Comme convenu, voici ici, un document avec les questions traitées remises dans l’ordre. En

supplément, vous pourrez trouver une fiche récapitulative sur les Acides Aminés.

En vous souhaitant de bonnes révisions et une bonne préparation aux concours de pré-rentrée.

Quentin JANOT

Pré-Rentrée

UE 1 – TD 4

ANNEXE

ENZYMOLOGIE

METHODES D’ETUDE DES PROTEINES

24 août – 2 septembre 2016

1- QCM

a. ENZYMOLOGIE.

QCM 1. Indiquer la ou les réponse(s) correcte(s).

A. L’allostérie enzymatique est le plus souvent la conséquence de l’interaction entre différentes sous-unités d’une protéine multimérique.

B. La courbe Vo=f(S) (vitesse initiale en fonction de la concentration de substrat d’une enzyme

allostérique) est une droite.

C. Une enzyme allostérique possède le plus souvent un unique site de fixation pour les effecteurs

éventuels.

D. Une enzyme allostérique possède un ou plusieurs sites enzymatiques.

E. L’action d’une enzyme allostérique peut être régulée par le métabolite final d’une cascade

enzymatique où elle intervient.

Enoncé commun aux QCM 2 & 3.

QCM 2. Indiquer la ou les réponse(s) correcte(s).

A. V₀ varie linéairement avec la concentration en substrat jusqu’à une limite maximale : la concentration saturante en substrat.

B. Cette courbe correspond à la cinétique d’une enzyme allostérique. C. La vitesse de la réaction est minimale en début de réaction. D. Il n’y a plus (ou presque) de substrat à transformer durant la phase de plateau. E. Plus la Km est élevée, plus l’affinité de l’enzyme pour son substrat est élevée. QCM 3. Indiquer la ou les réponse(s) correcte(s).

A. La flèche Q2 correspond à la Km (= constante de Michaelis)

B. La flèche Q2 correspond à Vmax/2

C. La flèche Q3 correspond à la Km

D. La flèche Q3 correspond à Vmax/2

E. La flèche Q3 correspond la Kcat (= constante catalytique)

Q2

Q3

Enoncé commun aux QCM 4 & 5. Les droites A et B représentent des cinétiques enzymatique (la vitesse de réaction V est en µmol.min¯¹ ; la concentration en substrat S est en µM). La droite A représente la cinétique d’une enzyme E en l’absence d’effecteur.

QCM 4. Indiquer la ou les réponse(s) correcte(s).

A. La Km de l’enzyme E est -0.25 µM. B. La Vmax de l’enzyme E est 0.25 µmol.min¯¹. C. Le Km de l’enzyme E est 4 µM. D. La Vmax de l’enzyme E est 4 µmol.min¯¹. E. L’enzyme E a une cinétique allostérique

QCM 5. La droite B est compatible avec la cinétique d’une enzyme dans une ou plusieurs conditions

suivantes, quelle est (sont) la (les) proposition(s) exacte(s) ?

A. Une enzyme ayant une affinité pour le substrat S supérieure à celle de l’enzyme E.

B. Une enzyme ayant la même affinité pour le substrat S que l’enzyme E. C. L’enzyme E en présence d’un inhibiteur compétitif. D. L’enzyme E en présence d’un inhibiteur se fixant sur le même site actif que l’enzyme. E. L’enzyme E en présence d’un inhibiteur non compétitif.

QCM 6. Parmi les propositions suivantes sur les inhibiteurs des enzymes de type Michaelliens, quelle

est (sont) la (les) proposition(s) exacte(s).

A. Les inhibiteurs compétitifs se fixent sur le site régulateur de l’enzyme. B. Les inhibiteurs compétitifs diminuent la Km de l’enzyme. C. Les inhibiteurs non compétitifs se fixent sur le site actif de l’enzyme. D. Les inhibiteurs non compétitifs augmentent la Km de l’enzyme. E. Aucune des réponses n’est exacte.

QCM 7. Quelle est (sont) la (les) proposition(s) exacte(s) concernant l’allostérie ?

A. La courbe de forme sigmoïde est caractéristique du phénomène de coopérativité. B. Une enzyme monomérique peut avoir un comportement allostérique. C. Un activateur déplace la courbe V= f(S) vers la gauche. D. La forme T possède une plus forte affinité pour le substrat que la forme R. E. Les inhibiteurs allostériques sont souvent le produit final de la voie métabolique.

QCM 8. Quelle est (sont) la (les) proposition(s) exacte(s) concernant les enzymes ? A. La Km d’une enzyme reflète son affinité pour un substrat donné. B. La Km et la Vmax sont liés dans l’équation de Michaelis-Menten. C. La vitesse initiale est la Vmax si la concentration en substrat est saturante. D. Les enzymes allostériques sont le plus souvent constituées d’une seule chaine protéique.

E. Les inhibiteurs allostériques entre en compétition avec le substrat sur un même site.

QCM 1 ADE

A. VRAI : Une enzyme allostérique est composée de plusieurs sous-unités et il existe un phénomène de coopérativité entre les différentes sous-unités.

B. Faux : Il s’agit d’une sigmoïde et c’est une hyperbole pour les enzymes michaeliennes.

C. Faux : Il y a au moins 1 site actifs et plusieurs sites régulateurs. D. VRAI : E. VRAI : On parle de rétrocontrôle négatif.

QCM 3 BC

A. Faux et B. VRAI: La courbe est une hyperbole: on est dans le cas d’une enzyme michaelienne. La flèche Q2 correspond à Vmax/2. C.VRAI, D.FAUX et E.FAUX. On est dans le cas d’une enzyme Michaelienne, on peut donc trouve le Km qui est indiqué par la flèche Q3. La Kcat n’est pas calculable graphiquement.

QCM 4 BC On regarde les intersections de la droite E avec les axes. B. VRAI et D. FAUX : 1/Vmax (ordonnée à l’origine) On a Vmax= 1/4=0,25. Items

A.FAUX et C.VRAI -1/Km : (insertion de la droite avec l’axe des abscisses) On a Km=-1/-0,25=4. Items E. FAUX il s’agît de l’équation de Michaellis-Menten en double inverse. Elle ne s’applique qu’aux enzymes michaeliennes.

QCM 2 D

A. VRAI. Il s’agît d’un item faisant appel à des notions de cours, il n’y a pas trop de réflexions

B. FAUX. Cette courbe est une hyperbole, il s’agît donc de la cinétique d’une enzyme michaelienne

C. FAUX. En phase initiale ou stationnaire, la vitesse de réaction est la plus rapide D. VRAI. Durant la phase de plateau, il n’y a plus de substrat à transformer, la réaction

est quasi terminée E. FAUX. Plus la Km est élevée, plus l’affinité de l’enzyme pour le substrat est faible

QCM 5 BE • On peut voir que les courbes se croisent sur l’axe des abscisses. Les deux enzymes

ont donc le même Km et des Vmax différentes.

• C. et D. FAUX ; E. VRAI L’enzyme B est donc un inhibiteur non compétitif. Le substrat

ne se fixe pas sur le site actif mais sur un site régulateur.

• A. FAUX et B. VRAI Les Km étant identiques, les enzymes ont donc la même affinité

pour le substrat.

• Remarque: on peut résoudre ce genre de questions de différentes manières

notamment en calculant les valeurs de Km et Vmax et raisonner ensuite. Faites

comme vous êtes les plus allaise.

QCM 6 E C’est une question de cours, il faut connaître ce petit tableau bien pratique.

I. COMPETITIF I. NON COMPETITIF

Site de fixation Site actif de l’enzyme Site régulateur Distinct du site actif

Influence sur le Km Km ↗et affinité ↘ Km = Influence sur la Vmax Vmax = Vmax ↘ Mécanisme de levée d’inhibition

Par ajout massif de substrat

QCM 7 ACE A. VRAI : une courbe sigmoïde est associée à un mécanisme allostérique dont une des

caractéristiques est la coopération des sous-unités.

B. FAUX : ce sont forcément des protéines multimériques qui ont donc une structure

quaternaire.

C. VRAI : la réponse sera plus rapide.

D. FAUX : c’est l’inverse. La forme Tendu a moins la capacité de se lier au substrat.

E. VRAI : on parle de rétrocontrôle négatif. Voir enzyme du métabolisme

QCM 8 ABC A. VRAI : plus la Km est basse, plus l’affinité est grande et inversement

B. VRAI :

C. VRAI :

D. FAUX. Elles ont une structure quaternaire donc présentent plusieurs chaines protéiques ou

sous-unités

E. FAUX. Elles entrent en compétition sur un site distinct dit régulateur

b. ETUDE DES PROTEINES.

QCM1. On réalise une électrophorèse à pH=6,8 d’un mélange d’hémoglobines mutées qui diffèrent

de l’hémoglobine normale par la substitution d’un acide aminé.

• L’hémoglobine X diffère de l’hémoglobine normale par le remplacement d’un ALA

par une VAL

• L’hémoglobine Y diffère de l’hémoglobine normale par le remplacement d’un VAL

par une GLU

• L’hémoglobine Z diffère de l’hémoglobine normale par le remplacement d’un GLU

par une LYS

Quel est le profil de migration électrophorétique de ces trois hémoglobines ? A. Anode Y Z X Cathode. B. Anode Z Y X Cathode. C. Anode Y X Z Cathode. D. Anode X Z Y Cathode. E. Anode Z X Y Cathode.

Enonce commun aux QCM 2 & 3. Soit les 2 peptides suivants, obtenus après digestion par le bromure de cyanogène d’un peptide de 14 AA :

Alpha: LEU – ARG – ASP – GLY – VAL - THR - GLU Béta: VAL – LYS – ILE – VAL – THR – TYR – MET

QCM 2. Quelle(s) est (sont) la (les) proposition(s) exacte(s) ? A. Un des résidus est impliqué dans des liaisons covalentes inter-chaînes. B. Ils sont séparés par une chromatographie échangeuse d’ions à pH=7. C. Ils sont séparés par une électrophorèse à pH=7. D. Les deux peptides sont détectés par une lecture d’absorbance à 280nm. E. Ils peuvent être séparés en SDS-PAGE.

QCM 3. Quelle(s) est (sont) la (les) proposition(s) exacte(s) ?

A. La séquence du peptide initial est béta-alpha. B. Alpha et Béta peuvent être digérés par la trypsine. C. La réaction d’Edman libère 2 résidus hydrophobes à partir du mélange Alpha-Béta. D. Alpha et Béta peuvent être digérés par la chymotrypsine. E. Une carboxypeptidase libère un résidu hydrophile à partir du peptide alpha.

QCM 4. Parmi les techniques suivantes, quelle(s) est (sont) celle(s) permettant la séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaire ?

A. L’électrophorèse en présence de SDS (SDS-PAGE). B. L’isoélectrofocalisation. C. L’ultracentrifugation. D. La chromatographie d’exclusion ou perméation de gel. E. La chromatographie échangeuse d’ions.

Enonce commun aux QCM 5, 6 & 7. L’angiotensinogène humain est un peptide de 485 AA constitué

d’un peptide signal de 33 résidus de long, suivi d’une séquence de 10 résidus se terminant par une

leucine (LEU) puis finissant par une chaine de 442 résidus dont le premier acide aminé est une Valine

(VAL).

33 AA (signal) – ASP – ARG – VAL – TYR –ILE – HIS – PRO – PHE – HIS – LEU – VAL – 441 AA

Le peptide signal est clivé avant la sécrétion de la protéine.

Si la pression artérielle décroit au niveau des reins, ceux-ci produisent la rénine. Celle-ci va cliver la

liaison peptidique de l’angiotensinogène entre les résidus LEU et VAL, pour libérer un décapeptide

nommé angiotensine I (AGT1). Des anticorps spécifiques dirigés contre les différentes formes de la

molécule AGT1 ont pu être produits.

QCM 5. Quelles affirmations concernant AGT1 est (sont) exacte(s) ?

A. Il est le produit d’un zymogène.

B. Il est clivable par la trypsine.

C. Il est clivable par la chymotrypsine.

D. Il est phosphorylable.

E. Il est possible de le purifier en utilisant une chromatographie d’affinité.

AGT1 a peu d’effets biologiques connus. Il est cependant le précurseur de l’angiotensine II (AGT2),

produit du clivage de l’AGT1 par l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE). AGT2 possède une

forte activité hypertensive, fondamentale dans le maintien de la pression artérielle, grâce à ses

propres propriétés vasoconstrictrices et par la régulation de la volémie qu’il induit via la stimulation

de la production d’aldostérone surrénalienne.

La séquence primaire de AGT2 est : ASP – ARG – VAL – TYR – ILE – HIS – PRO – PHE

QCM 6. Quelles affirmations concernant AGT2 est (sont) exacte(s) ?

A. Il peut être obtenu par clivage de l’AGT1 par la chymotrypsine.

B. Il est clivable par la tryspsine.

C. Il est clivable par la chymotrypsine.

D. Il est phosphorylable.

E. Le dipeptide (2AA) HIS-LEU est responsable de l’activité hypertensive.

Une petite partie de AGT2 est dégradée en AGT3 par des angiotensinases. AGT3 ne possède plus

alors que 40% de l’activité de AGT2 sur la pression artérielle mais conserve 100% de son activité sur

la production d’aldostérone.

La séquence primaire de AGT3 est : ARG – VAL – TYR – ILE – HIS – PRO – PHE

QCM 7. Quelles affirmations concernant AGT2 est (sont) exacte(s) ?

A. La perte de l’ASP en position N-terminale modifie la production d’aldostérone.

B. Il est clivable par la chymotrypsine.

C. Il est phosphorylable.

D. Il possède un pHi plus bas que celui de AGT2.

E. Les angiotensinases sont des endoprotéases.

QCM 1 C

QCM 2 BC Initialement, on a une chaîne de 14 AA. Après coupure par le bromure de cyanogène, on a 2 chaines de 7 AA.

A. FAUX, on dit qu’il y 2 peptides différents, donc ils ne sont pas liés B. VRAI. La chromatographie échangeuse d’ions se base sur la différence de charge des

protéines pour les séparer: alpha est – et béta est +, on peut donc les séparer grâce à cette

technique.

C. VRAI. L’électrophorèse se base sur la différence de charge des protéines pour les séparer:

alpha est – et béta est +, on peut donc les séparer grâce à cette technique.

D. FAUX. Seuls les résidus aromatiques (PHE, TRP et TYR) absorbent à 280nm. On cherche un de

ces trois AA dans chaque chaine. On ne trouve pas de résidu aromatique en alpha

E. FAUX. Le critère de sélection de la SDS-PAGE est la taille de la protéine. Or les deux protéines

ont la même taille à savoir 7AA.

Béta: VAL – LYS – ILE – VAL – THR – TYR – MET CHARGE POSITIVE

0 + 0 0 0 0 0

Alpha: LEU – ARG – ASP – GLY – VAL – THR – GLU CHARGE NEGATIVE

0 + - 0 0 0 -

QCM 3 ABCE A. VRAI. Le bromure de cyanogène coupe à droite des résidus MET enchainement béta-

alpha initialement

B. VRAI. La trypsine coupe à droite de ARG et LYS. Dans chaque peptide, il y a un de ces résidus

en milieu de chaine donc alpha et béta peuvent être digérés par la trypsine.

C. VRAI. Le réactif d’Edman libère un AA situé à l’extrémité N-term. Pour alpha, il libère LEU qui

est hydrophobe. Pour béta, il libère VAL qui est hydrophobe. L’item est donc valide

D. FAUX. La chymotrypsine coupe à droite de PHE, TYR et TRP. Il n’y a aucun de ces AA dans

AA, l’item est faux

E. VRAI. La carboxypeptidase libère le AA en C-term. Pour alpha elle libère du GLU qui est

hydrophyle

QCM 4 ACD

CRITERES DE SEPARATION TECHNIQUES UTILISEES

Poids moléculaires Nombre d’AA

Taille Densité

Ultracentrifugation Chromatographie d’exclusion

Electrophorèse SDS-PAGE Dialyse

Charge pHi

Chromatographie échangeuse d’ions Electrophorèse classique

Isofocalisation

QCM 5 ABCDE A. VRAI. Le zymogène est le précurseur inactif d’une enzyme activée par protéolyse. On nous

dit dans l’énoncé que le peptide signal est clivé avant la sécrétion de la protéine

B. VRAI. La trypsine coupe à droite de ARG et LYS. Il y a un de ces résidus en milieu de chaine

donc AGT1 est clivable par la trypsine.

C. VRAI. La chymotrypsine coupe à droite de PHE, TYR et TRP. Il y a PHE dans AGT1 donc il est

clivable par la chymotrypsine

D. VRAI. Les AA phosphorylables sont SER, THR et TYR. Il y a un TYR dans la chaine donc AGT1

est phosphorylable

E. VRAI. On nous dit dans l’énoncé que des anticorps spécifiques anti AGT1 ont pu être produits

QCM 6 BCD A. FAUX. La chymotrypsine coupe à droite de PHE, TYR et TRP. Le dernier AA de AGT2 est PHE

donc c’est possible si l’on se base sur cet AA. Or il y a un autre AA qui peut être coupé par la

chymotrypsine au milieu de la chaine donc l’item est faux. PIEGE

B. VRAI. La trypsine coupe à droite de ARG et LYS. Il y a un ARG au milieu de la chaine

C. VRAI. La chymotrypsine coupe à droite de PHE, TYR et TRP. Il y a un TYR au milieu de la

chaine

D. VRAI. Les AA phosphorylables sont SER, THR et TYR. Il y a un TYR au milieu de la chaine

E. FAUX. AGT1 qui possède HIS – LEU n’a pas d’activité hypertensive et AGT2 en a une. C’est

justement ce dipeptide qui fait que l’AGT1 n’a pas de propriété hypertensive.

QCM 7 BC A. FAUX. L’énoncé dit explicitement que la dégradation de l’AGT2 en AGT3 « conserve 100 % de

son activité sur la production d’aldostérone »

B. VRAI. La chymotrypsine coupe à droite de PHE, TYR et TRP. Il y a un TYR au milieu de la

chaine

C. VRAI. Les AA phosphorylables sont SER, THR et TYR. Il y a un TYR au milieu de la chaine

D. FAUX. On a perdu un ASP qui porte une charge négative: le pHi de AGT3 est donc plus HAUT

que celui de AGT2

E. FAUX. Les endoprotéases sont la trypsine et la chymotrypsine. Ici seul le AA en N-term a été

coupé: cette action est dûe à une exopeptidase

AGT 1 ASP ARG VAL TYR ILE HIS PRO PHE HIS LEU

AGT 2 ASP ARG VAL TYR ILE HIS PRO PHE

AGT 3 ARG VAL TYR ILE HIS PRO PHE

2- Fiche récapitulative (apparaissant sur la diapo et non dans le TD)