Z. Zellforseh. 134, 245--254 (1972) © by Springer-Verlag 1972

Uhrastructure des photor6cepteurs de Lineus ruber (0. F. Miiller) (H6t6ron61nertes Lineidae)

I I . Morphog6n~se des granules p igmenta i res de la cupule p igmenta i re de l 'oeil en r6g6n6rat ion

Guy Vernet

Laboratoire de Biologie Cellulaire (Direeteur: Professeur 1~I. Gonteh~ro/f) et Centre de Biologie et de Biochimie du D6veloppement, Faeult6 des Sciences de Reims - France

Regue le 7 aofit 1972

Ult ras t ructure of Photoreceptors in L i n e u s ruber (O. F. Mfiller) II. Morphogenesis of Pigmentary Granules of the Pigmentary Cupula

in the Regenerating Eye Summary. In Lineus tuber the biochemical differentiation of the new pigmentary cells is

sequential during the reparative regeneration of the eyes. The enzymatic pathways for por- phyrin and melanin biosynthesis appear successively.

UltrastructurM and high resolution radioautography studies, show that melanization occurs in specialized organelles called premelanosomes, melanosomes and melanin granules. Porphyrogenesis occurs in Golgi vesicles which are also involved in mclanogenesis.

Key words: Melanogenesis - - Porphyrinogenesis - - Lineus ruber - - Autoradiography- Electron microscopy.

Rdsumd. Lors de la r6g6n6ration traumatique des yeux de Lineus tuber la diff6renciation biochimique des nouvelles cellules pigmentaires est s6quentielle. On assiste £ l'apparition successive des chalnes enzymatiques n6c6ssaires £ la biosynth6se de porphyrine et de m61anine.

Les 6tudes ultrastructurale et autoradiographique £ h~ute r6solution de ces ph6nomgnes - - montrent que la m61anisation s'op~re au niveau "d'organites" cellulaires sp6ciMis6s (pr6- m61anosomes, m61anosomes). La porphyrinog6nbse se d6veloppe duns des vacuoles et organites d'origine golgienne qui participent 6galement £ la m61anog6n~se.

Introduction

L 'analyse ul trastructurale des photor6ccpteurs de L i n e u s tuber a fair l 'objet /t ce jour de deux s6ries de t r avaux (Vernet, 1970; Storeh et ~¢[oritz, 1971). Les r6sultats obtenus comp16tent l ' importante 6rude comparat ive des structures 616mentaires constitutives des cellules photor6ceptrices chez les M6tazoaires dont le pionnier est Eakin (1962, 1965, 1968). Ils fournissent aussi une description des cellules de la cupule pigmentaire de l'oeil de ce vcr. (Vernet, 1970).

On salt que chaque granule pigmentaire contenu duns ces eellules est form6 de m61anine et d 'uroporphyr ine (Vernet, 1967). La nature mixte de ce pigment a pour cons6quence lors de la r6g6n6ration exp6rimentale des yeux la diff6rencia- t ion biochimique s6qucntielle des nouvelles cellules pigmentaires. Cette eyto- diff6renciation consiste en l 'appari t ion successive des chaines enzymatiques n6eessaires ~ la biosynthbse d 'uroporphyr ine et de m61anine (Vernet et Gontcharoff, 1971).

246 G. Vernet:

On suit que pendan t la porphyrinog6n6se, des mol6cules d 'acide delta-amino- lgvulinique sont synth6tis6es duns les mitochondries (Graniek, 1958). Elles sont ensuite lib6r6es puis transform6es par voie enzymat ique au n iveau du cytoplasme en porphobil inoggne et porphyrine.

Une cellule pigmentaire en m6lanoggngse diff6rencie des "organi tes" spgcia- lis6s (v6sicules interm6diaires ou ~ protyrosinase, pr6m6]anosomes, m61anosomes, granules m61aniques), dans lesquels des remaniements s t ruc turaux et chimiques impor tan t s ont lieu. Ces proeessus sont m a i n t e n a n t bien eonnus et par fa i tement d6erits au n iveau des u l t ras t rue tures (Seiji, Shimao, Birbeck, Fi tzpatr ick, 1963a; Cardell, Hu, Knighton , 1964).

Dans ces condit ions il 6fair part icul i~rement int6ressant d 'employer l 'auto- radiographic ~ haute r6solution, apr~s inject ion pr6alable d 'aeide del ta-amino- l~vulinique tr i t i6 (z~-ALA2-3H~), en rue d '6tabl ir au n iveau u l t ras t ruc tura l une corr61ation morphologique entre les sites d'61aboration des uroporphyrine et m61anine par t ic ipant ~ la morphog~n~se des granules pigmentaires de la eupule pigmentaire de l 'oeil de Lineus tuber en r6g6n6ration.

Mat4riels et Techniques

I. Elevate: Les Lineus tuber sont r~colt6s ~ Roscoff. Pour tout ce qui int~resse le maintien en ~levage au laboratoire des animaux, nous nous

sommes conform~ aux indications donn~es par Gontcharoff (1951, 1959, 1960).

I I . Techniques opdratoires:

1. Mise en rdgdn~ration et injection de prdcurseur marqud. Chez les Lin~idae, la situation anatomique particuli~re des yeux permet leur ablation s4lective sans l~sion du syst~me nerveux central. ])ans les trente jours qui suivent l'amputation, intervient une r~g~n~- ration totale de la r~gion amput4e y compris des yeux. Des animaux en r~g~n6ration ant~rieure depuis 20 ~ 26 jours, re~oivent une injection de z1-ALA 2-3H ~ (activit~ totale = 1 tz C) en vue de l'~tude autoradiographique ~ haute r~solution de la biosynth~se de porphy- rine. Les autres servent ~ l'4tude de la synth~se m~lanique.

La dose de pr~curseur marqu6 (1 ~ C de zJ-ALA 2-3H 3) et la r~gion oh il dolt ~tre inject4 ont (;t~ d6termin~s au cours des travaux ant6rieurs (Vernet et Gontcharoff, 1971).

2. Pr@aration des r~gdndrats pour la microscopic dlectronique. Les r~g~n~rats pr~c4r~braux d'~ges diff6rents (compris entre 22 et 28 jours) sont destines b~ la microscopic ~lectronique. Ils sont fixes au t4troxyde d'osmium 1% dans du tampon Sorensen phosphate ~ pit = 7,4; 1 heure ~ 4 ° C. Les pi~ces sont d6shydrat~es et incluses dans de ]'araldite. Les objets sont d~bit~s ~ l'ultramicrotome Reichert Om U 2 muni de couteau de verre. Les coupes sont mon- t~es sur des grilles sans support et carbonics. Pour augmenter le constraste on a paffois color~ les preparations ~ l'ac6tate d'uranyle selon Watson (1958). L'observation est faite au microscope ~lectronique Hitachi IIU 11 A.

3. Autoradiographie. Les coupes r~alis~es ~ partir de r~g~n4rats d'animaux qui ont re~u l'injection de ~-ALA2-3H a sont dispos~es sur des lames porte-objet recouvertes d'un film de celloidine (Granboulan, 1965). Elles sont contrast~es 5~ l'ac6tate d'uranyle puis carbonics (Salpeter and Bachmann, 1965). On les ~rempe ensuite dans de l'~mulsion II~ord L4 dilute au 1/5 avec de l'eau bidistiII~e. La r4v~lation a lieu au bout de 2 ~ 3 tools. Les autoradiographies sont d~velopp~es 4 minutes dans le Mierodol X ~ 20 ° C et fix~es au thiosul~ate ~ 30 %. Puis les membranes de cello~dine portant les autoradiographies sont d~coll~es de leur support et amen~es sur des grilles. Enfin leur @aisseur est r~duite par un passage de 2 ~ 3 minutes dans de l'ac4tate d'isoamyle (Droz, 1967a, b).

Ultrastructure des photor6cepteurs de Lineus tuber 247

4. Produits particuliers employg8. L'Acide delta aminol6vulinique triti~ (A-ALA2-3H a) (aetivit~ sp6ci[ique t0 Ci/mM) nous a 4t~ fourni par le C.E.A. L'~mulsion L4 utilis4e pour l'autorudiographie nous a 6t~ fournie par ILFORD LIMITED en flacons de 50 cc "Gelform".

Observations

Les processus morphologiques de la m61unisation ont 6t6 bien 6tudi6s au microscope 61ectronique par Seiji, Shimao, Bh'beck et Fitzpatrick (1963a). Pour eette raison, c'est par eux que nous uvons d4but~ nos t ravaux chez Lineu8 tuber.

Duns les r4g4n@ats pr6c@4braux £g6s de 24 £ 25 jours, on trouve des eellules (Fig. 1) en pleine m6]anog4nSse. On y note la pr6sence autonr d 'un Golgi parti- euli@ement bien d6velopp6 de vacuoles de tailles diff@entes et de structures du type pr4m61anosome. On remarque en outre un tr~s important r6tieulum endo- plasmique rugueux et quelques mitochondries.

A fort grossissement (Figs. 2, 3) on observe que certaines vacuoles p@igolgien- nes pr~sentent un aspect particulier et ressemblent £ des v6sieules interm6diaires suivant la terminologie raise au point par Seiji et all. Duns d 'autres cellules on pent snivre l'6volution des v6sicules interm6diaires en pr6m61anosomes (Fig. 4--8), puis en mglanosomes (Fig. 9) et enfin en granules de m61anine de 0,9 × 0,6 [± (Fig. 10). Ce stade ultime est atteint duns les r4g6n6rats de 28 jours. Les grains de pigment m~lanique song les produits terminaux des mglanocytes.

La m61anisation des cellules pigmentaires de l'oeil en r6g6n@ation de Lineus ruber s'op@e done elassiquement, au niveau d'organites sp6cialis6s qne l 'on retrouve duns tout m61anocyte en diff@enciation.

Un des int@~ts majeurs du travail de Seiji et al. e'est d 'avoir non seulement mis au point la nomenclature et la chronologic des diff6rents organites sp6cialis6s duns la m61anog6ngse mais aussi d'avoir reli6 les modifications morphologiques aux modifications bioehimiques qui se d@oulent simultan~ment. Les auteurs montrent ainsi que les vgsicules interm4diaires correspondent a u n stade de strueturation des mol6eules de protyrosinase. L'6volution ult@ieure de ces v6si- eules interm6diaires ou v6sieules ~ protyrosinase passe par la phase de prgm61uno- some pendant luqueile s'uehgve l 'arrangement structural de la protyrosinase. Ensuite d6bute la p@iode de synth~se de la mSlanine duns les m61anosomes. C'est

ce moment que la tyrosinase devient active. [Chez Lineus ruber nous avons suivi l 'apparit ion de la tyrosinase duns des eellules de r6g6n@ats pr6e@6braux (Vernet, 1966)]. L'6tape finale de la synth~se de la m61anine est agteinte avec l'61aboration des granules mglaniques. A e e stade on ne d6e~le plus de tyrosinase duns les grains de pigment du m61anocyte.

Ce song des r6g6n@ats pr6c@6bruux de 22 £ 28 jours, trait6s 1 ou 2 jours au pr6alable par de l'acide delta-aminol6vulinique triti6 (zJ-ALA2-3 I-I s) qui ont servi £ la pr@arat ion des autoradiographies.

L 'examen syst6matique des autoradiogrammes permet de eonstater que cer- gaines cellules de r6g6n@ats de 22 jours poss~dent des vacuoles eirenmgolgiennes de types v~sicules interm6diaires £ protyrosinase qui ont pr6eipit4 £ leur niveau des grains d 'argent eontenus duns l'6mulsion (Fig. 11). Ces v6sieules ~ protyro- sinase ont ineorpor6 l'acide delta-aminol6vulinique triti6.

248 G. Vernet:

Fig. 1. Section de eellule pigmentaire d'oeil en r~g6n6ration ehez Lineus ruber. Phase de m61anisation. Appareil de Golgi (G). Mitoehondries (Mit.). l~6tieulum endoplasmique (R.E.).

Pr6m~lanosome (PMS.). Fixation aeide osmique. (Gr. × 26000)

Figs. 2 et 3. V~sicules intermgdiaires & protyrosinase (Flgehes.) pros de l'appareil de Golgi (G). Fixation aeide osmique (Gr. × 108000)

Dans les r6g6n6rats de 28 jours, le eonstituang porphyrinique des grains de pigment oeulaire n6oform6 a aeeumul6 l 'aeide delta-aminol~vulinique triti6. Les nombreux grains d 'argent qui les signalent en font foi (Figs. 12, 13).

Nous n 'avons pas observ6 de pr6m61anosomes ni de m61anosomes marqu6s par le traeeur radioactif.

Ultrastructure des photor6cepteurs de Lineus tuber 249

Figs. 4--8. Evolution des v6sicules intermgdiaires ~ protyrosinase en pr6m61anosomes. Fixation aeide osmique. Fig. 4 et 5 (Gr. × 125000). Fig. 6 (Gr. × 80000). Fig. 7 et 8 (Gr. × 65000)

Fig. 9. M61~nosome. Fixation acide osmique. (Gr. × 108000) Fig. 10. Granule m~lanoporphyrinique. Fixation aeide osmique. (Gr. × 61500)

Discussion

La biog6n6se de la m61anine r~sulte de l 'oxydat ion et de la polymgrisation de la tyrosine. Elle est eonnue depuis les t r avaux de g a p e r (1927), g a p e r et coll. (1930), Mason (1953).

17 Z. Zellforsch., Bd. 134

250 G. Vetoer:

Fig. 11. Autoradiographie d'une section de cellule pigmentaire d'oeil en r6g6n4ration chez Lineus tuber apr~s injection d'aeide delta-aminol~vulinique triti4 (A-ALA2-3H 3). Phase de porphyrinog~n~se. Marquage d'une v~sicule interm~diaire g protyrosinase (fl&che) situ6e pros

de l'appareil de Golgi (G). Fixation acide osmique (Gr. × 76000)

Figs. 12 ef 13.28 jours de rdg6n4ration. Marquage de granules pigmentaires m~lanoporphyrini- ques n4oformds. Fixation acide osmique. Fig. 12 (Gr. × 44500). Fig. 13 (Gr. × 17500)

Cependant l 'origine cellulaire des granules m~laniques des m61anoeytes a ]ongtemps 6t6 myst~rieuse. A l 'heure actuelle, ]a plupart des spScialistes £~ccor- dent £ penser que l '~pparefl de Golgi joue un r61e impor tan t dans les ph6nom~nes de biosynth~se de m6]anine et de granules m~laniques (Wellings et Siegel, 1959,

Ultrastructure des photor6cepteurs de Lineus tuber 251

(5

MIT

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14 grnp

Fig. 14. Diagramme repr6sentant la morphog@ngse des granules pigmentaires mglanopor- phyriniques darts une cellule pigmentaire d'oeil en rgggn6ration ehez Lineus ruber. Phase de mglanisation (24--28igme jours de r6g6n6ration). V6sieules ~ protyrosinase d'origine golgienne (Vp)--~ pr6m61anosome (Pms)~ m61anosome (Ms)--~ granule m61anoporphyrinique (Gmp). Phase de porphyrinog6ngse (22--28 i~me jours de r6g6ngration). Apparation d'aeide delta-aminol6vulinique d'origine mitoehondriale au niveau des v6sieules ~ protyrosinase (Vp). Evolution de ce pr6eurseur en porphobilinoggne et porphyrine dans les pr6mglanosomes (Pros),

m61anosome (Ms) et granule m61anoporphyrinique (Gmp)

1960; Birbeck, 1962, 1963; Drochmans, 1963; Moyer, 1963; Seiji et coll., 1963a, b; Wellings et Siegel, 1963 ; Fi tzpatr ick et coll., 1967 ; Poirier et Nufiez-Dispot, 1968 ; 2V[aul, 1969; Hunte r et coll., 1970; Spitznas, 1971).

Les autcurs supposent que la biosynth~se de la m61anine et ]a morphog6n~se des granules m61aniques ont lieu de la mani~re suivante : ~u niveau du ret iculum endoplasmique rugueux, des polypeptides sont synth6tis6s et passent dans les saccules de l 'apparei] de Golgi oh ils sont condensSs en mol6cules de protyro- sinase. A c e moment ]es r6actions histoenzymologiques de d4tection de la tyro-

17"

252 G. Vernet:

sinase sent n6gatives car d'apr6s Seiji et coll. les mol6eules d'enzymes ne sent pas encore fonctionnelles. Les v6sieules £ protyrosinase fusionnent en structures plus grandes : les v6sieules interm6diaires qui grossissent et deviennent des pr6m61ano- seines £ l'int6rieur desquels les mol6eules de protyrosinase sent alig~6es. Les pr6m61anosomes ne sent pas m61anis6s et sent tyrosinase-n6gatifs. Chez les individus normaux la synth6se de m61anine d6marre alors sur les ehaines de tyrosinase transformant les pr6m61anosomes en m61anosomes tyrosinase-positifs. La synth6se de m61anine se poursuit jusqu'£ 6puisement du stock de tyrosinase et jusqu'£ ee que le m61anosome soit bourr6 de m61anine sons la forme de granules m61aniques tyrosinase-n6gatifs.

Depuis les t ravaux de Shemin et I~ittenberg (1946) et de Laseelles, Kikuehi et coll. (1956) des progrgs importants ont 6t6 r6alis6s eoneernant la biog6n6se des porphyrines. Bien que notre eonnaissanee des enzymes qui interviennent dans la biosynth6se de ees substances soit encore loin d'6tre parfaite, on sait que dans les eellules eoneern6es ehaque 6tape de la porphyrinog6n6se est li6e £ la eatalyse enzymatique (Gajdos et Gajdos-Torok, 1969).

Les premiers stades du proeessns sent les suivants :

Glycooolle @ acide suecinique ~ Acide A-aminol6vulinique---> Porphobilinog6ne E1

(mitochondriale)

H6moglobine ~-- H6me +

J¢2

uroporphyrinog6nc III

uroporphyrine I I I

E~

"In vivo" la formation d'aeide deltaaminol6vulinique est li6e g l 'aetivit6 d'nne enzyme mitoehondriale: la A-ALA d6shydratase (El). L'aeide deltaaminol6vn- linique 6labor6 dans les mitoehoncMes est 6vaeu6 vers la phase liquide de la eellule off i] est transform6 par vole enzymatique en uroporphyrinog6ne I I I (E2, E 3 . . .) et 6ventuellement apr6s oxydation en uroporphyrine I I I . Nous nons arr4terons eette 6tape puisque la porphyrine de l'oeil de Lineus tuber est une uroporphy- rine I I I .

La Fig. 14 rend compte, sous forme de seh6ma, des r6sultats que nons avons obtenus au eours de notre 6tude de la morphog6n6se des granules pigmentaires de la eupule pigmentaire de l'oeil de Lineus tuber en r6g6n6ration. Ce seh6ma montre que si les ph6nom6nes de m61anisation et de porphyrinog6n6se se d6veloppent par deux voies bioehimiques bien distinetes, iis ont lieu au niveau des m4mes struc- tures morphologiques. I1 eompl6te un pr6e6dent travail eoneernant ]a s6quence des 6v6nements bioehimiques et morphologiques qni interviennent lors de la diIf6reneiation des eellules pigmentaires de ]'oeil en r6g6n6ration (Vernet et Gont- eharoff, 1971).

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Ultrastructure des photor6cepteurs de Lineus tuber 253

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Guy Vernet Labora~oire de Biologie cellulaire Facult6 des Sciences B.P. 347 51062 Reims-Cedex (France)