UMR BIOGECO INRA Pierroton- Equipe de Génétique Plasticité moléculaire de deux Ecotypes de pin maritime soumis à un stress osmotique Philippe CHAUMEIL

UMR BIOGECO

INRA Pierroton- Equipe de Génétique

Plasticité moléculaire de deux Ecotypes de pin maritime soumis à

un stress osmotique

Philippe CHAUMEIL

13 avril 2006

2

Pin maritime (Pinus pinaster (Ait.))

Aire naturelle

4 Millions hectares

25% production nationale de bois de résineux Sylviculture intensive

peuplement monospécifique

Âge de rotation :35-50 ans

Pâte àpapier

Palettesemballages

Bois d’œuvre

Construction

En Aquitaine :Intérêt économique et écologique

http://www.mairie-athis-mons.fr/env/tri/images/recycl/mag3.jpg

3

Amélioration du Pin maritime

- Rendement - Rectitude

Gestion des ressources génétiqueset création de variétés améliorées

Gains supérieurs à 30 %

1960

4

Evolution du climat mondial

hiverhiver printempsprintemps

étéété automneautomneautomne

+4°C

Evolution des températures à l’échelle du siècle

Augmentation des températures estivales

5

hiverhiver printempsprintemps

étéété automneautomne

-50mm

-10mm+40mm

-30mm

Evolution des précipitations à l’échelle du siècle

Evolution du climat mondial

Hivers plus humides

Etés plus secs

6

Impacts climatiques

2001 2002 2003 2004

Nécessité de prendre en compte l’adaptation des variétés améliorées aux conditions climatiques à venir

Précipitations annuelles

-25% -50% -25% -25%

25-30 000 ha en dépérissement dans les landes

7

Des nouveaux critères à prendre en compte

Adaptation à l’environnement

• Améliorer la résistance à la sécheresse des variétés• Développement durable du massif forestier

1995…..Recherche des déterminants génétiques de caractères adaptatifs :

Etudes- Physiologiques- Génétiques- Moléculaires

de la réponse au stress hydrique

8

Résistance à la sécheresse

Quels sont les mécanismes de résistance à la sécheresse ?

• échappement

• évitement

• tolérance

Stratégies de résistance :

9

Réponses physiologiques au stress hydrique

Stress Hydrique

Régulation stomatique

Conductance hydraulique

Développement racinaire

Hormones du stress(ethylène, ABA, PA)

Pin maritime

• Variabilité phénotypique

(ex: pression de sève, transpiration, teneur en eau)

• Variabilité physiologique

(ex gs, E, ψs, ψh, TRE, croissance …)

• Modélisation du bilan hydrique au

sein d’une parcelle

• Espèce évitante

• Variabilité de réponse à la sécheresse entre Ecotypes, + ou - tolérants

11

Stress Hydrique

Détoxification

Chaperonne

Osmorégulation

Modification structurale

Régulation transcription

Transduction du signal

5

Modifications de l’expression des gènes :

Réponses moléculaires au stress hydrique

• Plasticité du protéome (thèse de Costa)

• Plasticité du transcriptome (thèse de Dubos)

Pin maritime

12

Diversité de réponse à la contrainte

Il existe une diversité intra-spécifique pour le niveau de résistance à la sécheresse

Phénotypessensibles

Phénotypesrésistants

• Entre individus• Entre populations

13

France

Maroc

650mm

980mm

Diversité de réponse chez le pin maritime

+ -

- +

Efficacité d’utilisation

de l’eau Tolérance

2 Ecotypes bien adaptés à leur milieu

14

Origine de la variabilité phénotypique

Qu’est ce qui détermine le phénotype ?

P = G + E + GxE

G: Composante génétique (héréditaire) soumise à la sélection naturelle

E: Composante épigénétique: PLASTICITE

G x E : interaction ( partie de la plasticité génétiquement contrôlée)

15



P = G + E + GxE




16

Plasticité phénotypique et moléculaire

Plasticité phénotypique: capacité d’un génotype à modifier son phénotype dans des environnements différents

P = G + E + GxE

Phénotype Génotype Environnement Interaction

Par analogie…

Plasticité moléculaire: capacité d’un génotype à modifier l’expression de son génome dans des environnements différents

17



P = G + E + GxE




18

Les normes de réaction

E

G

Unité Génétique (G) :[Individu ou Population/Ecotype ou espèce]

P = G + E + GxEUne façon simple de représenter

P

La valeur P d’un G au travers des E

19


Ph

éno

typ

e

E1 E2

1 seule Unité Génétique (UG) :[Individu ou Population/Ecotype ou espèce] P = G + E + GxE

Détection de gènes de réponse au stressPLASTICITE

Valeur adaptative de cette plasticité ?

20

ex: sensible vs résistant

GE

xpre

ssio

nEnv1 Env2

Exp

ress

ion

Env1 Env2

G1

G2

E

Exp

ress

ion

Env1 Env2

G+EE

xpre

ssio

n

Env1 Env2

G+E

Exp

ress

ion

Env1 Env2

G+E+GxE

Exp

ress

ion

Env1 Env2

GxE


Au moins 2 Unités Génétiques (G) P = G + E + GxE

21

GE

xpre

ssio

nEnv1 Env2

Exp

ress

ion

Env1 Env2

G1

G2

E

Exp

ress

ion

Env1 Env2

G+EE

xpre

ssio

n

Env1 Env2

G+E

Exp

ress

ion

Env1 Env2

G+E+GxE

Exp

ress

ion

Env1 Env2

GxE


Mise en évidence de stratégies de réponses différentes entre les génotypes

22

Objectif

Identifier les gènes impliqués dans l’adaptation à la sécheresse chez le pin

maritime

Hypothèse : Les gènes qui présentent ces normes de réaction sont liés à l’adaptationdes populations à leur environnement

23

Questions de recherche

1. Quels sont les gènes différentiellement exprimés entre Ecotypes sensible vs tolérant lors du stress hydrique?

2. Est-il possible d’identifier parmi ces gènes des groupes présentant des normes de réaction indiquant un rôle possible dans l’adaptation au stress hydrique?

24

Ressources nécessaires

1. Développement d’une ressource génomique

2. Obtention du matériel végétal

Pour répondre à ces questions

3. Acquisition des données d’expression du génome

25

Méthode :

• Création de banques d’ADNc et séquençage d’EST

• Identification de la fonction des gènes



26

Gènes exprimés : séquençage EST

Extraction d’ARNm

Séquences d’ADNc (EST)

Banque d’ADNc

Principe ?

Quel matériel végétal utiliser pour une bonne représentativité des banques d’ADNc ?

27

Banques d’ADNc

Xylème en différentiation

Racines de plantules (Stress / Contrôle )

• Les racines : 1er organe à percevoir une sécheresse édaphique• Rôle d’ancrage et de captage de l’eau et des nutriments

• Un type cellulaire majoritaire chez le pin (trachéides)• Rôle de soutien et de conduction de l’eau et des minéraux • Le bois : un bio-indicateur des conditions hydriques

8 260 EST

10 238 EST

28

Assemblage et annotation des Séquences

EST

CL1 CL2 CL3 CL… CL10

CT12 CT13 CT14

CN56 CN57CN59

CN58

D2 Cluster

Craw

Phrap

singletons

- Création projet- Repeat masker- Assemblage

Pipeline bioinformatique

famille de gène ou gène

Membres (paralogues)

Allèles? Épissage?

- Consultation- Étape d’Annotation

Interfaced’annotation

29

18498 EST assemblées en :

- 2697 Clusters- 2893 Contigs- 5051 Singletons

Création d’un Unigène de 7200

gènes :

4236 Singletons2889 Consensus

Réalisation d’un Unigène

30

Doit permettre d’identifier :

• Les gènes impliqués dans l’adaptation au stress hydrique

• De détecter les gènes de la réponse précoce et ceux impliqués dans un stress établi



31

Matériel végétal : 2 Ecotypes aux comportements tranchés

2 Ecotypes bien adaptés à leur milieu

Gènes impliqués dans l’adaptation au

stress hydrique ?

Gènes de la réponse précoce / gènes du

stress établi ?

2 types de stress :

- Court et violent- Prolongé et modéré

32

Choix d’une culture hydroponique

Matériel végétal : culture hydroponique

Osmoticum = PEG

33

Stress court

-0.6

0 M

Pa

Témoin court

+2H

+6H

+24H

+48H

Application du stress

Hydroponie

Germination Stress Long-0

.45

MP

a

+3 semaines Témoin long

Matériel végétal : Choix des conditions expérimentales

34

Matériel végétal : application du stress osmotique

Germination Salle de culture Eclairage

0

2

4

6

8

10

FrTC McTC Fr48H Mc48H FrTL McTL FrSL McSL

Nature de l'échantillon

(ba

r)

Stress court Stress long

témoin témoin

stress stress

Traitement appliqué induit bien un stressUne différence entre Ecotypes en stress long

Mesure du potentiel de base

35



3.1. Réalisation d’une puce à ADNc

3.2. Quantification de l’accumulation des transcrits

36

Fabrication

Réalisation d’une puce à ADNc

Gènes (EST)

+lame de verre

Dépôt « spotting »

37

Fabrication

Réalisation d’une puce à ADNc

Gènes (EST)

+lame de verre

Dépôt « spotting »

Ech 1

Analyse des résultats

Hybridation et lecture

Ech 2

Extraction des ARN

Transcription des ARNmen ADNc et marquage

Cy3 Cy5

Hybridation

38

Quantification de l’accumulation des transcrits: Plan d’expérience

Choix du schéma d’hybridation essentiel :

• dépend du nombre d’échantillons à comparer• détermine le coût de l’expérience• doit permettre d’estimer les effets expérimentaux• détermine la puissance de détection des variations d’expression

Hybridations selon un « Loop design »

Avantages

Inconvénients

Nb de lames réduitEstimation des effets plus précise

Sensibilité aux données manquantes

« loop »

A

B C

A,B,C : 3 échantillons: lame

39

Pas de pont entre les 2 expériences

•Nombre de lames limité (30)•Limiter le risque des manips•Réponse « stress court » vs. « stress long »

Témoin

Stress 6h Stress 48h

Témoin

Stress 6hStress 48h

18 lames

Réponse à court terme

Témoin

Stress

Témoin

Stress

8 lames

Réponse à long terme

Quantification de l’accumulation des transcrits: Plan d’expérience

40

ijklrijklr Ycor

3/ Obtention de données d’expression corrigées

2/ Normalisation inter-lames modèle global (gènes = répétitions) :

lglg EE ijkkllkijjiijk tCtCttDD

résiduellelame

fluorochromeBiais techniques

Écotype

Condition Correction technique liée à l’E et à la condition

1/ Normalisation intra-lame, « rlowess » (MAANOVA) :

• normalise signal Cy3/Cy5• tient compte de la position des spots

Quantification de l’accumulation des transcrits: analyse biométrique

41

Pour résumer…



20 000 EST annotées et Unigène de 7200 éléments

2 Ecotypes x 5 conditions

700 000 données !


42

Questions de recherche

1. Quels sont les gènes différentiellement exprimés entre Ecotypes sensible vs tolérant lors du stress hydrique?


43

Question de recherche n°1

Méthode :

• Utilisation des données d’expression de puces à ADNc

• Détection des gènes différentiellement exprimés par ANOVA (effet Ecotype, effet environnement, interaction)

1. Quels sont les gènes différentiellement exprimés entre Ecotypes sensibles vs tolérants lors du stress hydrique?

44

Analyse de variance

Détection des gènes différentiellement exprimés :

• part de variation expliquée par facteurs G + E + GE >40%ou 1/3 variation expliquée par un des trois facteurs

• seuil de probabilité de 0,01 pour au moins un des facteurs

ijklrkllkrijjiijk eEERDDYcor GGlg

Ecotype condition

Effets techniques

Prise en compte de la multiplicité des tests dans l’erreur globale de type 1

7200 tests ! Utilisation de la méthode FDR: « False Discovering Rate »

45

Stress Court Stress Long

effet significatif

Condition (E) 15% 82% (504)

Ecotype (G) 64% (292) 4%

Ecotype+Condition (G+E) 19% 8%

Interaction seule (GxE) 0,2% 0%

Quels sont les effets significatifs majeurs ?

Analyse de variance: résultats

Nombre de gènes différentiellement exprimés :

Expérience « Stress court » = 458 gènes

Expérience « Stress long » = 612 gènes

46

Stress court = regroupement par Ecotype

458 gènes

Stress long = regroupement par condition

612 gènes

Regroupement des échantillons sur la base d’une distance transcriptomique Euclidienne

47

≤

1,25

1,5

2

3

4

5

≥

Amplitude de régulation

Amplitudede régulation :

Stress Court Stress Long

Ratios G E G E3 0 1 20

64 5 24 220

256 64 36 224

58 68 11 82

3 14 3 20

0 6 0 4

0 4 0 4

Gènes de fonctions connues pour leur implication dans la réponse au stresset de nombreux gènes de fonctions inconnues

Ex:

HSP, +6,62xSmall HSP, +5,48xProtéines de membranes induites par l’ABA, +3,92x Déhydrine, +3,21Précurseurs de peroxydases, -3,2 à -6,59xLEA, +3,02x

HSP classe I, +4,16xSmall HSP, +3,22xFlavonoid 3',5'-hydroxylase, +6,72x

48

Questions de recherche n°2

Méthode :

• Méthodes de regroupement des données


49

Méthodes visant à maximiser l’homogénéité intra-groupe et à minimiser l’homogénéité

inter-groupe

Agrégation des données (Clustering)

Expander «Click » : http://www.cs.tau.ac.il/~rshamir/expander/expander.html

Stress courtGènes différentiellement exprimés

Stress LongGènes différentiellement exprimés

Clustering

Regrouper les gènes dont le profil d’expression est similaire

50

Résultats

6 profils en « Stress Court » 7 profils en « Stress Long »

458 Gènes 612 Gènes


51


Expérience « Stress court » Expérience « Stress Long »

Tc 6H 48H Tc 6H 48H TL SL

TL SL TL SL

Cluster 1 :181 Cluster 2 :107



Cluster 1 :219 Cluster 2 :192 Cluster 3 :41

Cluster 4 :39 Cluster 5 :34 Cluster 6 :29

Cluster 7 :21

52

Existe-t-il des gènes caractéristiques de la plasticité moléculaire ?


Exp

ress

ion

Ctrl Stress

E1

E2

E

Réponses similaires entre Ecotypes =gènes à comportement plastique

53



Tc 6H 48H Tc 6H 48H

Profil « Condition »

TL SL TL SL

45 gènes411 gènes

Exp

ress

ion

Ctrl Stress

E1

E2

54

Gènes régulés par le stress quel que soit l’Ecotype

Exp

ress

ion

Ctrl Stress

E1

E2

Détection des gènes classiquementdécrits lors du stress hydrique

• Déhydrine• Protéines de réponse à l’éthylène• HSP• ASR• LEA• protéine à 7 domaines transmembranaires• récepteur protéine kinase• …

Ex :

Permettent d’étudier les mécanismes de la réponse au stress

55

Variabilité entre Ecotype

Existe-t-il des gènes caractéristiques des Ecotypes ?

G

Exp

ress

ion

Ctrl Stress

56

Quelle est l’origine de la différence de régulation entre populations différentes ?

Dérive génétique Sélection naturelle

Écotype marocain exposé à une sécheresse chronique

Différentiel d’expression peut apporter un avantage sélectif

Variabilité entre Ecotype

Gènes de l’adaptation ?

57



TL SL

Profil « Écotype »

Tc 6H 48H

Tc 6H 48H

Exp

ress

ion

Ctrl Stress

58

Gènes différenciant les deux Ecotypes

Hypothèse :Stratégies adaptatives différentes

Ex: Ecotype français :PALPectates lyasesGlucane endo-1,3-beta glucosidaseBétaïne-aldéhyde déshydrogénase

Composition des parois

Osmoprotection

Exp

ress

ion

Ctrl Stress

Ecotype marocain :Glutathione transférasePrécurseur de la peroxydaseThioredoxine type HPeptidyl prolyl IsoméraseCarbonate déshydrataseProton-exporting ATPase

Détoxification

Transport ionique

Stabilisation protéique

Exp

ress

ion

Ctrl Stress

59

Gènes impliqués dans l’adaptation

Quels sont les gènes qui montrent des stratégies de réponse au stress (E) différentes entre Ecotypes (G) ?

H0: gènes potentiellement impliqués dans l’adaptation au stress hydrique

Exp

ress

ion

Env1 Env2

G+E

Exp

ress

ion

Env1 Env2

G+E+GxE

Exp

ress

ion

Env1 Env2

GxE

60


TL SL TL SL

Profil « Ecotype + Condition»

TL SLTc 6H 48H

Tc 6H 48H


61


TL SL TL SLTL SLTc 6H 48H

Tc 6H 48H

Gènes plus fortement exprimés chez l’Ecotype marocain


62


TL SLTc 6H 48Hgènes surexprimés par le stress, + Marocains


63

Exp

ress

ion

Ctrl Stress

Ex :Gènes surexprimés,plus fortement exprimés chez l’Ecotype marocain

Protéines de choc thermique (HSP), protéine induite par l’ ABA, LEA, Métallothionéines, Synthèse flavonoïdes…

Réponse au stress

Régulation de l’expression et synthèse des protéines

Phospholipase DRING finger, Zinc finger,G-box binding factor,Histone H4Elongation factor 1-gamma, …

Composition paroisCellulose synthaseElastine-like

Caractéristique de la réponse de l’Ecotype marocain ?


64


gènes surexprimés par le stress, + Français


65

Exp

ress

ion

Ctrl Stress

Ex :Gènes surexprimés,plus fortement exprimés chez l’Ecotype français

Peptides antimicrobiens, Aluminium-induced protein-like, précurseur de péroxydase, cytochrome P450, protéines chaperonnes dnaJ…

Réponse au stress

+ fonction inconnue

+ métabolisme

Stratégie de maintien du métabolisme ?


66


Tc 6H 48H

sous-expression, Ecotype marocain plus exprimé


67

Exp

ress

ion

Ctrl Stress

Ex : Gènes sous-exprimés lors du stress,

Niveau d’expression maintenu plus élevé chez l’Ecotype marocain

Isopentenyl-diP delta-Isomérase2-C-methyl-D-erythritol 2,4-diP synthaseGeranyl diP synthasePinène synthase

Synthèse des terpènes

Cholinephosphate cytidyltransférase B Précurseur Bétaïne

Bétaïne-aldéhyde déshydrogénase, plus exprimée chez l’Ecotype français

Stratégies de régulation différentes de la Bétaïne ?


68


TL SL

sous-expression, Ecotype français plus exprimé


69

Exp

ress

ion

Ctrl Stress

Ex :Gènes sous-exprimés lors du stress,

mais plus exprimé Ecotype français

Metallothionein-like protein EMB30Disease resistance response proteinDehydratation stress-induced protein

Réponse au stress

Synthèse lignineC4HCaffeate O-methyltransferase

PAL est également plus exprimée chez l’Ecotype français quelque soit condition

Stratégies de régulation composition des parois différentes ?


70


Il existe d’autres normes de réaction…

71


41 gènes

12 accessions de Pinus taeda

24 accessions très faiblement régulées

5 accessions à profil intéressant

Ge053H04

9

9,5

10

10,5

11

11,5

12

Tc 6H 48H

Ge075H01

10,5

11

11,5

12

12,5

13

13,5

14

Tc 6H 48H

RS49G03

9,5

10

10,5

11

11,5

12

12,5

13

TL SL

Ge093A05

8,28,48,68,8

99,29,49,69,810

TL SL

Alco

ol

désh

ydro

gén

aseIn

osito

lo

xygén

ase

Ger

min

(o

xala

te

oxi

das

e)-l

ike

Fo

nct

ion

in

con

nu

e

RS07C09

9,5

10

10,5

11

11,5

12

TL SL

Métallothionéine -like

G+E+GxEGxE

72

Synthèse: des gènes candidats de l’adaptation

Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

IPP isomérase

GPP synthase

Pinène synthase

PAL

C4H

COMT

• Pectate lyase• Glucan endo1,3 beta glucosidase

• Cellulose synthase• Elastine-like

PAROIS

• Histone H4• RING finger• Zinc finger• G-box binding factor

• Elongation factor 1 G

• Peptidilprolyl isomérase

Rég

ula

tio

nE

xpre

ssio

n

• Carbonate déshydratase• Proton exporting ATPase

Choline-P cytidyltransférase

Bétaine aldéhyde desH2

Bétaine

Os

mo

rég

ula

tio

n

• DETOXIFICATION

• Peptide antimicrobien• Aluminium induced prot-like• Précurseur peroxydase• Cytochrome P450• Protéine chaperonne dnaJ• Inositol oxygenase

• HSP• ABA induced protein• LEA• Métallothionéines• Synthèse flavonoïde

• Métallothionéines• Disease resistance• Dehydratation stress-induced

S

T

R

E

S

S

73

Conclusions

THESE

1. Génération et mise à disposition d’une ressource d’EST annotées

• 10000 EST de racines• 9000 EST de xylème

• 8000 EST de bourgeons

= 27000 EST de pin maritime

Outil d’assemblage et d’annotation (EPA)

74

Conclusions

THESE


2. Production et utilisation d’une puce à ADNc pin maritime

Première fois chez cette espèce

Maintenant, Unigènede 12000 gènes

75

Conclusions

THESE



3. Détection de 458 gènes dans le SC et 612 gènes dans le SL

Fort effet Ecotype en stress courtetfort effet condition en stress long

76

Conclusions

THESE


5. Possibilité de stratégies de réponses différentes


3. Détection de 458 gènes dans le SC et 612 gènes dans le SL

4. Détection de gènes potentiellement impliqués dans l’adaptation au stress hydrique

Gènes candidatspotentiels

77

Perspectives

•Validation de gènes par qPCR sur plus d’EcotypesqPCR= technique adaptée pour les études ciblées (beaucoup de pop et peu de gènes)

Différence d’expression entre Ecotypesplantés au champ et mesurés pour l’efficacité d’utilisation de l’eau

T29M8.12 protein (monooxygenase /disulfide oxidoreductase ) En cours …

Test de provenance

78

Perspectives

•Étudier la diversité nucléotidique pour un lot de gènes potentiellement liés à l’adaptation et analyser si la diversité observée est compatible avec un effet de la sélection naturelle

(thèse en cours E Eveno, sur l’étude des patrons de diversité au sein de gènes candidats)

• Glycin-Rich Protein

• Caffeoyl-CoA-3-O-methyltransferase

• Arabinogalactan /Prolin-Rich Protein

• Trans-cinnamate-4-hydroxylase (C4H)

• Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase

• putative dehydrin

79

Perspectives

• Caractériser la composition chimique des parois (coopération ISA Lisbonne) …en cours…

min10 20 30 40 50 60 70 80

cellulose

témoinTC

TL

TL

TC

80

Remerciements

Christophe PlomionPatrick LégerCéline LalanneManon MoreauChristophe BouryJean-marc Frigério…

Johan PetitVirginie Garcia

Silvia FluchMarie Foulongne

Aurélien BarréNacer Mohellibi…

Membres du jury : O. Brendel, P. Dizengremel, B. Garbay , P. Label, M. Zivy

Documents

UMR BIOGECO INRA Pierroton- Equipe de Génétique Plasticité moléculaire de deux Ecotypes de pin maritime soumis à un stress osmotique Philippe CHAUMEIL