en fibrilles puis en fibres. Notons que le collagène de

type I est le plus communément distribué dans le tissu conjonctif.

La formation des fibres de collagène est décrite dans la figure 5. Les fibres de collagène

sont formées dans l’espace extracellulaire, par l’assemblage de molécules de

tropocollagène synthétisées et excrétées essentiellement par les fibroblastes. A mesure

que la chaîne polypeptidique se forme, elle est libérée dans la lumière du réticulum

endoplasmique rugueux (RER) où les chaînes de collagène sont remaniées puis

assemblées en hélices triples : certains résidus prolines du milieu des chaînes sont

hydroxylés par des enzymes membranaires, les prolyl-4-hydroxylases et prolyl-3-

hydroxylases; certains résidus lysines de ces domaines sont hydroxylés par une lysine

hydroxylase. L’ascorbate est un facteur essentiel des deux prolyls hydroxylases.

L’absence d’ascorbate entraîne un défaut d’hydroxylation du collagène : l’hélice formée

27

par ces chaînes n’est pas stable à 37°C et ne s’assemble pas en fibrilles normales. Les

chaînes de procollagène non hydroxylées sont dégradées dans la cellule.

Le collagène de type VI (hétérotrimère : une chaîne α1, une

chaîne α2 et une chaîne α3) s’assemble en dimères antiparallèles puis

en tétramères afin de former des agrégats. Ce collagène s’associe

avec d’autres molécules de la matrice extracellulaire comme la

décorine ou le hyaluronanne. Il est également impliqué dans

l’adhésion cellulaire par des interactions avec les intégrines.

Les collagènes présents à la surface des fibrilles de collagène,

connus également sous le nom de FACITs (Fibrill-Associated

Collagens with Interrupted Triple helice) : collagènes de type XII

(homotrimère : trois chaînes α1), de type XIV (homotrimère : trois

chaînes α1) et de type XVI (homotrimère : trois chaînes α1).

Le collagène de type IV (deux chaînes α1 et une chaîne α2) est le

constituant majeur des membranes basales.

Le collagène de type VII (homotrimère : trois chaînes α1),

constituant principal des fibrilles d’ancrage pour la membrane basale

est essentiellement synthétisé par les kératinocytes.

D’un point de vue structural, chaque triple hélice de collagène comporte à l’extrémité N-

terminale un domaine globulaire non collagénique NC1. Deux chaînes s’associent par leur

extrémité C-terminale pour former un dimère qui interagit avec d’autres constituants de

la matrice extracellulaire : laminine 5, collagènes de type I et de type III.

28

Figure 5 : Formation des fibres de collagènes, (Schöni-Affolter,F. et al. 2005) copyright Dr. med. F. Schöni-Affolter. La synthèse des molécules de procollagène est réalisée dans le RER, les hydroxylations des lysines et des prolines sont réalisées dans l’appareil de Golgi. Ces molécules sont exportées dans l’espace extracellulaire par des vésicules de sécrétion. Les domaines non hélicoïdaux sont supprimés par des collagène peptidases. La formation des molécules de tropocollagène est assurée par des lysyl oxydases (crosslinking). L’association de plusieurs microfibrilles forme des fibrilles. Les fibrilles de collagène s’associent en fibres de collagène. Ce processus est facilité par des protéoglycannes et des collagènes FACIT.

29

Les fibres élastiques

L’élasticité de la peau dépend de la présence de fibres élastiques de la MEC. Les fibres

élastiques sont composées de deux éléments bien distincts : l’élastine, élément amorphe,

ainsi qu’un composant microfibrillaire de nature glycoprotéique. L’élastine est une

molécule majeure du derme bien qu’elle ne représente que 1 à 3% de ses composants

(Robert 2001).

Les glycosaminoglycannes et protéoglycannes

Les glycosaminoglycannes (GAG) sont des polysaccharides anioniques. Cette polarité les

fait participer à certaines fonctions biologiques comme l’hydratation. Ces molécules

(hyaluronanne excepté) sont liées par des liaisons covalentes à des chaînes peptidiques :

les « protéines-cœur » et forment ainsi des molécules de protéoglycannes. De façon

générale, les rôles biologiques des protéoglycannes sont très divers allant d’un rôle de

filtration moléculaire (perlécanne), à des effets plus spécifiques dans l’adhésion, la

différenciation cellulaire, ou encore à des interactions protéine-protéoglycanne

(collagène-décorine).

Les glycosaminoglycannes

Le derme se caractérise par une résistance mécanique importante, assurée par le réseau

dense des fibres de collagène (80% du poids sec du derme) ainsi que par une souplesse

assurée par les protéoglycannes et le hyaluronanne (ou acide hyaluronique). Le

hyaluronanne est le principal GAG du derme, c’est le seul GAG non fixé à une « protéine-

cœur » et non sulfaté. Ce polysaccharide, synthétisé de façon continue par les

fibroblastes, assure l’hydratation du tissu conjonctif.

Les protéoglycannes

Les protéoglycannes sont regroupées en plusieurs familles :

la famille des lecticannes regroupe l’agréganne, le versicanne, le

neurocanne et le brevicanne. Leur fonction est principalement

structurale : ces molécules confèrent une certaine rigidité aux tissus,

leur permettant de résister à la compression.

la famille SLRP (Small Leucine-Rich Protein), qui comporte un noyau

protéique riche en leucine. Ces protéines ont généralement une

structure « en fer à cheval », qui favorise les interactions protéine-

protéine. Les chaînes de glycosaminoglycannes qui les composent

30

sont des chondroïtines sulfates, dermatannes sulfates ou des

kératannes sulfates. La décorine, le biglycanne, la fibromoduline et le

kératocanne appartiennent à cette famille. Ces molécules jouent un

rôle majeur dans la fibrillogenèse du collagène, la modulation des

facteurs de croissance ainsi que dans la régulation de la croissance

cellulaire.

La décorine se lie à de nombreux collagènes : collagènes de type I,

II, III et IV (Reed and Iozzo 2003) et à la fibronectine (Aumailley

and Smyth 1998; Schmidt et al. 1987). Elle favorise la formation des

fibres de collagène, augmente leur stabilité et modifie leur solubilité

(Stander et al. 1999). Cette protéine est absente de l’épiderme, par

contre elle est abondante dans le derme (Schönherr et al. 1993).

Son absence dans le derme entraîne une fragilité de la peau

(Danielson et al. 1997). D’un point de vue structural, la décorine est

composée de quatre domaines (figure 6) : le premier comprend un

pro-peptide qui est clivé avant la sécrétion de la protéine ; le

deuxième est le domaine N terminal de la protéine mature auquel

une chaîne de glycosaminoglycanne (chondroïtine-sulfate,

dermatanne-sulfate) est attachée ; le troisième est composé de dix

répétitions riches en leucine ainsi que d’oligosaccharides N-liés ;

enfin le quatrième domaine, ou région C terminal, possède deux

résidus cystéines.

Figure 6 : Représentation de la décorine. La décorine est composée d’un cœur protéique (domaines I, II, III et IV), d’une chaîne de GAG ainsi que d’oligosaccharides N-liés. Le domaine I est généralement clivé avant sécrétion. Le domaine II porte la chaîne GAG elle-même liée par un tétrasaccharide de liaison, ce domaine comporte également deux ponts dissulfures. Le domaine III comporte 10 séquences répétitives riches en

31

leucine. Le domaine IV comporte un pont dissulfure. La chaîne GAG est formée d’unités dissacharides de type chondroïtine ou dermatanne sulfate.

la famille des protéoglycannes héparanne sulfates comporte des

molécules jouant un rôle important dans l’adhésion cellulaire, la

migration, la prolifération et la différenciation. Ces molécules sont

des constituants de la lame basale.

Les glycoprotéines de structure

Le terme de matrice implique une structure faite de composants qui interagissent. Cette

définition s’applique parfaitement à la matrice extracellulaire qui, outre les collagènes, les

fibres élastiques et les protéoglycannes contient d’autres protéines qui interagissent

entre elles de manière bien définie (Alberts and al., 2004).

Parmi les glycoprotéines de structure présentes dans la matrice extracellulaire, on

s’intéressera à la fibronectine, aux laminines ainsi qu’au nidogène.

La fibronectine est une glycoprotéine sécrétée par les fibroblastes.

Cette molécule joue un rôle majeur dans l’adhérence cellulaire au

tissu conjonctif et intervient dans la communication cellulaire

(Alberts and al., 2004).

Les laminines, avec le collagène de type IV, le nidogène et le

perlécanne sont les principaux composants des lames basales

(Bosman and Stamenkovic 2003). D’un point de vue structural, les

laminines sont formées de trois chaînes polypeptidiques différentes

(chaînes α, β et γ), reliées par des liaisons dissulfures et organisées

en une molécule ressemblant à une croix dotée de trois bras courts

et d’un long (Alberts and al., 2004). Les laminines jouent un rôle

dans l’adhésion cellulaire, la migration cellulaire et la différentiation

cellulaire. Le rôle principal des laminines serait de permettre

l’interaction des cellules avec la matrice extracellulaire,

particulièrement avec la membrane basale (Aumailley and Smyth

1998). Les molécules de laminines peuvent fixer des molécules de

nidogène. Ainsi, le nidogène relie les laminines au collagène de type

IV. La laminine 5 est synthétisée et sécrétée par les kératinocytes

basaux de l’épiderme. C’est un constituant majeur de la lame basale

de la jonction dermo-épidermique (JDE).

Le nidogène est une glycoprotéine sulfatée, composée de trois

domaines globulaires. Il s’agit d’un composant de la membrane

basale (Lodish et al., 1997) qui a pour fonction de contrôler la

32

formation d’un complexe stable entre le collagène de type IV, les

laminines et le perlécanne. En plus d’être indispensable à la

formation de la lame basale, il a un rôle de stabilisation et de

maintien de son architecture (Ekblom et al. 1994).

1.3. Les flavonoïdes

Après une recherche bibliographique sur les différentes molécules antagonistes des

récepteurs A1 adénosine, nous nous sommes intéressés plus particulièrement à l’une

d’elle, la cirsimarine, molécule appartenant à la famille des flavonoïdes.

1.3.1.Généralités sur les flavonoïdes

Les flavonoïdes appartiennent, avec les acides phénoliques et les tannins, à la famille des

polyphénols (Diehl et al. 2001). Les composés polyphénoliques sont constitués d’un

noyau aromatique comportant une ou plusieurs fonctions hydroxyles ainsi que des

groupes fonctionnels (ester, méthyl ester, glycosides…). Les flavonoïdes comportent le

squelette de base suivant : deux noyaux aromatiques (cycle A et cycle B) de 7 carbones

chacun interconnectés par un autre cycle (cycle C) de 3 carbones (figure 6).

O

O

4 '

7

5

A

B

C 6 '

5 '

3 '

2 '

2

3

46

8

Figure 7 : Squelette de base des flavonoïdes

De nombreuses enzymes comme les glycosyl transférases, les méthyl transférases et les

acyl transférases peuvent modifier le squelette de base (figure 7). Ce groupe de

molécules comporte plusieurs classes : les flavanones, les isoflavones, les flavones, les

flavonols, les flavanols ainsi que les anthocyanidines.

Les flavonoïdes sont des molécules responsables de la pigmentation des fleurs, des fruits

et des graines. Ils jouent un rôle dans la protection contre les rayonnements ultraviolets

(UV), dans la défense des plantes contre les micro-organismes pathogènes, dans la

fertilité des plantes, dans les interactions plante-microbe (Bovy 2004). Ces molécules

sont également douées de plusieurs propriétés biologiques : anti-oxydantes, anti-virales,

anti-microbiennes, inhibitrices d’enzymes impliquées dans d’importantes fonctions

cellulaires. Certaines possèdent des propriétés lipolytiques, protectrices de l’ADN voire

33

même anti-âge (Diehl et al. 2001). Nous détaillerons ci-dessous quelques unes de leurs

propriétés.

1.3.2.Propriétés biologiques des flavonoïdes

Activités anti-oxydantes

Les flavonoïdes sont des molécules capables de piéger de nombreuses espèces

oxydatives comme l’anion superoxyde (O2.-), le radical hydroxyle (OH.), le radical peroxy

(ROO.) ou encore l’oxygène singulet (1O2). Plusieurs travaux décrivent les relations

structures-activités des flavonoïdes (Cos et al. 1998; Harborne and Williams 2000;

Woodman et al. 2005). Ces travaux permettent de connaître les activités anti-oxydantes

de ces molécules en fonction de leurs caractéristiques structurales. Ainsi, les composés

possédant un groupement carbonyl en C4 et une double liaison entre les carbones C2 et

C3 sont les flavonoïdes dont les activités anti-oxydantes sont les plus marquées, il en est

de même pour les molécules où la délocalisation des électrons peut se réaliser de façon

aisée (Harborne and Williams 2000). Par ailleurs, la présence d’un groupement hydroxyle

en position C3 et C3’ ainsi qu’un nombre important de résidus hydroxyles augmenteraient

le potentiel anti-oxydant de ces molécules (Woodman et al. 2005). Aussi, chaque année,

la presse scientifique présente beaucoup de travaux décrivant les propriétés anti-

oxydantes de ces molécules, comme l’hespéridine, l’apigénine , la scutallaréine, le

kaempférol, la rutine, la naringine, la néohespéridine, la neoériocitrine (Wilmsen et al.

2005).

Inhibition d’enzymes

Les flavonoïdes affectent l’activité de nombreux systèmes enzymatiques in vitro mais

également in vivo. Ci-dessous sont présentés quelques exemples qui montrent l’étendue

des activités modulées par ces molécules. Certains flavonoïdes ont la capacité d’inhiber

des enzymes clés de la respiration mitochondriale, en particulier la NADH oxydase (Cos

et al. 1998; Harborne and Williams 2000). Il s’agit des flavonoïdes saturés en position

C2-C3, comportant une fonction cétone en C4 et des groupements hydroxyles en C3’, C4’ et

C5’.

Les biflavones présentent dans le Ginko biloba inhibent l’activité de la phosphodiestérase

adipocytaire, enzyme importante dans le processus lipolytique (Dell'Agli and Bosisio

2002; Harborne and Williams 2000). L’alpha-glucosylrutine inhibe les MMP1 (matrix

34

metalloprotease 1 ou collagénase 1) et MMP2 (matrix metalloprotease 2 ou gélatinase A),

alors que la 8-prénylnaringénine serait responsable d’un effet opposé (Hantke et al.

2002).

Les kinases sont des enzymes intervenant dans de multiples voies de signalisation. Ainsi,

la protéine kinase C (PKC) participe notamment au processus inflammatoire, au

processus sécrétoire ainsi qu’à la fonction lymphocytaire. Cette enzyme est inhibée par la

quercétine, la fisétine et la lutéoline (Ferriola et al. 1989). Les protéines tyrosine kinases

(PTK) sont impliquées dans de nombreuses voies de signalisation comme la régulation, la

transformation et la croissance cellulaire, le déplacement cellulaire, l’adhésion cellulaire

(Qian and Weiss 1997). La génistéine (Akiyama et al. 1987) et la quercétine (Friedman

et al. 1985) inhibent ces enzymes.

Activité anti-inflammatoire

L’acide arachidonique peut être métabolisé par la voie de la lipoxygénase pour aboutir à

la formation de leucotriènes et par la voie de la cyclo-oxygénase pour produire des

thromboxanes et des prostaglandines, molécules fortement impliquées dans le processus

inflammatoire. Le cirsiliol (Furukawa et al. 1984) et la baicaléine (Sekiya and Okuda

1982) inhibent la 5 lipoxygénase. Les flavonoïdes lutéoline, morine, galangine et

catéchine inhibent de façon modérée la cycloxygénase (Baumann et al. 1980) ; la

chrysine, l’apigénine et la phlorétine diminuent l’activité cycloxygénase et inhibent

l’agrégation plaquettaire (Landolfi et al. 1984)

35

Figure 8 : Action de flavonoïdes sur les lipoxygénases et cyclo-oxygénases L’acide arachidonique (C20 :4) est transformé en leucotriènes (voie des lipoxygénases) et en prostaglandines et thromboxanes (voie des cyclo-oxygénases). Le cirsiliol et le baicaléine inhibent la lipoxygénase, la lutéoline, la morine, la galangine ainsi que la catéchine inhibent la cyclo-oxygénase.

Activité vasculaire

L’endothélium vasculaire est extrêmement sensible aux dommages oxydatifs générés par

les espèces oxygénées réactives (ROS, reactive oxygen species), libérées notamment par

les cellules inflammatoires (Sacks et al. 1978). Deux flavonoïdes, la citrine et

l’hespéridine diminuent de façon importante la perméabilité capillaire. Leurs activités sont

telles qu’elles ont porté durant quelques années le nom de vitamine P (Kuhnau 1976), ce

terme a par la suite été abandonné, ces deux molécules ne remplissant par entièrement

la définition de vitamine. Les flavonoïdes hespéridine et hespérétine (connus aussi sous

le terme citroflavonoïdes) exercent des propriétés vasorelaxantes (Orallo et al. 2004) par

action sur le système du cytochrome P450 en limitant la production d’ions superoxydes.

La quercétine et la silybine exercent des effets vasculaires protecteurs en diminuant la

production d’espèces radicalaires par inhibition de la xanthine oxydase (Sanhueza et al.

1992).

Activité lipolytique

La génistéine inhibe la prolifération des préadipocytes préconfluents et postconfluents. La

naringénine inhibe de façon dose dépendante la prolifération des préadipocytes

préconfluents, par contre elle n’a d’effet ni sur les adipocytes postconfluents, ni sur la

différenciation des préadipocytes en adipocytes. La génistéine bloque l’étape de

36

différenciation uniquement quand ce flavonoïde est administré au tout début de cette

étape. En plus de ses effets sur l’adipogenèse, la génistéine augmente significativement

la lipolyse (Harmon and Harp 2001).

L’épigallocatéchine-3-gallate, flavonoïde présent dans le thé vert, augmente

significativement la lipolyse (Mochizuki and Hasegawa 2004a).

Le pycnogénol, extrait du pin maritime, est un complexe comportant plus de quarante

composés. Il stimule la lipolyse (Hasegawa 1999) et inhibe la lipogenèse (Hasegawa

2000).

La myricétine, flavonoïde présent dans le thé, les fruits et plusieurs plantes médicinales,

stimule la lipogenèse (Ong and Khoo 1996).

Action sur la synthèse de certains composants de la matrice extracellulaire

Les flavonoïdes du Ginko biloba ont été étudiés sur un modèle de fibroblastes humains

(Kim et al. 1997) : la quercétine et le kaempférol ainsi que le sciadopitysin, le ginkgetin

et le isoginkgetin augmentent la synthèse de collagène de type I. La quercétine, le

kaempferol et le sciadopitysin augmentent la production de fibronectine de façon dose

dépendante.

1.4. Le stress oxydant

L’oxygène, molécule essentielle à la vie pour les organismes aérobies, est à l’origine de la

formation de composés peu stables mais hautement réactifs et toxiques : les espèces

oxygénées réactives (ROS). Le terme ROS comprend non seulement les radicaux libres

de l’oxygène (superoxyde, O2.- et hydroxyl, OH.) mais aussi des molécules dérivées de

l’oxygène (le peroxyde d’hydrogène, H2O2 ; l’oxygène singulet, 1O2 ; l’acide hypochloreux

HOCl). Tous les composés de nature lipidique contenant des liaisons insaturées, comme

les membranes cellulaires, sont susceptibles d’être oxydés par ces molécules et conduire

à l’accumulation de peroxydes. Plusieurs facteurs peuvent activer la production de ROS

parmi lesquels la température, la lumière (surtout dans l’UV), la pollution, la présence de

métaux, en particulier le cuivre et le fer.

L’organisme évolue dans un environnement oxygéné, il génère en permanence des ROS

capables d’oxyder de nombreux composés cellulaires comme les protéines, les acides

nucléiques ou encore les lipides. A terme, de telles oxydations sont dommageables pour

la cellule. Tout système biologique possède des mécanismes anti-oxydants capables de

contrer les effets délétères des ROS. Parmi eux, on peut citer les enzymes

détoxifiantes (la superoxyde dismutase, la glutathion peroxidase, la catalase, la NAD(P)H

quinone réductase), les anti-oxydants hydrophiles (l’ascorbate, le glutathion, l’acide

urique) ainsi que des anti-oxydants lipophiles (les tocophérols, le coenzyme Q, le β-

carotène, les mélanines).

37

Le stress oxydant se définit comme un déséquilibre entre les espèces oxygénées

réactives pro-oxydantes et les systèmes de défense anti-oxydants, avec comme

conséquence de nombreux impacts sur le fonctionnement cellulaire.

Le stress oxydant est impliqué dans la régulation de la réponse lipolytique. En effet, le

peroxyde d’hydrogène diminue la réponse lipolytique aux catécholamines (Visentin et al.

2003). Par ailleurs, les protéines G inhibitrices, impliquées dans la régulation de la

lipolyse par le système adénylyl cyclase, ont été décrites comme cibles du peroxyde

d’hydrogène (Nishida et al. 2000). On peut, faire l’hypothèse que cette voie de

signalisation puisse être l’un des mécanismes d’action du peroxyde d’hydrogène.

Le stress oxydant est impliqué dans de nombreuses pathologies cutanées comme le

psoriasis, la dermatite de contact, l’inflammation. Il joue également un rôle important

dans le vieillissement cutané.

Après avoir décrit les régulations du métabolisme lipidique et les différents composants

de la matrice extracellulaire, présenté les flavonoïdes, expliqué la nature et les effets du

stress oxydant, la partie suivante est consacrée à la caratérisation et au dosage de la

cirsimarine, molécule d’intérêt retenue pour ce travail.

38

2. Caractérisation et dosage de la cirsimarine

2.1. Matériels et méthodes

2.1.1.Caractérisation et identification de la cirsimarine

Suite aux travaux publiés par Hasrat (Hasrat et al. 1997a; Hasrat et al. 1997c) nous nous

sommes procurés un échantillon de cirsimarine (figure 9) sous forme poudre (référence

Gattefossé E090) afin de disposer d’un étalon pour mettre plus facilement en place une

méthode de dosage de la cirsimarine.

Figure 9 : Formule de la cirsimarine, MW : 476,4 Nous avons effectué des analyses par RMN avec un spectromètre DRX500 (Brucker) sur

l’échantillon E090 afin d’être certains de la nature du composé fourni et de connaître sa

pureté. Deux types d’analyses ont été réalisés : une RMN du proton à 500 MHz et une RMN

du carbone à 125 MHz. Pour cela, 15 mg de l’échantillon E090 ont été dissous dans du DMSO

deutéré (diméthyl sulfoxyde deutéré, Sigma) et analysés. Les spectres obtenus ont été

comparés à ceux publiés dans la littérature (Park et al. 1995a; Park et al. 1995b). Les

solutions mères de cette molécule sont préparées dans un solvant (CH3OH / DMSO ; 95 / 5 ;

v/v).

2.1.2.Méthodes de dosage

Méthode par chromatographie sur couche mince haute performance (HPTLC)

Cette méthode permet de doser la cirsimarine dans des extraits végétaux hydroalcooliques

ou hydroglycoliques. Ce dosage nécessite de la cirsimarine étalon (préalablement purifiée par

HPLC préparative), du méthanol ou CH3OH qualité HPLC (Carlo Erba), du chloroforme ou

CHCl3 qualité HPLC (Carlo Erba), de l’acide formique ou HCOOH (Carlo Erba), de l’acide

acétique glacial ou CH3COOH (Carlo Erba).

7

6 5 43

2

2'

6'

H 3CO

H 3CO

OO

HO H

HH

H

H

O HO H

OH

OO H

O

3'4'

5'8

39

Une solution étalon de cirsimarine est préparée à la concentration de 0,15 mg / mL.

Différents volumes de cette solution étalon seront déposés sur la plaque de migration, ils

constitueront la gamme étalon. Les extraits végétaux à doser sont systématiquement dilués

au cinquième dans du méthanol.

Le dosage est réalisé en HPTLC sur un système (Camag) composé d’un déposeur

automatique ATS III, d’une cuve de migration horizontale (20 cm*10 cm), d’un appareillage

d’immersion de plaque, d’un scanner TLC et du logiciel WinCats. Cet appareillage dépose les

échantillons à la vitesse de 100 nL par seconde sur une plaque en gel de silice 60 (Merck), en

intercalant les dépôts correspondant à la gamme étalon, ceux correspondant aux extraits à

analyser et ceux correspondant au solvant de dissolution de la cirsimarine. La plaque est

ensuite placée dans une cuve de migration remplie de phase mobile (CHCl3 / CH3OH /

HCOOH / CH3COOH ; 30 / 7 / 0,4 / 0,4 ; v/v/v/v). Lorsque la migration est terminée, la

plaque est soigneusement séchée puis scannée à 254 nm ou à 330 nm (en cas de présence

de solvant glycolé). En effet, la longueur d’onde d’absorption maximale de la cirsimarine

varie selon le solvant de dissolution de la molécule. Le traitement des résultats est réalisé

directement par le logiciel d’exploitation : il calcule la quantité de cirsimarine présente dans

l’échantillon dosé, à partir de la densité du signal.

Méthode par chromatographie analytique liquide haute performance (HPLC)

Cette technique permet de doser la cirsimarine dans des extraits végétaux

hydroéthanoliques. Ce dosage nécessite de la cirsimarine étalon, de l’acétonitrile CH3COCN

qualité HPLC, de l’acide acétique glacial, du DMSO ainsi que de l’eau ultra pure. Les solvants

utilisés proviennent de chez Carlo-Erba.

La phase mobile est un mélange eau / acétonitrile / acide acétique ; 665 / 285 / 50 (v/v/v).

La solution mère de cirsimarine est préparée à la concentration de 500 µg / mL puis

différentes dilutions de cette solution mère sont réalisées dans la phase mobile. Les

échantillons à doser sont systématiquement dilués au dixième dans la phase mobile.

L’analyse s’effectue avec un système HPLC LaChrom composé d’une colonne silice C18

Lichrospher 100 (VWR) de granulométrie 5 µm, de longueur 250 mm et de diamètre 4 mm ;

d’une pompe L 7100 (Merck) ; d’un passeur d’échantillons Hitachi L 7200 (Merck) ; d’un

détecteur UV L 7400 (Merck) ; d’une interface informatique L 7000 (Merck) et d’un logiciel de

pilotage HSM (Merck). Chaque injection (20µL) a une durée de 10 minutes, en mode

d’élution isocratique (1 mL / minute). La longueur d’onde de détection est de 254 nm. Pour

exploiter les résultats, l’aire du pic centré à 254 nm est utilisée : en effet, à cette longueur

d’onde, l’aire des pics de la gamme étalon est directement proportionnelle à la concentration

de cirsimarine injectée.

40

Purification de la cirsimarine par chromatographie préparative liquide haute performance (HPLC préparative)

Cette méthode permet de purifier de la cirsimarine à partir d’un extrait hydroéthanolique de

Microtea debilis Swartz (Sw.)

Cet extrait est obtenu par extraction solide / liquide mettant en œuvre 10% de plante sèche

broyée dans un mélange d’éthanol et d’eau (70 / 30, v/v). Ce mélange est placé sous

agitation magnétique à 50°C. Après 5 heures d’extraction, le mélange est clarifié sur filtre

nylon puis sur papier filtre de porosité 8 µm (Whatman). Le filtrat obtenu (l’extrait) est

décoloré par du charbon actif (Ceca) selon les indications mentionnées dans le paragraphe

3.1.3 puis filtré sur papier filtre 8 µm (Whatman). Cet extrait (100 mL) est concentré à

l’évaporateur rotatif (Büchi), jusqu’à l’obtention d’une pâte brune visqueuse. Ce concentré,

repris dans 10 mL de phase mobile (eau / acétonitrile ; 72 / 28 ; v/v) est filtré à 0,45

µm (Gelman GHP) avant la purification. La purification de la cirsimarine s’effectue avec un

système HPLC préparative (Merck) composé d’une colonne silice C18 Lichrospher 100 (VWR)

(granulométrie 5 µm, longueur 250 mm et diamètre 25 mm), d’une pompe, d’un injecteur et

d’un collecteur de fraction (Knauer). Plusieurs injections (volume : 2 mL ; mode isocratique :

10 mL / min, pression : 136 bar) sont réalisées. La cirsimarine est éluée au bout de

5 minutes. Les fractions correspondant à la cirsimarine sont rassemblées, concentrées à

l’évaporateur rotatif (Büchi) et lyophilisées (Heto FD3, Jouan-Nordic Als, Denmark).

2.2. Résultats et conclusions

2.2.1.Identification de la cirsimarine

Les résultats du spectre du proton figurent dans le tableau 1. L’identification des différents

groupements chimiques de la cirsimarine est obtenue en combinant les données

correspondantes au déplacement chimique (δ), à l’intégration du signal, à la multiplicité

(singulet s ou doublet d) et à la valeur de la constante de couplage J.

41

Déplacement chimique (δ) en dpm

Intégration du signal

Multiplicité singulet (s) ou doublet (d)

Valeur de la constante de couplage (J) en Hertz

Groupement chimique

12,8 1H s - 5-OH 88 2H d 9,06 H-2’ et H-6’ 7,21 2H d 9,06 H-3’ et H-5’ 6.98 1H s H-3 5,4 1H d 4,8 proton anomère 3,93 3H s - 6-OMe 3,74 3H s - 7-OMe

Tableau 1 : Résultats du spectre RMN du proton pour l’échantillon E090 Les spectres RMN du proton et du carbone de l’échantillon E090 (référence) sont cohérents

avec ceux publiés (Park et al. 1995a; Park et al. 1995b) : l’échantillon reçu est bien de la

cirsimarine.

Les résultats du spectre du carbone figurent dans le tableau 2. A chaque déplacement

chimique (δ) enregistré a été attribué le groupement chimique correspondant.

Déplacement chimique (δ) en dpm

Groupement chimique

163,28 C-2 103,54 C-3 182,2 C-4 151,93 C-5 131,82 C-6 158,62 C-7 91,59 C-8 152,57 C-9 105,08 C-10 123,77 C-1’ 128,10 C-2’ ; C-6’ 116,48 C-3’, C-5’ 160,27 C-4’ 59,95 6-OCH3 56,37 6-OCH3 99,71 GLC-C-1 73,09 GLC-C-2 76,46 GLC-C-3 69,57 GLC-C-4 77,11 GLC-C-5 60,56 GLC-C-6

Tableau 2 : Résultats du spectre RMN du carbone pour l’échantillon E090

42

2.2.2.Méthodes de dosage

Méthode par chromatographie sur couche mince haute performance (HPTLC)

Dans le tableau 3 sont rassemblés les résultats d’un dosage utilisant le système HPTLC

(Camag) permettant de quantifier la teneur en cirsimarine d’un extrait hydro-éthanolique E.

Solutions

Volume déposé (µL)

Quantité de cirsimarine déposée (ng)

Hauteur du pic à 254 nm (unité arbitraire UA)

Solvant CH3OH / DMSO; 95 / 5 0,2 0 0 Solvant CH3OH / DMSO ; 95 / 5 1,2 0 0 Solution de cirsimarine à 0,15 mg / mL 0,2 30 9,78 Solution de cirsimarine à 0,15 mg / mL 0,4 60 19,76 Solution de cirsimarine à 0,15 mg / mL 0,6 90 30,88 Solution de cirsimarine à 0,15 mg / mL 0,8 120 40,91 Solution de cirsimarine à 0,15 mg / mL 1 150 55,81 Solution de cirsimarine à 0,15 mg / mL 1,2 180 61,83 Extrait E dilué au 1/5 0,5 X 31

Tableau 3 : Gamme étalon de cirsimarine (de 0 à 180 ng), recherche de la concentration en cirsimarine d’un extrait hydro-éthanolique E, dosage par HPTLC.

La figure 10 correspond à la droite étalon : hauteur du pic à 254 nm (unité arbitraire, UA) en

fonction de la quantité de cirsimarine déposée (ng). D’après l’équation de la courbe, si y =

31 (hauteur du pic à 254 nm pour l’extrait E dilué au 1/5), x vaut 89 ng. Sachant que 0,5 µL

a été déposé, l’échantillon E dilué au cinquième contient 178,4 ng de cirsimarine par µL. et

Par conséquent l’extrait E contient 892 µg de cirsimarine par mL.

y = 0,3556x - 0,7221R2 = 0,9954

010203040506070

0 50 100 150 200

Quantité de cirsimarine (ng)

Hau

teur

du

pic

à 25

4nm

(UA

)

Figure 10 : Droite étalon permettant le dosage par HPTLC de la cirsimarine contenue dans l’extrait E

43

Méthode par chromatographie analytique liquide haute performance (HPLC)

Dans le tableau 4 figurent les résultats d’un dosage utilisant le système HPLC (LaChrom)

utilisé pour doser la cirsimarine dans un échantillon E1.

Solutions Quantité de cirsimarine injectée µg

Aire du pic à 254 nm (unité arbitraire UA)

Solution standard 1 de cirsimarine à 90 µg / mL

1,8 1460183

Solution standard 2 de cirsimarine à 120 µg / mL

2,4 1994638

Solution standard 3 de cirsimarine à 150 µg / mL

3 2509457

Solution standard 4 de cirsimarine à 180 µg / mL

3,6 3043505

Solution standard 5 de cirsimarine à 210 µg / mL

4,2 3612767

Echantillon E1 dilué au 1/10 X 4032821

Tableau 4 : Gamme étalon de cirsimarine (de 0 à 4,2 µg), recherche de la concentration en cirsimarine d’un extrait hydro-éthanolique E1, dosage par HPLC. La figure 11 correspond à la droite étalon : aire du pic à 254 nm (UA) en fonction de la

quantité de cirsimarine injectée (µg). D’après l’équation de la courbe, si y = 4032821 (aire

du pic à 254 nm pour l’extrait E1 dilué au 1/10), x vaut 4,7 µg. Les injections réalisées étant

de 20 µL, l’échantillon E1 dilué au dixième comporte 235 µg de cirsimarine par mL. La

concentration en cirsimarine de E1 vaut 2,35 mg / mL.

y = 892339x - 152908R2 = 0,9997

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 1 2 3 4 5 6Quantité de cirsimarine (µg)

Aire

du

pic

à 25

4nm

(UA

)

Figure 11 : Droite étalon permettant le dosage par HPLC de l’extrait E1

44

2.2.3.Préparation de l’étalon

Méthode par chromatographie préparative liquide haute performance

Dans le tableau 5 figure la quantité de cirsimarine obtenue après deux purifications par HPLC

préparative.

Numéro de l’extrait utilisé pour purifier la cirsimarine. Concentration en cirsimarine dans cet extrait (extrait brut, non décoloré), dosage par HTPLC

Volume de l’extrait utilisé pour la purification de la cirsimarine. Quantité de cirsimarine présente dans l’extrait (théorique)

Quantité de cirsimarine purifiée

Rendement

D10864 : 1,56 mg / mL 48 mL 74,9 mg

58,1 mg 78%

D10829 : 1,8 mg / mL 30 mL 54 mg

34,5 mg 64%

Tableau 5 : Calcul du rendement de purification de la cirsimarine par HPLC préparative. Deux purifications ont été réalisées à partir de deux extraits (D10864 et D10829). Le rendement, exprimé en pourcentage, correspond à la quantité de cirsimarine purifiée / la quantité de cirsimarine présente dans l’extrait.

D’après ces deux essais, le rendement est de 70%, ce qui est une valeur satisfaisante.

La molécule d’intérêt, la cirsimarine est caractérisée et isolée, de façon à disposer d’un

étalon pour réaliser les différents tests. La finalité de ce travail étant de réaliser un extrait

végétal titré en cirsimarine, la partie suivante est consacrée à la mise au point de cet extrait

végétal.

45

3. Caractérisation, extraction du végétal et mise au

point d’un extrait sous forme de poudre titrée en

cirsimarine

La finalité de ce travail est de mettre au point un extrait végétal doué de propriétés

biologiques lui permettant d’être incorporé dans des produits de soins minceur. Notre

démarche nous a conduit à privilégier la cirsimarine, flavone décrite comme antagoniste des

récepteurs adénosine A1 (Hasrat et al. 1997c). C’est pourquoi, dans la partie précédente

cette molécule a été isolée dans le but de tester ses activités biologiques (cf. parties 4, 5 et

6). Dans cette partie, la présence de cette molécule a été recherchée dans diverses espèces

végétales afin de sélectionner le matériel végétal à utiliser. Puis, un extrait végétal, titré en

cirsimarine, sera ensuite mis au point. Les propriétés biologiques de cet extrait seront par la

suite étudiées (cf. parties 4 et 5).

3.1. Matériels et méthodes

3.1.1.Choix de la plante

Recherche de plantes contenant de la cirsimarine

Peu de plantes sont signalées contenir de la cirsimarine à l’état naturel. Outre Microtea

debilis Sw., plante de la famille des Phytolaccacées (Hasrat et al. 1997b) point de départ de

ce travail, la cirsimarine serait aussi présent dans Teucrium arduini (Lamiacées) (Harborne et

al. 1986), dans Clerodendrum mandarinorum (Verbenacées) (Zhu et al. 1996), dans

Scoparia dulcis (Scrophulariacées) (Freire et al. 1991) ainsi que dans diverses variétés de

Cirsium (Composées) : Cirsium maritimum (Harborne and Baxter, 1999), Cirsium japonicum

(Park et al. 1995a) et Cirsium pendulum (Yun and Chang 1978).

Microtea debilis Sw. est une petite plante herbacée, annuelle, originaire d’Amérique du sud ;

elle pousse entre le niveau de la mer et 650 m d’altitude, du Guatémala jusqu’au Pérou ainsi

qu’au Brésil (Fournet, 2002). Elle est signalée en Guyane française et au Suriname où elle

connaît une utilisation en médecine traditionnelle sous forme de poudre de plante séchée,

administrée par voie orale pour soigner les protéinuries (Hasrat et al. 1997b; Standley and

Steyermark, 1946). Aux Antilles françaises, c’est une plante médicinale pour soigner « les

maladies d’yeux ainsi que les maux d’estomac ». Nous avons pu nous procurer en Guyane,

46

un échantillon de plante séchée. Un spécimen de cette plante a été déposé (numéro 24) à

l’institut de botanique, homéopathie et pharmacognosie de Lyon.

Teucrium arduini est une plante largement répandue dans le bassin méditerranéen. La

cirsimarine serait un produit d’excrétion de la plante que l’on retrouverait à la surface des

feuilles et des tiges (Harborne et al. 1986).

Clerodendrum mandarinorum est un arbuste pouvant atteindre 20 m de hauteur originaire de

Chine (Zhu et al. 1996).

Scoparia dulcis est une plante répandue dans plusieurs pays tropicaux. Elle serait abondante

en Amérique du Sud, spécialement dans la forêt amazonienne. C’est une plante herbacée

pouvant atteindre 50 cm de hauteur, avec des feuilles dentelées et des fleurs blanches. Elle

est utilisée en médecine traditionnelle pour ses propriétés anti-inflammatoires, hypotensives

et analgésiques. La cirsimarine est un composé de la partie aérienne de cette plante (Freire

et al. 1996; Pereira-Martins et al. 1998).

Cirsium maritimum, Cirsium japonicum et Cirsium pendulum sont des plantes herbacées

sauvages d’origine asiatique, relativement répandues au Japon, en Corée et en Chine. Ces

plantes sont connues pour avoir des propriétés biologiques et nutritionnelles (Nakasugi,T.

and Komai,K. 1999; Park et al. 1995a; Park et al. 1995b; Yun and Chang 1978). Les Cirsium

sont des plantes pérennes, avec de belles fleurs ressemblant à celles de nos chardons.

Cirsium japonicum est proposé par plusieurs herboristeries sous le nom de Da Ji ou

Da Xiao Ji.

Conditions d’extraction de la cirsimarine décrites dans la bibliographie

A la lecture des différents articles parus sur la mise en évidence et l’isolation de la

cirsimarine, on remarque que si ce composé a toujours été extrait à partir de plante sèche,

les conditions d’extraction varient d’une étude à l’autre. Ainsi, pour obtenir un extrait

comportant de la cirsimarine, Hasrat utilise de l’éthanol à 80% pour réaliser un extrait de

Microtea debilis Sw. ou de Scoparia dulcis (Hasrat et al. 1997a), Park utilise du méthanol

pour réaliser un extrait de Cirsium japonicum (Park et al. 1995a), Zhu utilise de l’éthanol à

70% pour réaliser un extrait de Clerodendrum mandarinorum (Zhu et al. 1996). Enfin,

Arisawa a travaillé à partir de Teucrium arduini et a utilisé du chloroforme comme solvant

d’extraction (Arisawa et al. 1987).

47

Pré-étude : recherche d’une source de cirsimarine

Le but de cette pré-étude est de sélectionner la plante la plus riche en cirsimarine. Parmi les

plantes répertoriées dans la bibliographie, nous avons pu nous procurer des échantillons de

Cirsium japonicum (plante sèche, entière, en provenance de Chine), de Microtea debilis Sw.

(plante sèche, partie aérienne, en provenance de Guyane française) et de Scoparia dulcis

(plante sèche, entière, en provenance d’Amérique centrale).

Pour chacune de ces trois plantes, différents essais ont été réalisés en suivant au mieux les

conditions d’extractions décrites dans la bibliographie.

Pour Cirsium japonicum, l’utilisation de l’éthanol a été préférée à celle du

méthanol, solvant mentionné dans la publication (Park et al. 1995a). En

effet, même si l’éthanol présente un pouvoir solubilisant moindre que le

méthanol vis-à-vis des polyphénols, sa toxicité est moindre. Quatre

essais (température ambiante, agitation magnétique, durée 7 heures)

ont été réalisés afin de s’assurer de la présence de ce flavonoïde dans

cette plante. La description des essais figure dans le tableau 6.

Pour Microtea debilis Sw., l’éthanol a été utilisé comme solvant

d’extraction, c’est celui qui était recommandé dans la littérature (Hasrat

et al. 1997a; Park et al. 1995a). Deux essais (tableau 6) ont été réalisés

(température ambiante, agitation magnétique, durée 7 heures).

Pour Scoparia dulcis, les recommandations de la littérature ont été

suivies, l’éthanol a été utilisé comme solvant d’extraction (Hasrat et al.

1997a; Park et al. 1995a), cf. tableau 6.

Plantes utilisées % de plante mis en œuvre (p/v de solvant d’extraction)

Composition du solvant d’extraction (éthanol / eau)

Cirsium japonicum 5 5 5 5

0 / 100 50 / 50 80 / 20 100 / 0

Microtea debilis Sw. 5 10

80 / 20 80 / 20

Scoparia dulcis 10 80 / 20

Tableau 6 : Description des essais réalisés avec Cirsium japonicum, Microtea debilis Sw. et Scoparia dulcis.

Après analyses par CCM de chacun des sept extraits réalisés (tableau 6), la cirsimarine est

retrouvée uniquement dans Microtea debilis Sw. C’est cette plante qui sera utilisée dans la

suite de ce travail.

48

3.1.2.Choix des conditions d’extraction

Le but de ces essais est d’optimiser les conditions d’extraction de la plante retenue afin

d’obtenir un extrait le plus riche possible en cirsimarine. Pour optimiser les conditions

d’extraction, nous testerons l’influence de trois facteurs (nature du solvant, température

d’extraction, durée de l’extraction) sur deux critères (concentration en cirsimarine dans

l’extrait et quantité de matière sèche contenue dans l’extrait). La présence éventuelle de

molécules actives autres que la cirsimarine dans l’extrait végétal, justifie de s’intéresser à la

quantité de matière sèche extraite.

Pour mesurer la quantité de matière sèche contenue dans un extrait végétal, une quantité

connue de l’extrait végétal (liquide) est placée dans une étuve à 105°C durant 15 h. La

quantité de matière qui en résulte (en g) correspond à la matière sèche, elle s’exprime en

pourcentage par rapport à la masse de l’extrait végétal liquide (en g) placé dans l’étuve.

Tous les extraits ont été réalisés avec 10% (p/v) de plante sèche broyée, il s’agit de la

quantité maximum de plante pouvant être mise en œuvre au laboratoire. Des essais

complémentaires, réalisés avec des quantités supérieures à 10%, ont montré une mauvaise

imprégnation de la plante par le solvant d’extraction.

Une des façons de concentrer au maximum l’extrait végétal est d’éliminer la totalité du

solvant d’extraction, l’extrait obtenu est alors sous forme poudre.

Choix du solvant d’extraction

D’après les travaux de Hasrat (Hasrat et al. 1997a; Park et al. 1995a), la cirsimarine est

isolée à partir d’un extrait hydro-éthanolique de Microtea debilis Sw. Ce travail visant à

développer un extrait végétal sous forme poudre, il est important d’utiliser un solvant

d’extraction pouvant s’éliminer facilement et utilisé de façon courante pour la réalisation

d’extraits végétaux pour la cosmétique, ce qui est le cas de l’éthanol. Pour ces raisons, nous

avons choisi comme solvant d’extraction un mélange éthanol-eau. Plusieurs proportions

d’éthanol ont été testées : 20%, 50%, 70% et 80%. Chaque essai est réalisé comme

l’indique le tableau 7. Ces extraits ont été réalisés à température ambiante, sous agitation

magnétique durant cinq heures.

Nature de la matière première chargée Quantité de la matière première chargée

Plante Microtea debilis Sw., sèche, broyée, pesée sur une balance de précision

10 g

Solvant d’extraction 100 mL Total 10 g de plante / 100 mL solvant

Tableau 7 : Nature des matières premières mises en œuvre pour la réalisation des extraits végétaux

Après cinq heures d’extraction, le mélange brut est clarifié sur un papier filtre 11 µm

(Whatman) dans une fiole jaugée de 100 mL. L’erlenmeyer ainsi que le tourteau sont rincés

49

plusieurs fois avec du solvant neuf. Le volume du filtrat est ajusté au trait de jauge de la

fiole avec du solvant neuf.

Choix de la température d’extraction

Trois températures d’extraction sont étudiées : 25°C (température ambiante), 50°C ainsi que

la température à laquelle l’extrait végétal est au reflux (à ébullition, température supérieure

à 50°C). Tous les extraits sont réalisés avec un solvant d’extraction composé d’eau et

d’éthanol (30 / 70, v/v). L’extraction se déroule sous agitation magnétique durant cinq

heures.

Choix de la durée d’extraction

Des cinétiques d’extraction sont menées afin de définir la durée d’extraction optimale. Pour

cela, un extrait est réalisé (10% de plante, température de 50°C, agitation magnétique,

durée 24 h). Des prélèvements sont effectués au bout de 1 h, 3 h, 5 h, 7 h et 24 h.

3.1.3.Décoloration des extraits végétaux

Les extraits végétaux de Microtea debilis Sw. sont en général très colorés. Les molécules

responsables de la coloration des extraits peuvent être des molécules polaires ou apolaires.

Parmi les molécules polaires, on distingue les flavonoïdes (jaunes à orangés), les

anthocyanes (bleus, violets, rouges) et les tannins (marrons à bruns). Ces molécules sont

solubles dans des mélanges eau-alcool. Parmi les molécules apolaires, on retrouve les

caroténoïdes (jaunes à rouges), les xanthophylles (jaunes), les tocophérols (jaunes à

oranges), solubles dans des solvants apolaires (chloroforme, heptane). La chlorophylle est

soluble dans les solvants apolaires ainsi que dans les alcools.

Plusieurs techniques sont envisageables pour décolorer un extrait végétal :

le traitement des plantes par des solvants organiques afin d’éliminer, les

molécules responsables de la coloration ultérieure de l’extrait.

le traitement de l’extrait par des solvants organiques (extraction

liquide / liquide).

l’utilisation de terres décolorantes ou de charbons actifs. Ces deux

produits utilisent le procédé d’adsorption, procédé qui retient les

molécules (sans en modifier la structure) sur la surface interne ou

externe d’un solide. Les terres décolorantes sont généralement utilisées

pour décolorer les huiles. Les plus utilisées sont des argiles de type

Montmorillonites ou Bentonites. Les charbons actifs sont des composés

carbonés (80% de carbone), de grande surface spécifique (entre

50

1000 m²/g et 2000 m²/g). Ils sont obtenus à partir de matières

premières riches en carbone (bois, tourbe, lignite, bourre de coco…). Les

matières premières sont ensuite activées (physiquement ou

chimiquement). En fonction du type d’activation et de la matière

première utilisée, différents types de charbon sont obtenus, caractérisés

essentiellement par leur porosité (surface spécifique).

L’objet de ce travail est de choisir une technique de décoloration, permettant de diminuer la

couleur de l’extrait végétal tout en préservant sa teneur en cirsimarine. Nous avons par

conséquent testé les trois techniques de décoloration pré-citées :

le traitement de la plante par un solvant organique.

le traitement de l’extrait par une extraction liquide / liquide.

Les solvants utilisés dans ces deux techniques, ont été choisis principalement en fonction de

deux critères : solvants autorisés par l’industrie chimique et cosmétique dans la fabrication

d’extraits végétaux, solvants pouvant être utilisés à l’échelle industrielle.

le traitement de l’extrait par des charbons actifs.

L’extrait végétal utilisé dans ce travail à mis en œuvre 10% (p/v) de plante sèche broyée

dans un solvant hydro-éthanolique (70 / 30, v/v) durant 7 heures à 50°C sous agitation.

Traitement de la plante par solvant

Ce procédé consiste à traiter la plante par un solvant organique à chaud (60°C) ou à

température ambiante, sous agitation pendant une durée définie dans le but d’éliminer le

maximum de molécules colorantes. Deux séries d’essais ont été réalisées. Les solvants

utilisés proviennent de chez Carlo-Erba.

La première série d’essais consiste à mettre en œuvre 10% (p/v) de plante sèche broyée

avec différents solvants (heptane, acétate d’éthyle, acétone, propanol-2 ou méthyl éthyl

cétone) et de placer le mélange sous agitation (en chauffant éventuellement) pour une durée

de six heures. Après filtration, la plante est mise à sécher sous hotte. L’extraction est ensuite

réalisée avec la plante traitée. Les conditions d’extractions sont celles qui ont été définies

préalablement dans ce travail (cf. section 3.2.1) : 10% (p/v) de plante sèche broyée,

solvant d’extraction composé de 70% d’éthanol et de 30% d’eau, durée de 7 heures à 50°C

sous agitation.

Pour chaque extrait obtenu, sont recherchées la concentration en cirsimarine, la teneur en

matière sèche et la valeur de son indice Gardner. L’indice Gardner permet de caractériser la

couleur des extraits végétaux par rapport à des référentiels (platinate de potassium, chlorure

de fer ou chlorure de cobalt). L’appareil utilisé, un colorimètre Lico 50 (Dr Lange), attribue

51

des indices compris entre 0 et 12. Les solutions claires ont un indice faible par opposition aux

solutions foncées qui ont un indice élevé.

Dans la seconde série d’essais, le solvant de traitement de la plante est renouvelé. Les

solvants étudiés sont ceux qui ont donné les meilleurs résultats dans la première série

d’essais. De la même façon que précédemment, 10% (p/v) de plante sèche broyée sont mis

en œuvre avec différents solvants (heptane, acétate d’éthyle et méthyl éthyl cétone), placés

sous agitation (en chauffant éventuellement) pendant une heure. Le solvant est ensuite

renouvelé, le mélange placé sous agitation pendant une heure. Cette opération est répétée à

trois reprises. Après filtration, la plante est mise à sécher. L’extraction est ensuite réalisée

avec la plante traitée. Pour chaque extrait obtenu, les mêmes analyses que pour la première

série d’essais sont réalisées.

Extraction liquide-liquide

Ce procédé consiste à traiter l’extrait par un solvant organique non miscible avec le solvant

de l’extrait. Pour cela, trois extractions liquide-liquide successives par un solvant organique

sont réalisées. Les solvants organiques testés sont l’heptane, l’hexane et le pentane (Carlo

Erba).

Traitement des extraits par l’utilisation de charbons actifs

Ce procédé consiste à traiter l’extrait à décolorer avec plusieurs types de charbons actifs

sous forme poudre (tableau 8). Le traitement s’effectue à température ambiante, sous

agitation magnétique et pendant une durée définie.

Fournisseur Nom commercial Mode d’activation Surface spécifique (m²/g)

pH

Ceca Acticarbone CXV Activation chimique par de l’acide phosphorique

1200 3-7

Norit CN 1 Activation chimique par de l’acide phosphorique puis neutralisé

1400 5,5-8

Norit SA 4 Activation physique d’intensité faible, à la vapeur d’eau

800 alcalin

Norit SX plus Activation physique d’intensité moyenne, à la vapeur d’eau, suivie d’un lavage à l’HCl

1100 7

Tableau 8 : Nature et caractéristique des charbons actifs étudiés

52

3.1.4. Mise au point d’un extrait sous forme poudre

Pour obtenir un extrait sous forme poudre à partir d’un extrait sous forme liquide plusieurs

techniques sont possibles : la lyophilisation, l’atomisation ou encore la granulation humide.

La lyophilisation, également appelée séchage à froid, est basée sur le principe physique de la

sublimation de l’eau (passage de l’état solide à l’état gazeux). Ce procédé comporte plusieurs

étapes : congélation de l’extrait (état solide), sublimation de la glace en vapeur d’eau,

récupération de la vapeur d’eau, retrait de l’extrait sous forme solide (poudre).

L’atomisation, également appelée séchage par pulvérisation, consiste à pulvériser l’extrait à

sécher sous forme d’un fin brouillard dans un courant d’air chaud, de manière à obtenir

presque instantanément une poudre.

La granulation par voie humide consiste à pulvériser l’extrait sur un lit de support solide

fluidisé et chaud, permettant simultanément la fixation de l’extrait sur le diluant et le

séchage des particules formées.

La lyophilisation, technique couramment utilisée chez Gattefossé a été retenue. Pour cela, un

extrait de Microtea debilis Sw. est concentré au rotavapor de laboratoire (Büchi) réglé à

40°C, et à 70 mbars afin d’éliminer toute trace d’éthanol (la présence de solvant organique

empêche une congélation homogène et peut rendre impossible la lyophilisation). Lorsque la

concentration de l’extrait est terminée, de la maltodextrine (Glucodry 210, Amylum Group)

est ajoutée. Ce composé, support de lyophilisation, améliore le processus de lyophilisation.

Le mélange obtenu est congelé puis lyophilisé (Heto FD3, Jouan-Nordic Als, Denmark),

broyé, homogénéisé et conditionné. La poudre obtenue au final contient 50% de

maltodextrine, cette quantité assure une lyophilisation homogène de l’extrait. La teneur

finale en cirsimarine de cette poudre est dosée par HPLC analytique.

53

3.2. Résultats et conclusions

3.2.1.Choix des conditions d’extraction

Les conditions d’extraction de Microtea debilis Sw. sont sélectionnées en fonction de la

teneur en cirsimarine de l’extrait végétal ainsi que de la teneur en matière sèche des

extraits. En effet, la présence éventuelle de molécules actives autre que la cirsimarine justifie

de s’intéresser à la quantité de la matière sèche extraite.

Choix du solvant d’extraction

Quatre mélanges d’eau et d’éthanol ont été utilisés : 20 / 80 ; 30 / 70 ; 50 / 50 ; 80/ 20

(v/v) à partir desquels quatre extraits ont été réalisés, chacun d’eux mettant en œuvre

10% (p/v) de plante sèche broyée. La concentration en cirsimarine et la quantité de matière

sèche présente dans l’extrait ont été mesurées (figure 12).

Figure 12: Sélection du solvant d’extraction. L’influence de différents pourcentages d’eau, de 20% à 80% est étudiée sur la concentration en cirsimarine dans l’extrait (graphique de gauche) et sur la quantité de matière sèche dans l’extrait (graphique de droite). Chaque graphique représente les moyennes ± SEM (n=4) de chacun des quatre essais. Chacun met en œuvre 10 g de plante sèche broyée pour 100 mL de solvant (x% d’eau et (100-X)% d’éthanol), sous agitation magnétique à température ambiante pour une durée d’extraction de 5 heures. Les astérisques indiquent une différence significative, test de Student p<0,05.

Pour obtenir des extraits riches en cirsimarine, le solvant d’extraction doit contenir au

maximum 50% d’eau. Par contre, on visualise peu de différences sur la concentration en

cirsimarine, que l’extrait contienne de 20 à 50%. La quantité de matière sèche contenue

dans l’extrait végétal est la plus importante dans les extraits réalisés avec au minimum 30%

d’eau. A la vue de ces résultats, le solvant d’extraction retenu est composé de 30 % d’eau et

de 70 % d’éthanol.

54

Choix de la température d’extraction

Afin de sélectionner la température d’extraction, trois extraits ont été réalisés à trois

températures différentes : température ambiante, 50°C et température à laquelle l’extrait

végétal est au reflux. Chaque extrait a mis en œuvre 10 g de plante Microtea debilis Sw.

dans 100 mL de solvant (30% d’eau et de 70% d’éthanol). La concentration en cirsimarine

dans l’extrait ainsi que la quantité de matière sèche présente dans l’extrait ont été dosées

(figure 13).

Figure 13 : Sélection de la température d’extraction. L’influence de trois températures d’extraction a été étudiée : ambiante, 50°C et reflux sur la concentration en cirsimarine dans l’extrait (graphique de gauche) et sur la quantité de matière sèche dans l’extrait (graphique de droite). Chaque graphique représente les moyennes ± SEM (n=4) de chacun des quatre essais. Chacun met en œuvre 10% de plante sèche broyée pour 100 mL de solvant (30% d’eau et 70% d’éthanol), sous agitation magnétique pour une durée d’extraction de 5 heures. Les astérisques indiquent une différence significative, test de Student p<0,05. A l’issue de ces résultats, nous avons choisi de réaliser les extractions à 50°C. A cette

température d’extraction, la concentration en cirsimarine ainsi que la quantité de matière

sèche présentes dans l’extrait sont supérieures à celles obtenues lorsque l’extraction est

réalisée à température ambiante.

Choix de la durée d’extraction

Afin de sélectionner la durée d’extraction, une cinétique a été réalisée sur un extrait mettant

en œuvre 10 g de plante Microtea debilis Sw. dans 100 mL de solvant (30% d’eau et 70%

d’éthanol) sous agitation magnétique à 50°C. Cinq prélèvements ont été réalisés : après une

heure, trois heures, cinq heures, sept heures et vingt-quatre heures d’extraction. A chaque

prélèvement, la concentration en cirsimarine ainsi que la quantité de matière sèche contenue

dans l’extrait sont dosées. Les résultats de ces dosages sont présentés dans la figure 14.

55

Figure 14 : Sélection de la durée d’extraction. L’influence de la durée d’extraction est étudiée (1h, 3h, 5, 7h et 24h). Pour chaque prélèvement, la concentration en cirsimarine dans l’extrait (graphique de gauche) et la quantité de matière sèche dans l’extrait (graphique de droite) sont dosées. Chaque graphique représente les moyennes ± SEM (n=4). L’extrait étudié met en œuvre 10% de plante sèche broyée pour 100 mL de solvant (70% d’éthanol, 30 % d’eau), il est réalisé sous agitation magnétique à 50°C.

Dans les conditions opératoires de cet essai, la majorité de la cirsimarine est extraite après

trois heures d’extraction et la majorité de la matière sèche est extraite après cinq heures

d’extraction. Afin de palier les variations pouvant survenir d’un essai à l’autre, lors de

transposition d’échelle, la durée de l’extraction sera fixée à sept heures.

3.2.2.Choix de la technique de décoloration de l’extrait végétal

Traitement de la plante par solvant

Dans une première série d’essais (tableau 9), nous avons étudié l’intérêt de traiter la plante

par un solvant organique (acétone, acétate d’éthyle, méthyl éthyl cétone, propanol-2 et

heptane) à froid (température ambiante) ou à chaud (60°C) durant six heures avant de

réaliser l’extraction. Pour cela, un extrait sans traitement préalable de la plante (extrait

témoin) a été réalisé afin de discuter de l’effet des différents traitements.

56

Solvant utilisé pour le traitement de la plante

Température Concentration en cirsimarine mg / mL (perte par rapport au témoin)

Matière sèche présente dans l’extrait (%) (perte par rapport au témoin)

Indice Gardner

Témoin (sans traitement de la plante) 2,0 2,0 11,7 (dilué au 1/3) Acétone ambiante 1,2 (-40%) 1,9 (-5%) 11 (dilué au ½) Acétone 60°C 0,9 (-45%) 1,9 (-5%) 11 (dilué au ½) Propanol-2 ambiante 1,3 (-35%) 1,8 (-10%) 11,8 (dilué au ½) Propanol-2 60°C 1,0 (-50%) 1,8 (-10%) 10,2 (dilué au ½) Méthyl-éthyl cétone ambiante 1,4 (-30%) 1,9 (-5%) 11,5 (dilué au ½) Méthyl-éthyl cétone 60°C 1,2 (-40%) 1,9 (-5%) 10,7 (dilué au ½) Acétate d’éthyle ambiante 1,6 (-20%) 2,0 11,4 (dilué au ½) Acétate d’éthyle 60°C 1,3 (-35%) 1,8 (-10%) 10,7 (dilué au ½) Témoin (sans traitement de la plante) 1,6 1,4 ND Heptane ambiante 1,4 (-12,5%) 1,4 ND Heptane 60°C 1,6 1,4 ND

Tableau 9 : Résultats de la première série d’essais, décoloration des extraits par traitement préalable de la plante avec différents solvants organiques. Chaque solvant utilisé a été étudié à froid (température ambiante) ou à chaud (60°C). Pour chaque essai ont été dosées, la concentration en cirsimarine, la matière sèche ainsi que l’indice de couleur Gardner. Ces valeurs sont comparées à celle du témoin (extrait sans traitement préalable de la plante). ND : valeur non déterminée.

Les solvants qui assurent le meilleur compromis entre une décoloration efficace et une

teneur des extraits en cirsimarine préservée sont dans l’ordre décroissant l’heptane, l’acétate

d’éthyle et le méthyl éthyl cétone.

Dans la seconde série d’essais (tableau 10), les trois solvants ayant donné les meilleurs

résultats de décoloration dans la première série d’essais ont été utilisés (acétate d’éthyle,

méthyl éthyl cétone et heptane). Chaque solvant organique a été renouvelé trois fois (trois

traitements de une heure).

Solvant Température Concentration en cirsimarine mg / mL (perte par rapport au témoin)

Matière sèche présente dans l’extrait (%) (perte par rapport au témoin)

Indice Gardner

Témoin 1.9 2,5 11,4 (dilué au ½) Acétate d’éthyle ambiante 1,0 (-47%) 2,3 (-8%) 10,3 (non dilué) Acétate d’éthyle 60°C 0,8 (-58%) 2,5 12 (non dilué) Méthyl éthyl cétone ambiante 0,8 (-58%) 2,2 (-12%) 11,3 (non dilué) Méthyl éthyl cétone 60°C 0,5 (-74%) 2,0 (-20%) 9 (non dilué) Heptane ambiante 1,4 (-26%) 2,3 (-8%) 11 (dilué au ½) Heptane 60°C 1,6 (-16%) 2,5 10,6 (dilué au ½)

Tableau 10 : Résultats de la seconde série d’essais, décoloration des extraits par traitement de la plante par solvants. Chaque solvant utilisé a été étudié à froid (température ambiante) ou à chaud (60°C). Pour chaque essai ont été dosées, la concentration en cirsimarine, la matière sèche ainsi que l’indice de couleur Gardner. Ces valeurs sont comparées à celle du témoin (extrait sans traitement préalable de la plante). Des trois solvants étudiés, le solvant à privilégier est l’heptane ; c’est lui qui préserve au

mieux la matière sèche et la concentration en cirsimarine.

57

Extraction liquide-liquide

L’intérêt de décolorer l’extrait végétal par la réalisation d’extraction liquide / liquide avec

différents solvants organiques (heptane, hexane et pentane) est étudié. Pour chaque essai,

la concentration en cirsimarine, la quantité de matière sèche ainsi que l’indice de couleur

Gardner obtenus après traitement sont comparés aux valeurs de l’extrait témoin (sans

traitement), cf. tableau 11.

Solvant Concentration en cirsimarine mg / mL

Matière sèche présente dans l’extrait (%)

Indice Gardner

Témoin 1,9 2,0 11,9 (dilué au ½) Heptane 1,9 2,0 11,1 (dilué au ½) Hexane 1,9 2,0 11,2 (dilué au ½) Pentane 1,9 2,0 11,0 (dilué au ½)

Tableau 11 : Résultats des essais, décoloration des extraits par extraction liquide-liquide. L’influence de trois solvants organiques (l’heptane, l’hexane et le pentane) est étudiée sur la concentration en cirsimarine, sur la quantité de matière sèche et sur l’indice de couleur Gardner.

Les trois solvants étudiés décolorent les extraits de façon similaire l’extrait végétal.

L’avantage de réaliser ce type de décoloration par rapport au traitement préalable de la

plante est de préserver la quantité de matière sèche de l’extrait ainsi que la concentration en

cirsimarine.

Traitement des extraits par l’utilisation de charbons actifs

Dans cette première série d’essais (tableau 12), nous avons testé sur 30 minutes le pouvoir

décolorant, sous agitation, de quatre charbons actifs (charbon CXV (Ceca), charbon CN1

(Norit), charbon SX plus (Norit) et charbon SA4 (Norit)). Chaque charbon a été testé à deux

concentrations (0,5% et 0,2%).

Charbon utilisé Quantité Concentration en cirsimarine mg / mL (perte par rapport au témoin)

Indice Gardner

Témoin 1,46 >12 CXV (Ceca) 0,5% (p/v) 1,17 (-20%) 8,2 CXV (Ceca) 0,2% (p/v) 1,43 (-2%) 11,1 CN1 (Norit) 0,5% (p/v) 1,01 (-31%) 8,3 CN1 (Norit) 0,2% (p/v) 1,31 (-10%) 10 SA 4 (Norit) 0,5% (p/v) 1,46 10,8 SA 4 (Norit) 0,2% (p/v) 1,13 (-21%) 11,7 SX plus (Norit) 0,5% (p/v) 1,16 (-21%) 9 SX plus (Norit) 0,2% (p/v) 1,45 (-1%) 11

Tableau 12 : Résultats préliminaires, décoloration par l’utilisation de charbons actifs. Chaque charbon actif étudié a été testé à deux concentrations (0,5% et 0,2%). Pour chaque traitement, la concentration en cirsimarine présente dans l’extrait ainsi que l’indice de couleur Gardner de l’extrait ont été mesurés et comparés à celle du témoin (sans traitement).

58

Les charbons les plus performants pour décolorer l’extrait tout en préservant la concentration

en cirsimarine sont les charbons CXV et SA4.

A l’issue de ces premiers résultats, nous avons réalisé des cinétiques de décoloration

(prélèvements à 0 h ; 30 min ; 1 h ; 2 h ; 3 h et 4 h) avec les quatre charbons actifs. Les

charbons CXV et CN1 ont été étudiés à 0,2% (p/v) et à 0,4% (p/v). Les charbons SX plus et

SA4 ont été étudiés de 0,5% et à 1% (p/v). Pour chaque prélèvement, nous avons mesuré la

concentration en cirsimarine et l’indice de couleur Gardner. Les résultats de cette cinétique

figurent dans le tableau 13.

59

CECA CXV 0,2% (p/v) 0,4% (p/v) Temps (h) Concentration en

cirsimarine mg / mL (perte par rapport au témoin)

Indice Gardner

Temps (h) Concentration en cirsimarine mg / mL (perte par rapport au témoin)

Indice Gardner

0 1,58 12 0 1,5 12 0,5 1,4 (-11%) 10,3 0,5 1,2 (-20%) 9 0,75 1,4 (-11%) 10,1 0,75 1,2 (-20%) 8,8 1 1,4 (-11%) 9,9 1 1.2 (-20%) 8,7 2 1,4 (-11%) 9,6 2 1,2 (-20%) 8,5 3 1,4 (-11%) 9,4 3 1,2 (-20%) 8,4 4 1,4 (-11%) 9,4 4 1,2 (-20%) 8,4 NORIT CN1 0,2% (p/v) 0,4% (p/v) Temps (h) Concentration en

cirsimarine mg / mL (perte par rapport au témoin)

Indice Gardner

Temps (h) Concentration en cirsimarine / mL (perte par rapport au témoin)

Indice Gardner

0 1,58 12 0 1,5 12 0,5 1,44 (-9%) 11,1 0,5 1,25 (-17%) 10 0,75 1,41 (-11%) 11 0,75 1,25 (-17%) 9,7 1 1,41 (-11%) 10,8 1 1,24 (-17%) 9,6 2 1,41 (-11%) 10,4 2 1,24 (-17%) 9,3 3 1,41 (-11%) 10,3 3 1,24 (-17%) 9,1 4 1,41 (-11%) 10,2 4 1,24 (-17%) 9 NORIT SX PLUS 0,5% (p/v) 1% (p/v) Temps (h) Concentration en

cirsimarine mg / mL (perte par rapport au témoin)

Indice Gardner

Temps (h) Concentration en cirsimarine mg / mL (perte par rapport au témoin)

Indice Gardner

0 1,55 12 0 1,38 12 0,5 1,34 (-14%) 10,6 0,5 1 (-35%) 8,5 0,75 1,34 (-14%) 10,2 0,75 0,99 (-36%) 8,4 1 1,32 (-15%) 10 1 0,98 (-37%) 8,4 2 1,32 (-15%) 9,8 2 0,98 (-37%) 8,3 3 1,32 (-15%) 9,6 3 0,95 (-39%) 8,2 4 1,32 (-15%) 9,6 4 0,93 (-40%) 8,2 NORIT SA 4 0,5% (p/v) 1% (p/v) Temps (h) Concentration en

cirsimarine mg / mL (perte par rapport au témoin)

Indice Gardner

Temps (h) Concentration en cirsimarine mg / mL (perte par rapport au témoin)

Indice Gardner

0 1,56 12 0 1,38 12 0,5 1,47 (-6%) 11,2 0,5 1,27 (-8%) 10,2 0,75 1,47 (-6%) 11,1 0,75 1,25 (-9%) 9,8 1 1,47 (-6%) 11,1 1 1,25 (-9%) 9,8 2 1,47 (-6%) 11 2 1,25 (-9%) 9,6 3 1,47 (-6%) 10,8 3 1,25 (-9%) 9,5 4 1,47 (-6%) 10,9 4 1,25 (-9%) 9,5

Tableau 13 : Résultats de la cinétique de décoloration d’un extrait végétal par l’utilisation de différents des charbons actifs. Pour chaque charbon étudié, une cinétique a été réalisée. A chaque prélèvement (0 h ; 30 min ; 1 h ; 2 h ; 3 h et 4 h), la concentration en cirsimarine présente dans l’extrait ainsi que l’indice de couleur Gardner de l’extrait ont été mesurés et comparés à celle du témoin (sans traitement).

60

D’après le tableau 13, les charbons qui décolorent le plus les extraits sont ceux qui fixent le

plus de cirsimarine :

Les charbons les plus efficaces pour la décoloration sont dans l’ordre

décroissant : SX plus (1%) ; CXV (0,4%) ; CN1 (0.4%) ; CXV (0.2%),

SA4 (1%) ; SX plus (0,5%) ; CN1 (0,2%) et SA4 ( 0,5%).

Les charbons qui conservent au mieux la concentration en cirsimarine

dans l’extrait sont dans l’ordre décroissant : SA4 (0,5%) ; SA4 (0,2%) ;

CN1 (0,2%) et CXV (0,2%) ; SX plus (0,2%) ; CN1 (0,4%) ; CXV

(0,4%) et SX plus .

Le charbon qui réalise le meilleur compromis entre la décoloration et la conservation en

cirsimarine est le charbon CXV (Ceca) à la concentration de 0,2% (p/v).

61

4. Effets de la cirsimarine et d’un extrait végétal sur

le métabolisme lipidique

4.1. Effets de la cirsimarine et d’un extrait végétal sur

la lipolyse

La lipolyse sera dans un premier temps étudiée sur un modèle d’adipocytes isolés de rat,

puis sur un modèle d’adipocytes isolés humains et enfin sur un modèle d’explants cutanés

humains.

4.1.1.Modèle d’adipocytes isolés de rat

Ce modèle, couramment utilisé au laboratoire, a été utilisé pour mettre en évidence l’activité

lipolytique de la cirsimarine.

Matériels et méthodes

Un tampon Krebs de pH 7,4 est préparé. Les réactifs utilisés proviennent de chez Sigma. Ce

tampon contient 118 mM de NaCl ; 4,69 mM de KCl ; 3,33 mM de CaCl2 ; 1,25 mM de

KH2PO4 ; 1,16 mM de MgSO4 ; 124 mM de NaHCO3 ; 6 mM de glucose et 44 mM de tampon

Hépès. Lorsque tous les composés sont dissous, le pH est ajusté à 7,4 avec une solution de

soude 0,1M. De l’albumine sérique délipidée (4% m/v Sigma) est ajoutée au tampon Krebs.

L’albumine délipidée fixe les acides gras libres produits lors de la lipolyse et évite la rétro-

inhibition de la lipolyse par ces molécules. Avant utilisation, le milieu d’incubation est filtré à

0,45 µm et porté à 37°C.

La suspension adipocytaire est obtenue selon la méthode décrite par Rodbell en

1965 (Rodbell 1965). Pour cela, du tissu adipeux épididymal est prélevé sur des rats Sprague

Dawley, sacrifiés par inhalation de dioxyde de carbone (340 ± 40 g ; Harlan France), en

accord avec la directive européenne (86 / 609 / EEC). Une fois prélevé, le tissu adipeux est

placé dans du milieu d’incubation contenant 188 unités / mL de collagénase de type II

(Sigma Aldrich) pendant une heure sous agitation douce. La collagénase dégrade le réseau

de collagène qui maintient les cellules adipeuses entre elles. Après numération, la suspension

adipocytaire peut être utilisée.

62

Pour apprécier l’activité lipolytique d’un produit, la suspension adipocytaire est répartie dans

des tubes coniques (Eppendorf) de 2 mL à la concentration d’environ 75 000 cellules par

mL. Si A est le volume en µL de la solution d’adipocytes nécessaire pour avoir la

concentration de 200 000 cellules par mL et B le volume en µL de solution mère du produit à

tester, il est ajouté successivement dans les tubes :

(1000-A-B) µL de tampon Krebs à 4% d’albumine

B µL de solution mère du produit à tester

A µL de suspension adipocytaire

Tous les essais sont répétés quatre fois. Pour que la réaction ait lieu, les tubes sont placés au

bain-marie à 37°C, sous agitation latérale douce. La réaction est arrêtée au bout d’une heure

en plongeant les tubes dans de la glace. Les adipocytes sont éliminés, les acides gras libres

présents dans le milieu d’incubation sont dosés par un test colorimétrique (kit de dosage

Wako). L’absence d’interférence entre les produits testés et le kit de dosage a été vérifiée.

L’activité lipolytique mesurée est exprimée en pourcentage par rapport à la référence

positive. L’EC50 (concentration efficace 50, concentration pour laquelle on observe 50% de

l’activité maximale de la molécule considérée) de la caféine et de la cirsimarine est ensuite

calculée en utilisant le logiciel Statview 4.5 (MacIntosh). Dans cette étude, la concentration

efficace 50 correspond à la concentration de produit nécessaire pour obtenir une activité

lipolytique de 50%.

La lipolyse obtenue après action des différents produits à tester est comparée :

à la lipolyse basale, c’est-à-dire à la lipolyse se produisant spontanément

lors de la mise en place de la réaction. Pour la mesurer, on prépare des

tubes contrôle dans lesquels on met A µL de solution adipocytaire,

(1000-A) µL de tampon Krebs. La moitié de ces tubes contrôle

(contrôle 1) est mise directement sur de la glace avant incubation afin

de stopper toute réaction enzymatique. L’autre moitié (contrôle 2) est

traitée de la même façon que les tubes échantillons. On soustrait la

lipolyse obtenue dans les tubes « contrôle 2 » à celle obtenue dans les

tubes « contrôle 1 » : c’est la lipolyse basale.

à la lipolyse obtenue avec une référence positive, c’est-à-dire avec une

molécule connue pour induire une activité lipolytique forte

(noradrénaline à 1 µM).

Résultats

Les activités lipolytiques de la cirsimarine et de la caféine sont présentées dans la figure 15.

Pour chaque essai (caféine et cirsimarine), les activités lipolytiques mesurées sont

63

normalisées par rapport à celle obtenue avec la noradrénaline (référence positive du test),

puis exprimées en pourcentage.

Figure 15 : Comparaison de l’activité lipolytique de la cirsimarine et de la caféine sur adipocytes isolés de rat. La manipulation a été répétée cinq fois. Pour chaque manipulation, n=3. NA = noradrénaline. Les lettres indiquent la significativité des variations observées. Deux produits sont significativement différents lorsqu’ils n’ont en commun aucune lettre (analyse de variance, test Fisher plsd –protected least significant difference-, p<0,05). Par exemple, l’activité lipolytique de la cirsimarine testée à 0,2 mM est significativement plus importante que celle de la caféine testée à 0,2 mM.

L’activité lipolytique de la cirsimarine et de la caféine est dose-dépendante aux

concentrations testées. La concentration la plus faible pour laquelle une activité lipolytique

est observée est de 5 µM pour la cirsimarine contre 0,2 mM pour la caféine. La EC50 pour la

caféine est de 0,49 ± 0,08 mM et de 0,025 ± 0,01 mM pour la cirsimarine.

Ce travail sur adipocytes isolés de rat a permis de valider l’intérêt de la cirsimarine comme

agent lipolytique. Les adipocytes de rat sont un modèle largement décrit dans la littérature,

utilisé couramment au laboratoire. Toutefois, l’objet de ce travail étant de développer un

produit amincissant, il est impératif d’étudier l’action de la cirsimarine sur du tissu adipeux

humain. C’est l’objet des deux parties suivantes.

64

4.1.2.Modèle adipocytes isolés humains

L’objet de cette partie est d’étudier l’activité lipolytique de la cirsimarine, puis de comparer

son effet à celle de la caféine. Enfin, l’association caféine et cirsimarine sera également

testée.

Matériels et méthodes

Le milieu d’incubation utilisé est composé de MEM pH 7,4 (Minimum Essential Medium, Merck

Eurolab), supplémenté avec 1,87 mg / mL de bicarbonate (Life Technologies), de mélange

d’antibiotique pénicilline / streptomycine (50 UI / mL et 50 µg / mL, Life Technologies),

2 mM de L-glutamine (Life Technologies) et 0,5% (p/v) d’albumine sérique délipidée

(Sigma).

Du tissu adipeux provenant d’une biopsie abdominale est placé dans du milieu d’incubation

contenant 200 UI de collagénase par mL. Il est placé à 37 °C pendant trente minutes. Cette

suspension est ensuite rincée plusieurs fois dans du milieu d’incubation afin d’éliminer la

collagénase. La solution d’adipocytes est répartie dans des tubes coniques (Eppendorf) de

2 mL de la même façon qu’en 4.1.1. L’activité lipolytique des produits à tester est comparée

à celle obtenue avec de l’isoprotérénol à 1 µM et avec de la théophylline à 1 mM et à 0,5 mM

références positives du test). Chacun des essais est répété 3 fois. La réaction est arrêtée soit

au bout de deux heures (étude 1), soit au bout d’une heure (étude 2 et 3) en plongeant les

tubes dans de la glace. L’activité lipolytique est mesurée en dosant la quantité d’acides gras

libres dans le milieu d’incubation (kit de dosage Wako).

Résultats

Dans une première étude, nous avons étudié l’activité lipolytique de la cirsimarine, de la

caféine et d’un mélange caféine / cirsimarine durant deux heures d’incubation (figure 16).

Les activités lipolytiques obtenues ont été comparées à celle de deux références positives : la

théophylline et l’isoprotérénol. La cirsimarine est diluée dans un mélange

NaOH 0,2 M / DMSO, 95 / 5, v/v. La caféine est diluée directement dans le milieu

d’incubation.

65

Figure 16 : Activité lipolytique de la cirsimarine et de la caféine sur adipocytes isolés humains. Étude 1. Condition : deux heures d’incubation, 0,5% d’albumine sérique délipidée. Le graphique représente les moyennes ± écarts-types (n=3). Les astérisques indiquent une différence significative par rapport au contrôle, test de Student p<0,05.

Dans cette étude,

la cirsimarine stimule de façon significative la lipolyse à toutes les

concentrations testées. Toutefois, on n’observe pas un effet dose dans

cette gamme de concentrations : les stimulations les plus fortes sont

celles obtenues avec les concentrations de 0,25 mM et de 0,1 mM. Cette

absence d’effet dose peut s’expliquer par le choix de la gamme de

concentration étudiée : il se peut que si des concentrations comprises

entre 0,1 mM et 0,001 mM avaient été choisies, on ait visualisé un effet

dose-réponse. Il se peut également que le temps d’incubation (deux

heures) soit trop long.

la caféine, testée à 1 mM ; 0,5 mM et 0,25 mM stimule fortement la

lipolyse. A 0,1 mM et à 0,01 mM la caféine ne modifie pas la quantité

d’acides gras libérés dans le milieu d’incubation.

66

le mélange caféine et cirsimarine stimule de façon significative la

lipolyse. Dans tous les cas, l’association caféine à 0,1 mM et cirsimarine

donne une meilleure stimulation que la cirsimarine seule (figure 17).

Figure 17 : Comparaison de l’activité lipolytique théorique et observée de l’association caféine et cirsimarine. Selon l’étude 1, la somme de l’activité lipolytique de la caféine 0,1 mM et de la cirsimarine 1 mM prises isolément produit 79 µM d’acides gras (caféine 0,1 mM : 42 µM et cirsimarine 1 mM : 37 µM) : c’est l’activité lipolytique théorique. Si on mélange dans un même tube de la caféine 0,1 mM et de la cirsimarine 1 mM, on dose 62 µM d’acide gras : c’est l’activité lipolytique observée.

Dans une deuxième étude, les activités lipolytiques de la cirsimarine et de la caféine ont été

comparées à celles de deux références positives : la théophylline et l’isoprotérénol (figure

18). Par rapport à la première étude, l’incubation des adipocytes est d’une heure et le milieu

réactionnel comporte 4% d’albumine délipidée. Ces paramètres ont été changés afin de se

placer dans les mêmes conditions que celles de l’étude sur adipocytes isolés de rat, décrite

en 5.1.1.

67

Figure 18 : Activité lipolytique de la cirsimarine et de la caféine sur adipocytes isolés humains. Étude 2. Condition : Une heure d’incubation, 4% d’albumine délipidée. Le graphique représente les moyennes ± écarts-types (n=3). Les astérisques indiquent une différence significative par rapport au contrôle, test de Student p<0,05. La cirsimarine testée à 1 mM ; 0,5 mM ; 0,25 mM stimule de façon dose-dépendante la

lipolyse. Aux concentrations les plus faibles testées (0,1 mM et 0,01 mM), la cirsimarine

montre encore une efficacité. La caféine montre une activité lipolytique quatre fois plus

importante que la cirsimarine aux concentrations 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM.

Dans la troisième et dernière étude (figure 19), on a étudié l’effet lipolytique de la caféine

lorsqu’on ajoute ou non de la cirsimarine à faible concentration

68

Figure 19 : Activité lipolytique de la cirsimarine et de la caféine sur adipocytes isolés humains. Étude 3. Condition : Une heure d’incubation, 4% d’albumine sérique délipidée. Le graphique représente les moyennes ± écarts-types (n=3). Les astérisques indiquent une différence significative par rapport au contrôle, test de Student p<0,05. La cirsimarine testée à 0,05 mM et 0,1 mM montre une activité lipolytique correspondant à

38% et 44% de celle observée avec l’isoprotérénol. Par contre, aux concentrations testées,

l’activité lipolytique du mélange caféine et cirsimarine, n’est pas plus importante que celle

obtenue avec la caféine à 0,5 mM.

D’après ces études, la cirsimarine possède une activité lipolytique sur adipocytes isolés

humains. Dans la partie suivante, nous nous étudierons l’activité lipolytique d’un extrait

végétal, titré en cirsimarine, sur des explants de peau humaine, modèle le plus proche des

conditions d’utilisation du produit en cours de développement.

4.1.3.Modèle explants de peau humaine

Les activités lipolytiques d’un extrait végétal (contenant 2,5 % de cirsimarine), de la caféine

et de mélanges caféine / extrait végétal sont mesurées et comparées à celle d’un produit

commercial, Percutaféine®. L’extrait végétal, la caféine et les mélanges caféine / extrait

végétal sont formulés dans un gel et appliqués sur des explants de peau humaine (prélevés

sur des donneurs féminins âgés de 30 à 40 ans) pendant une période de 10 jours à raison

69

d’une application tous les deux jours. L’activité lipolytique est évaluée par le dosage des

lipides libérés dans le milieu d’incubation. Ce travail a été réalisé à partir de trois plasties

différentes (n=3).

Matériels et méthodes

Les produits à évaluer sont formulés sous forme de gel (avec les ingrédients et selon le

protocole mentionné dans le tableau 14) :

le produit 1 (P1) contient 1% d’extrait de Microtea debilis Sw. (soit

0,525 mM en équivalent cirsimarine) et caféine 5%.

le produit 2 (P2) contient 5% de caféine.

le produit 3 (P3) contient 1% d’extrait de Microtea debilis Sw.

le produit 4 (P4) contient 0,5% d’extrait de Microtea debilis Sw. (soit

263 mM en équivalent cirsimarine) et 5% caféine.

le produit 5 (P5) contient 0,5% d’extrait de Microtea debilis Sw.

Tableau 14 : Liste des ingrédients utilisés pour la formulation des gels testés sur explants. Pour une formulation plus aisée, ces ingrédients sont regroupés en trois pré-mélanges (ou phases). Préparation de la phase I : saupoudrer le carbopol dans l’eau et laisser reposer quelques minutes, sous agitation, ajouter les autres ingrédients (alcool 96%, propylène glycol et cétiol HE). Les ingrédients de la phase II sont ensuite ajoutés sous agitation. Lorsque les poudres sont complètement dispersées, le pH est ajusté à pH = 6,0 avec de l’aminomethyl propanol.

Pour chaque étude, 42 explants de peau entière sont préparés et placés dans un milieu défini

puis répartis en sept lots de six explants : un lot témoin (lot T) ; un lot témoin positif,

produit Percutaféine® (lot R) ; un lot P1 ; un lot P2 ; un lot P3 ; un lot P4 et un lot P5.

A J0 (jour 0) les explants sont placés dans 2 mL de milieu d’incubation. Les produits sont

appliqués comme suit :

les explants (n=6) du lot T ne reçoivent aucun traitement

les explants (n=6) du lot R reçoivent 2 mg / cm² de produit de

référence, Percutaféine®.

les explants (n=6) du lot P1 reçoivent 4 mg / cm² de produit P1.

Ingrédients Désignation INCI % (w/w) Fonction des ingrédients

Phase I

Eau déminéralisée Water qsp 100,00 Carbopol Ultrez 21 (2) Acrylate / C10-30 alkyl

acrylate crosspolymer 1,00 Agent gélifiant

Alcool 96% Alcohol 40,00 Solvant Propylène Glycol (1) Propylene glycol 5,00 Solvant Cétiol HE (3) PEG-7 glycéryl cocoate 5,00 Emolient Phase II Extrait Microtea debilis Sw. (1) et / ou caféine (4)

Selon les formules

Ingrédient actif

Phase III AMP-95 (50% sol) (5) Aminomethyl propanol 1,00 Agent neutralisant (1) Gattefossé / (2) Novéon / (3) Cognis / (4) Merck / (5) Angus

70

les explants (n=6) du lot P2 reçoivent 4 mg / cm² de produit P2.

les explants (n=6) du lot P3 reçoivent 4 mg / cm² de produit P3.

les explants (n=6) du lot P4 reçoivent 4 mg / cm² de produit P4.

les explants (n=6) du lot P5 reçoivent 4 mg / cm²

de produit P5.

L’application de chaque produit est renouvelée à J2, J4, J6 et J8. Pour chaque explant, 100 µL

de milieu d’incubation sont prélevés à J1, J2, J3, J4, J5, J8 et regroupés dans un tube placé à -

20°C en vue du dosage des lipides. A J8, trois explants de chaque lot sont retirés et fixés

dans du liquide de Bouin aqueux (VWR) en vue de l’étude histologique. Le liquide de Bouin

est considéré comme un fixateur universel. A J10 la totalité du milieu de culture restant est

prélevé et conservé à -20°C et les explants restants sont fixés dans du liquide de Bouin.

Les explants sont fixés, déshydratés, inclus dans de la paraffine, mis en bloc, coupés et

colorés au trichrome de Masson. La viabilité cellulaire des explants à J8 et à J10 est vérifiée

par un examen microscopique de la morphologie cellulaire des différents compartiments

cutanés. Le contrôle de la viabilité cellulaire détermine si l’extraction et le dosage des lipides

doivent être réalisés sur les milieux de culture prélevés jusqu’à J8 ou sur les milieux prélevés

jusqu’à J10.

Les lipides sont extraits du milieu de culture par de l’hexane : 8 mL de milieu sont mélangés

à 5 mL d’hexane, après deux centrifugations (10 minutes, 15000 rpm, 4°C) les phases

organiques sont rassemblées puis évaporées sous azote. Les lipides sont ensuite repris dans

un faible volume d’hexane et déposés sur une plaque silice (20 cm*10 cm). Conjointement

aux dépôts des milieux à étudier, des standards (monoglycérides, diglycérides, triglycérides

et acides gras) sont déposés.

La migration (95 minutes) est réalisée avec une phase mobile (hexane / éther de

pétrole / diéthyl éther / acide acétique, 60 / 5 / 20 / 15, v/v/v/v). La révélation s’effectue

avec un réactif au sulfate de cuivre (10 g de sulfate de cuivre, 69 mL d’eau osmosée, 23 mL

d’éthanol et 8 mL d’acide phosphorique). Après avoir appliqué le révélateur, la plaque est

chauffée à 105°C durant deux heures. Les lipides apparaissent sous forme de spots foncés

sur fond bleuté. La détection est réalisée par un scanner ChromImage. La quantification

utilise le logiciel Diamir JMBS.

Résultats

D’après la figure 20, tous les produits formulés sont lipolytiques. Après comparaison de

chaque produit un à un, on remarque que, au seuil de significativité α= 1% :

l’activité lipolytique du mélange caféine à 5% et extrait de Microtea

debilis Sw. à 0,5% (P4) est significativement différente de celle de

Percutaféine® (R), test de Student, p<0,01.

71

les activités lipolytiques des extraits de Microtea debilis Sw. à 0,5% (P5)

et à 1% sont comparables (P3), test de Student, p<0,01.

les activités lipolytiques de la référence positive (Percutaféine®) et de la

caféine à 5% sont comparables, test de Student, p<0,01.

les activités lipolytiques des deux mélanges P4 et P1 (caféine + extrait

végétal) sont différentes, test de Student, p<0,01.

Figure 20 : Activité lipolytique de l’extrait de Microtea debilis Sw. et de la caféine sur explants de peau humaine. Étude 1. Chaque barre représente les moyennes de six expériences ± écarts-types. Les astérisques indiquent une différence significative par rapport au contrôle, test de Student p<0,01.

72

La figure 21 montre les résultats obtenus à partir de la deuxième plastie. Après comparaison

de chaque produit un à un, on remarque que, au seuil de significativité α=1%:

tous les produits testés sont lipolytiques.

l’activité lipolytique de la caféine à 5% est comparable à celle de

Percutaféine® , test de Student, p<0,01.

les activités lipolytiques des produits P4 et P1 sont comparables, tout

comme les activités des produits P3 et P5 , test de Student, p<0,01.

Figure 21 : Activité lipolytique de l’extrait de Microtea debilis Sw. et de la caféine sur explants de peau humaine. Étude 2. Chaque barre représente les moyennes de six expériences ± écarts-types. Les astérisques indiquent une différence significative par rapport au contrôle, test de Student p<0,01. Les résultats obtenus avec la plastie 3 sont présentés dans la figure 22. On observe qu’au

seuil α=1% :

tous les produits testés sont lipolytiques.

l’activité lipolytique de la caféine formulée à 5% est comparable à celle

de Percutaféine®, test de Student, p<0,01.

l’activité lipolytique du produit P1 est supérieure à celle du produit P4 ,

test de Student, p<0,01.

l’activité lipolytique du produit P3 est supérieure à celle du produit P5 ,

test de Student, p<0,01.

73

Figure 22 : Activité lipolytique de l’extrait de Microtea debilis Sw. et de la caféine sur explants de peau humaine. Étude 3. Chaque barre représente les moyennes de six expériences ± écarts-types. Les astérisques indiquent une différence significative par rapport au contrôle, test de Student p<0,01.

D’après ces résultats, l’extrait de Microtea debilis Sw. induit le processus lipolytique

(libération d’acides gras). Cet effet peut être attribué à la cirsimarine mais également à

d’autres molécules contenues dans l’extrait végétal. Comme nous l’avons expliqué dans la

première partie de ce travail, plusieurs mécanismes peuvent stimuler la lipolyse (induire le

processus lipolytique) (figure 2). Hasrat et al. ont démontré que la cirsimarine agit comme

antagoniste des récepteurs A1 adénosine (Hasrat et al. 1997c). Dans la partie suivante nous

nous sommes intéressés à l’activité de la phosphodiestérase en absence et en présence de

cirsimarine.

74

Rappel de la figure 2. En bleu figurent les différentes cibles possibles de la cirsimarine.

4.1.4. Activité de la cirsimarine sur la phosphodiestérase

L’AMPc intracellulaire est transformé en 5’AMP par la phosphodiestérase. Ainsi, toute

molécule capable d’inhiber cette enzyme provoquera une augmentation de la concentration

intracellulaire d’AMPc, ce qui stimulera la lipolyse.

Matériels et méthodes

Le but de cet essai est de mettre en évidence l’effet inhibiteur de la cirsimarine sur la

phosphodiestérase et de le comparer à celui observé avec la caféine. Cet essai est réalisé

avec le kit de dosage [3H]cAMP SPA (Amersham). Le principe de cet essai est basé sur le fait

qu’en présence du sulfate de zinc, les nucléotides linéaires se lient préférentiellement aux

billes de silicate d‘yttrium SPA, par rapport aux nucléotides cycliques.

Le kit de dosage contient le tampon nécessaire pour réaliser le dosage, et un flacon de billes

de silicate d’yttrium. Ces billes fournies lyophilisées, sont mises en suspension dans de l’eau

déminéralisée avant utilisation, à la concentration de 20 mg / mL. Le traceur utilisé est une

solution d’[3H]cAMP à 1 mCi / mL (Amersham), avant utilisation il est dilué au 1/200 dans de

l’eau déminéralisée. La solution de phosphodiestérase est préparée à la concentration

de 0,05 g / L.

L’essai est réalisé dans des microplaques 96 puits (VWR), on ajoute successivement dans

chacun des puits 60 µL d’eau, 10 µL de tampon, 10 µL de traceur radioactif, 10 µL de la

molécule à tester. La plaque est placée durant 15 minutes sous agitation. La suspension de

75

billes de silicate d’yttrium (50 µL) est ajoutée. Après homogénéisation et incubation

(10 minutes, température ambiante) la radioactivité est lue avec un compteur à scintillation

(Top count counter, 96 well microtitre plate, PerkinElmer).

Résultats

L’activité de la cirsimarine est comparée à celle de la caféine. L’inhibition est pondérée par

rapport à celle de la référence positive du test, le milrinone à 10-3M. Les résultats sont

présentés dans la figure 23.

Figure 23 : Inhibition de la phosphodiestérase par la caféine et par la cirsimarine La caféine et la cirsimarine ont été testées à des concentrations de 1 mM ; 0,5 mM et 0,1 mM. L’inhibition est représentée en pourcentage par rapport au milrinone (référence positive) ± écarts-types. Les astérisques indiquent une différence significative par rapport à la concentration la plus faible testée, test de Student p<0,05.

La cirsimarine, flavonoïde majoritaire de l’extrait de Microtea debilis Sw., inhibe la

phosphodiestérase. L’AMPc produit n’étant pas transformé en 5’AMP, il s’accumule. Une telle

inhibition provoque une augmentation de la concentration d’AMPc intracellulaire ce qui

provoque l’amorce du processus lipolytique (cf figure 2).

*

76

Rappel de la figure 2. Les molécules inhibitrices de la phosphodiestérase conduisent à augmenter la concentration intracellulaire en AMPc et à amorcer le processus lipolytique.

Triglycérides

Récepteurs α2 adrénergiquesadénosine A1

Récepteurs β adrénergiques

AGL + glycérol

Gi Gs

ATPAMPc

- +

LHS phosphoryléeactive

5 ’AMP

Adénylyl cyclase

AGL + DG

AGL + MG

Phosphodiestérase

Inhibiteurs de la phosphodiestérase : cirsimarine, caféine

Protéine kinase A inactive

Protéine kinase A active

LHS inactive

77

4.2. Effets de la cirsimarine et d’un extrait végétal sur

la lipogenèse

L’activité anti-lipogénique de la cirsimarine (étude 1) et d’un extrait de Microtea debilis Sw.

(étude 2) a été mise en évidence sur un modèle d’adipocytes isolés humains.

4.2.1.Matériels et méthodes

Le milieu d’incubation utilisé pour l’étude de la lipogenèse sur un modèle adipocytaire

humain est composé de MEM (Minimum Essential Medium, Polylabo) auquel sont ajoutés

1,87 mg / mL de bicarbonate (Invitrogen), un mélange d’antibiotiques

pennicilline / streptomycine (50 UI / mL et 50 µg / mL, Invitrogen), de la L-glutamine

(2 mM, Invitrogen) et 0,5% (p/v) d’albumine sérique délipidée (Sigma). La suspension

d’adipocytes humains isolés est obtenue de la même façon que mentionnée au paragraphe

4.1.2.

Si A est le volume en µL de la solution d’adipocytes nécessaire B le volume en µL de solution

mère du produit à tester et C le volume en µl de solution de traceur radioactif (acétate

marqué au carbone 14 ; 2,07 GBq / mmol, 56 mCi / mmol ; Amersham), il est ajouté

successivement dans des tubes coniques de 2 mL (Eppendorf) : (1000-A-B-C) µL de milieu

d’incubation ; A µL de la suspension adipocytaire et B µL de solution mère du produit à

tester. Après incubation (une heure, 37°C), C µL d’acétate radioactif sont ajoutés. Les tubes

sont placés dans un incubateur ( 37°C, 5% de CO2) pendant 4 heures. La réaction est arrêtée

en plaçant les tubes dans la glace. Les lipides sont extraits du mélange réactionnel selon le

protocole de Bligh and Dyer (Bligh and Dyer 1959). La radioactivité est comptée. Les

données brutes du comptage radioactif ont été transférées sous le logiciel PRISM® (Graph

Pad Software), les comparaisons intergroupes ont été réalisées par analyse de variance

(ANOVA) à l’aide du test de comparaisons multiples de Dunnett.

4.2.2.Résultats

La première étude (figure 24), compare l’activité anti-lipogénique de la cirsimarine à celle

d’une référence positive : l’acide éicosapentaénoïque. La cirsimarine, préalablement diluée

dans une solution de NaOH 0,2M / DMSO (95 / 5, v/v) est testée à 0,03 mM. L’acide

éicosapentaénoïque, dilué dans de l’huile de vaseline est testé à 1 mM. La concentration de

0,03 mM a été choisie suite aux résultats obtenus avec la puce à ADN. Il s’agit de la

concentration maximale non cytotoxique de la cirsimarine après 24 heures d’incubation, sur

un modèle de fibroblastes humains en culture.

78

Figure 24 : Activité lipogénique de la cirsimarine comparée à celle d’une référence positive. Chaque essai a été réalisé en triple. Chacune des barres représente la moyenne de trois essais ± écarts-types. Les astérisques indiquent une différence significative par rapport au contrôle, test de Student, p<0,05. La cirsimarine à 0,03 mM possède une activité anti-lipogénique aussi importante que celle de

la référence positive, l’acide éicosapentaénoïque testé à 1 mM.

79

Dans la seconde étude (figure 25), l’activité lipogénique de la cirsimarine et celle de l’extrait

de Microtea debilis Sw. ont été comparées à deux références positives : la cérulénine et

l’acide éicosapentaénoïque.

Figure 25 : Activités lipogéniques de la cirsimarine et de l’extrait de Microtea debilis Sw. Chacune des barres représente la moyenne de trois essais ± écarts-types. Les astérisques indiquent une différence significative par rapport au contrôle, test de Student, p<0,05. La cirsimarine, testée à des concentrations comprises entre 0,03 mM et 0,003 mM inhibe

fortement l’incorporation de l’acétate dans les acides gras. L’effet dose réponse est peu

marqué, la cirsimarine à 0,003 mM doit être encore trop concentrée. L’extrait Microtea

debilis Sw., testé à des concentrations comprises entre 0,2 g / L et 22 mg / L inhibe

l’incorporation de l’acétate dans les acides gras de façon dose-dépendante.

D’après ces deux études, la cirsimarine ainsi que l’extrait Microtea debilis Sw. inhibent la

lipogenèse de façon dose-dépendante aux concentrations testées.

Après l’étude de la cirsimarine et de l’extrait végétal sur le métabolisme lipidique, la partie

suivante étudie les effets de ces deux composés sur la matrice extracellulaire.

80

5. Effets de la cirsimarine et d’un extrait végétal sur

la matrice extracellulaire

La cible des produits amincissants est généralement l’adipocyte, élément clé de la cellulite

(ou plus exactement de la lipodystrophie localisée), toutefois, certains produits contiennent

également des molécules restructurantes du derme. En effet, au cours du développement

important des adipocytes, la matrice extracellulaire est mise à mal, d’où l’importance de

proposer des composés restructurants qui améliorent la fermeté cutanée (Franchi et al.

2003). Ainsi, après le contrôle métabolique de l’adipocyte par les voies de la lipolyse et de la

lipogenèse, nous nous intéresserons à l’activité de l’extrait végétal sur la restucturation du

tissu conjonctif.

Les effets de la cirsimarine et de l’extrait végétal Microtea debilis Sw. sur la matrice

extracellulaire ont été étudiés sur l’expression génique (puces à ADN et RT-Q-PCR (reverse

transcription, quantitative polymerase chain reaction) ainsi que sur l’expression protéique

(western blot) de plusieurs composants de la matrice extracellulaire.

L’utilisation de puces à ADN permet de visualiser, au sein d’une même expérience, l’effet

d’un traitement sur l’expression de différents gènes d’intérêt. Les résultats obtenus par

l’utilisation de puces à ADN doivent être vérifiés par RT-Q-PCR.

5.1. Étude par puces à ADN

Le modèle de puce à ADN, appelé aussi DNA array est une méthode de biologie moléculaire

qui permet de tester simultanément l’expression de milliers de gènes. On distingue trois

types de puces à ADN : les macroarrays (jusqu’à 64 sondes greffées / cm²), les microarrays

(jusqu’à 104 sondes/ cm²), enfin les chips (jusqu’à 2,5 105 sondes / cm²). Une puce à ADN

porte, greffée sur sa surface (verre, polymère, silicium) des sondes (fragments courts d’ADN

simple brin) susceptibles de s’apparier à des brins complémentaires d’ADN dans des

conditions opératoires définies (température, salinité, pH). Lorsqu’un fragment d’ADN cible

de l’échantillon à tester reconnaît sa séquence complémentaire d’ADN sonde sur la puce, les

deux fragments s’apparient pour reconstituer la double hélice d’ADN : c’est le phénomène

d’hybridation. Les doubles hélices d’ADN formées sont marquées par des traceurs

fluorescents ou radioactifs.

La puce utilisée dans ce travail comporte 597 gènes greffés sur un support en nylon. Ces

gènes correspondent à des marqueurs majeurs exprimés par les kératinocytes, les

fibroblastes, les adipocytes, les mélanocytes ainsi que des gènes de ménage appelés aussi

gènes rapporteurs ou housekeeping genes. Théoriquement, l’expression de ces gènes est

81

constante et ne doit pas être modulée par un traitement expérimental. Les gènes

rapporteurs présents sur cette puce sont : le gène codant pour la glycéraldéhyde 3

phosphate déshydrogénase, la ß-actine, l’ubiquitine, la protéine ribosomale 60 S, la sous

unité α de l’antigène C-4 (HLA classe 1), la phospholipase A2, l’hypoxanthine guanine

phosphoribosyl transférase. Cette puce utilise la technologie ATLAS de Clontech et a été

développée par la société BioAlternatives. Il s’agit de la seconde génération de puce

développée par cette société, la première comportait 475 gènes. Cette dernière a fait l’objet

d’une validation sur trois modèles in vitro : kératinocytes humains normaux en monocouche,

épiderme humain reconstruit (SkinEthic) ainsi que sur biopsie d’épiderme humain normal

(Bernard et al. 2002).

L’objet de cette étude est d’étudier, sur un modèle de fibroblastes humains normaux, les

voies de signalisation ainsi que les différentes molécules modulées par la cirsimarine,

flavonoïde majoritaire de l’extrait Microtea debilis Sw.

5.1.1.Matériels et méthodes

Culture cellulaire et traitement

Les cellules étudiées sont des fibroblastes humains normaux (lot PF2, BioAlternatives),

utilisés au 8ème passage et cultivés dans un milieu DMEM (Life Technologies) additionné de

10% de sérum de veau fœtal (SVF, Life Technologies), d’antibiotiques

pénicilline / streptomycine (50 UI / mL et 50 µg / mL, Life Technologies), de glutamine

(2mM, Life Technologies). Ces cellules sont placées dans un incubateur (37°C, 5% de CO2).

A 80% de confluence (appréciée au microscope), le milieu de chaque boîte est remplacé par

un milieu composé de milieu DMEM additionné de 1% de SVF, des antibiotiques

pénicilline / streptomycine (50 UI / mL et 50 µg / mL, Life Technologies), de glutamine

(2 mM, Life Technologies). Lorsque les cellules sont confluentes, le milieu est changé et le

produit à étudier est ajouté. Les cellules sont replacées à l’incubateur pour un temps défini

en fonction des études à réaliser.

La solution mère de cirsimarine est préparée à 20 mM dans une solution de

NaOH 0,2 M / DMSO (95 / 5). La concentration maximale non cytotoxique de l’extrait

Microtea debilis Sw. est également recherchée. Pour cela, une solution mère de cet extrait

est réalisée à 10 g / L directement dans le milieu de culture. Ces solutions mères sont

ensuite diluées dans le milieu de culture pour obtenir les concentrations finales à tester. Des

cultures témoins sont réalisées dans les mêmes conditions de culture que les cultures

traitées.

82

Étude de la viabilité cellulaire

Les fibroblastes sont ensemencés en plaques 96 puits à 15000 cellules / puits et cultivés

jusqu’à confluence dans un milieu à 10% de SVF. A confluence, le milieu est changé et les

produits à évaluer sont ajoutés. Huit concentrations (tableau 15) sont étudiées pour chacun

des deux produits à étudier. La durée d’incubation des produits avec les fibroblastes est de

24 h.

Après 24 h d’incubation, la viabilité des fibroblastes est étudiée par le test au MTT (Mosmann

1983). Ce test permet de comparer le nombre de cellules vivantes avant et après traitement.

Il est basé sur la transformation du MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl

tétrazolium bromide, Sigma) en cristaux bleus de formazan par une enzyme mitochondriale,

la succinate déshydrogénase. Pour cela, 10 µL d’une solution de MTT (5 mg / mL d’eau

distillée) sont ajoutés dans chaque puits. Après 2 h d’incubation (37°C, 5 % de CO2), 100 µL

d’une solution de lyse (triton 10% dans du HCl 0,1M) sont ajoutés. Après dissolution du

colorant, l’absorbance de la solution à 540 nm est mesurée. Chaque essai est réalisé en

triple. Les blancs de lecture correspondent à du milieu MEM contenant du MTT et la solution

de lyse.

Produits testés Concentrations testées Cirsimarine 1 mM

0,33 mM 0,11 mM 0,037 mM 0,012 mM 4,1 µM 1,37 µM 0,46 µM

Extrait de Microtea debilis Sw. 5 g / L 1 g / L 0,2 g / L 0,04 g / L 8 mg / L 1,6 mg / L 0,32 mg / L 0,064 mg / L

Tableau 15 : Étude des cytotoxicités de la cirsimarine et de l’extrait Microtea debilis Sw. : concentrations testées

Extraction des ARN totaux

Des fibroblastes sont mis en incubation (37°C, 5% CO2) en présence de cirsimarine (30 µM

durant 6h et durant 24h) dans un milieu DMEM comportant 10% de SVF. L’extraction des

ARN totaux est réalisée avec le kit et selon la procédure Atlas Pure Total RNA Labeling

System (Clontech). Avant l'extraction, les cellules sont rincées à trois reprises avec du

tampon PBS (Phosphate-Buffered Saline : NaCl 137 mM ; Na2 / KPO4 10 mM ; KCl 2,7 mM ;

pH 7,4), puis trypsinées (trypsine 0,05% / EDTA 0,02% en solution dans du tampon PBS).

83

La trypsine est une enzyme qui dégrade les molécules d’adhésion des cellules. Il est

important de surveiller son action au microscope, en effet si elle agit trop longtemps, elle

détruit également la paroi cellulaire. Lorsque l’action de la trypsine est suffisante, du milieu à

10% de SVF est ajouté : le sérum qu’il contient inhibe l’action de la trypsine. La suspension

cellulaire obtenue est centrifugée (12000 rpm, 10 min, 4°C). Le culot cellulaire est lysé par

1 mL de TRI reagent (Chomczynski and Sacchi 1987) (Sigma) puis 200 µL de chloroforme

(Sigma) sont ajoutés avant que le lysat ne soit agité plusieurs fois, puis centrifugé

(12000 rpm, 4°C pendant 15 minutes). Le surnageant contenant les ARN est récupéré. Les

ARN sont précipités (4°C pendant 10 minutes) par l’ajout de 0,5 mL d’alcool isopropylique

(Sigma). Les ARN sont récupérés par centrifugation (12000 rpm, 4°C, 5 minutes) puis lavés

par 1 mL d’éthanol à 75 %, centrifugés et séchés. Le culot est dissous dans 30 µL d’eau

DEPC. L’eau DEPC est de l’eau déminéralisée à laquelle est rajouté 1 g / L de DEPC

(diéthylpyrocarbonate, Sigma), un inhibiteur de RNAse. Ce mélange est placé à 37°C durant

une nuit puis autoclavé avant utilisation.

Traitement des ARN à la DNAse

Les ARN extraits sont dilués avec de la solution tampon (volume final 60µL), traités à la

DNAse (17 U / 100 µL) afin d’éliminer toute trace de matériel génomique. Ce mélange est

centrifugé quelques secondes (8000 rpm, température ambiante) puis placé dans un bain-

marie (37°C, 30 minutes). Après un premier lavage avec un mélange phénol / chloroforme /

alcool isoamylique, (50 / 48 / 2, v/v/v) suivi d’une centrifugation (12000 rpm, 4 minutes,

4°C) puis d’un second lavage avec un mélange chloroforme / alcool isoamylique, (24 / 1,

v/v). Après centrifugation (12000 rpm, 4°C, 2 minutes), le surnageant est récupéré. Les ARN

sont précipités (-20°C, une nuit) par l’ajout de 10 µL d’acétate de sodium (3 M, pH = 5,2) et

de 250 µL d’éthanol pur.

84

Quantification des ARN

Les ARN sont quantifiés par spectrophotométrie. Dans une cuve de 100 µL, 2 µL de la

solution d’ARN sont mélangés avec 98 µL d’eau DEPC. L’absorbance est lue à 260 nm ainsi

qu’à 280 nm. Le ratio A260 / A280 est calculé. Les solutions d’ARN sont considérées comme

« pures » lorsque leurs ratios sont compris entre 1,9 et 2,1 . Une unité d’absorbance à

260 nm correspond à une solution d’ARN de 40 µg / mL.

La concentration de la solution d’ARN est obtenue en effectuant le calcul suivant :

Qualité des ARN

La qualité des ARN est appréciée par électrophorèse.

L’électrophorèse est réalisée sur un gel d’agarose / formaldéhyde. Pour réaliser le gel,

mélanger 0,5 g d’agarose avec 2,5 mL de tampon MOPS 10X (acide morpholinopropane

sulfonique 200 mM / acétate de sodium 80 mM / EDTA 10 mM) ajusté à pH 7,1 et à 23 mL

avec de l’eau DEPC. Ce mélange est chauffé légèrement pour dissoudre l’agarose. Sous

hotte, 1,35 mL d’une solution de formaldéhyde à 37% est ajouté. Le gel est ensuite coulé. La

polymérisation s’effectue à température ambiante. Après 30 minutes, le gel est prêt à être

utilisé.

Les échantillons d’ARN sont ensuite préparés. Dans un tube sont mélangés 2 µL de tampon

MOPS 10X, 3,5 µL de formaldéhyde, 10 µL de formamide et 4,5 µL de la solution d’ARN à

analyser. Après une rapide centrifugation, chaque échantillon est placé dans un bain-marie

agité pendant 15 minutes à 55°C puis placé sur de la glace. Dans chaque tube, 2 µL de

tampon porteur (50% de glycérol / 0,4% de bleu de bromophénol / EDTA 1 mM) et 1 µL de

bromure d’éthydium (intercalant) sont ajoutés. Après une brève centrifugation, les

échantillons sont déposés dans le gel. La migration (30 minutes, 50 V) s’effectue dans du

tampon MOPS 1X.

La migration des ARN sur le gel est ensuite visualisée sous lampe ultra-violette (figure 26).

Lorsque l’extraction des ARN est correcte, deux bandes doivent apparaître sur

l’électrophorèse des ARN totaux. Ces bandes correspondent aux ARN ribosomaux 18S et

28S. En effet les ARN ribosomaux représentent la grande majorité des ARN totaux.

85

Figure 26 : Electrophorèse d’un échantillon d’ARN. La piste de gauche correspond à la migration d’ARN témoin : la bande la plus haute correspond aux ARN ribosomaux 28S, l’autre aux ARN ribosomaux 18S. Les autres pistes correspondent à des ARN purifiés par nos soins : les bandes correspondant aux ARN 18S et 28S sont présentes, ceci témoigne du fait que les ARN extraits sont de bonne qualité.

Enrichissement du pool d’ARN extraits en ARN poly(A)

Cette étape est réalisée avec les solutions et les indications du kit Atlas Pure Total RNA

(Clontech), elle consiste à enrichir le pool d’ARN extraits en ARN poly(A) ou ARNm pour

synthétiser ensuite les ADNc.

Pour cela, 15 µL du mélange de la solution stock de billes magnétiques sont prélevés et

placés dans un tube de 0,5 mL (Eppendorf). Les billes sont séparées du surnageant par un

séparateur de particules magnétiques (Promega). Les billes sont ensuite lavées à trois

reprises avec 150 µL de tampon Binding buffer (fourni dans le kit) puis re-suspendues dans

15 µL de tampon Binding buffer.

Une partie de la solution d’ARN (10 à 50 µg) est placée dans un tube de 0,5 mL (Eppendorf)

avec 45 µL d’eau déionisée et 1 µL d’oligo dT biotinylés. L’ensemble est placé à 70°C

pendant deux minutes puis à température ambiante pendant 10 minutes. Puis, 45 µL de

tampon binding buffer 2X, et 15 µL de billes magnétiques sont ajoutés. Le tube est

centrifugé à 1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les billes sont séparées

avec le séparateur de particules magnétiques puis lavées à trois reprises avec 50 µL de

tampon Wash buffer avant d’être re-suspendues dans 50 µL de tampon Reaction buffer puis

dans 6 µL d’eau déionisée. Le pool d’ARN extrait est enrichi en ARN poly(A).

Synthèse des ADNc

Les ADNc sont synthétisés et marqués au 32P pour être hybridés sur les puces à ADN. Les

billes re-suspendues dans de l’eau déionisée (qui comportent les ARN poly(A)) sont

mélangées à 4 µL de mélange de primers (primers correspondant aux gènes présents sur la

Dépôt des échantillons

28S (4,5kb) 18S (1,9kb)

86

puce). Ce mélange est placé à 65°C (deux minutes), puis à 50°C (deux minutes) afin de

permettre l’hybridation des primers.

Un mélange Master Mix composé de 4 µL de tampon Reaction Buffer 5X, de 2 µL de mélange

dNTP 10X (formé de 5 mM de chacun des trois nucléotides dCTP, dGTP, dTTP), de 5 µL de

[α-32P]dATP, de 0,5µL de DTT (dithiothréitol, 100 mM) et de 2 µL de reverse transcriptase

est préparé.

Les 10 µL du mélange comportant les billes magnétiques sont mélangés à 13,5 µL du

mélange Master Mix. Cet ensemble est incubé (50°C, 25 minutes) pour permettre

l’élongation des amorces, puis 2 µL de mélange Terminaison Mix sont ajoutés pour terminer

la synthèse des amorces.

Afin de séparer les sondes marquées au 32P des sondes non marquées, et d’éliminer les

petits fragments d’ADNc (<0,1kb), une étape de purification des sondes par chromatographie

sur colonne est réalisée.

Les billes magnétiques sont séparées du milieu réactionnel. Un mélange, constitué de 20 µL

de surnageant et de 180 µL de tampon NT2 est déposé sur une colonne d’extraction

NucleoSpin extraction Spin Column préalablement fixée sur un tube de 2 mL. Après

centrifugation (14000 rpm, une minute), la colonne est insérée sur un nouveau tube. Après

trois rinçages avec 400 µL de tampon NT3, la colonne est fixée sur un nouveau tube de

1,5 mL. Les sondes sont éluées par 100 µL de tampon NE et la radioactivité est comptée par

un compteur à scintillation. La radioactivité doit être comprise entre 5 et 20.106 cpm. Les

sondes sont stockées à -20°C.

Hybridation des sondes d’ADNc

La puce à ADN macroarray est rincée avec de l’eau déionisée et incubée avec 5 mL d’une

solution d’hybridation BD ExpressHyb sous agitation (68°C, 30 minutes).

Les sondes d’ADNc préalablement synthétisées sont chauffées (95-100°C, 2 minutes) puis

placées sur de la glace. Ces sondes sont mises en contact avec la membrane. L’ensemble est

mis sous agitation (68°C, une nuit). La solution d’hybridation éliminée, la puce est lavée trois

fois (68°C, 30 minutes, sous agitation) par 200 mL de solution de lavage 1 (NaCl 17,5g / L ;

Na3 citrate 2H2O 8,82 g / L pH 7,0 ; SDS 10 g / L). La puce est ensuite lavée (température

ambiante, 5 minutes, sous agitation) avec 200 mL de solution de lavage 2 (NaCl 0,88 g / L;

0,44 g / L Na3citrate 2H2O, pH 7,0 ; SDS 5 g / L), préalablement chauffée à 68°C. Le dernier

lavage (température ambiante, 5 minutes, sous agitation) est réalisé par 200 mL de

solution SSC 2X (NaCl 17,5 g / L ; Na3citrate 2H2O, 8,82 g / L pH 7,0 ). La puce, humide, est

scellée dans un film plastique. La radioactivité est quantifiée directement par l’utilisation d’un

PhosphorImager (Packard Instrument). La puce est exposée durant 72h. Les images

obtenues sont traitées avec le logiciel AtlasImage 2.7 (Clontech). Pour chaque gène, les

intensités de la radioactivité de la membrane correspondant aux cellules traitées par rapport

87

à celle correspondant aux cellules témoins seront comparées afin d’observer les effets du

flavonoïde à étudier sur l’expression génique.

5.1.2.Résultats

Étude de la viabilité cellulaire

La cytotoxicité de la cirsimarine est présentée dans la figure 27, celle de l’extrait de Microtea

debilis Sw. est présentée sur la figure 28.

Figure 27 : Test de viabilité cellulaire au MTT réalisé sur des fibroblastes humains normaux (PF2) traités avec de la cirsimarine pendant 24 h (gamme de dilution de la cirsimarine entre 1 mM et 0,46 µM. Chacune des barres représente la moyenne de trois essais ± écarts-types. La densité optique (DO) à J0 est matérialisée par un trait rouge donnant la limite à prendre en compte pour la cytotoxicité. Les astérisques indiquent une différence significative par rapport au témoin (J0), test de Student, p<0,05. Les concentrations de 1 mM, 333 µM et 111 µM sont nettement cytotoxiques alors que les

dilutions plus élevées (à partir de 37 µM) montrent une viabilité qui n’est pas

significativement différente de celle du contrôle à J0. De plus, l’observation des fibroblastes

au microscope permet de constater des anomalies morphologiques (grandes vacuoles

intracellulaires) à partir de 37 µM.

88

Figure 28 : Test de viabilité cellulaire au MTT réalisé sur des fibroblastes humains normaux traités (pool PF2) avec de l’extrait pendant 24 h (gamme de dilution de l’extrait de Microtea debilis Sw. entre 5 g / L et 0,064 mg / L. Chacune des barres représente la moyenne de trois essais ± écarts-types. La densité optique (DO) à J0 est matérialisée par un trait rouge donnant la limite à prendre en compte pour la cytotoxicité. Les astérisques indiquent une différence significative par rapport au témoin (J0), test de Student, p<0,05. Les concentrations 5 g / L, 1 g / L et 0,2 g / L sont cytotoxiques. La concentration maximale

non cytotoxique est de 40 mg / L.

Les résultats partiels de l’étude puce à ADN sont présentés dans le tableau 16. L’expression

de chaque gène a été étudiée suite à deux traitements (incubation de 6 heures et incubation

de 24 heures avec la cirsimarine à 0,03 mM). Dans chacun des deux cas a été calculée

l’expression relative (ER) en utilisant la formule suivante :

ER % = [(expression du gène d’intérêt)traité*100] / (expression du gène d’intérêt)témoin

89

Gène d’intérêt Expression relative (en %) du gène d’intérêt après 6 h d’incubation avec de la cirsimarine

Expression relative (en %) du gène d’intérêt après 24 h d’incubation avec de la cirsimarine

décorine 125 184 collagène de type I, sous-unité alpha 1 120 139 collagène de type I, sous-unité alpha 2 105 135 collagène de type III, sous-unité alpha 1 140 214 collagène de type IV, sous unite alpha 1 165 138 collagène de type IV, sous unite alpha 2 203 174 collagène de type IV, sous-unité alpha 3 100 100 collagène de type IV, sous-unité alpha 5 100 100 collagène de type IV, sous-unité alpha 6 100 100 collagène de type VII, sous-unité alpha 1 293 190 laminine, sous-unité alpha 4 145 171 laminine, sous-unité beta 1 159 119 laminine, sous-unité beta 2 198 172 laminine, sous-unité beta 3 100 100 laminine, sous-unité gamma 1 121 128 laminine, sous-unité gamma 2 100 100 lysyl hydroxylase 144 128 lysyl hydroxylase 3 148 147 lysyl hydroxylase, isoforme 2 100 100 lysyl oxidase 120 139 matrix metalloproteinase 1 (MMP1) 100 100 matrix metalloproteinase 2 (MMP2) 169 149 matrix metalloproteinase 3 (MMP3) 146 207 nidogène (NID) 118 193 prolyl-4-hydroxylase alpha polypeptide 146 133 tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1) 136 131 tissue inhibitor of metalloproteinase 2 (TIMP2) 143 123 tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (TIMP3) 120 91 tissue inhibtor of mettaloproteinase 4 (TIMP4) 100 100 versican 163 123

Tableau 16 : Résultats partiels de l’étude par puce à ADN – macroarray. Dans la première colonne figure une sélection des gènes étudiés ; dans la deuxième colonne, l’expression relative des gènes après 6 heures d’incubation et dans la troisième colonne, l’expression relative des gènes après 24 heures d’incubation. D’après cette étude, il semble que plusieurs gènes codant pour des éléments composant la

matrice extracellulaire sont activés. Cette stimulation doit être confirmée par une étude en

RT-Q-PCR. Cependant, pour des raisons de coût, il nous est impossible de réaliser ce travail

pour chacun des gènes présentés dans le tableau 18. Aussi, une RT-Q-PCR est réalisée sur

les collagènes de type I et III, collagènes retrouvés majoritairement dans la peau humaine ;

sur le collagène de type VII, marqueur des lames basales ; sur la décorine, molécule

appartenant à la famille des protéoglycannes ainsi que sur le nidogène, glycoprotéine,

marqueur des lames basales. Cette étude sera réalisée après incubation de la cirsimarine

durant 24 heures, c’est la durée au bout de laquelle l’activation des gènes sélectionnés est la

plus importante.

90

5.2. Étude par RT-Q-PCR

A l’issue de l’étude par puce à ADN, l’expression génique de certains gènes étant augmentée

de façon significative, une RT-Q-PCR a été réalisée afin de confirmer ces résultats. Cette

technique est souvent utilisée en complément des études par puces à ADN : elle réalise

l’amplification spécifique d’une séquence cible grâce à la combinaison de deux

oligonucléotides. La quantification obtenue est par conséquent de meilleure spécificité que

celle obtenue avec des techniques basées sur une seule hybridation. La RT-Q-PCR est une

technique récente qui permet de mesurer l’expression transcriptionnelle des gènes. En

utilisant la fluorescence comme système rapporteur, l’augmentation de la quantité d’ADN au

cours de la PCR est enregistrée au fur et à mesure de la réaction. La réaction terminée, les

quantités d’ADN sont comparées dans la partie exponentielle, moment pendant lequel

l’augmentation de la quantité d’ADN est proportionnelle à la quantité initiale de matrice.

Le principe de la réaction de PCR est basé sur l’hybridation de courts fragments d’ADN simple

brin sur une matrice d’ADN simple brin de séquence complémentaire. Ces oligonucléotides

sont situés aux extrémités du fragment à amplifier et servent d’amorces à une ADN

polymérase ADN dépendante qui synthétise le brin complémentaire de la molécule d’ADN

simple brin à laquelle ils sont hybridés. La matrice d’ADN est dénaturée par la chaleur (95°C)

en présence des amorces et des quatre dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP). Le mélange

réactionnel est ensuite refroidi jusqu’à la température permettant l’hybridation spécifique des

amorces ou Tm (melting temperature). L’ADN polymérase synthétise ensuite le « nouveau »

brin d’ADN. Ce cycle de dénaturation, d’hybridation et de synthèse d’ADN se répète plusieurs

dizaines de fois. Comme les fragments d’ADN synthétisés au cours d’un cycle servent de

matrice aux cycles suivants, la quantité du fragment d’ADN à amplifier s’accroît

exponentiellement au cours de la PCR. En théorie, à chaque cycle, la quantité de l’ADN cible

est doublée. En pratique, beaucoup de facteurs influent sur l’efficacité de la PCR : nature des

primers utilisés, température d’hybridation utilisée, salinité du milieu réactionnel, nature de

la polymérase utilisée.

Les premiers essais visant à enchaîner des réactions de polymérisation successives d’ADN

par catalyse enzymatique ou PCR afin d’amplifier un fragment d’ADN datent des années

1985-1987 (Mullis et al. 1986), la réaction était alors catalysée par le fragment Klenow de

l’ADN polymérase I de E. Coli. Le protocole a par la suite été amélioré avec l’utilisation d’une

polymérase thermostable, la Taq polymérase (Higuchi et al. 1988).

Pour appliquer la PCR à l’étude de l’expression différentielle des gènes, une étape

supplémentaire, précédent l’étape d’amplification est nécessaire : celle de la conversion des

ARNm en ADNc (ADN complémentaire) grâce à une reverse transcriptase (RT), enzyme ARN

dépendante. Cet enzyme synthétise un brin d’ADN complémentaire d’une molécule d’ARN à

91

partir d’une zone double brin créée par une amorce. Bien entendu, la qualité des ADNc

synthétisés dépend de la qualité des ARN utilisés.

La Q-PCR en temps réel inclut dans la même manipulation l’amplification et l’analyse en

s’affranchissant d’une visualisation sur gel ou d’un comptage en radioactivité. Actuellement

de nombreux systèmes existent combinant les cycles thermiques et l’acquisition de la

fluorescence. Grâce à cette technique, la fluorescence d’agents intercalants fluorescents ou

de sondes fluorescentes est suivie à chaque cycle de la PCR. Aussi, à partir d’un certain

nombre de cycles, la fluorescence dépasse de manière significative le bruit de fond ; ce cycle

porte le nom de cycle seuil ou threshold cycle C(T) (Bernard et al. 2002). Aussi, plus le

nombre de cycles nécessaires pour obtenir une fluorescence détectable est faible, plus la

séquence cible est abondante au départ. L’amplification de la PCR étant exponentielle (figure

29), on compare l’expression du gène d’intérêt par rapport à un gène de ménage (ou gène

rapporteur), c’est pour cela que l’on parle de quantification relative.

Figure 29 : Résultat obtenu après un essai de RT-Q-PCR. Plus le C(T) est faible pour un gène, plus le nombre de copie d’ARNm de celui-ci était important au départ (avant l’amplification). La quantification du gène cible est possible en se rapportant au gène de ménage constant.

92

5.2.1.Matériels et méthodes

Culture cellulaire et traitement

Dans cette étude, les cellules étudiées sont des fibroblastes humains normaux

(lot 025, IBCP) utilisés au 8ème passage, ensemencés dans des boîtes (Ø 10 cm) à la densité

de 2,5.106 cellules / boîte, dans 10 mL de milieu DMEM (Cambrex) additionné de 10% de

sérum de veau fœtal (Biowest), 50 µg / mL de gentamycine (Euromedex) et de 50 µg / mL

d’ascorbate de sodium (Sigma). Les fibroblastes sont placés dans un incubateur (37°C, 5%

de CO2). Lorsque les cellules sont adhérentes, les milieux sont changés et les produits à

étudier (cirsimarine à 0,03 mM, extrait de Microtea debilis Sw. à 0,04 g / L) sont ajoutés

comme indiqué dans le tableau 17. Les solutions mères des produits à étudier sont préparées

dans un mélange NaOH 0,2M / DMSO ; 95 / 5 ; v / v ; la cirsimarine est préparée à

0,61 mM, l’extrait de Microtea debilis Sw. à 0,8 g / L. Le diluant est ajouté à la même

concentration dans les cultures témoins.

Cette étude est réalisée en présence d’ascorbate. En effet, en parallèle de ce travail est

réalisée une étude de l’expression protéique de trois des cinq molécules étudiées (collagène

de type I, collagène de type III, décorine). L’ascorbate est une molécule qui joue un rôle

important pour assurer la conformation tridimentionnelle des molécules de collagène, elle

augmente également la stabilité de certains ARNm.

Essais

Solution de cirsimarine à 0,61 mM (500 µL / 10 mL)

Extrait de Microtea debilis Sw. à 0,8 g /L (500 µL / 10 mL)

Solution de diluant (500 µL / 10 mL)

Solution d’ascorbate à 5 g/ L (100 µL / 10 mL)

Témoin + + Extrait végétal + + cirsimarine + +

Tableau 17 : Nature des produits ajoutés dans les différentes boîtes de culture. Ces cultures cellulaires permettent d’étudier l’expression génique par RT-Q-PCR ainsi que l’expression protéique.

Dans cette étude, l’expression de chaque gène est pondérée par celle du gène rapporteur

utilisé, la cytotoxicité éventuelle des produits à étudier est corrigée de façon indirecte.

Extraction des ARN

Les ARN sont extraits en utilisant le kit RNeasy (Quiagen). Après 24h d’incubation, le milieu

de culture est enlevé, les cellules sont rincées à trois reprises avec 3 mL de tampon PBS. Les

cellules sont trypsinées, la suspension cellulaire obtenue est numérée puis centrifugée à

3000 rpm pendant 10 minutes afin de précipiter les cellules. Les cellules sont lysées par

l’ajout de 350 µL de tampon RLT (contenant 1% de β mercapto-éthanol) sur le culot

cellulaire. Après homogénéisation, 350 µL d’éthanol à 70° sont ajoutés. Cet homogénat est

93

versé sur la colonne de purification des ARN. Après centrifugation (15 secondes à 8000 rmp),

le surnageant est éliminé. La colonne est rincée avec 700 µL de tampon RW1, puis à deux

reprises avec 500 µL de tampon RPE. Les ARN sont élués avec 30 µL d’eau DEPC.

Les ARN extraits sont traités à la DNAse, analysés sur gel d’agarose / formaldéhyde pour

visualiser leur qualité et quantifiés par spectrophotométrie comme indiqué précédemment

dans le paragraphe puce à ADN – macroarrays.

Reverse transcription

La reverse transcription des ARN est réalisée en utilisant le kit Expand Reverse Transcriptase

(Roche). Les solutions d’ARN total (1 µg) et d’oligo (dT)15 (0,5 µg) sont mélangées, après

ajustement du volume réactionnel à 11 µL avec de l’eau DEPC. Ce mélange est incubé (65°C,

10 minutes) pour éliminer les structures secondaires. Les constituants nécessaires à la

transcription inverse ajoutés (2 µL de dithiothréitol, DTT), 2 µL de dNTP (mélange contenant

10 mM de chacun des quatre nucléotides), 4 µL de tampon 10X et 1 µL de reverse

transcriptase à 50 UI / µL), cette solution est incubée (42°C, 40 minutes). A l’issue de ces

deux étapes, on dispose d’un pool d’ADNc.

RT-Q-PCR

Pour chacun des cinq gènes (collagène de type I, collagène de type III, collagène de type

VII, décorine, nidogène), des études de PCR quantitative sont réalisées afin de confirmer ou

d’infirmer les résultats de la puce à ADN.

Toute mise au point d’une réaction de PCR quantitative nécessite l’optimisation préalable des

conditions de la réaction (quantité d’ADN matriciel, nature des amorces, température

d’hybridation, nature de la Taq polymérase utilisée) afin de parvenir à l’amplification

sélective du fragment recherché.

La quantité d’ADN utilisée peut influer sur le résultat d’amplification, une quantité

insuffisante ne permettant pas d’obtenir d’amplification, alors qu’une quantité trop

importante d’ADN peut conduire à la génération d’amplification non spécifique. C’est

pourquoi, pour chaque essai, différentes concentrations de matrices ont été testées.

La réaction de PCR nécessite l’hybridation d’amorces spécifiques sur la séquence à étudier.

Cette amplification est conditionnée par la qualité et la quantité des amorces utilisées. En

effet, si le ratio-matrice / amorce est important, la séquence de ces dernières est tout aussi

déterminante. Pour chacun des cinq gènes, un couple d’amorces est recherché. Pour cela, le

site internet Primer3 est utilisé (Rozen,S. 2005). Les amorces sélectionnées, différents

logiciels tel Oligonucleotide Properties Calculator (Cao,Q. et al. 2005) sont disponibles sur

internet pour le calcul des Tm, d’autres permettent la recherche d’homologies inter-amorces

comme le logiciel BLAST (Anonymous 2005). Lorsqu’un couple d’amorce est retenu,

94

l’efficacité de ces amorces et la spécificité du couple d’amorce pour le gène étudié sont

étudiées.

L’efficacité de la PCR est une donnée importante. Aussi, en théorie, lorsque l’efficacité de la

PCR durant la phase exponentielle de croissance est de 100%, à chaque cycle de PCR la

quantité d’ADN cible est multipliée par deux. Aussi, plus l’efficacité relative diverge des 100%

plus l’interprétation relative est difficile.

La spécificité du couple d’amorce pour la séquence cible à amplifier consiste à vérifier

l’absence de formation de dimères d’amorce ou primer dimer ou d’amplifications

aspécifiques.

Pour le choix de la température d’hybridation, il est souvent recommandé de se placer à une

température inférieure de 4-5°C au Tm du couple d’amorce (si le Tm est différent pour les

deux amorces, choisir le Tm le plus bas comme point de référence). Si dans la même

expérience, plusieurs gènes différents sont étudiés, une seule température d’hybridation est

sélectionnée.

Dans ce travail, nous avons, en première intention, choisi d’utiliser le gène codant pour la ß-

actine comme gène rapporteur, gène rapporteur utilisé dans l’étude par puce à ADN. A l’issue

des résultats obtenus et à la lecture d’un article (Vandesompele et al. 2002), un autre gène

rapporteur a été testé : celui codant pour la glycéraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase

(GAPDH). L’analyse conjointe des résultats obtenus avec les gènes rapporteurs en présence

et en absence de traitements (cirsimarine, extrait végétal) nous a permis de choisir comme

gène rapporteur le gène codant pour la GAPDH.

Le pool d’ADNc obtenu après la réaction de reverse transcription est dilué dans de l’eau DEPC

(au tiers, cinq fois successives). Pour chacun des cinq gènes d’intérêt, six essais sont

réalisés : un pour chacune des cinq dilutions et un où l’ADNc est remplacé par de l’eau DEPC

(blanc). Le milieu réactionnel utilisé (kit Biorad) contient : une enzyme Taq polymérase,

enzyme permettant la synthèse de l’ADN, le tampon de réaction, un agent intercalant

fluorescent, le SYBR Green (λ excitation = 490 nm, λ emission = 530 nm), molécule permettant de

suivre en temps réel la réaction de PCR. Dans chaque tube réactionnel, sont mélangés l’ADNc

à amplifier, le milieu réactionnel ainsi que 0,3 mM de chaque couple de primers

correspondant aux ADNc (tableau 18).

95

Gène Amorce forward Amorce reverse Tm amorce forward ; amorce reverse

β- GAPDH CCTCAACGACCACTTTGTCAA CTTCCTCTTGTGCTCTTGCTG 65,0 ; 64,1 chaîne α2, collagène de type I

AAGGTCATGCTGGTCTTGCTG GACCTGTTCACCTTTTCCA 66,5 ; 63,8

chaîne α1,

collagène de type III AACACGCCAAGGCTGTGAGACT GCCAACGTCCACACCAAATTCT 66,2 ; 69,0

chaîne α1,

collagène de type VII GTGACCGTGAGCACCCTATT CTCAACAGAAGCGTCAGGC 63,9 ; 63,8

décorine CTGGACACAACACCAAAAAGG TGAAGGTGGATGGCTGTATCT 64,2 ; 63,4 nidogène CAGAAAGGCAAGAGAAACACGT TGAGAATGTCGTATGGAACTGCA 64,4 ; 66,5

Tableau 18 : Description des amorces utilisées dans l’étude par RT-Q-PCR. Cinq gènes sont étudiés : ceux codant pour la chaîne α2 du collagène de type I, pour la chaîne α1 du collagène de type III, pour la chaîne α1 du collagène de type VII, pour la décorine et pour le nidogène. Le gène rapporteur utilisé code pour la β- GAPDH.

Après centrifugation, les tubes sont placés dans un thermocycler (iCycler, Biorad). Le

programme de la Q-PCR est lancé :

Activation de l’ADN polymérase (Taq DNA polymérase, Sigma) par

chauffage (95°C, 15 minutes).

Réaction de Q- PCR proprement dite (40 cycles) :

- dénaturation de l’ADN (95°C, 15 secondes) : la

double hélice d’ADN est dénaturée, les deux brins

d’ADN sont séparés.

- hybridation des amorces (58°C, 30 secondes) : les

amorces (simple brin) s’apparient au brin d’ADN

complémentaire. Durant cette période, l’ADN

polymérase commence à incorporer les nucléotides,

ce processus est lent car la polymérase n’est pas

très efficace à cette température.

- élongation de l’ADN (72°C, 30 secondes) : l’ADN

polymérase synthétise l’ADNc. Durant cette

période, le SYBR Green s’intercale dans la double

hélice d’ADN nouvellement synthétisée. L’intensité

de fluorescence générée au-dessus du bruit de fond

est mesurée et sera utilisée pour quantifier la

quantité d’ADNc synthétisée.

Courbe de fusion (passage de 65°C à 95°C, de degré en degré à la

vitesse de 10 secondes par degré) : cette étape permet de mettre en

évidence la formation éventuelle de dimères d’amorces ou d’autres

amplifications non spécifiques.

96

Les réactions de Q-PCR terminées, les résultats sont analysés afin d’évaluer les effets des

traitements (cirsimarine 0,03 mM et extrait de Microtea debilis Sw. 0,04 g / L) sur

l’expression différentielle des différents gènes étudiés. Pour cela, la formule suivante est

utilisée, elle permet de calculer l’expression différentielle du gène cible par rapport au gène

rapporteur (Kenneth and Schmittgen 2001) :

Expression différentielle du gène cible par rapport au gène de référence

= 2-∆∆C(T)

où

∆∆C(T) = [C(T) gène cible - C(T) gène rapporteur] traitement A

– [C(T) gène cible - C(T) gène rapporteur] témoin

5.2.2.Résultats

L’étude par RT-Q-PCR complète les résultats obtenus dans l’étude par puces à ADN. Le

tableau 19 décrit l’expression relative (ER) des gènes cibles (collagène de type I , collagène

de type III, collagène de type VII, décorine, nidogène) par rapport au gène de référence

(GAPDH) par la formule utilisant les ∆C(T) (formule expliquée en section 5.1.1). On considère

qu’un produit stimule l’expression génique à partir de ER = 200.

Essais Expression relative (%) Collagène de type I Témoin 100 Extrait de Microtea debilis Sw. 6111 Cirsimarine 7524 Collagène de type III Témoin 100 Extrait de Microtea debilis Sw. 100 Cirsimarine 110 Collagène de type VII Témoin 100 Extrait de Microtea debilis Sw. 166 Cirsimarine 145 Décorine Témoin 100 Extrait de Microtea debilis Sw. 132 Cirsimarine 155 Nidogène Témoin 100 Extrait de Microtea debilis Sw. 1068 Cirsimarine 4147

Tableau 19 : Résultat de l’expression génique par RT-Q-PCR des cinq molécules étudiées en absence et en présence des composés étudiés (extrait Microtea debilis et cirsimarine). Étude après 24 h d’incubation de l’extrait de Microtea debilis Sw. à 40 µg / mL et de la cirsimarine à 30 µM dans un modèle de fibroblastes humains en monocouche. Chaque essai a été réalisé en double, ci-dessus a été reporté une expérience significative pour chacun d’eux.

97

L’extrait végétal de Microtea debilis Sw. et la cirsimarine stimulent fortement l’expression du

gène codant pour le collagène de type I et pour le nidogène. Ces deux composés n’ont pas

d’effet sur l’expression génique du collagène de type III. Concernant le collagène de type VII

et la décorine, ces deux composés stimulent peu l’expression génique.

5.3. Expression moléculaire

Les effets de la cirsimarine (0,03 mM) et de l’extrait végétal Microtea debilis Sw. (0,04 g / L)

sont étudiés sur l’expression moléculaire du collagène de type I, de type III et de la décorine

après quatre jours d’incubation. Les expressions du nidogène et du collagène de type VII

n’ont pas pu être étudiées sur ce modèle, ces deux protéines étant localisées dans la jonction

dermo-épidermique.

Pour étudier l’expression de ces trois molécules plusieurs étapes sont nécessaires :

préparation des échantillons à analyser, électrophorèse en conditions dénaturantes, western-

blotting, révélation par une réaction de chimiluminescence utilisant le système ECL.

5.3.1.Matériels et méthodes

Culture cellulaire et traitement

Cette étude a été réalisée sur les mêmes fibroblastes que ceux utilisés dans l’étude de

l’expression génique par RT-Q-PCR (section 5.1.1) à la différence que l’incubation des

produits (cirsimarine 0,03 mM et extrait Microtea debilis Sw. 0,04 g / L) a duré quatre jours.

Étude de la viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire est appréciée par le test au MTT décrit en 5.1.1. Dans cette étude, les

fibroblastes sont ensemencés en plaques 96 puits à raison de 20000 cellules / puits en

présence de l’ascorbate et des produits à étudier (J0). A J4, l’analyse de la viabilité est

effectuée.

98

Préparation des échantillons à analyser

A J4, les milieux de cultures sont prélevés et traités différemment selon le type de molécules

qu’on souhaite étudier.

1. Traitement des prélèvements pour l’électrophorèse du collagène de type I et du

collagène de type III

Les collagènes de type I et III sont impliqués dans la formation de fibrilles striées. Pour être

étudiées en électrophorèse, ces molécules doivent subir un traitement enzymatique à la

pepsine afin d’éliminer, en grande partie, les régions télopeptidiques impliquées dans des

liaisons covalentes et permettre ainsi la séparation des différentes chaînes peptidiques. Pour

cela, les milieux sont acidifiés par de l’acide acétique à 8,7 M (240 µL pour 1 mL de milieu),

puis pepsinés (24 h, 4°C) par l’ajout de 24 µL d’une solution d’acide acétique 0,5 M

contenant 5 g / L de pepsine (Sigma). Les protéines sont ensuite précipitées (une heure, -

20°C) par de l’éthanol à –20°C (4 mL pour 1 mL de milieu). Ce mélange est centrifugé (10

minutes, 12000 rpm), puis les culots sont dissous dans du tampon porteur pour

électrophorèse (saccharose 190 g / L, Tris 42,2 g / L, EDTA 4,1 g / L, SDS 166,6 g / L,

quelques cristaux de bromophénol, pH 6,9). Ces échantillons sont déposés dans les puits du

gel de concentration.

2. Traitement des prélèvements pour l’électrophorèse de la décorine

Les protéines sont précipitées (30 minutes, 4°C) par de l’acide trichloroacétique (120 µL

d’acide trichloroacétique pour 1 mL de milieu) puis centrifugées (10 minutes, 12000 rpm).

Les surnageants sont éliminés, 1 mL d’éthanol à -20°C est ajouté. Après centrifugation (10

minutes, 12000 rpm), les culots sont repris avec du tampon porteur pour électrophorèse puis

déposés dans les puits du gel de concentration.

Electrophorèse des prélèvements en conditions dénaturantes

L’électrophorèse en conditions dénaturantes consiste à séparer, sous l’influence d’un champ

électrique, différentes molécules chargées sur un gel de polyacrylamide (agent réticulant) en

présence de sodium dodécyl sulfate (SDS, Sigma), on parle alors de SDS-PAGE (SDS-

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). L’électrophorèse est généralement réalisée en présence

de marqueurs de poids moléculaire (BioRad) : Myosine 200000 kDa ; β-galactosidase 116250

kDa ; Phosphorylase b 97400 kDa ; Sérum albumine 66200 kDa ; Ovalbumine 45000 kDa ;

anhydrase carbonique 31000 kDa ; Inhibeur de la trypsine 21500 kDa ; Lysozyme

14400 kDa et Aprotinine 6500 kDa. Ces molécules, de masses moléculaires connues, sont

99

utilisées comme références. Elles permettent l’identification des molécules composants

l’échantillon par leurs masses moléculaires.

La polymérisation du gel est catalysée par la présence de TEMED (N,N,N’,N’-

Tetraméthyléthylènediamine, Sigma) et de persulfate d’ammonium (Sigma). Le degré de

réticulation du gel de séparation permet la séparation des protéines en fonction de leur

masse moléculaire. Il est choisi en fonction de la masse moléculaire des molécules à séparer.

Afin de dénaturer les protéines et de leur conférer une charge négative, les échantillons sont

chauffés dans un tampon comportant du SDS. Ainsi, les protéines migrent vers l’anode et

sont séparées par un effet de tamisage moléculaire. La présence de ce détergent anionique

hautement chargé dénature les chaînes protéiques et masque complètement leurs charges

naturelles en les recouvrant uniformément. La charge électrique propre à chaque molécule

devient alors négligeable. C'est ainsi que chaque protéine acquiert une densité de charge

identique. Le fait que le SDS rende négatives les protéines permet de les séparer en fonction

de leur taille (donc de la masse molaire) et non pas en fonction de leur charge. Les protéines

migrent vers l’anode. Leurs séparation est inversement proportionnelle au logarithme de leur

masse moléculaire. Pour augmenter la résolution de la technique, l’échantillon migre

successivement dans deux gels : le gel de concentration appelé encore « stacking gel » dont

la réticulation est très lâche et permet de concentrer l’échantillon à la frontière du gel de

séparation ou « running gel » dans lequel s’effectue la séparation des protéines. La

composition de ces gels figure dans le tableau 20.

Gel de séparation Acryl / Bisacryl % final 6 8 Eau Tris 1,5M pH 8,8 SDS 10% TEMED Acryl / Bisacryl 40% APS 10%

5,85 mL 2,5 mL 0,1 mL 0,01 mL 1,5 mL 0,05 mL

5,35 mL 2,5 mL 0,01 mL 0,01 mL 2 mL 0,05 mL

Gel de concentration Acryl / Bisacryl % final 3 Eau Tris 0,5M pH 6,8 SDS 10% TEMED Acryl / Bisacryl 40% APS 10%

6,59 mL 2,5 mL 0,1 mL 0,01 mL 0,75 mL 0,05 mL

Tableau 20: Composition des gels de séparation et des gels de migration Les gels sont préparés avec le système BioRad, les échantillons sont déposés dans les puits

du gel de concentration. Le tampon de migration est composé de Tris 1,2 g / L ; glycine

5,76 g / L et SDS 0,3 g / L. La migration s’effectue à 100 V dans le gel de concentration et à

200 V dans le gel de séparation. Le bleu de bromophénol contenu dans le tampon de

l’échantillon indique le front de migration électrophorétique. Quand le colorant atteint le bas

du gel, l’électrophorèse est arrêtée.

100

Pour réaliser la séparation des chaînes de collagène sur gel de polyacrylamide, le gel de

séparation comporte 6% d’acrylamide et le gel de concentration en comporte 3%.

Pour réaliser la séparation de la décorine sur gel de polyacrylamide, le gel de séparation

contient 8% d’acrylamide et le gel de concentration 3%.

Western-blotting et révélation par chimiluminescence ECL

La migration terminée, les molécules sont transférées sur une membrane de nitrocellulose

(Immobilon, Millipore), membrane qui fixe les protéines de façon non spécifique. La

membrane est préalablement trempée quelques secondes dans du méthanol avant d’être

rincée à l’eau puis équilibrée dans du tampon de transfert (100 mL de CAPS 100 mM, pH

11 ; 100 mL de méthanol et de 800 mL d’eau distillée). Le gel de polyacrylamide est

également équilibré dans le tampon de transfert avant d’être mis en contact avec la

membrane comme indiqué sur la figure 30. Le transfert se déroule durant une nuit à

ampérage constant, 150mA, à 5°C.

Figure 30 : Montage de l’électrotransfert

Le transfert terminé, le gel et la membrane de nitrocellulose sont récupérés. Il est possible,

juste après le transfert, de colorer la membrane avec un colorant spécifique des protéines, le

rouge Ponceau par exemple. Cette opération permet de se rendre compte si l’électrophorèse

et le transfert se sont bien passés. La coloration n’est pas spécifique de la protéine

recherchée, mais en connaissant sa masse molaire, on pourra déjà juger de sa présence ou

non dans l’échantillon.

Avant de procéder à un immunomarquage de la membrane, les sites de fixation potentiels,

non utilisés de la membrane sont bloqués. On parle de blocage de la membrane ou encore de

saturation de la membrane. Cette étape assure la spécificité de la technique. Si elle n’était

pas réalisée, la fixation de l’anticorps primaire sur la membrane donnerait un bruit de fond

élevé et sa fixation sur des protéines autres que la protéine cible se traduirait par des bandes

101

supplémentaires sur le transfert. Pour cela, les membranes sont placées pendant une heure

dans une solution de blocage (lait écrémé à 10 % dans du tampon T-TBS (Tween-Tris

Buffered Saline : Tween 20 0,5 mL ; KCl 0,2 g / L ; Tris 3g / L ; pH 8,0) : la caséine du lait

se fixe de façon non spécifique sur la membrane. Les membranes sont lavées à plusieurs

reprises dans du tampon T-TBS afin d’éliminer le tampon de blocage.

La membrane de nitrocellulose contient l’ensemble des protéines de l’échantillon cellulaire.

La meilleure méthode pour caractériser une protéine au milieu d’autres est

l’immunomarquage. La protéine recherchée joue le rôle d’antigène face à des anticorps

spécifiques (anticorps primaires) de cette protéine. Le complexe antigène-anticorps formé,

est détecté grâce à un deuxième anticorps qui détecte les emplacements où des anticorps

primaires se sont fixés sur des antigènes présents sur la membrane.

Ainsi dans ces essais, la membrane est incubée durant une heure avec l’anticorps primaire

de la protéine à étudier (tableau 21), puis rincée avec du tampon T-TBS plusieurs fois et

incubée pendant 45 minutes avec le second anticorps couplé à de la peroxydase. Les

membranes sont rincées avec du tampon T-TBS plusieurs fois puis avec du tampon TBS. Les

anticorps sont dilués dans du tampon T-TBS-BSA (tampon T-TBS contenant 1% de BSA).

Tableau 21 : Anticorps primaires et secondaires utilisés en western-blot

L’anticorps secondaire est lié de manière covalente à une enzyme, la peroxydase. C’est en

fait l’activité enzymatique de la peroxydase qui sera détectée grâce à une méthode de

chimiluminescence. La luminescence est l’émission de lumière résultant de l’énergie émise

par une substance qui passe de l’état excité à un état fondamental. Le kit de révélation

utilisé ECL (Enhanced Chemiluminescence, chimiluminescence amplifiée, Amersham) permet

la formation enzymatique d’un ester d’acridinium, lequel est dégradé en un composé excité

qui libère son énergie sous forme lumineuse à une longueur d’onde maximale de 430 nm afin

de pouvoir retourner à son état fondamental. Ici, chaque membrane est incubée durant deux

minutes dans la solution de révélation, puis séchée et enveloppée dans du cellophane. La

membrane est exposée à un film photographique dans une chambre noire durant une

minute. Le film est développé dans une développeuse automatique (Kodak), puis analysé

dans un densitomètre.

Molécules recherchées

Anticorps primaires Anticorps secondaires

Collagène de type I

Anti-collagène I, origine lapin (IBCP)

Anti-lapin couplé à de la peroxydase (Bio Rad)

Collagène de type III

Anti-collagène III, origine lapin (IBCP)

Anti-lapin couplé à de la peroxydase (Bio Rad)

Décorine Anti-décorine, origine lapin (Santa Cruz Biotechnology)

Anti-lapin couplé à de la peroxydase (Bio Rad)

102

5.3.2.Résultats

Etude de la viabilité cellulaire

La cytotoxicité de la cirsimarine à 0,03 mM et de l’extrait de Microtea debilis Sw. à 0,04 g / L

sur les fibroblastes du pool 025 ont été réalisées a posteriori, on s’attendait à ce que ces

concentrations ne soient pas cytotoxiques. Les résultats (figure 31) montrent qu’elles ne

l’étaient pas ; par contre ces deux produits inhibent la prolifération cellulaire. Les résultats de

l’expression protéique ont du être recalculés afin de ramener la quantité de protéines au

nombre de cellules vivantes.

Figure 31 : Test de viabilité cellulaire au MTT réalisé sur des fibroblastes humains normaux (025) traités avec de la cirsimarine et avec de l’extrait Microtea debilis Sw. pendant 4J. J0 contrôle : Cellules confluentes à 2.5 106 cellules / boîte. Contrôle : Cellules traitées à J0 avec le solvant de dissolution. Viabilité étudiée à J4. Extrait végétal : Cellules traitées à J0 avec de l’extrait végétal. Viabilité étudiée à J4. Cirsimarine : Cellules traitées à J0 avec de la cirsimarine. Viabilité étudiée à J4. La densité optique (DO) à J0 est matérialisée par un trait rouge donnant la limite à prendre en compte pour la cytotoxicité. Les astérisques indiquent que les différences observées sont significatives par rapport au témoin, test de Student, p<0,05.

La quantité de cellules présente à J4 n’est dans aucun cas inférieure à la quantité de cellules

présente à J0, ce qui suggère que ni l’extrait végétal, ni la cirsimarine ne soient cytotoxiques.

On observe cependant que la cirsimarine inhibe la prolifération cellulaire. La quantité de

protéines dosée dans ce cas devra être rapportée à la quantité de cellules présentes. Le

facteur de correction suivant sera par conséquent appliqué à la valeur lue au densitomètre :

valeur corrigée = (valeur lue / 126)*150,5 .

103

Expression protéique du collagène de type I

Les effets de l’extrait végétal (40 mg / L) et de la cirsimarine (30 µM) sur la synthèse

protéique du collagène de type I sont présentés dans la figure 32.

Figure 32 : Effet de l’extrait végétal Microtea debilis Sw. (40 mg / L durant 4J) et de la cirsimarine (30 µM durant 4 jours) sur la production protéique du collagène de type I. Chaque essai a été réalisé trois fois, on présente ici une manipulation représentative des résultats obtenus. A gauche : film photographique, détection par chimiluminescence du western-blot. A droite : semi-quantification après analyse du film photographique au densitomètre, chaque barre représente la moyenne des triplicatas ± écarts-types. En ordonnée, sont indiquée en unité arbitraires (UA) les valeurs des volumes lues au densitomètre. * : différence observée significative par rapport au témoin, test de Student, p<0,05.

Le collagène de type I est composé de deux chaînes, une chaîne α1 et une chaîne α2. Aussi,

on s’attend à visualiser sur l’électrophorèse la présence de deux bandes. Dans cette

expérience, nous ne visualisons qu’une seule bande. Il est possible que trop de matériel ait

été déposé, ce qui pourrait gêner la distinction de la chaîne α1 et de la chaîne α2. D’après ces

résultats, l’extrait végétal stimule la production du collagène de type I.

L’extrait végétal utilisé dans ce travail contient 3% de cirsimarine. Pour des raisons de

cytotoxicité, la cirsimarine a été testée à 30 µM et l’extrait végétal à 40 mg / mL (soit 2,5 µM

en équivalent cirsimarine). Aussi, ces résultats suggèrent le fait que la stimulation de la

synthèse du collagène de type I puisse être attribuée à d’autres molécules (cirsimarine

exceptée) présentes dans l’extrait végétal, ou que la concentration en cirsimarine testée soit

trop importante pour visualiser un effet.

104

Expression protéique du collagène de type III

Les effets de la cirsimarine et de l’extrait végétal sur la synthèse du collagène de type III

sont présentés dans la figure 33. Le collagène III est un homotrimère, il migre sous la forme

d’une seule bande (bande la plus haute sur l’électrophorèse), la bande située en dessous est

un artéfact de migration.

Figure 33 : Effet de l’extrait végétal Microtea debilis Sw. (40 mg / L durant 4J) et de la cirsimarine (30 µM durant 4 jours) sur la production de collagène de type III. Chaque essai a été réalisé trois fois, on présente ici une manipulation représentative des résultats obtenus. A gauche : film photographique, détection par chimiluminescence du western-blot. A droite : semi-quantification après analyse du film photographique au densitomètre, chaque barre représente la moyenne des triplicatas ± écarts-types. En ordonnée, sont indiquées en unité arbitraires (UA) les valeurs des volumes lues au densitomètre. * : différence observée significative par rapport au témoin, test de Student, p<0,05. L’extrait végétal (40 mg / L) ainsi que la cirsimarine (30 µM) augmentent la quantité de

collagène de type III sécrétée dans le milieu de culture, on peut par conséquent faire

l’hypothèse que la cirsimarine soit une des molécules de l’extrait responsable de cette

stimulation.

105

Expression protéique de la décorine

Les effets de l’extrait végétal et de la cirsimarine sur la production de la décorine sont

présentés dans la figure 34.

Figure 34 : Effet de l’extrait végétal Microtea debilis Sw. (40 mg / L durant 4J) et de la cirsimarine (30 µM durant 4 jours) sur la production moléculaire de la décorine. Chaque essai a été réalisé trois fois, on présente ici une manipulation représentative des résultats obtenus. A gauche : film photographique, détection par chimiluminescence du western-blot. A droite : semi-quantification après analyse du film photographique au densitomètre, chaque barre représente la moyenne des triplicatas ± écarts-types. En ordonnée, sont indiquées en unité arbitraires (UA) les valeurs des volumes lues au densitomètre. * : différence observée significative par rapport au témoin, test de Student, p<0,05. D’après ces résultats, seule la cirsimarine à 30 µM stimule la production de la décorine,

aucune stimulation n’est observée avec l’extrait végétal. Ceci peut s’expliquer par le fait

que ce soit la cirsimarine responsable en partie de cet effet et que compte-tenu de la

concentration utilisée pour l’extrait végétal (douze fois plus faible en équivalent

cirsimarine), cette stimulation ne soit pas observée par la technique utilisée.

La figure 35 regroupe les effets de la cirsimarine et de l’extrait végétal sur la matrice

extracellulaire : la cirsimarine stimule la synthèse du collagène de type I et de la

décorine. L’extrait végétal stimule la synthèse du collagène de type I et du collagène de

type III. La stimulation de ces protéines de structure renforce la cohésion de la matrice

extracellulaire et améliore la fermeté cutanée.

106

Figure 35 : Effets de la cirsimarine et de l’extrait végétal Microtea debilis Sw. sur la synthèse des collagènes de type I et III et sur la décorine. Les flèches rouges et vertes indiquent des stimulations de synthèse des molécules indiquées - en rouge : stimulation provoquée par la cirsimarine - en vert : stimulation provoquée par l’extrait végétal Microtea debilis Sw.

107

6. Effet anti-oxydant de la cirsimarine

Les flavonoïdes sont des molécules connues pour leur propriétés anti-oxydantes (Robak

and Gryglewski 1988). Récemment, le tissu adipeux a été identifié comme un site majeur

de production d’espèces oxygénées réactives (Furukawa et al. 2004) ; c’est pourquoi, il

nous a semblé intéressant de comparer les propriétés anti-oxydantes de la cirsimarine à

celles de deux flavonoïdes, la quercétine et la génistéine. Les propriétés anti-oxydantes

de ces trois flavonoïdes ont été étudiées sur un modèle acellulaire (peroxydation de

l’acide arachidonique) ainsi que sur un modèle physiologique (tissu adipeux de rat).

6.1. Matériels et méthodes

6.1.1. Étude des activités anti-oxydantes sur un modèle acellulaire

Le degré de peroxydation de l’acide arachidonique est apprécié par la méthode TBARS

(Thiobarbituric Acid Reactive Substances). Ce test consiste à incuber (37°C, une heure)

une solution d’acide arachidonique (200 µM, Sigma) dans un tampon NaHCO3 (100 µM,

pH 7,4, Sigma) en présence de FeCl3 (50 µM, Sigma) et d’acide ascorbique (500 µM,

Sigma) ainsi que les différents flavonoïdes à étudier. En effet, en présence d’ions

ferriques (Fe3+), l’acide ascorbique s’oxyde en acide déhydroascorbique. Cette réaction

produit du peroxyde d’hydrogène, qui génère, via la réaction de Fenton, des radicaux

hydroxyles (OH.) qui oxydent l'acide arachidonique (C20 :4, n-6). La solution d’acide

arachidonique peroxydée (500 µL) est mélangée avec une solution à 200 µM d’acide

thiobarbiturique préparée dans de l’acide acétique à 90% (TBA, 500 µL). Le

malonaldéhyde (MDA), composé issu de la dégradation oxydative de l’acide

arachidonique, réagit avec le TBA en milieu acide pour former, après incubation (98°C,

30 minutes) un complexe MDA-TBA qui présente un maximum d’absorption à 532 nm.

L’activité anti-oxydante est exprimée en équivalent TMPO (1,1,3,3 tétraméthoxypropane)

(Phillippy and Graf 1997). La solution cirsimarine est préparée dans du propylène glycol à

la concentration de 30 mM, puis diluée dans le tampon (NaHCO3, acide ascorbique, FeCl3,

pH 7,4) afin d’obtenir les concentrations à tester (0,03 mM ; 0,1 mM ; 0,3 mM ; 1 mM et

3 mM). La plus forte concentration testée contient 10% de solvant (propylène glycol), le

témoin contiendra par conséquent 10% de propylène glycol.

La génistéine (Sigma) a été solubilisée dans de l’éthanol à 96°2 (Carlo-Erba) à la

concentration de 30 mM, puis les concentrations à tester (0,03 mM ; 0,1 mM ; 0,3 mM ;

1 mM et 3 mM) ont été obtenues, par dilution dans le tampon d’incubation. Le témoin

108

contient 1% d’éthanol. La quercétine (quercétine dihydrate, Sigma) a été solubilisée

dans de l’éthanol à 96°2 à la concentration de 10 mM puis diluée dans le tampon

d’incubation afin d’obtenir les concentrations à tester : 1 µM ; 3 µM ; 10 µM ; 30 µM et

100 µM. Un témoin contenant 1% d’éthanol a été préparé en parallèle.

La quantité de lipides peroxydés est dosée en absence et en présence des flavonoïdes

étudiés. L’activité anti-oxydante (AO) de chaque flavonoïde correspond au pourcentage

d’inhibition de la peroxydation lipidique induite par FeCl3, elle est calculée selon la

formule : AO (%) = [(TMPO Témoin – TMPO Flavonoïde) / TMPO Témoin]*100

6.1.2.Étude des activités anti-oxydantes sur un modèle physiologique

Le tissu adipeux blanc a été récemment décrit comme site de production d’espèces

oxygénées réactives comme le peroxyde d’hydrogène, H2O2. C’est pourquoi l’activité anti-

oxydante de la cirsimarine a été étudiée et comparée à celle obtenue avec d’autres

flavonoïdes sur ce modèle. Pour cela, des prélèvements de tissus adipeux blanc ont été

réalisés sur des rats Wistar (Harlan), en suivant les recommandations de la directive

européenne 86 / 609.

Le test développé ici consiste à suivre l’oxydation de l’acide homovanillique

(λ excitation = 312 nm et λ émission = 436 nm) par le peroxyde d’hydrogène en visualisant

l’augmentation de la fluorescence à 436 nm (Ruch et al. 1983) en utilisant un

spectrofluorimètre PTI, modèle Quantamaster QM 2000-8 (Bioritech).

En effet, les adipocytes, en présence de tyramine, produisent du peroxyde d’hydrogène.

Nous comparerons la capacité de la cirsimarine à diminuer la quantité de peroxyde

d’hydrogène à celle de deux autres flavonoïdes, la quercétine et la génistéine.

Dans un premier temps, une courbe de calibration utilisant du peroxyde d’hydrogène

commercial a été réalisée afin de valider le dosage. Pour cela, sont ajoutés

successivement dans une cuve de spectrofluorimètre, 400 µM d’ acide homovanillique

(HVA, Sigma), 1 mM de tyramine (Sigma) et 36 U de peroxydase (horse radish

peroxidase, HRP, Sigma) ainsi que du tampon Krebs à 1% de BSA qsp 3 mL et

différentes concentrations de peroxyde d’hydrogène. La fluorescence est lue

extemporanément, elle correspond à la formation de dimère de HVA. La spécificité de ce

dosage est testée en ajoutant 200 mU de catalase (Sigma) à H2O2 auxquels on ajoute les

réactifs (HRP , HVA), après dix minutes d’incubation. La catalase dégrade le peroxyde

d’hydrogène, ce qui annule le signal.

La production de H2O2 adipocytaire est mesurée à partir de prélèvement de tissus

adipeux de 30 à 50 mg. Chaque prélèvement est placé dans une cuve de

spectrofluorimètre contenant 36 U de HRP, 400 µM d’HVA, 1 mM de NaN3, 1 mM de

tyramine, ainsi que du tampon Krebs à 1 % de BSA qsp 3 mL. La production d’ H2O2 au

109

sein du tissu adipeux est mesurée en absence et en présence de 15 µM de quercétine, de

15 µM génistéine ou de 15 µM cirsimarine. Ces trois flavonoïdes ont été solubilisés

comme expliqué précédemment (voir paragraphe 5.1.1). Après 30 minutes d’incubation à

37°C, la fluorescence est lue à 436 nm.

Enfin, nous avons souhaité savoir si les trois flavonoïdes étudiés agissaient directement

sur le peroxyde d’hydrogène ou s’ils agissaient plutôt sur les cellules. Pour lever cette

question, nous avons utilisé le même protocole que celui utilisé pour réaliser la courbe

étalon de peroxyde d’hydrogène mais en présence des différents flavonoïdes étudiés.

6.2. Résultats

6.2.1.Étude des activités anti-oxydantes sur un modèle acellulaire

La quercétine, la génistéine et la cirsimarine sont des molécules anti-oxydantes. Aux

concentrations testées, un effet dose-réponse est observé pour les trois molécules

étudiées (figures 36 à 38).

Figure 36 : Activité anti-oxydante in vitro de la quercétine. La partie gauche du graphique représente l’activité anti-oxydante de la quercétine exprimée en équivalent TBARS (TMPO). La partie droite du graphique représente la droite de régression (activité anti-oxydante (A0) exprimée en pourcentage en fonction de la concentration en quercétine). La quercétine possède une forte activité anti-oxydante : à 10 µM, l’activité anti-oxydante

atteint son maximum (99%). Dans la gamme de concentration étudiée, la concentration

inhibitrice 50 a été estimée en utilisant la droite de régression : y = 22,57 Ln(x) +

42,41 ; où y représente l’inhibition en % et x la concentration en quercétine en µM ;

ainsi, pour y = 50 on a x = 1,41 µM, d’où IC50 = 1,41 µM

AO

, %

110

Figure 37 : Activité anti-oxydante in vitro de la génistéine. La partie gauche du graphique représente l’activité anti-oxydante de la génistéine exprimée en équivalent TBARS (TMPO). La partie droite du graphique représente la droite de régression (activité anti-oxydante (A0) exprimée en pourcentage en fonction de la concentration en génistéine).

L’activité inhibitrice 50 de la génistéine dans ce modèle in vitro est de 0,17 mM, cette

valeur est obtenue de la même façon que précédemment, en utilisant la droite de

régression : y = 15,44 Ln(x) + 77,67.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,03 0,1 0,3 1 3

Cirsimarine, mM

TMPO

, µM

Figure 38 : Activité anti-oxydante in vitro de la cirsimarine. La partie gauche du graphique représente l’activité anti-oxydante de la cirsimarine exprimée en équivalent TBARS (TMPO). La partie droite du graphique représente la droite de régression (activité anti-oxydante (A0) exprimée en pourcentage en fonction de la concentration en cirsimarine).

y = 20,336Ln(x) + 70,055R2 = 0,9969

0102030405060708090

100

0,01 0,1 1 10

Cirsimarine, mM

AO

, %

111

L’activité anti-oxydante de la cirsimarine est du même ordre de grandeur que celle

obtenue avec la génistéine. La concentration la plus faible pour laquelle un effet anti-

oxydant est observé est 0,1 mM. En utilisant la droite de régression

y = 20,34 Ln(x) + 70,1 ; on obtient la concentration inhibitrice 50 pour la cirsimarine.

Elle vaut 0,37 mM.

6.2.2.Étude des activités anti-oxydantes sur un modèle physiologique

La courbe standard représentant la fluorescence du dimère d’acide homovanillique à

436 nm en fonction de la quantité de peroxyde d’hydrogène est présentée en figure 39.

On remarque que la fluorescence à 436 nm est linéaire de 0 à 1 µM d’H2O2. Le dosage

est spécifique du peroxyde d’hydrogène, puisqu’en présence de catalase, on éteint

complètement la fluorescence.

Figure 39 : Courbe standard de la quantité de peroxyde d’hydrogène, H2O2. La concentration en H2O2 est déterminée en suivant l’augmentation de la fluorescence à 436 nm, due à l’oxydation de l’acide homovanillique. Chaque point de mesure correspond à une moyenne de huit déterminations ± SEM. La présence de catalase éteint complètement la fluorescence.

112

Les effets des flavonoïdes étudiés sur le peroxyde d’hydrogène sont décrits dans la

figure 40. La quantité de peroxyde d’hydrogène est mesurée en absence (contrôle) et en

présence des différents flavonoïdes testés à 15 µM. Les trois flavonoïdes diminuent la

quantité de H2O2 produite par le tissu adipeux. L’inhibition la plus importante est obtenue

avec la quercétine (80%), suivie par la génistéine (54%) et enfin avec la cirsimarine

(36%).

Figure 40 : Inhibition de la production de peroxyde d’hydrogène par les trois flavonoïdes (quercétine, génistéine et cirsimarine) testés à 15 µM La production d’H2O2 est mesurée par l’augmentation de fluorescence à 436 nm provoquée par l’oxydation enzymatique de l’acide homovanillique par le peroxyde d’hydrogène. Chaque résultat est la moyenne de quatre essais ± SEM. *, différence significative par rapport au contrôle, test de Student, p<0,05. ***, différence significative par rapport au contrôle, test de Student, p<0,005.

0

20

40

60

80

100

120

Contrôle Quercétine Génistéine Cirsimarine

H2

O2

, %

du

con

trôle

(-80%)***

(-54%)***

(-36%)*

113

A l’issue de ce résultat (figure 40), il n’est pas possible de savoir si la diminution de la

production de H2O2 observée est due à une action directe des flavonoïdes sur le peroxyde

d’hydrogène ou sur les cellules produisant le peroxyde. Pour élucider cette question, nous

avons réalisé des courbes dose-réponse de H2O2 en absence et en présence des

flavonoïdes afin de mettre en évidence une interaction directe entre les flavonoïdes et le

peroxyde d’hydrogène (figure 41). Seules la quercétine et la génistéine montrent une

diminution significative de la quantité de H2O2 (p<0,005), ce résultat suggère que la

cirsimarine n’interagit pas directement avec le peroxyde d’hydrogène.

Figure 41 : Effet de différents flavonoïdes sur la concentration de H2O2. La concentration en H2O2 est mesurée par fluorescence, à 436 nm due à l’oxydation de l’acide homovanillique par la peroxydase. La fluorescence est mesurée pour différentes concentrations de H2O2, en présence de 15 µM de quercétine, de génistéine et de cirsimarine. *** : différence significativement différente du contrôle, p<0,005.

0

40000

80000

120000

160000

200000

0 0,125 0,25 0,375 0,5 0,625 0,75

H2O2, µM

H2O

2Fl

uore

scen

ce à

436

nm

ContrôleCirsimarine 15 µMQuercétine 15 µMGénistéine 15 µM

***

***

114

7. Discussion sur les propriétés biologiques de la

cirsimarine et d’un extrait végétal

Les cytotoxicités de la cirsimarine et de l’extrait végétal ont été étudiées sur différents

modèles cellulaires (fibroblastes humains en monocouche, explants de peau humaine).

Le temps de contact de ces produits avec les adipocytes étant court (de une à deux

heures), leurs cytotoxicités n’ont pas été étudiées sur ce modèle. L’absence de

cytotoxicité d’une molécule à des concentrations déterminées permet de s’affranchir d’un

biais dans la méthode de dosage. Ainsi, les activités mesurées ne peuvent être attribuées

qu’à la présence de la molécule étudiée et non à un état de souffrance cellulaire ou à un

changement du nombre de cellules. L’efficacité du produit démontrée, l’évaluation de sa

toxicité est analysée par différents tests, réalisés sur animaux en absence de tests

alternatifs sur cultures cellulaires.

7.1. Activités de la cirsimarine et d’un extrait végétal

sur le métabolisme lipidique

7.1.1.Activité lipolytique de la cirsimarine et d’un extrait végétal

Pour mesurer l’activité lipolytique d’un extrait végétal deux approches sont possibles :

doser les acides gras libérés dans le milieu d’incubation ou bien doser le glycérol. En

effet, lors de la lipolyse, une molécule de triglycéride est dégradée en une molécule de

glycérol et trois molécules d’acides gras. La quantification des acides gras libérés est par

conséquent plus sensible que celle du glycérol.

Dans ce travail, nous avons tout d’abord étudié l’activité lipolytique de la cirsimarine par

rapport à celle de la caféine, molécule dont les propriétés lipolytiques sont publiées

(Raben and Matsuzaki 1966; Verdy 1967). Puis, une fois l’intérêt démontré pour la

cirsimarine, nous avons étudié l’activité lipolytique d’un extrait végétal titré en

cirsimarine.

Concernant les modèles utilisés ici, l’activité lipolytique de la cirsimarine a été étudiée sur

des adipocytes isolés de rat, puis sur des adipocytes isolés humains. Celle de l’extrait

végétal a été étudiée sur des explants de peau humaine.

115

Étude sur adipocytes isolés de rat

Cette étude a permis de comparer l’activité lipolytique de la cirsimarine à celle de la

caféine. Comme la caféine, la cirsimarine est lipolytique sur adipocytes isolés de rat de

façon dose-dépendante. Par contre la cirsimarine est beaucoup plus efficace que la

caféine: la concentration la plus faible pour laquelle une activité lipolytique est observée

est de 0,005 mM pour la cirsimarine alors qu’elle est de 0,2 mM pour la caféine (cf. figure

15). De surcroît, la EC50 (Concentration Efficace 50) pour la cirsimarine est de

0,025 ± 0,01 mM alors qu’elle est de 0,49 ± 0,08 mM pour la caféine.

Étude sur adipocytes isolés humains

Dans la première étude, (figure 16), la théophylline à 1 mM et à 0,5 mM ainsi que

l’isoprotérénol à 1 µM stimulent fortement la lipolyse. La cirsimarine aux concentrations

testées (de 0,01 mM à 1 mM) augmente de façon significative la concentration d’acides

gras libres dans le milieu d’incubation. Toutefois, on n’observe pas d’effet dose dans

cette gamme de concentrations. Il est possible que les concentrations testées soient trop

fortes. Pour visualiser une courbe dose-réponse, il faudrait étudier l’intervalle entre

0,01 mM et 0,1 mM, c’est l’objet de la troisième étude (figure 19). La caféine testée à

1 mM, 0,5 mM et 0,25 mM stimule fortement la lipolyse. A 0,1 mM et 0,01 mM, la caféine

ne la stimule plus.

Le mélange caféine et cirsimarine stimule de façon significative la lipolyse. Dans tous les

cas, l’association caféine à 0,1 mM (non lipolytique) et cirsimarine donne une meilleure

stimulation que la cirsimarine seule (figure 18). De plus, à certaines concentrations

(figure 17) les effets lipolytiques de la cirsimarine et de la caféine s’ajoutent.

Si l’on cherche à comparer les conditions expérimentales de l’étude réalisée sur

adipocytes isolés de rat (figure 15) avec cette première étude réalisée sur adipocytes

isolés humains (figure 16), on remarque une différence dans la composition des milieux

d’incubation des adipocytes (étude sur adipocytes de rat, figure 15, le tampon Krebs

contient 4% d’albumine contre 0,5% dans l’étude sur adipocytes humains, figure 16) et

de la durée d’incubation (étude sur adipocytes de rat, une heure ; adipocytes humains

2 heures). Nous avons donc choisi d’uniformiser les essais et d’utiliser une heure

d’incubation et 4% d’albumine pour le second essai sur les adipocytes humains.

Dans la deuxième étude sur adipocytes humains (figure 17), la cirsimarine stimule de

façon dose-dépendante la lipolyse de 0,1 mM à 1 mM. A 0,01 mM, la cirsimarine n’est

plus lipolytique. La caféine, testée à 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM montre une activité

lipolytique quatre fois plus importante que celle obtenue avec la cirsimarine. A 0,1 mM la

cirsimarine est lipolytique alors que la caféine ne l’est pas.

116

Dans la dernière étude (figure 19), la cirsimarine étudiée à 0,01 mM, 0,05 mM et 0,1 mM

exerce un effet lipolytique de 18%, 38% et 44%, respectivement, de celle obtenue avec

l’isoprotérénol.

Les études (figures 17, 18 et 19) montrent que la cirsimarine est lipolytique sur les

adipocytes humains. L’activité de la cirsimarine exprimée en pourcentage de celle de la

caféine est variable. Cette variabilité peut dépendre des conditions d’expérimentation qui

ont changé selon les études (temps d’incubation, concentrations testées, nature des

échantillons de tissu adipeux, localisation anatomique des échantillons de tissus adipeux,

âge des donneurs.) (Mauriege et al. 1995a; Mauriege et al. 1995b).

L’activité lipolytique de l’extrait végétal Microtea debilis Sw. n’a pas été réalisée sur

adipocytes isolés humains car la méthode de dosage des acides gras libres (méthode

colorimétrique) est mal adaptée pour l’étude de produits colorés, ce qui est notre cas.

Nous avons par conséquent choisi d’étudier l’activité lipolytique de l’extrait végétal sur

des explants de peau humaine maintenus en survie où le dosage a été effectué par

chromatographie sur couche mince.

Étude sur explants de peau humaine

Dans les trois études réalisées (figures 20, 21 et 22), l’extrait de Microtea debilis Sw.

formulé à 1% induit une lipolyse aussi importante que la caféine formulée à 5% ou que

Percutaféine®. L’association de l’extrait végétal de Microtea debilis Sw. et caféine n’est

pas plus lipolytique que l’extrait seul. Plusieurs hypothèses sont possibles : les

concentrations testées en extrait et en caféine seraient trop importantes pour visualiser

une additivité des activités lipolytiques, l’extrait Microtea debilis Sw. et la caféine

agiraient sur les mêmes voies métaboliques. Dans cette dernière hypothèse, il est

rapporté que les récepteurs adénosine A1 sont impliqués dans le contrôle de la lipolyse

(Liang et al. 2002). Il est également indiqué que la caféine (Daly et al. 1991; Solinas et

al. 2005), tout comme la cirsimarine (Hasrat et al. 1997b; Hasrat et al. 1997c) sont des

ligands des récepteurs adénosine A1, des inhibiteurs de la phosphodiestérase (Beavo et

al. 1971) et sont des molécules lipolytiques (Raben and Matsuzaki 1966; Verdy 1967).

Sur les trois études réalisées, la caféine formulée par Gattefossé à 5% (cf. tableau 14)

est aussi efficace que Percutaféine® (produit commercial contenant 5% de caféine).

Deux études sur les trois réalisées indiquent que l’extrait végétal testé à 0,5% est autant

lipolytique que Percutaféine®, suggérant une concentration d’utilisation efficace de 0,5%.

Il serait intéressant de réaliser des études complémentaires pour optimiser la

concentration d’utilisation de cet extrait végétal afin d’obtenir un produit amincissant

efficace avec un coût de formulation moindre.

D’un point de vue mécanistique, nos résultats suggèrent que la cirsimarine agisse sur la

lipolyse de différentes façons. D’après la bibliographie, la cirsimarine est référencée

117

comme un antagoniste des récepteurs adénosines A1 (Hasrat et al, 1997c). Ces

récepteurs étant présents à la surface adipocytaire, nous pouvons faire l’hypothèse que,

lorsqu’ils sont stimulés, ils inhibent l’inhibition de la lipolyse, donc activent la lipolyse.

Dans ce travail, nous avons montré que la cirsimarine est également, au même titre que

la caféine un inhibiteur de la phosphodiestérase. Cependant, l’effet inhibiteur de la

cirsimarine n’a pas été testé sur le sous type de phosphodiestérase majoritairement

présent dans les adipocytes. La PDE3B est l’isoenzyme majoritairement présent dans les

adipocytes. Il est dix fois plus abondant que le sous-type PDE4B. L’activité PDE3B est

rapportée associée aux membranes microsomales. La PDE4B serait d’avantage associée à

la membrane plasmique et d’après Zhang et Carey serait responsable du métabolisme

extracellulaire de l’AMPc (2004). Des inhibiteurs spécifiques des PDE3 stimulent la

lipolyse d’adipocytes, humain, murin et de rat. Les inhibiteurs de PDE4 n’ont pas d’effet

sur la lipolyse d’adipocytes de rats. Ceux de PDE1 et 2 n’ont aucun effet sur la lipolyse

quelle que soit l’espèce considérée (Snyder et al. 2005). L’analyse de la relation

structure-fonction des flavonoïdes sur l’activité inhibitrice des phosphodiestérases montre

que la présence de la double liaison entre les carbones C2-C3 (cf. figures 7 et 9) est

essentielle pour exercer un effet inhibiteur des PDE1 à 5. Ce résultat conforte l’activité

inhibitrice de la cirsimarine sur les phosphodiestérases présentes dans l’adipocyte (Ko et

al. 2004).

Rappel des figures 7 (squelette de base des flavonoïdes) et 9 (formule de la cirsimarine)

Nos résultats montrent que la cirsimarine stimule fortement la lipolyse. Les mécanismes

d’action que nous avons identifiés sont la fixation sur les récepteurs à adénosine A1 et

l’inhibition de la phosphodiestérase. L’activation de la lipolyse dans les adipocytes met en

jeu toute une cascade de régulation qui aboutit à l’hydrolyse des triglycérides.

L’augmentation de la concentration cellulaire en AMPc stimule la protéine kinase A qui

active à son tour la lipase hormono-sensible. Par ailleurs, l’identification récente d’une

nouvelle lipase, impliquée dans l’hydrolyse des triglycérides, l’adipose triglycéride lipase

(ATGL) qui catalyse l’étape initiale de l’hydrolyse des triglycérides, constitue un nouveau

site de régulation possible. Les mécanismes qui sous-tendent la régulation de

118

l’expression de l’activité de ATGL sont, pour l’essentiel, inconnus. Les différentes étapes

de la lipolyse sont autant de sites de régulations possibles. Il n’est pas exclu que la

cirsimarine agisse également directement sur ces régulations, par exemple sur

l’expression de HSL ou de ATGL ou sur la phosphorylation des périlipines. L’utilisation de

H89 (inhibiteur de la protéine kinase A) permettrait de tester les effets de la cirsimarine

sur la PKA.

7.1.2.Activité anti-lipogénique de la cirsimarine et d’un extrait végétal

D’après les figures 22 et 23, la cirsimarine testée à 0,03 mM a une activité anti-

lipogénique aussi importante que l’acide éicosapentaénoïque à 1 mM. La cirsimarine ainsi

que l’extrait de Microtea debilis Sw. montrent un effet dose-réponse aux concentrations

testées. Par contre, si l’inhibition de la lipogenèse par la cirsimarine est importante (de

75% à 84%), celle correspondant à l’extrait végétal l’est sensiblement moins. En effet,

l’extrait testé à 67 mg / L correspond à 3 µM de cirsimarine ; si pour l’extrait on obtient

56% d’inhibition on a 75 % d’inhibition pour la cirsimarine seule. La même tendance est

observée pour l’extrait à 0,2 g / L qui contient 10 µM de cirsimarine : l’inhibition est de

78% pour l’extrait contre 84% pour la cirsimarine. Deux explications sont possibles pour

rendre compte de ces différences. La première hypothèse serait que la biodisponibilité de

la cirsimarine dans l’extrait végétal soit plus faible que celle de la cirsimarine purifiée.

L’autre hypothèse serait que l’extrait végétal contienne une ou des molécules qui

favoriseraient la lipogenèse. Il se produirait alors au sein de l’adipocyte une compétition

entre ces molécules dont la résultante serait une inhibition moindre de la lipogenèse.

Le fait que la cirsimarine soit non seulement lipolytique mais également anti-lipogénique

est extrêmement intéressant. En effet, mobiliser les lipides accumulés est difficile, d’où

l’intérêt accru d’une molécule capable de prévenir l’accumulation des lipides. Cependant ,

la question reste posée du mécanisme de l’effet anti-lipogénique de la cirsimarine.

L’équilibre fonctionnel d’un adipocyte oscille entre la lipogenèse et la lipolyse. Aucune

étude n’a jamais montré que les deux voies opposées fonctionnent en même temps, ce

qui se comprend aisément. Dès lors, dans la mesure où la cirsimarine inhibe la

phosphodiestérase responsable de la diminution de la concentration intra-cellulaire en

AMPc, l’activité de l’adipocyte s’oriente vers la lipolyse. Il n’est pas surprenant que la

lipogenèse cesse. Une façon de tester les effets anti-lipogéniques de la cirsimarine serait

de mesurer les effets lipogéniques de l’insuline en présence de cirsimarine et de

concentration élevée en adénosine.

119

7.1.3. Flavonoïdes et voies de signalisation

Les flavonoïdes sont présents sur terre depuis sans doute plus d’un milliard d’années

pendant lesquelles ils n’ont cessé d’interagir avec les organismes vivants. Leur survie

dans les plantes vasculaires au cours de l’évolution peut s’expliquer par des interactions

essentielles dans les réactions biochimiques et pharmacalogiques. Les flavonoïdes sont

importants dans la biochimie et la physiologie des plantes où ils sont anti-oxydants,

inhibiteurs d’enzymes, précurseurs de substances toxiques. Ils sont de plus impliqués

dans la photosensibilisation, le transfert d’énergie, la croissance, la photosynthèse, la

morphogenèse et la défense contre les infections (Smith and Blanks, 1986).

Les flavonoïdes sont très répandus dans le monde végétal où ils sont responsables des

couleurs des feuilles, essentiellement pendant l’automne. Ils sont abondants dans les

agrumes, l’huile d’olive, le vin, le thé. Certaines plantes et épices sont utilisées depuis

des millénaires en médecine orientale. Malgré l’abondante littérature portant sur les

effets des flavonoïdes, la médecine occidentale n’a pas encore utilisé les vertus

thérapeutiques des flavonoïdes malgré leur innocuité avérée.

La quantité et la nature des flavonoïdes apportés par l’alimentation varie selon les pays.

La consommation journalière en flavonoïdes atteint 1 g / jour aux USA (Kuhnau 1976), la

consommation aux Pays-Bas était de 23 mg / jour en 1987-88 (Hertog et al. 1993). La

quantité de flavonoïdes apportés dans le régime méditéranéen doit être très élevée, ce

régime étant riche en huile d’olive, et en agrumes et végétaux divers. Ces quantités

pourraient se traduire par des concentrations plasmatiques et tissulaires significatives .

Par contre, quelque soit le pays, les apports alimentaires en flavonoïdes dépassent

largement celle de la vitamine E et du béta-caroténe qui avoisinent le milligramme par

jour (Middleton E Jr et al. 2000).

Les flavonoïdes agissent dans un grand nombre de réactions biochimiques et

pharmacologiques suggérant qu’ils puissent agir dans de nombreuses fonctions des

systèmes cellulaires de mammifères.

D’un point de vue historique, deux flavonoïdes la citrine et l’hespéridine ont été pendant

quelque temps considérés comme des vitamines (Scarborough and Bacharach, 1949). Le

terme de vitamine P avait été utilisé pour souligner leur capacité à diminuer la

perméabilité capillaire et à prolonger la vie de cochons d’Inde partiellement carencés en

vitamine C. Bien que la qualité de vitamine n’ait pas été confirmée, leur effet anti-

oxydant et préservateur de vitamine C a été démontré (Clemtson, 1989). Actuellement

les flavonoïdes sont considérés comme des facteurs alimentaires non essentiels dont

l’importance pour la santé humaine n’a pas été évaluée. L’activité des flavonoïdes a

cependant été démontrée dans de nombreuses fonctions : anti-inflammatoires, anti-

oxydantes, anti-allergiques, hépatoprotectrices, anti-thrombotiques, anti-virales et anti-

120

carcinogénes. Cependant, les mécanismes d’action des flavonoïdes restent pour

l’essentiel mal compris (Middleton E Jr et al. 2000). Ainsi, on ne sait ni comment ils

rentrent dans la cellule ni si ces molécules peuvent s’accumuler dans des organites

cellulaires. Leurs effets étant très variés, de nombreux sites d’actions ont été mis en

évidence. Cependant, pour l’essentiel des travaux, les voies de signalisation des

flavonoïdes ont été jusqu’à présent peu étudiées. Nous avons rassemblé ci-dessous

certains effets rapportés de flavonoïdes dont les activités portent sur la cascade de

signalisation de la lipolyse.

Action sur les récepteurs béta-adrénergiques : le pycnogénol

stimule la lipolyse d’adipocytes 3T3-L1. Cette stimulation est

partiellement inhibée par le propranolol un antagoniste béta

adrénergique. Ceci suggère que le pycnogénol est capable de

moduler l’activité de ces récepteurs (Mochizuki and Hasegawa

2004b).

Action sur les kinases : certains flavonoïdes modulent l’activité de

la protéine kinase C (PKC) (Picq et al. 1989). La quercétine inhibe la

PKC purifiée de cerveau de rat (Ferriola et al. 1989). Elle agit comme

un substrat compétitif de l’ATP et du GTP. Elle inhibe la MAP kinase

de cellules humaines épidermales cancéreuses (Bird et al. 1992). La

fisétine et la lutéoline sont des inhibiteurs compétitifs du site de

fixation de l’adénosine tri-phosphate (ATP) de la PKC (Alexandrakis

et al. 1999). Des effets bénéfiques des isoflavones du soja (en

particulier de la génistéine) ont été rapportés sur l’obésité, le diabète

et les maladies cardiovasculaires. Des travaux récents montrent un

effet de la génistéine sur la kinase activée par l’AMP se traduisant

par une inhibition de l’adipogenèse, une augmentation de la

production de ROS résultant en l’apoptose des adipocytes

différenciés (Hwang et al. 2005).

Action sur la phospholipase A2 (PLA2) : la quercétine est un

inhibiteur de la PLA2 des leucocytes humains et de lapin (Lee et al.

1982);(Lanni and Becker 1985).

Action sur les ATPases : la quercétine inhibe la Calcium-ATPase en

agissant comme un inhibiteur compétitif de l’ATP (Murakami et al.

1992).

121

Action sur les lipoxygénases et les cyclo-oxygénases : la

quercétine est un inhibiteur efficace de la 12-lipoxygénase (Rao et

al. 1985). D’autres flavonoïdes (sideretoflavone, oroxinidine) sont

des inhibiteurs des lipoxygénases et des cyclo-oxygénases des

leucocytes péritonéaux de rats (Ferrandiz et al. 1990). La quercétine

et certains de ses dérivés inhibent l’activité et l’expression de la

cyclooxygénase de type 2 (O'Leary et al. 2004)

Action sur les phosphodiestérases (PDE): les nucléotides

cycliques (cAMP, cGMP) sont impliqués dans de nombreux

mécanismes cellulaires (division cellulaire, contraction des muscles

lisses, sécrétions, immunité, aggrégation plaquettaire…). Ils sont

dégradés par l’activité de la PDE. L’inhibition de PDE de diverses

origines cellulaires a été décrite pour de nombreux flavonoïdes

(Beretz et al. 1986; Ruckstuhl and Landry 1981).

Activité sur l’adénylyl cyclase : la chrysine et l’apigénine

diminuent la réponse de l’AMPc des plaquette à la prostacycline, cet

effet est attribué à une diminution de l’adénylyl cyclase (Landolfi et

al. 1984).

Action sur la lipase hormono-sensible : le magnolol stimule la

lipolyse. Cette stimulation est inhibée par le PD98059 un inhibiteur

de la mitogen-activated protéine kinase (MEK) et de la

phosphorylation de l’extracellular signal related kinases (ERK1 et 2),

suggérant que le magnolol agit par ces intermédiaires. Le magnolol

augmente transitoirement la concentration intracellulaire de calcium,

effet médié par la calcium calmoduline protéine kinase dépendante

(CaMK). La stimulation de ERK est connue pour activer la lipase

hormono-sensible et stimuler la lipolyse (Huang et al. 2004).

Action sur la fatty acid synthase (FAS) : plusieurs flavonoïdes

ont été définis comme inhibant la FAS avec des concentrations

efficaces 50 allant de 2 à 110 µM. La morine se fixe de façon

réversible sur le domaine béta-acyl synthase de la FAS ce qui inhibe

l’élongation des groupes acyls lors de la synthèse des acides gras (Li

and Tian 2004).

122

Tous ces exemples montrent que de beaucoup de flavonoïdes sont capables d’agir sur le

métabolisme lipidique. Il n’est donc pas étonnant d’en avoir découvert un capable de

stimuler la lipolyse. Ces nombreux exemples indiquent qu’il n’est pas rare qu’un

flavonoïde agisse de multiples façons. C’est le cas pour le flavonoïde qui est sans doute

le plus étudié, la génistéine, bien qu’aucune synthèse de ses effets sur les voies de

signalisation n’ait été réalisé.

Nous avons mis en évidence que la cirsimarine, antagoniste des récepteurs à adénosine,

stimule la lipolyse, est un inhibiteur de la PDE, et que cette molécule inhibe également la

lipogenèse. Il n’est pas impossible que d’autres effets de la cirsimarine existent, comme

l’inhibition de la synthèse et de l’activité des cyclo-oxygénases.

7.2. Activité de la cirsimarine et d’un extrait végétal

sur la synthèse de protéines de la matrice

extracellulaire

L’ascorbate, molécule connue depuis longtemps pour ses propriétés anti-oxydantes

(Wayner et al. 1986) est nécessaire au bon fonctionnement cellulaire (Padayatty et al.

2003) : cette molécule joue un rôle crucial dans certaines réactions d’hydroxylation

indispensables au fonctionnement des prolyl hydroxylases, des lysyl hydroxylases ou

encore des asparaginyl hydroxylases (Salnikow and Kasprzak 2005). Plus précisément,

l’ascorbate maintient le fer, co-facteur de ces enzymes, sous sa forme active Fe2+

(Myllyla et al. 1984). Les hydroxylations des résidus proline et lysine dans les molécules

de collagènes servent à former et à stabiliser, dans certaines conditions physiologiques,

les triples hélices de collagène. Les chaînes de collagène qui ne contiennent pas de

résidus 4-hydroxyproline ne peuvent pas former de structure en triple hélice stable

(Pihlajaniemi et al. 1991).

L’ascorbate n’a pas seulement un rôle dans la conformation tri-dimensionnelle des

molécules de collagène, il stimule aussi la transcription des gènes codant pour le

collagène de type I et augmente la stabilité des ARNm codant pour ce collagène (Lyons

and Schwarz 1984; Murad et al. 1981). De même, une étude réalisée sur des

chondrocytes montre que l’ascorbate augmente l’expression génique de la décorine

(Hering et al. 1994).

C’est pour l’ensemble de ces raisons que, dans ce travail, l’étude de l’expression des

composants de la matrice extracellulaire, a été réalisée en présence d’ascorbate.

123

Le résultat du travail par puce à ADN (tableau 16) montre que la cirsimarine testée à

0,03 mM stimule l’expression de plusieurs composants de la matrice

extracellulaire comme la décorine, le collagène de type I, le collagène de type III, le

collagène de type VII, l’élastine, le nidogène et le versicanne. Ce flavonoïde stimule aussi

la transcription de systèmes enzymatiques (lysyl hydroxylase, prolyl-4-hydroxylase) qui

permettent la maturation des molécules de collagène ainsi que des enzymes matrix

métalloprotéases (MMP), enzymes impliquées dans le renouvellement des molécules de

collagène. Le fait que ces enzymes de dégradation soient stimulées indique que la

matrice extracellulaire se renouvelle et se restructure.Cette étude par puce à ADN a mis

en évidence la stimulation de la synthèse de certaines molécules composant la matrice

extracellulaire par la cirsimarine. A l’issue de cette étude, nous avons vérifié par la

technique de RT-Q-PCR, la stimulation de cinq gènes codant pour des composants de la

matrice extracellulaire : chaîne α2 codant pour le collagène de type I, chaîne α1 codant

pour le collagène de type III, chaîne α1 codant pour le collagène de type VII, décorine et

nidogène. En effet, pour des raisons de coûts nous étions limités par le nombre de RT-Q-

PCR pouvant être réalisé. Ces cinq molécules ont été choisies comme témoin de la

synthèse globale des molécules composant la matrice extracellulaire.

Les résultats de l’étude par RT-Q-PCR, présentés dans le tableau 19, montrent que

l’extrait végétal et la cirsimarine augmentent de façon importante la transcription du

gène codant pour la chaîne α2 du collagène de type I ainsi que celui codant pour le

nidogène ; il existe une augmentation faible de la transcription des gènes codant le

collagène de type VII et la décorine. On ne visualise pas d’augmentation de synthèse des

ARNm codant pour le collagène de type III.

Les résultats obtenus par western-blot ( figures 32 à 35) montrent que l’extrait

augmente de façon significative la synthèse du collagène de type I (figure 32) mais dans

une moindre mesure par rapport aux résultats de l’expression génique (tableau 19).

Cette différence peut s’expliquer par le fait que le collagène de type I est un

hétérotrimère composé de deux chaînes α1 et d’une chaîne α2. Lors de l’étude par RT-PCR

(tableau 19) nous nous sommes intéressés uniquement à la transcription de la chaîne α2

et nous avons observé une forte augmentation de synthèse. Il se peut que la

transcription du gène codant la chaîne α1 soit peu stimulée par l’extrait, ce qui

expliquerait au final une quantité de collagène de type I moins importante (figure 26).

On peut également envisager d’autres hypothèses :

l’extrait stimulerait de façon importante la transcription des deux

gènes codant pour les deux chaînes du collagène de type I mais

l’étape limitante serait la traduction des ARNm en protéines.

il existerait une auto-régulation cellulaire : les cellules ne

traduiraient pas tous les ARNm présents en protéines.

124

la stabilité des ARNm serait limitée dans le temps.

En ce qui concerne le collagène de type III, protéine homotrimérique, on observe que

l’extrait végétal tout comme la cirsimarine augmente la synthèse de cette protéine

(figure 33). L’étude de l’expression génique a montré que la transcription du gène codant

pour la chaîne α1 du collagène de type III n’est pas augmentée ni par l’extrait, ni par le

flavonoïde. Aussi, il est possible que ces composés agissent sur la traduction protéique.

La synthèse de la décorine est augmentée de façon significative lorsque les fibroblastes

sont traités avec la cirsimarine (figure 34), ce résultat n’est pas retrouvé avec l’extrait

végétal.

Si l’on s’intéresse aux différences existantes entre une peau jeune et une peau âgée, on

observe que la quantité de collagène cutané (collagène de type I et collagène de type III)

diminue avec l’âge (Autio et al. 1994; Lovell et al. 1987) de façon linéaire (étude sur des

sujets âgés de 19 à 68 ans) (Dumas et al. 1994). Cette diminution peut être soit la

conséquence d’une diminution de la synthèse du collagène, soit d’une augmentation de

sa dégradation. Selon Furth, la synthèse des deux ARNm codant pour le collagène de

type I est diminuée dans les fibroblastes sénescents par rapport aux fibroblastes d’une

peau jeune (Furth 1991). De plus, la proportion du collagène de type I par rapport au

collagène de type III est constante que la peau soit jeune ou mature (Brinckmann et al.

1994).

7.3. Activité anti-oxydante de la cirsimarine

La grande majorité des flavonoïdes exerce des effets anti-oxydants. Par ailleurs, le stress

oxydant est impliqué dans de nombreuses pathologies (résistance à l’insuline, obésité…).

Des travaux suggèrent que le stress oxydant généré par H2O2 diminue la réponse

lipolytique des adipocytes isolés à la noradrénaline (Visentin 2003). En considérant ces

résultats, un effet anti-oxydant constituerait un autre mécanisme d’action de la

cirsimarine sur la lipolyse. Il était donc naturel de tester les effets anti-oxydants de la

cisimarine. Les premiers résultats montrent que la cirsimarine (figure 38) est faiblement

anti-oxydante comparée à deux autres flavones, la quercétine (figure 36) et la génistéine

(figure 37). Nous avons cependant testé les effets anti-oxydants de la cirsimarine sur du

tissu adipeux de rat. Cela a nécessité l’utilisation d’une méthode de dosage de H2O2.

Cette méthode a été validée par la réalisation d’une courbe standard qui montre la

linéarité du signal de fluorescence en fonction de la concentration de H2O2 (figure 39). Le

premier objectif a consisté à mesurer la production de H2O2 par le tissu adipeux. Bien que

ceci ait été rapporté par Krieger-Bauer et Kather, nous n’avons pas été capables de

125

reproduire leurs résultats dans leurs conditions expérimentales : Krebs, 2 % albumine, 1

mM NaN3 (Krieger-Brauer and Kather 1992). Dans nos conditions expérimentales, nous

avons observé une production de H2O2 seulement en ajoutant de la tyramine (1 mM).

Nous avons donc mesuré la production de H2O2 par des échantillons de tissu adipeux

incubés en présence des différentes flavones (quercétine, génistéine et cirsimarine) et de

tyramine. Dans ces conditions (figure 40), nous avons observé une inhibition de la

production de H2O2 par la quercétine (-80%), par la génistéine (-54%) et par la

cirsimarine (-36%). Une fois encore la cirsimarine montrait un effet anti-oxydant, certes

présent mais inférieur aux autres flavones testées. En recherchant les mécanismes

d’action possibles de cet effet anti-oxydant, nous avons testé l’interaction directe des

flavones et de H2O2. Nous avons constaté que la quercétine et la génistéine inhibent

fortement le signal généré par le peroxyde d’hydrogène (figure 41) suggérant ainsi une

interaction directe de ces flavones avec H2O2. De façon intéressante, cette interaction est

non significative, entre la cirsimarine et H2O2, ce qui suggère que l’effet anti-oxydant ne

soit pas dû à une réaction avec H2O2 mais plutôt à une action directe sur la cellule. Des

travaux supplémentaires sont nécessaires pour identifier le mécanisme d’action anti-

oxydant de la cirsimarine. Dans nos conditions expérimentales, en présence de tyramine,

une hypothèse pourrait être que la cirsimarine interfère avec la monoamine oxydase qui

désamine la tyramine. Une telle interaction a été rapportée avec une autre flavone la

kaempférol (Kuppusamy and Das 1992).

126

8. Perspectives

Les effets biologiques de la cirsimarine sont pour l’essentiel inexplorés. Nous avons mis

en évidence ses effets lipolytiques, anti-lipogéniques et anti-oxydants. Par ailleurs, nous

sommes en train de mettre en évidence ses effets sur le derme. Les résultats collectés

jusqu’à présent suggèrent que la cirsimarine puisse accroître la tonicité du derme en

stimulant notamment la synthèse de différents collagènes. Compte tenu des effets

pléiotropes attribués aux flavonoïdes, de nombreux effets pourraient être recherchés

pour valoriser la cirsimarine. Le mécanisme d’action de l’effet anti-oxydant de la

cirsimarine doit être identifié. Par ailleurs, la cirsimarine est-elle anti-inflammatoire ? Cet

effet pourrait être recherché par exemple sur l’expression des cyclooxygénases (COX) en

réponse à un stress, comme par exemple l’addition de 4-HNE (4-hydroxynonénal). Le 4-

HNE est un aldéhyde produit en réponse à un stress oxydant par les adipocytes 3T3-L1.

L’addition de cirsimarine, diminuera-t-elle l’augmentation de l’expression de COX2 dans

ce modèle ?

La cirsimarine a-t-elle des effets sur la dépense énergétique, comme cela a été rapporté

pour les flavones du thé vert ? Cette question est importante, y compris du point de vue

cosmétique car un agent uniquement lipolytique même très efficace se limitera à

mobiliser les lipides à son point d’application sans conséquence sur leur oxydation

ultérieure, laissant supposer qu’une fois libérés dans la circulation, ils retourneront se

déposer sur le site initial, si la balance énergétique du sujet n’est pas négative. Un

produit lipolytique et thermogénique (augmentation de la dépense énergétique)

assurerait non seulement la mobilisation des lipides périphériques mais également leur

oxydation.

De plus en plus d’études sont réalisées sur les flavonoïdes, permettant une analyse de la

relation structure–activité. Il est sans doute possible de trouver des composés plus

lipolytiques que la cirsimarine en modifiant les radicaux présents sur les différents cycles

de la molécule de même que son degré de glycosylation. Il serait intéressant de

développer une méthode d’analyse à haut débit permettant de quantifier les effets

lipolytiques des flavones en se basant sur le rapport structure fonction de celles-ci. Enfin

si le tissu adipeux est actuellement privilégié dans l’approche cosmétique, les effets

raffermissants du derme le sont également. Aussi, il serait intéressant de développer des

tests appropriés permettant d’identifier des molécules capables de raffermir le derme et

d’en diminuer le vieillissement.

127

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FOLIO ADMINISTRATIF

THESE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

NOM : GIROTTI - CHANU DATE de SOUTENANCE : 22 mars 2006 Prénoms : Catherine Marguerite Marie TITRE : Étude de la lipolyse et de la synthèse de composés du derme sous l’effet de la cirsimarine, flavone extraite de Microtea debilis NATURE : Doctorat Numéro d'ordre : 2006-ISAL-0016 Ecole doctorale : Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences Santé Spécialité : Biochimie Cote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 / et bis CLASSE : RESUME :

Notre objectif était de trouver un agent lipolytique pouvant être utilisé comme amincissant en cosmétique. Plutôt que de rechercher des agonistes activateurs de la lipolyse, nous nous sommes basés sur des mécanismes de régulation peu connus dans lesquels la lipolyse est inhibée en permanence. A partir ce cette possibilité, vérifiée dans nos travaux préliminaires, nous avons recherché des antagonistes de l’inhibition de la lipolyse. Les données de la littérature nous ont permis d’identifier une molécule pouvant jouer ce rôle : la cirsimarine. Nos objectifs ont été : 1) de trouver un approvisionnement, pour cela nous nous sommes procurés plusieurs plantes référencées pour contenir ce flavonoïde afin de choisir le végétal à utiliser ; 2) de mettre au point une méthode d’extraction et de purification de la cirsimarine ; 3) de mettre au point une méthode de dosage de cette molécule ; 4) de tester les effets lipolytiques de cette molécule sur différents modèles : adipocytes isolés de rat, adipocytes isolés humains, explants cutanés. Ces travaux nous ont permis d’établir que la plante Microtea debilis Sw. est la meilleure source potentielle en cirsimarine. Plusieurs conditions d’extractions ont été testées. Une méthode de purification de la cirsimarine par chromatographie préparative liquide haute performance a été développée afin de disposer d’un étalon fiable pour réaliser nos travaux de recherche. La cirsimarine produite a été identifiée et dosée par chromatographie sur couche mince et par chromatographie liquide haute performance. Nous avons étudié les effets de l’extrait végétal et de la flavone sur le métabolisme lipidique : lipolyse (sur des modèles d’adipocytes isolés et sur des explants) et lipogenèse (sur un modèle d’adipocytes isolés). Étant donné que la matrice extracellulaire est altérée lors de l’hypertrophie des adipocytes, nous nous sommes intéressés à l’action de l’extrait végétal sur la synthèse de certains composants de cette matrice. Les résultats préliminaires sur l’expression des ARNm et sur la synthèse de différentes molécules de la matrice extracellulaire suggèrent que la cirsimarine puisse jouer un rôle important sur la fermeté cutanée. Enfin, considérant l’effet antioxydant de la plupart des flavonoïdes, nous avons recherché cet effet pour la cirsimarine. Nos résultats suggèrent une action cellulaire directe de la cirsimarine résultant en une diminution de la production de peroxyde d’hydrogène par le tissu adipeux. MOTS-CLES : métabolisme lipidique, lipolyse, lipogenèse, adipocyte, récepteur adénosine A1, flavone, cirsimarine, Microtea debilis Sw., extrait, matrice extracellulaire, peau, anti-oxydant. Laboratoire (s) de recherches : Physiologie des Lipides et Membranes (PLM), UMR 585 INSERM / INSA-Lyon Institut de Biologie et Chimie des Protéines (IBCP), UMR 5086 CNRS / UCBL Société Gattefossé, Service Recherche et Développement Directeurs de thèse: Mr le Dr Alain GÉLOËN / Mr le Dr Frédéric DEMARNE Président de jury : Mr le Pr Michel LAGARDE Composition du jury : Mr le Pr Pierre CLOUET / Mr le Pr Philippe HUMBERT / Mr le Dr Bernard WENIGER / Mr le Pr Michel LAGARDE Mr le Dr Alain GÉLOËN / Mr le Dr Frédéric DEMARNE