© Dymka Coudé, 2018

Étude par traçage neuronal unitaire de la voie corticosubthalamique hyperdirecte chez le singe

Mémoire

Dymka Coudé

Maîtrise en neurobiologie - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

Étude par traçage neuronal unitaire de la voie corticosubthalamique hyperdirecte chez le singe

Mémoire

Dymka Coudé

Sous la direction de :

Martin Parent, directeur de recherche

iii

Résumé

Ce mémoire traite de l’organisation anatomique et fonctionnelle de la voie

corticosubthalamique chez le singe macaque. Cette projection neuronale, aussi connue sous

le nom de voie hyperdirecte, a été étudiée grâce à une méthode de marquage neuronal

unitaire. L’injection d’un traceur antérograde, la biotine dextran amine, dans la couche V du

cortex moteur primaire de quatre singes cynomolgus (Macaca fascicularis) par

microiontophorèse nous a permis de tracer en détails l’arborisation axonale de 28 axones

corticofuges composants la voie hyperdirecte. Les principaux résultats de cette étude

montrent que la projection corticosubthalamique est essentiellement ipsilatérale et que la

population de neurones à l’origine de cette projection est indépendante de celle composant

la voie corticostriée. Après avoir quitté le cortex, les axones de fort calibre (jusqu’à 3.7 µm

de diamètre) de la voie hyperdirecte voyagent le long de la capsule interne jusqu’au tronc

cérébral. À la hauteur du noyau subthalamique, ces axones émettent des collatérales de plus

petit diamètre qui innervent non seulement le noyau subthalamique, mais également la zona

incerta, le noyau rouge, les noyaux pontiques supérieurs et le noyau réticulaire du thalamus.

Dans le noyau subthalamique, les fines collatérales de la voie hyperdirecte s’arborisent

profusément au sein du territoire sensorimoteur. Les résultats obtenus dans le cadre de la

présente étude par marquage neuronal unitaire révèlent, pour la toute première fois chez le

singe, que la voie « hyperdirecte » est majoritairement « indirecte » puisque celle-ci provient

essentiellement de collatérales d’axones principaux qui innervent les étages inférieurs du

tronc cérébral. En outre, cette projection ne semble pas exclusive au noyau subthalamique

puisque les axones qui la composent ciblent plusieurs autres régions motrices cérébrales.

iv

Abstract

This thesis deals with the anatomical and functional organization of the corticosubthalamic

pathway in macaque monkey. This neuronal projection, which is also known as the

hyperdirect pathway, was investigated with the help of a single-cell labeling method. An

anterograde tracer, biotin dextran amine, was microiontophoretically delivered in layer V of

the primary motor cortex in four cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis), allowing us to

trace in detail the axonal arborization of 28 corticofugal axons forming the hyperdirect

pathway. The main results of this study indicate that the corticosubthalamic pathway is

essentially ipsilateral and that the population of neurons at the origin of this projection is

distinct from those giving rise to the corticostriatal projection. After leaving the cortex, the

large caliber axons (up to 3.7 μm in diameter) that form the hyperdirect pathway travel along

the internal capsule, heading toward the brainstem. At the subthalamic nucleus level, these

axons emit some small-diameter collaterals that innervate the zona incerta, the red nucleus,

the superior pontine nuclei, the thalamic reticular nucleus, and the subthalamic nucleus. In

the latter structure, thin collaterals of the corticosubthalamic projection arborize principally

within its sensorimotor territory. The results of the present single-axons tracing study reveal,

for the very first time in primates, that the so called “hyperdirect” pathway is largely

“indirect” since it is mainly composed of collaterals of main axons that travel downward to

the brainstem. Moreover, this projection does not seem exclusive to the subthalamic nucleus

since it targets several other cerebral motor nuclei.

v

Table des matières

RÉSUMÉ ......................................................................................................................................................... III

ABSTRACT .................................................................................................................................................... IV

TABLE DES MATIERES ............................................................................................................................... V

LISTE DES FIGURES ................................................................................................................................ VIII

LISTE DES TABLEAUX .............................................................................................................................. IX

LISTE DES ABRÉVIATIONS ........................................................................................................................ X

DEDICACE ET EPIGRAPHE .................................................................................................................... XII

REMERCIEMENTS ................................................................................................................................... XIII

AVANT-PROPOS ......................................................................................................................................... XV

1. INTRODUCTION GÉNÉRALE ................................................................................................................. 1

1.1 LES GANGLIONS DE LA BASE : STRUCTURES ET FONCTIONS ....................................................................... 1

1.1.1 Vue d'ensemble ................................................................................................................................. 1

1.1.2 Le noyau subthalamique ................................................................................................................... 2

Morphologie, neurochimie et propriétés électriques des neurones du noyau subthalamique .................................. 2

Les projections afférentes au noyau subthalamique ................................................................................................ 3

Les projections efférentes du noyau subthalamique ............................................................................................... 5

1.2 LE MODÈLE CLASSIQUE ANATOMO-FONCTIONNEL DES GANGLIONS DE LA BASE ....................................... 6

1.2.1 La voie directe et indirecte ................................................................................................................ 6

1.2.2 La voie hyperdirecte ......................................................................................................................... 9

Le noyau subthalamique comme seconde porte d'entrée des ganglions de la base ................................................. 9

Le noyau subthalamique en conditions pathologiques .......................................................................................... 10

L'implication du noyau subthalamique dans la maladie de Parkinson ............................................................. 10

Une cible de choix pour la stimulation cérébrale profonde .............................................................................. 11

1.3 OBJECTIFS DU PROJET ............................................................................................................................. 13

1.3.1 État de la question et objectifs poursuivis ....................................................................................... 13

1.3.2 La technique utilisée ....................................................................................................................... 15

1.3.3 Présentation du mémoire ................................................................................................................ 18

RÉSUMÉ DE L’ARTICLE ........................................................................................................................... 19

vi

2. ARTICLE .................................................................................................................................................... 20

SINGLE-AXON TRACING OF THE CORTICOSUBTHALAMIC HYPERDIRECT PATHWAY IN

PRIMATES ..................................................................................................................................................... 20

ABSTRACT ................................................................................................................................................. 21

INTRODUCTION ....................................................................................................................................... 22

MATERIALS AND METHODS ................................................................................................................. 23

Injection procedures................................................................................................................................. 23

Tracer visualization and cytochrome oxidase staining ............................................................................ 24

Material analysis and neuronal reconstructions ....................................................................................... 25

Preparation of samples for electron microscopy ...................................................................................... 26

RESULTS .................................................................................................................................................... 27

General labeling features ......................................................................................................................... 27

Initial axonal trajectory ............................................................................................................................ 28

Subthalamic nucleus ................................................................................................................................ 29

Zona incerta ............................................................................................................................................. 30

Red nucleus.............................................................................................................................................. 31

Reticular thalamic nucleus and superior pontine nucleus ........................................................................ 32

Ultrastructural features of VGluT1+ axon varicosities in the primate subthalamic nucleus.................... 33

DISCUSSION .............................................................................................................................................. 34

M1 axons arborize exclusively in the sensorimotor territory of the primate STN ................................... 34

The hyperdirect pathway in primates is mainly ipsilateral ...................................................................... 36

The hyperdirect pathway in primates is not solely devoted to the STN .................................................. 36

The corticosubthalamic and corticostriatal projections are two distinct entities in primates ................... 37

The hyperdirect pathway in primates modulates STN neurons through presynaptic and postsynaptic

contacts .................................................................................................................................................... 38

Functional implications for Parkinson's disease and deep brain stimulation ........................................... 39

CONCLUDING REMARKS ................................................................................................................................ 40

vii

FIGURE 1 ....................................................................................................................................................... 41

FIGURE 2 ....................................................................................................................................................... 42

FIGURE 3 ....................................................................................................................................................... 43

FIGURE 4 ....................................................................................................................................................... 44

FIGURE 5 ....................................................................................................................................................... 45

FIGURE 6 ....................................................................................................................................................... 46

TABLEAU 1 ................................................................................................................................................... 47

TABLEAU 2 ................................................................................................................................................... 48

3. CONCLUSION GÉNÉRALE .................................................................................................................... 49

BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................................... 52

viii

Liste des figures

Figure 1 Photomicrographies d’un site d’injection dans le M1 et de neurones isolés,

accompagnées d’une reconstruction tridimensionnelle d’un neurone de la

couche V du M1. L’activité électrophysiologique caractéristique des neurones

qui composent la couche V du M1 est également représentée. (p. 41)

Figure 2 Reconstruction tridimensionnelle de l’arborisation axonale de deux types de

neurones différents. Le premier innerve le STN et le tronc cérébral alors que

le deuxième projette au tronc cérébral, à la ZI et au STN. La

photomicrographie montre des varicosités corticales fréquemment observées

au STN. (p. 42)

Figure 3 Reconstruction tridimensionnelle de l’arborisation axonale de deux types de

neurones différents. Le premier innerve le STN, les étages inférieurs du tronc

cérébral, la ZI et continue probablement vers le RN. Le deuxième ne projette

qu’au STN et à la ZI. La photomicrographie montre des varicosités corticales

fréquemment observées dans la ZI. (p. 43)

Figure 4 Reconstruction tridimensionnelle de l’arborisation axonale de deux types de

neurones différents. Le premier innerve le STN, la ZI, le RN, le rt et les étages

inférieurs du tronc cérébral. Le deuxième projette aux étages inférieurs du

tronc cérébral, à la ZI, au RN et au STN. La photomicrographie montre le type

d’embranchement fréquemment observé d’un axone principal qui envoie une

collatérale au niveau de la pointe dorsolatérale du STN. (p. 44)

Figure 5 Reconstruction tridimensionnelle de l’arborisation axonale de deux types de

neurones différents. Le premier innerve le STN, la ZI, le RN, le rt et les étages

inférieurs du tronc cérébral alors que le deuxième innerve la ZI, le STN et un

noyau pontique supérieur. De plus, ce dernier projette aux étages inférieurs du

tronc cérébral en passant par la SNr. La première photomicrographie montre

une innervation corticale périsomatique fréquemment observées au RN. La

deuxième photomicrographie montre des varicosités corticales fréquemment

observées au STN. (p. 45)

Figure 6 Caractéristiques ultrastructurelles des varicosités axonales VGluT1-positives

observées dans le territoire sensorimoteur du STN d’un singe macaque. (p. 46)

ix

Liste des tableaux

Tableau 1 Types neuronaux composant le M1 chez le macaque ainsi que l’importance

relative de leurs projections axonales. (p. 47)

Tableau 2 Caractéristiques morphologiques des varicosités axonales VGluT1 provenant

d’axones corticales retrouvées au sein du territoire sensorimoteur du STN du

singe macaque. (p. 48)

x

Liste des abréviations

ABC Complexe avidine-biotine

AS Aire associative

av Varicosité axonale

BDA Biotine dextran amine

bs Tronc cérébral

Cd Noyau caudé

d Dendrite

DAB Diaminobenzidine

DBS Stimulation cérébrale profonde

DRN Noyau dorsal du raphé

GABA gamma-Aminobutyric acid

GB Ganglions de la base

Glu Glutamate

GP Globus pallidus

GPe Segment externe du globus pallidus (pallidum externe)

GPi Segment interne du globus pallidus (pallidum interne)

H1 Champ de Forel H1 (thalamic fasciculus)

H2 Champ de Forel H2 (lenticular fasciculus)

ic Capsule interne

LI Aire limbique

M1 Cortex moteur primaire

MP Maladie de Parkinson

PB Tampon phosphate

PBS Tampon phosphate salin

PFA Paraformaldehyde

PPN Noyau pédonculopontin

Put Putamen

RN Noyau rouge

rt Noyau réticulaire du thalamus

xi

SM Aire sensorimotrice

SN Substance noire (substantia nigra)

SNc Substance noire pars compacta (Substantia nigra pars compacta)

SNr Substance noire pars reticulata (Substantia nigra pars reticulata)

SPN Noyau pontin supérieur

STN Noyau subthalamique

Th Thalamus

VGluT1 Transporteur vésiculaire du glutamate 1

VGluT2 Transporteur vésiculaire du glutamate 2

xii

Dédicace et épigraphe

À l’absurdité de l’existence

« Life is a playground, use it as such »

xiii

Remerciements

Je tiens à remercier en premier lieu ma conjointe, Annie Faucher, pour m’avoir soutenu tout

au long du cheminement de ma Maîtrise. Malgré les moments de bonheur et de tristesse qui

ont façonné cette épopée, tu as toujours été présente pour moi. Merci pour ton existence dans

ma vie, ton soutien, ta compréhension et ton amour. Sans toi, le parcours aurait sans doute

été bien différent.

Je voudrais aussi profiter de ces quelques lignes pour remercier mes amies et amis. Grâce à

vous, ces 2 dernières années dans la ville de Québec ont été rempli de folie et de souvenirs

marquants que je ne suis pas près d’oublier.

Merci à mes parents, qui, malgré une incompréhension complète et totale de ce que j’ai pu

faire durant les 2 dernières années, m’ont toujours appuyé sans jamais remettre mes choix en

question. J’apprécie énormément votre amour et votre support ainsi que votre présence dans

ma vie.

Ensuite, je tiens à remercier toutes les magnifiques personnes que j’ai eu la chance de côtoyer

quotidiennement au centre de recherche tout au long de ma Maîtrise. Que ce soient les

anciens étudiants, les nouveaux arrivés, le personnel de soutien ou les chercheurs, vos

encouragements et votre guidance durant ces 2 années m’ont été d’une aide incroyable. Et

que dire de nos conversations dépourvus de sens, absurdes, loufoques ou simplement trop

profondes par moments. Sans vous, les journées moroses et les moments creux m’auraient

sans doute volé une partie de ma santé mentale. Je tiens à remercier particulièrement Dave

Gagnon et Marie-Josée Wallman pour avoir fait de moi un apprenti Jedi dans un monde où

tout est toujours à apprendre.

Finalement, merci à mon superviseur, Martin Parent, de m’avoir accueilli dans ton laboratoire

et de m’avoir poussé afin d’obtenir mes bourses de formation à la Maîtrise. Merci pour ta

patience et tes judicieux conseils qui m’ont permis d’élever mes capacités de raisonnement

xiv

et d’écriture en Science. Je tiens aussi à remercier le Dr André Parent pour les conversations

sur l’histoire des neurosciences qui ont approfondi mes connaissances dans le domaine. Votre

rôle de mentor lors de la réception des cerveaux humains était d’ailleurs très apprécié.

xv

Avant-propos

L’article inséré dans ce mémoire est sous sa forme finale ; il a été revu et corrigé par le Dr

Martin Parent. De plus, celui-ci est accepté et publié, depuis août 2018, dans la revue Brain

Structure and Function. Mon rôle dans la préparation de cet article a été substantiel, ce qui

fait de moi le premier auteur. J’ai été celui qui a effectué les manipulations techniques,

l’analyse du matériel, la rédaction de l’article et la création des illustrations. Bien entendu, il

m’est indispensable de remercier mon directeur de recherche pour sa contribution à la

correction de l’article. Sans lui, l’article ne serait pas ce qu’il est aujourd’hui. Je tiens

également à remercier Dr André Parent, coauteur, pour les corrections et suggestions qu’il a

su apporter à la version finale de l’article.

1

1. Introduction générale

1.1 Les ganglions de la base : structures et fonctions

1.1.1 Vue d'ensemble

Les noyaux gris centraux, mieux connus sous le nom de ganglions de la base (GB),

constituent un ensemble de structures sous-corticales indispensables au comportement

psychomoteur. À ce jour, chez le primate, les ganglions de la base sont considérés comme

étant constitués (1) du striatum, qui comprend le putamen, le noyau caudé et le noyau

accumbens, (2) du globus pallidus divisé en segment interne (GPi) et externe (GPe), de la (3)

substance noire divisée en pars reticulata (SNr) et en pars compacta (SNc), et du (4) noyau

subthalamique (STN) (Mink & Thach, 1993; Parent & Hazrati, 1995a; Parent & Parent, 2016;

Steiner & Tseng, 2016). De ces noyaux, le striatum est considéré comme la porte d’entrée

principale alors que le STN est vu comme une porte d’entrée secondaire des GB. Le GPi et

la SNr sont considérés comme des portes de sortie des GB puisque ces structures projettent

directement au thalamus. Les noyaux moteur de cette dernière structure viennent ensuite

innerver le cortex cérébral et engager l’initiation du mouvement (Steiner & Tseng, 2016;

Tewari et al., 2016). De cet ensemble de structures nait la boucle cortico-GB-thalamo-

corticale. Cette boucle est d’une importance particulière pour le contrôle moteur. D’ailleurs,

l’une des principales pathologies neurodégénératives qui affectent les GB est la maladie de

Parkinson (MP) (Mink, 1996; Levy et al., 1997). Il est à noter que certains noyaux

neuromodulateurs situés en marge des GB viennent significativement influencer le flot

d’information neuronale qui circule tout au long de l’axe principal de cette boucle. Parmi

ceux-ci, (1) le noyau dorsal du raphé (DRN), (2) les noyaux intralaminaires du thalamus et

(3) le noyau pédonculopontin sont considérés comme ayant le plus d’impact sur le

fonctionnement des GB (Steiner & Tseng, 2016). Le texte qui suit portera une attention

particulière au STN puisque cette structure est centrale à la problématique ayant guidée la

présente étude.

2

1.1.2 Le noyau subthalamique

Morphologie, neurochimie et propriétés électriques des neurones du noyau

subthalamique

Le STN joue un rôle crucial dans l’organisation anatomo-fonctionnelle des GB puisqu’il est

le seul noyau excitateur faisant partie de cet ensemble de structures sous-corticales (Parent

& Hazrati, 1995b). Ses neurones de projection utilisent majoritairement le glutamate comme

neurotransmetteur excitateur, mais le noyau renferme aussi un faible nombre d’interneurones

qui exercent leur rôle modulateur via l’acide γ-aminobutyrique (GABA), un

neurotransmetteur inhibiteur (Lévesque & Parent, 2005a). Étant donné la présence du

transporteur vésiculaire du glutamate 2 (VGluT2) au sein des neurones glutamatergiques du

STN, il est facile de les identifier en utilisant des techniques d’immunomarquages simples

(Schweizer et al., 2014). Le STN est un noyau dit « fermé » puisqu’il est entouré de différents

faisceaux de fibres : la capsule interne (ic) le borde latéralement, les champs de Forel en

ferme l’accès médialement alors que le faisceau lenticulaire le couvre dorsalement (Hamani

et al., 2004). La taille du STN varie significativement d’une espèce à l’autre, mais sa

composition neuronale est très peu affectés par les variations interspécifiques (Parent &

Hazrati, 1995b). Les corps cellulaires des neurones du STN sont principalement de type

ovoïde et émettent de 5 à 8 dendrites généralement lisses et quasi dépourvues d’épines (Sato

et al., 2000). Ces dendrites semblent confinées à l’intérieur du noyau et couvrent la totalité

de celui-ci chez le rat, mais seulement le neuvième de son volume chez le primate (Parent &

Hazrati, 1995b). En conditions normales, les neurones du STN ont une activité

électrophysiologique autonome, c’est-à-dire qu’ils sont en mesure de s’activer

indépendamment de signaux excitateurs extrinsèques (Steiner & Tseng, 2016). Cette activité

autonome serait due à la présence de canaux sodiques transitoires axosomatiques qui se

referment très lentement et qui sont en mesure de dépolariser les neurones de manière

cyclique (Atherton et al., 2008). Les projections afférentes et efférentes du STN seront

abordées lors des prochaines sections de ce texte.

3

Les projections afférentes au noyau subthalamique

Les projections afférentes au noyau subthalamique (STN) proviennent de sources multiples.

Il existe néanmoins deux projections afférentes majeures, soit celles provenant du GPe et

celles émergeant du cortex cérébral (Parent & Hazrati, 1995b). À l’aide de synapses

axosomatiques ou axodendritiques ciblant les récepteurs GABAA exprimés par les neurones

du STN, l’innervation GABAergique du GPe aurait un effet fortement inhibiteur sur l’activité

du noyau (Baufreton et al., 2001). Cette projection couvre d’ailleurs la majorité du volume

occupé par le STN et respecte une organisation topographique bien précise. En effet, chez le

primate, les neurones retrouvés au centre du GPe projettent au tiers latéral du STN alors que

ceux antérieurs innervent les neurones présents dans les deux tiers antérieurs du noyau. Cette

organisation laisse croire à la possibilité de populations neuronales distinctes, ayant des

fonctions différentes, au sein même du STN (Carpenter et al., 1981). Comme le GPe, le

cortex cérébral innerve le STN en respectant une organisation somatotopique très spécifique

(Nambu et al., 1996; Haynes & Haber, 2013). Par exemple, le cortex cingulaire antérieur,

impliqué dans le phénomène d’empathie, innerve la pointe médiale du STN. Le cortex

préfrontal dorsolatéral, quant à lui impliqué dans les fonctions cognitives complexes et

associatives, projette majoritairement sur le STN ventral. Pour sa part, le cortex moteur

primaire, qui joue un rôle dans la planification et l’exécution des mouvements, innerve

massivement la pointe dorsolatérale du STN. Cette topographie, imposée par les projections

axonales en provenance des régions limbiques, associatives et motrices du cortex cérébral,

donne finalement naissance à trois territoires fonctionnels distincts au sein du STN : la pointe

ventromédiale du noyau est considérée comme le territoire limbique, la partie dorsolatérale

comme le territoire sensorimoteur et la partie ventrale du noyau comme le territoire associatif

(Alkemade, 2013; Alkemade et al., 2015). Les afférences corticales proviennent de neurones

de la couche V du cortex cérébral et interagissent principalement avec les dendrites des

neurones du STN, où elles forment des synapses de type asymétrique (Romansky et al., 1979;

Villalba & Smith, 2011). L’effet excitateur du cortex cérébral s’exercent par l’intermédiaire

de récepteurs glutamatergiques de type métabotropique ainsi que de récepteurs ionotropiques

AMPA et NMDA exprimés par les neurones du STN (Awad et al., 2000; Chu et al., 2015).

4

Le STN reçoit aussi des projections moins denses en provenance de diverses régions

cérébrales autre que le GPe et le cortex cérébral. Parmi celles-ci, notons une projection

glutamatergique provenant du complexe centremédian-parafasciculaire du thalamus qui cible

préférentiellement les dendrites des neurones du STN (Sadikot et al., 1992). Cette projection

thalamo-STN conserve, elle aussi, une certaine topographie qui respecte les territoires

fonctionnels de cette structure. Le noyau centremédian du thalamus, considéré comme ayant

un rôle dans les fonctions motrices, innerve le territoire sensorimoteur du STN alors que le

noyau parafasciculaire, ayant des fonctions limbiques et associatives, projette à l’aire

associative du STN (Parent & Hazrati, 1995b). En plus de la projection d’origine thalamique,

le noyau pédonculopontin (PPN) du tronc cérébral impliqué dans la locomotion procure, lui

aussi, un apport considérable en glutamate au STN. L’effet de cette afférence du tronc

cérébral serait de stimuler le STN. Cependant, le PPN renferme aussi des neurones qui

relâchent de l’acétylcholine au sein du STN. L’acétylcholine favoriserait l’activation du STN

en exerçant un effet inhibiteur pré-synaptique sur les afférences GABAergiques en

provenance du GPe, le tout médié par l’activation de récepteurs muscariniques

métabotropiques (m1 et m3) situés sur l’axone des afférences en provenance du GPe, mais

également directement sur les neurones du STN (Flores et al., 1996; Xiang et al., 2012). Le

STN est également soumis à une neuromodulation complexe exercée par deux autres

neurotransmetteurs: la dopamine et la sérotonine (Mori et al., 1985; Lavoie et al., 1989;

Hassani et al., 1997; Wallman et al., 2011). Effectivement, les neurones provenant de la SNc

et du DRN seraient en mesure de stimuler l’activité des neurones du STN en utilisant

respectivement la dopamine et la sérotonine comme neurotransmetteurs (Stanford et al.,

2005; Loucif et al., 2008). Les actions de ces neurotransmetteurs sont complexes. En agissant

sur de multiples récepteurs sérotoninergiques (5-HT1A, 5-HT2C, 5-HT4 et 5-HT1B) et

dopaminergiques (D1 et D2) situés sur le domaine somatodentritique des neurones du STN,

mais également sur les différentes projections afférentes, le DRN et la SNc viennent moduler

l’effet des afférences innervant le STN tout en agissant directement sur les neurones

glutamatergiques intrinsèques au noyau (Hassani et al., 1997; Cragg et al., 2004; Shen &

Johnson, 2008; Wallman et al., 2011; Miguelez et al., 2014).

5

Les projections efférentes du noyau subthalamique

Les neurones du STN établissent une panoplie de connections efférentes vers d’autres

composantes des GB. Ces projections ont été grandement étudiées à l’aide de traceurs

antérogrades, soit différents composés chimiques qui sont incorporés au niveau du corps

cellulaire et qui voyagent le long des dendrites et de l’axone des neurones qui le captent (Kita

& Kitai, 1987; Sato et al., 2000). Les résultats les plus pertinents concernant les efférences

du STN proviennent du laboratoire Parent où une étude de traçage unitaire a été fait chez le

singe macaque (Sato et al., 2000). De cette étude, cinq types de neurones composant le STN

ont été observés : (1) les neurones projetant au GPe, au GPi et à la SNr, (2) ceux qui projettent

au GPi et à la SNr, (3) les neurones qui innervent le GPe et le GPi, (4) les neurones projetant

seulement au GPe et (5) ceux qui innervent le striatum. Malgré la diversité de populations

neuronales retrouvée, la projection la plus dense était celle innervant le GPe. Il est

présentement accepté que cette connexion se fasse sur des neurones innervant à leur tour le

STN afin d’assurer un rétrocontrôle direct sur l’activité du noyau. En plus des projections

vers des structures sous-corticales, il existe des évidences à l’effet que le STN projette aussi

au cortex cérébral (Degos et al., 2008). De manière intéressante, les neurones du STN

innerveraient préférablement les couches II, III et IV des régions limbiques, associatives et

motrices du cortex cérébral. De plus, le STN semble innerver le noyau pédonculopontin.

Malheureusement, les populations de neurones visées dans cette structure ne sont toujours

pas connues, mais une innervation globale des neurones GABAergiques, glutamatergiques

et cholinergiques est fort probable (Steiner & Tseng, 2016). Finalement, certains neurones

du STN innervent aussi la SNc (Watabe-Uchida et al., 2012). En exerçant une action

excitatrice sur la SNc, le STN renforce sa position d’importance au sein des ganglions de la

base. En effet, en plus d’être le seul noyau glutamatergique de cet ensemble de structure sous

corticales, le STN serait en mesure d’influencer l’activité de la SNc, l’une des structures

modulatrices les plus importantes des GB.

6

1.2 Le modèle classique anatomo-fonctionnel des ganglions de la

base

1.2.1 La voie directe et indirecte

Bon nombre d’études effectuées à l’aide de modèles animaux, ainsi que chez différents

patients atteints de la maladie de Parkinson, ont permis de développer un modèle anatomo-

fonctionnel des ganglions de la base (GB). Vers les années 80, le concept de voie directe et

indirecte voyait le jour dans le but d’expliquer le fonctionnement normal et pathologique des

GB (Penney & Young, 1983; Albin et al., 1989; Mink & Thach, 1993; Parent & Hazrati,

1995a).

Tel que décrit plus haut, la boucle cortico-GB-thalamo-corticale assure une connexion

réciproque entre les GB et le cortex cérébral. Le modèle considère le striatum comme la porte

d’entrée principale des GB. En effet, les afférences glutamatergiques excitatrices du cortex

cérébral seraient en mesure de contrôler de façon importante l’activité des neurones du

putamen et/ou du noyau caudé. D’ailleurs, le cortex sensorimoteur innerverait principalement

le putamen, le cortex associatif le noyau caudé et le cortex limbique innerverait

préférentiellement le striatum ventral, dont la partie principale est le noyau accumbens. Il

existe donc, au sein du striatum, une ségrégation des territoires fonctionnels semblable à celle

retrouvée au STN. Suite à l’innervation corticale du striatum, l’information est transmise

jusqu’aux portes de sortie des GB : le GPi et la substance noire pars reticulata (SNr). Ces

noyaux GABAergiques inhibiteurs innervent alors certains neurones glutamatergiques

contenus au sein du tiers ventral du thalamus afin qu’ils puissent, ou non, transmettre le

message filtré au cortex cérébral qui est responsable d’envoyer une commande motrice

descendante vers les motoneurones de la moelle épinière.

Selon le modèle classique de l’organisation anatomique et fonctionnelle des GB,

l’information voyage au travers des GB d’une manière parallèle et ségréguée au sein de la

voie directe et indirecte. La voie directe doit son nom au fait que les neurones qui la

7

constituent projettent directement aux portes de sortie des GB alors que les neurones de la

voie indirecte projettent indirectement, via un relais dans d’autres noyaux, à celles-ci.

Cependant, certaines études récentes suggèrent qu’il existe de nombreuses interactions entre

ces deux voies, ce qui vient complexifier significativement le modèle classique (Parent et al.,

2000; Parent & Parent, 2016). Les quelques lignes qui suivent résument les principales

caractéristiques du modèle classique de l’organisation anatomique et fonctionnelle des GB

de manière abrégée.

La voie directe est constituée de neurones striataux GABAergiques qui expriment le

récepteur dopaminergique D1, ainsi que la substance P et la dynorphine (Parent & Parent,

2016). Ces neurones, une fois excités, projettent de manière directe et monosynaptique sur

certains neurones du GPi et de la SNr afin de les inhiber. Ce faisant, l’inhibition du thalamus

est levée et celui-ci peut communiquer avec le cortex cérébral dans le but, bien souvent, de

l’informer sur l’action motrice sélectionnée. La voie directe est alors considérée comme

favorisant la sélection d’une action motrice, l’accomplissement de celle-ci et, donc,

l’exécution d’un mouvement.

Pour sa part, la voie indirecte est constituée de neurones striataux GABAergiques qui

expriment le récepteur dopaminergique D2, ainsi que l’enképhaline (Parent & Parent, 2016).

Leur influence sur les portes de sortie des GB se fait de manière polysynaptique puisque leur

projection primaire vise les neurones du GPe. Cette structure, tel que décrit plus haut, cible

principalement les neurones du STN afin de diminuer leur activité. Une fois inhibés par les

neurones de la voie indirecte, les neurones du GPe subissent une baisse d’activité qui conduit

à une désinhibition des neurones du STN. Cette perte d’inhibition permet aux neurones du

STN de stimuler les portes de sortie des GB via leurs projections glutamatergiques. Ceci a

pour effet d’inhiber de manière globale le thalamus et, par le fait même, d’empêcher la

sélection motrice ainsi que l’exécution du mouvement. La voie indirecte est alors perçue

comme défavorable à l’initiation du mouvement. Il est important de souligner ici la position

cruciale qu’occupe le STN au sein de la voie indirecte des ganglions de la base.

8

On présume que le fonctionnement harmonieux des GB repose en grande partie sur

l’équilibre entre la voie directe et indirecte. Il s’agit là d’un équilibre précaire puisqu’il repose

principalement sur la fluctuation d’un neuromodulateur qui influence grandement le

fonctionnement des GB. En effet, la dopamine provenant de la SNc est d’une grande

importance pour le fonctionnement du striatum. Une augmentation subite ou une diminution

à long terme de sa concentration au sein de la structure viendra grandement débalancer

l’équilibre entre la voie directe et indirecte. Ces changements sont la cause de ce qui mène,

entre autres, à l'expression des symptômes moteurs de nature hypokinétiques qui

caractérisent la maladie de Parkinson (MP) (Levy et al., 1997; DeLong & Wichmann, 2007;

Obeso et al., 2008). En effet, puisque les neurones de la voie directe expriment le récepteur

D1 couplé positivement à l’adénylate cyclase, ces neurones seront excités par la dopamine.

D’un autre côté, les neurones de la voie indirecte expriment le récepteur D2, inhibiteur,

puisque celui-ci est couplé négativement à l’adénylate cyclase. La présence de la dopamine

au sein du striatum permet donc de réguler l’activité des voies directe et indirecte. Une perte

de dopamine, telle qu’observée dans la MP par exemple, provoque un déséquilibre important

entre ces voies. La voie directe deviendra moins active alors que la voie indirecte deviendra

beaucoup plus active sans l’inhibition que lui procurait la dopamine. Ceci résulte, au final,

en l’apparition de symptômes moteurs si caractéristiques chez les patients parkinsoniens,

comme la bradykinésie, les tremblements au repos, les problèmes posturaux et la difficulté

d’initier des mouvements.

Tel que décrit plus haut, ce modèle ne tient pas en compte certaines études récentes qui

suggèrent qu’il existe de nombreuses interactions entre la voie directe et indirecte (Parent et

al., 2000; Lévesque & Parent, 2005b; Parent & Parent, 2016). Par exemple, on sait

maintenant que la plupart des neurones striatofuges innervent aussi le GPe. Le degré de

collatéralisation des neurones qui composent les GB est beaucoup plus complexe que ce qui

est présenté dans le modèle classique. Bien que très utile à la compréhension du

fonctionnement et de l’organisation des GB, je crois important de mentionner qu’il faut

tempérer cet ancien modèle dans le contexte actuel.

9

1.2.2 La voie hyperdirecte

Le noyau subthalamique comme seconde porte d'entrée des ganglions de la base

Tel que mentionné plus haut dans ce mémoire, le STN reçoit différentes projections

afférentes en provenance du cortex cérébral (Nambu et al., 1996; Kita & Kita, 2012; Haynes

& Haber, 2013). À la suite du modèle classique proposé dans les années 80, les projections

corticales forment une troisième voie neuronale qui s’ajoute à l’ancien modèle. Cette

projection du cortex au STN fut nommée la projection corticosubthalamique, mieux connue

sous le nom de « voie hyperdirecte » (Nambu et al., 2002). Cette projection était nécessaire

afin d’expliquer certains phénomènes observables au niveau du fonctionnement des GB, mais

dont on ne connaissait pas la cause. En effet, après stimulation du cortex cérébral, il était

possible d’observer une forte, mais courte, activation des neurones du STN et du GPi avant

même l’arrivée de l’information en provenance de la voie indirecte et directe (Nambu et al.,

2000; Nambu et al., 2002). La compréhension des mécanismes reliés à la voie hyperdirecte

permet de mieux expliquer ces phénomènes.

Des études électrophysiologiques chez le macaque ont permis d’observer que les neurones

pallidaux passaient au travers de trois phases suite à une stimulation corticale : (1) une courte

excitation suivie (2) d’une inhibition puis (3) d’une excitation tardive (Nambu et al., 2000).

De manière intéressante, une lésion de la voie hyperdirecte chez le singe macaque élimine

l’excitation initiale normalement perçue dans les neurones pallidaux de singes normaux

(Inoue et al., 2012; Mathai et al., 2015; Chu et al., 2017). Ainsi, on croit que la voie

corticosubthalamique permettrait au cortex cérébral d’acheminer indirectement de

l’information au pallidum, via un relais au STN, tout en court-circuitant le striatum. Ce

mécanisme permettrait alors d’inhiber de larges portions du thalamus lors d’une présélection

d’une action motrice par le cortex cérébral. Par la suite, le signal transmis par la voie directe

serait en mesure d’inhiber des neurones spécifiques appartenant aux portes de sortie des GB.

En inhibant les neurones GABAergiques, on assure une sélection fine et précise de l’action

motrice à exécuter en désinhibant les noyaux moteurs du thalamus. Finalement, le signal

parvenant par la voie indirecte arriverait au GPi par le STN ce qui permettrait une seconde

10

inhibition du thalamus afin de s’assurer une terminaison du mouvement et une inhibition des

mouvements involontaires.

Le projet de recherche présenté dans ce mémoire tentera de valider cette hypothèse en faisant

l’inventaire des noyaux, autre que le STN, qui sont innervés par la voie hyperdirecte. Ce type

d’information nous permettra de mieux mieux comprendre le rôle de la voie hyperdirecte au

sein des GB.

Le noyau subthalamique en conditions pathologiques

L'implication du noyau subthalamique dans la maladie de Parkinson

La maladie de Parkinson (MP) est reconnue pour être causée par la dégénérescence des

neurones dopaminergiques qui composent la SNc et dont les axones s’arborisent au sein du

striatum (Albin et al., 1989; DeLong & Wichmann, 2007; Galvan & Wichmann, 2008). Tel

que décrit plus haut, cette perte en dopamine dans le striatum causerait un débalancement

entre la voie directe et la voie indirecte. Ceci aurait comme conséquence immédiate de

produire les symptômes moteurs décrits plus haut qui sont si facilement visibles chez les

patients atteints de la maladie. En effet, la perte de dopamine striatale lève l’inhibition

normalement produite par ce neurotransmetteur au niveau des neurones de la voie indirecte

qui exprime le récepteur D2. Cette voie devient alors anormalement active, ce qui vient

bloquer de manière efficace une partie du contrôle moteur.

Bien que la perte en dopamine au sein du striatum soit à la base des changements fonctionnels

observés dans les GB, plusieurs autres modifications sont visibles et mesurables (Galvan &

Wichmann, 2008). Par exemple, la hausse d’activité de la voie indirecte viendrait diminuer

le niveau d’activité du GPe normalement observé en conditions saines. En revanche, le

débalancement entre les voies directe et indirecte induirait une augmentation de l’activité du

GPi et du STN (Galvan & Wichmann, 2008; Mathai et al., 2015). Bien que le STN possède

une activité autonome en conditions normales, les neurones du noyau deviendraient

11

hyperactifs suite à la perte des mécanismes de rétroaction du GPe : les patrons de décharge

normalement stables et rythmés changent pour des patrons de décharge en rafale dans la MP

(Bergman et al., 1994). L’augmentation de l’activité du STN expliquerait alors une activité

du GPi accrue, un phénomène qui renforce davantage l’inhibition du mouvement causée par

la voie indirecte. D’ailleurs, un autre changement est observé dans le STN en condition

pathologique. Étrangement, les neurones composant le STN synchronisent leurs décharges

avec d’autres structures des GB dans la MP (Bergman et al., 1994; Hammond et al., 2007).

Cette synchronicité anormale est présentement considérée comme étant en partie la cause des

symptômes moteurs observés lors de la MP.

La voie hyperdirecte subit à son tour des changements fonctionnels et morphologiques dans

la MP. Tel que démontré chez le modèle primate de la MP, cette voie se réorganise d’un

point de vue ultra-structurel (Mathai et al., 2015). Une perte d’innervation, ou plutôt une

diminution du nombre de varicosités axonales glutamatergiques est observée au sein du STN

chez les modèles animaux de la MP. Cette perte serait concentrée sur le territoire

sensorimoteur du STN, suggérant que les projections du cortex moteur seraient le plus

fortement touchées par la MP. La diminution d’innervation corticale au STN permettrait ainsi

d’expliquer en partie la quantité de mouvements involontaires observés suite à l’initiation du

mouvement chez les patients parkinsoniens; en ayant une diminution d’intensité dans le

premier signal du cortex au STN relayé par la voie corticosubthalamique, qui permet

d’inhiber une bonne partie du thalamus moteur avant le choix du programme moteur à

effectuer par la voie directe, certains symptômes moteurs seraient en mesure de faire leur

apparition chez le patient (Inoue et al., 2012).

Une cible de choix pour la stimulation cérébrale profonde

Les patients atteints de la MP reçoivent normalement de la L-Dopa. Cette molécule, qui est

le précurseur de la dopamine, est régulièrement utilisée comme première ligne de traitement

afin de diminuer l’ampleur des symptômes moteurs provoqués par la dégénérescence des

neurones dopaminergiques de la SNc. En effet, les symptômes moteurs de la maladie, tels

12

que les tremblements au repos, la difficulté d’initier un mouvement et la rigidité musculaire,

se voient grandement améliorés suite à ce traitement pharmacologique (Connolly & Lang,

2014). Bien que ce médicament soit très efficace durant les premières années de traitement,

il ne permet pas d’arrêter le processus neurodégénératif associé à la MP. Certains patients

finissent par ne plus répondre à la L-Dopa alors que d’autres voient leurs symptômes moteurs

associés à la MP revenir. De plus, la L-Dopa cause fréquemment des dyskinésies chez

plusieurs patients après seulement quelques années de traitement (Manson et al., 2012). Ces

patients deviennent alors de parfaits candidats pour un nouveau type de thérapie, la

stimulation cérébrale profonde (DBS) (Jahanshahi, 2013; Akram et al., 2017).

Présentement, deux composantes des GB sont principalement visées lors de cette chirurgie :

le GPi et le STN (Steiner & Tseng, 2016; Wichmann & DeLong, 2016). Cependant, la petite

taille du STN fait de cette structure la zone de choix pour l’implantation des électrodes. En

effet, le territoire sensorimoteur étant plus facile à atteindre dans le STN comparativement

au GPi, les effets thérapeutiques de la DBS sont alors plus prononcés. De plus, les patients

qui reçoivent des implantations d’électrodes DBS dans le STN sont en mesure d’arrêter ou

de diminuer progressivement leur médication en L-Dopa, contrairement à ceux qui reçoivent

des implantations dans le GPi (Wichmann & DeLong, 2016).

Il est intéressant de noter qu’une lésion du STN chez un individu normal cause de

l’hémiballisme (mouvements anormaux et involontaires de nature violente et désordonnée)

alors qu’une inhibition fonctionnelle ou lésionnelle de cette même structure chez un patient

souffrant de la MP atténue significativement certains des symptômes moteurs de la maladie

(Steiner & Tseng, 2016). L’hémiballisme serait causé par la perte de l’action inhibitrice

qu’exercent les portes de sortie des ganglions de la base sur le thalamus. Les neurones du

STN étant lésés, ceux-ci ne sont plus en mesure de stimuler efficacement le GPi et de la SNr

et donc d’inhiber les mouvements involontaires. En revanche, les effets bénéfiques de la DBS

au niveau du STN chez les patients parkinsoniens seraient dus, en partie, à une perturbation

électrique du noyau qui lui permettrait de retrouver un état d’activité semblable à la normale

(Wichmann & DeLong, 2016). En ramenant le STN hyperactif à un niveau d’activité normal,

la DBS diminuerait les symptômes associés à la difficulté d’initier un mouvement chez les

13

patients atteints de la MP. De plus, il est observé qu’une désynchronisation de l’activité des

noyaux composant les GB permettrait l’amélioration des symptômes moteurs de la MP

(Wichmann & DeLong, 2016). La voie corticosubthalamique serait-elle aussi impliquée dans

ces effets bénéfiques? Certaines équipes de recherche (Li et al., 2007; Kuriakose et al., 2009;

Devergnas & Wichmann, 2011) s’avancent en disant qu’une dépolarisation antidromique des

axones constituant cette voie neuronale médierait une partie des effets thérapeutiques.

Cependant, des recherches plus poussées sur ce mécanisme d’action sont nécessaires afin de

pouvoir arriver à une meilleure compréhension des mécanismes à la base des effets

thérapeutiques produits par la stimulation à haute fréquence du STN. Le projet de recherche

présenté dans ce mémoire tentera d’éclaircir davantage ce mode d’action en décrivant de

manière approfondie l’organisation morphologique de la voie hyperdirecte chez le macaque.

1.3 Objectifs du projet

1.3.1 État de la question et objectifs poursuivis

Le STN est la principale structure excitatrice des GB. La position cruciale que le STN occupe

dans l’organisation anatomique et fonctionnelle de cet ensemble de structures sous-corticales

impliqué dans le contrôle du comportement moteur nous a été révélée, entre autres, par des

études de traçage unitaire détaillées portant sur les relations de ce noyau avec les autres

structures sous-corticales. En revanche, notre connaissance des projections que le STN reçoit

en provenance du cortex cérébral est très lacunaire. À ce jour, une seule étude de la voie

corticosubthalamique par traçage neuronal unitaire a été réalisée (Kita & Kita, 2012). Ce

travail, effectué chez le rat, rapporte plusieurs caractéristiques morphologiques et

anatomiques intéressantes des neurones corticaux composant le cortex moteur primaire du

rongeur. Celles-ci sont décrites dans le deuxième chapitre de ce mémoire. Malheureusement,

la transposition de ces données aux primates pose problème car il existe de nombreuses

variations neuroanatomiques entre rongeurs et primates. Bien que le modèle anatomique et

fonctionnel des GB s’applique aussi bien aux rongeurs qu’aux primates, certains différences

14

interspécifiques fondamentales seront mises en évidence dans l’article présenté dans la

section 2 de ce mémoire.

Certaines études des afférence corticales au STN ont été effectuées chez le singe avec des

traceurs rétrogrades et antérogrades (Nambu et al., 1996; Nambu et al., 1997), ainsi qu’avec

des virus (Haynes & Haber, 2013). Cependant, ces travaux ne rapportent qu’une vision

globale de ces projections sans offrir une analyse détaillée au niveau neuronal unitaire de

l’organisation de la voie hyperdirecte. Par exemple, on ne sait toujours pas si les neurones

qui forment la voie corticosubthalamique émettent, le long de leur trajet descendant, des

collatérales au striatum. Est-ce une seule et même population de neurones qui innervent à la

fois le striatum et le STN, ou est-ce deux populations distinctes? Est-ce que ces neurones

ciblent le STN de manière controlatérale, ipsilatérale ou un mélange des deux? De plus, nous

n’avons qu’une vague idée des autres structures innervées par les neurones de la voie

hyperdirecte. Existe-t-il plusieurs types morphologiques de neurones projetant au STN? Ces

neurones sont-ils tous dédiés exclusivement au STN ou projettent-ils en plus à d’autres

structures? En outre et tel que décrit plus haut, les mécanismes d’action de la stimulation

cérébrale profonde sont encore peu compris. Serait-il possible que la voie hyperdirecte ait un

rôle à jouer dans le mécanisme thérapeutique de la DBS, par activation orthodromique et

antidromique des fibres de la voie cortisubthalamique? Afin de répondre à ces questions, des

informations concernant la trajectoire et le degré de collatéralisation des axones

glutamatergiques de la voie hyperdirecte chez le primate sont nécessaires, et ce, de manière

neuronale unitaire.

L’objectif principal de mon projet de recherche est donc de mettre en évidence l’organisation

anatomique et fonctionnelle unitaire des neurones formant la voie hyperdirecte. Pour se faire,

j’ai utilisé une technique de marquage et de traçage de neurones unitaires (voir section 1.3.2)

qui permet la reconstruction tridimensionnelle complète de l’arborisation axonale des

neurones situés dans la couche V du cortex moteur primaire chez le primate. Pour la toute

première fois, il sera possible de visualiser l’arborisation entière des neurones formant la voie

corticosubthalamique. Différents types de neurones pourront être identifiés en portant une

attention particulière au degré de collatéralisation de chaque axone. De plus, il sera possible

15

de décrire l’arborisation la voie hyperdirecte en fonction des territoires fonctionnels du STN.

Ceci permettra de mieux comprendre l’implication de cette projection corticofuge dans le

contrôle moteur, limbique et associatif. Finalement, cette étude vise à améliorer la

compréhension globale de l’organisation anatomo-fonctionnelle des GB. Elle s’inscrit donc

dans un programme de recherche d’envergure qui permettra à plusieurs autres équipes de

recherche, dont celles en bioinformatique, neuroanatomie et en neurochirurgie, de faire

avancer les connaissances en ce qui a trait à la physiopathologie de la MP, mais aussi de ses

traitements.

1.3.2 La technique utilisée

Pour effectuer cette étude, l’utilisation d’une technique autrefois révolutionnaire, mais

aujourd’hui encore très fiable, a été choisie. L’injection stéréotaxique d’un traceur

antérograde assure le marquage entier de quelques neurones seulement, des dendrites à

l’axone. Elle permet d’effectuer des reconstructions individuelles et en trois dimensions de

neurones ayant capté le traceur, incluant le traçage détaillé du trajet et de l’arborisation de

leur axone.

Afin d’étudier les neurones de la couche V du cortex moteur primaire de singes macaques,

d’où origine la voie hyperdirecte, l’utilisation d’injections stéréotaxiques par

microiontophorèse a été choisi. Comme traceur neuronal, nous avons utilisé la biotine

dextran amine (BDA), un traceur antérograde qui est capté par le corps cellulaire du neurone

et qui voyage le long de ses dendrites et de son axone. La BDA est d’abord dissoute (2%)

dans une solution d’acétate de potassium (0,5 M). Cette solution est ensuite introduite dans

une micropipette de verre de 2-3 µm de diamètre. De manière intéressante, cette même

micropipette permet l’enregistrement électrophysiologique de neurones rencontrés lors de la

descente. L’enregistrement des patrons de décharge, qui diffèrent d’une population neuronale

à l’autre, assure un meilleur guidage lors de la descente de la micropipette. Comme il s’agit

ici d’injections dans le cortex moteur primaire, dont l’emplacement varie peu d’un animal à

l’autre, nous n’avons pas senti le besoin de procéder à une ventriculographie. Une telle

16

procédure est surtout nécessaire lorsque les injections visent des structures sous-corticale

profondes. Le traceur est injecté à l’aide d’un courant positif de 300-400 nA appliqué pendant

25 minutes, 1 seconde ON et une seconde OFF. Par la suite, on laisse l’animal survivre pour

une période de 8 à 10 jours afin que le traceur puisse migrer jusqu’aux terminaisons axonales.

L’animal est ensuite sacrifié par perfusion transcardiaque dans le but de fixer le cerveau. À

cet effet, on procède d’abord à un lavage avec une solution de NaCl 0,9%, suivie de

paraformaldéhyde à 4% et d’une solution de sucrose 10%. Par la suite, une post-fixation est

faite. Le cerveau est placé dans une solution composée d’un tiers de paraformaldéhyde 4%

et de deux tiers de sucrose 30%, pendant 24h.

Afin d’être en mesure de visualiser le traceur, on doit traiter le cerveau à l’aide d’une méthode

d’immunohistochimie. Celui-ci est d’abord coupé en tranches de 70 µm d’épaisseur à l’aide

d’un microtome à congélation. Les sections sont ensuite incubées dans une solution contenant

le complexe avidin-biotine couplé à la peroxydase (kit ABC) à 4° Celsius pendant une nuit.

Le traceur injecté est révélé à l’aide de peroxyde d’hydrogène 30% et un chromogène, le

3,3’-diaminobenzidine tétrahydrochloride (DAB). Afin de mieux visualiser l’ensemble des

structures cérébrales, les sections sont contre-colorées grâce à une réaction enzymatique

médiée par la cytochrome oxydase.

Le marquage des neurones injectés étant d’une qualité semblable à celle obtenue par

l’imprégnation argentique de la méthode de Golgi, la reconstruction neuronale entière à l’aide

de sections sériées put s’effectuer. L’utilisation d’un microscope optique, d’une caméra

lucida et du logiciel Neurolucida (MicroBright-Field, Colchester, VT) a été nécessaire afin

de compléter l’étude.

De plus, afin de décrire en détail la morphologie et l’incidence synaptique des varicosités

axonales libérant du glutamate dans le STN et dont le corps cellulaire est situé dans le cortex

cérébral, le cerveau d'un singe cynomolgus a été préparé pour la microscopie électronique.

Ce singe a préalablement été sacrifié par perfusion transcardiaque avec 400 ml de PBS, suivi

de 600 ml d'acroléine dilué à 3% dans du PBS, d’une solution de 700 ml de PFA 4% avec

0,2% de glutaraldéhyde et enfin, d’une solution de 600 ml de PFA 4%. Le cerveau a été

17

rapidement extrait puis post-fixé par immersion dans une solution de PFA 4% pendant 1

heure à 4°C. Par la suite, le cerveau a été coupé au vibratome en sections transversales de 50

µm d'épaisseur. Trois sections prises au centre du STN ont été immunomarquées pour le

transporteur vésiculaire du glutamate 1 (VGluT1), un marqueur spécifique des axones

corticofuges (Fujiyama et al., 2006; Raju et al., 2006). En bref, ces sections ont été incubées

à température pièce dans (1) une solution bloquante pendant 1 heure, (2) la même solution

contenant une dilution 1:1000 d'anticorps polyclonaux de cobaye dirigés contre VGluT1

pendant une nuit et (3) une dilution 1:1000 d'anticorps biotinylés anti-cobaye pendant 1 heure

dilués dans la solution de blocage initiale. Les sections ont ensuite été incubées dans une

solution contenant le complexe avidin-biotine couplé à la peroxydase (kit ABC) à 4°C

pendant 1 heure. Le marquage VGluT1 est révélé à l’aide de peroxyde d’hydrogène 0,005%

et de DAB 0,05%. Les coupes ont ensuite été incubées pendant 30 minutes dans une solution

d'OsO4 1%. Elles ont ensuite été déshydratées dans de l'éthanol et de l'oxyde de propylène

pour finalement être mises sur lame avec du Durcupan. Des régions quadrangulaires du STN

dorsolatéral ont été découpées à partir des coupes marquées pour VGluT1. Celles-ci ont

ensuite été coupées en sections ultra-fines (~80 nm) à l’aide d’un ultramicrotome. Après

avoir été collectées sur grilles et colorées au citrate de plomb, les sections ultra-fines ont été

examinées au microscope électronique à transmission équipé d’une caméra digitale intégrée.

Les varicosités axonales positives pour VGluT1 (+) ont été échantillonnées de manière

aléatoire à un grossissement de 11 000x en prenant une photo à chaque fois qu'elles étaient

rencontrées. Les varicosités axonales VGluT1+ ont été analysées en utilisant le logiciel de

traitement IMAGE J pour mesurer leurs axes longs et courts. Elles ont ensuite été classées

comme contenant ou non une mitochondrie et montrant ou non une jonction synaptique.

Toutes les jonctions synaptiques ont également été caractérisées comme symétriques ou

asymétriques, puis la cible synaptique a été identifiée et la longueur des jonctions mesurée.

L'incidence synaptique mesurée à partir de sections ultra-fines a ensuite été extrapolée au

volume total des varicosités axonales au moyen de la formule de Beaudet et Sotelo (Beaudet

& Sotelo, 1981), en utilisant le grand axe comme diamètre, selon Umbriaco et al. (Umbriaco

et al., 1994).

18

Pour obtenir de plus amples informations sur la technique, veuillez référer à la section

« Materials and Methods » de l’article intégré dans ce mémoire.

1.3.3 Présentation du mémoire

La formule adoptée pour la présentation de ce mémoire est celle de l’intégration par article

scientifique. Les résultats de cette étude ont été présentés en novembre 2017 lors de la

quarante-septième édition du congrès de la « Society for Neuroscience » qui se tenait à

Washington, D.C., aux États-Unis. Le manuscrit incorporé a récemment été accepté pour

publication dans la revue Brain Structure and Function, un journal doté d’un comité de

révision par les pairs. Suite à une brève introduction, la méthode y est décrite en détails et les

différents résultats concernant l’arborisation axonale tridimensionnelle des neurones du

cortex moteur primaire formant la voie hyperdirecte sont présentés. Une importante

discussion suit la présentation des résultats afin de situer ces nouvelles observations par

rapport à celles retrouvées précédemment dans la littérature.

19

Résumé de l’article

Des injections stéréotaxiques par microiontophorèse de biotine dextran amine, un traceur

antérograde, ont été effectuées au niveau de la couche V du cortex moteur primaire chez

quatre singes cynomolgus (Macaca fascicularis). Le traçage unitaire détaillé de

l’arborisation axonale de 28 axones composant la voie corticosubthalamique montre que

l’innervation de ces axones est ipsilatérale et que la population neuronale à l’origine de cette

projection est distincte de celle composant la voie corticostriée. Ces axones voyagent

jusqu’aux étages inférieurs du tronc cérébral et émettent, en passant, des collatérales de plus

petit diamètre qui innervent à la fois la zona incerta, le noyau rouge, les noyaux supérieurs

pontiques, le noyau réticulaire du thalamus et le noyau subthalamique. L’arborisation

axonale de la voie hyperdirecte au sein du noyau subthalamique intéresse principalement le

territoire sensorimoteur. Les résultats obtenus démontrent que la voie corticosubthalamique

est majoritairement indirecte : celle-ci provient de collatérales émises par des axones

principaux en route vers les étages inférieurs du tronc cérébral.

20

2. Article

SINGLE-AXON TRACING OF THE

CORTICOSUBTHALAMIC HYPERDIRECT

PATHWAY IN PRIMATES

Dymka Coudé, André Parent and Martin Parent*

Laboratoire de Neurobiologie

Centre de recherche Université Laval CERVO

2601, Chemin de la Canardière, Local F-6500

Beauport, Québec, Canada, G1J 2G3

Abbreviated title: The hyperdirect pathway in monkeys

Key words: basal ganglia, subthalamic nucleus, primary motor cortex,

single-axon reconstruction, corticosubthalamic projections,

monkeys.

*Correspondence to: Martin Parent, Ph.D.

CERVO Brain Research Centre

2601, Canardière, F-6500

Quebec City (Quebec)

Canada, G1J 2G3

Tel: (418) 663-5747 (ext 6736)

Fax: (418) 663-8756

E-mail: martin.parent@fmed.ulaval.ca

Grant sponsor: The study was supported by research grants from the Canadian

Institutes of Health Research (CIHR MOP-153068) and the

Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada

(NSERC 2018-06264 and 2018-522690) to M.P. who also

benefited from of a Junior II career award from the Fonds de

Recherche du Québec - Santé (FRQ-S). D.C. was recipient of

MSc fellowship from FRQ-S. The authors have no conflict of

interest to declare.

21

ABSTRACT

Individual axons that form the hyperdirect pathway in Macaca fascicularis were visualized

following microiontophoretic injections of biotinylated dextran amine in layer V of the

primary motor cortex (M1). Twenty-eight singly-labeled axons were reconstructed in 3D

from serial sections. The M1 innervation of the subthalamic nucleus (STN) arises essentially

from collaterals of long-ranged corticofugal axons en route to lower brainstem regions.

Typically, after leaving M1, these large caliber axons (2-3 µm) enter the internal capsule and

travel between caudate nucleus and putamen without providing any collateral to the striatum.

More ventrally, they emit a thin collateral (0.5-1.5 µm) that runs lateromedially within the

dorsal region of the STN, providing boutons en passant in the sensorimotor territory of the

nucleus. In some cases, the medial tip of the collateral enters the lenticular fasciculus dorsally

and yields a few beaded axonal branches in the zona incerta. In other cases, the collateral

runs caudally and innervates the ventrolateral region of the red nucleus where large axon

varicosities (up to 1.7 µm in diameter) are observed, many displaying perisomatic

arrangements. Our ultrastructural analysis reveals a high synaptic incidence (141%) of

cortical VGluT1-immunoreactive axon varicosities on distal dendrites of STN neurons, and

on various afferent axons. Our single-axon reconstructions demonstrate that the so-called

hyperdirect pathway derives essentially from collaterals of long-ranged corticofugal axons

that are rarely exclusively devoted to the STN, as they also innervate the red nucleus and/or

the zona incerta.

22

INTRODUCTION

The subthalamic nucleus (STN) occupies a pivotal position in the functional organization of

the basal ganglia (BG). Being the only glutamatergic component of the BG, the STN is often

viewed as a major driving force of this set of subcortical structures (Parent & Hazrati, 1995b;

Mink, 1996; DeLong & Wichmann, 2007; Gerfen & Bolam, 2017). Our previous single-axon

tracing studies in primates have revealed that STN neurons are endowed with a highly

collateralized axon, which allows them to exert a direct excitatory influence on the two major

output structures of the BG, namely, the internal pallidum and the substantia nigra pars

reticulata, as well as on the external pallidum and the striatum (Sato et al., 2000). Besides

these multiple efferent projections, the STN receives afferents from different brain regions

(Parent & Hazrati, 1995b) and is often considered an important input station of the BG, as it

acts in parallel with the striatum, the main entry structure, to directly collect and integrate

cortical information (Nambu et al., 1996; Nambu et al., 2002). Although significant

glutamatergic projections arising from the caudal intralaminar thalamic nuclei exist (Sadikot

et al., 1992), the STN receives most of its glutamate-mediated excitatory input from neurons

located in layer V of the primary motor cortex (M1) and the supplementary motor area

(Hartmann-von Monakow et al., 1978; Rouzaire-Dubois & Scarnati, 1985; Canteras et al.,

1990; Nambu et al., 1996), as well as from other prefrontal cortical regions (Haynes & Haber,

2013). This projection system, which has been called the hyperdirect pathway (Nambu et al.,

1996), allows cortical information to be directly relayed to the STN, without being processed

by striatal neurons (Steiner & Tseng, 2016). Because it bypasses the striatum, the hyperdirect

pathway is seen as a route whereby cortical information can influence the BG output

structures (the internal pallidum and the substantia nigra pars reticulata) with shorter latencies

than through the so-called direct and indirect striatofugal pathways.

The abnormal activity of STN neurons in Parkinson's disease (PD) is believed to be

associated with motor symptoms that characterize this neurodegenerative disorder, including

rigidity, bradykinesia, resting tremors and postural instability (Galvan & Wichmann, 2008;

Kita & Kita, 2011). For this reason, the STN has become a target of choice for chronic deep

brain stimulation (DBS), a neurosurgical approach used to alleviate PD motor symptoms

23

(Wichmann et al., 2017). Moreover, antidromic activation of the motor cortex through the

hyperdirect pathway following DBS of the STN is thought to play a key role in the mediation

of DBS therapeutic effects in PD patients (Wichmann & DeLong, 2016; Anderson et al.,

2018). Therefore, in the hope to reach a better understanding of the anatomical and functional

organization of the primate BG, while obtaining new insights into the cellular mechanisms

of DBS, we undertook, for the very first time, a detailed single-axon tracing study of the

corticosubthalamic hyperdirect pathway in cynomolgus monkeys. Our main findings indicate

that the hyperdirect pathway derives essentially from collaterals of long-ranged corticofugal

axons, en route to lower brainstem regions.

MATERIALS AND METHODS

Injection procedures

A total of five adult cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) of both sexes, with a body

weight that ranged from 3-4 kg, were used in the present study. All experimental procedures

were approved by the Comité de Protection des Animaux de l’Université Laval, in accordance

with the Canadian Council on Animal Care’s Guide to the Care and Use of Experimental

Animals (Ed2). Maximum efforts were made to minimize the number of animals used. The

animals were first anesthetized with ketamine (75 mg/kg) plus xylazine (5 mg/kg) and their

head placed in a specifically designed stereotaxic apparatus. They were then maintained

under propofol (10 mg/ml, i.v.) anesthesia, while microiontophoretic injections of biotin

dextran amine (BDA 10 000 MW, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Catalog no.

D1956) were being made bilaterally in the forelimb area of the primary motor cortex (M1),

as identified on physiological maps previously established (Woolsey, 1958; Kwan et al.,

1978; Stepniewska et al., 1993). Because corticosubthalamic projections were found to

originate mainly from layer V in primates (Nambu et al., 1996), BDA injections were

centered upon this cortical layer. In some cases, neurons located in supragranular layers were

also labeled. However, these neurons were very few in number, their staining was weak, and

their axon could not be traced outside the cerebral cortex. They most likely represent neurons

24

whose neuronal processes (axons or dendrites) have transported a small amount of tracer

from the periphery of the main injection loci.

Four injections were made in each animal, two on each side of the brain. We used the

stereotaxic coordinates of the atlas of Szabo and Cowan (Szabo & Cowan, 1984) and

microiontophoretic labeling was carried out with glass micropipettes (tip diameter 2-3 µm)

filled with a solution of potassium acetate (0.5M) plus 2% BDA. These electrodes had

impedance ranging between 10-15 MΩ and were used to monitor the extracellular activity of

the neuronal populations encountered during the penetration of the micropipette. Layer V of

M1 was easily recognizable by the characteristic bursting firing pattern of its neurons under

propofol anesthesia (Fig. 1C). Once in the chosen target, the micropipette was connected to

a high compliance iontophoresis device (NeuroData) and the tracer was injected by passing

positive current pulses of 350 nA (1s on/ 1s off) for 25 min.

Tracer visualization and cytochrome oxidase staining

After a survival period of 8-10 days, the animals were deeply anesthetized with sodium

pentobarbital and perfused transcardially with 1 liter of saline solution (0.9%) followed by 2

liters of a fixative solution containing 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffer (PB,

0.1M, pH 7.4) and 1 liter of 10% sucrose solution in PB. The brains were dissected out and

placed in a cryoprotective solution composed of 1/3 PFA (4% solution in PB) and 2/3 sucrose

(30% solution in PB) for 24h at 4°C. Sagittal (1 monkey) or frontal (3 monkeys) frozen

sections of 70 µm were obtained from a sliding microtome. The sections were collected

serially in phosphate buffer saline (PBS, 0.1M, pH 7.4) and processed for the visualization

of BDA according to the avidine-biotin-peroxydase method (ABC Elite kit, Vector Labs,

Burlingame, CA) with 3,3’diaminobenzidine (DAB; Sigma, St. Louis, MO) as the

chromogen. In brief, the sections were incubated overnight at 4°C in a solution containing

ABC diluted 1:100 in 0.1M PBS, pH 7.4, plus 1% normal rabbit serum and 1% triton X-100.

They were then rinsed twice in PBS and once in Tris buffer. The bound peroxidase was

revealed by incubating the sections in a solution containing 0.05% DAB, 0.3% nickel-

ammonium sulfate, and 0.005% H2O2 in 0.05M Tris buffer (pH 7.6) for 8-10 minutes at room

25

temperature. The reaction was terminated by a rinse in Tris buffer followed by two rinses in

PBS.

To help identify cortical layers, nuclei and structures that harbored labeled neurons and

axons, sections were counterstained for cytochrome oxidase, according to the histochemical

protocol of Wong-Riley (Wong-Riley, 1979). The counterstaining was performed before

BDA revelation, and nickel-cobalt-intensified DAB (dark blue reaction) and unintensified

DAB (diffuse brown precipitate) were used to reveal BDA and cytochrome oxidase,

respectively.

Material analysis and neuronal reconstructions

All sections were mounted on gelatin-coated slides, dehydrated in graded alcohols, cleared

in toluene, and coverslipped with Permount. Labeled axons were reconstructed in three

dimensions by using a light microscope equipped with a motorized stage and an image

analysis software (Neurolucida, MicroBrightField, Colchester, VT). Entire and individual

axonal reconstructions were obtained from serial sagittal or transverse sections, each

containing at least one axonal segment. By going from one section to another, we were able

to follow and reconstruct individually injected axons. The terminal fields of labeled neurons

were mapped at lower magnifications to determine their topographic localization according

to the atlas of Szabo and Cowan (Szabo & Cowan, 1984). The photomicrographs were

digitally captured (camera model DC 300, Leica, Wetzlar, Germany) and processed with the

Adobe Photoshop software (version CS6, Adobe, San Jose, CA). The terminal arborization

of each axon at the STN level was carefully examined. A neuron was considered projecting

toward lower brainstem regions when its labeled axon could be traced into the cerebral

peduncle, ventral and caudal to the substantia nigra. Each axonal varicosity encountered

along the various branches of individual axons was precisely charted and the total number of

such varicosities was determined to estimate the strength of the synaptic input provided by a

single corticofugal axon.

26

Preparation of samples for electron microscopy

The brain of one cynomolgus monkey was prepared for electron microscopy. This monkey

was transcardially perfused with 400 mL of ice-cold PBS (50 mM; pH 7.4) followed by 600

mL of 3.0% acrolein in PBS and by 700 mL of cold 4% PFA with 0.2% glutaraldehyde and

finally by 600 mL of cold 4% PFA. The brain was rapidly dissected out, post-fixed by

immersion in PFA for 1h at 4°C and cut with a vibratome (model VT1200 S, Leica) into 50

µm-thick transverse sections collected in PBS. Three 50 µm-thick transverse sections were

taken through the STN, at 12.1 mm relative to the interaural plane (Szabo & Cowan, 1984),

and immunostained for the vesicular glutamate transporter 1 (VGluT1), a faithful marker of

corticofugal axons (Fujiyama et al., 2006; Raju et al., 2006). Briefly, these free-floating

sections were sequentially incubated at room temperature in: (1) a blocking solution of PBS,

containing 2% normal goat serum and 0.5% gelatine (1h); (2) the same solution containing a

1:1000 dilution of guinea pig polyclonal antibody against VGluT1 (overnight, Catalog no.

AB5905; EMD Millipore Corporation) and (3) a 1:1000 dilution of biotinylated goat anti-

guinea pig antibody (1h, Vector Labs) diluted in the same solution. After rinses in PBS,

sections were incubated for 1h at 4°C in ABC diluted 1:100 in blocking solution. They were

then rinsed in PBS and Tris-saline buffer (TBS; 50 mM; pH 7.4), and the bound peroxidase

was revealed by incubating the sections for 3 min, at room temperature, in a 0.05% solution

of DAB diluted in Tris, to which 0.005% H2O2 was added. The reaction was stopped by

several washes in TBS followed by PB. Sections were then incubated for 30 min in a 1%

solution of OsO4 diluted in PB, followed by several rinses in PB. They were then dehydrated

in graded ethanol and in propylene oxide and flat-embedded in Durcupan (Fluka, Buchs,

Switzerland). Quadrangular pieces of the dorsolateral STN were cut from the flat-embedded

VGluT1-immunostained sections and glued on the tip of a resin block and cut ultrathin (~80

nm) with an ultramicrotome (model EM UC7, Leica). After being collected on bare 150-

mesh copper grids and stained with lead citrate, the ultrathin sections were examined by using

a transmission electron microscope (Tecnai 12; Philips Electronic, Amsterdam, Netherlands),

at 100 kV, and an integrated digital camera (MegaView II; Olympus, Müster, Germany). The

VGluT1-positive (+) axon varicosities were randomly sampled at a working magnification

of 11,000x by taking a picture every time one was encountered. VGluT1+ axon varicosities

were analyzed, using the public domain IMAGE J processing software from NIH (v.1.45),

27

for the long and short axis and cross-sectional area. They were then categorized as containing

or not a mitochondrion, and as showing or not a synaptic junctional complex, i.e. a localized

straightening of apposed plasma membranes associated with a slight widening of the

intercellular space and a thickening of the pre- and/or postsynaptic membrane. All synaptic

junctions were also characterized as symmetrical or asymmetrical, the synaptic target

identified, and the length of junctional complexes measured. The synaptic incidence

observed in single section was then extrapolated to the whole volume of varicosities by

means of the formula of Beaudet and Sotelo (Hardman et al., 2002), using the long axis as

diameter, according to Umbriaco et al. (Umbriaco et al., 1994).

RESULTS

General labeling features

As defined anatomically using physiological maps of monkey cerebral cortex, the M1 area

targeted in this study corresponds mainly to the forelimb area (Woolsey, 1958; Kwan et al.,

1978; Stepniewska et al., 1993). The injection sites were centered upon the cortical layer V

since previous electrophysiological as well as anterograde and retrograde cell labeling studies

indicate that corticosubthalamic projections in rats and primates arise mainly from cortical

neurons located in this layer (Rouzaire-Dubois & Scarnati, 1985; Canteras et al., 1990;

Nambu et al., 1996). Under propofol anesthesia, cortical neurons in layer V of M1 display

characteristic bursting firing patterns (Fig. 1C) that facilitate their identification. Almost all

injection loci have a dense core composed of BDA precipitate (Fig. 1A) surrounded by

several neurons labeled in a Golgi-like manner (Fig. 1B). Neurons labeled in M1 layer V

have a triangular cell body ranging between 15 and 30 µm in diameter. Usually, 2 to 5

horizontal basal dendrites arborizing as far as 400 to 700 µm away from the cell body were

seen, as well as a single apical dendrite (Fig. 1B, C). The remarkable length of these dendrites

explains why labeled neurons were occasionally found at some distance from the core of the

injection site. Intensely labeled axons could be seen to emerge either from the core of the

injection sites or from individually labeled neurons located peripherally. In the latter case,

28

the axons emerge from the basis of the cell body and then invade the subcortical white matter

where they initiate their downward course.

Only axons of M1 cortical neurons projecting to the STN were traced in the present study

since reconstructions were initiated in the STN itself. Twenty-eight corticosubthalamic axons

were traced. Unfortunately, because of the dense core of BDA precipitate surrounding the

injection sites, none of these reconstructed axons could be directly connected to their parent

cell body. However, a detailed analysis of the material was made to ensure that they were

emerging from the core of the injection loci. All brain regions that are known to project to

M1, including the thalamus, were carefully examined for the presence of potentially

confounding retrogradely-labeled neurons, but no such retrogradely-labeled neurons were

observed. The single-axon reconstruction approach used here is a very powerful technique

that yields a detailed view of single-neuron axonal arborization (Parent et al., 2001; Parent

& Parent, 2005; Parent & Parent, 2006; Gagnon & Parent, 2014; Parent & Parent, 2016). The

fact that each charted axonal segment and axonal collateral belongs to the same axonal unit

was ensured by carefully examining all serial brain sections in which these axonal segments

were encountered. However, because of the considerable length of these corticofugal axons,

the most distal portions of certain axonal branches, particularly those that reached the lower

brainstem regions, became too faintly labeled to be accurately traced, although they were

clearly in continuity with the rest of the axonal branching. In such cases, the distal ends of

axonal branches were labeled with an arrow in figures. This applies principally to the long-

ranged axonal branches, en route to the lower brainstem regions and/or spinal cord that were

lost in the cerebral peduncle, ventral and posterior to the substantia nigra.

Initial axonal trajectory

Based on their target sites and axonal branching patterns, different types of

corticosubthalamic projection axons arising from M1 forelimb area were identified (Table

1). Apart from the STN in which the tracing was initiated, brain regions that are targeted by

reconstructed axons of the hyperdirect pathway are the lower brainstem (25/28 neurons), the

zona incerta (ZI, 15/28 neurons), the red nucleus (6/28 neurons), the reticular thalamic

nucleus (2/28 neurons) and the superior pontine nucleus (1/28 neurons). Despite such

29

widespread axonal branching patterns, all M1 reconstructed axons forming the hyperdirect

pathway follow a similar initial trajectory. Primary axons endowed with a large diameter (2

– 3 µm) emerge from the core of the injection site to invade the subcortical white matter and

initiate a sinuous downward course. The vast majority of reconstructed corticosubthalamic

axons (25/28) have their major axonal branch projecting toward lower brainstem regions.

This principal axonal segment travels in the internal capsule, between the caudate nucleus

and the putamen (Fig. 2B). Interestingly, one axon was seen passing through the caudate

nucleus, but without leaving any boutons en passant in this striatal region (Fig. 2A). The

main axonal branch then reaches the cerebral peduncle, ventral and posterior to the substantia

nigra. Of all reconstructed corticosubthalamic axons, none were seen to emit collateral

innervating the striatum, indicating that the hyperdirect pathway comes from a distinct

cortical neuronal population than the one at the origin of the corticostriatal projections. Most

of the major axonal branches traced (23/25) exhibit large and beaded axon varicosities as

they course in the internal capsule, with an average of 37 axon varicosities per axon. No axon

collaterals were seen to cross the midline.

Subthalamic nucleus

Our results indicate that the hyperdirect pathway is largely composed of axons that are not

solely dedicated to the STN. Indeed, only one axon was seen to innervate exclusively the

STN. In the internal capsule, axon of this neuron was thinner (~ 1 µm) than that of the other

long-ranged axons and its small diameter remains constant throughout its course. It then

enters the dorsolateral tip of the STN, where it branches into 3 varicose axon collaterals that

arborize in the dorsolateral region of the nucleus. The STN innervation provided by all other

reconstructed axons derives essentially from 1 or 2 thin axon collaterals that depart at right

angle from the main and larger axonal branch that runs downward in the cerebral peduncle.

These thinner axon collaterals have a diameter ranging from 0.5 to 1.5 µm and depart from

the main axon at the level the dorsolateral tip of the STN to invade this BG component. These

branches usually run lateromedially within the dorsal region of the STN, providing boutons

en passant (see photomicrographs in Fig. 2B and Fig 5B). Occasionally, the lateromedially

coursing collateral(s) breaks out into even thinner and varicose branches that plunge ventrally

within dorsolateral region of the STN. An example of such neuron is provided in figure 2A.

30

Its main axon travels in the internal capsule, where it yields 16 large and beaded axon

varicosities in this myelinated fiber bundle. Once it reaches the height of the dorsolateral tip

of the STN, the main axon emits a thinner and perpendicular oriented branch that enters the

STN. In the STN, this smaller collateral breaks out into numerous thinner and varicose axonal

segments that remain confined to the dorsolateral region of the nucleus. A total number of

299 axon varicosities were counted in the STN, representing the strongest STN innervation

provided by a single corticofugal axon in our study.

In most cases, the thin axon collaterals that enter the STN and provide boutons en passant

there exit the nucleus to reach other brain structures. As seen in figure 2B, after coursing a

short distance and leaving boutons en passant in the STN, the collateral emits a thin and

varicose axonal branch that plunges ventrally in the STN, leaving 80 varicosities in the

sensorimotor part of the nucleus. The axon collateral then continues its course medially to

enter the ZI, probably on its way to the red nucleus. As it is the case for most reconstructed

neurons, the main and thicker axonal branch located in the internal capsule reaches the

cerebral peduncle to continue its course further caudally in the brainstem. Unfortunately, in

the cerebral peduncle, most thick axons were lost as they fainted, ventral and caudal to the

substantia nigra.

Zona incerta

Six reconstructed neurons out of 28 send an axon collateral that runs within the ZI, where it

provides rounded axon varicosities of different sizes (see photomicrograph in Fig. 3A). In

the ZI, the number of axon varicosities per neuron ranged from 8 to 87. Except for one axon

that innervate only the STN and the ZI, all axons that project to ZI derive from a thin

collateral emitted from the main axonal branch that heads toward lower brainstem regions.

Typically, most of these ZI projecting axon collaterals travel first through the STN before

continuing their dorsomedial trajectory toward the ZI. Figure 3A provides an example of

such an axon. After coursing in the internal capsule, the main axon emits a thin collateral that

enters the STN from its dorsolateral aspect. This collateral runs dorsomedially within the

nucleus, where it breaks out into small and varicose axonal branches, leaving a total of 154

31

axon varicosities in the STN. One of the small axon collaterals ascends within the lenticular

fasciculus (Forel’s field H2) and provides shorter, thin and highly varicose axonal branches

endowed with a total number of 71 axon varicosities located in the ventral aspect of the ZI.

The main axon collateral continues its course toward the red nucleus.

Only one axon was seen to innervate the ZI without sending its main axonal branch toward

lower brainstem regions (Fig. 3B). The diameter of this unique axon, as measured in the

internal capsule, was smaller than that of axons running downward in the cerebral peduncle.

The main axon splits itself into two major axonal branches just before entering the

dorsolateral aspect of the STN. One of these two branches penetrates the sensorimotor

territory of the STN, where it leaves 9 boutons en passant. It then exits the STN through its

dorsal surface to enter the lenticular fasciculus and divide into two thin and perpendicularly

oriented axon collaterals that arborize in the ZI. The second branch travels along the dorsal

surface of the STN and reaches the ZI, where it breaks out into many short varicose

collaterals. A total of 64 axon varicosities belonging to this neuron were counted in the ZI.

Axon collaterals of this neuron that run in the ZI end their course either in the ZI or in the

prerubral field (Forel’s field H), dorsal to the substantia nigra.

Red nucleus

Six reconstructed axons out of 28 were seen to innervate the red nucleus. Of these axons,

only one had a main axonal branch that did not pursue its course further down in the cerebral

peduncle. The innervation of the red nucleus provided by fibers of the hyperdirect pathway

derives essentially from thin and varicose collaterals that are emitted by axons that have

traveled through the ZI and/or the STN. Interestingly, in the red nucleus, these axons often

form typical perisomatic arrangements composed of large axon varicosities (up to 1.7 µm in

diameter), contrasting heavily with the thin diameter of axons that bear them (see

photomicrograph in Fig. 5A). In the red nucleus, the number of axon varicosities per neuron

ranged between 4 and 185.

32

An example of a corticosubthalamic axon that innervates the red nucleus is provided in figure

4A. In this case, the large main axonal branch yields three thinner axon collaterals at right

angle as it courses within the internal capsule. The first collateral enters the reticular thalamic

nucleus where it provides only 2 axon varicosities. The second one penetrates through the

lateral aspect of the ZI, travels within this area for a long distance, but yields only 12 axon

varicosities en passant in this structure. The third axon collateral enters the STN through its

dorsal aspect and emits a thin branch that plunge ventrally to provide 37 axon varicosities in

the nucleus. The latter axonal branch sweeps ventrally to reach the red nucleus where it

breaks out into a multitude of thin and varicose branches, providing 56 axon varicosities in

the parvicellular region of this nucleus.

Another example of a reconstructed neuron innervating the red nucleus is illustrated in figure

4B. Again, two thin axon collaterals are yielded by a thicker axonal branch that descend

within the internal capsule, en route to lower brainstem regions. The first collateral emerges

at the mid-thalamic level and continues its downward course to reach the dorsolateral edge

of the STN. At this level, it splits into 2 branches that further divide to arborize extensively

in the sensorimotor area of the STN and in the ZI, providing 219 and 30 axon varicosities in

each respective locus. Five of these axonal branches traveling in the STN continue their

ventromedial course to reach the red nucleus. The second major axon collateral is emitted by

the main axon running in the internal capsule, at the STN level. Once in the STN, it yields

thin and varicose branches that arborize in the sensorimotor territory of the nucleus before

heading toward the red nucleus, where it breaks out into a multitude of thin and varicose

branches occupying principally its lateral region with 172 axon varicosities.

Reticular thalamic nucleus and superior pontine nucleus

Two main axons were seen to emit 1 or 2 thin collaterals within the internal capsule, at the

level of thalamus, that enter the thalamic reticular nucleus to provide only few axon

varicosities at this level (Fig 4A, Fig. 5A). In addition to the reticular thalamic nucleus, these

two reconstructed axons also project to the STN, the ZI and the red nucleus. One example is

provided in figure 5A. After traveling in the internal capsule, where it leaves an impressive

33

number of 75 beaded axon varicosities, the main axon emits two thin and varicose collaterals

that provide 53 axon varicosities within the reticular thalamic nucleus. The main axon

continues its course and yields a thin varicose collateral in the lenticular fasciculus that

plunges ventrally to arborize in the dorsal region of the STN. A thicker collateral leaves the

main axon in the lenticular fasciculus, yields some boutons en passant in the dorsal region

of the STN, and arborizes principally in the lateral region of the red nucleus, where it displays

large axon varicosities forming perisomatic arrangements (Fig. 5A). The large axon

varicosities forming these perisomatic arrangements in the red nucleus amount to 185, in

contrast to only 8 smaller varicosities in the ZI and 25 in the STN.

Besides their typical innervation of the STN and ZI, one reconstructed axon of the hyperdirect

pathway arborizes as far down as the superior pontine nucleus (Fig. 5B), in addition to the

STN, the ZI and lower brainstem regions. After traveling for a long distance in the internal

capsule, the main axon yields two major collaterals at the dorsolateral tip of the STN. The

more dorsal collateral enters the sensorimotor territory of the STN, where it leaves boutons

en passant, before continuing its route medially toward the ventral aspect of the ZI. The other

major collateral remains in the STN, where it also yields boutons en passant. A number of

87 axon varicosities were detected in the ZI and 59 in the STN. The main large caliber axon

continues its route toward lower brainstem regions by passing through the substantia nigra

pars reticulata, without providing any axon varicosities within this BG component. After

exiting the substantia nigra pars reticulata, the main axon reaches the superior pontine

nucleus, where it branches into some extremely thin and varicose axonal collaterals that

display a total of 53 axon varicosities.

Ultrastructural features of VGluT1+ axon varicosities in the primate

subthalamic nucleus

We found that the VGluT1+ axon varicosities, presumably of cortical origin (Raju et al.,

2008; Mathai et al., 2015), that occur in the dorsolateral region of the STN in cynomolgus

monkeys derive essentially from unmyelinated axons, are generally small and ovoid, contain

aggregated small and clear vesicles and frequently harbor one or more mitochondria. Their

34

axoplasm is filled with DAB immunoprecipitate of variable density, which typically lines the

plasma membrane and the outer surface of organelles (Fig. 6). The VGluT1+ axon

varicosities present in the STN have a mean diameter of 1.02 0.06 µm (Table 2) and the

synaptic incidence of these immunolabeled axon varicosities, as measured from single-thin

sections, is 35%. When extrapolated to the whole volume of varicosities with the

stereological formula of Hardman et al. (2002), the synaptic incidence amount to 141%,

indicating that many VGluT1+ axon varicosities observed in the dorsolateral STN region

establish more than one synaptic contact (Fig. 6A). The VGluT1+ axon varicosities that

display genuine synaptic contacts are mostly found on small dendritic profiles of STN

neurons (81%), but some also occur on unlabeled axons (19%). They form synaptic junctions

that are mostly of the asymmetric type (81%). No synaptic contacts on cell bodies were

observed.

DISCUSSION

The present study provides the first detailed description of the trajectory of individually

labeled corticosubthalamic axons in monkeys. We show that the so-called hyperdirect

pathway derives mainly from collaterals of long-ranged corticofugal axons en route to lower

brainstem regions or spinal cord. Furthermore, these collaterals are rarely exclusively

devoted to the STN, as they also innervate the red nucleus and/or the zona incerta (ZI). Our

findings highlight differences between primates and rodents in regard to the morphological

organization of the corticosubthalamic projection system. The functional significance of our

results, notably in relation with deep brain stimulation (DBS) therapy used to treat PD

patients, will be discussed.

M1 axons arborize exclusively in the sensorimotor territory of the primate

STN

Neurons located in the dorsolateral region of the STN are known to process principally

information of the sensorimotor type, whereas neurons lying ventromedially and others

confined to the medial tip of the nucleus are respectively concerned with association and

35

limbic types of information (Parent & Hazrati, 1995b; Awad et al., 2000; Conn et al., 2005).

On such basis, the primate STN can be subdivided into a large dorsolateral sensorimotor

territory, a smaller ventromedial associative territory and an even smaller medial limbic

territory. Our data indicate that the terminal arborizations of M1 axons are restricted to the

dorsolateral region of the STN, corresponding to its sensorimotor functional territory. This

observation is in agreement with previous studies showing that M1 neurons project to the

dorsolateral sector of the STN in primates (Nambu et al., 1997; Haynes & Haber, 2013),

where there is a somatotopic organization with a clear representation of the leg, arm and face

cortical regions (Hartmann-von Monakow et al., 1978; Nambu et al., 1996; Iwamuro et al.,

2017). Our data indicate that M1 cortical neurons of the forelimb area display a preferential

innervation of the mid dorsolateral sector of the STN, corresponding to the “arm” region of

the nucleus, as defined previously in Macaca fuscata (Nambu et al., 1996). Overall, the M1

projections to STN in primates respect the functional subdivisions of the nucleus that were

previously disclosed from studies of its efferent projections. The dorsolateral sector of the

STN has been shown to be more specifically involved in the control of squeletomotor

behavior (Raju et al., 2008; Johnson et al., 2009), whereas the ventromedial sector appears

more concerned with oculomotor and associative aspects of motor behavior (Romansky et

al., 1979; Bevan et al., 1995; Götz et al., 1997; Jin & Smith, 2011). In rats, single-axon

tracing experiments indicate that the terminal arborization of M1 corticosubthalamic axons

is also largely restricted to the sensorimotor territory of the STN, with some axons leaving

varicosities in the two other functional territories (Kita & Kita, 2012). The dendritic field of

a single STN neuron in rats may cover the whole nucleus, whereas there is room for five non-

overlapping neurons in macaque monkeys (Canteras et al., 1990; Smith et al., 2001). Such a

ratio between the size of the STN and that of the dendritic domain of its neurons, combined

with the different extent of M1 axonal arborization in the STN evokes the possibility of a

more specific and ordered spatial organization in the STN of the monkey compared with rats.

Therefore, we can hypothesize that the primate STN is able to process in parallel cortical

information of different types and convey them to the BG along separate channels, in line

with the need for the elaboration and execution of more sophisticated motor programs in

primates.

36

The hyperdirect pathway in primates is mainly ipsilateral

In contrast to the corticostriatal projection in monkeys (Parent & Parent, 2006), no axon

collaterals were seen to cross the midline in the present study indicating that the hyperdirect

pathway in monkey is mostly ipsilateral. This observation is in accordance with previous

studies conducted in macaque (Hartmann-von Monakow et al., 1978), squirrel monkeys

(Rouzaire-Dubois & Scarnati, 1985) and cats (Romansky et al., 1979). In rats, retrograde

(Canteras et al., 1990; Manson et al., 2012) and anterograde (Kita & Kita, 2012) tracing

studies, as well as electrophysiological studies (Fujiyama et al., 2006), also indicate that the

hyperdirect pathway is mainly ipsilateral.

The hyperdirect pathway in primates is not solely devoted to the STN

Our data reveal that single M1 cortical neurons innervate the STN chiefly through thin axonal

branches of a thicker long-ranged axon heading toward lower brainstem regions. These thin

collaterals provide some boutons en passant in the dorsolateral sector of the STN and many

of them leave the nucleus to innervate the ZI or the red nucleus. By counting the number of

axon varicosities, we were able to assess the input strength of a single M1 axon into its

different target sites. For most of our reconstructed axons, the STN is the most densely

innervated structure with a number of axon varicosities per neuron ranging between 3 and

299, compared to 1 and 94 in the rat STN (Kita & Kita, 2012). The second most densely

innervated structure is the red nucleus, with a number of axon varicosities ranging between

4 and 185, followed by the ZI with 8 to 87 axon varicosities per reconstructed axon.

The fact that most reconstructed axons of the hyperdirect pathway in monkeys derive from

thin axon collaterals emitted by a thicker axon running downward in the cerebral peduncle

suggests that STN neurons receive efferent copies of motor commands heading to lower

brainstem regions and/or spinal cord motoneurons. Although the present study provides the

first evidence of such morphological organization in primates, data previously gathered in

cats indicate that the STN innervation could indeed originate from axons of the corticospinal

tract (Giuffrida et al., 1985; Lévesque & Parent, 2005b). Whether non-motor projections to

the primate STN also originate from axon collaterals of long-ranged corticofugal axons is

37

currently unknown. In rats, a single-axon tracing study also reported that virtually all motor

cortex axons innervating the STN derive from large caliber pyramidal tract axons (Kita &

Kita, 2012).

Many axons coursing in the STN continue their course to enter the ZI where they display

many boutons en passant, mainly restricted to its ventral part. This region of the ZI is known

to project to many brain structures, including thalamus, substantia nigra, pontine nuclei and

spinal cord (Mitrofanis, 2005). By modulating the main BG output nucleus, but also by

projecting to the thalamus and spinal cord, ZI neurons can directly influence posture and

locomotion (Mitrofanis, 2005). Corticosubthalamic neurons projecting to the ventral sector

of the ZI would therefore be ideally positioned to directly influence these aspects of motor

behavior. Six out of 28 reconstructed axons arising from the M1 forelimb area and projecting

to the STN send a collateral that innervates the lateral region of the red nucleus. By

modulating the rubrospinal tract, the corticosubthalamic axons could have a direct impact on

gait and posture (Hicks & Onodera, 2012; Lemon, 2016). Although the innervation of the

reticular thalamic nucleus by cortical neurons is known to be morphologically and

functionally important (Pinault, 2004; Miller, 2017), our study reveals that this innervation,

as provided by single cortical neurons that also innervate the STN, is rather rare (2/28 axons)

and sparse (2-53 axon varicosities per neuron).

The corticosubthalamic and corticostriatal projections are two distinct

entities in primates

Our single-axon tracing study show that the corticostriatal and corticosubthalamic

projections in primates arise from two distinct neuronal populations in M1. Of all

reconstructed corticosubthalamic axons, none were seen to emit axon collateral that innervate

the striatum indicating that the cortical motor information that reaches the striatum and the

STN is conveyed through two distinct and independent channels. This observation is in

accordance with a previous single-axon tracing study of the primate corticostriatal

projections, in which no collateral innervating the STN was observed (Parent & Parent,

2006). Therefore, the hyperdirect pathway, as previously suspected, represents a route

whereby cortical information can bypass the striatum to reach the BG output structures with

38

shorter latencies than through the so-called direct and indirect striatofugal pathways. A

similar morphological organization has been suggested in cats (Giuffrida et al., 1985;

Lévesque & Parent, 2005b) and rats (Kitai & Deniau, 1981) but a double retrograde labeling

study reported the existence of a subset of cortical neurons projecting to both the striatum

and the STN in rats (Feger et al., 1994). However, these collateralized axons appear to arise

chiefly from prefrontal or anterior cingulate cortices and more rarely from M1 cortex (Feger

et al., 1994). In a more recent single-axon tracing studies also conducted in rats, half of the

reconstructed axons arising from the motor cortex were found to innervate the STN and the

striatum (Kita & Kita, 2012). Altogether, these results indicate that a subpopulation of

corticosubthalamic neurons projecting also to the striatum exists in rats but not in monkeys,

pointing to significant variations between rodents and primates in regard to the organization

of the hyperdirect pathway.

The hyperdirect pathway in primates modulates STN neurons through

presynaptic and postsynaptic contacts

The vesicular glutamate transporter 1 (VGluT1) is known to be a reliable marker for

visualizing, at the electron microscopic level, cortical projections to different brain regions

(Fujiyama et al., 2006; Raju et al., 2006; Villalba & Smith, 2011), including the STN (Mathai

et al., 2015). We thus used this imprint to determine the ultrastructural features of varicosities

displayed by axons of the hyperdirect pathway. We found that corticosubthalamic axons form

many synaptic contacts, mostly of the asymmetric type. About 80% of the total number of

synapses occurred on dendrites of STN neurons, most of them on small size dendritic

branches or dendritic appendages, as previously described in rats (Bevan et al., 1995) and

cats (Romansky et al., 1979). Interestingly, about 20% of synaptic contacts formed by

VGluT1+ axon varicosities occurred on unlabeled axons. Although the STN innervation

provided by a single M1 neurons may at first appear sparse at the light microscope level,

since it often derives from boutons en passant bare by only few thin axonal branches, the

high synaptic incidence (141%) observed in the present study suggest that this cortical input

could mediate a powerful excitatory effect upon STN neurons. Our ultrastructural findings

also indicate that the hyperdirect pathway is able to modulate the activity of STN neurons

through presynaptic excitation of some of their major inputs, including the GABAergic axons

39

arising from the external pallidum. Glutamatergic receptors such as NMDA, AMPA,

mGluR1 and mGluR5 are known to be mostly located on the somatodendritic membrane of

STN neurons, some occurring preferentially at the edge of asymmetric glutamatergic

synapses (Clarke & Bolam, 1998; Kuwajima et al., 2004) but presynaptic elements labeled

for mGluR1 have also been reported in mice (Kuwajima et al., 2007).

Functional implications for Parkinson's disease and deep brain stimulation

It has been hypothesized that some of the therapeutic benefits of STN DBS is due to the

antidromic activation of motor systems, whereas the side effects of this procedure might

result from the non-physiologic invasion of non-motor corticosubthalamic pathways (Drouot

et al., 2004; Li et al., 2007; Gradinaru et al., 2009; Anderson et al., 2018). The antidromic

activation of the hyperdirect pathway might also influence other cortical neurons by local

axon collaterals, or even by interrupting the synchronized oscillations between STN and the

cerebral cortex (Wichmann & DeLong, 2016; Akram et al., 2017). However, attempts to

explain the beneficial effect of DBS must also take into account the fact that the hyperdirect

pathway loses efficiency in late stages of PD (Mathai et al., 2015; Chu et al., 2017). The

current model of the BG suggests that, when neurons of the substantia nigra degenerate, the

lack of dopamine in the striatum causes an augmentation in the activity of the indirect

pathway, which leads to the inhibition of movements, as it is the case in PD (Mink, 1996;

DeLong & Wichmann, 2007; Obeso et al., 2008). Likewise, the hyperdirect pathway has

been reported to suffer from a major loss of strength when dopaminergic neurons die in PD

condition. Such a down regulation of the corticosubthalamic projection coupled with an

increased striatopallidal transmission might leads to an imbalance of synaptic excitation and

inhibition upon STN neurons that is likely to contribute to motor abnormalities observed in

PD. Some findings of the present study regarding the anatomical organization of the

hyperdirect pathway in primates, particularly its widespread distribution to other motor

nuclei besides the STN, also need to be considered. For example, the antidromic and

orthodromic activation of hyperdirect pathway axons through DBS might lead to an

abnormally high glutamate-mediated excitation of structures such as the ZI, the reticular

thalamic nucleus, the red nucleus and the superior pontine nucleus, with possible effects such

as facilitating initiation of movement and correcting selected motor commands.

40

Concluding remarks

The present study has provided the first detailed description, at the single-axon level, of the

hyperdirect pathway originating from M1 in primates. Our results indicate that the so-called

hyperdirect pathway derives essentially from collaterals of large caliber pyramidal tract

axons. Also, our data show that the corticosubthalamic projection originates from a neuronal

population that is distinct from the one giving rise to the corticostriatal pathway. Furthermore,

axon collaterals entering the STN are rarely exclusively devoted to this structure, as they also

innervate the zona incerta or/and the red nucleus. These novel findings should be taken into

account if one hopes to properly interpret the role of the hyperdirect pathway in the functional

organization of the primate BG as well as to better understand the cellular mechanisms

underlying the beneficial effect of DBS used to alleviate PD motor symptoms.

41

Figure 1

Figure 1. A: High magnification view of a BDA injection site in M1 that comprises a dense

core of BDA precipitate. B: Photomicrograph showing a typical pyramidal, Golgi-like, BDA-

labeled neurons in primate M1 layer V. C: Tridimensional reconstruction of a typical layer

V M1 neuron with its firing pattern recorded under propofol anesthesia.

42

Figure 2

Figure 2. A: Composite two-dimension reconstructions from serial transverse sections of a

single BDA-labeled M1 axon projecting to the subthalamic nucleus (STN) and toward lower

brainstem regions. It was obtained by superposing all serial sections containing labeled

profiles onto a single two-dimension frame. Showing 3D neurons this way inevitably leads

to some image distortion since the tortuous three-dimensional course of the axon and the

structures in which it courses and arborizes are not necessarily at the same plane as the one

selected for the illustration. The limits of the various structures should be taken as mere

indications, a warning that also applies to all reconstruction shown in this paper. The top

right insert provides a higher magnification view of the axonal innervation observed in the

dorsolateral region of the STN. B: Frontal reconstruction depicting a large caliber pyramidal

tract axon sending collaterals that innervate the STN and the zona incerta (ZI). Bottom left

insert shows a typical small but varicose axon in the sensorimotor territory of the STN,

whereas the top right insert illustrates a higher magnification of the collateral plunging

ventrally in the nucleus. The number of axonal varicosities observed in each structure is

indicated in parentheses. For abbreviations, see list.

43

Figure 3

Figure 3. A: Frontal plane reconstruction of the axonal arborization of a M1 neuron that

projects to the subthalamic nucleus (STN), the zona incerta (ZI), the red nucleus (RN) and

toward lower brainstem regions. The arrow in the ZI refers to the bottom left insert where

the axonal branch can be visualized. Top right insert shows a higher magnification of the

STN innervation. B: Sagittal plane reconstruction of the axonal arborization of a M1 neuron

that projects to the STN and ZI. Top right insert depicts the pattern of innervation observed

in the ZI at a higher magnification. The number of axonal varicosities observed in each target

structure is indicated in parentheses. For abbreviations, see list.

44

Figure 4

Figure 4. A: Frontal plane reconstruction of a M1 neuron axonal arborization to the reticular

thalamic nucleus (rt), the zona incerta (ZI), the subthalamic nucleus (STN) and the red

nucleus (RN) via thin collaterals emitted by a thick long-ranged axon coursing toward lower

brainstem regions. The bottom left insert shows a typical collateral branching perpendicularly

from the main axon at the STN level (see arrow), whereas the top right insert provides higher

magnification of the ventrolateral innervation of the RN. B: Frontal plane reconstruction of

the axonal arborization of a M1 neuron that projects to the ZI, the STN and the RN via

collaterals of a main large caliber pyramidal tract axon travelling in the internal capsule (ic).

Top right insert shows a higher magnification of the terminal field observed in the RN. The

number of axonal varicosities observed in each target site is indicated in parentheses. For

abbreviations, see list.

45

Figure 5

Figure 5. A: Frontal plane reconstruction of the axonal arborization of a M1 neuron that

projects to the subthalamic nucleus (STN), the zona incerta (ZI), the reticular thalamic

nucleus (rt), the red nucleus (RN) and toward lower brainstem regions. The bottom left insert

shows a typical perisomatic innervation observed in the RN, whereas the top right insert

provides higher magnification of the ventrolateral innervation of the RN. B: Sagittal plane

reconstruction of a M1 axon that projects to the STN, the ZI and the superior pontine nucleus

(SPN) after travelling through the substantia nigra pars reticulata (SNr). The arrow in the

STN refers to the bottom left insert where varicosities en passant can be observed. Top right

insert shows the innervation of the SPN at a higher magnification. The number of axonal

varicosities observed in each target structure is indicated in parentheses. For abbreviations,

see list.

46

Figure 6

Figure 6. Ultrastructural features of VGluT1-positive (+) axon varicosities observed in the

dorsolateral STN region of the cynomolgus monkey. The VGluT1+ axon varicosities

establish many synapses (between arrows) with different neuronal elements within the STN.

The one shown in A establishes three synaptic contacts, two with dendrites (d) and one with

an unlabeled axon varicosity (av). The VGluT1+ axon varicosity profile depicted in B

establishes an asymmetric synapse with a small dendritic profile (d).

47

Tableau 1

48

Tableau 2

49

3. Conclusion générale

Cette étude de traçage neuronal unitaire exploite une technique neuroanatomique de pointe

qui présente un grand avantage comparativement aux anciennes méthodes qui utilisaient des

traceurs rétrogrades. Effectivement, l’injection d’un traceur antérograde, telle que la BDA

utilisée ici, nous a permis de visualiser et de reconstruire en trois dimensions l’arborisation

axonale complète de neurones injectés dans la couche V du cortex moteur primaire chez le

singe macaque. En outre, cette méthode nous a fourni la possibilité de quantifier la puissance

de l’innervation de chaque axone au niveau de chacune des structures cibles en quantifiant

les sites de relâche de neurotransmetteur, soit les varicosités axonales. Cette technique nous

a donc permis de visualiser en détail la morphologie des axones et de mesurer la densité de

l’innervation dans diverses structures cérébrales ciblées par les neurones qui composent la

voie hyperdirecte. De plus, il fut possible de classer les neurones reconstruits en groupes

distincts selon les types d’innervation rencontrés au sein des différentes cibles de la voie

hyperdirecte (Tableau 1).

Parmi les résultats les plus frappants de la présente étude, mentionnons la découverte du fait

que les neurones du cortex moteur primaire (M1) à l’origine de la voie hyperdirecte projettent

quasi-exclusivement sur le territoire sensorimoteur du STN. De fait, nous avons démontrer

que tous les neurones moteurs (28/28) reconstruits individuellement dans la présente étude

laissaient des varicosités dans ce territoire fonctionnel du STN. De plus, nous avons

découvert que les projections axonales émergeant des neurones du M1 ciblent les zones

impliquées dans le contrôle moteurs de plusieurs structures nerveuses sous-corticales autre

que le STN, soit la zona incerta, le noyau rouge, le noyau réticulé du thalamus, les noyaux

supérieurs pontiques et le tronc cérébral (Tableau 1). L’innervation de la voie hyperdirecte

n’est donc pas exclusivement dédiée au STN. En fait, nous n’avons trouvé qu’un seul neurone

dont l’axone s’arborisait uniquement dans le STN. Par ailleurs, nos données révèlent que la

voir hyperdirecte est exclusivement ipsilatérale, contrairement à la projection corticostriée

dont une proportion significative d’axones croise la ligne médiane. Ces résultats mettent en

évidence l’importance de la collatéralisation axonales des neurones qui forment la voie

50

corticosubthalamique. En outre, nos observations démontrent que cette arborisation est

spécifique aux régions motrices du cerveau. Les axones de la voie hyperdirecte sont donc en

mesure de stimuler, à l’aide du glutamate, un grand nombre de neurones situés dans plusieurs

structures sous-corticales impliquées dans le contrôle moteur.

Mon travail de recherche démontre que les neurones composants la voie

corticosubthalamique font parties d’une population neuronale distincte de celle qui est à

l’origine de la voie corticostriée. En effet, aucun neurone faisant partie de la voie corticostriée

n’a été vu s’arborisant à la fois dans le striatum et le STN (Parent & Parent, 2006). De plus,

dans la présente étude, aucun neurone de la voie hyperdirecte n’a laissé de collatérales au

striatum avant d’innerver le STN. Ces populations neuronales semblent donc distinctes et on

peut ainsi présumer que chacune d’elle exerce une influence sur le fonctionnement des GB

d’une façon différente. Nos résultats appuient donc le « center-surround model » proposé par

Nambu, en 2002, qui propose que la voie hyperdirecte permet de contourner le striatum afin

de s’assurer que le programme moteur sélectionné par la voie directe soit initié, exécuté et

terminé dans un temps restreint. De plus, cette projection neuronale assure que toute autre

sélection motrice pouvant apparaître avant les informations provenant de la voie directe

soient annulée dans le but d’éviter les mouvements involontaires (Nambu et al., 2002).

Cependant, d’autres études impliquant des tâches motrices spécifiques seront nécessaires afin

de valider l’effet comportemental et moteur de la voie hyperdirecte. Par exemple, il serait

possible d’éliminer la voie hyperdirecte chez le primate à l’aide de virus et d’immunotoxines

dans l’optique de tester en profondeur les fonctions réelles de cette projection neuronale chez

des animaux vivants. En considérant que la force de l’innervation corticale au STN est

grande, puisque nos observations montrent une incidence synaptique de 141% (Tableau 2)

dans le territoire sensorimoteur de la structure, des effets moteurs devraient sans doute être

visible si cette voie neuronale est éliminée.

En ce qui concerne la stimulation cérébrale profonde, plusieurs mécanismes d’action ont été

suggérés au cours des dernières années (Wichmann & DeLong, 2016). De ceux-ci,

l’activation antidromique des axones formant la voie hyperdirecte, ainsi qu’une perturbation

électrique du STN qui lui permet de retrouver un état d’activité normale, ont été proposés

51

comme médiateurs des bienfaits cliniques de la DBS. Le projet de recherche présenté dans

ce mémoire apporte une nouvelle vision quant aux effets thérapeutiques médiés par la DBS

au niveau du STN. En effet, nous proposons que cette thérapie puisse améliorer les

symptômes moteurs des patients atteints de la MP en activant de manière orthodromique les

fibres qui composent la voie corticosubthalamique. Puisque les collatérales de celles-ci

innervent d’autres centres moteurs du cerveau, ainsi que le tronc cérébral et possiblement

certains neurones spinaux, il serait possible que l’activation orthodromique de la voie

hyperdirecte permette un meilleur contrôle moteur tout en diminuant de façon significative

les symptômes associés à la MP.

Le modèle classique des GB proposé dans les années 80, amélioré par l’inclusion de la voie

hyperdirecte dans les années 2000, a permis de propulser et d’orienter la recherche sur cet

ensemble de structures sous-corticales impliqué dans le contrôle moteur. Cependant, ces

anciens modèles restent simples et n’expliquent que de manière superficielle le

fonctionnement des GB ainsi que les mécanismes de certaines pathologies qui leurs sont

associées. Tel que démontré dans ce mémoire, l’arborisation axonale des populations

neuronales qui composent les GB est complexe. La voie hyperdirecte n’est pas exclusive au

STN. La forte collatéralisation axonale des neurones de la voie corticosubthalamique devrait

être considérée afin d’actualiser le modèle et de favoriser une meilleure compréhension du

fonctionnement des GB. Suite à ce projet, je souhaite que l’arrivée des superordinateurs

puisse permettre une meilleure modélisation des GB, une modélisation qui tienne compte des

subtilités et les moindres détails de cet ensemble de structures reliées entre elles par un vaste

et complexe réseau de projections axonales fortement collatéralisées. C’est en faisant table

rase et en bâtissant de nouveaux modèles que nous pourrons, pour une seconde fois, propulser

les recherches centrées sur les GB afin de mieux comprendre leur fonctionnement, tant en

conditions normales que pathologiques.

52

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